ES2217554T3 - Clonacion de la udp-galactosa epimerasa. - Google Patents

Abstract

Enzima de UDP-galactosa epimerasa susceptible de ser obtenida a partir de guar, en el que el enzima comprende por lo menos la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2, o es una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 98% de homología con la misma.

Description

Clonación de la UDP-galactosa epimerasa.

La presente invención se refiere a un enzima. Además, la presente invención se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica el enzima. La presente invención también se refiere a una o más utilizaciones del enzima.

Es sabido que resulta deseable dirigir la expresión de una secuencia de nucleótidos de interés ("NOI") en ciertos tejidos de un organismo, tal como un hongo filamentoso (por ejemplo, el Aspergillus niger) o incluso en un cultivo de plantas. La proteína o el enzima, resultantes, se pueden utilizar luego en la industria. Alternativamente, la proteína o el enzima resultantes pueden ser útiles para el propio organismo. Por ejemplo, puede ser deseable producir productos proteínicos de cultivo con una composición de aminoácidos optimizada y así aumentar el valor nutritivo de un cultivo. Por ejemplo, el cultivo se puede hacer más útil como pienso. Alternativamente, puede ser deseable aislar la proteína o el enzima resultantes y luego utilizar la proteína o el enzima para preparar, por ejemplo, composiciones alimenticias. A este respecto, la proteína o el enzima resultantes pueden ser un componente de la composición alimenticia o se pueden utilizar para preparar composiciones alimenticias, incluyendo alterar las características o el aspecto de las composiciones alimenticias. Incluso puede ser deseable utilizar el organismo, tal como un hongo filamentoso o una planta de cultivo, para expresar secuencias de nucleótidos de organismos no plantas, tal como para los mismos propósitos.

La presente invención pretende proporcionar un enzima que sea útil para la industria y también una secuencia de nucleótidos que lo codifica.

De acuerdo con un aspecto de la presente invención, se proporciona un enzima de UDP-galactosa epimerasa obtenible del guar (Cyanopsis tetragonoloba), donde el enzima comprende por lo menos la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2, o es una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 98% de homología con la misma.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un enzima de UDP-galactosa epimerasa obtenible del guar, donde el enzima es codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos la secuencia mostrada como SEC. ID. No, 1 o SEC. ID. No. 2, o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 98% de homología con la misma.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2, o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 98% de homología con la misma, o una secuencia complementaria de la misma.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona un enzima de UDP-galactosa epimerasa que es inmunológicamente reactivo con un anticuerpo erigido frente a un enzima de UDP-galactosa epimerasa purificado, de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un procedimiento de preparar un enzima de acuerdo con la presente invención, que comprende expresar una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención.

De acuerdo con un aspecto adicional de la presente invención, se proporciona la utilización de un enzima de acuerdo con la presente invención o un enzima preparado por un procedimiento de acuerdo con la presente invención, para preparar un producto alimenticio (tal como un pienso).

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona una secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención, operativamente unida a un promotor.

De acuerdo con otro aspecto de la presente invención, se proporciona un producto alimenticio que comprende el enzima de acuerdo con la presente invención o un enzima preparado por un procedimiento de acuerdo con la presente invención.

Otros aspectos de la presente invención incluyen: una construcción que comprende o es capaz de expresar la presente invención; un vector que comprende o es capaz de expresar la presente invención; un plásmido que comprende o es capaz de expresar la presente invención; un tejido que comprende o es capaz de expresar la presente invención; un órgano que comprende o es capaz de expresar la presente invención; un organismo transgénico que comprende o es capaz de expresar la presente invención.

Preferentemente, el enzima comprende la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2, o una variante, un homólogo o un fragmento de la misma, y la secuencia de nucleótidos que codifica la misma comprende la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2, o una variante, un homólogo o un fragmento de la misma.

Otros aspectos de la presente invención incluyen métodos de expresar o permitir la expresión de, o transformar, uno cualquiera entre las secuencias de nucleótidos, la construcción, el plásmido, el vector, la célula, el tejido, el órgano o el organismo, así como los productos de los mismos.

Aspectos adicionales de la presente invención incluyen utilizaciones del enzima para preparar o tratar productos alimenticios, incluido un pienso para animales.

Algunas de las ventajas clave de la presente invención estriban en que ésta proporciona un enzima que tiene actividad de UDP-galactosa epimerasa. La UDP-galactosa epimerasa es un enzima importante ya que, entre otras cosas, cataliza la transformación de UDP-D-glucosa en UDP-D-galactosa. Además, el enzima de la presente invención se puede preparar en ciertas células o tejidos, específicos, como sólo en una célula o en un tejido específicos de un organismo, tal como una planta o, a título de posible ejemplo adicional, un microorganismo.

La presente invención también proporciona una secuencia de nucleótidos que codifica el enzima UDP-galactosa epimerasa que se puede expresar preferentemente en células o tejidos específicos como los de un organismo, tal como una planta o, a título de posible ejemplo adicional, un microorganismo.

Asimismo, la presente invención proporciona construcciones, vectores, plásmidos, células, tejidos, órganos y organismos que comprenden la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención y métodos de expresar los mismos, preferentemente en células o tejidos específicos, tal como la expresión en sólo una célula o un tejido específicos de un organismo, tal como una planta o, a título de posible ejemplo adicional, un microorganismo.

Preferentemente, el enzima de la presente invención se utiliza en la preparación de un producto alimenticio. Productos alimenticios típicos pueden incluir productos lácteos, productos cárnicos, productos avícolas, productos de pescado y productos de panadería.

Los términos "variante", "homólogo" o" fragmento" en relación con la secuencia de aminoácidos para el enzima UDP-galactosa epimerasa preferido de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) aminoácido(s) desde o hacia la secuencia, con tal que el enzima resultante tenga actividad de UDP-galactosa epimerasa; preferentemente que tenga por lo menos la misma actividad que el enzima que comprende la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2. En particular, el término "homólogo" cubre la homología con respecto a la estructura y/o la función. En lo que concierne a la homología de secuencias, preferentemente hay por lo menos un 75%, más preferentemente por lo menos un 85%, más preferentemente por lo menos un 90%, de homología con un enzima que comprende la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2. Más preferentemente, hay por lo menos un 95%, más preferentemente por lo menos un 98%, de homología con un enzima que comprende la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2.

Los términos "variante", "homólogo" o "fragmento" en relación con la secuencia de nucleótidos que codifica el enzima UDP-galactosa epimerasa de la presente invención incluyen cualquier sustitución de, variación de, modificación de, reemplazo de, deleción de o adición de uno (o más) ácidos nucleicos desde o hacia la secuencia, con tal que la secuencia de nucleótidos resultante codifique o bien sea capaz de codificar un enzima que tenga actividad de UDP-galactosa epimerasa, preferentemente que tenga por lo menos la misma actividad que el enzima que comprende la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2. En particular, el término "homólogo" cubre la homología con respecto a la estructura y/o función, con tal que la secuencia de nucleótidos resultante codifique o bien sea capaz de codificar un enzima que tenga actividad de UDP-galactosa epimerasa. En lo que respecta a la homología de secuencias, preferentemente hay por lo menos un 75%, más preferentemente por lo menos un 85%, más preferentemente por lo menos un 90% de homología, con una secuencia que comprende la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2. Más preferentemente hay por lo menos un 95%, y aún más preferentemente por lo menos un 98%, de homología con una secuencia que comprende la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2.

Los términos anteriores son sinónimos de variaciones alélicas de las secuencias.

La presente invención también cubre secuencias que son complementarias de las secuencias de nucleótidos anteriormente mencionadas. El término "complementario" significa que la presente invención cubre secuencias de nucleótidos que se pueden hibridizar a la secuencia de nucleótidos de la presente invención, tal como se ha definido anteriormente, de preferencia bajo condiciones de hibridación severas.

El término "nucleótido" en relación con la presente invención incluye ADN genómico, ADNc, ADN sintético y ARN. Preferentemente significa ADN, más preferentemente significa ADNc.

El término "construcción" - que es sinónimo de términos tales como "conjugado", "cassette" e "híbrido" - incluye la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención directa o indirectamente unida a un promotor. Un ejemplo de una unión indirecta es el aporte de un grupo espaciador adecuado, tal como una secuencia de un intrón, como el intrón Shl o el intrón ADH, intermedia entre el promotor y la secuencia de nucleótidos de la presente invención. Lo mismo es cierto para el término "fusionado" en relación con la presente invención, que incluye la unión directa o indirecta. En cada caso, los términos no cubren la combinación natural de la secuencia de nucleótidos que codifica el enzima ordinariamente asociado con el promotor del gen de tipo salvaje y cuando están los dos en su entorno natural. Una realización muy preferida es la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención, que está unida de manera operativa a un promotor.

La construcción puede incluso contener o expresar un marcador que permite la selección de la construcción genética en, por ejemplo, un hongo filamentoso, preferentemente del género Aspergillus, tal como el Aspergillus niger, o en plantas, como las patatas, la remolacha, etc., a las que ha sido transferido. Alternativamente, o además, la construcción puede incluso contener o expresar un marcador que permite la selección de la construcción genética en, por ejemplo, una semilla de una planta, tal como el maíz, el trigo o la cebada, a la que se ha transferido. Existen varios marcadores que se pueden utilizar, como, por ejemplo, aquéllos que codifican la manosa-6-fosfato isomerasa (especialmente para las plantas) o aquellos marcadores que proporcionan resistencia a los antibióticos - por ejemplo, resistencia al G418, a la higromicina, a la bleomicina, a la kanamicina y a la gentamicina.

El término "vector" incluye vectores de expresión y vectores de transformación.

El término "vector de expresión" significa una construcción capaz de expresión in vivo o in vitro.

El término "vector de transformación" significa una construcción capaz de ser transferida de una especie a otra - tal como desde un plásmido del E. coli a un hongo filamentoso, preferentemente del género Aspergillus. Incluso puede tratarse de una construcción capaz de ser transferida desde un plásmido de E. coli a un Agrobacterium y a una planta.

El término "tejido" incluye tejido aislado y tejido dentro de un órgano.

El término "organismo" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que pueda comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el enzima de acuerdo con la presente invención y/o el producto de expresión obtenido de la misma, donde la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención se puede expresar cuando está presente en el organismo.

El organismo puede ser una planta.

El organismo puede ser un hongo filamentoso, preferentemente del género Aspergillus, más preferentemente el Aspergillus niger.

Otros organismos preferidos incluyen cualquier otro microorganismo adecuado, tal como uno entre Bacillus, Aspergillus oryzae, A. tubigensis, A. awamori, Trichoderma reesei, T. viride y T. longibrachiatum.

El término "organismo transgénico" en relación con la presente invención incluye cualquier organismo que comprenda la secuencia de nucleótidos que codifica el enzima de acuerdo con la presente invención y/o el producto de expresión obtenido de la misma, donde la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención se puede expresar dentro del organismo. Preferentemente, la secuencia de nucleótidos está incorporada en el genoma del organismo.

Por consiguiente, el organismo transgénico de la presente invención incluye un organismo que comprende una cualquiera de, o combinaciones de, la secuencia de nucleótidos que codifica el enzima de acuerdo con la presente invención, construcciones de acuerdo con la presente invención, vectores de acuerdo con la presente invención, plásmidos de acuerdo con la presente invención, células de acuerdo con la presente invención, tejidos de acuerdo con la presente invención, o los productos de los mismos. Por ejemplo, el organismo transgénico también puede comprender la secuencia de nucleótidos que codifica el enzima de la presente invención bajo el control de un pro-
motor.

El término "organismo transgénico" no cubre la secuencia de codificadora de nucleótidos nativa de acuerdo con la presente invención en su entorno natural cuando está bajo el control de su promotor nativo, el cual también está en su entorno natural. Además, la presente invención no cubre el enzima nativo de acuerdo con la presente invención cuando está en su entorno natural y cuando ha sido expresado por su secuencia codificadora de nucleótidos nativa que también está en su entorno natural, y cuando esta secuencia de nucleótidos está bajo el control de su promotor nativo, el cual también está en su entorno natural.

La célula u organismo transformada/o podría preparar cantidades aceptables del producto de expresión deseado, que sería fácilmente recuperable a partir de la célula o el organismo.

Preferentemente, la construcción de la presente invención comprende la secuencia de nucleótidos de la presente invención y un promotor.

El término "promotor" se utiliza en el sentido normal de la técnica, por ejemplo, un sitio de unión a la ARN-polimerasa en la teoría de Jacob-Monod de la expresión de genes.

A título de ejemplo, el promotor para la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser el promotor \alpha-Amy 1 (de otra manera conocido como el promotor Amy 1, el promotor Amy 637 o el promotor \alpha-Amy 637), tal como se describe en la solicitud internacional de patente PCT/EP95/02195 (incorporada aquí a modo de referencia). Alternativamente, el promotor para la secuencia de nucleótidos de la presente invención puede ser el promotor \alpha-Amy 3 (de otra manera conocido como el promotor Amy 3, el promotor Amy 351 o el promotor \alpha-Amy 351), tal como se describe en la solicitud internacional de patente PCT/EP95/02196 (incorporada aquí a modo de referencia). Alternativamente, el promotor podría ser el promotor de la glucanasa - a veces llamado el promotor egla - como se describe en la solicitud internacional de patente PCT/EP96/01008 (incorporada aquí a modo de referencia). Alternativamente, el promotor podría ser el promotor de la arabinofuranosidasa, tal como se describe en la solicitud internacional de patente PCT/EP96/01009 (incorporada aquí a modo de referencia).

Además de las secuencias de nucleótidos anteriormente descritas, el promotor para la utilización en expresar la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención podría adicionalmente incluir rasgos característicos para asegurar o aumentar la expresión en un huésped adecuado. Por ejemplo, los rasgos característicos pueden ser regiones conservadas tales como una caja Pribnow o una caja TATA. Los promotores pueden incluso contener otras secuencias para afectar (tal como para mantener, aumentar, disminuir) los niveles de expresión de la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención. Por ejemplo, otras secuencias adecuadas incluyen el intrón ShI o un intrón ADH. Otras secuencias incluyen elementos inducibles - tales como la temperatura, un producto químico, la luz o elementos que pueden causar estrés. Además, pueden estar presentes elementos adecuados para mejorar la transcripción o la traducción. Un ejemplo del último elemento es la secuencia señal TMV 5' (véase Sleat, Gene, 217 [1987] 217-225: y Dawson, Plant Mol. Biol., 23 [1993] 97).

La presente invención también abarca combinaciones de promotores y/o secuencias de nucleótidos que codifican proteínas, o enzimas y/o elementos recombinantes.

La presente invención también abarca la utilización de promotores para expresar una secuencia de nucleótidos que codifica el enzima de acuerdo con la presente invención, donde una parte del promotor está inactivada, pero donde el promotor todavía puede funcionar como promotor. La inactivación parcial de un promotor en algunos casos es ventajosa. En particular, en el caso del promotor Amy 351, anteriormente mencionado, es posible inactivar una parte del mismo para que el promotor parcialmente inactivado exprese el nucleótido de la presente invención de una manera más específica, tal como en sólo un tipo específico de tejido u órgano.

El término "inactivación parcial" significa que la pauta de expresión del promotor está modificada, pero donde el promotor parcialmente inactivado todavía funciona como un promotor. Sin embargo, tal como se ha expresado anteriormente, el promotor modificado es capaz de expresar el nucleótido de la presente invención en por lo menos un (pero no todos) tejido específico del promotor original. Un promotor tal es el promotor Amy 351 anteriormente descrito. Ejemplos de inactivación parcial incluyen alterar la pauta de plegadura de la secuencia del promotor, o unir especies químicas a partes de la secuencia de nucleótidos, de manera que una parte de la secuencia de nucleótidos no sea reconocida por, por ejemplo, la ARN-polimerasa. Otra manera, preferible, de inactivar parcialmente el promotor es truncarlo para formar fragmentos del mismo. Otra manera sería mutar por lo menos una parte de la secuencia de manera que la ARN-polimerasa no se pueda unir a esta parte u otra parte. Otra modificación es mutar los sitios de unión para las proteínas reguladoras, por ejemplo la proteína CreA de la que se sabe a partir de los hongos filamentosos que ejerce la represión de los catabolitos carbonados, y así anula la represión de los catabolitos del promotor nativo.

La secuencia de nucleótidos de la presente invención se puede expresar antes, durante o después de la expresión de otro NOI. Aquí el otro NOl puede ser cualquier secuencia (o secuencias) de nucleótidos adecuada(s), de interés. El otro NOI puede ser cualquier nucleótido que sea o bien extraño o bien natural al organismo (por ejemplo, un hongo filamentoso, preferentemente del género Aspergillus, o una planta) en cuestión. Ejemplos típicos de otros NOIs incluyen secuencias de nucleótidos que codifican proteínas y enzimas que modifican los procesos metabólicos y catabólicos. El otro NOI puede codificar un agente para introducir o aumentar la resistencia a organismos patógenos. El otro NOI puede incluso ser una construcción antisentido para modificar la expresión de las transcripciones naturales presentes en los tejidos pertinentes. El otro NOI puede incluso codificar una proteína no nativa de un hongo filamentoso o un compuesto que es beneficioso para los animales o los seres humanos. Ejemplos de otros NOIs incluyen pectinasas, pectina despolimerasas, poligalacturonasas, pectato liasas, pectina liasas, ramno-galacturonasas, hemicelulasas, endo-\beta-glucanasas, arabinasas, o acetil esterasas, o combinaciones de las mismas, así como secuencias antisentido de las mismas. El otro NOI puede ser una proteína que da valor nutritivo a un alimento o un cultivo. Ejemplos típicos incluyen proteínas de plantas, que pueden inhibir la formación de factores antinutritivos, y proteínas de plantas, que tienen una composición de aminoácidos más deseable (por ejemplo, un contenido más elevado en lisina que una planta no transgénica).

El otro NOI puede incluso codificar un enzima que se puede utilizar en el procesamiento de productos alimenticios, tal como la quimosina, la taumatina y la \alpha-galactosidasa. El otro NOI puede ser una secuencia de nucleótidos que codifica uno cualquiera entre una toxina para organismos nocivos, un transcrito antisentido como aquél para la patatina o \alpha-amilasa, la ADP-glucosa pirofosforilasa (por ejemplo, véase el documento EP-A-0455316), un enzima de proteasa, una glucanasa o \beta-1,4-endoglucanasa genómica.

El otro NOI puede ser la secuencia de nucleótidos que codifica el enzima arabinofuranosidasa, que es el sujeto de la solicitud internacional de patente PCT/EP96/01009 (incorporada aquí a modo de referencia). El otro NOI puede ser cualquiera de las secuencias de nucleótidos que codifican los enzimas de ADP-glucosa pirofosforilasa que son el sujeto de la solicitud internacional de patente PCT/EP94/01082 (incorporada aquí a modo de referencia). El otro NOI puede ser cualquiera de las secuencias de nucleótidos que codifican el enzima \alpha-glucano liasa, que se describen en la solicitud internacional de patente PCT/EP94/03397 (incorporada aquí a modo de referencia). El otro NOI puede ser cualquiera de las secuencias de nucleótidos que codifican el enzima glucanasa, que se describen en la solicitud internacional de patente PCT/EP96/01008 (incorporada aquí a modo de referencia).

El organismo hospedador puede ser un procariota o un organismo eucariota. Ejemplos de huéspedes procariotas adecuados incluyen el E. coli y el Bacillus subtilis. En el estado de la técnica vienen bien documentadas enseñanzas sobre la transformación de hospedadores procariotas; véase, por ejemplo, Sambrook et al. "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", 2ª edición, 1989, Cold Spring Harbor Laboratory Press). Si se utiliza un hospedador procariota, entonces puede ser preciso modificar adecuadamente la secuencia de nucleótidos antes de la transformación - tal como por eliminación de intrones.

Preferentemente, en uno cualquiera de los plásmidos, de los vectores, tal como un vector de expresión o un vector de transformación, de las células, del tejido, del órgano, del organismo o del organismo transgénico, el promotor está presente en combinación con por lo menos un NOI.

Preferentemente, el promotor y el NOI se mantienen establemente dentro del organismo transgénico. A título de ejemplo, el promotor y el NOI (tal como por lo menos la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención) se pueden mantener dentro del organismo transgénico en una construcción extracromosómica estable. Esto se prefiere para bacterias y levaduras, o incluso algunos hongos filamentosos, transgénicos. Alternativamente, el promotor y el NOI (como por lo menos la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención) se pueden incorporar establemente dentro del genoma del organismo transgénico. Esto se prefiere para algunas bacterias y levaduras, y la mayoría de los hongos filamentosos, transgénicos.

Un posible organismo transgénico preferido es un hongo filamentoso, preferentemente del género Aspergillus, más preferentemente el Aspergillus niger. Alternativamente, el organismo transgénico puede ser una levadura. El organismo transgénico incluso puede ser una planta, tal como una planta monocotiledónea o dicotiledónea.

Un posible organismo hospedador preferido para la expresión de la secuencia de nucleótidos de la presente invención y/o para la preparación del enzima de acuerdo con la presente invención es un organismo del género Aspergillus, tal como el Aspergillus niger. A este respecto, un Aspergillus transgénico de acuerdo con la presente invención se puede preparar siguiendo las enseñanzas de Rambosek, J. y Leach, J. 1987 (Recombinant DNA in filamentous fungi: Progress and Prospects, CRC Crit. Rev. Biotechnol., 6: 357-393), Davis R.W., 1994 (Heterologous gene expression and protein secretion in Aspergillus. En: Martinelli S.D., Kinghorn J.R. (Editores) Aspergillus: 50 years on progress in industrial microbiology, vol 29. Elsevier, Amsterdam 1994. páginas 525-560), Ballance, D. J., 1991 "Transformation systems for Filamentous Fungi and an Overview of Fungal Gene Structure". En: Leong, S.A., Berka R.M. (Editores) "Molecular Industrial Mycology. Systems and Applications for Filamentous Fungi". Marcel Dekker Inc., Nueva York 1991. páginas 1-29) y Turner G., 1994 "Vectors for genetic manipulation". En: Martinelli S.D. Kinghorn J.R. (Editores) "Aspergillus: 50 years on Progress in industrial microbiology", vol. 29, Elsevier Amsterdam 1994. páginas 641-666). El siguiente comentario proporciona un sumario de esas enseñanzas para producir el Aspergillus transgénico de acuerdo con la presente invención.

Durante casi un siglo, los hongos filamentosos han sido ampliamente utilizados en muchos tipos de industria para la producción de compuestos orgánicos y enzimas. Por ejemplo, las fermentaciones tradicionales de koji japonés y de soja han utilizado especies de Aspergillus. Además, en este siglo, el Aspergillus niger se ha utilizado para la producción de ácidos orgánicos, en particular de ácido cítrico, y para la producción de diversos enzimas para la utilización en la industria.

Hay dos razones principales por las cuales en la industria se han utilizado tan ampliamente los hongos filamentosos. En primer lugar, los hongos filamentosos pueden producir cantidades elevadas de productos extracelulares, por ejemplo enzimas y compuestos orgánicos tales como antibióticos o ácidos orgánicos. En segundo lugar, los hongos filamentosos pueden crecer sobre sustratos de bajo coste, tales como cereales, salvado, pulpa de remolacha, etc. Las mismas razones han hecho atractivos a los hongos filamentosos organismos como hospedadores para la expresión heteróloga de acuerdo con la presente invención.

Para preparar el Aspergillus transgénico, las construcciones de expresión se preparan insertando un NOI en una construcción diseñada para la expresión en hongos filamentosos.

Se han desarrollado varios tipos de construcciones utilizadas para la expresión heteróloga. Las construcciones contienen un promotor y el NOI que es activo en los hongos. Ejemplos de promotores incluyen un promotor fúngico para un enzima extracelular altamente expresado, tal como el promotor de la glucoamilasa o el promotor de la \alpha-amilasa. El NOI se puede fusionar a una secuencia señal que ordena que se secrete la proteína codificada por el NOI. Habitualmente, se utiliza una secuencia señal de origen fúngico. Un terminador activo en los hongos finaliza el sistema de expresión.

En los hongos se ha desarrollado otro tipo de sistema de expresión en el que la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención está fusionada a una parte menor o mayor de una secuencia de nucleótidos fúngica que codifica una proteína estable. Este aspecto puede estabilizar la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención. En un sistema tal, se puede introducir un sitio de desdoblamiento, reconocido por una proteasa específica, entre la proteína fúngica y la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención (o incluso otro NOI), de manera que la proteína de fusión producida pueda ser desdoblada en esta posición por la proteasa específica, liberando así la proteína codificada por la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención (o incluso otro NOI). A título de ejemplo, cabe introducir un sitio que sea reconocido por una peptidasa de tipo KEX-2 hallada en por lo menos algunos Aspergilli (Broekhuijsen et al., 1993, J. Biotechnol., 31: 135-145). Una fusión tal lleva al desdoblamiento in vivo, lo que da como resultado la producción del producto expresado y no una proteína de fusión de mayor tamaño.

La expresión heteróloga en el Aspergillus se ha reportado para varias secuencias de nucleótidos que codifican proteínas bacterianas, fúngicas, de vertebrados y de plantas. Las proteínas se pueden depositar intracelularmente si la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención (u otro NOl) no está fusionada a una secuencia señal. Tales proteínas se acumularán en el citoplasma y normalmente no serán glucosiladas, lo que puede ser una ventaja para algunas proteínas bacterianas. Si la secuencia de nucleótidos de acuerdo con la presente invención (u otro NOI) está provista de una secuencia señal, la proteína se acumulará extracelularmente.

Con respecto a la estabilidad del producto y a las modificaciones de la cepa hospedadora, algunas proteínas heterólogas no son muy estables cuando se secretan en el fluido del cultivo de hongos. La mayoría de los hongos producen varias proteasas extracelulares que degradan las proteínas heterólogas. Para evitar este problema, como huésped para la producción heteróloga se han utilizado cepas fúngicas especiales con una producción de proteasas reducida.

Para la transformación de hongos filamentosos, se han desarrollado varios protocolos de transformación para muchos hongos filamentosos (Ballance 1991, ibídem). Muchos de dichos protocolos están basados en la preparación de protoplastos y la introducción de ADN en los protoplastos utilizando PEG e iones Ca^{2+}. Los protoplastos transformados se regeneran luego y los hongos transformados se seleccionan utilizando diversos marcadores selectivos. Entre los marcadores utilizados para la transformación hay varios marcadores auxotrofos tales como el argB, el trpC, el niaD y el pyrG, marcadores de la resistencia a los antibióticos, como la resistencia al benomil, la resistencia a la higromicina y la resistencia a la fleomicina. Un marcador de transformación comúnmente utilizado es el gen amdS del A. nidulans que, en un número de copias elevado, permite que el hongo crezca con acrilamida como única fuente de nitrógeno.

En otra realización, el organismo transgénico puede ser una levadura. A este respecto, las levaduras también han sido extensamente utilizadas como vehículo para la expresión heteróloga de genes. La especie Saccharomyces cerevisiae tiene una larga historia de utilización industrial, incluida su utilización para la expresión heteróloga de genes. La expresión de secuencias de nucleótidos heterólogas en el Saccharomyces cerevisiae ha sido revisada por Goodey et al. (1987, "Yeast Biotechnology", D.R. Berry et al., eds., páginas 401-429, Allen y Unwin, Londres) y por King et al. (1989, "Molecular and Cell Biology of Yeasts", E.F. Walton y G.T. Yarronton, eds., páginas 107-133, Blackie, Glasgow).

Por varias razones, el Saccharomyces cerevisiae resulta perfectamente adecuado para la expresión heteróloga de la secuencia de nucleótidos. En primer lugar, no es patógeno para los seres humanos y es incapaz de producir ciertas endotoxinas. En segundo lugar, tiene una larga historia de utilización segura tras siglos de aprovechamiento comercial para varios propósitos. Esto ha llevado a una amplia aceptabilidad pública. En tercer lugar, la extensa utilización comercial e investigación consagrada al organismo ha originado una riqueza de conocimientos sobre la genética y la fisiología, así como las características de fermentación a gran escala, del Saccharomyces cerevisiae.

Una revisión de los principios de la expresión de genes heterólogos en el Saccharomyces cerevisiae y la secreción de productos génicos viene dada por E. Hinchcliffe, E. Kenny (1993. "Yeast as a vehicle for the expression of heterologous genes", Yeasts. Vol. 5, Anthony H. Rose y J. Stuart Harrison, eds., 2ª edición, Academic Press Ltd.).

Varios tipos de vectores de levaduras están disponibles, incluyendo vectores integradores que requieren la recombinación con el genoma del huésped para su mantenimiento, y plásmidos vectores que se replican autónomamente.

Para preparar el Saccharomyces transgénico, las construcciones de expresión se preparan insertando la secuencia de nucleótidos de la presente invención en una construcción diseñada para la expresión en la levadura. Se han desarrollado varios tipos de construcciones utilizadas para la expresión heteróloga. Las construcciones contienen un promotor activo en la levadura fusionado a la secuencia de nucleótidos de la presente invención; normalmente, se utiliza un promotor cuyo origen es una levadura, tal como el promotor GAL1. Habitualmente se utiliza una secuencia señal que tiene como origen una levadura, tal como la secuencia que codifica el péptido señal SUC2. Un terminador activo en la levadura finaliza el sistema de expresión.

Para la transformación de la levadura, se han desarrollado varios protocolos de transformación. Por ejemplo, se puede preparar un Saccharomyces transgénico de acuerdo con la presente invención siguiendo las enseñanzas de Hinnen et al. (1978, Proceedings of the National Academy of Sciences of the USA, 75, 1929): Beggs, J.D. (1978, Nature, Londres, 275, 104); e Ito, H. et al. (1983, J. Bacteriology, 153, 163-168).

Las células de levadura transformadas se seleccionan utilizando diversos marcadores selectivos. Entre los marcadores utilizados para la transformación están varios marcadores auxotrofos como el LEU2, el HIS4 y el TRP1, y los marcadores dominantes de la resistencia a los antibióticos, tales como los marcadores de antibióticos aminoglucosídicos, por ejemplo, el G418.

Otro organismo hospedador es una planta. Aunque el enzima y la secuencia de nucleótidos que lo codifican no se dan a conocer en los documentos EP-B-0470145 y CA-A-2006454, estos dos documentos proporcionan algún comentario de fondo útil en los tipos de técnicas que se pueden emplear para preparar plantas transgénicas de acuerdo con la presente invención. Algunas de estas enseñanzas de base se incluyen ahora en el siguiente comentario.

El principio básico en la elaboración de plantas genéticamente modificadas es insertar la información genética en el genoma de la planta a fin de obtener un mantenimiento estable del material genético insertado.

Existen varias técnicas para insertar la información genética, siendo los dos principios primordiales la introducción directa de la información genética y la introducción de la información genética mediante la utilización de un sistema vector. Una revisión de las técnicas generales puede hallarse en los artículos de Potrykus (Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., [1991] 42: 205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech, marzo/abril 1994, 17-27).

Así pues, en un aspecto, la presente invención se refiere a un sistema vector que lleva una secuencia de nucleótidos o una construcción de acuerdo con la presente invención, y que es capaz de introducir la secuencia de nucleótidos o la construcción en el genoma de un organismo, tal como una planta.

El sistema vector puede comprender un vector, pero puede comprender dos vectores. En el caso de dos vectores, el sistema vector se denomina normalmente un sistema vector binario. Sistemas vectores binarios se describen con mayor detalle en Gynheung An et al. (1980), "Binary Vectors. Plant Molecular Biology Manual A3" 1-19.

Un sistema ampliamente utilizado para la transformación de células de plantas con una secuencia de nucleótidos o una construcción, dada, se basa en la utilización de un plásmido Ti procedente del Agrobacterium tumefaciens o de un plásmido Ri procedente del Agrobacterium rhizogenes, An et al. (1986), Plant Physiol., 81, 301-305 y Butcher D.N. et al. (1980), Tissue Culture Methods for Plant Pathologists, eds.: D.S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208. Se han preparado varios plásmidos Ti y Ri diferentes, que son adecuados para la elaboración de las construcciones de plantas o células de plantas, anteriormente descritas. Un ejemplo no limitativo de un plásmido Ti tal es el pGV3850.

La secuencia de nucleótidos o construcción de la presente invención debe insertarse preferentemente en el plásmido Ti entre las secuencias terminales del ADN-T o adyacente a una secuencia de ADN-T para evitar la ruptura de las secuencias que rodean inmediatamente los costados del ADN-T, dado que por lo menos una de estas regiones parece ser esencial para la inserción del ADN-T modificado en el genoma de la planta.

Como se entenderá a partir de la explicación anterior, si el organismo es una planta, entonces el sistema vector de la presente invención es preferentemente uno que contiene las secuencias necesarias para infectar la planta (por ejemplo, la región vir) y por lo menos una parte delimitante de una secuencia de ADN-T, estando la parte delimitante localizada en el mismo vector que la construcción genética.

Preferentemente, el sistema vector es un plásmido Ti del Agrobacterium tumefaciens o un plásmido Ri del Agrobacterium rhizogenes, o un derivado de los mismos; dado que estos plásmidos son bien conocidos y extensamente empleados en la construcción de plantas transgénicas, existen muchos sistemas vectores que están basados en estos plásmidos o en derivados de los mismos.

En la preparación de una planta transgénica, la secuencia de nucleótidos o la construcción, de la presente invención, se puede preparar primero en un microorganismo en el que el vector pueda replicarse y que sea fácil de manipular antes de la inserción en la planta. Un ejemplo de un microorganismo útil es el E. coli, pero pueden utilizarse otros microorganismos que tengan las propiedades anteriores. Cuando un vector de un sistema vector, como se ha definido anteriormente, se ha construido en el E. coli, se transfiere, en caso necesario, a una cepa de Agrobacterium adecuada, por ejemplo, el Agrobacterium tumefaciens. El plásmido Ti que alberga la secuencia de nucleótidos o construcción de la invención se transfiere así preferentemente a una cepa de Agrobacterium adecuada, por ejemplo, el A. tumefaciens, a fin de obtener una célula de Agrobacterium que alberga la secuencia de nucleótidos o construcción de la invención, cuyo ADN se transfiere subsiguientemente a la célula de la planta a ser modificada.

Tal como viene reportado en el documento CA-A-2006454, se dispone de una gran cantidad de vectores de clonación que contienen un sistema de replicación en el E. coli y un marcador que permite una selección de las células transformadas. Los vectores comprenden, por ejemplo, el pBR 322, la serie pUC, la serie M13 mp, el pACYC 184, etc.

De este modo, la secuencia de nucleótidos o construcción de la presente invención se puede introducir en una posición de restricción adecuada en el vector. El plásmido contenido se utiliza para la transformación en el E. coli. Las células de E. coli se cultivan en un medio nutriente adecuado y luego se cosechan y se lisan. Seguidamente, el plásmido se recupera y luego se analiza - tal como por una cualquiera o más de las siguientes técnicas: análisis secuencial, análisis de restricción, electroforesis y métodos biológicos bioquímico-moleculares adicionales. Después de cada manipulación, la secuencia de ADN utilizada se puede restringir y conectar con la siguiente secuencia de ADN. Cada secuencia se puede clonar en el mismo o en diferente plásmido.

Después de cada método de introducción de la construcción o la secuencia de nucleótidos, deseada, de acuerdo con la presente invención, en las plantas puede ser necesaria la presencia y/o inserción de secuencias de ADN adicionales. Si, por ejemplo, para la transformación se utiliza el plásmido Ti o el Ri de las células de la planta, por lo menos se pueden conectar el límite derecho y a menudo, sin embargo, el límite izquierdo y el derecho del ADN-T del plásmido Ti y del Ri como zonas flanqueantes de las secuencias de nucleótidos introducidas. La utilización de ADN-T para la transformación de las células de plantas ha sido exhaustivamente estudiada y viene descrita en el documento EP-A-120516; Hoekema, en: "The Binary Plant Vector System" Offset-drukkerij Kanters B.B., Alblasserdam, 1985. Capítulo V; Fraley, et at., Crit. Rev. Plant Sci., 4: 1-46; y An et al., EMBO J. (1985) 4: 277-284.

La infección directa de los tejidos de plantas por el Agrobacterium es una técnica simple que ha sido extensamente empleada y que viene descrita en Butcher D.N. et al. (1980), "Tissue Culture Methods for Plant Pathologists", eds.: D.S. Ingrams y J.P. Helgeson, 203-208. Para enseñanzas adicionales sobre este tema, véase Potrykus (Annu. Rev. Plant. Physiol. Plant Mol. Biol. [1991] 42: 205-225) y Christou (Agro-Food-Industry Hi-Tech. marzo/abril 1994 17-27). Con esta técnica, la infección de una planta se puede hacer en una cierta parte o tejido de la planta, esto es, en una parte de una hoja, una raíz, un tallo u otra parte de la planta.

Típicamente, para la infección directa de tejidos de la planta por el Agrobacterium que lleva el promotor y el NOI, se practica una herida a una planta a infectar, por ejemplo, cortando la planta con una navaja de afeitar o pinchando la planta con una aguja o frotando la planta con un abrasivo. La herida se inocula luego con el Agrobacterium. La planta o la parte de la planta inoculada se hace crecer luego en un medio de cultivo adecuado y se deja desarrollar para dar plantas maduras.

Cuando se preparan células de plantas, estas células se pueden hacer crecer y mantener de acuerdo con métodos de cultivo de tejidos bien conocidos, tal como cultivando las células en un medio de cultivo adecuado abastecido con los factores de crecimiento necesarios, tales como aminoácidos, fitohormonas, vitaminas, etc. La regeneración de las células transformadas en plantas genéticamente modificadas se puede conseguir utilizando métodos conocidos para la regeneración de plantas a partir de cultivos de células o de tejidos, por ejemplo seleccionando retoños transformados utilizando un antibiótico y subcultivando los retoños en un medio que contiene los nutrientes apropiados, fitohormonas, etc.

Enseñanzas adicionales sobre la transformación de plantas se pueden hallar en el documento EP-A-0449375.

En suma, la presente invención proporciona un enzima de UDP-galactosa epimerasa y una secuencia de nucleótidos que codifica el mismo.

Las muestras siguientes se depositaron de acuerdo con el Tratado de Budapest en el depositario reconocido "The National Collections of Industrial and Marine Bacteria Limited (NCIMB)" en 23 St. Machar Drive, Aberdeen, Escocia, Reino Unido, AB2 1RY, el 23 de mayo de 1997:

1.

E.coli DH5\alphapGEPI42. El número de depósito es NCIMB 40881. El NCIMB 40881 contiene el clon GEPI42 - que comprende la SEC. ID. No. 1.

2.

E.coli DH5\alphapGEPI48. El número de depósito es NCIMB 40882. El NCIMB 40882 contiene el clon GEPI48 - que comprende la SEC. ID. No. 2.

Por consiguiente, aspectos altamente preferidos de la presente invención se refieren a las secuencias codificadoras de nucleótidos obtenibles de estos depósitos, incluidos vectores de expresión, construcciones, organismos y organismos transgénicos que comprenden estas mismas secuencias o plásmidos.

Así pues, de acuerdo con una realización preferida, la secuencia de nucleótidos de la presente invención es obtenible a partir del número de depósito NCIMB 40881 o NCIMB 40882, o es una variante, un homólogo o un fragmento de la misma.

De acuerdo con una realización más preferida, la secuencia de nucleótidos de la presente invención es obtenible del número del depósito NCIMB 40881 o NCIMB 40882.

La presente invención se describirá ahora sólo a título de ejemplo.

Clonación y caracterización parcial de las secuencias de nucleótidos de la UDP-galactosa epimerasa procedente del guar (Cyamopsis tetragonoloba)

Los estudios bioquímicos sobre la UDP-galactosa 4-epimerasa (EC 5.1.3.2.) en el guar han mostrado que incluso cuando se halla una actividad bastante elevada de este enzima, la cantidad de proteína de UDP-galactosa epimerasa era muy pequeña, lo que impedía la purificación preparativa para el análisis de aminoácidos. Por consiguiente, la estrategia de clonación, de elección, era por complementación funcional en un mutante galE del E. coli.

Banco de ADNc

Un banco de expresión de ADNc que representa ARNm de semillas de guar inmaduras se construyó en el plásmido pcDNAII (Invitrogen Corporation) y se transformó en la cepa de E. coli Top10F'. La calidad del banco de ADNc se controló por purificación de plásmidos procedentes de varias colonias de Top10F' separadas, escogidas al azar. El análisis por enzimas de restricción reveló que todos los plásmidos examinados eran recombinantes.

Cepa de E. coli deficiente en UDP-galactosa epimerasa

La cepa PL-2 de E. coli no puede metabolizar la galactosa debido a un gen galE defectivo, mientras que los dos otros genes del operón gaI, galK y gaIT, están intactos (Buttin, J. Mol. Biol., 7, 164-182 (1963); Wu y Kalckar, Proc. Nat. Acad. Sci. USA, 55, 622-629 (1966). Así pues, la inserción de un gen activo de la UDP-galactosa epimerasa en las células PL-2 permitiría que esta cepa creciera en galactosa.

Transformación de la cepa PL-2 y selección

Las células PL-2 se hicieron competentes por el método de Hanahan, Techniques for transformation of E. coli, IRL Press, Oxford (ISBN 0-947946-18-17), 109-135 (1985). Se obtuvo un título de 5 x 10^{6} células transformadas/\mug de plásmido de banco.

El medio de selección era esencialmente galactosa añadida a un medio mínimo consistente en sales M9 (Maniatis et al., "Molecular cloning, a laboratory manual", Cold Spring Harbor, Nueva York (ISBN 0-87969-136-0) (1982) y se le añadieron 0,05 g/l de treonina, 0,05 g/l de leucina, 0,05 g/l de metionina, 1,0 g/l de tiamina\cdotHCl, 50 mg/l de ampicilina, 0,8 g/l de fructosa, 0,9g/l de agarosa y 6 u 8 g/l de galactosa. Los medios se denominan de ahora en adelante M9-ES6 (que contiene 6 g/l de galactosa) o M9-ES8 (que contiene 8 g/l de galactosa).

Células PL-2 competentes se transformaron con el banco de ADNc del guar y las células se sembraron en placas sobre el sustrato selectivo M9-ES6 o M9-ES8. Al cabo de dos días a 37ºC, aparecieron las colonias (aproximadamente el 0,1% del número total de transformantes). Se seleccionaron un total de 48 colonias.

Ensayo de la UDP-galactosa epimerasa en las colonias seleccionadas

A fin de establecer si la capacidad adquirida para crecer sobre galactosa era debida a la presencia de actividad de UDP-galactosa epimerasa, todas las colonias seleccionadas se ensayaron para determinar la actividad de UDP-galactosa epimerasa utilizando extractos brutos producidos por tratamiento con ultrasonidos y subsiguiente clarificación por centrifugación. Los ensayos de UDP-galactosa epimerasa se realizaron esencialmente de acuerdo con Dey (Phytochem., 23, 729-732 (1984)). La actividad de UDP-galactosa epimerasa en los extractos de PL-2 era cero (control negativo) mientras que se hallaron niveles significativos de actividad en DH5a (control positivo), como era de esperar. Las colonias de PL-2 transformadas que mostraban elevados niveles de actividad de UDP-galactosa epimerasa se escogieron para el análisis adicional.

Retransformación con el ADN plásmido procedente de las colonias 42 y 48

Los plásmidos procedentes de la colonia 42 y la colonia 48 se purificaron y se retransformaron en células PL-2 competentes y se sembraron en placas sobre M9-ES6 o M9-ES8. En ambos experimentos de retransformación aparecieron un gran número de colonias después de dos días a 37ºC. Se analizaron aproximadamente diez colonias independientes de cada uno de ellos para determinar la actividad de UDP-galactosa epimerasa, y todos los extractos contenían niveles elevados, similares, de actividad de UDP-galactosa epimerasa, como los hallados en las colonias originales 42 y 48. Este experimento demuestra que la actividad de UDP-galactosa epimerasa detectada en las colonias 42 y 48 derivadas de las células PL-2 es codificada por los insertos de ADNc.

Análisis de secuenciación del ADN de los insertos en las colonias 42 y 48

Las secuencias parciales de nucleótidos de los clones que contenían la UDP-galactosa-4-epimerasa, pGEPI42 y pGEPI48, se determinaron utilizando un equipo (kit) de secuenciación de ciclo fluorescente con secuenasa, de Termo Amersham) y un secuenciador de ADN ALF (Pharmacia).

Las SEC. ID. No. 1 y No. 2 muestran las secuencias parciales de nucleótidos de los insertos en las colonias 42 y 48, respectivamente, junto con las secuencias de aminoácidos deducidas.

Producción de anticuerpos

Se erigieron anticuerpos frente al enzima de la presente invención inyectando conejos con el enzima purificado y aislando las inmunoglobulinas del antisuero según los procedimientos descritos de acuerdo con N. Harboe y A. Ingild ("Immunization, Isolation of Immunoglobulins, Estimation of Antibody Titer". In A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis, Methods and Applications, N.H Axelsen, et al. (eds.), Universitetsforlaget, Oslo, 1973) y por T.G. Cooper, "The Tools of Biochemistry" John Wiley & Sons, Nueva York, 1977).

Otras modificaciones de la presente invención resultarán evidentes para los expertos en la materia.

1

2

3

4

Claims (11)

1. Enzima de UDP-galactosa epimerasa susceptible de ser obtenida a partir de guar, en el que el enzima comprende por lo menos la secuencia de aminoácidos mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2, o es una secuencia de aminoácidos que tiene por lo menos un 98% de homología con la misma.

2. Enzima de UDP-galactosa epimerasa susceptible de ser obtenida a partir de guar, en el que el enzima es codificado por una secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos la secuencia mostrada como SEC. ID. No. 1 o SEC. ID. No. 2, o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 98% de homología con la misma.

3. Secuencia de nucleótidos que comprende por lo menos la secuencia mostrada como ID. SEC No. 1 o SEC. ID. No. 2, o una secuencia de nucleótidos que tiene por lo menos un 98% de homología con la misma, o una secuencia complementaria de la misma.

4. Secuencia de nucleótidos según la reivindicación 3, operativamente unida a un promotor.

5. Construcción que comprende o es capaz de expresar la invención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.

6. Vector que comprende o es capaz de expresar la invención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. Plásmido que comprende o es capaz de expresar la invención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Organismo transgénico no humano que comprende o es capaz de expresar la invención según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. Procedimiento de preparar un enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende expresar una secuencia de nucleótidos según la reivindicación 4.

10. Utilización de un enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, o un enzima preparado por un procedimiento según la reivindicación 9, para la preparación de un producto alimenticio (tal como un pienso).

11. Producto alimenticio que comprende el enzima según cualquiera de las reivindicaciones 1 y 2, o un enzima preparado por un procedimiento según la reivindicación 9.