ES2221172T3

ES2221172T3 - Procedimiento para detectar la presencia de materias biologicas de origen bovino, y oligonucleotidos para su realizacion.

Info

Publication number: ES2221172T3
Application number: ES98924370T
Authority: ES
Inventors: Catherine Hanni; Vincent Laudet; Corine Grangette; Marc Lange; Stephane Pasteau
Original assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Priority date: 1997-05-05
Filing date: 1998-05-04
Publication date: 2004-12-16
Anticipated expiration: 2018-05-04
Also published as: AU7659098A; DE69823346T2; FR2762842A1; FR2762842B1; ZA983771B; CA2286585A1; EP0980378A1; EP0980378B1; ATE264865T1; CA2286585C; US6756495B1; AU753665B2; WO1998050401A1; DE69823346D1

Abstract

La presente invención se refiere a un procedimiento de obtención de un fragmento de ADN bovino, que presenta una dimensión y una secuencia determinadas, específico de los bovinos, y en particular de las especies Bos taurus y Bos indicus, a partir de una muestra de materia orgánica, procedimiento por el cual se amplia, por reacción de polimerización en cadena, una secuencia determinada del genoma bovino presente en los genomas de los bovinos pero ausente en los genomas de las otras especies animales.

Description

Procedimiento para detectar la presencia de materias biológicas de origen bovino, y oligonucleótidos para su realización.

La presente invención se refiere a un procedimiento para detectar la presencia de materias biológicas de origen bovino en una muestra de materia orgánica.

Asimismo, tiene por objeto unos oligonucleótidos para la realización de este procedimiento.

En 1986, la encefalopatía espongiforme bovina (ESB), o enfermedad de "las vacas locas", se puso de manifiesto por primera vez en el censo bovino británico. Desde entonces, más de 100.000 casos clínicos se han identificado en el ganado. Esta enfermedad, presente en Gran Bretaña, tiene una evolución endémica. La enfermedad se ha observado también en diferentes países europeos: Irlanda, Suiza, Francia, Dinamarca, Alemania - en los que evoluciona de manera esporádica.

Se conoce el cuadro clínico de la enfermedad. El agente infeccioso responsable, llamado "prión", se caracteriza, entre otras propiedades, por una resistencia extrema a los agentes descontaminantes clásicos tales como la temperatura, las radiaciones o los detergentes. Por otra parte, estudios recientes han mostrado la enorme resistencia del agente infeccioso en las condiciones "naturales", y en particular su persistencia en las dehesas. Así, la capacidad infecciosa puede persistir en el suelo durante al menos tres años.

Uno de los modos de transmisión del agente infeccioso es la ingestión de alimentos contaminados, pudiendo por otra parte realizarse esta transmisión de una especie animal hacia otra.

El análisis de los datos epidemiológicos ha permitido descubrir el origen de la epidemia inglesa, debida a una contaminación mediante el agente infeccioso de harinas de carnes y de huesos (FVO) utilizadas para la fabricación de aditivos alimentarios destinados a la alimentación de vacas lecheras. Estas harinas son subproductos de los centros de despiece, que proceden del tratamiento de piezas en canal y residuos que provienen de los mataderos.

La estructura del "prión" no se conoce hasta ahora, y no existe ningún ensayo que permita detectarlo.

Por tanto es importante determinar si una materia orgánica contiene materias biológicas de origen bovino, y es susceptible de contener "priones".

En el campo agroalimentario, la caracterización de especies animales ha utilizado primero las técnicas bioquímicas de análisis de las proteínas (BARA et al. 1992, Trends in Food Science and Technology, 3, 69-72; SOTELO et al. 1993, Trends in Food Science and Technology, 4, 395-401; Hernández et al., 1994, Food and Agricultural Immunology, 6, 95-104). Sin embargo, estos métodos son poco específicos (electroforesis), o son incompatibles con la desnaturalización de las muestras a analizar (inmunoanálisis). Ahora se sustituyen progresivamente por técnicas de análisis del ADN, molécula menos sensible que las proteínas a las condiciones físico-químicas desnaturali-
zantes.

La identificación de las principales especies animales de interés se ha efectuado primero mediante técnicas de hibridación de sondas nucleicas (BUNTJER et al. 1995, Zeitschrift fuer Lebensmittel Untersuchung und Forschung 201(6): 577-582; MEYER et al., 1994, Fleischwirtschaft 74(11): 1237-1238; TSUMURA et al., 1992, Journal of Japanese Society of Food Science and Technology 39(1) 60-63; EBBEHOJ y THOMSEN, 1991, Meat Science 30(4): 359-366; BAUER et al., 1987, Archiv fuer Lebensmittelhygiene 38(6): 172-174; EBBEHOJ y THOMSEN, 1991, Meat Science 30(3): 221-234).

Esta tecnología, de uso delicado, ahora está suplantada por el método de la PCR (reacción de polimerización en cadena) que ha sido utilizado para caracterizar materias biológicas que provienen de diversas especies animales.

Los únicos métodos de amplificación mediante PCR descritos para el buey (Bos taurus) recurren a la amplificación de la región del ADN mitocondrial (ADNmt) que codifica un citocromo por medio de cebadores de PCR que reconocen secuencias conservadas en las especies de vertebrados, y después a su caracterización por medio de enzimas de restricción (RFLP) o mediante secuenciación (MEYER et al. 1995, Journal of AOAC-International 78(6): 1542-1551; CHIKUNI et al. 1994, Animal Science and Technology, 65(6): 571-579; GUGLISH et al. 1994, J. Forensic. Sci. 39(2): 353-361).

Se conoce la organización y la secuencia completa del ADN mitocondrial (ADNmt) bovino (ANDERSON et al. 1982, J. Mol. Biol. 156(4): 683-717). A partir de estos datos, se han dedicado varios trabajos al estudio de la variabilidad genética del genoma mitocondrial de bóvidos domésticos mediante análisis del polimorfismo de restricción (CHEN et al. 1995, Comp. Biochem. Physiol. B. Biochem. Mol. Biol. 111(4): 643-649; KIKKAWA et al. 1995, Biochem. Genet. 33(1-2): 51-60; BRADLEY et al. 1994, Anim. Genet. (4): 265-271; AMANO et al. 1994, Anim. Genet. 25(1): 29-36; SUZUKI et al. 1993, Anim. Genet. 24(5): 339-343: LAN et al. 1993, I. Chuan. Hsueh. Pao 20(5): 419-425; BHAT et al. 1990, Biochem. Genet 28(7-8): 311-318; LOFTUS et al., 1994, Anim. Genet. 25: 265-271) o mediante secuenciación (LOFTUS et al. 1994, Proc. Natl. Sci. USA 91(7): 2757-2761; RON et al. 1993, Anim. Genet. 24(3): 183-186; BRADLEY et al,. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5131-5135; BAILEY et al., 1996, Proc. R. Soc. Lond. B., 263: 1467-1473).

La secuenciación parcial de la región de control del ADNmt bovino se ha efectuado además para diversas razas bovinas europea, africana e hindú (LOFTUS et al., 1994, Proc. Natl. Sci. USA 91(7): 2757-2761; BRADLEY et al. 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 5131-5135; BAILEY et al., 1996, Proc. R. Soc. Lond. B, 263: 1467-1473).

La patente americana 5.596.089 se refiere a secuencias oligonucleotídicas bovinas y porcinas del gen nuclear SRY, que permite la determinación molecular del sexo de los bovinos o porcinos. El método descrito en esa patente es un método de sexaje de los tejidos bovinos y porcinos.

El artículo de Sinclair et al. (Gene, 1995, vol. 1, nº 167, páginas 285-289) se refiere a estrategias que utilizan la reacción de PCR para aislar el extremo 5' del ADNc bovino que codifica la inmunoglobulina.

Del estudio de la técnica anterior, se destaca que ya se han efectuado trabajos de análisis del ADN de algunas especies y razas bovinas. Sin embargo, ninguno de los documentos de la técnica anterior describe un método específico y sensible de amplificación del ADN bovino, que permite identificar trazas de materias biológicas de origen bovino, aplicable a todas las razas bovinas y en materias orgánicas que presentan composiciones muy variadas.

En efecto, las técnicas de identificación de ADN bovino conocidas (por ejemplo, análisis de los genomas mediante RFLP o PCR-RFLP realizadas en porciones de secuencias poco variables) presentan inconvenientes. Con estos métodos poco específicos, a menudo es difícil analizar mezclas de ADN que provienen de diferentes especies, debido al gran número de bandas, y de las dificultades de interpretación unidas a esta característica.

La baja sensibilidad de algunas de estas técnicas no permite destacar de manera fiable la presencia de materias orgánicas de origen bovino en sustratos orgánicos muy diversos. Estos métodos son inaplicables cuando el ADN presente en las muestras está degradado en forma de pequeños fragmentos de una tamaño menor que aproximadamente 500 pares de bases.

El problema de la identificación de materias orgánicas que provienen de todas las razas bovinas es particularmente crucial, porque la encefalopatía espongiforme bovina no se limita a las razas europeas, sino que se extiende a las razas africanas e hindúes (Bos taurus y Bos indicus).

Se ha intentado entonces resolver estos problemas.

Se ha mostrado que se podía detectar de manera específica y sencilla, y con una gran sensibilidad, la presencia de materias biológicas de origen bovino, de cualquier raza bovina (Bos taurus y Bos indicus), en muestras de materias orgánicas, amplificando de manera específica una secuencia determinada del genoma bovino.

En su forma más general, la presente invención se refiere entonces a un procedimiento para la obtención de un fragmento de ADN bovino que presenta un tamaño y una secuencia determinados, específico de los bovinos, y en particular de las especies Bos taurus y Bos indicus, a partir de una muestra de materia orgánica, procedimiento mediante el cual se amplifica, mediante reacción de polimerización en cadena, una secuencia determinada del genoma bovino presente en los genomas de bobinos pero ausente en los genomas de otras especies animales.

La presente invención tiene además por objeto un procedimiento de detección y de identificación de la presencia de materias biológicas de origen bovino en una muestra de materia orgánica, caracterizado porque la presencia de ADN de origen bovino se determina en dicha materia orgánica mediante amplificación de una secuencia de ADN específica del genoma bovino.

Se entiende por materia orgánica toda materia sólida o líquida que se supone tiene al menos parcialmente un origen biológico.

Ventajosamente, la secuencia de ADN es de origen mitocondrial. La elección de una secuencia mitocondrial es particularmente ventajosa porque, en una célula animal, hay de alrededor de 100 a 1000 copias de ADN mitocondrial por copia de ADN nuclear. En caso de degradación del ADN, la probabilidad de detectar un ADN mitocondrial es entonces mucho más mayor que la probabilidad de detectar un ADN nuclear. Además, el ADN mitocondrial es más resistente a la degradación que el ADN nuclear. El ADN mitocondrial se detectar entonces de forma más segura en materias orgánicas en las que el ADN se somete a diversos factores físicos (temperatura, presión, etc.), químicos (hidrólisis, oxidación, etc.) o bioquímicos, que tienden a su degradación.

Esta particularidad se revela particularmente importante cuando se busca detectar la presencia de materias biológicas de origen bovino en materias orgánicas que han tenido numerosas transformaciones, por ejemplo en cosmética, en la industria agroalimentaria, tales como las harinas utilizadas para la alimentación del ganado, los abonos compuestos, los abonos y los estiércoles, etc.

La invención es igualmente ventajosa para detectar la presencia de materias biológicas de origen bovino en los siguientes sustratos orgánicos: las carnes crudas, ahumadas, o cocinadas, los gránulos, la sangre y los productos a base de sangre, la leche y los productos a base de leche, los huesos y los productos a base de huesos, los cueros, las pieles, los marfiles, los pelos, los cuernos, y los productos a base de cuernos, el guano, las heces, estiércol líquido, las aguas de estiércoles, la gelatina y los productos a base de gelatina, los productos cosméticos y agroalimentarios.

La invención se refiere a fragmentos de ADN mitocondrial específicos del genoma bovino, de tamaños de aproximadamente 500 pares de bases a aproximadamente 100 pares de bases, especialmente de aproximadamente 152 a 480 pares de bases, que presentan una identidad de secuencia de al menos 80% y preferentemente de al menos 90% con las regiones homólogas de la secuencia de la región de control del ADN mitocondrial determinada por ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol. 156, 683-717, y especialmente de la posición 15824 a la posición 171, determinándose estas posiciones según la secuencia completa del ADN mitocondrial del buey que comprende 16338 nucleótidos, determinada por ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717.

Preferentemente, la amplificación del ADN se efectúa mediante el método de amplificación en cadena por polimerasa (PCR), que comprende una repetición de un ciclo constituido por las etapas siguientes:

-: Calentamiento del ADN extraído de la muestra de materia orgánica, a fin de separar el ADN en dos hebras monocatenarias.

-: Hibridación de cebadores oligonucleotídicos a las hebras de ADN monocatenarias, a una temperatura adecuada, y

-: Alargamiento de cebadores oligonucleotídicos mediante un polimerasa, a una temperatura adecuada.

De manera particularmente preferente, uno de los cebadores es un oligonucleótido que presenta una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente de al menos de 90%, y ventajosamente de al menos 95%, con un oligonucleótido constituido por una secuencia de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, especialmente alrededor de 20 a 25 nucleótidos, comprendida en la secuencia SEC ID nº 1 siguiente (posiciones 136 a 178 según ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717):

TAATGTCCATGCTTATCATTATGCTGGTGCTCAAGATGCAGTT

Este primer cebador puede ser en particular un oligonucleótido, o una mezcla de oligonucleótidos, que contiene la secuencia SEC ID nº 2 siguiente (posiciones 152 a 166 según ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717):

YTATCATTATGCTGG

en la que Y es T o C.

Preferentemente, es un oligonucleótido, o una mezcla de oligonucleótidos, que presenta la secuencia SEC ID nº 3 siguiente (posiciones 152 a 171 según ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717):

CATGCYTATCATTATGCTGG (PBR6)

en la que Y es T o C.

El segundo cebador es un oligonucleótido que presenta una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente de al menos 90%, y ventajosamente de al menos 95%, con un oligonucleótido constituido por una secuencia de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, especialmente de aproximadamente 20 a 25 nucleótidos, comprendida en la secuencia SEC ID nº 4 siguiente (posiciones 16015 a 16060 según ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717):

ATTATATGCCCCATGCATATAAGCAAGTACATGACCTCTATAGCAG

Tal oligonucleótido es preferentemente el que comprende la secuencia SEC ID nº 5 siguiente (posiciones 16034 a 16048 según ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717):

TAAGCAAGTACATGA

o también preferentemente el que presenta la secuencia SEC ID nº 6 siguiente (posiciones 16029 a 16048 según ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717):

GCATATAAGCAAGTACATGA (PBF9)

Cada uno de los oligonucleótidos SEC ID nº 1 a 3 se utiliza emparejado con uno cualquiera de los oligonucleótidos SEC ID nº 4 a 6. El par de cebadores más ventajoso es el par SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6.

Según un modo de realización particularmente ventajoso de la presente invención, al menos una parte de las etapas de hibridación de los ciclos que constituyen la reacción de amplificación se efectúa a una temperatura de aproximadamente 50ºC a 58ºC, especialmente 50ºC a 55ºC. Además, se ha encontrado que una temperatura de aproximadamente 51ºC es particularmente apropiada para obtener una amplificación específica.

Tal modo de realización permite obtener una gran especificidad de amplificación.

Las temperaturas de las etapas de separación de las hebras y del alargamiento son ventajosamente de aproximadamente 94ºC y 72ºC, respectivamente.

El procedimiento descrito aquí arriba es específico porque no da ninguna reacción de amplificación detectable en presencia de ADN de otro origen distinto del bovino (Bos taurus y Bos indicus). La utilización de los cebadores SEC ID nº 1 a SEC ID nº 6 da origen solamente a un fragmento de ADN de aproximadamente 480 pares de bases. Este fragmento oligonucleotídico constituye otro objeto de la presente invención.

Ventajosamente, presenta una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95%, con la secuencia SEC ID nº 8 siguiente (posiciones 16029 a 171 según la secuencia de ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717, que contiene 16338 nucleótidos):

1

Se observará que, para la realización de este procedimiento, se ha resuelto un número de problemas técnicos. Primero, la elección de los cebadores constituía un verdadero problema, porque se necesitaba seleccionar secuencias comunes a las diferentes razas bovinas, y por otra parte que se hibridasen de manera estable, en condiciones físico-químicas muy variables representativas de la gran diversidad de materias orgánicas susceptibles de contener materias biológicas de origen bovino.

Se han perfeccionado igualmente otros cebadores oligonucleotídicos presentados aquí abajo y que tienen la característica de poder engendrar fragmentos de amplificación más pequeños, de tamaño menor que aproximadamente 200 pares de bases y mayor que 100 pares de bases, y ventajosamente de aproximadamente 150 pares de bases. Las secuencias de estos cebadores oligonucleotídicos son las siguientes:

2

Las posiciones de estos cebadores nucleotídicos, que se definen según la secuencia de ANDERSON et al., 1982, J. Mol. Biol., 156, 683-717, se indican entre paréntesis.

La invención se refiere igualmente a pares de cebadores oligonucleotídicos caracterizados porque los oligonucleótidos que los constituyen se seleccionan de entre los:

-: que presentan una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95% con un oligonucleótido constituido por una secuencia de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, especialmente 20 a 25 nucleótidos, que comprende al menos 10 nucleótidos contiguos de la SEC ID nº 9 siguiente:

GAGCCTTATCAGTATTAAATTTATC

-: o de la secuencia SEC ID nº 10 siguiente:

CATTAATGTTATGTACATTA

-: o de la secuencia SEC ID nº 11 siguiente:

TTTCACGCGGCATGGTAATT

-: o de la secuencia SEC ID nº 12 siguiente:

ATCCAATGAATTTTACCAGG

-: o de la secuencia SEC ID nº13 siguiente:

GTCAATGGTCACAGGACATA

-: o de la secuencia SEC ID nº 14 siguiente:

ATTGACTTTGTTTGGAGTGC

Cada uno de los cebadores oligonucleotídicos SEC ID nº 4 a 6 y SEC ID nº 9, 12 y 13 se utiliza emparejado con uno cualquiera de los cebadores oligonucleotídicos SEC ID nº 1 a 3 y SEC ID nº 10, 11 y 14. Los pares de cebadores oligonucleotídicos más ventajosas son las siguientes: SEC ID nº 9 con SEC ID nº 10, SEC ID nº 6 con SEC ID nº 11, SEC ID nº 12 con SEC ID nº 3, SEC ID nº 13 con SEC ID nº 14.

El par de cebadores SEC ID nº 9 con SEC ID nº 10 permite obtener el fragmento que presenta ventajosamente una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95% con el fragmento de ADN siguiente:

\newpage

SEC ID nº 15 (posiciones 15824-15981):

20

El par de cebadores SEC ID nº 6 con SEC ID nº 11 permite obtener el fragmento que presenta ventajosamente una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95% con el fragmento de ADN siguiente:

SEC ID nº 16 (posiciones 16029-16181):

21

El par de cebadores SEC ID nº 12 con SEC ID nº 13 permite obtener el fragmento que presenta ventajosamente una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95% con el fragmento de ADN siguiente:

SEC ID nº 17 (posiciones 16245-171):

3

El par de cebadores SEC ID nº 13 con SEC ID nº 14 permite obtener el fragmento que presenta ventajosamente una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95% con el fragmento de ADN siguiente:

SEC ID nº 18 (posiciones 181-338):

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Los productos de amplificación descritos aquí arriba, y especialmente las secuencias SEC ID nº 15 a SEC ID nº 18, pueden ser detectados cuando una fracción importante del ADN está degradada, a saber, después de la acción de los factores físicos, químicos y/o bioquímicos descritos aquí arriba y durante las transformaciones de los sustratos orgánicos.

El experimentador busca preferentemente la presencia de SEC ID nº 8, descrita aquí arriba, con la ayuda de los cebadores apropiados y, en el caso en el que la detección sea negativa, busca los fragmentos de tamaño menor y especialmente los de aproximadamente 150 a 260 pares de bases engendrados especialmente mediante la utilización de los cebadores SEC ID nº 9 a SEC ID nº 14.

La utilización de los cebadores SEC ID nº 9 a SEC ID nº 14 da origen sólo a fragmentos de ADN únicos de aproximadamente 150 a 260 pares de bases. El procedimiento descrito aquí arriba es específico porque no da ninguna reacción de amplificación detectable en presencia de ADN de origen distinto del bovino. Estos fragmentos oligonucleotídicos constituyen otro objeto de la presente invención.

La singularidad del producto de amplificación representa otra ventaja de la presente invención, permitiendo obtener una sensibilidad importante y facilitando enormemente la interpretación de los resultados.

El procedimiento según la presente invención presenta entonces un gran número de ventajas con relación a las técnicas de identificación de ADN bovino ya conocidas.

Así, el procedimiento descrito presenta una gran simplicidad de interpretación, por razón de la producción de un solo y único producto, específico del ADN bovino, y que no se encuentra entonces en los productos de amplificación de ADN de otras especies.

La lectura de los perfiles de migración de los productos de amplificación, obtenidos con el procedimiento según la presente invención, consiste entonces simplemente en determinar la presencia de una sola y única banda de migración en un gel de electroforesis. En ausencia de tal banda, se puede considerar que no hay trazas detectables de ADN bovino. La presencia de una banda significa, por el contrario, que el ADN bovino está presente en la muestra, y entonces que la muestra en cuestión contiene materia biológica de origen bovino.

El producto de amplificación se puede poner de manifiesto mediante cualquier método conocido por el experto en la técnica, y, en particular, mediante electroforesis simple sobre un gel de agarosa. Este producto de amplificación se puede secuenciar a fin de determinar la secuencia nucleotídica y confirmar su identidad. Igualmente se puede poner de manifiesto mediante hibridación con una sonda que contiene una parte oligonucleotídica y un marcador. El oligonucleótido que constituye esta sonda comprende como mínimo alrededor de 15 nucleótidos, preferentemente al menos aproximadamente 20 nucleótidos.

Para confirmar la identidad del fragmento SEC ID nº 8, se utiliza un oligonucleótido cuya parte de la secuencia presenta una identidad de al menos 80%, preferentemente 90%, con las secuencias SEC ID nº 7 o nº 19 siguientes:

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en las que R es G o A.

La identidad de los fragmentos SEC ID nº 15 a SEC ID nº 18 se confirmará ventajosamente mediante secuenciación.

El marcador puede ser cualquier marcador conocido por el experto en la técnica, pero preferentemente es la digoxigenina (DIG).

La utilización de las sondas descritas aquí arriba, para poner de manifiesto el producto de la reacción de amplificación SEC ID nº 8, es particularmente ventajosa porque permite confirmar el origen bovino de este producto de amplificación, y por tanto mejorar aún más la especificidad y la sensibilidad del procedimiento.

La presente invención se refiere además a oligonucleótidos complementarios e inversos/complementarios de los oligonucleótidos descritos aquí arriba.

El experto en la técnica podrá ventajosamente referirse al manual general de SAMBROOK et al. 1989, Molecular Cloning: A laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor NY., o a una de sus recientes reediciones, para la utilización de las técnicas de biología molecular de la presente invención.

La presente invención permite detectar la presencia de compuestos de origen bovino en los productos utilizados en la producción agroalimentaria y en la industria de los cosméticos, tales como las carnes cocidas o crudas, los gránulos y harinas utilizados para la alimentación del ganado, los abonos compuestos, los abonos y los estiércoles, los productos a base de sangre, de polvo de huesos, de cuero, de guano, las gelatinas y las grasas animales.

La presente invención se ilustra, sin estar limitada, mediante los ejemplos siguientes.

La figura 1 representa un gel de agarosa, coloreado mediante bromuro de etidio. Los ADN de buey, de caballo, de oveja, de cerdo, de pato, de pollo y de pavo (respectivamente, pozos 2 a 8) se amplificaron con la ayuda de los cebadores SEC ID nº 6 (PBF9) y SEC ID nº 3 (PBR6). El pozo 1 corresponde a un testigo negativo. El producto de amplificación migra formando una banda de 480 pares de bases.

La figura 2 es otro gel de agarosa sobre el que se han puesto a migrar los productos de amplificación del ADN de diferentes razas europeas bovinas: Azul Blanca Belga (pozos 2 y 3), Limusina (pozos 4 y 5), Charolesa (pozos 6 a 10), Normanda (pozos 11 y 12), Prim'Holstein (pozos 13 a 16), Rubia de Aquitania (pozos 17 a 20), Frisona (pozo 21), Cruzada (pozos 22 y 23) y Partenesa (pozo 24). El pozo 1 corresponde a un testigo negativo.

La figura 3 representa la transferencia mediante la técnica Southern del gel de agarosa de la figura 1, hibridada con la ayuda de la sonda SEC ID nº 7 (BH1) marcada.

La figura 4 es un gel de agarosa con los productos de amplificación de alimentos para ganado que presenta porcentajes de incorporación de harina bovina respectivamente de 5; 2,5; 1; 0,5; 0,25; 0,1; 0,075; 0,06; 0,05; 0,01% (pozos 2 a 11, respectivamente). El pozo 1 corresponde a un testigo negativo.

La figura 5 es una transferencia mediante el método Southern del gel representado en la figura 4, e hibridada mediante la sonda SEC ID nº 7 (BH1) marcada.

Ejemplo 1 Extracto y cuantificación del adn de diferentes materias orgánicas

A fin de poder obtener un método de detección mediante amplificación génica de compuestos de origen bovino en los productos utilizados en la producción agroalimentaria y en la industria de los cosméticos, se han realizado los experimentos descritos en este primer ejemplo con diversos tipos de muestras que representan fuentes potenciales de diseminación de la ESB.

Las muestras seleccionadas se reparten en 12 grupos de productos finales, o de productos que entran en la composición del producto final:

Abonos, abonos compuestos	Abono	Guano
Estiércol, excremento	Mantillo	Gránulos para ganado
Harinas para ganado	Cueros	Huesos y polvos de huesos
Plumas	Sangre	Gelatinas, grasa

Para poder efectuar un análisis de una muestra cualquiera mediante PCR, es necesario disponer de técnicas de extracción del ADN. Debido a la diversidad de las muestras ensayadas, se utilizan varias técnicas:

1) Extracción del ADN mediante el método con fenol/cloroformo

Este método está dirigido preferentemente a las muestras cuyo contenido en compuestos de origen animal es mayoritario (harinas, gránulos, huesos, sangre, plumas, cueros, etc.).

Este método se refiere a técnicas descritas por HÄNNI et al., 1990, C. R. Acad. Sci. Paris., 310, 356-370, y por HÄNNI et al., 1995, Nucl. Acids. Res., 23, 881-882, que describen la extracción de ADN a partir de huesos y de dientes.

Se incuban 0,5 g de polvo durante tres horas a 56ºC en 2,5 ml de tampón de lisis de la siguiente composición:

Tris 100 mM, pH 8

NaCl 100 mM

Sarcosinato de sodio 1%,

que contiene 200 \mug/ml de proteinasa K, que permite degradar las proteínas y liberar los ácidos nucleicos.

Después, el lisado se extrae mediante un volumen de fenol/cloroformo 1/1 para eliminar la parte proteica del lisado. Se efectúa una segunda extracción. Después, la fase acuosa se extrae mediante 1 volumen de cloroformo.

El ADN se precipita entonces mediante 0,6 volumen de isopropanol y 0,1 volumen de acetato de amonio 2M a -20ºC durante un mínimo de 2 horas. Después, se recupera mediante centrifugación (15 min a 12000 rpm), y después se lava con etanol a 70ºC (mantenido a -20ºC). Después de la evaporación del alcohol residual (1 a 2 horas bajo campana extractora), el ADN se disuelve en agua para preparación inyectable (agua PPI; el volumen de agua está en función de la cantidad de ADN recuperado).

2) Extracción según el método con CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio)

Este método descrito por MURRAY (Nucleic Acid Res. 8 (19), 4321-4325(1980)) se dirige preferentemente a las muestras que contienen residuos de origen vegetal mezclados con productos de origen animal (abono de composición, abonos, etc.).

Se incuba 1 g de muestra 3 horas a 56ºC en 2,5 ml de tampón de lisis cuya composición es:

Tris 10 mM pH 8

EDTA 0,1 mM

dodecilsulfato de sodio 1%

proteinasa K 100 \mug/ml

Se añaden 450 \mul de NaCl 5 M y 375 \mul de CTAB al 10%, y NaCl 0,7 M, precalentados a 65ºC, y se incuban 20 min a 65ºC. Se añade entonces un volumen de cloroformo. Tras agitar y centrifugar (10 min a 12000 rpm, a 4ºC), la fase acuosa se recupera y se reextrae una segunda vez para aclararla. Se extrae de nuevo mediante un volumen de fenol/cloroformo. La continuación de la extracción se efectúa como se indica en el párrafo 1.

3) Cuantificación del ADN extraído

El método de cuantificación utilizado es el de LABARCA, (1980, Analytical Biochemistry 102, 344-352). Se basa en la reacción de interposición de una molécula, la Hoechst 33258 (2-(2-(4-hidroxifenil)bencidazolil)-6(1-metil-4-piperazil)bencimidazol, 3HCl), en la doble hélice del ADN que se desea cuantificar. Irradiado a 356 nm, el complejo Hoechst 33258/ADN emite una señal de fluorescencia característica (458 nm).

La emisión de fluorescencia es proporcional a la cantidad de ADN en disolución; la lectura se efectúa por medio de un fluorímetro (DyNA quant-Hoeffer). El ADN de la muestra a cuantificar se añade en 2 ml de tampón Tris 10 mM-pH 7,4, EDTA 1 mM, NaCl 0,2 M, que contiene 1 \mug de 33258/ml.

Mediante contraste del aparato con la ayuda de una disolución de ADN estándar de concentración conocida, se mide la cantidad de ADN extraído de la muestra.

La tabla 1 siguiente muestra que las técnicas descritas permiten poner de manifiesto en todas las muestras un ADN en cantidad suficiente para ser analizado mediante el método PCR según la presente invención.

Ejemplo 2 Amplificación mediante PCR de secuencias de ADNmt bovino a partir del ADN extraído de las muestras 1) Purificación del ADN extraído sobre sílice

Para poder efectuar la reacción PCR en condiciones de reacción óptimas, es necesario purificar anteriormente el ADN extraído. La purificación descrita aquí abajo utiliza una técnica descrita por BOOM et al. (1990, J. Clin. Microbiol. 28, 495-503).

Se diluyen 50 \mul de ADN bruto, obtenido mediante cualquiera de los métodos detallados en el ejemplo 1, en 400 \mul de un tampón obtenido mediante adición a 100 ml de un tampón Tris 0,1 mM, pH 6,4, de 120 g de tiocianato de guanidinio, de 22 ml de EDTA 0,2 M, pH 8, y de 2,6 ml de Triton X100.

Esta disolución se incuba 5 min a temperatura ambiente con 300 \mul de sílice (Wizard DNA clean up System Promega ref A7280: sílice y mini-columnas). La sílice se lava en columna con 2 ml de isopropanol al 80%. La columna se centrífuga 2 min a 12000 rpm para eliminar el alcohol residual, se añaden 50 \mul de agua PPI precalentada a 70ºC para eluir el ADN fijado sobre la sílice (incubación de 5 a 30 min., a 70ºC).

El eluato, que contiene el ADN recuperado mediante centrifugación (12000 rpm, 2 min.), está preparado para ser utilizado en la PCR.

Si es necesario, se efectúa una segunda purificación en sílice.

2) La reacción de PCR

La PCR se ha realizado con los dos cebadores oligonucleotídicos SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6 que presentan respectivamente las secuencias SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6.

Las amplificaciones se realizaron en un volumen total de 50 \mul que contiene:

5 \mul de un tampón Taqx10 (desprovisto de Mg++) comercializado con la enzima

5 \mul de una mezcla de dATP, dCTP, dGTP y dTTP (2 mM cada uno)

3 \mul de MgCl_{2} 25 mM

0,5 \mul de albúmina 20 mg/ml

5 \mul de cada uno de los cebadores SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6 (10 \muM cada uno)

10 \mul de ADN de matriz de genoma (de 100 ng a 1 \mug)

0,2 \mul de ADN polimerasa de Taq (5 unidades/\mul)

16,3 \mul de agua destilada estéril.

Con la excepción de la matriz de genoma, de los cebadores y de la ADN polimerasa de Taq, todos los materiales anteriores constituyen la disolución tampón de base preparada en volumen y conservada a -20ºC.

Todas las amplificaciones se han realizado con un aparato de puesta en marcha del ciclo térmico "Perkin-Elmer" con el siguiente programa de temperatura:

"Programa PCR"

1 ciclo inicial que comprende	5 min. a 94ºC

9 ciclos que comprenden	30 seg. a 94ºC
	30 seg. a 55ºC (después una disminución de la temperatura de 0,5ºC cada ciclo
	hasta 51ºC)
	30 seg. a 72ºC

32 ciclos que comprenden	30 seg. a 94ºC
	30 seg. a 51ºC
	30 seg. a 72ºC

1 ciclo final que comprende	7 min. a 72ºC
	desde algunos minutos hasta varias horas a 4ºC

Los productos de amplificación se analizan mediante electroforesis sobre gel de agarosa al 1,5% bajo tensión constante de 130 V durante 45 min., y con la ayuda de bromuro de etidio para visualizar las amplificaciones obtenidas.

La reacción de PCR que utiliza el par de cebadores SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6 se ha efectuado sobre una serie de extractos de ADN obtenidos a partir de diversos tejidos animales y vegetales. Se observa un producto de amplificación único (fragmento de una longitud de 480 pares de base -480 pb-) para los tejidos bovinos, y ningún producto para todos los demás ADN ensayados (figura 1). Así, los cebadores SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6 son convenientes para la identificación del ADN específico de bovino en una aplicación PCR.

Además de estos resultados, la técnica de PCR que utiliza estos dos cebadores se ha aplicado sobre un ADN extraído de tejidos animales de razas europeas bovinas variadas (Blanca Azul Belga, Limusina, Charolesa, Normanda, Prim'Holstein, Charolesa cruzada con Normanda, Rubia de Aquitania, Partenesa). Todas las muestras han dado el mismo perfil (un fragmento único de 480 pb), indicando que el método se puede aplicar sea cual sea el origen del ADN bovino analizado (figura 2).

Ejemplo 3 Caracterización del ADN amplificado en la reacción PCR mediante la técnica denominada "Southern"

La confirmación del carácter "bovino" del producto de amplificación de PCR (480 pb) se obtiene mediante la hibridación a ese producto de una sonda oligonucleotídica que corresponde a la secuencia de identificación BH1 (SEC ID nº 7). La sonda BH1 utilizada para este efecto se marca con la digoxigenina (DIG) por medio de un kit comercial ("Kit de marcado del extremo 3' del oligonucleótido con Dig-Boehringer").

Después de la transferencia por capilaridad sobre membrana de nailon, los productos de amplificación se desnaturalizaron antes de la unión covalente a la membrana mediante UV. Después de la incubación de la membrana en un tampón de hibridación que contiene la sonda BH1 marcada, se procede a los lavados, y después la sonda se revela mediante un sistema de anticuerpos anti-DIG acoplados a la fosfatasa alcalina en presencia de cloruro de nitroazul-tetrazolio y de 5-bromo, 4-cloro, 3-indolilfosfato. Los productos de amplificación se caracterizan así en esta reacción por la aparición de una coloración marrón-violeta.

Se constata, mediante la utilización del análisis mediante hibridación/transferencia de tipo "Southern", que la sonda BH1 se hibrida específicamente a la secuencia de ADNmt bovino amplificado por medio de los cebadores SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6, y no al ADN de otras especies animales y vegetales (figura 3).

Ejemplo 4 Utilización de las técnicas de PCR y "Southern" para detectar harinas animales de origen bovino en los alimentos para el ganado

Se han aplicado los procedimientos de los ejemplos 1, 2 y 3 sobre muestras de alimentos para ganado (en forma de harinas o de gránulos), que no contienen productos de origen bovino, y a los que se ha incorporado experimentalmente harina de subproductos bovinos en porcentajes que varían de 5 a 0,01%.

Se ha obtenido una señal específica, proporcional al porcentaje de incorporación, mediante amplificación de PCR que utiliza los cebadores SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6, sobre todas las muestras que comprenden al menos 0,1% de harina de origen bovino.

La aplicación de la técnica "Southern" con la sonda oligonucleotídica BH1, sobre los productos de amplificación anteriormente obtenidos, permite una detección específica de las muestras que contienen harina de carnes, pero con un porcentaje límite de detección llevado a 0,05% (figura 4).

Ejemplo 5 Utilización de las técnicas de PCR y "Southern" para detectar productos de origen bovino en toda las muestras

Los procedimientos de los ejemplos 1, 2 y 3 se han aplicado sobre muestras variadas, susceptibles de contener porcentajes variables de productos de origen bovino, tales como las carnes cocidas o crudas, los gránulos y harinas utilizados para la alimentación del ganado, los abonos compuestos, abonos y estiércoles, los productos a base de sangre, de polvo de huesos, de cuero, de guano, las gelatinas y grasas animales.

Se ha obtenido una señal específica con todas las muestras ensayadas que contienen productos de origen bovino (tabla 2 a continuación). Se observa una perfecta correlación entre la presencia reconocida de producto de origen bovino en las muestras y la señal de PCR (presencia del amplificado de 480 pb que se hibrida con la sonda BH1 marcada).

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(Tabla pasa a página siguiente)

4

5

(1) INFORMACIÓN GENERAL:

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(i): SOLICITANTE:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): NOMBRE: CENTRE NATIONAL DE LA RECHERCHE SCIENTIFIQUE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): DIRECCIÓN: 3, rue Michel-Ange

\vskip0.500000\baselineskip

(C): CIUDAD: París

\vskip0.500000\baselineskip

(E): PAÍS: FRANCIA

\vskip0.500000\baselineskip

(F): CODIGO POSTAL: 75794 CEDEX 16

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TÍTULO DE LA INVENCIÓN: PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE MATERIAS BIOLÓGICAS DE ORIGEN BOVINO, Y OLIGONUCLEÓTIDOS PARA SU REALIZACIÓN

\vskip0.800000\baselineskip

(iii): NÚMERO DE SECUENCIAS: 19

\vskip0.800000\baselineskip

(iv): FORMATO LEGIBLE POR ORDENADOR:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): TIPO DE SOPORTE: DISQUETE

\vskip0.500000\baselineskip

(B): ORDENADOR: IBM PC compatible

\vskip0.500000\baselineskip

(C): SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS

\vskip0.500000\baselineskip

(D): PROGRAMA: PatentIn Release #1.0, versión #1.25 (OEB)

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 1:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 43 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAATGTCCAT GCTTATCATT ATGCTGGTGC TCAAGATGCA GTT

\hfill

43

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 2:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 2:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

YTATCATTAT GCTGG

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

: Y = T o C

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 3:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 3:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATGCYTATC ATTATGCTGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.500000\baselineskip

: Y = T o C

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 4:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 46 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 4:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTATATGCC CCATGCATAT AAGCAAGTAC ATGACCTCTA TAGCAG

\hfill

46

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 5:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 15 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 5:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAAGCAAGTA CATGA

\hfill

15

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 6:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 6:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GCATATAAGC AAGTACATGA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 7:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 27 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 7:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CTTGATAGTA TATCTATTAT ATATTCC

\hfill

27

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 8:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 482 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 8:

\vskip1.000000\baselineskip

6

\vskip0.500000\baselineskip

: Y = C o T

\vskip0.500000\baselineskip

: R = A o G

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 9:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 9:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GAGCCTTATC AGTATTAAAT TTATC

\hfill

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 10:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 10:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

CATTAATGTT ATGTACATTA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 11:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 11:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TTTCACGCGG CATGGTAATT

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 12:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 12:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATCCAATGAA TTTTACCAGG

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 13:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 13:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

GTCAATGGTC ACAGGACATA

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 14:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 20 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 14:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

ATTGACTTTG TTTGGAGTGC

\hfill

20

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 15:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 159 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 15:

\vskip1.000000\baselineskip

24

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 16:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 153 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 16:

\vskip1.000000\baselineskip

25

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 17:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 265 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 17:

\vskip1.000000\baselineskip

7

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 18:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 158 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 18:

\vskip1.000000\baselineskip

26

\vskip1.000000\baselineskip

(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID nº: 19:

\vskip0.800000\baselineskip

(i): CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:

\vskip0.500000\baselineskip

(A): LONGITUD: 25 pares de bases

\vskip0.500000\baselineskip

(B): TIPO: ácido nucleico

\vskip0.500000\baselineskip

(C): NÚMERO DE HEBRAS: Simple

\vskip0.500000\baselineskip

(D): CONFIGURACIÓN: lineal

\vskip0.800000\baselineskip

(ii): TIPO DE MOLÉCULA: ADN (genómico)

\vskip0.800000\baselineskip

(xi): DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 19:

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

\hskip-.1em\dddseqskip

TAARCCGTGG GGGTCGCTAT CCAAT

\hfill

25

Claims

1. Oligonucleótidos caracterizados

-: porque presentan una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95% con un oligonucleótido constituido por una secuencia de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, especialmente 20 a 25 nucleótidos, comprendida en la secuencia SEC ID nº 1 siguiente:

TAATGTCCATGCTTATCATTATGCTGGTGCTCAAGATGCAGTT

-: o porque comprenden la secuencia SEC ID nº 2 siguiente:

YTATCATTATGCTGG

-: o porque están constituidos por la secuencia SEC ID nº 3 siguiente:

CATGCYTATCATTATGCTGG

en la que Y es T o C.

2. Oligonucleótidos caracterizados

-: porque presentan una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95% con un oligonucleótido constituido por una secuencia de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, especialmente 20 a 25 nucleótidos, comprendida en la secuencia SEC ID nº 4:

ATTATATGCCCCATGCATATAAGCAAGTACATGACCTCTATAGCAG

-: o porque comprenden la secuencia SEC ID nº 5 siguiente:

TAAGCAAGTACATGA

-: o porque están constituidos por la secuencia SEC ID nº 6 siguiente:

GCATATAAGCAAGTACATGA

3. Pares de cebadores caracterizados porque están constituidos por uno cualquiera de los oligonucleótidos SEC ID nº 1, SEC ID nº 2, SEC ID nº 3, según la reivindicación 1, y uno cualquiera de los oligonucleótidos SEC ID nº 4, SEC ID nº 5, SEC ID nº 6, según la reivindicación 2, y ventajosamente constituidos por el par de oligonucleótidos SEC ID nº 3 y SEC ID nº 6.

4. Pares de cebadores oligonucleotídicos caracterizados porque los oligonucleótidos que los constituyen se seleccionan de entre:

-: los que presentan una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95% con un oligonucleótido constituido por una secuencia de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, especialmente 20 a 25 nucleótidos, que comprenden al menos 10 nucleótidos contiguos de la secuencia SEC ID nº 9 siguiente:

GAGCCTTATCAGTATTAAATTTATC

-: o de la secuencia SEC ID nº 10 siguiente:

CATTAATGTTATGTACATTA

-: o de la secuencia SEC ID nº 11 siguiente:

TTTCACGCGGCATGGTAATT

-: o de la secuencia SEC ID nº 12 siguiente:

ATCCAATGAATTTTACCAGG

-: o de la secuencia SEC ID nº 13 siguiente:

GTCAATGGTCACAGGACATA

-: o de la secuencia SEC ID nº 14 siguiente:

ATTGACTTTGTTTGGAGTGC

y especialmente los pares de cebadores siguientes:

SEC ID nº 9 con SEC ID nº 10, SEC ID nº 6 con SEC ID nº 11, SEC ID nº 12 con SEC ID nº 3, SEC ID nº 13 con SEC ID nº 14.

5. Oligonucleótido que comprende al menos aproximadamente 15 nucleótidos, preferentemente como mínimo aproximadamente 20 nucleótidos, y del que al menos una parte de su secuencia presenta una identidad de al menos 80%, preferentemente 90%, con la secuencia SEC ID nº 7 siguiente:

CTTGATAGTATATCTATTATATATTCC

o con la secuencia SEC ID nº 19 siguiente:

TAARCCGTGGGGGTCGCTATCCAAT

6. Sondas caracterizadas porque comprenden unos oligonucleótidos según la reivindicación 5 o unos oligonucleótidos complementarios o inverso/complementarios de los oligonucleótidos según la reivindicación 5.

7. Procedimiento para obtener un fragmento de ADN mitocondrial bovino que presenta un tamaño y una secuencia determinados, específico de los bovinos, y en particular de las especies Bos taurus y Bos indicus, a partir de una muestra de materia orgánica, procedimiento mediante el que se amplifica, por reacción de polimerización en cadena, una secuencia determinada del genoma bovino presente en los genomas de los bovinos pero ausente en los genomas de otras especies animales, estando dicho procedimiento caracterizado porque la amplificación se efectúa mediante el método de amplificación en cadena por polimerasa (PCR), que comprende una repetición del ciclo de las etapas siguientes:

-: Calentamiento del ADN extraído de la muestra de materia orgánica, a fin de separar el ADN en dos hebras monocatenarias;

-: Hibridación de cebadores oligonucleotídicos según las reivindicaciones 1 a 4, a las hebras de ADN monocatenarias, a una temperatura adecuada, y

-: Alargamiento de cebadores oligonucleotídicos mediante polimerasa, a una temperatura adecuada.

8. Procedimiento para detectar e identificar la presencia de materias biológicas de origen bovino en una muestra de materia orgánica, caracterizado porque se determina la presencia de ADN mitocondrial de origen bovino en dicha materia orgánica mediante amplificación de una secuencia de ADN mitocondrial específica del genoma bovino, estando dicho procedimiento caracterizado porque la amplificación se efectúa mediante el método de amplificación en cadena por polimerasa (PCR), que comprende una repetición del ciclo de las etapas siguientes:

9. Procedimiento según la reivindicación 7 u 8, caracterizado porque la secuencia de ADN mitocondrial específica del genoma bovino comprende aproximadamente 500 pares de bases hasta aproximadamente 100 pares de bases, especialmente 152 hasta 480 pares de bases aproximadamente, y presenta una identidad de secuencia de al menos 80%, y preferentemente de al menos 90%, con las regiones homólogas de la secuencia de la región de control del ADN mitocondrial, y especialmente de la posición 15824 hasta la posición 171, siendo estas posiciones determinadas según la secuencia completa del ADN mitocondrial del buey que comprende 16338 nucleótidos.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque la secuencia amplificada obtenida se detecta mediante hibridación con una sonda, o mediante secuenciación.

11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque dicha sonda comprende al menos en parte el oligonucleótido según una de las reivindicaciones 5 ó 6, y un marcador.

12. Fragmento de ADN susceptible de ser obtenido mediante el procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 9, caracterizado porque comprende aproximadamente 500 hasta aproximadamente 100 pares de bases.

13. Fragmento según la reivindicación 12, caracterizado porque presenta una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90%, y ventajosamente 95%, con un oligonucleótido constituido por una secuencia de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, comprendida en la SEC ID nº 8 siguiente:

8

y especialmente fragmento de 480 pares de bases que comprende o que está constituido por la SEC ID nº 8 definida aquí arriba.

14. Fragmentos según la reivindicación 12, caracterizados porque presentan una identidad de secuencia de al menos 80%, preferentemente 90% y ventajosamente 95%, con un oligonucleótido constituido por una secuencia de aproximadamente 15 a 25 nucleótidos, comprendida en la SEC ID nº 15 siguiente:

9

o en la SEC ID nº 16 siguiente:

10

o en la SEC ID nº 17 siguiente:

11

\newpage

o en la SEC ID nº 18 siguiente:

12

y especialmente fragmento de 159 pares de bases que comprende o que está constituido por la SEC ID nº 15 definida aquí arriba,

y especialmente fragmento de 153 pares de bases que comprende o que está constituido por la SEC ID nº 16 definida aquí arriba,

y especialmente fragmento de 265 pares de bases que comprende o que está constituido por la SEC ID nº 17 definida aquí arriba,

y especialmente fragmento de 158 pares de bases que comprende o que está constituido por la SEC ID nº 18 definida aquí arriba.

15. Utilización del procedimiento según una de las reivindicaciones 7 a 11 para detectar materias biológicas de origen bovino en productos tales como: las harinas utilizadas para la alimentación del ganado, los abonos compuestos, los abonos y los estiércoles, las carnes y mezclas de carnes crudas, ahumadas, o cocidas, los granulados, la sangre y los productos a base de sangre, la leche y los productos a base de leche, los huesos y los productos a base de huesos, los cueros, las pieles, los marfiles, los pelos, los cuernos y los productos a base de cuernos, el guano, las heces, el estiércol líquido, los purines, la gelatina y los productos a base de gelatina, los productos cosméticos, y los productos utilizados en la industria agroalimentaria.