ES2222769A1 - Aplicaciones del peptido de secuencia nlrialrrlairln en terapia clinica. - Google Patents

Abstract

Aplicaciones del péptido de secuencia NLRIALRRLAIRLN en terapia clínica. Dicho péptido tiene utilidad en la fabricación de medicamentos para el tratamiento terapéutico de enfermedades en las que se precise una modulación de la actividad del sistema inmunitario y/o el control de la proliferación celular descontrolada. Aplicación en el sector biosanitario.

Description

Aplicaciones del péptido de secuencia NLRIALR
RLAIRIN en terapia clínica.

Campo técnico de la invención

La presente invención se encuadra dentro del sector biosanitario y en especial del tratamiento, control y prevención de las enfermedades relacionadas con el sistema inmunitario o con la proliferación celular descontrolada.

Mas específicamente, la presente invención proporciona nuevas aplicaciones terapéuticas del péptido P5 que inciden de forma específica sobre dicho tipo de enfermedades.

Estado de la técnica anterior a la invención

El péptido de secuencia NLRIALRRLAIRLN (denominado, de aquí en adelante, P5) se corresponde con los aminoácidos 77-83/83-77 de la molécula de histocompatibilidad HLA-B2702.

En los últimos años, se ha descrito que ciertos péptidos sintéticos con estructura correspondiente a la parte más conservada de \alpha1-hélice de la molécula de histocompatibilidad clase -I, tienen capacidad inmunomoduladora [(1) Clayberger, C., S.C. Lyu, P. Pouletty, and A. M. Krensky 1993 Péptidos corresponding to T-cell receptor-HLA contact regions inhibit class I-restricted inmune responses. Transplant.Pro. 25:477] y que, incluso, alguno de estos péptidos tienen la propiedad de prolongar la viabilidad de trasplantes en animales de experimentación [(2) Buelow, R.,P. Veyron, C. Clayberger, P.Pouletty, and J.L. Touraine 1995. Prolongation of skin allograft survival in mice following administration of ALLOTRAP. Transplantation 59:455; (3) Cuturi, M.C., R. Josien, P. Douillard, C. Pannetier, D. Cantarovich, H. Smit, S. Menoret, P. Pouletty, C. Clayberger, and J.P. Soulillou 1995. Prolongation of allogencic heart graft survival in rats by administration of a peptide (a.a 75-84) from the alpha 1 helix of the first domain of HLA-B701. Transplantation 59:661; (4) Gao, L., J. Woo, and R. Buelow 1996 Both L-and D-isomers of allotrap 2702 prolong cardiac allograft survival in mice J.Heart Lung Transplant 15:78; (5) Woo, J.L. Gao, M.C. Cornejo, and R. Buelow 1995. A synthetic dimeric HLA class 1 peptide inhibits T ceil activity in vitro and prolongs allogeneic heart graft survival in a mouse model. Transplantation 60:1156].

Los inventores han llevado a cabo estudios con el péptido P5, pudiendo demostrar que el mismo es capaz de de bloquear la lisis natural y la lisis redirigida de células NK. El modelo clásico de lisis natural, utilizando Cr^{51} es bien conocido y está descrito [(6) Tarazona, R., M. López-Luch, M.-D. Galiani, E. Aguado, F. Barahona, R. Solana, and J. Pena. 2000. HLA-B2702 (77-83) derived peptide binds to beta tubulin on human natural killer cells and blocks their cytotoxicity capacity. J. Immunol 2000.165:6776- y (7) Luque, I. R. Solana, M.D. Galiani, R. González, F. García, J.A. López de Castro and J. Peña 1996. Thrconine 80 on HLA-B27 confers protection against lysis by a group of natural Killer clones. Eur. J. Immunol. 26:1974]. Asimismo, el modelo de lisis redirigida también es conocido y está descrito en la referencia (6) anterior.

Los inventores también han podido identificar una proteína que forma parte del citoesqueleto de las células, a saber, la denominada \beta-tubulina, como el ligando para dicho péptido en las células efectoras. Ello hace pensar que esta proteína sea parte esencial en los fenómenos de citotoxicidad y que esté implicada en los fenómenos inmunorreguladores descritos para el P5 (6).

La posible intervención de la tubulina en el mecanismo de lisis de las células NK ya había sido descrita con anterioridad. Así, por ejemplo, se ha descrito la importancia del reordenamiento del citoesqueleto dependiente de tubulina, tanto en células efectoras como en células diana [(8) Bershadsky, A.D., O.Y. Ivanova, L.A. Lyass, O.Y. Pletyushkina, J.M. Vasiliev, and I.M. Gelfand 1990. Cytoskeletal reorganizations responsible for the phorbol ester-induced formation of cytoplasmic processes: possible involvement of intermediate filaments. Proc Natl Acad Sci USA., 87:18848; y (9) Arancia G. Sirianni MC, Malorni W. Soddu S. Crateri P. Fiorentini C. Aiuti F, Donelli G. 1991. Suicide behavior of target cells after binding with natural Killer cells.Blood Cells; 17(1):159-72; discussion 173-5], y se ha demostrado que la inhibición del ensamblaje de los microtúbulos con colchicina "in vitro", protege del rechazo de trasplantes renales en animales de experimentación, prolongando con ello la viabilidad del órgano transplantado [(10) Akalin E. Hancock WW. Perico N.Remuzzi G. Imberti O. Carpenter CB Sayegh 1995. MH. Blocking cell microtubule assembly inhibits the alloimmune response in vitro and prolongs renal allograft survival by inhibition of Thl and sparing of Th2 cell function in vivo. J. Am Soc. Nephrol., 5(7):1418-25]. Además, se ha demostrado la importancia del defecto de polimerización existente en las células NK de pacientes infectados por HIV, para determinar la alteración funcional de las mismas en esta enfermedad [(11) Sirianni MC. Soddu S. Malorni W. Arancia G, Aiuti F. Soddus S. 1988. Mechanism of defective natural killer cell activity in patients with AIDS is associated with defective distribution of tubulin Immunol. 15:140(8):2565-8].

El efecto encontrado para el P5 sobre la \beta-tubulina parece equivalente al mostrado por el taxol, que es un fármaco ampliamente utilizado en oncología, por su acción inhibidora de la proliferación celular, debido a su capacidad de interferir con la función de los microtúbulos de la célula [(12) Amos, L.A. and J. Lowe 1999. How Taxol(R) stabilises microtubule structure. Chem Biol 6:R65-R69; (13 Wall, M.E. 198 Camptothecin and taxol: discovery to clinic. Med Res Rev 18:299; (14) Derry, W.B., L. Wilson, I.A. Khan, R.F. Luduena, and M.A. Jordan 1997. Taxol differentially modulates the dynamics of microtubules assembled from unfractionated and purified beta-tubulin isotypes, Biochemistry 363554; (15) Ojima, I.S. Chakravarty, T. Inoue, S. Lin, L. He. S.B. Horwitz, S.D. Kuduk, and S. J. Damishcfsky 1999. A common pharmacophore for cytotoxic natural products that stabilize microtubules. Proc. Natl Acad Sci USA. 96:4256].

En experimentos realizados "in vitro" (6), los inventores han podido comprobar que el péptido P5 ejerce una acción directa sobre la tubulina, produciendo la polimerización de la misma. Asimismo, es conocido que el taxol y el GTP inducen la polimerización de la tubulina [(16) Rao, S.L. He, S. Chakravarty, I. Ojima, G.A. Orr, and S.B. Horwitz 1999. Characterization of the Taxol binding site on the microtubule. Identification of Arg(282) in beta-tubulin as the site of photoincorporation of a 7-benzophenone analogue of Taxol. J. Biol Chem.274:37990], mientras que dicha polimerización no tiene lugar cuando se utiliza un péptido control (6).

Descripción detallada de la invención

La presente invención, tal y como se indica en su enunciado, se refiere a las aplicaciones del péptido P5 en terapéutica clínica.

El péptido P5, cuya secuencia se ha mostrado en el apartado anterior de la presente memoria descriptiva, se caracteriza por su efecto bloqueante "in vitro" de la acción destructora de las células inmunocompetentes con mayor capacidad lítica, como son los linfocitos T citotóxicos y las células NK. Precisamente son estas células las que están implicadas en la destrucción de las células tumorales, de las células infectadas por virus y de otras muchas células que hayan experimentado algún tipo de mutación o alteración estructural.

El péptido P5, por su capacidad para intervenir en la regulación de la actividad del sistema inmunitario bloqueando la acción de los linfocitos citotóxicos, posee una actividad inmunosupresora sobre el mismo.

Esta característica le convierte en un péptido con aplicaciones en terapéutica clínica en diferentes casos, entre los que cabe citar los siguientes:

(i) casos de hiperactividad del sistema inmunitario, lo cual da lugar a enfermedades autoinmunes (por ejemplo, artritis reumatoide, esclerosis múltiple, diabetes tipo II, enfermedades alérgicas en sus diferentes manifestaciones, etc.);

(ii) casos en los que se precise la inhibición funcional del sistema inmunitario (por ejemplo, trasplantes de órganos para controlar los problemas de rechazo);

(iii) casos en los que se precise el control o interferencia del crecimiento celular acelerado, como por ejemplo las enfermedades tumorales.

Las anteriores aplicaciones están basadas en el efecto del P5 sobre la polimerización de la tubulina, y en la interferencia secundaria de dicho efecto sobre la actividad citotóxica de las células inmunocompetentes, o sobre la actividad mitótica y el crecimiento celular.

Como ya se comentó en el apartado anterior de la presente memoria, se ha publicado (12-15) que el efecto encontrado del P5 sobre la \beta-tubulina parece ser equivalente al del taxol. Esto es, el P5 parece ejercer una acción directa sobre la tubulina produciendo la polimerización de la misma "in vitro" (6) siendo conocido como el taxol y GTP inducen la polimerización de la tubulina (16).

A este respecto, el presente solicitante ha podido demostrar que el péptido P5 es capaz de inducir la polimerización de la tubulina de forma independiente de GTP (ver diagrama expuesto en la figura 1). Es decir, dicha polimerización se produce en ausencia de GTP y, además, se protege la despolimerización que tendría lugar con GTP al enfriar el sistema a 4°C. En el diagrama ilustrado por la figura 1 se muestra el efecto directo de la tubulina (I), probablemente por acción sobre los microtúbulos celulares y acción chaperona y sobre HSP (II), que a su vez ejercen efecto indirecto sobre la lisis celular (III). Por su parte, la hiperpolimerización de la tubulina por acción del péptido bloquearía ambos efectos.

En el siguiente apartado de la presente memoria descriptiva se ilustran los ensayos y experimentos que han permitido a los inventores llegar a estas conclusiones.

Todo lo anterior permite preconizar el uso del péptido P5 en la modulación de la actividad del sistema inmunitario y/o el control de la proliferación celular indeseada. Así el descenso en los porcentajes de lisis natural y lisis redirigida de células NK policlonales y de la línea celular NKL, comentadas más adelante en los resultados de los ensayos, justifican el empleo del P5 en diferentes grupos de enfermedades:

- Enfermedades de tipo autoinmune, por ejemplo, la artritis reumatoide. En este caso se puede instaurar un tratamiento bien local (en la propia articulación) o bien sistémico (vía general), empleando un medicamento que contenga como ingrediente activo dicho péptido P5, el cual bloquea la reacción del sistema inmunitario, evitando con ello, el daño que éste produce sobre las articulaciones.

- Enfermedades de tipo alérgico en sus diversas manifestaciones. En este tipo de enfermedades pueden utilizarse los mismos criterios que en las enfermedades autoinmunes, puesto que lo que se produce en el organismo es una respuesta exagerada del sistema inmunitario del paciente frente al alérgeno, produciendo la patología y síntomas de dicha respuesta. Por ello, es aplicable un medicamento que contenga como principio activo el P5 que puede controlar dicha respuesta exacerbada constante de la sintomatología alérgica.

- Enfermedades de tipo tumoral. En este tipo de enfermedades existe una actividad mitótica acelerada y descontrolada. Por ello es aplicable un medicamento que contenga como principio activo el P5, el cual actúe como bloqueante de la mitosis para detenerlo o reducir la proliferación celular indeseada, tanto de forma local (actuando sobre el propio foco tumoral) como de forma general (para controlar la generación de metástasis).

- Enfermedades derivadas del rechazo de órganos trasplantados. En el caso de trasplantes de órganos es aplicable un medicamento que contenga como principio activo el P5, con el fin de interferir en la respuesta del sistema inmunitario frente al órgano trasplantado, interviniendo con la tubulina de las células respondedoras, impidiendo la total activación de las células responsables del rechazo.

En resumen, de acuerdo con la presente invención el péptido P5 con la secuencia NLRIALRRLAIRLN, tiene aplicación en el tratamiento de todas aquellas situaciones patológicas en las que sea necesario inducir un estado de inmunosupresión del sistema inmunitario, para evitar o aminorar las acciones lesivas del mismo. Así, dicho péptido es utilizable en las terapias inmunosupresoras para pacientes trasplantados y en la modulación de la respuesta en enfermedades autoinmunes y alérgicas. Asimismo, el péptido P5 es utilizable como anticancerígeno frente a enfermedades tumorales, por su capacidad para disminuir el ritmo de la proliferación celular.

Breve descripción de la figura

La figura 1 y única adjunta a la presente memoria descriptiva es un diagrama ilustrativo en el que se muestra como el péptido P5 es capaz de inducir la polimerización de la tubulina de forma independiente de GTP.

Modos de realización de la invención

Seguidamente se ilustran ensayos científicos y los resultados de los mismos para que sirvan como soporte de las diferentes aplicaciones del péptido P5, objeto de la presente invención. Debe entenderse que dichos ensayos son meramente ilustrativos de la invención y no pretenden en absoluto limitar su alcance, el cual está definido exclusivamente por la nota reivindicatoria adjunta.

Ensayos y resultados

El solicitante ha podido comprobar que se produce una disminución significativa del porcentaje de lisis natural cuando se emplean, como células efectoras, un pool de células NK policlonales purificadas, con actividad citotóxica y, como células diana, la línea celular 721.221, sensible a células NK.

Utilizando ensayos clásicos de citotoxicidad medida en c . p . m . (cuentas por minuto) de liberación de Cr^{52}, se produjo una disminución de un 55\pm 12% de la lisis control, cuando se incubaron 200 \mug/ml del P5 con las células efectoras, 30 minutos previos al ensayo de lisis, mientras que el porcentaje de lisis no varió al utilizar a las mismas dosis y concentraciones, un péptido sintético de control, correspondiente a la misma secuencia que el P5 (77-83/83-77), derivado de la molécula de histocompatibilidad HLA-B44 (al que se designará P4).

Por otro lado, los resultados de la lisis redirigida, utilizando como células efectoras células NK policlonales purificadas y como células diana la línea celular resistente a NK, P815, en presencia de 20 \mug/ml de un anticuerpo monoclonal anti-CD16, como se describe en (6), muestran una inhibición del 41\pm 6% de lisis respecto al control, al incubar el P5 con las células efectoras en igual concentración y tiempo que en el caso anterior.

Cuando se utilizan como células efectoras la línea celular NKL, con actividad citotóxica NK, y como células diana la línea celular NK-sensible K562, en un ensayo clásico de lisis, se observa que existe una disminución de aproximadamente un 63% de la lisis control, al añadir al ensayo el P5 incubado previamente durante 30 minutos con las células efectoras, hecho que no ocurre con el péptido P4.

Se ha podido identificar a la proteína de unión específica del P5 como \beta-tubulina, mediante aislamiento y secuenciación de la misma. la tubulina es la proteína mayor de los microtúbulos, y está implicada en la actividad lítica de las células.

La adición de P5 induce polimerización de la tubulina en los microtúbulos a 37°C, en ausencia de GTP, y la estabiliza contra la despolimerización por frío (1). Este efecto del P5 es similar al producido por el taxol, un fármaco de conocido uso en oncología por su efecto antimitótico (12-14, 16).

Claims (8)

1. Uso del péptido dimérico P5 de estructura NL
RIALRRLAIRLN, correspondiente a la secuencia de aminoácidos 77-83/83-77 de la molécula de histocompatibilidad HLA-B2702, en la fabricación de medicamentos para el tratamiento terapéutico de enfermedades en que se precise una modulación de la actividad del sistema inmunitario y/o el control de la proliferación celular descontrolada.

2. Uso del péptido P5, según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad de tipo autoinmune.

3. Uso del péptido P5, según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha enfermedad autoinmune es artritis reumatoide.

4. Uso del péptido P5, según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha enfermedad autoinmune es esclerosis múltiple.

5. Uso del péptido P5, según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha enfermedad autoinmune es diabetes tipo II.

6. Uso del péptido P5, según la reivindicación 2, caracterizado porque dicha enfermedad autoinmune es una enfermedad alérgica en cualquiera de sus manifestaciones.

7. Uso del péptido P5, según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad derivada del rechazo de órganos trasplantados.

8. Uso del péptido P5, según la reivindicación 1, caracterizado porque dicha enfermedad es una enfermedad de tipo tumoral.