ES2225107T3 - Analogos del peptido inhibidor gastrico y su uso para el tratamiento de la diabetes. - Google Patents
Analogos del peptido inhibidor gastrico y su uso para el tratamiento de la diabetes.Info
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Abstract
Análogo peptídico de GIP(1-42) que comprende al menos 15 residuos de aminoácido del extremo N-terminal de GIP(1-42) que tiene al menos una sustitución o modificación de aminoácido en la posición 1 - 3 y que no incluye Tyr1-sorbitol-GIP(1-42), que es biológicamente activo.
Description
Análogos del péptido inhibidor gástrico y su uso
para el tratamiento de la diabetes.
La presente invención se refiere a la liberación
de insulina y el control de la glucemia. Más particularmente, la
invención se refiere al uso de péptidos para estimular la
liberación de insulina, la disminución de la glucemia y
preparaciones farmacéuticas para el tratamiento de la diabetes tipo
2.
El polipéptido inhibidor gástrico (GIP) y el
péptido similar al
glucagón-1(7-36)amida
(GLP-1 truncado; tGLP-1) son dos
importantes hormonas que liberan insulina secretadas por células
endocrinas en el tracto intestinal en respuesta a la alimentación.
Junto con los nervios autónomos, desempeñan un papel de apoyo vital
a los islotes pancreáticos en el control de la homeostasia de la
glucemia y el metabolismo de los nutrientes.
Se ha identificado la dipeptidil peptidasa IV
(DPP IV; EC 3.4.14.5) como una enzima clave responsable de la
inactivación de GIP y tGLP-1 en el suero. DPP IV se
inhibe completamente en el suero mediante la adición de diprotin A
(DPA, Ile-Pro-Ile, 0,1 mol/l). Esto
se produce mediante la rápida eliminación de los dipéptidos del
extremo N-terminal
Tyr^{1}-Ala^{2} e
His^{7}-Ala^{8} que da lugar a los metabolitos
principales GIP(3-42) y
GLP-1(9-36)amida,
respectivamente. Se informa de que estos péptidos truncados carecen
de actividad biológica o incluso sirven como antagonistas en los
receptores GIP o tGLP-1. Por tanto, las semividas
biológicas resultantes de estas hormonas incretinas in vivo
son muy cortas, se estima que no son más largas de 5 minutos.
En situaciones de regulación de la glucosa y
sensibilidad de las células B pancreáticas normales, esta corta
duración de acción es ventajosa al facilitar ajustes momentáneos
para el control homeostático. Sin embargo, el objetivo actual de un
posible papel terapéutico de las hormonas incretinas,
particularmente tGLP-1 en el tratamiento de DMNID
(diabetes mellitus no insulinodependiente) se frustra por varios
factores además de encontrar una vía de administración conveniente.
Los más notables de éstos son la rápida degradación peptídica y la
rápida absorción (se alcanzan concentraciones pico en 20 minutos) y
la necesidad resultante tanto de una dosificación elevada como de
una sincronización precisa con las comidas. Estrategias terapéuticas
recientes se han centrado en preparaciones precipitadas para
retrasar la absorción peptídica y la inhibición de la degradación
de GLP-1 utilizando inhibidores específicos de DPP
IV. También se sugiere un posible papel terapéutico por la
observación de que un inhibidor específico de DPP IV, la isoleucina
tiazolidida, disminuyó la glucemia y aumentó la secreción de
insulina en ratas Zucker obesas, diabéticas, tratadas con glucosa,
presumiblemente protegiendo frente al catabolismo de las hormonas
incretinas tGLP-1 y GIP, véase también la solicitud
de patente DE 196 16 486.
Numerosos estudios han indicado que la infusión
de tGLP-1 restablece la sensibilidad de las células
B pancreáticas, las oscilaciones secretoras de insulina y el
control mejorado de la glucemia en varios grupos de pacientes con
IGT (alteración de la tolerancia a la glucosa) o DMNID. Los estudios
a largo plazo también muestran los beneficios significativos de
inyecciones de tGLP-1 en el tratamiento de DMNID y
posiblemente DMID (diabetes mellitus insulinodependiente),
proporcionando un incentivo importante para desarrollar un análogo
de tGLP-1 de acción prolongada o eficaz por vía
oral. Se han hecho varios intentos para producir análogos
modificados estructuralmente de tGLP-1, que sean
resistentes a la degradación por DPP IV. Se observa una
prolongación significativa de la semivida sérica con
His^{7}-sorbitol-tGLP-1
y análogos de tGLP-1 sustituidos en la posición 8
con Gly, Aib, Ser o Thr. Sin embargo, estas modificaciones
estructurales parecen alterar la unión al receptor y la actividad
insulinotrópica, comprometiendo así parte de los beneficios de
protección frente a la degradación proteolítica. En recientes
estudios que utilizaron
His^{7}-sorbitol-tGLP-1,
la resistencia frente a DPP IV y la degradación sérica estuvo
acompañada por una grave pérdida de actividad de liberación de
insulina.
GIP comparte, no sólo la misma ruta de
degradación que tGLP-1, sino también muchas
acciones fisiológicas similares, incluyendo la estimulación de la
secreción de insulina y somatostatina y el aumento de eliminación de
glucosa. Estas acciones se ven como aspectos claves en las
propiedades antihiperglucémicas de tGLP-1 y, por
tanto, hay una buena expectativa de que GIP pueda tener un
potencial similar como tratamiento de DMNID. De hecho, la
compensación por GIP es válida para explicar los trastornos
moderados de la homeostasia de la glucosa observados en ratones
deficientes en tGLP-1. Aparte de estudios
preliminares, no se ha explorado el potencial antidiabético de GIP y
tGLP-1 parece más atractivo puesto que se ve por
algunos como un secretagogo de insulina más potente cuando se
infunde en las concentraciones "denominadas" fisiológicas,
estimadas por RIA (radioinmunoensayo).
La presente invención se dirige a proporcionar
análogos eficaces de GIP. En un objetivo de la invención
proporcionar un producto farmacéutico para el tratamiento de la
diabetes tipo 2.
Según la presente invención, se proporciona un
análogo peptídico eficaz del GIP(1-42)
biológicamente activo que tiene características mejoradas para el
tratamiento de la diabetes tipo 2, en el que el análogo comprende al
menos 15 residuos de aminoácidos del extremo N de
GIP(1-42) y tiene al menos una sustitución o
modificación de aminoácidos en posición 1-3 y que no
incluye
Tyr^{1}-sorbitol-GIP(1-42).
A continuación, se muestran las estructuras de
GIP(1-42) humano y porcino. El péptido
porcino difiere sólo en dos sustituciones de aminoácidos en las
posiciones 18 y 34.
\newpage
El análogo puede incluir la modificación mediante
la adición de ácido graso en un grupo epsilon-amino
de al menos un residuo de lisina.
La invención incluye
Tyr^{1}-sorbitol-GIP(1-42)
que tiene adición de ácido graso en un grupo
epsilon-amino de al menos un residuo de lisina.
Fig.
1
Fig.
2
Los análogos de GIP(1-42)
pueden tener una capacidad mejorada para estimular la secreción de
insulina, aumentar la eliminación de glucosa, retrasar la absorción
de glucosa o pueden mostrar una estabilidad mejorada en el plasma en
comparación con el GIP nativo. También pueden tener una resistencia
a la degradación mejorada.
Cualquiera de estas propiedades aumentará la
potencia del análogo como agente terapéutico.
Los análogos que tienen sustituciones de
D-aminoácidos en las posiciones 1, 2 y 3 y/o
aminoácidos N-glicados,
N-alquilados, N-acetilados o
N-acilados en la posición 1 son resistentes a la
degradación in vivo.
Se incluyen varias sustituciones de aminoácidos
en el segundo y tercer residuos amino terminal, tales como
GIP(1-42)Gly2,
GIP(1-42)Ser2,
GIP(1-42)Abu2,
GIP(1-42)Aib,
GIP(1-42)Ala2,
GIP(1-42)Sar2,
GIP(1-42)Pro3.
Los análogos de GIP modificados en el extremo
amino terminal incluyen GIP(1-42)
N-glicado, GIP(1-42)
N-alquilado, GIP(1-42)
N-acetilado o
N-acetil-GIP(1-42)
y
N-isopropil-GIP(1-42).
Otros análogos estabilizados incluyen aquellos
con un enlace peptídico isóstero entre residuos de aminoácidos en
la posición 2 y 3. Estos análogos pueden ser resistentes a la
enzima plasmática dipeptidil peptidasa IV (DPP IV) que es en gran
parte responsable de la inactivación de GIP mediante la eliminación
del dipéptido amino terminal Tyr1-Ala2.
En realizaciones particulares, la invención
proporciona un péptido que es más potente que el GIP humano o
porcino en la moderación de las fluctuaciones de la glucemia,
consistiendo dicho péptido en GIP(1-42) o
fragmentos del extremo N-terminal de
GIP(1-42) que consisten en hasta entre 15 y
30 residuos de aminoácidos del extremo N-terminal
(es decir, GIP(1-15) -
GIP(1-3)) con una o más modificaciones
seleccionadas del grupo que consiste en:
- (a)
- sustitución de Ala^{2} por Gly
- (b)
- sustitución de Ala^{2} por Ser
- (c)
- sustitución de Ala^{2} por Abu
- (d)
- sustitución de Ala^{2} por Aib
- (e)
- sustitución de Ala^{2} por D-Ala
- (f)
- sustitución de Ala^{2} por Sar
- (g)
- sustitución de Glu^{3} por Pro
- (h)
- modificación de Tyr^{1} por acetilación
- (i)
- modificación de Tyr^{1} por acilación
- (j)
- modificación de Tyr^{1} por alquilación
- (k)
- modificación de Tyr^{1} por glicación
- (l)
- conversión del enlace Ala^{2}-Glu^{3} en un enlace [CH2NH] psi
- (m)
- conversión del enlace Ala^{2}-Glu^{3} en un enlace peptídico isóstero estable
- (n)
- (n-isopropil-H)-1GIP
La invención también proporciona el uso de
Tyr^{1}-sorbitol-GIP en la
preparación de un medicamento para el tratamiento de la
diabetes.
La invención proporciona también composiciones
farmacéuticas mejoradas que incluyen análogos de GIP con
propiedades farmacológicas mejoradas.
Otros análogos posibles incluyen ciertos
aminoácidos que se encuentran comúnmente, que no están codificados
por el código genético, por ejemplo, beta-alanina
(beta-ala) u otros
omega-aminoácidos, tales como ácido
3-aminopropiónico, 4-aminobutírico,
etc., ornitina (Om), citrulina (Cit), homoarginina (Har),
t-butilalanina (t-BuA),
t-butilglicina (t-BuG),
N-metilisoleucina (M-McIle),
fenilglicina (Phg) y ciclohexilalanina (Cha), norleucina (Nle),
ácido cisteico (Cya) y metionina sulfóxido (MSO), la sustitución de
la forma D de un aminoácido neutro o ácido o la forma D de tirosina
para tirosina.
Según la presente invención, también se
proporciona una composición farmacéutica útil en el tratamiento de
la diabetes tipo II, que comprende una cantidad eficaz del péptido
descrito en el presente documento, en mezcla con un excipiente
farmacéuticamente aceptable.
La invención proporciona también un método para
modificar en el extremo N-terminal GIP o análogos
del mismo, comprendiendo el método las etapas de sintetizar el
péptido desde el extremo C-terminal hasta el
penúltimo aminoácido del extremo N-terminal, añadir
tirosina a un sistema de burbujeo como una resina de
Tyr(tBu)-Wang protegida con
F-moc
(9-fluorenilmetiloxicarbonilo), desproteger el
extremo N-terminal de la tirosina y hacerla
reaccionar con un agente de modificación, permitir que la reacción
avance hasta su finalización, escindir la tirosina modificada de la
resina de Wang y añadir la tirosina modificada a la reacción de
síntesis peptídica.
Preferiblemente, el agente es glucosa, anhídrido
acético o ácido piroglutámico.
Ahora se demostrará la invención con referencia
al siguiente ejemplo no limitante y las figuras adjuntas, en las
que:
La figura 1 ilustra la degradación de GIP por DPP
IV.
La figura 1b ilustra la degradación de GIP y
Tyr^{1}-sorbitol-GIP por DPP
IV.
La figura 2a ilustra la degradación de GIP por
plasma humano.
La figura 2b ilustra la degradación de GIP y
Tyr^{1}-sorbitol-GIP por plasma
humano.
La figura 3 ilustra la espectrometría de masas de
ionización por electrospray de GIP;
Tyr^{1}-sorbitol-GIP y el
principal fragmento de degradación
GIP(3-42).
La figura 4 muestra los efectos de GIP y GIP
glicado sobre la homeostasia de la glucosa plasmática.
La figura 5 muestra los efectos de GIP sobre las
respuestas de la insulina plasmática.
La figura 6 muestra la degradación por
DPP-IV de GIP 1-42.
La figura 7 muestra la degradación por
DPP-IV de GIP-(Abu^{2}).
La figura 8 muestra la degradación por
DPP-IV de GIP-(Sar^{2}).
La figura 9 muestra la degradación por
DPP-IV de GIP-(Ser^{2}).
La figura 10 muestra la degradación por
DPP-IV de
N-acetil-GIP.
La figura 11 muestra la degradación por
DPP-IV de GIP glicado.
La figura 12 muestra la degradación por plasma
humano de GIP.
La figura 13 muestra la degradación por plasma
humano de GIP-(Abu^{2}).
La figura 14 muestra la degradación por plasma
humano de GIP-(Sar^{2}).
La figura 15 muestra la degradación por plasma
humano de GIP-(Ser^{2}).
La figura 16 muestra la degradación por plasma
humano de GIP glicado.
La figura 17 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Abu^{2}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 5,6 mM.
La figura 18 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Abu^{2}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 16,7 mM.
La figura 19 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Sar^{2}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 5,6 mM.
La figura 20 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Sar^{2}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 16,7 mM.
La figura 21 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Ser^{2}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 5,6 mM.
La figura 22 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Ser^{2}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 16,7 mM.
La figura 23 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y
N-acetil-GIP 1-42
sobre la liberación de insulina desde células
BRIN-BD11 incubadas con glucosa 5,6 mM.
La figura 24 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y
N-acetil-GIP 1-42
sobre la liberación de insulina desde células
BRIN-BD11 incubadas con glucosa 16,7 mM.
La figura 25 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP
1-42 glicado sobre la liberación de insulina desde
células BRIN-BD11 incubadas con glucosa 5,6 mM.
La figura 26 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP
1-42 glicado sobre la liberación de insulina desde
células BRIN-BD11 incubadas con glucosa 16,7
mM.
La figura 27 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Gly^{2}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 5,6 mM.
La figura 28 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Gly^{2}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 16,7 mM.
La figura 29 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Pro^{3}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 5,6 mM.
La figura 30 muestra los efectos de diversas
concentraciones de GIP 1-42 y GIP-(Pro^{3}) sobre
la liberación de insulina desde células BRIN-BD11
incubadas con glucosa 16,7 mM.
La modificación en el extremo
N-terminal de GIP es esencialmente un procedimiento
de tres etapas. En primer lugar, se sintetiza GIP a partir de su
extremo C-terminal (partiendo de una resina de
Fmoc-Gln(Tratamiento)-Wang,
Novabiochem) hasta el penúltimo aminoácido del extremo
N-terminal (Ala2) en un sintetizador automático de
péptidos (Applied Biosystems, CA, EE.UU.). La síntesis sigue
protocolos de la química de péptidos con Fmoc habituales. En
segundo lugar, se añade el aminoácido N-terminal del
GIP nativo (Tyr) a un sistema de burbujeo manual como una resina de
Tyr (tBu) -Wang protegida con Fmoc. Este aminoácido se desprotege
en su extremo N-terminal (piperidina en DMF
(dimetilformamida, 20% en v/v)) y se deja que reaccione con una alta
concentración de glucosa (glicación, en condiciones reductoras con
cianoborohidruro de sodio), anhídrido acético (acetilación), ácido
piroglutámico (piroglutamilo), etc., durante hasta 24 horas, según
sea necesario para permitir que la reacción se lleve hasta su
finalización. La completitud de la reacción se monitorizará
utilizando la prueba de la ninhidrina que determinará la presencia
de grupos a-amino libres disponibles. En tercer
lugar, (una vez que la reacción es completa) la tirosina ahora
modificada estructuralmente se escinde de la resina de Wang (95% de
TFA (ácido trifluoroacético) y 5% de los eliminadores de impurezas
apropiados. N.B. Tyr se considera que es un aminoácido problemático
y puede necesitar una consideración especial) y se añade, en
consecuencia, la cantidad requerida de la Tyr modificada en el
extremo N-terminal directamente al sintetizador
automático de péptidos, que continuará con la síntesis, uniendo así
la Tyr modificada en el extremo N-terminal al
a-amino de GIP(Ala2), completando la
síntesis del análogo de GIP. Este péptido se escinde de la resina de
Wang (como anteriormente) y luego se le da un tratamiento final
utilizando las técnicas de filtración en Buchner, precipitación,
evaporación giratoria y secado habituales.
El ejemplo siguiente investiga la preparación de
Tyr^{1}-sorbitol-GIP junto con la
evaluación de sus propiedades antihiperglucémicas y de liberación de
insulina in vivo. Los resultados demuestran claramente que
este análogo de GIP novedoso muestra una resistencia sustancial a
la degradación por aminopeptidasa y un aumento de la actividad
hipoglucemiante en comparación con el GIP nativo.
Se adquirió GIP humano de la American Peptide
Company (Sunnyvale, CA, EE.UU.). Se obtuvo acetonitrilo de calidad
para HPLC de Rathburn (Walkersburn, Escocia). Se obtuvo ácido
trifluoroacético (TFA) de calidad para secuenciación de Aldrich
(Poole, Dorset, RU). Todos los demás productos químicos adquiridos,
incluyendo dextrano T-70, carbón activado,
cianoborohidruro de sodio y la fracción V de albúmina sérica bovina
procedían de Sigma (Poole, Dorset, RU). Diprotin A (DPA) se
adquirió a Calbiochem-Novabiochem (RU) Ltd.
(Beeston, Nottingham, RU) y la insulina de rata habitual para RIA
se obtuvo de Novo Industria (Copenhague, Dinamarca). Se adquirieron
cartuchos Sep-Pak de fase inversa (C18) a
Millipore-Waters (Milford, MA, EE.UU.). Toda el agua
utilizada en estos experimentos se purificó utilizando un sistema
de purificación de agua Milli-Q (Millipore
Corporation, Milford, MA, EE.UU.).
Se incubó GIP humano con glucosa en condiciones
reductoras, en tampón fosfato sódico 10 mmol/l a pH 7,4 durante 24
horas. La reacción se detuvo mediante la adición de ácido acético
0,5 mol/l (30 \mul) y la mezcla se aplicó a una columna de HPLC
analítica (C-18) (4,6 x 250 mm) Vydac (The
Separations Group, Hesperia, CA, EE.UU.) y se establecieron
condiciones de elución en gradiente utilizando disolventes
acuosos/TFA y de acetonitrilo/TFA. Las fracciones correspondientes
a los picos glicados se reunieron, se llevaron a sequedad a vacío
utilizando un concentrador Speed-Vac AES 1000 (Life
Sciences Internacional, Runcom, RU) y se purificaron hasta
homogeneidad en una columna Supelcosil (C-8) (4,6 x
150 mm) (Supelco Inc., Poole, Dorset, RU).
Se incubaron GIP o
Tyr^{1}-sorbitol-GIP purificados
mediante HPLC a 37°C con DPP-IV (5 mU) durante
diversos periodos de tiempo en una mezcla de reacción enrasada
hasta 500 \mul con trietanolamina-HC1 50 mmol/l,
pH 7,8 (concentración peptídica final de 1 \mumol/l). Las
reacciones enzimáticas se terminaron tras 0, 2, 4 y 12 horas
mediante la adición de 5 \mul de TFA al 10%/agua (v/v). Las
muestras se enrasaron hasta un volumen final de 1,0 ml con TFA al
0,12% (v/v) y se almacenaron a -20°C antes del análisis mediante
HPLC.
Se incubó el plasma humano reunido (20 \mul)
extraído de seis sujetos humanos sanos en ayunas a 37°C con GIP o
Tyr^{1}-sorbitol-GIP (10 µg)
durante 0 y 4 horas en una mezcla de reacción enrasada hasta 500
\mul, que contenía tampón trietanolamina/HCl 50 mmol/l, pH 7,8.
También se realizaron incubaciones durante 4 horas en presencia de
diprotin A (5 mU). Las reacciones enzimáticas se terminaron
mediante la adición de 5 \mul de TFA y el volumen final se ajustó
a 1,0 ml utilizando TFA al 0,1%/agua, v/v. Las muestras se
centrifugaron (13.000 g, 5 min) y el sobrenadante se aplicó a un
cartucho Sep-Pak C-18 (Millipore
Waters), que previamente se había preparado y lavado con TFA al
0,1% /agua (v/v). Tras el lavado con 20 ml de TFA al 0,12%/agua, se
liberó el material unido a la columna mediante elución con 2 ml de
acetonitrilo al 80%/agua (v/v) y se concentró utilizando un
concentrador Speed-Vac (Runcorn, RU). El volumen se
ajustó a 1,0 ml con TFA al 0,12%/agua (v/v) antes de la
purificación mediante HPLC.
Se aplicaron muestras a una columna de poro ancho
Vydac C-18 equilibrada con TFA al 0,12%/ H_{2}O
(v/v) a una velocidad de flujo de 1,0 ml/min. Utilizando TFA al
0,1% (v/v) en acetonitrilo al 70%/H_{2}O, se elevó la
concentración de acetonitrilo en el disolvente de elución desde el
0% hasta el 31,5% durante 15 minutos, hasta el 38,5% durante 30
minutos y desde el 38,5% hasta el 70% durante 5 minutos, utilizando
gradientes lineales. Se monitorizó la absorbancia a 206 nm y se
evaluaron las áreas de pico utilizando un integrador modelo 2221
LKB. Las muestras recuperadas manualmente se concentraron
utilizando un concentrador Speed-Vac.
Se purificaron adicionalmente mediante HPLC
muestras para el análisis mediante EM-ESI que
contenían fragmentos intactos y de degradación de GIP (de las
incubaciones con DPP IV y plasma) así como
Tyr^{1}-sorbitol-GIP. Se
disolvieron los péptidos (aproximadamente 400 pmoles) en 100 \mul
de agua y se aplicaron al espectrómetro de masas LCQ montado sobre
la mesa de trabajo (Finnigan MAT, Hemel Hempstead, RU) dotado de
una columna para HPLC Microbore C-18 (150 x 2,0 mm,
Phenomenex, RU, Ltd, Macclesfield). Se inyectaron las muestras
(inyección en bucle ("loop") directa de 30 \mul) a una
velocidad de flujo de 0,2 ml/min, en condiciones isocráticas con
acetonitrilo al 35%/agua (v/v). Se obtuvieron y se registraron los
espectros de masas a partir del analizador de trampa iónica de
cuadrupolo. Se reunieron los espectros utilizando el modo de
barrido fónico total en el intervalo de masa con respecto a carga
(m/z) de 150 - 2000. Se determinaron las masas moleculares de GIP y
las estructuras relacionadas a partir de los perfiles de
EM-ESI, utilizando iones de carga múltiple
destacados y la siguiente ecuación M_{r} = iM_{i} - iM_{h}
(en la que M_{r} = masa molecular; M_{i} = razón m/z; i = número
de cargas; M_{h} = masa de un protón).
Se examinaron los efectos de GIP y
Tyr^{1}-sorbitol-GIP sobre las
concentraciones plasmáticas de glucosa e insulina utilizando ratas
Wistar macho de 10 - 12 semanas de edad. Los animales se alojaron
individualmente en una habitación climatizada y a 22 \pm 2°C con
un ciclo de 12 horas de luz/12 horas de oscuridad. Se suministraron
a voluntad agua potable y una dieta de mantenimiento de roedores
habitual (Trouw Nutrition, Belfast). Se retiró la comida durante un
periodo de 18 horas antes de la inyección intraperitoneal de
glucosa sola (18 mmoles/kg de peso corporal) o en combinación con
GIP o Tyr^{1}-sorbitol-GIP (10
nmoles/kg). Se administraron las disoluciones de prueba en un
volumen final de 8 ml/kg de peso corporal. Se recogieron muestras
de sangre, a los 0, 15, 30 y 60 minutos desde el corte de la punta
de la cola de las ratas conscientes, en tubos de microcentrífuga
con fluoruro/heparina enfriados (Sarstedt, Nümbrecht, Alemania). Se
centrifugaron las muestras utilizando una microcentrífuga Beckman
durante aproximadamente 30 segundos a 13.000 g. Las muestras de
plasma se dividieron en alícuotas y se almacenaron a -20°C antes de
las determinaciones de la glucosa y la insulina. Todos los estudios
animales se realizaron de acuerdo con el Acta para Animales
(procedimientos científicos) de 1986.
Análisis. Se ensayó la glucosa plasmática
mediante un procedimiento automatizado con glucosa oxidasa,
utilizando un analizador II de glucosa de Beckman [33]. Se
determinó la insulina plasmática mediante el radioinmunoensayo con
carbón-dextrano tal como se describió anteriormente
[34]. Se calcularon las áreas incrementales bajo las curvas de
glucosa e insulina plasmáticas (AUC) utilizando un programa
informático (CAREA) que emplea la regla trapezoidal [35] con resta
de la línea base. Los resultados se expresan como la media \pm EEM
(error estándar de la media) y se compararon los valores utilizando
una prueba de la t de Student para datos independientes. Se
consideró que los grupos de datos eran diferentes de manera
significativa si P < 0,05.
La figura 1 ilustra los perfiles de picos
obtenidos a partir de la separación mediante HPLC de los productos
obtenidos a partir de la incubación de GIP (figura 1a) o
Tyr^{1}-sorbitol-GIP (figura 1b)
con DPP IV durante 0, 2, 4 y 12 horas. Los tiempos de retención de
GIP y Tyr^{1}-sorbitol-GIP a t=0
fueron de 21,93 minutos y 21,75 minutos, respectivamente. La
degradación de GIP fue evidente tras 4 horas de incubación (54%
intacto) y en 12 horas la mayor parte (60% de GIP intacto) se
convirtió en el producto único con un tiempo de retención de 21,61
minutos. Tyr^{1}-sorbitol-GIP
permaneció casi completamente intacto en toda la incubación de 2 -
12 horas. La separación se hizo en una columna Vydac
C-18 utilizando gradientes lineales del 0% al 31,5%
de acetonitrilo durante 15 minutos, hasta el 38,5% durante 30
minutos y desde el 38,5 hasta el 70% durante 5 minutos.
La figura 2 muestra un conjunto de perfiles de
HPLC habituales de los productos obtenidos a partir de la
incubación de GIP o
Tyr^{1}-sorbitol-GIP con plasma
humano durante 0 y 4 h. El GIP (figura 2a) con un tiempo de
retención de 22,06 minutos se metabolizó rápidamente por el plasma
en un plazo de incubación de 4 horas, que dio lugar a la aparición
de un pico de degradación principal con un tiempo de retención de
21,74 minutos. Por el contrario, la incubación de
Tyr^{1}-sorbitol-GIP en
condiciones similares (figura 2b) no dio como resultado la
formación de ningún fragmento de degradación detectable durante
este tiempo, observándose sólo un único pico con un tiempo de
retención de 21,77 minutos. La adición de diprotin A, un inhibidor
específico de DPP IV, a GIP durante la incubación de 4 horas
inhibió por completo la degradación del péptido por el plasma. Se
indican los picos que corresponden a GIP intacto,
GIP(3-42) y
Tyr^{1}-sorbitol-GIP. Aparece un
pico principal que corresponde al tripéptido DPA, inhibidor
especifico de DPP IV, en los paneles inferiores con tiempo de
retención de 16 - 29 minutos.
La figura 3 muestra las masas moleculares
monoisotópicas obtenidas para GIP, (panel A),
Tyr^{1}-sorbitol-GIP (panel B) y
el principal fragmento de degradación plasmática de GIP (panel C)
utilizando EM-ESI. Los péptidos analizados se
purificaron de las incubaciones plasmáticas, tal como se muestra en
la figura 2. Los péptidos se disolvieron (aproximadamente 400
pmoles) en 100 \mul de agua y se aplicaron al CL/EM (cromatógrafo
de líquidos/espectrómetro de masas) dotado con una columna para
HPLC Microbore C-18. Se aplicaron las muestras
(inyección en bucle directa de 30 \mul) con una velocidad de
flujo de 0,2 ml/min, en condiciones isocráticas con acetonitrilo al
35%/agua. Se registraron los espectros de masas utilizando un
analizador de masas de trampa iónica de cuadrupolo. Se reunieron
los espectros utilizando el modo de barrido fónico total en el
intervalo de masa con respecto a carga (m/z) de 150 - 2000. Se
determinaron las masas moleculares (M_{r}) de GIP y las
estructuras relacionadas a partir de los perfiles de
EM-ESI, utilizando iones de carga múltiple
destacados y la siguiente ecuación M_{r} = iM_{i} - iM_{h}.
Se calcularon las masas moleculares (M_{r}) exactas utilizando la
ecuación M_{r} = iM_{i} - iM_{h}, tal como se define en
Diseño y métodos de la investigación. Tras realizarse el promedio
espectral, se detectaron las especies destacadas de carga
múltiple
(M+3H)^{3+} y (M+4H)^{4+} de GIP a m/z 1661,6 y 1246,8, que corresponden a 4981,8 de M_{r} intacto y 4983,2 Da, respectivamente (figura 3A). De manera similar, para Tyr^{1}-sorbitol-GIP se detectaron ((M+4H)^{4+} y (M+5H)^{5+}) a m/z 1287,7 y 1030,3, que corresponden a masas moleculares intactas de Mr 5146,8 y 5146,5 Da, respectivamente (figura 3B). La diferencia entre las masas moleculares observadas del GIP con carga cuádruple y la especie de GIP modificada en el extremo N-terminal (163,6 Da) indicó que este último péptido contenía un único aducto de sorbitol que correspondía a Tyr^{1}-sorbitol-GIP. La figura 3C muestra las especies destacadas con carga múltiple (M+3H)^{3+} y (M+4H)^{4+} detectadas a partir del fragmento principal de GIP a m/z 1583,8 y 1188,1, que corresponden a M_{r} intacto 4748,4 y 4748 Da, respectivamente (figura 3C). Esto corresponde a la masa teórica de la forma truncada en el extremo N-terminal del péptido GIP(3-42). Este fragmento también fue el principal producto de degradación de las incubaciones con DPP IV (datos no mostrados).
(M+3H)^{3+} y (M+4H)^{4+} de GIP a m/z 1661,6 y 1246,8, que corresponden a 4981,8 de M_{r} intacto y 4983,2 Da, respectivamente (figura 3A). De manera similar, para Tyr^{1}-sorbitol-GIP se detectaron ((M+4H)^{4+} y (M+5H)^{5+}) a m/z 1287,7 y 1030,3, que corresponden a masas moleculares intactas de Mr 5146,8 y 5146,5 Da, respectivamente (figura 3B). La diferencia entre las masas moleculares observadas del GIP con carga cuádruple y la especie de GIP modificada en el extremo N-terminal (163,6 Da) indicó que este último péptido contenía un único aducto de sorbitol que correspondía a Tyr^{1}-sorbitol-GIP. La figura 3C muestra las especies destacadas con carga múltiple (M+3H)^{3+} y (M+4H)^{4+} detectadas a partir del fragmento principal de GIP a m/z 1583,8 y 1188,1, que corresponden a M_{r} intacto 4748,4 y 4748 Da, respectivamente (figura 3C). Esto corresponde a la masa teórica de la forma truncada en el extremo N-terminal del péptido GIP(3-42). Este fragmento también fue el principal producto de degradación de las incubaciones con DPP IV (datos no mostrados).
Las figuras 4 y 5 muestran los efectos de la
glucosa intraperitoneal (i.p.) sola (18 mmol.kg) (grupo control) y
glucosa en combinación con GIP o
Tyr^{1}-sorbitol-GIP (10 nmol/kg)
sobre las concentraciones de glucosa e insulina plasmáticas.
(4A). Concentraciones de glucosa
plasmática tras glucosa i.p. sola (18 mmol.kg) (grupo control) y
glucosa en combinación con GIP o
Tyr^{1}-sorbitol-GIP (10
nmol/kg). El tiempo de inyección se indica mediante la flecha (0
min). (4B) Valores de AUC para la glucosa plasmática para 0 - 60
minutos tras la inyección. Los valores son la media \pm EEM para
seis ratas. **P < 0,01, ***P < 0,001 en comparación con GIP y
Tyr^{1}-sorbitol-GIP; tP <
0,05, \dagger\daggerP < 0,01 en comparación con GIP no
glicado.
(5A). Concentrados de insulina plasmática
tras glucosa i.p. sola (18 mmol/kg) (grupo control) o glucosa en
combinación con GIP o GIP glicado (10 nmol/kg). El tiempo de
inyección se indica mediante la flecha. (5B) Se calcularon los
valores de AUC para la insulina plasmática para cada uno de los 3
grupos hasta 90 minutos tras la inyección. El tiempo de inyección
se indica mediante la flecha (0 min). Valores de AUC para la
insulina plasmática 0 - 60 minutos tras la inyección. Los valores
son la media \pm EEM para seis ratas. *P < 0,05, **P < 0,001
en comparación con GIP y
Tyr^{1}-sorbitol-GIP; \daggerP
< 0,05, ttP < 0,01 en comparación con GIP no glicado.
En comparación con el grupo control, las
concentraciones de glucosa plasmática y el área bajo la curva (AUC)
fueron significativamente inferiores tras la administración de GIP
o Tyr^{1}-sorbitol-GIP (figuras
4A, B). Además, los valores individuales a los 15 y 30 minutos
junto con el AUC fueron significativamente inferiores tras la
administración de
Tyr^{1}-sorbitol-GIP en
comparación con GIP. En concordancia con las propiedades de
liberación de insulina establecidas, las concentraciones de
insulina plasmática de ambos grupos tratados con péptido se elevaron
significativamente a los 15 y 30 minutos en comparación con los
valores tras la administración de glucosa sola (figura 5A). Las
respuestas globales de insulina, estimadas como AUC, fueron también
significativamente superiores para los dos grupos tratados con
péptido (figura 5B). A pesar de las concentraciones imperantes de
glucosa inferiores a las del grupo tratado con GIP, la respuesta de
insulina plasmática, calculada como AUC, tras
Tyr^{1}-sorbitol-GIP fue
significativamente superior que tras GIP (figura 5B). La elevación
significativa de la insulina plasmática a los 30 minutos es de
particular interés, lo que sugiere que la acción de liberación de
insulina de Tyr^{1}-sorbitol-GIP
es más prolongada que en GIP, incluso ante un estímulo glucémico
disminuido (figuras 4A, 5A).
El GIP de cuarenta y dos aminoácidos es una
importante hormona incretina liberada a la circulación desde
células K endocrinas del duodeno y el yeyuno tras la ingestión de
alimentos. El alto grado de conservación estructural de GIP entre
las especies apoya la opinión de que este péptido desempeña un papel
importante en el metabolismo. La secreción de GIP se estimula
directamente por los nutrientes transportados activamente en el
lumen intestinal sin un estímulo notable de los nervios autónomos.
Los estimulantes más importantes de la liberación de GIP son
azúcares simples y ácidos grasos insaturados de cadena larga,
ejerciendo los aminoácidos efectos más débiles. Como con
tGLP-1, el efecto de liberación de insulina de GIP
es estrictamente dependiente de glucosa. Esto proporciona
protección frente a la hipoglucemia y satisface así una de las
características más deseables de cualquier fármaco antidiabético
actual o potencialmente nuevo.
Los presentes resultados demuestran por primera
vez que Tyr^{1}-sorbitol-GIP
presenta una profunda resistencia a la degradación sérica y por DPP
IV. Utilizando EM-ESI, el presente estudio mostró
que GIP nativo se escindía rápidamente in vitro para dar un
producto de degradación principal de 4748,4 Da, que corresponde a
GIP(3-42), lo que confirmó los hallazgos
anteriores utilizando espectrometría de masas por tiempo de vuelo
con ionización por desorción de matrices asistida por láser. La
degradación sérica se inhibió completamente mediante diprotin A
(Ile-Pro-Ile), un inhibidor
competitivo específico de DPP IV, confirmando a éste como la
principal enzima para la inactivación de GIP in vivo. Por el
contrario, Tyr^{1}-sorbitol-GIP
permaneció casi completamente intacto tras la incubación con suero o
DPP IV durante hasta 12 horas. Esto indica que la glicación de GIP
en el residuo de Tyr^{1} amino-terminal oculta el
sitio de escisión potencial de DPP IV y evita la eliminación del
dipéptido Tyr^{1}-Ala^{2} del extremo
N-terminal, evitando la formación de
GIP(3-42).
En concordancia con la protección in vitro
frente a DPP IV, la administración de
Tyr^{1}-sorbitol-GIP potenció
significativamente la actividad antihiperglucémica y la acción de
liberación de insulina del péptido cuando se administra con glucosa
a ratas. El GIP nativo aumentó la liberación de insulina y redujo
la fluctuación glucémica observada en muchos estudios anteriores.
Sin embargo, la glicación amino-terminal de GIP
aumentó las acciones de liberación de insulina y
antihiperglucémicas del péptido en un 62% y un 38%, respectivamente,
estimado a partir de las medidas de AUC. El análisis cinético
detallado es difícil debido a la limitación necesaria de los tiempos
de toma de muestras, pero las concentraciones superiores de
insulina tras
Tyr^{1}-sorbitol-GIP, a diferencia
de GIP, a los 30 minutos tras la inyección es indicativo de una
semivida más larga. El aumento glucémico fue moderado en ambos
grupos tratados con péptido y las concentraciones de glucosa tras la
inyección de Tyr^{1}-sorbitol-GIP
fueron sistemáticamente inferiores que tras la de GIP. Puesto que
las acciones insulinotrópicas son dependientes de glucosa, es
probable que la potencia relativa de liberación de insulina de
Tyr^{1}-sorbitol-GIP esté
sumamente subestimada en los presentes experimentos in
vivo.
Los estudios in vitro en el laboratorio de
los presentes inventores, que utilizan células B clonales que
responden a la glucosa, mostraron que la potencia de liberación de
insulina de Tyr^{1}-sorbitol-GIP
era varios órdenes de magnitud mayor que la de GIP y que su
eficacia era más sensible al cambio de las concentraciones de
glucosa dentro del intervalo fisiológico. Junto con las presentes
observaciones in vivo, esto sugiere que la glicación
N-terminal de GIP confiere resistencia a la
degradación por DPP IV mientras que potencia los efectos secretores
de insulina y de unión al receptor sobre la célula B. Estos
atributos de Tyr^{1}-sorbitol-GIP
se expresan por completo in vivo cuando la resistencia a DPP
IV impide la degradación del péptido a
GIP(3-42), prolongado así la semivida y
aumentando las concentraciones eficaces del péptido intacto,
biológicamente activo. Así es posible que GIP glicado esté
aumentando la secreción de insulina in vivo tanto con el
aumento de la potencia en el receptor así como mejorando la
resistencia a DPP IV. Así, numerosos estudios han mostrado que
GIP(3-42) y otros fragmentos modificados en
el extremo N-terminal, incluyendo
GIP(4-42) y GIP(17-42)
son débilmente eficaces o inactivos en estimular la liberación de
insulina. Además, existen pruebas de que las deleciones en el
extremo N-terminal de GIP dan como resultado
propiedades antagonistas del receptor en células de riñón de
hámster chino transfectadas con receptor de GIP [9], lo que sugiere
que la inhibición del catabolismo de GIP también reduciría el
posible antagonismo de retroalimentación al nivel del receptor
mediante el GIP(3-42) truncado.
Además de sus acciones insulinotrópicas, otras
varias acciones extrapancreáticas potencialmente importantes de GIP
pueden contribuir al aumento de la actividad antihiperglucémica y a
otros efectos metabólicos beneficiosos de
Tyr^{1}-sorbitol-GIP. Éstos
incluyen la estimulación de la captación de glucosa en los
adipocitos, el aumento de la síntesis de ácidos grasos y la
activación de la lipoproteína lipasa en el tejido adiposo. GIP
también promueve el aclaramiento plasmático de los triglicéridos en
respuesta a una carga oral grasa. En el hígado, GIP ha demostrado
aumentar la inhibición dependiente de insulina de la
glucogenolisis. GIP también reduce tanto la lipólisis estimulada
por glucagón en el tejido adiposo como la producción de glucosa
hepática. Finalmente, recientes hallazgos indican que GIP tiene un
potente efecto sobre la captación y el metabolismo de la glucosa en
el músculo del diafragma aislado de ratón. Esta última acción puede
compartirse con tGLP-1 y ambos péptidos tienen los
beneficios adicionales de estimular la secreción de somatostatina y
ralentizar el vaciado gástrico y la absorción de nutrientes.
En conclusión, el estudio ha demostrado por
primera vez que la glicación de GIP en el residuo de Tyr^{1}
amino-terminal limita el catabolismo de GIP a través
de la reducción de las acciones proteolíticas de las peptidasas
séricas y prolonga así su semivida in vivo. Este efecto
viene acompañado por un aumento de la actividad antihiperglucémica
y elevación de las concentraciones de insulina in vivo, lo
que sugiere que tales análogos resistentes a DPP IV deben
explorarse junto con tGLP-1 como agentes
terapéuticos potencialmente útiles para DMNID.
Tyr^{1}-sorbitol-GIP parece ser
particularmente interesante a este respecto puesto que tal
modificación amino-terminal de GIP aumenta, en
lugar de reducir, la potencia insulinotrópica dependiente de
glucosa, tal como se observó recientemente para
tGLP-1.
Este ejemplo considera la capacidad de
modificaciones estructurales adicionales en el extremo
N-terminal de GIP para evitar la inactivación por
DPP y en plasma y su aumento asociado tanto de la potencia de
liberación de insulina como del valor terapéutico potencial. Se
probaron GIP humano nativo, GIP glicado, GIP acetilado y varios
análogos de GIP con sustituciones de aminoácidos en el extremo
N-terminal.
Se obtuvo acetonitrilo de calidad para
cromatografía líquida de alta resolución (HPLC) de Rathburn
(Walkersburn, Escocia). Se obtuvo ácido trifluoroacético (TFA) de
calidad para secuenciación de Aldrich (Poole, Dorset, RU). Se
adquirió dipeptidil peptidasa IV a Sigma (Poole, Dorset, RU) y se
adquirió Diprotin A a Calbiochem Novabiochem (Beeston, Nottingham,
RU). Se adquirieron medio de cultivo tisular RPMI 1640, suero
bovino fetal, penicilina y estreptomicina, todos a Gibco (Paisley,
Strathclyde, RU). Toda el agua utilizada en estos experimentos se
purificó utilizando un sistema de purificación de agua
Milli-Q (Millipore Corporation, Milford, MA,
EE.UU.).
Todos los demás productos químicos utilizados
fueron de la mayor pureza disponible.
Se sintetizaron consecutivamente GIP,
GIP(Abu2), GIP(Sar2), GIP(Ser2),
GIP(Gly2) y GIP(Pro3) en un sintetizador automático
de péptidos de Applied Biosystems (modelo 432A) utilizando un
procedimiento habitual con Fmoc en fase sólida, partiendo de una
resina de Fmoc-Gln-Wang. Tras la
escisión de la resina con ácido trifluoroacético: agua, tioanisol,
etanoditiol (90 / 2,5 / 5 / 2,5, un volumen total de 20 ml/g de
resina), la resina se eliminó por filtración y se redujo el volumen
del filtrado a presión reducida. Se añadió lentamente dietil éter
seco hasta que se observó un precipitado. El precipitado se recogió
mediante centrifugación a baja velocidad, se resuspendió en dietil
éter y se centrifugó de nuevo, llevándose a cabo este procedimiento
al menos cinco veces. Entonces, los gránulos se secaron a vacío y
se evaluó si eran puros mediante HPLC de fase inversa en un sistema
de cromatografía Millenium 2010 de Waters (versión 2.1.5 del
software). Se prepararon GIP acetilado y glicado en el extremo
N-terminal mediante la modificación menor de un
método publicado.
Se llevó a cabo espectrometría de masas de
ionización por electrospray (EM-ESI) tal como se
describe en el ejemplo 2.
Se llevó a cabo la degradación de GIP y análogos
de GIP novedosos por DPP IV y plasma humano tal como se describe en
el ejemplo 2.
Se cultivaron células BRIN-BD11
[30] en matraces de cultivo tisular estériles (Corning, Glass
Works, RU) utilizando medio de cultivo tisular RPMI 1640 que
contenía un 10% (v/v) de suero bovino fetal, un 1% (v/v) de
antibióticos (penicilina 100 U/ml, estreptomicina 0,1 mg/ml) y
glucosa 11,1 mM. Las células se mantuvieron a 37°C en una atmósfera
de un 5% de CO_{2} y un 95% de aire, utilizando una incubadora de
LEEC (Laboratory Technical Engineering, Nottingham, RU).
Antes de la experimentación, se recogieron las
células de la superficie de los matraces de cultivo tisular con la
ayuda de tripsina/EDTA (Gibco), se sembraron en placas de 24
pocillos múltiples (Nunc, Roskilde, Dinamarca) con una densidad de
1,5 x 105 células por pocillo y se permitió que se unieran durante
la noche a 37°C. Las pruebas agudas para determinar la liberación
de insulina estuvieron precedidas por una incubación previa de 40
minutos a 37°C en 1,0 ml de tampón
Krebs-Ringer-bicarbonato (NaCl 115
mM, KC1 4,7 mM, CaCl_{2} 1,28 mM, KH_{2}PO_{4} 1,2 mM,
MgSO_{4} 1,2 mM, NaHCO_{3} 10 mM, albúmina sérica bovina 5 g/l,
pH 7,4) complementado con glucosa 1,1 mM. Se realizaron las
incubaciones de prueba (n = 12) en dos concentraciones de glucosa
(5,6 mM y 16,7 mM) con un intervalo de concentraciones (de
10^{-13} M a 10^{-8} M) de GIP o análogos de GIP. Tras 20
minutos de incubación, se retiró el tampón de cada pocillo y se
utilizaron alícuotas (200 \mul) para la medición de la insulina
mediante radioinmunoensayo [31].
Los resultados se expresan como la media \pm
E.E.M. y se compararon los valores utilizando la prueba de la t de
Student para datos independientes. Se consideró que los grupos de
datos eran diferentes de manera significativa si P < 0,05.
Se determinaron las masas moleculares
monoisotópicas de los péptidos utilizando EM-ESI.
Tras realizarse el promedio espectral, se detectaron las especies
destacadas de carga múltiple (M+3H)3+ y (M+4H)4+ para
cada péptido. Las masas moleculares calculadas confirmaron la
identidad estructural del GIP sintético y cada uno de los análogos
N-terminal.
Las figuras 6 - 11 ilustran los perfiles de picos
habituales obtenidos a partir de la separación mediante HPLC de los
productos de reacción obtenidos a partir de la incubación de GIP,
GIP(Abu2), GIP(Sar2), GIP(Ser2), GIP glicado y
GIP acetilado con DPP IV, durante 0, 2, 4, 8 y 24 horas. Los
resultados resumidos en la tabla 1 indican que GIP glicado, GIP
acetilado, GIP(Ser2) y GIP(Abu2) son más resistentes
que GIP nativo a la degradación in vitro con DPP IV. A partir
de estos datos, GIP(Sar2) parece que es menos
resistente.
Las figuras 12 - 16 muestran un conjunto
representativo de perfiles de HPLC obtenidos a partir de la
incubación de GIP y análogos de GIP con plasma humano durante 0, 2,
4, 8 y 24 h. También se realizaron observaciones tras incubación
durante 24 h en presencia de DPA. Estos resultados se resumen en la
tabla 2, son ampliamente comparables con las incubaciones con DPP
IV, pero las condiciones que reflejan más estrechamente las
condiciones in vivo son menos rigurosas enzimáticamente. GIP
se degradó rápidamente por el plasma. En comparación, todos los
análogos probados mostraron una resistencia a la degradación
plasmática, incluyendo GIP(Sar2) que a partir de los datos
con DPP IV parecía ser el menos resistente de los péptidos
probados. DPA inhibió sustancialmente la degradación de GIP y todos
los análogos probados con supresión completa de la degradación en
los casos de GIP(Abu2), GIP(Ser2) y GIP glicado. Esto
indica que DPP IV es un factor clave en la degradación in
vivo de GIP.
Las figuras 17 - 30 muestran los efectos de un
intervalo de concentraciones de GIP, GIP(Abu2),
GIP(Sar2), GIP(Ser2), GIP acetilado, GIP glicado,
GIP(Gly2) y GIP(Pro3) sobre la secreción de insulina
de las células BRIN-BD11 con glucosa 5,6 y 16,7
mM.
GIP nativo provocó una estimulación destacada y
relacionada con la dosis de la secreción de insulina.
En concordancia con los estudios previos [28], el
análogo de GIP glicado mostró una respuesta insulinotrópica
considerablemente superior en comparación con el péptido nativo.
GIP acetilado en el extremo N-terminal mostró un
patrón similar y el análogo de GIP(Ser2) también suscitó una
fuerte respuesta. A partir de estas pruebas, GIP(Gly2) y
GIP(Pro3) parecen ser los análogos menos potentes en cuanto
a la liberación de insulina. Otros análogos estables probados,
concretamente GIP(Abu2) y GIP(Sar2), mostraron un
patrón complejo en el grado de respuesta, dependiente de la
concentración de glucosa y de la dosis empleada. Por tanto,
concentraciones muy bajas fueron extremadamente potentes en
condiciones hiperglucémicas (glucosa 16,7 mM). Esto sugiere que
incluso estos análogos puede demostrar ser terapéuticamente útiles
en el tratamiento de la diabetes tipo 2, donde la capacidad
insulinotrópica combinada con la degradación in vivo dicta
la potencia del péptido.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Las tablas representan el porcentaje de péptido
intacto (es decir, GIP 1-42) con respecto al
principal producto de degradación GIP 3-42. Los
valores se tomaron de perfiles de HPLC realizados por triplicado y
se calcularon los valores de la media y el E.E.M. DPA es diprotin
A, un inhibidor específico de DPPIV.
Claims (11)
1. Análogo peptídico de
GIP(1-42) que comprende al menos 15 residuos
de aminoácido del extremo N-terminal de
GIP(1-42) que tiene al menos una sustitución
o modificación de aminoácido en la posición 1 - 3 y que no incluye
Tyr^{1}-sorbitol-GIP(1-42),
que es biológicamente activo.
2. Análogo peptídico según la reivindicación 1,
que incluye una modificación mediante la adición de ácido graso en
un grupo epsilon-amino de al menos un residuo de
lisina.
3. Análogo peptídico de
GIP(1-42) biológicamente activo, en el que el
análogo es
Tyr^{1}-sorbitol-GIP(1-42)
modificado mediante la adición de ácido graso en un grupo
epsilon-amino de al menos un residuo de lisina.
4. Análogo peptídico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que la sustitución o
modificación se elige del grupo que comprende sustituciones de
D-aminoácidos en las posiciones 1, 2 y 3 y/o
glicación, alquilación, acetilación o acilación en el extremo
N-terminal.
5. Análogo peptídico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el aminoácido en la posición
2 ó 3 se sustituye por lisina, serina, aminoácido
4-aminobutírico, Aib, D-alanina,
sarcosina o prolina.
6. Análogo peptídico según cualquiera de las
reivindicaciones anteriores, en el que el extremo
N-terminal se modifica mediante una del grupo de
modificaciones que incluye glicación, alquilación, acetilación o
mediante la adición de un grupo isopropilo.
7. Uso de un análogo peptídico según cualquiera
de las reivindicaciones anteriores, en la preparación de un
medicamento para el tratamiento de la diabetes.
8. Composición farmacéutica que incluye un
análogo según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 -
6.
9. Composición farmacéutica según la
reivindicación 8, en mezcla con un excipiente farmacéuticamente
aceptable.
10. Método de modificación del extremo
N-terminal de GIP o análogos peptídicos del mismo,
comprendiendo el método las etapas de sintetizar el péptido desde el
extremo C-terminal hasta el penúltimo aminoácido
del extremo N-terminal, añadir tirosina como una
resina de Tyr(tBu)-Wang protegida con
F-moc, desproteger el extremo
N-terminal de la tirosina y hacerla reaccionar con
un agente de modificación, permitir que la reacción avance hasta su
finalización, escindir la tirosina modificada de la resina de Wang
y añadir la tirosina modificada a la reacción de síntesis
peptídica.
11. Método según la reivindicación 10, en el que
el agente de modificación se elige del grupo que comprende glucosa,
anhídrido acético o ácido piroglutámico.
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