ES2224640T3 - Utilizacion de nucleotidos modificados en 5' en biologia molecular y en medicina. - Google Patents

Abstract

Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos, que comprende la incorporación de compuestos de la fórmula general (I): en la que: B significa una nucleobase, W y Z significan en cada caso OR1, SR1, N(R1)2 ó R1, representando R1 en cada caso, independientemente, en cada aparición, hidrógeno o un radical orgánico, X significa OR2, SR2 ó B(R2)3, significando R2 en cada caso, independientemente, hidrógeno, un catión, o un radical orgánico, Y significa NR3 ó S, representando R3 hidrógeno o un radical orgánico, y R significa hidrógeno, un catión, un radical orgánico o un grupo de fosfato o difosfato eventualmente modificado, en ácidos nucleicos y la subsiguiente disociación específica para un sitio de los ácidos nucleicos.

Description

Utilización de nucleótidos modificados en 5' en biología molecular y en medicina.

El invento se refiere a procedimientos para la incorporación en ácidos nucleicos de nucleótidos modificados en 5' y la subsiguiente disociación específica para un sitio de los ácidos nucleicos en los eslabones monoméricos modificados en 5'. Estos procedimientos se pueden emplear para la secuenciación de ácidos nucleicos, para la producción de bibliotecas de ácidos nucleicos o para la detección de mutaciones.

Los procedimientos aplicados hoy en día de manera rutinaria para la secuenciación de ácidos nucleicos implican, por regla general, la polimerización de una cadena de ácido nucleico complementaria con una matriz, y la producción de una mezcla de fragmentos de ácidos nucleicos con todas las longitudes posibles (1). La secuenciación de esta mezcla de fragmentos de ácidos nucleicos se puede efectuar por terminación de la polimerización o por descomposición mediante exonucleasas (2), por métodos iterativos de secuenciación (3), por adición de bases individuales y detección de la liberación de pirofosfato (4), por métodos químicos mediando utilización de reacciones de eliminación (5), por métodos químicos - enzimáticos mediando incorporación de nucleósidos modificados y disociación por ataque sobre nucleótidos modificados con fósforotioato o boro (6), o bien sobre nucleótidos modificados con amino en 5' (28,29), por incorporación de ribonucleósidos en un ADN y subsiguiente disociación en condiciones básicas (7) o mediante la incorporación de nucleótidos marcados cromáticamente en 3' con separación simultánea o posterior del colorante (8). Junto a estos métodos, están a disposición también unas estrategias, que implican una secuenciación por hibridación (9) y una producción física de fragmentos mediante espectrometría de masas (10). También se debatió una detección mediante microscopía de fuerza atómica (11).

En los últimos veinte años, el método preferido ha sido, no obstante, el método enzimático por interrupción de la cadena. Este método hace posible una automatización y una secuenciación con un alto caudal de paso para su aplicación en la secuenciación de genomas enteros. La automatización se conseguía mediante utilización de cebadores de colorantes (12), marcación interna (13) o terminadores colorantes (14). La secuenciación con cebadores de colorantes y la marcación interna tienen, no obstante, la desventaja de que aparecen unos procesos irregulares de terminación en el director de la secuencia, y pueden conducir a una interpretación errónea de los datos de una secuencia. Los terminadores colorantes tienen la desventaja de que en parte son incorporados en sitios erróneos y sólo hacen posible una limitada longitud de lectura, puesto que en su caso se trata de substratos modificados.

Además de esto, subsiste una necesidad de disminuir la cantidad de ADN que se necesita para una determinación de una secuencia. Para ello, actualmente sólo está a disposición un único método de secuenciación en ciclos (15), que, sin embargo, al contrario que una PCR (reacción en cadena de polimerasa), en donde tiene lugar una amplificación exponencial, sólo conduce a una amplificación lineal de los productos. El empleo de una amplificación por PCR de la muestra es posible en un procedimiento de secuenciación, que, mediando utilización de ácidos nucleicos modificados con boranos, prevé una formación enzimática de ácidos nucleicos y una subsiguiente degradación deliberada (30). La secuenciación directa de los productos de la PCR tiene, a su vez, desventajas, puesto que en los recipientes de reacción se presentan grandes cantidades de trifosfatos y moléculas de cebadores, que pueden conducir a un perjuicio de la reacción de secuenciación o de la determinación de la secuencia (16). La purificación de los productos de la PCR es, sin embargo, larga, e implica una etapa adicional de procedimiento. Ciertamente, los trifosfatos se pueden disociar por métodos enzimáticos (17), pero también esto requiere mucho tiempo y aumenta los costes para la realización de la reacción de secuenciación. Como alternativa está a disposición un procedimiento exponencial directo de amplificación y secuenciación (DEXAS) para la secuenciación de pequeñas cantidades de un material de ADN (18); este procedimiento no se pudo emplear hasta ahora para una secuenciación clásica y – al contrario de lo que indica su nombre - no es directamente exponencial.

De acuerdo con el presente invento, se pone a disposición un nuevo procedimiento de secuenciación de ácidos nucleicos, en el que se evitan, por lo menos parcialmente, las desventajas del estado de la técnica. Por medio de este procedimiento se evita en particular el problema de la especificidad para un substrato en lo que se refiere a los terminadores colorantes y se hace posible una rápida secuenciación de un ADN mediando utilización de unas cantidades muy pequeñas de un material de partida de ADN, en combinación con una reacción de amplificación de ácido nucleico, tal como por ejemplo una PCR. Por medio del procedimiento se mejora también la longitud legible de las matrices secuenciables.

El procedimiento de acuerdo con el invento para la detección de ácidos nucleicos comprende la incorporación de compuestos de la fórmula general (I):

1

en la que:

B

significa una nucleobase, es decir una base natural o no natural apropiada para la hibridación con cadenas complementarias de ácidos nucleicos, tal como ilustrativamente A, C, G, T, U, I, 7-desaza-G, 7-desaza-A, 5-metil-C, etc.,

W y Z

significan en cada caso OR^{1}, SR^{1}, N(R^{1})_{2} ó R^{1}, representando R^{1} en cada caso, independientemente, en cada aparición, hidrógeno o un radical orgánico, p.ej. un radical alquilo, alquenilo, hidroxialquilo, amino, o de éster, acetal o tioéster, de manera preferida con hasta 10 átomos de carbono y, de manera especialmente preferida, con hasta 6 átomos de carbono,

X

significa OR^{2}, SR^{2} ó B(R^{2})_{3}, significando R^{2} en cada caso, independientemente, hidrógeno, un catión, p.ej. un ion de un metal alcalino o de amonio, o un radical orgánico, p.ej. un colorante tal como ilustrativamente fluoresceína, rodamina, cianina y sus derivados,

Y

significa NR^{3} ó S, en particular NR^{3}, representando R^{3} hidrógeno o un radical orgánico, p.ej. un radical hidrocarbilo saturado o insaturado, en particular un radical de C_{1}-C_{4} o un radical de un colorante, habiéndose de entender por hidrógeno también los isótopos deuterio y tritio, y

R

significa hidrógeno, un catión, un radical orgánico o un grupo de fosfato o difosfato eventualmente modificado, en particular un grupo de difosfato,

en ácidos nucleicos, y la subsiguiente disociación específica para un sitio de los ácidos nucleicos, de manera preferida por hidrólisis del enlace P-Y, formándose unos fragmentos de ácidos nucleicos con un extremo HY-CH_{2}- en 5'.

El grupo R puede significar un radical orgánico, por ejemplo, un radical lipófilo, que facilita la penetración de la sustancia en una célula.

De manera preferida, R es un grupo de fosfato:

^{\ominus}O---

\melm{\delm{\para}{O ^{\ominus} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---

o un grupo de difosfato:

^{\ominus}O---

\melm{\delm{\para}{O ^{\ominus} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---O---

\melm{\delm{\para}{O ^{\ominus} }}{P}{\uelm{\dpara}{O}}

---

Este grupo de fosfato o difosfato puede estar modificado. Así, uno o varios átomos de oxígeno situados en los extremos pueden llevar sustituyentes, p.ej. radicales orgánicos. Por otra parte, uno o varios átomos de oxígeno situados en los extremos y - en el caso del grupo de difosfato - también el átomo de oxígeno de puente, pueden ser recambiados por grupos tales como S, NR^{3} o C(R^{3})_{2}, estando definido R^{3} tal como anteriormente. Además de esto, también 2 sustituyentes junto a los átomos de oxígeno situados en los extremos pueden estar unidos entre sí por un puente.

Cuando están presentes sustituyentes, éstos se encuentran de manera preferida junto a átomos de oxígeno del átomo de fósforo situado en cada caso en un extremo, de manera especialmente preferida junto al átomo de fósforo \gamma. Ejemplos de sustituyentes apropiados son radicales orgánicos, tales como ilustrativamente radicales alquilo, que por sí mismos pueden estar sustituidos, o un grupo salicilo, que puede formar con 2 átomos de oxígeno del fósforo situado en un extremo un diéster cíclico de 6 miembros. El núcleo aromático de los grupos salicilo puede por sí mismo llevar, a su vez, uno o varios sustituyentes adicionales, p.ej. los que se han definido como para R^{1}, o átomos de halógenos. Sustituyentes preferidos adicionalmente situados junto al átomo de oxígeno son radicales tales como alquilo C_{1}-C_{10}, -(CH_{2})_{n}-N_{3}, (CH_{2})_{n}N(R^{3})_{2} ó -(CH_{2})_{n}NHOCO(CH_{2})_{m}-N((R^{3})_{2}, siendo n y m unos números enteros de 1 a 8, de manera preferida de 2 a 5, y R^{3} está definido tal como anteriormente, pero además puede significar preferiblemente un radical aromático tal como ilustrativamente fenilo o dinitro-fenilo.

La incorporación de compuestos de la fórmula general (I) en ácidos nucleicos se efectúa de manera preferida por vía enzimática. No obstante, también es posible una síntesis química. Para una incorporación por vía enzimática se utilizan de manera preferida enzimas seleccionadas entre el conjunto que consta de polimerasas de ADN dependientes de ADN, polimerasas de ARN dependientes de ADN, polimerasas de ADN dependientes de ARN, polimerasas de ARN dependientes de ARN y transferasas terminales. Se prefiere en particular la polimerasa de ADN de T7, enzimas emparentadas, tales como ilustrativamente la polimerasa de ADN de T3 o de SP6, o modificaciones de estas enzimas. Correspondientemente, en el caso de los ácidos nucleicos, en los que se incorporan los compuestos de la fórmula (I), se puede tratar de ADN's o/y de ARN's, que pueden llevar eventualmente uno o varios eslabones adicionales de nucleótidos modificados.

Los ácidos nucleicos, que contienen como eslabones monoméricos por lo menos un compuesto de la fórmula general (I), pueden ser disociados de manera específica para un sitio junto al eslabón nucleotídico que contiene el enlace P-Y. Esta disociación específica para un sitio se puede efectuar, por ejemplo, junto al enlace P-Y propiamente dicho mediante aumento de la temperatura, p.ej. a por lo menos 37ºC, ajuste de condiciones ácidas, p.ej. a un
pH \leq 5, tratamiento con microondas, tratamiento con un láser, p.ej. con un láser de infrarrojos, o/y en la posición 3' del nucleótido que contiene el enlace P-Y, mediante una digestión enzimática, por ejemplo con exo- o endo-nucleasas o fosfodiesterasas, p.ej. con la fosfodiesterasa 3'\rightarrow5' de veneno de serpiente.

El procedimiento de acuerdo con el invento se puede llevar a cabo también en combinación con una reacción de amplificación, p.ej. con una PCR. Esto permite la utilización de unas cantidades extremadamente pequeñas de un material de partida de ADN para la producción de cadenas complementarias marcadas de ácidos nucleicos. De manera preferida, la amplificación de ácidos nucleicos se lleva a cabo con enzimas termoestables en varios ciclos.

La incorporación de los compuestos de acuerdo con (I) en los ácidos nucleicos se puede efectuar en solución. Alternativamente, la incorporación de los compuestos se puede efectuar, no obstante, también en ácidos nucleicos fijados a un soporte. Después de la síntesis, se puede efectuar entonces una liberación de los ácidos nucleicos con respecto del soporte, eventualmente mediante la disociación específica para un sitio del enlace P-Y o por medio de otros métodos.

Después de la disociación específica para un sitio de los ácidos nucleicos, se producen fragmentos de ácidos nucleicos, que tienen de manera preferida en su extremo 5' el grupo Y-CH_{2}- o/y en su extremo 3' un grupo fosfato. Hasta ahora, los ácidos nucleicos modificados de esta manera se tenían que producir de una complicada manera por medio de una síntesis química (19) o mediante reacciones enzimáticas (20,21). El procedimiento de acuerdo con el invento es esencialmente más rápido, más barato, y permite una manipulación más sencilla de los compuestos. Los ácidos nucleicos modificados, preparados de esta manera, se pueden utilizar para finalidades terapéuticas o/y para investigaciones de biología molecular, p.ej. para investigaciones de mecanismos de la recepción y del metabolismo de ácidos nucleicos en células, puesto que junto al grupo 5'-Y se puede acoplar de una manera sencilla un grupo de marcación. El grupo fosfato en 3' constituye, por su parte, un grupo protector frente a una ligación o/y a una elongación enzimática con polimerasas. Junto al extremo 3' fosforilado de los fragmentos de ácidos nucleicos se pueden adosar - siempre que se desee - grupos de marcación, p.ej. cuando se lleva a cabo una desfosforilación, y se adosan al grupo 3'-OH resultante por medio de una reacción enzimática, por ejemplo, oligonucleótidos marcados mediando utilización de una ligasa o una transferasa terminal, o didesoxi-nucleósido-trifosfatos marcados con una polimerasa, o cuando el grupo 3'-fosfato contiene un grupo reactivo, p.ej. un átomo de azufre.

Los fragmentos de ácidos nucleicos, producidos por medio del procedimiento de acuerdo con el invento, además, por causa del grupo definido situado en su extremo 5', se pueden inmovilizar de una manera sencilla sobre un soporte, que contiene una superficie funcionalizada, reactiva con el grupo Y. Por otra parte, se puede llevar a cabo también una fijación por adsorción a una superficie a través del grupo Y. Soportes apropiados son los que tienen superficies, por ejemplo, a base de un metal, vidrio, materiales cerámicos o/y un material sintético. Se prefieren especialmente los soportes con vidrio o/y superficies de silicio. Los soportes pueden tener, además, una forma arbitraria, p.ej. de micropartículas, tales como ilustrativamente micropartículas magnéticas o materiales semiconductores, tales como biochips, p.ej. chips de ADN o ARN, que pueden contener eventualmente varias superficies definidas, capaces de fijarse específicamente con ácidos nucleicos, en forma de disposiciones en conjuntos.

Los fragmentos de ácidos nucleicos, producidos por medio del procedimiento de acuerdo con el invento, se pueden acoplar a un soporte también en forma de una mezcla de diversos fragmentos. De esta manera, se producen unos soportes con fragmentos de ácidos nucleicos dispuestos de manera estadística sobre ellos. Esto tiene ventajas, cuando p.ej. se lleva a cabo una amplificación subsiguiente sobre la superficie del soporte con cebadores, que codifican una secuencia predeterminada de ácido nucleico, p.ej. un gen.

Cuando en el caso de la disociación de los ácidos nucleicos se forma una mezcla heterogénea de ácidos nucleicos, ésta se puede utilizar para la producción de una biblioteca de ácidos nucleicos, en particular una biblioteca estadística. Tales bibliotecas se pueden producir también mediante una incorporación estadística múltiple de compuestos de la fórmula (I) en una cadena de ácido nucleico, seguida por una disociación específica para un sitio. Además, para la producción de bibliotecas estadísticas de ácidos nucleicos se pueden emplear también cebadores degenerados y que se fijan de manera estadística a matrices de ácidos nucleicos.

Los fragmentos de la biblioteca de ácidos nucleicos se pueden recomponer de nuevo por vía combinatoria sin, o después de, un adicional tratamiento enzimático o químico (la barajadura de ADN, del inglés DNA-shuffling). Puesto que, en el caso de cada fragmento, el grupo extremo 5' está provisto de un grupo Y (con excepción del extremo 5' del primer fragmento), la recomposición de otros fragmentos se puede realizar solamente de tal manera que el primer fragmento original forme, por su parte, el primer fragmento. El espacio combinatorio completo se puede aprovechar después de un adicional tratamiento por vía enzimática o química de la biblioteca, o de fragmentos individuales de ella.

Los fragmentos de ácidos nucleicos, producidos mediante el procedimiento de acuerdo con el invento, se pueden someter a una reacción de detección, después de la disociación específica para un sitio. Esta reacción de detección se puede efectuar con métodos arbitrarios, conocidos para esta finalidad. De manera preferida, se llevan a cabo un análisis por espectrometría de masas o/y una electroforesis, p.ej. una electroforesis en gel de poli(acrilamida).

La reacción de detección se puede emplear, por ejemplo, para la detección de mutaciones, p.ej. de mutaciones puntuales en ácidos nucleicos. Seguidamente, se describen de manera detallada dos protocolos para el análisis de mutaciones puntuales.

Otra utilización importante del procedimiento de acuerdo con el invento consiste en la secuenciación de ácidos nucleicos. Tales procedimientos de secuenciación se pueden llevar a cabo en diversas variantes. Por ejemplo, el procedimiento de acuerdo con el invento es también apropiado para una secuenciación en "ciclos", en combinación con una amplificación de ácido nucleico, o/y para un análisis bidireccional de la secuencia en una cadena de ácido nucleico. A continuación, se describen detalladamente ejemplos preferidos de procedimientos de secuenciación.

Los compuestos de la fórmula (I) se pueden utilizar como partes componentes de estuches de reactivos para la detección de ácidos nucleicos, p.ej. como estuches de secuenciación o como estuches para el análisis de mutaciones, eventualmente con otros componentes de detección. Estos otros componentes de detección son, por ejemplo, enzimas, en particular polimerasas, tales como ilustrativamente polimerasas de ADN o transcriptasas inversas, oligonucleótidos utilizables como cebadores, que pueden llevar eventualmente una marcación en su extremo 5' o/y en su cadena lateral, desoxi-nucleósido-trifosfatos, que pueden llevar eventualmente una marcación, didesoxi-nucleósido-trifosfatos (moléculas para interrupción de cadena), que pueden llevar eventualmente una marcación, así como otros reactivos, p.ej. tampones, etc., y soportes sólidos. De manera preferida, los estuches de reactivos contienen los componentes indicados en las siguientes Figuras.

Además, el invento es explicado adicionalmente mediante las Figuras y los Ejemplos siguientes:

Allí muestran:

la Fig. 1 una representación esquemática de la síntesis de nucleósidos modificados con amino en 5';

la Fig. 2 una representación esquemática de la preparación de nucleósido- trifosfatos modificados con amino en 5'

la Fig. 3 la representación esquemática de la producción de fragmentos de ADN modificados con amino en 5' o/y fosforilados en 3' mediante una disociación específica para un sitio del enlace P-N en el caso de los 5'-amino-nucleósido-trifosfatos incorporados;

la Fig. 4 la representación esquemática de una marcación selectiva en 5' o 3' de fragmentos de ácidos nucleicos;

la Fig. 5 la representación esquemática de la separación de ácidos nucleicos desde soportes sólidos;

la Fig. 6 la representación esquemática de un protocolo de secuenciación mediando utilización de un cebador de secuenciación marcado con un colorante en 5';

la Fig. 7 un procedimiento alternativo para la producción de fragmentos secuenciables mediante digestión con una exonucleasa;

la Fig. 8 la representación esquemática de un método iterativo de secuenciación, sin electroforesis;

la Fig. 9 la representación esquemática de un método bidireccional de secuenciación en una única cadena de ácido nucleico;

la Fig. 10 la marcación de los fragmentos de ácidos nucleicos después de la reacción de secuenciación por medio de una transferasa terminal;

la Fig. 11 una primera forma de realización para la detección de mutaciones puntuales;

la Fig. 12 una segunda forma de realización para la detección de mutaciones puntuales, y

la Fig. 13 la producción de una biblioteca de ADN.

En las Figuras 1a y b se muestran procedimientos para la preparación de compuestos de la fórmula (I), en la que Y representa un grupo amino. La Figura 1a muestra un esquema para la preparación de nucleósidos de 5'-amino-2',5'-didesoxi-purina. Para ello, se bloquean los grupos amino de la nucleobase mediante una reacción con grupos protectores, p.ej. mediante una sililación con cloruro de trimetil-sililo, y una subsiguiente introducción de un grupo protector Bz ó Ibu. Luego se activa el grupo 5'-OH, p.ej. mediante reacción con cloruro de tosilo, de tal manera que éste pueda reaccionar con un aziduro de metal alcalino, p.ej. LiN_{3}. Después de haber separado los grupos protectores, p.ej. con una mezcla de NH_{3} y MeOH, el grupo protector se puede transformar por reducción, p.ej. con H_{2}/ PtO_{2}, en un grupo amino.

En la Figura 1b se representa un correspondiente esquema de síntesis para la preparación de nucleósidos de 5'-amino-2'-5'-didesoxi-pirimidina. La timidina se puede hacer reaccionar, por ejemplo, directamente con una sal aziduro, p.ej. NaN_{3}, y a continuación, el grupo azido se puede transformar por reducción en un grupo amino. En el caso de la citidina, se bloquea primeramente la nucleobase mediante un grupo protector, p.ej. Bz, y a continuación se introduce, de una manera análoga a como en el caso de la timidina, un grupo azido, que se puede transformar por reducción en un grupo amino.

En la Figura 2 se muestra un esquema de síntesis para la preparación de 5'-amino-2',5'-didesoxi-nucleósido-5'-trifosfatos, con el que de una manera sencilla se puede adosar un grupo trifosfato a los nucleósidos obtenidos de acuerdo con la Fig.1. Los 5'-amino-nucleósido-trifosfatos preparados de esta manera se pueden utilizar como eslabones monoméricos para su incorporación en ácidos nucleicos.

En el Ejemplo 1 se encuentran datos detallados acerca de la realización de estas reacciones.

La Figura 3 muestra la producción de fragmentos modificados de ADN, que contienen un eslabón de 5'-amino-T, y la subsiguiente disociación de estos fragmentos de ADN en el enlace P-N, obteniéndose fragmentos de ADN fosforilados en 3' o/y modificados con amino en 5'.

La Figura 4 muestra ejemplos de una marcación selectiva en 5' y 3' de los fragmentos de ácidos nucleicos producidos por la disociación

La Figura 5 muestra la síntesis de moléculas de ADN que contienen eslabones de 5'-amino-nucleótidos en presencia de un soporte sólido, y la subsiguiente liberación de los fragmentos de ADN modificados con amino en 5' mediante disociación del enlace P-N.

La Figura 6 muestra una representación esquemática de una forma de realización del procedimiento de secuenciación con amino en 5'. De acuerdo con la forma de realización mostrada, se utiliza un cebador que lleva junto al extremo 5' un grupo de marcación, que es prolongado mediante una polimerización enzimática, introduciéndose en la cadena de ácido nucleico, en posiciones estadísticas, nucleótidos modificados con amino en 5'. Los nucleótidos modificados son aceptados como substratos por polimerasas de ADN, p.ej. por la polimerasa de ADN de T7. Los enlaces P-N están distribuidos de una manera estadística a lo largo de la cadena de ácido nucleico y se pueden disociar de una manera sencilla, p.ej. mediante pirólisis, unas condiciones ácidas o/y mediante un tratamiento con microondas, resultando una mezcla de fragmentos de ácidos nucleicos. Cada uno de estos fragmentos lleva en su extremo 3' un grupo de fosfato, con lo que se evitan modificaciones de la movilidad en el caso de una electroforesis en gel. Al efectuar la incorporación de compuestos de la fórmula (I), en los que X significa un grupo detectable, p.ej. un grupo de colorante, después de la disociación se obtienen unos fragmentos de ácidos nucleicos, que presentan una marcación junto a su nucleótido situado en 3'.

También para una secuenciación en "ciclos" se pueden emplear los nucleótidos modificados. Mediando utilización de polimerasas termoestables, es posible amplificar primeramente la matriz de ADN, por ejemplo mediante una PCR, e incorporar luego los nucleótidos modificados a 37ºC con la polimerasa de ADN de T7. La disociación se efectúa entonces directamente en el recipiente de reacción mediante un sencillo calentamiento a, por ejemplo, 95ºC. Alternativamente, la incorporación de los nucleótidos modificados se puede efectuar ya durante la amplificación propiamente dicha mediante una polimerasa termoestable.

Después de la disociación, la mezcla de reacción, o una parte de ésta, se somete a una reacción de detección, p.ej. mediante una electroforesis en gel. De esta manera, se evitan problemas en lo que se refiere a la especificidad para un substrato en el caso de moléculas para interrupción de cadena, marcadas con un colorante. En comparación con los métodos químicos - enzimáticos disponibles hasta ahora, p.ej. mediante incorporación de \alpha-tionucleótidos, el procedimiento de acuerdo con el invento permite una disociación más sencilla de las cadenas de ácidos nucleicos que se han producido, sin que se tengan que utilizar agentes químicos agresivos, que podrían atacar al grupo de marcación del cebador o bien al enlace glicosídico. Mediante el procedimiento de acuerdo con el invento se pueden disminuir los costes de los protocolos de secuenciación existentes, puesto que los trifosfatos se pueden preparar de una manera muy sencilla, p.ej. por el propio usuario, directamente antes de la secuenciación. El procedimiento es rápido, sencillo y funciona incluso con una cantidad muy pequeña de un material de partida de ADN.

La Figura 7 muestra un método alternativo para la producción de fragmentos de ácidos nucleicos secuenciables mediante digestión con una exonucleasa 3'\rightarrow5', p.ej. una fosfodiesterasa de veneno de serpiente.

La Figura 8 muestra un ejemplo de un método iterativo de secuenciación sin electroforesis o/y sin gel. En este caso, se utilizan desoxi-nucleósido-trifosfatos modificados con amino en 5', llevando cada nucleótido un grupo de marcación diferente. Por medio de la polimerasa de ADN se adosa al cebador un único nucleósido modificado con amino, marcado con un colorante, y seguidamente éste se separa de nuevo específicamente junto al enlace P-N. El tipo del nucleótido adosado se puede identificar por medio del grupo de marcación que se ha detectado. A continuación, el nucleótido identificado en una forma no modificada se puede adosar por medio de la polimerasa y se repite la etapa de secuenciación descrita anteriormente. Se puede detectar una incorporación múltiple del mismo nucleótido por medio de la intensidad de la marcación, p.ej. una marcación por fluorescencia.

La Figura 9 muestra un protocolo de secuenciación bidireccional dentro de una única cadena de ácido nucleico. Para esto, nucleósidos marcados con amino en 5', tal como se han descrito anteriormente, se incorporan en cadenas de ácidos nucleicos. La terminación de la elongación se efectúa mediante adición de moléculas para interrupción de cadena, p.ej. ddNTPs. Mediante disociaciones (cortes) por restricción se pueden producir entonces extremos 3' definidos de las cadenas de ácidos nucleicos. Por adición de una molécula para interrupción de cadena provista de un segundo grupo de marcación, p.ej. de un ddNTP, y de una transferasa terminal, se obtienen unas cadenas de ácidos nucleicos, que en su extremo 5' o 3' llevan en cada caso dos grupos, de manera preferida diferentes, de marcación. Después de la disociación de los enlaces P-N se obtienen dos conjuntos de fragmentos de ADN marcados diferentemente, que son detectables uno junto a otro en una única reacción de secuenciación.

La Figura 10 muestra una introducción de grupos de marcación en el terminal 3'. Para esto, se preparan primeramente por polimerización, mediando utilización de amino-trifosfatos, unas cadenas de ácidos nucleicos, que son disociadas seguidamente en el enlace P-N. Los resultantes fragmentos de ácidos nucleicos con grupos 3'-fosfato, son desfosforilados y marcados por adición de una molécula para interrupción de la cadena, que lleva un grupo de marcación, p.ej. un 5'-amino-ddNTP, y de una transferasa terminal. De esta manera se puede llevar a cabo una reacción de secuenciación en ausencia de cualquier tipo de grupos de marcación. La incorporación de los grupos de marcación en los fragmentos de ADN, que se han de secuenciar, se efectúa tan sólo después de haberse terminado la reacción de secuenciación. De esta manera se evitan problemas en lo que se refiere a la especificidad de polimerasas para un substrato, y se consigue una disminución de los costes, puesto que es superflua la utilización de moléculas de cebadores marcados.

La Figura 11 muestra una primera forma de realización para la detección de mutaciones puntuales. En este caso, se utiliza un cebador de ácidos nucleicos, cuyo extremo 3' se encuentra directamente "corriente arriba" del sitio potencial de mutación. Mediante adición de un nucleósido-trifosfato modificado con amino en 5', provisto de un grupo de marcación, en presencia de una polimerasa, se efectúa una elongación del cebador en por lo menos un nucleótido, siempre y cuando que en la cadena de la matriz se presente el nucleótido complementario al nucleósido-trifosfato modificado, que en cada caso se utiliza. La incorporación del nucleótido marcado, modificado con amino, en la cadena de ADN, o la ausencia de esta incorporación, se puede detectar de una manera sencilla por métodos conocidos. Para esto, el nucleótido no incorporado se puede eliminar, p.ej. mediante una centrifugación o - en el caso de la fijación a una fase sólida - mediante lavado, y luego se puede efectuar la detección de la marcación en una forma fijada al cebador o/y después de la disociación.

La Figura 12 muestra otra forma de realización para la detección de mutaciones puntuales. Para esto se utiliza un cebador fijado a un soporte, que lleva un grupo interno de marcación. Entonces se añaden un nucleósido-trifosfato modificado con amino en 5' y una polimerasa. En el caso de la presencia de una determinada nucleobase en la cadena de la matriz, se efectúa una elongación del cebador, por lo demás no se adosa al cebador ningún 5'-amino-nucleósido-trifosfato. La tanda de reacción se trata seguidamente con una exonucleasa 3'\rightarrow5. Después de haber adosado al cebador el nucleótido modificado con amino en 5', no tiene lugar por causa del enlace P-N ninguna degradación enzimática mediante la exonucleasa, y el grupo de marcación incorporado en el cebador permanece inmovilizado junto al soporte sólido. Cuando, por el contrario, no se adosa ningún nucleósido-trifosfato modificado con amino en 5' al cebador, éste es degradado por la exonucleasa, y la marcación es separada desde el soporte sólido. La permanencia de la marcación junto al soporte, o su liberación, se pueden detectar sin problemas por métodos
conocidos.

La Figura 13 muestra la producción de una biblioteca de ADN a través de una incorporación múltiple de 5'-amino-desoxi-nucleósido-trifosfatos en fragmentos de ADN. Mediante una disociación de los enlaces P-N se produce un gran número de diferentes fragmentos de ADN, que o bien pueden ser fijados a un soporte, o se pueden analizar, por ejemplo, mediante una espectrometría de masas.

Ejemplos 1. Síntesis de nucleósidos modificados

La síntesis de nucleósidos modificados se llevó a cabo apoyándose en la cita de Mag y colaboradores (25). El 5'-amino-5'-desoxi-timidina-5'-trifosfato y el 5'-amino-2',5'-didesoxi-citidina-5'-trifosfato se sintetizaron de acuerdo con Yamamoto y colaboradores (26) mediante una sustitución del grupo 5'-hidroxilo por un grupo azido, seguida por una reducción catalítica para dar la correspondiente amina. Los correspondientes derivados de guanosina y adenosina se prepararon mediante tosilación del grupo 5'-hidroxilo y sustitución del grupo tosilo con aziduro de litio, para evitar las reacciones de ciclización en N^{1}-C^{5}. Los compuestos de azida de purina se redujeron asimismo mediante hidrogenación catalítica. Después de haber separado los grupos protectores, los nucleósidos se trifosforilaron, de acuerdo con el método descrito por Letsinger y colaboradores (27), con trimetafosfato de trisodio.

1.1 N^{4}-Benzoíl-2'-desoxi-citidina

1 equivalente de 2'-desoxi-citidina se disolvió en piridina anhidra. A esto se añadieron 5 equivalentes de trimetil-cloro-silano a la temperatura ambiente. La mezcla de reacción se agitó durante 30 min, se enfrió a 0ºC, y se mezcló gota a gota con 1,2 equivalentes de cloruro de benzoílo. La mezcla se agitó primeramente durante 30 min y luego durante dos horas más a la temperatura ambiente. La reacción se interrumpió por adición de 10 ml de agua fría a 0ºC. Después de 20 min, se eliminó el disolvente bajo vacío. El residuo remanente se disolvió en agua caliente y se lavó tres veces con acetato de etilo. La fase acuosa se enfrió a 4ºC y los cristales resultantes se obtuvieron por filtración y lavado con agua fría. El producto se secó a 50ºC sobre P_{2}O_{5} en vacío hasta obtener un peso constante.

La N^{6}-benzoíl-2'-desoxi-adenosina y la N^{2}-isobutiril-2'-desoxi-guanosina se prepararon según la misma prescripción.

1.2 5'-Azido-desoxi-timidina

7,26 g (30 mmol) de timidina, 9,45 g (36 mmol) de trifenil-fosfina, 5,85 g (90 mmol) de aziduro de sodio y 11,94 g (36 mmol) de tetrabromometano se disolvieron en 120 ml de dimetil-formamida seca, y se agitaron durante 24 h a la temperatura ambiente. La mezcla se lavó con 150 ml de hidrógeno-carbonato de sodio y la fase acuosa se extrajo con cuatro veces 200 ml de cloroformo. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio y el disolvente se eliminó en vacío. El producto bruto obtenido se purificó mediante cromatografía en gel de sílice con un gradiente de 0 a 10% de metanol en diclorometano. El rendimiento fue de aproximadamente 76% (6,09 g).

Análisis

DC (cromatografía de capa fina):

\hskip0,5cm

R_{f:}

\hskip0,5cm

0,40 (mezcla de cloroformo y metanol = 9:1; gel de sílice 60, F_{264}, de Merck)

IR (infrarrojos):

\hskip0,5cm

\nu_{as}(N_{3}) = 2.093,7 cm^{-1} (s, KBr)

RMN (resonancia magnética nuclear): \delta-^{1}H[ppm], 270 MHz, 300 K, DMSO-d_{6}:

11,30 (s, 1H, N^{3}H); 7,47 (s, 1H, H^{6}); 6,18 (t, 1H, H^{1}); 5,39 (d, 1H, O^{3'}H);

4,22 (m, 1H, H^{3'}); 3,85 (m, 1H, H^{4'}); 3,55 (d, 2H, H^{5'1}, H^{5'2}); 2,29 (m, 1H, H^{2'2});

2,08 (m, 1H, H^{2'1}); 1,79 (d, 3H, C^{5}-CH_{3})

Análisis elemental

calculado:	C: 44,94%	H: 4,90%	N: 26,21%
encontrado:	C: 44,77%	H: 4,86%	N: 25,93%

La 5'-azido-N^{4}-benzoíl-2',5'-didesoxi-citidina se preparó según la misma prescripción.

1.3 5'-Azido-2',5'-didesoxi-citidina

La 5'-Azido-N^{4}-benzoíl-2',5'-didesoxi-citidina se disolvió en una solución saturada de amoníaco en metanol y se agitó a la temperatura ambiente durante 12 h. Luego se eliminó el disolvente en vacío y el residuo se purificó por cromatografía mediando utilización de diclorometano con un gradiente de 0 a 15% de metanol como agente de elución.

1.4 5'-O-(4-metil-bencenosulfona)-N^{6}-benzoíl-2'-desoxi-adenosina y 5'-O-(4-metil-bencenosulfona)-N^{2}-isobutiril-2'-desoxi-guanosina

En cada caso 1 equivalente de N^{6}-benzoíl-2'-desoxi-adenosina y de N^{2}-isobutiril-2'-desoxi-guanosina se disolvieron en piridina seca. A esto se añadieron a la temperatura ambiente 3 equivalentes de cloruro de 4-metil-benceno-sulfonilo. La mezcla de reacción se agitó durante 45 min, luego se enfrió sobre hielo y se enfrió rápidamente con 5 ml de agua. Después de 15 min, la solución se concentró por evaporación y el residuo oleoso se recogió en acetato de etilo. La solución se lavó dos veces con NaHCO_{3} al 5%, con agua y con una solución salina saturada, se secó sobre sulfato de sodio y se concentró por evaporación en vacío. El residuo se purificó por cromatografía mediando utilización de un gradiente de 0 a 10% de metanol en diclorometano como agente de elución.

1.5 5'-Azido-2',5'-didesoxi-adenosina y 5'-azido-2',5'-didesoxi-guanosina

En cada caso 1 equivalente de los compuestos preparados en el Ejemplo 1.4 se recogieron en N,N-dimetil-formamida seca y se mezclaron con cinco equivalentes de aziduro de litio. La solución se agitó durante 5 h a 50ºC. Luego se añadió el volumen quíntuplo de diclorometano y se lavó tres veces con agua. La fase orgánica se secó con sulfato de sodio, se separó por filtración y el disolvente se eliminó. La separación de los grupos protectores y la purificación de los productos brutos se efectuó tal como en el caso de la preparación de 5'-azido-2',5'-didesoxi-citidina.

1.6 5'-Amino-5'-desoxi-timidina

150 ml de metanol absoluto se desgasificaron por cinco operaciones de congelación y descongelación en vacío. En éste se disolvieron 1,5 g (5,62 mmol) de 5'-azido-5'-desoxi-timidina y se añadió una pequeña cantidad de un catalizador de hidrato de dióxido de platino. Se introdujo hidrógeno gaseoso en la solución, y la mezcla se agitó durante 2 h a la temperatura ambiente. Después de haber filtrado a través de Celite, se eliminó el disolvente. No fue necesaria ninguna purificación adicional. El rendimiento era casi cuantitativo.

Análisis

DC:	R_{f:}	0,05 (en una mezcla de diclorometano y metanol = 9:1; gel de sílice 60, F_{264}, de Merck)
IR:	\nu_{as}(N_{3}) = no está presente (según KBr)

RMN: \delta-^{1}H[ppm], 270 MHz, 300 K, DMSO-d_{6}:

7,63 (s, 1H, H^{6}); 6,15 (t, 1H, H^{1}); 5,15 (d, 1H, O^{3}H); 4,21 (m, 1H, H^{3'}); 3,65 (m, 1H, H^{4'}); 2,73 (d, 2H, H^{5'1}, H^{5'2}); 1,95-2,15 (m, 2H, H^{2'1}, H^{2'2}); 1,79 (d, 3H, C^{5}-CH_{3})

Espectrometría de masas: ESI (+)	calculado:	242,2 Da
	encontrado:	242,1 Da

(ESI = ionización por proyección de electrones)

La 5'-Amino-2',5'-didesoxi-citidina, la 5'-amino-2',5'-didesoxi-adenosina y la 5'-amino-2',5'-didesoxi-guanosina se prepararon según la misma prescripción.

1.7 5'-Amino-5'-desoxi-timidina-5'-trifosfato

2 mg (1 equivalente) de 5'-amino-5'-desoxi-timidina y 13,4 mg (5 equivalentes) de trimetafosfato de trisodio se disolvieron en 100 \mul de agua estéril (a pH 8,50), se agitaron durante 30 h a la temperatura ambiente y luego se conservaron a -80ºC. Para los experimentos de secuenciación se extrajo desde la mezcla de reacción una parte alícuota directamente, sin más purificación.

El 5'-amino-2',5'-didesoxi-citidina-5'-trifosfato, el 5'-amino-2',5'-didesoxi-adenosina-5'-trifosfato y el 5'-amino-2',5'-didesoxi-guanosina-5'-trifosfato se prepararon según la misma prescripción de síntesis.

Análisis

Espectrometría de masas: ESI(-):
5'-Amino-2',5'-didesoxi-adenosina-5'-trifosfato
calculado:	490,199 Da
encontrado:	488,8 Da (M-H);
	510,9 Da (M-2H+Na);
	532,7 Da (M-2H+2Na)

\newpage

5'-Amino-2',5'-didesoxi-citidina-5'-trifosfato
calculado:	466,173 Da
encontrado:	464,8 Da (M-H);
	486,8 Da (M-2H+Na)

5'-Amino-2',5'-didesoxi-guanosina-5'-trifosfato
calculado:	506,198 Da
encontrado:	504,8 Da (M-H);
	526,8 Da (M-2H+Na);
	548,7 Da (M-3H+2Na)

5'-Amino-5'-desoxi-timidina-5'-trifosfato
calculado:	481,184 Da
encontrado:	479,9 Da (M-H);
	480,6 Da (M);
	501,8 Da (M-2H+Na);
	523,8 Da (M-3H+2Na)

2. Reacción de secuenciación

La realización de la reacción de secuenciación se llevó a cabo en el ejemplo de la huella de T. La reacción de secuenciación para las huellas de A, C y G se puede efectuar de una manera análoga.

Por cada tanda se reunieron 0,3 \mul de un cebador, p.ej. un cebador universal o un cebador inverso (marcado con isotiocianato de fluoresceína; 2 \muM), 0,3 \mul de DMSO, 1,2 \mul de ss-M13 MP18 (+) ADN y 0,6 ml de tampón de reanillamiento (Tris-HCl 1 M, pH 7,6; MgCl_{2} 100 mM). La solución se incubó durante 3 min a 70ºC y se enfrió a la temperatura ambiente durante un período de tiempo de 20 min.

A esta solución se le añadieron 0,60 \mul de una mezcla de dNTP's (en cada caso 250 \muM de dATP, dCTP y dGTP, así como 50 \muM de dTTP), 0,44 \mul de 5'-amino-dTTP (procedente de la mezcla de reacción del Ejemplo 1.7) y 0,25 \mul de la polimerasa de T7 (8 U/\mul) y se incubó durante 10 min a 37ºC. Para las huellas de A, C y G se utilizaron correspondientemente 5'-amino-dATP, 5'-amino-dCTP o 5'-amino-dGTP.

A continuación, se añadieron 4 ml de una solución para interrupción (95% de formamida desionizada, EDTA 20 mM, 0,05% de xileno-cianol; 0,05% de azul de bromofenol).

Para la preparación de una mezcla secuenciable de fragmentos de ácidos nucleicos, se disociaron los enlaces P-N. Para esto, están a disposición los siguientes métodos alternativos:

1. Disociación mediante aumento de la temperatura

Calentamiento a 95ºC durante 40 minutos (también es posible un calentamiento durante 20 minutos)

2. Disociación en condiciones ácidas

Adición de 2 a 5 \mul de HCl 1 N, incubación durante cinco minutos a la temperatura ambiente, neutralización con 2 a 5 \mul de NaOH 1 N, desnaturalización durante cinco minutos a 95ºC

3. Disociación mediante microondas

Tratamiento de la muestra con radiación de microondas durante 30 min a 900 W.

Alternativamente a esto, se pueden utilizar también métodos enzimáticos de disociación por medio de exo- o endo-nucleasas, en particular por exonucleasas 3'\rightarrow5', tales como ilustrativamente una fosfodiesterasa 3'\rightarrow5' de veneno de serpiente. Para esto, se añaden 10 mU (3,2 \mul) de una fosfodiesterasa 3'\rightarrow5' de veneno de serpiente, se incuba durante 10 min a 40ºC y se desnaturaliza durante 5 min a 95ºC.

A continuación, se analizó la mezcla de fragmentos, p.ej. mediante una electroforesis en gel de poli(acrilamida). Para esto, se cargaron sobre el gel 5 \mul de la tanda de reacción. Alternativamente, la tanda de reacción se puede conservar a -20ºC y luego se puede desnaturalizar, antes de su aplicación sobre el gel, durante 30 min a
95ºC.

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(30)

Documento WO-A-95/06.752

Claims (22)

1. Procedimiento para la detección de ácidos nucleicos, que comprende la incorporación de compuestos de la fórmula general (I):

2

en la que:

B

significa una nucleobase,

W y Z

significan en cada caso OR^{1}, SR^{1}, N(R^{1})_{2} ó R^{1},

\quad

representando R^{1} en cada caso, independientemente, en cada aparición, hidrógeno o un radical orgánico,

X

significa OR^{2}, SR^{2} ó B(R^{2})_{3},

\quad

significando R^{2} en cada caso, independientemente, hidrógeno, un catión, o un radical orgánico,

Y

significa NR^{3} ó S, representando R^{3} hidrógeno o un radical orgánico, y

R

significa hidrógeno, un catión, un radical orgánico o un grupo de fosfato o difosfato eventualmente modificado,

en ácidos nucleicos y la subsiguiente disociación específica para un sitio de los ácidos nucleicos.

2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1,

caracterizado porque

la incorporación se efectúa por vía enzimática.

3. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2,

caracterizado porque

la enzima se selecciona entre el grupo que consta de polimerasas de ADN dependientes de ADN, polimerasas de ARN dependientes de ADN, polimerasas de ADN dependientes de ARN, polimerasas de ARN dependientes de ARN y transferasas terminales.

4. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 3,

caracterizado porque

la disociación específica para un sitio se efectúa mediante:

(i)

aumento de la temperatura,

(ii)

ajuste de unas condiciones ácidas,

(iii)

tratamiento con microondas,

(iv)

tratamiento con un láser o/y

(v)

digestión enzimática.

5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 4,

caracterizado porque

la incorporación de los compuestos se efectúa en combinación con una reacción de amplificación de ácidos nucleicos.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5,

caracterizado porque

la amplificación de ácidos nucleicos comprende una PCR.

7. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 6,

caracterizado porque

la incorporación de los compuestos se efectúa en ácidos nucleicos fijados a un soporte.

8. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 7,

caracterizado porque

en los fragmentos de ácidos nucleicos resultantes por disociación se incorporan uno o varios grupos de marcación.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8,

caracterizado porque

se adosan grupos de marcación al extremo 5' o/y 3' de los fragmentos de ácidos nucleicos.

10. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 8,

caracterizado porque

los fragmentos de ácidos nucleicos resultantes por disociación son inmovilizados sobre un soporte.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10,

caracterizado porque

el soporte tiene una superficie de metal, vidrio, un material cerámico o/y un material sintético.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 u11,

caracterizado porque

el soporte se selecciona entre micropartículas y biochips.

13. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores,

caracterizado porque

se lleva a cabo una reacción de detección en ácidos nucleicos, que están contenidos en una biblioteca de ácidos nucleicos producida por la disociación.

14. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 13,

caracterizado porque

la reacción de detección comprende un análisis por espectrometría de masas.

15. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 14,

caracterizado porque

la reacción de detección comprende una electroforesis.

16. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 15,

caracterizado porque

la reacción de detección comprende una determinación de la secuencia.

17. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16,

caracterizado porque

la determinación de la secuencia comprende una secuenciación en ciclos en combinación con una amplificación de ácido nucleico.

18. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 16 ó 17,

caracterizado porque

la determinación de la secuencia se efectúa de manera bidireccional en una cadena de ácido nucleico.

19. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones anteriores,

caracterizado porque

los fragmentos de ácidos nucleicos resultantes por disociación se emplean para la detección de mutaciones.

20. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 19,

caracterizado porque

los fragmentos de ácidos nucleicos resultantes por disociación tienen en el extremo 5' el grupo HY-CH_{2}-, estando definido Y tal como en la reivindicación 1.

21. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 20,

caracterizado porque

los fragmentos de ácidos nucleicos tienen en el extremo 3' un grupo de fosfato.

22. Utilización de un estuche de reactivos, que contiene por lo menos un compuesto de la fórmula general (I), tal como se define en la reivindicación 1, en común con otros componentes de detección, en un procedimiento para la detección de ácidos nucleicos de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 hasta 21.