ES2222775B1 - Procedimiento para la deteccion de una predisposicion a una enfermedad cardiovascular. - Google Patents

Procedimiento para la deteccion de una predisposicion a una enfermedad cardiovascular.

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Abstract

Procedimiento para la detección de una predisposición a una enfermedad cardiovascular. Variante alélica en una región del cromosoma 5 limitada por dos marcadores, siendo dichos marcadores D5S400 y D5S408 y dicha variante alélica consistiendo en la sustitución de una citosina por una timina en la posición 46 respecto al inicio de la transcripción de la proteína del factor XII, siendo además dicha variante, indicativa de una predisposición a una enfermedad cardiovascular. El procedimiento para detectar la presencia de dicha variante alélica comprende: i) obtención de una muestra biológica de un humano y, ii) identificación, en el material genético de la muestra biológica, de la presencia de la variante alélica 46 C/T en la región del cromosoma 5 limitada por los marcadores D5S400 y D5S408 que comprende: a) la amplificación del fragmento genómico, b) digestión enzimática con SfaNI; y c) comparación electroforética con un patrón de bandas. El procedimiento permite detectar una predisposición auna enfermedad cardiovascular en un humano, pudiéndose diseñar una estrategia preventiva y terapéutica adecuada.

Description

Procedimiento para la detección de una predisposición a una enfermedad cardiovascular.
Campo de la invención
La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento para la detección de una predisposición a una enfermedad cardiovascular en humanos.
Antecedentes de la invención
Las enfermedades cardiovasculares, y en particular, tanto la trombosis arterial como la venosa, son una de las causas más frecuentes de mortalidad en los países industrializados.
Las causas de trombosis implica tanto factores genéticos como medioambientales. La alta prevalencia de trombosis y la conocida influencia medioambiental (por ejemplo utilización de anticonceptivos orales) sugiere el hecho de que se ven involucrados numerosos genes en la susceptibilidad a esta enfermedad.
De hecho, se han localizado y caracterizado varios defectos genéticos que llevan a un incremento en el riesgo trombótico (Lane DA, Mannucci PM, Bauer KA, Bertina RM, Bochkov NP, Boulyjenkov V, Chandy M, Dahlback B, Ginter EK, Miletich JP, Rosendaal FR, Seligsohn U. Inherited Thrombophilia: Part 1. Thromb Haemost 1996;76:651-662.).
Sin embargo, existe muy poca información accesible respecto a la importancia relativa de los factores genéticos en el riesgo a trombosis en la población, en general. Además, es poco probable que estas mutaciones conocidas, con sus comparativamente bajas frecuencias, constituyan la causa principal de riesgo a trombosis.
Recientemente, los inventores de la presente invención cuantificaron el componente genético de susceptibilidad a trombosis y los fenotipos relacionados (Souto JC, Almasy L, Borrell M, Garí M, Mártinez E, Mateo J, Stone WH, Blangero J, Fontcuberta J. Genetic determinants of hemostasis phenotypes in Spanish families, Circulation, 101:1546-1551. 2000; Souto JC, Almasy L, Borrell M, Blanco-Vaca F, Mateo J, Soria JM, Coll I, Felices R, Stone W, Fontcuberta J, Blangero J. Genetic susceptibility to thrombosis and its relationship to physiological risk factors: The GAIT study. Am J Hum Genet 67:1452-1459, 2000), observándose que los niveles de factor XII exhiben una de las más altas heredabilidades (67%) y una correlación genética positiva significativa (0,351), lo cual indica que algunos de los genes que influencian en la variación de este factor de riesgo fisiológico también influye en el riesgo a trombosis.
Por otro lado, es de gran interés un diagnóstico temprano de este tipo de enfermedades, especialmente en aquellas personas que, sin haber desarrollado la enfermedad son un grupo de riesgo por presentar alguna alteración genética, ya que de esta manera se podrían evitar muchas de las complicaciones secundarias asociadas a estas enfermedades.
Sin embargo, el desconocimiento existente en las causas genéticas que influyen en la trombosis genera problemas a la hora de establecer un diagnóstico adecuado para la identificación de individuos que presentan un riesgo genético para desarrollar enfermedades cardiovasculares y, en particular trombosis, ya que, como se ha mencionado anteriormente, se trata de una enfermedad multigénica (en la que se ven involucrados varios genes).
El objetivo de la presente invención es solventar los inconvenientes en el diagnóstico de enfermedades cardiovasculares proporcionando un procedimiento que permite la identificación de al menos una variante alélica en una región del cromosoma 5 limitada por los marcadores D5S400 y D5S408 para la identificación de individuos que presentan un factor de riesgo genético en el desarrollo cualquier enfermedad cardiovascular.
Descripción de la invención
El objetivo de la presente invención es la detección de por lo menos una variante alélica en el gen que codifica para la proteína factor XII, siendo muy útil para el diagnóstico genético ya que los individuos heterocigotos u homocigotos para el alelo mutado son los que tienen una mayor predisposición a sufrir eventos cardiovasculares. Este hecho supone un avance importante, especialmente en la prevención de dichas enfermedades cardiovasculares.
La presente invención se refiere a una variante alélica en una región del cromosoma 5 limitada por dos marcadores caracterizada por el hecho de que dichos marcadores son D5S400 y D5S408 y por el hecho de que dicha variante alélica consiste en la sustitución de una citosina por una timina en la posición 46 respecto al inicio de la transcripción de la proteína del factor XII, siendo, dicha variante, indicativa de una predisposición a una enfermedad
cardiovascular.
En un segundo aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de dicha variante alélica, que comprende las siguientes etapas:
(i) obtención de una muestra biológica de un humano, e
(ii) identificación, en el material genético de la muestra biológica, de la presencia de dicha variante alélica, comprendiendo los siguientes pasos:
a)
amplificación del fragmento genómico,
b)
digestión enzimática con SfaNI y,
c)
comparación electroforética con un patrón de bandas.
Por tanto, la presente invención va dirigida a la identificación de individuos que, aún no habiendo desarrollado la enfermedad, constituyen un grupo de riesgo por presentar al menos una variante alélica en dicha región cromosómica, que les hace susceptibles de desarrollar una enfermedad cardiovascular.
En una realización de la invención, la muestra biológica obtenida del humano es, preferiblemente, sangre.
En la presente invención, el término "material genético" se refiere a la secuencia de ADN que se extrae a partir de una muestra biológica. La extracción de ADN a partir de la muestra fisiológica se puede llevar a cabo mediante cualquiera de los protocolos conocidos en el estado de la técnica (por ejemplo, el descrito en el documento Miller SA, Dykes DD, Polesky HF (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells, Nucleic Acid Res 16:1215).
En una realización preferida, el procedimiento de la presente invención permite la identificación de al menos una variante alélica en el gen que codifica para la proteína factor XII.
En la presente invención, el término "variante alélica" se refiere a una variación genética en la secuencia de ADN que codifica para la proteína factor XII, implicando, dicha variación genética, una patología, pérdida o ganancia de función. En particular, dicha variación genética influye en la susceptibilidad a padecer una patología cardiovascular.
La secuencia del gen que codifica para la proteína factor XII en humanos se encuentra descrita en numerosos bancos de datos, como por ejemplo la base de datos OMIM, en la que la secuencia del gen que codifica para la proteína factor XII tiene el número de acceso 234000.004.
Los marcadores genéticos D5S400 y D5S408 se encuentran también descritos en diversos bancos de datos, como la Genome DataBank o la base de datos del Genoma Humano. Dichos marcadores se ubican en la posición 168.576.677 pb (D5S400) y 180.015.997 (D5S408) del cromosoma 5 (enumeración de los pares de bases (pb) desde el inicio del cromosoma 5).
La amplificación de dicha región codificante de factor XII se lleva a cabo mediante técnicas conocidas en el estado de la técnica, tales como la Reacción en Cadena de Polimerización (PCR).
La detección de la presencia de al menos una variante alélica en el fragmento amplificado se lleva a cabo mediante cualquiera de los protocolos conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo digiriendo el fragmento de ADN obtenido por PCR con cualquiera de las encimas de restricción que da lugar a un patrón de bandas electroforéticas diferencial en los individuos normales, los portadores heterocigotos y los portadores homocigotos.
La presente invención también se refiere a la utilización de una muestra biológica susceptible de comprender la variante alélica 46 C/T dentro de la región del cromosoma 5 limitada por los marcadores D5S400 y D5S408 para determinar la predisposición a enfermedades cardiovasculares que cursan con eventos trombóticos.
Existe una gran diversidad de enfermedades cardiovasculares que cursan con eventos trombóticos, tales como infarto agudo de miocardio, accidente vascular cerebral isquémico, trombosis venosa profunda, embolismos pulmonares, etc.
Un aspecto ventajoso de la presente invención es el hecho de que no necesita de técnicas especiales o complejas; de hecho, las técnicas utilizadas son del conocimiento general de cualquier experto en la materia. El aspecto clave de la presente invención es la detección de la variante alélica 46 C/T en una región del cromosoma 5, limitada por los marcadores D5400 y DS408 con el fin de determinar si existe una predisposición a una enfermedad cardiovascular en individuos que aún no la hayan desarrollado.
Además, con el procedimiento de la presente invención, se pueden identificar factores genéticos que permitan la comprensión de las bases moleculares de las enfermedades cardiovasculares, en particular con eventos trombóticos, siendo este aspecto clave para el desarrollo de métodos profilácticos y terapéuticos más eficaces.
Por otro lado, la identificación de una o más variantes alélicas en la secuencia genética que codifica para la proteína factor XII, conlleva ventajas asistenciales, ya que si en un individuo se identifica una variante alélica en el gen que codifica para la proteína factor XII, y aún, dicho individuo, no ha desarrollado la patología, se puede diseñar una estrategia preventiva y terapéutica.
La presente invención, permite, por tanto, la identificación de las regiones genéticas que afectan a la susceptibilidad a trombosis y a sus fenotipos intermedios. Además, presenta la ventaja que, al poderse diagnosticar en la primera fase de la enfermedad, la mortalidad y morbilidad asociadas a trombosis se puede reducir.
Actualmente, existe un gran interés de los investigadores en el campo de la genética molecular en generar una lista de todos los factores genéticos que contribuyen a desarrollar eventos cardiovasculares. Idealmente, esta lista ayudará a incrementar el conocimiento de los mecanismos de formación de trombos en una variedad diferente de ambientes y a diseñar estrategias de tratamiento y prevención a medida del perfil genético del individuo (Holtzman NA, Marteau TM. Will genetics revolutionize medicine?. N Engl J Med 2000 Julio 13;343(2):141-4). La presente invención constituye un avance importante en el diagnóstico y prevención de las enfermedades cardiovasculares.
A continuación, a modo ilustrativo, y no limitativo, se describe el siguiente ejemplo de realización.
Ejemplos
A continuación se expone un ejemplo, en el que se determina una variante alélica en el gen que codifica la proteína factor XII.
1. Identificación de una variante alélica en el gen que codifica para la proteína factor XII
En primer lugar, se extraen muestras de sangre de controles (250 individuos sanos) y de pacientes (250 individuos a diagnosticar). Una vez extraídas las muestras de sangre, se extrae el ADN mediante cualquiera de los protocolos estándar conocidos (Miller SA, Dykes DD, Polesky HF (1988) A simple salting out procedure for extracting DNA from human nucleated cells. Nucleic Acid Res 16:1215). Mediante la utilización de la técnica de PCR, utilizando condiciones estándar, se obtiene el fragmento genómico específico a analizar.
En segundo lugar, se identifica al menos una variante alélica en el fragmento obtenido. Para ello se puede utilizar cualquiera de los protocolos conocidos en el estado de la técnica, por ejemplo, secuenciación directa del fragmento amplificado, digestión con una encima de resticción (como hemos descrito anteriormente) o mediante sondas de hibridación específicas marcadas con fluorescencia.
En particular, y a modo ilustrativo, se determinará una variante alélica en el gen que codifica para la proteína factor XII, conocido como 46 C/T por la posición, con respecto al inicio de la transcripción.
El diagnóstico se basa en el análisis de la molécula de ADN mediante amplificación por PCR de un fragmento genómico de 369 pares de bases que contiene el nucleótido 46 C/T y digestión con el enzima de restricción SfaNI que reconoce la secuencia mutada. El fragmento amplificado de un alelo mutado es digerido por SfaNI en fragmentos de 247 y 122 pb. (Kanaji T, Okamura T, Osaki K, Kuroiwa M, Shimoda K, Hamasaki N, Niho Y (1998) A common genetic polymorphism (46 C to T substitution) in the 5'-untranslated region of the coagulation factor XII gene is associated with low translation efficiency and decrease in plasma factor XII level. Blood 91:2010-2014).
Amplificación por PCR: fragmento de 369 pb
Oligonucleótidos específicos:
Oligonucleótido 1: SEC. N° 1
Oligonucleótido 2: SEC. N° 2
MIX PCR (master mix Promega ref. M7502)
Master mix 12,5 \mul
Oligonucleótido 1 2,5 \mul
Oligonucleótido 2 2,5 \mul
ADN 4 \mul
Agua 3,5 \mul
Volumen final: 25 \mul 
\newpage
Programa PCR: PCR 9700 Aplied Biosystem.
1
Detección: digestión con el enzima SfaNI :
En primer lugar, se descongelan los reactivos necesarios para dar lugar a la digestión con el enzima de restricción SfaNI. A continuación, se añade en un tubo:
5 \mul producto de PCR (sin aceite)*
0,1 \mul SfaNI**
5 \mul NEBuffer
0,5 \mul BSA
H_{2}O c.s.p. 50 \mul
* de enfermos, control heterocigoto y control homocigoto normal.
** el enzima ha de estar siempre en un baño de hielo.
Se agita la mezcla, se centrifuga a 14000 rpm durante 5 segundos y se deja toda la noche a la estufa de 37°C.
Finalmente, se para la reacción a una temperatura de 4°C y se centrifuga a 14000 rpm, durante 5 segundos.
Resultados - Expresión de los resultados
Se ha de obtener un fragmento amplificado de 369 pb. La identificación de las bandas de la digestión con el enzima SfaNI de los alelos normales y de los portadores de la variante alélica 46C/T (alelo mutado) se hace por comparación con el patrón de bandas del marcador Phi:
Medida de las bandas
alelo normal: C 369 (1 bandas).
alelo mutado: T 247 / 122 (2 bandas).
- Interpretación de los resultados de la variante alélica 46C/T
Los individuos en los que se observa solo una banda de 369 pares de bases son homocigotos para el alelo normal, o sea, son portadores de dos alelos C (uno en cada uno de los dos cromosomas 5 donde se localiza el gen que codifica para la proteína Factor XII).
Los individuos en los que se observa una banda de 369 pares de bases y otras dos de 247/122 pares de bases, respectivamente, son heterocigotos para el alelo normal y el mutado, o sea, son portadores del alelo C (normal) en uno de los cromosomas 5 y portadores del alelo T (mutado) en el otro cromosoma 5.
Los individuos en los que sólo se observan dos bandas una de 247, y otra de 122 pares de bases (la banda de 369 pares de bases esta ausente) son homocigotos para el alelo mutado, o sea, son portadores de dos alelos T (mutado), uno en cada uno de los dos cromosomas 5 donde se localiza el gen que codifica para la proteína Factor XII.
<110> FUNDACIÓ PRIVADA I INSTITUT DE RECERCA DE L'HOSPITAL DE LA SANTA CREU I SANT PAU
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<120> Procedimiento para la detección de una predisposición a una enfermedad cardiovascular.
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<130> P153098
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<140> 200200308
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<141> 2001-01-31
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<160> 2
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<170> PatentIn Ver. 2.1
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<211> 21
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<213> Secuencia Artificial
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<223> Descripción de la Secuencia Artificial: SEC. N° 1
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ccagtcccac tatctagaaa a 
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21 
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atggctcatg gctgtgatag 
\hfill
20

Claims (4)

1. Uso de una variante alélica de la región del cromosoma 5 limitada por los marcadores D5S400 y D5S408 consistente en la sustitución de una citosina por una timina en la posición 46 respecto al inicio de la trascripción de la proteína del factor XII como marcador de predisposición a una enfermedad cardiovascular.
2. Procedimiento para detectar la presencia de una variante alélica según la reivindicación 1, caracterizado por el hecho de que dicho procedimiento comprende:
(i)
obtención de una muestra biológica de un humano, e
(ii)
identificación, en el material genético de la muestra biológica, de la presencia de dicha variante alélica según la reivindicación 1, que comprende:
a)
amplificación del fragmento genómico,
b)
digestión enzimática con SfaNI y
c)
comparación electroforética con un patrón de bandas.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en donde dicha muestra biológica es sangre.
4. Utilización de una muestra biológica susceptible de comprender la variante alélica según la reivindicación 1, para determinar la predisposición a enfermedades cardiovasculares que cursan con eventos trombóticos.
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