ES2222786B1 - Procedimiento de fermentacion dirigida secuencial, nueva cepa de levadura que interviene en el mismo, y su aplicacion industrial. - Google Patents
Procedimiento de fermentacion dirigida secuencial, nueva cepa de levadura que interviene en el mismo, y su aplicacion industrial.Info
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Abstract
Procedimiento de fermentación dirigida secuencial, nueva cepa de levadura vínica CECT 11773 que interviene en el mismo, y su aplicación industrial. La presente invención se refiere a una nueva cepa de Pichia fermentans, CECT 11773, y a la aplicación de un nuevo procedimiento de vinificación mediante fermentación secuencial dirigida, por el cual el mosto es sembrado en tiempos diferentes por dicha cepa y por otra del género Saccharomyces. La primera da lugar a la síntesis de una gran cantidad de sustancias aromáticas y saborizantes con baja producción de etanol, que determinarán el aroma del producto final; la segunda levadura se encarga de terminar la fermentación aumentando la cantidad de alcohol acumulado hasta un 12-13% v/v.
Description
Procedimiento de fermentación dirigida
secuencial, nueva cepa de levadura que interviene en el mismo, y su
aplicación industrial.
La presente invención tiene por objeto una nueva
cepa de la levadura Pichia fermentans, así como el
procedimiento de obtención de la misma, y su aplicación en la
producción de vinos.
En concreto atañe, por un lado, a un
procedimiento de fermentación dirigida y secuencial para la
producción de vino, y por otro, al aislamiento, caracterización y
uso de una cepa de levadura específica para la obtención de un
producto fuertemente aromatizado, con sus características
organolépticas mejoradas y reproducibles.
Es bien sabido que las bebidas alcohólicas
obtenidas por fermentación etanólica por levaduras han sido uno de
los productos biotecnológicos más antiguos. En un principio se
obtuvieron como medio de conservación de alimentos líquidos y agua,
y después como producto en sí mismo. Tradicionalmente para la
fermentación del mosto de uva se utilizan las poblaciones de
levaduras que existen en el ecosistema en el que se ha producido la
uva o en la propia bodega en la que ésta se transforma; las cuales
espontáneamente crecen en el jugo y alteran su composición química.
En ambos casos estas poblaciones están sometidas a presiones
selectivas, especialmente en regiones con climas extremos como el
mediterráneo, que provocan una evolución de las mismas. Por tanto,
las levaduras presentes en los frutos no son constantes a través de
los años, así como tampoco lo son las características metabólicas de
cuya interacción con el mosto se van a producir las características
organolépticas del vino resultante. Esta circunstancia da lugar a
una variación, no deseada, de la producción de temporada en
temporada. Para resolver este problema y también en un intento de
obtener un producto parecido al producido en regiones
tradicionalmente productoras, los países de nueva tradición
vitivinícola iniciaron la fermentación con inóculos de levaduras
seleccionadas e importadas de países con tradición muy
arraigada.
La siembra del mosto inicial con cepas de
levaduras seleccionadas del género Saccharomyces, permite
independizar el proceso de fermentación de la aparición, por
evolución de las poblaciones naturales, de características
indeseables en los vinos. Además, esta fermentación dirigida
asegura, en la mayoría de los casos, la normalización de la
población fermentativa y el mantenimiento de la uniformidad de la
calidad del producto final (Kunkee y Goswell. (1977). Tables wine.
Alcoholic beverages. Economic microbiology. Academic Press,
5-72. Fleet y Heard. (1993). Wine microbiology and
Biotecnology. Harwood Academic Publishers. 27-54).
Esta práctica ha sido utilizada con excelentes resultados en países
con sistemas de vinificación relativamente recientes y con la
necesidad de obtener vinos competitivos y de gran calidad como
Estados Unidos, Africa del Sur y Australia (Egli y col. (1998) J.
Applied Microbiology 85, 779-789). Recientemente,
también ha sido introducida en el proceso fermentativo de algunos
mostos del marco de Jerez, lo que ha permitido homologar de forma
muy específica la calidad de estos caldos (Ibeas y col. (1995)
Alimentación Equipos y Tecnología. Separata de marzo,
45-49).
Para que la fermentación controlada pueda ser
efectiva es necesario que la levadura inoculada se imponga a las
silvestres. En una situación natural, sin embargo, la fermentación
espontanea implica una sucesión de diferentes tipos de levaduras,
que pueden ser muy diferentes entre distintas zonas. Existen
estudios que demuestran el desplazamiento de todas las cepas
silvestres por la cepa comercial (Querol y col. (1992), Appl.
Envirom. Microbiol. 58, 2948-2953. Poblet y col.
(2000), Alimentación Equipos y Tecnología. Marzo,
95-100).
La mayoría de las levaduras comerciales
utilizadas para la fermentación dirigida o controlada son de origen
francés. Posiblemente, por el deseo involuntario de alcanzar un
vino de calidad comparable a la media de los vinos franceses. Esto
da lugar a dos problemas fundamentales. Por una parte, puesto que
gran parte de las características organolépticas del vino proceden
de la interacción del metabolismo de las levaduras y los
componentes químicos del mosto, los vinos pierden personalidad,
tendiendo a parecerse todos entre sí. Por otra parte, las levaduras
comerciales están seleccionadas en unas condiciones ecológicas que
con frecuencia son muy diferentes a las de los vinos de otras
regiones, por ejemplo las que tienen climas más cálidos o secos. En
estas regiones productoras las levaduras autóctonas suelen competir
ventajosamente con las alóctonas, desplazándolas e imponiendo las
características derivadas de su metabolismo.
Estos dos tipos de problemas pueden resolverse
por el uso, para el proceso de fermentación controlada, de una
levadura aislada y seleccionada de la zona vitivinícola específica.
Este tipo de levaduras pueden crecer más deprisa que otras
levaduras comerciales e incrementar la velocidad de fermentación, ya
que están mejor adaptadas a las condiciones específicas por las que
deberá pasar el mosto hasta su transformación. Además, teniendo en
cuenta que la levadura predominante es la que aporta la mayor
cantidad y número de componentes aromáticos del vino (Heart y
Fleet, (1986), Food Tecnol. Aust. 38, 1, 22-25), las
levaduras autóctonas seleccionadas contribuirán de forma
determinante al aroma y sabor del vino y por tanto, a su calidad y
valoración sensorial. Con esta práctica el vino tendrá unas
propiedades organolépticas distintivas y más relacionadas con su
origen geográfico y ecológico. Por tanto, la selección de levaduras
autóctonas y el desarrollo de técnicas para su utilización en
procesos industriales de fermentación controlada, están centrando
muchos esfuerzos (Querol y col. (1992), J. Food Sci. 57,
183-185. Degre (1993), Wine Microbiology and
Biotechnology. Hardwood Academic Publishers,
421-447).
En el documento de patente ES 2089982, se
describe detalladamente el aislamiento y aplicación de una nueva
cepa de Saccharomyces cerevisiae en la fermentación de
mostos resistentes al crecimiento adecuado de cepas comerciales. Con
este procedimiento se consigue un incremento en la velocidad de
fermentación, la desaparición de compuestos indeseables y aumentar
la reproducibilidad en la calidad de los vinos tanto blancos como
tintos. Resultados semejantes han sido obtenidos en aislamientos de
levaduras autóctonas de aplicación óptima en el inoculo y
fermentación de mostos de otras zonas (Lema y col. (1996), Am. J.
Enol. Vitic., 47, 2, 206-216. Querol y col. (1993)
Microbiología SEM 9, 76-82. Lema Costas C. (1997)
Viticultura/Enología Profesional. 51, 53-59.).
Desde un punto de vista enológico, se puede
esperar que el uso de levaduras indígenas en cultivos puros, para
procesos de fermentación dirigida, puede ser la técnica de elección
para proporcionar a los vinos su aroma, sabor y propiedades
características específicas (Heard G. (1999) Novel yeast in
winemaking-looking to the future. Food Australia
51: 247-352). Obviamente es necesario un equilibrio
en el uso de levaduras comerciales, puesto que se puede llegar a
perder la identidad organoléptica de caldos tradicionales. La
necesidad de recuperar los aromas y sabores tradicionales de los
vinos en las regiones en las que se ha impuesto la fermentación
dirigida con cepas comerciales francesas, ha llegado a establecer
programas de aislamiento y obtención de cultivos homogéneos de
levaduras autóctonas y rescatarlas para la industria vinícola
(Sipiczki y col. (2001), Antonie van Leewenhoek 79:
97-105).
La contribución final de las levaduras de la
especie Saccharomyces ha sido ampliamente estudiada (Gardner
y col. (1993), Applied and Environmental Microbiology 59:
2022-2028. Ubeda y col. (1995), Food Science and
Technology 28: 584-588. Mortimer y Polsinelli
(1999), Research in Microbiology 150, 199-204).
S. cerevisiae está presente, en baja concentración, en la
superficie de la uva y en las primeras etapas de la fermentación,
pero es la levadura predominante desde la mitad del proceso hasta
el final del mismo, debido a su mayor tolerancia al etanol (Delfini
y col. (2001), J. Agric. Food Chem. 49, 11:
5397-5408). Las levaduras que no pertenecen al
genero Saccharomyces (levaduras no-Saccharomyces, que
incluyen géneros como Candida, Debaryomyces, Hanseniaspora,
Hansenula, Pichia y Torulaspora) están descritas como
productoras de un gran número de subproductos de la fermentación,
tales como acetaldehido, acetato de etilo, glicerol, propanol,
isobutanol, alcohol isoamílico, etc. (Romano y col. (1997), Appl.
Environ. Microbiol. 59, 1838-1841). La influencia
de estos compuestos en la calidad sensorial ha sido ampliamente
estudiada y establecida (Rojas y col. (2001), International J. Food
Microbiol. 70, 283-289. Gil y col. (1996), J. Food
Sci. 61, 1247-1249. Heard y col. (1986), Food
Technol. Aust. 38, 22-25. Lema y col. (1996), Am. J.
Enol. Vitic. 47, 2: 206-216). Por tanto, las
levaduras no-Saccharomyces introducen la dimensión ecológica
y la diversidad química de la calidad organoléptica de los vinos
(Feet y col. (1993) En Wine: Microbiology and Biotechnology:
Harwood Academic Publishers, 27-54, Fernández y
col. (1999), FEMS Microbiol. Letters 173,
223-229).
Recientemente, se han realizado intentos para
incrementar la influencia de las levaduras no-Saccharomyces
en el crecimiento poblacional durante la fermentación y mejorar así
la calidad de los vinos. Estos estudios incluyen la inmovilización
de células de Candida con el propósito de incrementar la
concentración de glicerol en el vino (Ciani y col. (1996), Applied,
Environ. Microbiol. 62, 283-288),
co-cultivo de diferentes cepas de Candida
con diferentes cepas de Saccharomyces (Ciani y col. (1998),
J. Applied Microbiol. 85, 247-254),
co-cultivo de mezclas de Torulaspora
delbrueckii con Saccharomyces (Moreno y col. (1991), J.
Industrial Microbiol. 7, 181-190),
co-cultivo de mezclas de cepas de Hanseniaspora
uvarum o Kloeckera apiculata con Saccharomyces
(Gil y col. (1996), J. Food. Science 61, 6:
1247-1249, Erten y col. (2002), World J. Micorbiol.
Biotech. 18, 373-378).
Otra estrategia para incrementar el efecto de los
subproductos de la fermentación de levaduras
no-Saccharomyces sobre la calidad final de los vinos ha sido
la siembra secuencial del mosto con diferentes levaduras. En el
documento de Herraiz y col. (1990) en Am. J. Enol. Vitic., 41,4:
313-318 se comunica la fermentación por siembra
secuencial de Torulaspora delbrueckii o Kloeckera
apiculata con Saccharomyces. Los perfiles de compuestos
volátiles obtenidos en los procesos en los que las dos primeras
levaduras fueron inoculadas, mezcladas o separadas, 3 ó 5 días
antes de la inoculación con una cepa comercial de
Saccharomyces fueron claramente distintos y más complejos.
Posteriormente se demostró que el metabolismo de
Saccharomyces se altera cuándo el mosto es sembrado con esta
levadura después de haber sido parcialmente fermentado con levaduras
no-Saccharomyces. Concretamente se observó un fuerte
incremento en la producción de n-propanol, a partir
de subproductos metabólicos de la levaduras no-Saccharomyces
(Zaroni y col. (1993) Biotechnol. Letters, 15, 3:
235-238). En esta misma línea, un trabajo posterior
(Toro y col. (2002) World J. Microbiol. Biotech.18,
347-354) ha demostrado la mejora objetiva de la
calidad de los vinos obtenidos por fermentación dirigida por
siembra secuencial de Candida cantarellii y
Saccharomyces. Desde el punto de vista enológico, una
separación entre las dos siembras de 3 días produjo los mejores
resultados en el enriquecimiento en subproductos generadores de
aromas. El factor limitante de esta estrategia para incrementar la
calidad del vino, es la disponibilidad de una cepa
no-Saccharomyces que disponga de una fuerte capacidad para
producir compuestos participantes en las deseadas propiedades del
producto. En la mayoría de los casos esto no es posible, pues las
levaduras no-Saccharomyces suelen dar lugar a compuestos
característicos de aromas a podredumbre. Además algunos
subproductos de estas levaduras pueden ser reutilizados por
Saccharomyces y formar sustancias indeseables no aceptables
en la composición del vino.
La posibilidad de imponer una cepa seleccionada
en un proceso fermentativo permite otra aproximación técnica para
mejorar las propiedades organolépticas del vino. Así, la selección
en el laboratorio de nuevas cepas mediante cruces genéticos clásicos
ha sido explorada para el incremento en la producción de terpenos
(Javelot y col. (1991) J. Biotechnol. 21: 239-251).
Lamentablemente, estos estudios no han tenido unos resultados
rápidos y claramente diferenciadores; de tal forma que las nuevas
cepas pierden demasiadas características útiles a costa de ganar el
carácter de interés.
La tecnología del DNA recombinante también se
está aplicando a la mejora de las levaduras vinícolas. En el
documento EP103399 se describe el clonaje y utilización del gen de
la enzima maloláctica de Lactobacillus delbrueckii en cepas
de Saccharomyces. Las levaduras transformadas con este gen
pueden realizar la fermentación maloláctica sin necesidad de la
adición de bacterias específicas al fermentador. Otra mejora
enológica está comunicada en el documento ES 2059280, en ella se
construye un nuevo organismo por transformación de una levadura
silvestre con el gen codificante de la
\beta-(1,4)-endoglucanasa de Trichoderma
longibrachiatum. La expresión de este gen en la levadura durante
la fermentación permite la liberación de terpenos desde su
correspondiente diglucósido, lo que conlleva un incremento del aroma
del producto final. Teniendo en cuenta que la utilización de
organismos recombinantes para la fabricación de productos destinados
al consumo humano está pendiente de aceptación legal en Europa y
carece de aceptación social y ecológica, la transformación de
levaduras vínicas con nuevos caracteres de interés enológico es
solo una estrategia de futuro con improbable aplicación actual.
En la presente invención, se utiliza la evolución
natural, que espontáneamente forma organismos con características
enológicas de interés, para aislar las levaduras que contienen la
combinación apropiada de genes que permiten obtener un producto de
la fermentación de mosto mejorado organolépticamente. Esta
estrategia tiene la ventaja, frente a la mejora clásica de cepas,
que no implica la pérdida de ninguna característica de interés ni
la aparición de otras nuevas que resulten indeseables. Por otro
lado, no presenta los problemas asociados con la transformación
genética de organismos por cuanto no se manipula el genoma de los
mismos. El único inconveniente de esta técnica es que el
aislamiento de una nueva cepa, desde medios naturales, con las
características apropiadas, es un fenómeno probabilístico y que
requiere un enorme esfuerzo de análisis y diagnóstico de una gran
cantidad de organismos y cepas.
La cepa de levadura utilizada en esta invención
fue obtenida en un proceso de selección y aislamiento de levaduras
con capacidad de formar una combinación de productos aromáticos y
saborizantes superior a las existentes comercialmente, con
capacidad de formar o tolerar una concentración alcohólica superior
a 4-5% v/v, con capacidad de tolerar una
concentración de sulfuroso en el mosto de 0.15 gr/L e incapaz de
formar compuestos químicos de sabor u olor indeseables. Con estas
pautas de trabajo las levaduras fueron aisladas desde diversos
mostos de diferentes frutas. Las levaduras aisladas fueron
analizadas por el examen cromatográfico de la composición de aromas
durante la fermentación de mostos neutros de uva y por el análisis
sensorial de los mismos. De este proceso, resultó seleccionada una
levadura perteneciente a la especie Pichia fermentaras. Las
levaduras pertenecientes a esta especie han sido descritas como
altamente productoras de compuestos aromáticos implicados de forma
esencial en el aroma y buqué del vino, tales como el
etil-caproato, etil-caprilato,
2-feniletanol, ésteres, alcoholes de alto peso
molecular y ésteres de alcoholes entre otros compuestos (Lilly y
col. Applied Enviromen. Microbiol. (2000), 66, 2:
744-753, Huang y col. (2001), Food Res.
International, 34, 277-282, Rojas y col. (2001),
International J. Food Microbiol. 70, 283-289). De
esta cepa ha sido depositado cultivo, conforme a las provisiones
del tratado de Budapest sobre el reconocimiento del depósito de
microorganismos a los fines del procedimiento en materia de
patente, en la autoridad internacional de deposito de la Colección
Española de Cultivos Tipo (CECT) de la Universidad de Valencia,
Campus de Burjasot, 46100 (Valencia), España, con el número CECT
11773.
El uso combinado de esta levadura con otras del
género Saccharomyces en un nuevo proceso de fermentación
secuencial, que también se reivindica en la presente invención, ha
dado lugar a vinos con mayor riqueza aromática. La composición de
estos vinos ha sido caracterizada por cromatografía de gases y por
análisis enzimáticos, evidenciando diferencias y mejoras
organolépticas que han sido igualmente verificadas por análisis
sensorial.
La presente invención se refiere a una nueva cepa
de Pichia fermentans, CECT 11773, y a la aplicación de un
nuevo procedimiento de vinificación por el cual el mosto es
sembrado en tiempos diferentes por dicha cepa y por otra del genero
Saccharomyces. La primera da lugar a la síntesis de una gran
cantidad de sustancias aromáticas y saborizantes con baja
producción de etanol, que determinarán el aroma del producto final.
La segunda levadura se encarga de terminar la fermentación
aumentando la cantidad de alcohol acumulado hasta un
12-13% v/v.
La cepa CECT 11773 corresponde a una levadura
natural aislada de la corteza de fruta madura y perteneciente a la
especie Pichia fermentans. Presenta una excelente capacidad
de crecimiento en mosto de uva, tanto blanca como tinta. Si el mosto
se mantiene a una temperatura entre 17ºC y 30ºC la fermentación
comienza en menos de 24 horas, aunque la concentración de SO_{2}
sea de 0.15 gr/L. Esto la diferencia claramente de otras levaduras
no-Saccharomyces, que se caracterizan por no tolerar el
SO_{2} y, por tanto, no pueden ser utilizadas como
sobreproductoras de aromas en condiciones de vinificación
industrial.
La nueva cepa es capaz de producir gran cantidad
de compuestos volátiles y no volátiles implicados en el aroma y
sabor del vino. La Tabla 1, recoge los componentes sintetizados por
la cepa CECT 11773 en un mosto de uva de la variedad macabeo. Por
comparación con el perfil de compuestos formados por
Saccharomyces (Tabla 4), se demuestra que la levadura
Pichia fermentans CECT 11773 da lugar a un perfil más
variado y con mayor cantidad de compuestos aromáticos.
| CECT11773 | |
| Acetaldehido^{a} | 319.49\pm0.82 |
| Acido Acético^{a} | 18.43\pm0.05 |
| Acetato de etilo^{a} | 20.40\pm0.52 |
| Metanol^{b} | 43.15\pm0.63 |
| Etanol^{b} | 5.29 \pm0.30 |
| 1 propanol^{a} | 30.55\pm0.63 |
| 2 metil 1 propanol^{a} | 69.55\pm0.68 |
| 2 metil 1 butanol^{a} | 120.35\pm0.50 |
| 3 metil 1 butanol^{a} | 142.56\pm3.57 |
| n butanol^{a} | 81.97\pm1.65 |
| 1 hexanol^{a} | 207.01\pm1.83 |
| Etil Caprilato^{a} | 250.83\pm0.43 |
| 2,3 butenodiol^{a} | 121.86\pm1.50 |
La cepa CECT 11773 objeto de esta invención, está
caracterizada además por una elevada capacidad de fermentar tanto a
temperaturas bajas como altas, no provoca turbidez y su
fermentación no es rápida evitando así la formación de espuma.
Produce muy bajas concentraciones de ácido acético, produce un
máximo de 5% de etanol y no sintetiza ningún producto que
interfiera con el crecimiento y fermentación de
Saccharomyces, en el caso de que esta levadura sea sembrada
posteriormente en el mismo mosto. Una característica de gran
importancia es que la CECT 11773 presenta una tolerancia al
SO_{2} que la permite crecer a una concentración de 0.15 gr/l de
metabisulfito potásico a un pH 3.3, durante todo el proceso de
fermentación. Datos experimentales obtenidos por los inventores,
demuestran que esta levadura solo es sustituida por la cepa de
Saccharomyces inoculada posteriormente cuando la
concentración de etanol supera el 6%. Esto posibilita su uso
industrial y el incremento controlado de aromas en el vino
producido por el procedimiento que se describe en este
documento.
Otras características fisiológicas y bioquímicas
de la cepa CECT 11773 están descritos en la tabla 2.
Características bioquímicas y
morfológicas de Pichia fermentans CECT 11773
Características
morfológicas
| - Morfología celular | células redondas, ovaladas, ligeramente alargadas. |
| - Morfología de colonia: | |
| - Textura | colonias con textura mantecosa, superficie lisa |
| - Color | colonias de color blanco |
| - Reborde | lobulado |
| Se observó pseudomicelo |
Fermentación de compuestos
carbonados
| Fuentes de carbono | 1 día | 2 días | 3 días | 7 días |
| Glucosa | + | + | + | + |
| Lactosa | - | - | - | - |
| Sacarosa | - | - | - | - |
| Melezitosa | - | - | - | - |
| Almidón | - | - | - | - |
| Rafinosa | - | - | - | - |
| Galactosa | - | - | - | - |
| Maltosa | - | - | - | - |
| Celobiosa | - | - | - | - |
| Melibiosa | - | - | - | - |
Asimilación de compuestos
carbonados
| Fuentes de carbono | 1 día | 2 días | 3 días | 7 días |
| Glucosa | + | + | + | + |
| Lactosa | - | - | - | - |
| Sacarosa | + | + | + | + |
| Melezitosa | + | + | + | + |
| Trehalosa | + | + | + | + |
| D-arabinosa | - | - | - | - |
| L-arabinosa | - | - | - | - |
| Eritritol | - | - | - | - |
| Galactosa | + | + | + | + |
| Maltosa | + | + | + | + |
| Celobiosa | - | - | - | - |
| Melobiosa | + | + | + | + |
| Rafinosa | - | - | - | - |
| L-ramnosa | - | - | - | - |
| D-xilosa | - | - | + | + |
| Mio-inositol | - | - | - | - |
| Manitol | - | - | - | - |
\newpage
Esta cepa ha sido caracterizada molecularmente
por los autores de este documento, utilizando la técnica de la
secuenciación de los amplificados por la reacción en cadena de la
polimerasa del DNA codificante del RNA ribosómico 5.8s y las dos
regiones espaciadoras no transcribibles flanqueantes
(PCR-ITS), descrita en los protocolos de los
documentos: White y col. (1990) PCR protocols, Ed. Innis, Gelfand,
Sninsky and White. San Diego, Academic Press,
315-322, y Sambrook y col. (1989) Cold Spring
Harbor, New York.
La secuencia de las regiones no transcribibles
flanqueantes del DNA codificante del RNA ribosómico 5s (SEQ.ID
NO.1) ha sido registrada en el GeneBank con el número de acceso:
AY027508.
Dicha secuencia ha sido registrada en el GeneBank
con el número de acceso: AY027508.
El análisis de restricción se muestra a
continuación:
| Especie | Amplificado | CfoI | HaeIII | HinfI |
| Pichia fermentans | 450 | 170+100+100+80 | 340+90 | 250+200 |
El procedimiento preferente de uso de esta
levadura es en una fermentación dirigida de siembra secuencial. En
primer lugar el mosto, debidamente tratado, es sembrado con
Pichia fermentans CECT 11773 de tal forma que su densidad de
población final sea al menos tres ordenes de magnitud mayor que la
de cualquier otra levadura. Para ello se utiliza un pie de cuba
apropiado. Esta levadura permanece como microorganismo fermentador
predominante durante 2-4 días a una temperatura
entre 15ºC y 24ºC, en todo caso hasta que la concentración de
aromas sea la deseada por el operador. Posteriormente el caldo es
nuevamente sembrado, pero en este caso con una levadura
perteneciente al género Saccharomyces, preferentemente una
levadura autóctona seleccionada. Igualmente se prepara un pie de
cuba con una densidad de población semejante a la empleada en la
fermentación anterior. Después de realizar la siembra, el proceso
se deja transcurrir durante 20-30 días entre 18ºC y
24ºC, según se trate de mosto blanco o tinto. Una vez terminada la
fermentación el vino puede seguir el tratamiento específico y
habitual de la bodega.
Una descripción detallada de la aplicación de
esta invención se describe a continuación:
Durante el momento del prensado, el mosto es
tratado con anhídrido sulfuroso (en forma gaseosa o de
metabisulfito potásico) hasta una concentración de 0.1 gr/L.
Posteriormente es clarificado por sedimentación o centrifugación.
Seguidamente el caldo es tratado con la cantidad necesaria de ácido
tartárico, para llevar su pH hasta 3.25.
Cuando el mosto alcance una temperatura de 15ºC a
17ºC se siembra con un pie de cuba que debe ser entre un 2.5% y 5%
del volumen de mosto a fermentar. Este pie de cuba está preparado a
partir de mosto clarificado y sembrado con un precultivo de la
levadura Pichia fermentans CECT 11773, que se mantiene a
28ºC, durante 24 horas en aireación, preferentemente por remonte
mecánico. Alternativamente el mosto se puede sembrar con un volumen
de pie de cuba que permita una densidad de población final de l x
10^{6} ufc/mL.
El mosto una vez sembrado con la levadura
Pichia fermentans CECT 11773, es remontado y se deja
fermentar a 18ºC, entre 2 y 4 días, según el grado de aromas que se
desee introducir en el caldo. Transcurrido este tiempo se realiza
una nueva siembra con un pie de cuba, elaborado en las mismas
condiciones que el anterior pero con Saccharomyces
cerevisiae como cepa de levadura en cultivo. Esta cepa puede
ser comercial o seleccionada de las poblaciones autóctonas. Desde el
momento de la segunda siembra la fermentación se mantiene a 18ºC
durante 20 y 30 días, hasta que la concentración de azúcares
reductores es inferior a 0.2 gr/L. En este momento la fermentación
puede ser dada por terminada y el caldo debe ser filtrado. En
algunos casos la concentración de anhídrido sulfuroso deberá ser
corregida. Finalmente el vino se almacena a 4ºC con el fin de
conservarlo en buenas condiciones y precipitar los restos sólidos y
el tartrato que se forme a esta temperatura.
Transcurridos entre 40 y 60 días, el vino es
nuevamente filtrado y embotellado en atmósfera inerte.
Las uvas tintas son prensadas de forma ligera
pero que asegura la rotura de las bayas. La pasta resultante es
sulfitada hasta una concentración de 0.1 gr/L de sulfito total y el
pH es corregido hasta 3.25.
Esta pasta es sembrada con un inoculo de
Pichia fermentans CECT 11773 preparado como se describe en
el apartado anterior. Para iniciar eficientemente el proceso de
fermentación dicha pasta debe ser remontada 24 horas después de la
siembra. La fermentación se mantiene a una temperatura entre 20ºC y
24ºC, durante 2 a 4 días.
Transcurrida esta primera fermentación se realiza
la siembra con la segunda levadura Saccharomyces cerevisiae
como cepa de levadura en cultivo. Esta cepa puede ser comercial o
seleccionada de las poblaciones autóctonas. Esta siembra se realiza
con un pie de cuba con mosto clarificado, que debe mantenerse a
24ºC durante 24 horas o hasta que permita una densidad de población
final, desde la siembra, de 1 x 10^{6} ufc/mL. La pasta de mosto
puede volver a ser remontada para reactivar la fermentación y es
mantenida entre 22ºC y 24ºC, durante 20 ó 30 días. Posteriormente
se realiza una prensada de descube para eliminar las pieles de la
uvas y los residuos sólidos. Inmediatamente el vino es enfriado
hasta 4ºC, para eliminar las lías, y es filtrado para eliminar las
partículas no sedimentarias. Finalmente, según las necesidades de
la bodega, el vino es almacenado hasta su embotellamiento como vino
joven o hasta su almacenamiento en barrica.
La aplicación de la presente invención da lugar a
un producto con un contenido en sustancias aromáticas más rico y
variado que al realizar la fermentación por el método clásico de
fermentación dirigida o por fermentación espontánea. La
introducción en el cultivo de una considerable cantidad de Pichia
fermentans CECT 11773 en condiciones de ventaja competitiva con
las poblaciones salvajes es una novedad, que implica una mejora
evidente sobre los procedimientos tradicionales, por cuanto se
introduce una fase, en la técnica, destinada únicamente a la
formación específica de aromas. Esta fase puede ser controlada y
sus resultados cuantificados independientemente al proceso
fermentativo global. En la actualidad, no existen documentos que
protejan la aplicación de una fase específica de este tipo en la
vinificación. Como se describe en los siguientes ejemplos la
diferencia en composición química de sustancias aromáticas, entre
el procedimiento de fermentación dirigida clásica y el de
fermentación dirigida secuencial con diferentes levaduras que aquí
se propone es cuantificable.
Ejemplo
comparativo
Se preparan 1000 L de mosto por prensado de la
uva por un método convencional. Durante el momento del prensado el
mosto es tratado con anhídrido sulfuroso (en forma gaseosa o de
metabisulfito potásico) hasta una concentración de 0.1 gr/L.
Posteriormente es clarificado por sedimentación o centrifugación.
Seguidamente el caldo es tratado con la cantidad necesaria de ácido
tartárico, para llevar su pH hasta 3.25.
El mosto es enfriado hasta que alcance una
temperatura de 15ºC a 17ºC. En este momento se siembra con un pie
de cuba de 50 L. Este pie de cuba está preparado a partir de mosto
clarificado y sembrado con un precultivo de la levadura comercial
Saccharomyces L2056, que se mantiene a 28ºC, durante 24 horas
en aireación, preferentemente por remonte mecánico. En estas
condiciones la densidad de población de la levadura es tal que la
cantidad de unidades formadoras de colonias por mililitro de mosto
sembrado será aproximadamente de 1x10^{6}.
El mosto sembrado es remontado, para iniciar
activamente la fermentación y permanece a 18ºC durante 20 días o en
todo caso hasta que la concentración de azúcares reductores sea
menor de 0.2 gr/L.
En este momento la fermentación puede ser dada
por terminada y el caldo debe ser filtrado. En algunos casos la
concentración de anhídrido sulfuroso deberá ser corregida.
Finalmente el vino se almacena a 4ºC con el fin de conservarlo en
buenas condiciones, precipitar los restos sólidos y el tartrato que
se forme a esta temperatura.
Transcurridos entre 40 y 60 días, el vino es
nuevamente filtrado y embotellado en atmósfera inerte.
El perfil de la composición de sustancias
aromáticas implicadas en el sabor y aroma del vino, cuantificadas
por cromatografía de gases, se presentan en la Tabla 4.
| L2056 | |
| Acetaldehido ^{a} | 195.53\pm1.12 |
| AcidoAcetico ^{a} | 23.57\pm0.62 |
| Acetato de etilo ^{a} | 66.92 \pm0.21 |
| Metanol ^{a} | 43.68\pm0.16 |
| L2056 | |
| Etanol ^{b} | 8.95\pm0.98 |
| 1 propanol ^{a} | 26.67\pm0.15 |
| 2 metil 1 propanol ^{a} | 68.87\pm0.15 |
| 2 metil 1 butanol ^{a} | 118.84\pm0.09 |
| 3 metil 1 butanol ^{a} | 160.14\pm0.06 |
| n butanol ^{a} | 45.15\pm5.72 |
| 1 hexanol ^{a} | 0 |
| Etil Caprilato ^{a} | 255.09\pm1.01 |
| 2,3 Butenodiol ^{a} | 22.47\pm0.81 |
La presente invención se ilustra con los
siguientes ejemplos:
Se preparan 1000 L de mosto por prensado de la
uva por un método convencional. Durante el momento del prensado el
mosto es tratado con anhídrido sulfuroso (en forma gaseosa o de
metabisulfito potásico) hasta una concentración de 0.1 gr/L.
Posteriormente es clarificado por sedimentación o centrifugación.
Seguidamente el caldo es tratado con la cantidad necesaria de ácido
tartárico, para llevar su pH hasta 3.25.
El mosto es enfriado hasta que alcance una
temperatura de 15ºC a 17ºC. En este momento se siembra con un pie
de cuba de 50 L. Este pie de cuba está preparado a partir de mosto
clarificado y sembrado con un precultivo de Pichia fermentans
CECT 11773, que se mantiene a 28ºC, durante 24 horas en aireación,
preferentemente por remonte mecánico. En estas condiciones la
densidad de población de la levadura es tal que la cantidad de
unidades formadoras de colonias por mililitro de mosto sembrado
será aproximadamente de 1x10^{6}.
El mosto una vez sembrado con Pichia
fermentans CECT 11773, es remontado y se deja fermentar a 18ºC,
entre 2 y 4 días, según el grado de aromas que se desee introducir
en el caldo. Transcurrido este tiempo se realiza una nueva siembra
con un pie de cuba, elaborado en las mismas condiciones que el
anterior pero con Saccharomyces L2056 como cepa de levadura
en cultivo. Esta cepa puede ser comercial o seleccionada de las
poblaciones autóctonas. Desde el momento de la segunda siembra la
fermentación se mantiene a 18ºC durante 20 a 30 días, hasta que la
concentración de azúcares reductores es inferior a 0.2 gr/L. En este
momento la fermentación puede ser dada por terminada y el caldo
debe ser filtrado. En algunos casos la concentración de anhídrido
sulfuroso deberá ser corregida. Finalmente el vino se almacena a 4ºC
con el fin de conservarlo en buenas condiciones, precipitar los
restos sólidos y el tartrato que se forme a esta temperatura.
Transcurridos entre 40 y 60 días, el vino es
nuevamente filtrado y embotellado en atmósfera inerte.
Por este procedimiento se obtiene un perfil de
compuestos implicados en el aroma del vino que se representa en la
Tabla 5.
El mosto de uva concentrado se diluye hasta una
concentración de azúcares reductores comprendida entre 20 y 25%
w/v. Se corrige el pH hasta 3.25 añadiendo la correspondiente
cantidad de ácido tartárico y se sulfita hasta una concentración de
0.1 gr/L. Las sucesivas siembras con las diferentes levaduras y el
procedimiento fermentativo se realizan como se describe en el
ejemplo 1.
<110> Universidad de Almería
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Procedimiento de fermentación
dirigida secuencial, nueva cepa que interviene en el mismo, y su
aplicación industrial.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> P00002595/2002
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<140> P200202743
\vskip0.400000\baselineskip
<141>
2002-11-28
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 444
\vskip0.400000\baselineskip
<212> DNA
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Pichia fermentans
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
Claims (11)
1. Levadura vínica perteneciente a la especie
Pichia fermentans depositada en la Colección Española de
Cultivos Tipo, con número de identificación CECT 11773,
caracterizada por presentar regiones no transcribibles
flanqueantes del DNA codificante del RNA ribosómico 5S, que
corresponde a la secuencia SEQ. ID NO1 registrada en el GeneBank
con el número de acceso: AY027508.
2. Levadura vínica según reivindicación 1,
caracterizada porque presenta una tolerancia de
concentración alcohólica superior a 5% v/v.
3. Levadura vínica según reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque presenta una tolerancia al
anhídrido sulfuroso de hasta 0,15 gr/l.
4. Levadura vínica según reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque produce un máximo de 5% de
etanol.
5. Levadura vínica según reivindicaciones
anteriores, caracterizada porque presenta una elevada
capacidad de fermentar, es decir con una producción de etanol del
5% durante 2 a 4 días, a temperaturas comprendidas entre 15ºC y
24ºC.
6. Procedimiento de fermentación secuencial
dirigida que comprende la utilización de la levadura CECT 11773,
caracterizado porque comprende las siguientes etapas:
- a)
- tratamiento del mosto con anhídrido sulfuroso hasta una concentración de 0,1 g/l;
- b)
- tratamiento del caldo resultante con ácido tartárico hasta llevar su pH a 3,25;
- c)
- preparación de un pie de cuba entre 2,5 y 5% v/v del volumen de mosto a fermentar;
- d)
- sembrado con un precultivo de la levadura Pichia fermentans CECT 11773 durante un tiempo de 2 a 4 días, y a una temperatura entre 15ºC a 24ºC;
- e)
- preparación de un pie de cuba en las mismas condiciones que las anteriormente mencionadas;
- f)
- sembrado con un precultivo de levadura Saccharomyces cerevisiae durante un tiempo de 20 a 30 días, y a una temperatura entre 18ºC y 24ºC;
- g)
- eliminación de residuos sólidos y filtrado;
- h)
- almacenamiento del vino obtenido, a una temperatura de 4ºC hasta su posterior embotellado o crianza en barrica.
7. Procedimiento según reivindicación 6,
caracterizado porque en la producción de vino tinto, la
etapa d) se realiza preferentemente a una temperatura entre 20ºC a
24ºC.
8. Procedimiento según reivindicación 6,
caracterizado porque en la producción de vino tinto, la
etapa f) se realiza preferentemente a una temperatura entre 22ºC a
24ºC.
9. Procedimiento según reivindicación 6,
caracterizado porque en la producción de vino blanco, la
etapa d) se realiza preferentemente a una temperatura de 18ºC.
10. Procedimiento según reivindicación 6,
caracterizado porque en la producción de vino blanco, la
etapa f) se realiza preferentemente a una temperatura de 18ºC.
11. Uso de la levadura CECT 11773, en
fermentación secuencial dirigida para la producción de vinos.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200202743A ES2222786B1 (es) | 2002-11-28 | 2002-11-28 | Procedimiento de fermentacion dirigida secuencial, nueva cepa de levadura que interviene en el mismo, y su aplicacion industrial. |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| ES200202743A ES2222786B1 (es) | 2002-11-28 | 2002-11-28 | Procedimiento de fermentacion dirigida secuencial, nueva cepa de levadura que interviene en el mismo, y su aplicacion industrial. |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| ES2222786A1 ES2222786A1 (es) | 2005-02-01 |
| ES2222786B1 true ES2222786B1 (es) | 2006-04-01 |
Family
ID=34354757
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| ES200202743A Expired - Fee Related ES2222786B1 (es) | 2002-11-28 | 2002-11-28 | Procedimiento de fermentacion dirigida secuencial, nueva cepa de levadura que interviene en el mismo, y su aplicacion industrial. |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| ES (1) | ES2222786B1 (es) |
Family Cites Families (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| NZ207360A (en) * | 1983-03-23 | 1987-06-30 | Hickinbotham Winemakers | Method and apparatus for producing wine by full carbonic maceration |
| FR2654742A1 (fr) * | 1989-11-20 | 1991-05-24 | Francois Olivier | Boissons a base de mout de raisin partiellement fermente. |
-
2002
- 2002-11-28 ES ES200202743A patent/ES2222786B1/es not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (5)
| Title |
|---|
| GUILLAMÓN, J.M.; SABATÉ, J.; BARRIO, E. et al. Rapid identification of wine yeast species based on RFLP analysis of the ribosomal internal transcribed spacer (ITS) region. Archives of Microbiology, 1998, Vol. 169, páginas 387-392. * |
| HUANG, C.-Jr.; LEE, S.-L.; CHOU, C.-C. Production of 2-phenylethanol, a flavor ingredient, by Pichia fermentans L-5 under various culture conditions. Food Research International, 2001, Vol. 34, páginas 277-282. * |
| LAS HERAS-VÁZQUEZ, F.J.; MINGORANCE CAZORLA, L.; CLEMENTE-JIMÉNEZ, J.M.; RODRÍGUEZ-VICO, F. Identification of yeast species from orange fruit and juice by RFLP and sequence analysis of the 5.8S rRNA gene and the two internal transcribed spacers. FEMS Yeast Research 2003, Vol. 3, páginas 3-9. Publicado en línea 25. Julio 2002. \\ A 6,11 * |
| MADRID VICENTE, A.; MADRID CENZANO, J.; MADRID CENZANO, A. Tecnología y Legislación del Vino y Bebidas Derivadas. Edición ampliada. Madrid. Editoriales A. Madrid Vicente, Ediciones y Mundi-Prensa Libros, S.A., 1994, ISBN 84-87440-63-0 (A. Madrid Vicente, Ediciones) y 84-7114-487-5 (Mundi-Prensa Libros, S.A.). Páginas 87,104,105,119,138,139,148,149. * |
| TORO, M.E. y VÁZQUEZ, F. Fermentation behaviour of controlled mixed and sequential cultures of Candida cantarellii and Saccharomyces cerevisiae wine yeast. World Journal of Microbiology & Biotechnology. Mayo-Junio 2002, Vol. 18, nº 4, páginas 347-354. * |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| ES2222786A1 (es) | 2005-02-01 |
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