ES2216619T3 - Vacuna viral. - Google Patents

Abstract

Vacuna de proteína, que comprende una mezcla de moléculas de proteína virales, caracterizada porque las moléculas son variantes de secuencias de una sola proteína viral o de una parte de la misma, cuya mezcla contiene 102 variantes de secuencias, susceptible de ser obtenida por expresión de una mezcla de ADN plasmídico, que comprende, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria.

Description

Vacuna viral.

La presente invención se refiere una composición farmacéutica o una vacuna que comprende una mezcla de moléculas de proteína virales, que son variantes de secuencias de una sola proteína viral o de una parte de la misma, cuya mezcla contiene \geq 10^{2} variantes de secuencias, susceptible de ser obtenida por expresión de una mezcla de ADN plasmídico, y que comprende, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de una distribución aleatoria. Además, la invención se refiere, entre otros aspectos, a una vacuna de ADN, que codifica para una mezcla de proteínas virales de estructuras diferentes, en la que la vacuna contiene una mezcla de variantes de secuencias de una molécula de ADN viral o de una parte de la misma, que codifica para variantes de secuencias de una proteína viral o de una parte de la misma, cuya mezcla contiene \geq 10^{2} moléculas de ADN, que se distinguen con relación a su secuencia de ácidos nucleicos, cuya mezcla presenta, debido a la variación de las posiciones de nucleótidos, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria. Según una forma de realización preferida de la invención, las proteínas virales son variantes de secuencias de una proteína GP120 del virus inmunodeficiente humano, que se distinguen cada una de otra en su secuencia de aminoácidos en la zona del bucle V2 y/o del bucle V3, preferentemente tanto del bucle V2 como del bucle V3. Además, la invención se refiere a la preparación de las vacunas virales, incluidos los intermedios y constructos, procedimientos de preparación y usos relacionados con las mismas.

En muchas infecciones virales, en particular en la infección de VIH-1, se observa una fuerte defensa inmune, que es capaz de controlar el virus durante un periodo de varios años. El periodo en el que se controla el virus y no se observan síntomas de una enfermedad se denomina la fase asintomática de la enfermedad (de VIH). En el curso de la enfermedad, se producen cada vez más nuevas variantes de virus. Esto permite al virus de escaparse de la defensa inmune humano e infectar cada vez más nuevas células de defensa del sistema inmune (ver M. Schreiber et al., J. Virol. 68 No. 6 (1994) 3908-3916; J. Gen. Virol. 77 (1996) 2403-2414; Clin. Exp. Immunol. 107 (1997) 15-20; J. Virol. 71 No. 12 (1997) 9198-8205).

En el estado de la técnica se han utilizado, para el tratamiento de enfermedades virales, tales como por ejemplo las infecciones por el poliovirus (Horaud F et al., Biologicals, 1993, 21:311-316), el virus Hanta (Ulrich R et al., 1998 Vaccine 16:272-280; Schmaljohn CS et al., 1992 Vaccines 10:10-13), el virus Lassa (Morrison HG et al., 1989 Virology 171:179-188; Clegg JC et al., 1987 Lancet 2:186-188), el virus hepatitis A (Clemens et al., 1995 J. Infect. Dis. 171:Suppl1:S44-S49; Andre et al., 1990 Prog. Med. Virol. 37:72-95) y el virus hepatitis B (McAleer et al., 1984 Nature 307:178-180), pero también de la infección de VIH (Egan et al., 1885 J. Infect. Dis. 171:1623-1627, Kovac et al., 1993 J. Clin. Invest. 92:919-928), sólo antígenos virales individuales, genéticamente no modificados, específicos o cepas de virus individuales desactivadas, con el fin de realizar investigaciones sobre las estrategias de vacunación aptas. En caso de VIH, se han preparado hasta ahora por ejemplo las proteínas de la cubierta externas de dos cepas de virus para los experimentos de vacunas en el ser humano (MN y SF2) (Zolla-Pazner et al., J. Infect. Dis. 178 (1998) 1502-1506). Ambas moléculas GP120 se distinguen en sus secuencias de aminoácidos, pero en particular en su secuencia de aminoácidos de las zonas variables, tales como por ejemplo del bucle V3 (V3 loop). Las dos cepas de virus presentan distintas características fenotípicas, debido a las distintas secuencias del V3-Loop. La cepa MN de VIH-1 es una variante de virus que infecta preferentemente macrófagos y células que poseen el co-receptor viral CCR5. En cambio, los virus del tipo SF2 se multiplican preferentemente en células T y utilizan el co-receptor viral CXCR4. Este tipo de virus se denomina por lo tanto también variantes de virus trofes de células T (por ejemplo cepa de VIH MN) o trofes de macrófagos (por ejemplo cepa de VIH SF2). En chimpancés se han realizado experimentos de vacunación con estas dos variantes de GP120. En dichos experimentos se ha demostrado que se puede inducir una respuesta inmune, que protege no sólo contra las dos cepas de HIV MN y SF2, sino también es capaz de impedir la infección con otras cepas de virus y también aislados de pacientes de VIH-1. A diferencia de los chimpancés, en el ser humano se ha utilizado hasta la actualidad sólo una de las dos variantes de GP120 para experimentos de vacunación. Tanto MN GP120 como SF2 GP120 no protegen con seguridad contra una infección por una variante de virus tal como aparece en una persona infectada con VIH-1 (aislado de paciente o virus de tipo silvestre). Una vista general del estado de la investigación en conjunción con la vacunación con la proteína de la cubierta GP120 es ofrecida por J.A. Levy en "HIV and the Pathogenesis of AIDS", Editor: Jay A. Levy, capítulo 15 2ª edición, ASM Press Washington, D.C., 1998).

Las estrategias de vacunación discutidas o investigadas hasta la actualidad en el estado de técnica adolecen del inconveniente, entre otros, de que las vacunas utilizadas no son capaces de impedir la formación de variantes de virus cada vez nuevas en el curso de una enfermedad de virus.

Por tanto, el objetivo de la presente invención es proporcionar una vacuna que, en particular, sea capaz de impedir o disminuir sustancialmente la formación de nuevas variantes de virus en el curso den una enfermedad de virus y de limitar o impedir las posibilidades de que el virus pueda escapar de la defensa inmune humana e infectar una y otra vez nuevas células de defensa del sistema inmune.

Para conseguir dicho objetivo, se han propuesto, según la invención, los objetos expresados en las reivindicaciones siguientes adjuntas.

Por ello, el objetivo de la presente invención es, entre otros, una vacuna de proteína que comprende una mezcla de moléculas de proteína virales, en la que las moléculas son variantes de secuencias de una sola proteína viral o de una parte de la misma, en la que la mezcla contiene \geq 10^{2} variantes de secuencias, susceptibles de ser obtenidas por expresión de una mezcla de ADN plasmídico, la cual, debido a la variación de las posiciones de nucleótidos, comprende combinaciones de secuencias de distribución aleatoria.

Por variantes de secuencias de una proteína se entiende, según la invención, las moléculas que presentan secuencias de aminoácidos derivadas de una proteína viral nativa o de una parte (fragmento) de la misma, cuyas variantes se distinguen por el hecho de que en puntos cualesquiera de la secuencia o de partes de la misma puede haberse reemplazado por lo menos un aminoácido. Preferentemente, las variantes de secuencias presentan varios intercambios de aminoácidos en distintos puntos de la secuencia que son responsables de la producción, pero también de la unión de anticuerpos que neutralizan virus. El número y la posición de los aminoácidos reemplazados depende de la variabilidad de aminoácidos de las regiones del gp120, observada en aislados de VIH adaptados a cultivos de células y los del tipo silvestre. Según la invención, las variantes de secuencia presentan una heterogeneidad en por lo menos dos posiciones de aminoácidos de la secuencia o de partes de la misma. Se prefiere en particular una heterogeneidad en tres a ocho y preferentemente en más de ocho posiciones de aminoácidos, siendo posibles en dichas posiciones todos los aminoácidos que ocurren. De la combinación de los diferentes aminoácidos posibles para cada posición resulta el número de las variantes de secuencia posibles, que en su totalidad constituyen la vacuna.

La invención se refiere a una vacuna que comprende una mezcla de \geq 10^{2} moléculas de variantes de secuencias, es decir, una mezcla de más de 10^{2} diferentes secuencias de aminoácidos (homólogos). Se prefiere en particular una vacuna que comprende \geq 10^{3} y preferentemente \geq 10^{4} variantes de secuencias.

Dentro de la presente invención, se supone que la vacuna puede comprender, aparte de las variantes de secuencias, también la proteína como tal, de la que se han derivado las variantes de secuencias.

Por tanto, según la invención, se proporciona una sustancia activa contra virus, que comprende proteínas específicas de virus, que se distinguen todas con relación a sus secuencias o a partes de las mismas. A tal fin, se sintetiza de nuevo el gen que codifica para la proteína, con el fin de generar nuevos puntos de corte para las enzimas que cortan el ADN, permitiendo de esta manera el intercambio de regiones específicas. A continuación, se produce un banco de genes para la secuencia que codifica para la proteína por síntesis química de fragmentos de ADN que codifican para la sección de proteína en cuestión. A continuación, los vectores de expresión que codifican para la proteína se transfectan como mezcla en células. A partir de estas células productoras de proteína puede aislarse entonces la mezcla de las diferentes proteínas virales, que, según la invención, constituyen la sustancia activa preferida.

En caso de VIH como la enfermedad viral, la infección crónica y el resultante daño continuo del sistema inmune en el curso de la enfermedad producen una pérdida completa de la defensa de virus específica. La defensa de virus específica incluye anticuerpos neutralizantes, que poseen la propiedad de formar una unión específica, muy estable con determinadas estructuras antigénicas. De esta manera, se marcan antígenos ajenos y se bloquean su interacción con, por ejemplo, receptores de virus. Una defensa de virus específica de este tipo son los anticuerpos neutralizantes contra el bucle V3 de la proteína de la cubierta externa GP120. Los anticuerpos anti-V3-Loop de este tipo son capaces de impedir la infección de células. En el modelo animal, se ha demostrado que la administración de un determinado anticuerpo V3-Loop monoclonal puede impedir una infección con VIH-1. La administración del mismo anticuerpo monclonal también ha permitido curar una infección existente.

Sin embargo, a diferencia de los sistemas experimentales, se observa, en el curso natural de la infección de VIH, un desarrollo de variantes de virus cada vez nuevos. Así, en un momento dado, se encontraron en un solo paciente cientos de diferentes variantes V3-Loop, puesto que la variación del VIH-1 es particularmente alta justamente en el V3-Looop. El V3-Loop es un dominio dominante antigénico importante del GP120. Por tanto, contra cada V3-Loop se forma una respuesta inmune humoral muy específica. El resultado de la inducción de una respuesta inmune altamente específica contra el V3-Loop es que los anticuerpos neutralizantes contra el V3-Loop de la variante A del VIH-1 no son capaces de neutralizar la variante B y viceversa (Schreiber et al., J. Virol. 68 (1994) 3908-16, Abrahamsson et al., 4 (1990) 107-12).

Durante la fase asintomática de la enfermedad de VIH, las variantes de virus libres de células en el suero son neutralizadas por anticuerpos. Las variantes de virus que escapan de la neutralización autóloga no pueden observarse en el suero hasta más tarde. Dichas variantes V3-Loop-Escape ya no son detectadas por el anticuerpo V3-Loop y por tanto tampoco son neutralizadas. Sin embargo, todas las demás variantes de virus encontradas en el suero de los pacientes son detectadas por los anticuerpos autólogos del V3-Loop. Esto indica que en el curso de la enfermedad aparecen variantes de virus contra las que no existen anticuerpos del V3-Loop. Al examinarse el contenido en anticuerpos de muestras de suero de un paciente durante un periodo de varios años, pueden detectarse, en las muestras de suero tomadas al principio de la fase asintomática, los anticuerpos del V3-Loop contra la variante V3-Loop-Escape que aparece en una fase posterior. Por tanto, a diferencia de otras enfermedades de infección, no se observa el clásico "Escape" del agente patogénico por variaciones antigénicas cada vez nuevas, sino la desactivación de la respuesta inmune neutralizante contra uno de los virus que están replicando en el paciente. Por tanto, la falta de los anticuerpos V3-Loop neutralizantes que se observa es el resultado de una pérdida continua de los anticuerpos V3-Loop específicos del tipo. La pérdida de los anticuerpos neutralizantes permite al virus correspondiente de multiplicarse, lo cual da lugar a un incremento de la carga de virus en el suero del paciente. En el transcurso de la enfermedad, se observa también un incremento de la carga de virus en el ganglio linfático (Chun et al., Nature 387 (1997) 183-188).

Un virus que se impone contra el sistema inmune del paciente y llega a ser la variante de virus dominante debe superar forzosamente todas las barreras antivirales presentadas por el sistema inmune. Además de los anticuerpos neutralizantes, las células T citotóxicas sin igualmente capaces de suprimir la multiplicación de los virus. Las células T citotóxicas causan la muerte de las células T CD4+ infectadas con VIH. Además de la pérdida de los anticuerpos neutralizantes, se observa también la pérdida de las células T citotóxicas contra las células infectadas con VIH (Zerhoui et al., Thymus 24 (1997) 203-219; Gould et al., Semin Cell Dev Biol 9 (1998) 321-328; Wagner et al., J Gen Virol 74 (1993) 1261-1269; O'Toole et al., AIDS Res Hum Retroviruses 8 (1992) 1361-1368; Shearer et al., 137 (1986) 2514-2521). Por tanto, la misión de una vacuna heteróloga es de inducir o activar en la mezcla de muchas proteínas diferentes de la cubierta GP120 del VIH tanto los anticuerpos neutalizantes como las células T citotóxicas contra un gran número de variantes de virus distintas.

Como ya se ha expuesto, la enfermedad de VIH está caracterizada por el hecho de que el virus se modifica constantemente. La causa de esto es la tasa de error de la enzima viral transcriptasa inversa, que comete errores durante la multiplicación de la información hereditaria viral. Esto da lugar a la producción de mutantes que por un lado son seleccionados, debido a sus propiedades biológicas y al efecto antiviral del sistema inmune humano. Igual que en caso de VIH, existen otros agentes patogénicos que transcriben su información hereditaria sin corrección de errores, lo cual puede provocar la formación de un gran número de variantes. Estos incluyen, además de los virus de hepatitis A, B y C, también los virus Hanta y Lassa. Así, se observa en las personas vacunadas contra hepatitis B, que en aproximadamente un 2% tiene lugar un fallo de la vacunación. En dicho 2%, se encuentran variantes "escape" de hepatitis B, que no pueden suprimirse por medio de la respuesta inmune inducida por la vacuna.

La formación de las variantes "escape" de vacuna, de terapia y de respuesta inmune radica en la variabilidad genética de dichos virus (Blum, Int J Clin Lab Res 27 (1997) 213-214; Jongerius et al., Transfusion 38 (1998) 56-59).

Hasta la actualidad, no es conocido en el estado de la técnica cómo contrarrestar una pérdida de este tipo de anticuerpos neutralizantes de virus. Las estrategias utilizadas hasta ahora han conseguido su objetivo en cada caso sólo en parte, es decir, con relación a la formación y a la conservación de anticuerpos individuales específicos de variantes contra virus determinados, los métodos de tratamiento propuestos hasta ahora en forma de medicamentos o vacunas antivirales a base de una sustancia "memo" no son capaces de contrarrestar la pérdida de anticuerpos específicos del tipo contra la multiplicidad de las variantes de proteínas formadas por el virus en el curso de una enfermedad.

La presente invención de una vacuna heterogénea ahora ha hecho posible por primera vez evitar la pérdida de anticuerpos V3 neutralizantes o por lo menos contrarrestar sustancialmente dicha pérdida.

Sobre la base de la invención, se proporciona por primera vez un tratamiento inmunoreconstitutivo de pacientes infectados con virus, en particular de personas infectadas con VIH-1, en el que se activa el sistema inmune de tal manera que la defensa inmune adquirida naturalmente contra la población viral de las diferentes variantes de virus se regenera y se estimula nuevamente, impidiendo de esta manera la multiplicación de las variantes de virus contenidas en el paciente.

En breve, la invención se basa en el concepto de preparar para una sustancia activa contra VIH-1, una mezcla de proteínas GP120, distinguiéndose dichas proteínas GP120 por ejemplo en el bucle V2 o V3 o simultáneamente en ambos dominios variables, es decir, el V2-Loop y el V3-Loop. Para conseguir este objetivo, el gen que codifica para GP120 debe sintetizarse de nuevo con la formación de puntos de corte nuevos (monovalentes) para las enzimas que cortan ADN, permitiendo el intercambio específico de, por ejemplo, las regiones V2 y V3. A continuación, se prepara un banco de genes V2/V3 para GP120 por síntesis química de fragmentos de ADN que codifican para el V2-Loop y el V3-Loop. Finalmente, los vectores de expresión GP120 se transfectan como mezcla en células, y a partir de dichas células que producen GP120 puede entonces aislarse la mezcla de las diferentes proteínas GP120, que pueden utilizarse como sustancia activa para la profilaxis y/o terapia de la enfermedad de VIH o SIDA.

La idea en que se basa la presente invención por tanto radica en preparar, para una terapia inmune o una vacuna contra VIH-1, muchas moléculas GP120 diferentes, que llevan secuencias del V3-Loop (y/o secuencias del V2-Loop), tal como pueden identificarse también en las variantes de virus en pacientes.

La producción de una mezcla de variantes de virus naturales en el sistema de cultivo de células es muy complicada. Hay que tener en cuenta en particular que la composición de una mezcla de virus cambia, puesto que hay que utilizarse, en el cultivo de células, células que pueden ser infectadas por VIH-1. Algunas variantes de virus que presentan ventajas selectivas, por ejemplo una cinética de crecimiento más rápida, por tanto dominarán en el sistema de cultivo de células ya tras pocos días y desplazarán las variantes de virus más lentas. Esto es el caso especialmente cuando se desea aislar las variantes de virus diferentes que ocurren en las células sanguíneas periféricas mononucleares (PBMC) o en el suero de pacientes. Debido a la imposibilidad de cultivar una mezcla invariable de variantes de VIH, este método no consigue producir o aislar una mezcla correspondiente de proteínas GP120 a partir de cultivos de virus.

Por tanto, en el marco de la invención, se ha seleccionado, para la preparación de las variantes de VIH-1 y las variantes de GP120, un planteamiento de ingeniería genética. Para la preparación de las variantes de virus y del GP120 recombinante, se ha construido un sistema de clonación que se compone de dos vectores. La parte central de ambos vectores es un gen nuevo de una proteína de la cubierta VIH-1 (gen env de VIH-1) sintetizado químicamente, que codifica para la proteína GP120. Un vector contiene todo el genoma del VIH-1. Tras transfección de este vector en células, las células producen partículas de virus de infección. Esto permite la producción de una mezcla de variantes de virus, debido al hecho de que pueden utilizarse células que son resistentes a una infección por VIH-1. Por este motivo, en un sistema de cultivo de células de este tipo no puede cambiarse la composición de la mezcla a causa de las propiedades biológicas de las variantes de virus. El segundo vector permite la expresión de variantes de GP120 en células eucarióticas. Este vector sirve directamente para la preparación de la vacuna.

Para la preparación y expresión de las variantes de GP120 del V3-Loop en células eucarióticas por ingeniería genética, se ha preparado un constructo de gen específico de VIH-1-env, denominado en lo sucesivo "cajetín de gen". Para la preparación del cajetín de gen, se sintetizó según la invención químicamente la secuencia completa codificadora del gen env. Este método permite cambiar la secuencia codificadora del gen tal como se desee, con lo cual pueden incorporarse en la secuencia del gen env secuencias de reconocimiento de ADN nuevas para las enzimas de restricción que cortan el ADN. Al hacer esto, hay que asegurar que la secuencia de aminoácidos del GP120 original (preferentemente de las cepas NL4-3 y PI-932) no cambia, mientras que en cambio se forman nuevos puntos de corte de restricción en la secuencia de ADN del gen env. Al mismo tiempo, según la invención, se eliminan puntos de corte para enzimas que ocurren varias veces en la secuencia de env, con lo cual estará presente para cada enzima de restricción determinada sólo un punto de corte, tal como por ejemplo Bg1II. Según una forma de realización preferida, se incorporan en el gen env diez nuevos puntos de corte que ocurren sólo una vez (monovalentes) a una distancia de aproximadamente 150 pares de bases. El nuevo gen env así producido se denomina dentro de la presente invención también cajetín de gen. En principio, el nuevo fragmento env se parece a un "polylinker".

Los puntos de corte para las enzimas de restricción BstEII y BamHI limitan el cajetín de gen preferido según la invención (SEC ID NO: 9). Para poder reemplazar la zona del gen env, ambos puntos de corte se encuentran sólo una vez en el vector de expresión pBSCenvATG (SEC ID NO: 10) para gp120 y en el vector retroviral pNL4-3. El vector con la referencia pBSCenv-V3 asignada por el depositante se depositó el 6 de enero de 1999 en la DSM - Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (Colección alemana de microorganismos y cultivos de células), Mascheroder Weg 1b, D-38124 Braunschweig, Alemania, bajo el número de acceso DSM 12612 según el Convenio de Budapest.

Reemplazando la sección de gen limitada por BstEII y BamHI permite clonar las secciones del gen env nuevamente preparadas, que son limitadas igualmente por BstEII y BamHI, en ambos vectores. El PstI/Bc1I del V2-Loop y el fragmento env Bg1II/XbaI del V3-Loop se sintetizan químicamente o enzimáticamente y luego se clonan en un vector estándar, tal como por ejemplo pUC 18 ó 19. En dicho vector, el fragmento se examina por secuenciado y entonces se corta del vector por digestión con Pst/Bc1I o Bg1II/XbaI y se transfiere en el vector pBSCenvATG y después en el vector pNL4-3. En lugar de la clonación intermedia en un vector estándar (pUC 18, pUC 19, etc.), los fragmentos PstI/Bc1I V2-Loop y Bg1II/XbaI del V3-Loop pueden clonarse también directamente en pBSCenvATG.

Puesto que se encuentra en el cajetín de gen tras cada aproximadamente 100 pares de bases un punto de corte para una enzima de restricción, todas las zonas del gen env, en particular el V3-Loop o V2-Loop, pueden reemplazarse con fragmentos de ADN cualesquiera. La sección que codifica para el V3-Loop puede ser reemplazada por un fragmento Bg1II-XbaI, cuyo tamaño es de 244 pares de bases (ver SEC ID NO: 9; nucleótidos 708 a 955). El objetivo es reemplazar las secciones de gen que codifican para los "loops" variables de la proteína GP120 con nuevos fragmentos de ADN. Los fragmentos se preparan por síntesis y, a continuación, se clonan en el cajetín del gen env. Si en la síntesis de los fragmentos de ADN del V2-Loop y del V3-Loop se varía la secuencia en posiciones determinadas, es decir, si se incorporan los cuatro nucleótidos con la misma igualdad o si se utiliza en esta posición el nucleótido inosina, es posible preparar variantes del gen env que presentan una variación predeterminada en la secuencia de aminoácidos que codifican. Las secuencias del V3-Loop de aislados de pacientes son la base de partida para la preparación de la mezcla de GP120. Si se clonan dichas variantes en el cajetín de gen gp120, las proteínas GP120 correspondientes con sus dominios antigénicos variables pueden expresarse en células eucarióticas. Para la variación de la región V3-Loop del gen env están disponibles datos de secuencias procedentes de aislados de pacientes de VIH-1. Los aislados de pacientes son variantes de virus que se han cultivado en el laboratorio directamente a partir de material de pacientes, suero o células infectadas procedentes de la sangre. Dichos virus están caracterizados, a diferencia de los virus de VIH-1 que se han cultivado durante mucho tiempo en el laboratorio, por propiedades especiales. Dichos virus son más resistentes a anticuerpos neutralizantes y quimioquinas. A diferencia de los virus adaptados a los cultivos de células, los aislados de pacientes utilizan distintos co-receptores para la infección de células. Puesto que aislados de pacientes se diferencian mucho de virus adaptados al laboratorio, es deseable que los datos de secuencias del V2-Loop o V3-Loop de los genes env recogidos se utilicen para la preparación de la mezcla de GP120. Dentro de la invención son posibles intercambios de bases adicionales en las zonas fuera de las secciones de secuencias que codifican para V2 y V3. Según una forma de realización particular la invención, se proporciona una vacuna de ADN que comprende de las proteínas GP120 del virus inmunodeficiente humano (VIH), que se distinguen una de otra en sus secuencias de aminoácidos en la zona del V3-Loop y/o del V2-Loop.

En la invención, se incorporan, durante la preparación por ingeniería genética de la mezcla de proteínas o de las vacunas de proteínas, variaciones de secuencias preferentemente en las zonas del V3-Loop, que se encuentran fuera de las secuencias de consenso (ver por ejemplo M. Schreiber et al., J. Virol. 71 No. 12 (1997) 9198-9205). Las secuencias de consenso son secciones de secuencias que se mantienen sustancialmente intactas en el cuerpo tanto entre diferentes cepas de virus como en la formación de variantes de virus a medida que avanza la enfermedad viral (enfermedad de VIH). Una sección de este tipo es, en caso de VIH-1 del subtipo B, la secuencia gli-pro-gli-arg-ala-phe (GPGRAF). A la izquierda y la derecha de este motivo de secuencias se encuentran zonas cortas con un longitud de 4-10 aminoácidos, que pueden variar mucho. Esto se ha representado en la Fig. 1 con el ejemplo de las variaciones de secuencias del V3-Loop de aislados de pacientes.

Además de las variaciones en la zona del V3-Loop, las moléculas de las vacunas de proteína según la invención pueden presentar variaciones de secuencias también en la zona del V2-Loop. También en este caso, se prefieren los cambios en la secuencia aminoácidos fuera de las zonas de la secuencia de consenso (ver la Fig. 2). Además, son posibles intercambios de aminoácidos adicionales en zonas fuera del V2-Loop y del V3-Loop.

En relación con la invención, se utilizan siempre los códigos de uno o tres letras convencionales para denominar los aminoácidos. En la variación de las secuencias de aminoácidos dentro de la vacuna de proteína según la invención es posible cualquier intercambio de aminoácidos. Sin embargo, en cualquier caso se reemplazan los aminoácidos de la secuencia del GP120 viral o de las secuencias del V2-Loop y del V3-Loop preferentemente por aminoácidos que también ocurren en las otras variantes de virus en las posiciones de secuencias correspondientes (ver la Fig. 2, fecha de actualización de los datos de secuencias 1997 en: Human Retroviruses and AIDS, A compilation and analysis of nucleic acid and amino acid sequences, Los Alamos National Laboratory, Los Alamos, NM 87545, U.S.A., Editores: B. Korber, B. Hahn, B. Foley, J.W. Mellors, T. Leitner, G. Myers, F. McCutchan, C. Kuiken).

En la invención se proporciona por primera vez una vacuna de proteína que se ha preparado por ingeniería genética y comprende variantes de secuencias de antígenos virales específicos (proteínas). A continuación, la preparación de la vacuna se describirá con el ejemplo del V3-Loop de VIH. Para los expertos en la materia es sobreentendido que el principio de síntesis descrito a continuación puede aplicarse también a otros virus u otras proteínas virales o partes de sus secuencias.

En breve, como base de la vacuna se prepara una mezcla de proteínas GP120 con secuencias V3 variables, que imitan la variabilidad del V3-Loop de la proteína GP120 de VIH.

A dicho fin, se clona primero la secuencia que codifica para la proteína GP120 pieza por pieza en el plásmido pUC 18/19. Esto se efectúa por medio de un intercambio de "polylinker", con lo cual, a través de los sitios de restricción posibles, incorporados antes en la secuencia gp120 por mutaciones silenciosas, todas las secciones de interés están flanqueadas de sitios de restricción monovalentes, por lo cual pueden cortarse más tarde y reemplazarse.

A continuación, dos oligómeros de ácido nucleico homólogos se preparan con la ayuda de una máquina para la síntesis de ADN (longitud aproximadamente 300 pares de bases). Una vez completada la hibridación, se forma el fragmento de ADN de doble hebra con la secuencia de ADN del V3-Loop. Para la preparación del fragmento de ADN del V3-Loop de doble hebra, pueden utilizarse varios métodos estándares de la microbiología. En un método, los variables se introducen por medio de inosinas y, en la hebra complementaria correspondiente, los variables se introuducen por medio de una mezcla de nucleótidos (AGCT, AGC, AG, etc.). En dicho método, se prepara el fragmento de ADN exclusivamente por vía química. En otro método, una combinación de síntesis de ADN química y enzimática, se introducen los variables por medio de mezclas de nucleótidos. La hibridación tiene entonces lugar en los extremos complementarios de una longitud de 20-30 bases, que no son variables. La síntesis para dar la molécula completamente de doble hebra se realiza eenzimáticamente con la ayuda de una polimerasa de ADN. Para esto pueden utilizarse tanto polimerasas de ADN isotérmicos (fragmento Klenow) como polimerasas de ADN termoestables (polimerasas Taq). Si se utiliza la polimerasa Taq, es posible preparar mayores cantidades para la clonación del fragmento de ADN del V3-Loop también por medio de la reacción en cadena de polimerasa. Estos métodos se utilizan para preparar un fragmento de ADN de doble hebra, que es variable en posiciones determinadas. Dicha secuencia de ADN degenerada codifica para la multitud correspondiente de secuencias de aminoácidos del V3-Loop de la mezcla de proteínas GP120, es decir, la vacuna de proteína.

La mezcla de los fragmentos V2 sintetizados presenta por el término 5' un punto de corte PstI y por el término 3' un punto de corte Bc1I. La mezcla de los fragmentos V3 presenta por el término 5' un punto de corte Bg1II y por el término 3' un punto de corte XbaI. Por medio de los dos puntos de corte correspondientes, se clona la mezcla de fragmentos en un vector, por ejemplo pUC18 delta-env o pUC 18 BstEII-BamHI (Fig. 3). Tras dicha clonación, se obtiene una mezcla o un "pool" de ADNs plasmídicos del vector pUC18, que poseen todos el fragmento completo BstEII-BamHI env. Todos los ADNs plasmídicos se distinguen exclusivamente con respecto a la secuencia del V2-Loop o V3-Loop env. La deleción (delta-env) de la sección del gen env en el vector pUC18 se deshace por inserción de los fragmentos V2 o V3.

La mezcla así obtenida de los ADNs plasmídicos con fragmentos env variables se transforma en E. coli y se fermenta. E. coli amplifica y replica dicha mezcla de ADN plasmídico. En dicho proceso, se gneran todos las variables posibles de dichos plásmidos del V2-/V3-Loop.

A continuación, se aísla dicho "pool" de plásmidos. De la mezcla de ADNs plasmídicos se corta entonces el fragmento env por digestión con BstEII y BamHI y se clona directamente en el vector para la expresión del gp120 viral. Este vector presenta la ventaja de que GP120 se expresa también en el sistema de células eucarióticas.

Dicho "pool" de ADN del vector BSCenvATG con un constructo de gp120 variable se transfecta luego en células Cos o Chinese Hamster Ovary (células CHO). Estos eucariontes entonces expresan dicho "pool" de plásmidos, de modo que estadísticamente la proteína correspondiente se traslada y, a continuación, se glicosila de forma adecuada según el tipo de eucariontes utilizado. A esto sigue la cosecha de las proteínas, seguida de su purificación hasta obtener el producto acabado (mezcla de proteínas o mezcla de GP120 con secuencia de aminoácidos variable).

A fines de ilustración, se ha representado el procedimiento para la preparación de las vacunas de proteína según la invención de forma fácil de apreciar en la Fig. 4.

Como se ha expuesto, es posible realizar variaciones en el V2-Loop y/o V3-Loop. La variación del V2-Loop puede realizarse según el mismo esquema descrito para V3.

La preparación de la vacuna de proteína según la invención se realiza tal como se ha descrito anteriormente a través de varios constructos clave, es decir, intermedios de ácido nucleico y constructos de ADN, que son esenciales para la realización de la invención.

Tal como ya se ha expuesto anteriormente, la secuencia de ácido nucleico que codifica para la proteína GP120 se clona pieza por pieza en pUC 18/19, partiéndose, según la invención, de una secuencia gp120, en la que los sitios múltiples de escisión de restricción se modifican por medio de mutaciones silenciosas de tal manera que cada de los sitios de escisión de restricción restantes sólo ocurre una vez más en la secuencia. Esta modificación de secuencias es necesaria para poder incorporar el cajetín de expresión necesario para la generación de las variantes de secuencias de forma selectiva en un punto determinado, limitado por dos sitios de escisión de restricción, cada uno de los cuales ocurre sólo una vez en la secuencia. Los procedimientos para incorporar mutaciones silenciosas en una secuencia de ácido nucleico son conocidos por los expertos en la materia.

Para la presente invención, se generó, entre otras, una secuencia de ácido nucleico, derivada de la secuencia env en SEC ID NO: 1 o de un fragmento de la misma, estando dicha secuencia modificada de tal manera que contiene sitios de escisión de restricción exclusivamente monovalentes. Preferentemente, la modificación se efectúa por introducción de mutaciones silenciosas. Según una forma de realización preferida de la invención, la secuencia de ácido nucleico comprende la secuencia representada en SEC ID NO: 9. La secuencia del cajetín de gen puede estar modificada de tal manera que contiene todo el gen env o partes del gen env procedente de aislados de virus de pacientes. Preferentemente, un cajetín de genes de este tipo debería contener la secuencia env del aislado de paciente PI-932 (SEC ID NO: 11). Un cajetín de genes preferido según la invención basado en la secuencia PI-932 se ha representado en SEC ID NO: 12.

La presente invención se refiere también a una secuencia de ácido nucleico monohebra que contiene la zona que codifica para el V3-Loop y/o el V2-Loop o fragmentos o partes de la misma, en la cual, en caso del V3-Loop, un fragmento Bg1II-XbaI (247 bp) o bien un fragmento Bg1II-NheI (283 bp) puede ser reemplazado con un fragmento modificado que lleva por lo menos en 6, preferentemente en 9 a 20, posiciones intercambios de ácido nucleico o mutaciones y, en caso del V2-Loop, un fragmento PstI-Bc1I (139 bp) o bien un fragmento PstI-EcoRI (339) puede ser reemplazado por un fragmento modificado que lleva en por lo menos 6, preferentemente en 9 a 20, posiciones intercambios de ácido nucleico o mutaciones. En dichas secuencias, los nucleótidos dentro de una secuencia de ácido nucleico se han reemplazado en cada caso o bien por inosina o bien por una mezcla de 2-4 nucleótidos. Esto se ha ilustrado en el ejemplo de la Fig. 5. Si se desea combinar en 7 posiciones de aminoácido del V3-Loop 21 aminoácidos diferentes para dar 1152 variantes, es necesario incorporar, en la secuencia de ácidos nucleicos monohebra (oligonucleótidos), dos nucleótidos por síntesis química en cada de las 11 posiciones de ácido nucleico (Fig. 5).

Las secuencias de ácido nucleico monohebra se hibridizan o se sintetizan - tal como se ha mencionado ya anteriormente - para formar la doble hebra.

Por tanto, la presente invención se refiere además a ADN de doble hebra que comprende híbridos de las secuencias de ácido nucleico monohebra citadas anteriormente, en las que una secuencia de ácido nucleico (oligómero 5'-3' u oligómero 3'-5') contiene inosina en una o varias posiciones seleccionadas y la otra secuencia de ácido nucleico (oligómero 3'-5' u oligómero 5'-3') contiene, en las posiciones complementarias correspondientes durante la hibridación posterior dos, tres o cuatro de los nucleótidos posibles (adenina A; timina T; guanina G; citosina C). De esta forma, se producen secuencias en las que los cuatro bases se encuentran distribuido al azar en las posiciones correspondientes de la secuencia de ácido nucleico monohebra (ADN), con lo cual se producen las combinaciones deseadas de A, T, G o C para los codones de aminoácido correspondientes, deseados (un codon está formado por una secuencia de tres nucleótidos). Debido a la variación de las posiciones de nucleótidos, se producen combinaciones de secuencias de distribución aleatoria. Por tanto, por ejemplo para la combinación de (A, C) (ACT) (ACGT), se produce un total de 2x3x4=24 secuencias de ADN posibles, que codifican para aminoácidos diferentes. El número de posiciones variables determina también al mismo tiempo el número y la posición de las inosinas introducidas en la secuencia de ADN complementaria. El cálculo de la heterogeneidad de un constructo de este tipo se ha representado en la Fig. 5.

Puesto que el ADN de doble hebra es formado por hibridación de ADN monohebra, que cada una contiene inosina, con oligómeros, que contiene en cada de las posiciones correspondientes por distribución aleatoria A, T, G o C, se obtiene una mezcla de una secuencia gp120 de doble hebra o de una parte (fragmento) de la misma, cuyas secuencias de ácido nucleico están derivadas cada una de la secuencia env (SEC ID NO: 1 ó 12) y se distinguen una de otra con respecto a la zona que codifica para el bucle V2 y/o con respecto a la zona que codifica para el bucle V3. Esto quiere decir que las secuencias de ácido nucleico contenidas en la mezcla se distinguen una de otra de tal manera que codifican para una mezcla de proteínas que presentan, en el bucle V2 y/o en el bucle V3, respectivamente secuencias de aminoácidos que son diferentes una de otra.

En el marco de la invención, este método permite obtener por lo menos 10^{2}, preferentemente por lo menos 10^{3} y, según una forma de realización particularmente preferida de la invención, por lo menos 10^{4} variantes de secuencias a nivel del ácido nucleico (nivel de ADN). Dicha mezcla de ADN, que contiene \geq 10^{2} moléculas de ADN que se distinguen una de otra con respecto a su secuencia de ácido nucleico, presentando la mezcla, debido a la variación de las posiciones de nucleótidos, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria, se denominará de aquí en adelante "pool" de ADN, y, con respecto a las variantes de la secuencia gp120, se denominará de aquí en adelante "pool" con constructo de gp120 variable ("pool" gp120).

Por variantes de secuencias de una secuencia de ADN, se entienden dentro de la presente invención las moléculas que presentan una secuencia de ácido nucleico derivada, en comparación con una molécula de ADN viral nativa o con una parte (fragmento) de la misma, cuyas variantes se diferencian una de otra en que por lo menos un nucleótido puede estar reemplazado en puntos cualesquiera de la secuencia. Preferentemente, las variantes de secuencias comprenden varios intercambios de nucleótidos en puntos diferentes de la secuencia, dependiendo el número y la posición de los ácidos nucleicos reemplazados sustancialmente de la longitud de la secuencia de ácido nucleico.

Durante la expresión de las variantes del gen env a partir de la mezcla de ADN plasmídico preparada es de esperar que, debido a la distribución aleatoria, se expresan todas las secuencias de ADN posibles. Por tanto, se formarán también todas las variantes de secuencias de la molécula gp120 o de una parte de la misma posibles a base de la mezcla de ADN utilizada. La heterogeneidad de la mezcla de gp120 se calcula por un lado a base de heterogeneidad de la secuencia de ADN y de la degeneración del código genético para los aminoácidos (ver también la Fig. 5).

La detección de la heterogeneidad de la mezcla de ADN plasmídico se lleva a cabo por la secuenciación de ADN de clonos individuales. A tal fin, la mezcla de ADN plasmídico se transforma en E. coli, se seleccionan clonos individuales al azar y se determina su secuencia del V2-Loop y del V3-Loop. Es deseable que en total se secuencien aproximadamente 100-200 clonos diferentes. De la distribución estadística de las secuencias de ADN puede calcularse la distribución de la mezcla entera. Este método equivale sustancialmente al método de toma de muestras, tal como se realiza de forma estándar para el control de calidad de una amplia gama de productos.

El análisis molecular directo de la heterogeneidad de la mezcla de proteína GP120 es un poco más difícil, puesto que las moléculas GP120 indviduales no pueden separarse de la mezcla y detectarse. Esto es propio de su naturaleza, puesto que las variantes GP120 individuales se distinguen una de otra sólo en pocos aminoácidos. Una separación por electroforesis con gel o un análisis por espectroscopia de masa puede determinar si se trata de una mezcla o de una forma única de la molécula de GP120. Si la mezcla de GP120 se utiliza por ejemplo como una vacuna en un animal, la respuesta inmune inducida en el animal es dependiente directamente del número y de la composición de la mezcla de GP120. La respuesta inmune del animal, o sea los anticuerpos neutralizantes, puede examinarse entonces en un ensayo de neutralización de virus. Para el control de una respuesta inmune correspondiente que se extiende a las variantes, pueden utilizarse, en un ensayo de neutralización, varios aislados de pacientes de VIH-1, que se distinguen en su capacidad de utilizar co-receptores diferentes para la infección de las células de destino. En este caso, el potencial de neutralización de la mezcla de GP120 sirve de norma de calidad.

Por tanto, la invención se refiere además a una mezcla de proteínas que comprende proteínas GP120, las cuales presentan, en el bucle V2 y/o en el bucle V3, secuencias de aminoácidos que se distinguen entre sí, cuya mezcla contiene por lo menos 10^{2} (preferentemente por lo menos 10^{3} y, según una forma de realización particularmente preferida de la invención, por lo menos 10^{4}) variantes de secuencias y es susceptible de ser obtenida por expresión de una mezcla de ADN plasmídico que, debido a la variación de posiciones de nucleótidos, comprende combinaciones de secuencias de distribución aleatoria.

Como se ha mencionado, la mezcla de ADN de doble hebra, que puede obtenerse por hibridación de ADN monohebra que contiene inosina con ADN monohebra que contiene A, T, G y/o C de distribución aleatoria, es decir, el "pool" con un constructo GP120 variable se transforma y fermenta en células huéspedes procarióticas o eucarióticas, preferentemente en E. coli.

Por tanto, la invención se refiere a plásmidos que contienen ADN de doble hebra insertado, cada uno de los cuales comprende híbridos de la secuencia de ácido nucleico monohebra que contiene inosina (ver arriba) con la secuencia de ácido nucleico monohebra (ver arriba) que contiene una mezcla de todas las cuatro variantes de nucleótidos (A, T, G, C). Además, la invención se refiere a una mezcla de vectores que [comprende] una mezcla de dichos plásmidos, cuyas secuencias de ácido nucleico se distinguen entre sí en la zona que codifica para el bucle V3 y/o en la zona que codifica para el bucle V2, cuya mezcla de vectores contiene por lo menos 10^{2} (preferentemente por lo menos 10^{3} y, según una forma de realización particularmente preferida de la invención, por lo menos 10^{4}) de los plásmidos citados y comprende, debido a la variación de posiciones de nucleótidos, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria. Según las células huéspedes que se deseen utilizar para la expresión de los vectores (plásmidos), son aptos varios sistemas de expresión y vectores de base conocidos por los expertos en la materia (ver Methods in Enzymology, Vol. 185, Gene Expression Technology, 1991, Editor D.V. Goeddel, Academic Press, Inc.). Así, el plásmido pUC 18/19 se prefiere para la expresión en E. coli como plásmido de base en la que se clonan las variantes de las secuencias de ácido nucleico. Por ello, dentro de la presente invención, las mezclas de vectores puede expresarse o bien en células huéspedes bacterianas, tales como E. coli, o bien en células huéspedes eucarióticas, preferentemente del grupo constituido por células Cos, CHO o Baby Hamster Kidney (BHK) o en otras células huéspedes.

Por tanto, la invención se refiere además a células huéspedes de E. coli o células huéspedes eucarióticas transfectadas con una mezcla de vectores según la invención.

Puesto que se transfectan las células huéspedes con el "pool" de ADN (la mezcla de vectores), es de esperar que se produce un número igual de grande o por lo menos aproximadamente igual de grande de células huéspedes transformadas de manera diferente que el número de variantes de secuencias contenido en el "pool" de ADN. Durante la preparación de la vacuna hay que centrar la atención especialmente en los rendimientos de las etapas de clonación individuales. Los rendimientos de la preparación de los fragmentos de ADN de doble hebra, de la ligación de los fragmentos de ADN del V3-Loop y del V2-Loop en el gen env y la transformación o la preparación de bacterias y clonos de células debe realizarse de tal manera que no limita la heterogeneidad deseada de la mezcla. Esto se ilustrará haciendo referencia a un ejemplo. Si se desea por ejemplo tomar, de un conjunto de bolas que se distinguen en dos colores, un número de bolas en las que, sin embargo, ambos colores deben ocurrir con una probabilidad de un 99,9%, habría que tomar unos 13 bolas (G. Schreiber, Ein kombinatorisches Problem aus der Genetik (Un problema combinatorio de la genética), Bioengineering 1988, 2:32-35). Si esto se aplica a las etapas de clonación de la vacuna de VIH, significa que si se quiere producir una heterogeneidad de aproximadamente 6000 variantes de virus, habría que producirse en cada etapa de clonación 13 veces más de clonos. Por consiguiente, hay que preparar un banco de genes de aproximadamente 80.000 clonos para el V3-Loop. Partiendo de dicho banco de genes, se prepararán entonces los vectores de expresión para la transfección de las células CHO. Por consiguiente, en la transfección de las células CHO deben conseguirse aproximadamente 80.000 eventos de transfección. Una mezcla de este tipo de células CHO transfectadas producirá entonces la cantidad deseada de 6000 variantes gp120 diferentes.

La invención se refiere asimismo a un procedimiento para la preparación de una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína viral (cajetín de expresión), en el que se modifica la secuencia de tal manera o preferentemente se introducen tantas mutaciones silenciosas que a continuación contiene por lo menos dos sitios de escisión de restricción preferentemente exclusivamente monovalentes. De forma particularmente preferida, la secuencia contiene sitios de escisión de restricción sólo monovalentes. Preferentemente, la proteína codificada por la secuencia de ácido nucleico es GP120, variándose la secuencia de tipo silvestre de env por medio de mutaciones silenciosas.

Además, la presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de la mezcla de vectores según la invención, que contiene preferentemente una mezcla de plásmidos cuyas secuencias de ácido nucleico se distinguen entre sí en la zona que codifica para el bucle V2 y/o en la zona que codifica para el bucle V3 por distribución aleatoria de las bases en cada de las posiciones de nucleótido variadas, uniéndose los plásmidos según la invención a un vector (de base) que puede expresarse en células huéspedes (preferentemente células E. coli, Cos, CHO o BHK). El vector (de base) es preferentemente el vector pUC 18, pUC 19 o BSCenvATG.

Además, en la presente invención se proporciona un procedimiento para la preparación/producción de células huéspedes, preferentemente seleccionadas del grupo constituido por células E. coli, Cos, BHK o CHO, en el que se transforman las células huéspedes con una mezcla de vectores según la invención que contiene una mezcla de plásmidos cuyas secuencias de ácido nucleico se distinguen entre sí en la zona que codifica para el bucle V2 y/o en la zona que codifica para el bucle V3 por distribución aleatoria de las bases en cada de las posiciones de nucleótido variadas.

Finalmente, según la invención, se proporciona por primera vez un procedimiento para la preparación de una vacuna de ADN, en el que se realiza el procedimiento según la invención para la preparación de la mezcla de vectores, en el que los plásmidos según la invención expresan la mezcla de las proteínas gp120, tras su aplicación en células huéspedes (por ejemplo monocitos humanos y animales). Para su administración, la vacuna de ADN puede formularse, si se desea, con sustancias auxiliares y/o vehículos farmacéuticamente aceptables y, tras su administración, permitir en el organismo la producción de las variantes de secuencias de proteínas virales.

Por tanto, la invención se refiere asimismo a una composición farmacéutica o una vacuna de ADN que codifica para una mezcla de proteínas virales de estructuras diferentes, cuya vacuna contiene una mezcla de variantes de secuencias de una molécula de ADN viral o de una parte de la misma, es decir, de moléculas de ADN cuyas secuencias de ácido nucleico se distinguen entre sí en la zona que codifica para la proteína, una parte o un fragmento de la misma. La mezcla contiene \geq 10^{2} moléculas de ADN que se distinguen con respecto a su secuencia de ácido nucleico, presentando la mezcla, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria. Por el término "proteínas virales de estructuras diferentes" se entienden, según la invención, las proteínas cuyas secuencias de aminoácidos se han derivado de la secuencia del tipo silvestre de la proteína viral correspondiente, aunque sus secuencias de aminoácidos desvían en cuanto que se distinguen entre sí y en comparación con el tipo silvestre por uno o varios aminoácidos reemplazados en posiciones iguales o diferentes de la secuencia. Tal como ya se ha expuesto, las secuencias de ácido nucleico de la vacuna codifican, según la invención, preferentemente para una mezcla de proteínas GP120 de estructuras diferentes de VIH (variantes de secuencias de GP120), prefiriéndose en particular una vacuna que contiene una mezcla de moléculas de ADN cuyas secuencias de ácido nucleico se distinguen entre sí en la zona que codifica para el bucle V2 y/o en una zona que codifica para el bucle V3 de gp120 de VIH-1. En esta conexión, se hace referencia también a la Fig. 3, en la que se han representado diferencias y variaciones estructurales conocidas en el V3-Loop de GP120.

La vacuna de ADN según la invención es de importancia particular dentro una terapia génica.

Finalmente, según la invención, se proporciona por primera vez un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica o de una vacuna de proteína, en el que las células huéspedes según la invención, es decir, células huéspedes que se han transformado con una mezcla de vectores según la invención, cuyos vectores contienen cada uno plásmidos cuyas secuencias de ácido nucleico se distinguen entre sí en la zona que codifica para el bucle V2 y/o en la zona que codifica para el bucle V3 por distribución aleatoria de las bases en cada de las posiciones de nucleótido variadas, se cultivan en condiciones que permiten la expresión de la mezcla de variantes de secuencias de proteína virales. Preferentemente, las células huéspedes son células huéspedes bacterianas, tales como E. coli, o células huéspedes eucarióticas, preferentemente del grupo constituido por células Cos, Chinese Hamster Ovary (CHO) o Baby Hamster Kidney (células BHK).

Por tanto, la presente invención permite proporcionar una vacuna constituida por proteínas GP120 variables que en el tratamiento profiláctico y/o terapéutico de una infección de VIH o SIDA

1. activa el sistema inmune,

2. induce la formación de anticuerpos que neutralizan VIH-1

3. impide la pérdida de anticuerpos neutralizantes y

4. consigue que la sustancia activa se encarga del control sobre la estimulación de la respuesta inmune específica de GP120.

Esto se realiza preferentemente de tal manera que ya antes de la pérdida de los anticuerpos que neutralizan VIH relacionada con la aparición de SIDA está disponible un número suficiente de antígenos, que, debido a su variedad de secuencias de aminoácido diferentes (es decir de sus variaciones de secuencias) son capaces de inducir la formación del los anticuerpos de VIH que normalmente, es decir, sin una profilaxis adecuada según la presente invención, se pierden o disminuyen en su concentración a medida que avanza la enfermedad. Además de un tratamiento preventivo, la presente invención se refiere también al tratamiento terapéutico, utilizando la mezcla GP120 (vacuna de proteína) para contrarrestar una disminución o una pérdida de anticuerpos neutralizantes de VIH activando el sistema inmune y induciendo la formación de anticuerpos neutralizantes de VIH nuevos o adicionales.

Por tanto, según la invención, se utiliza la mezcla de proteínas virales de estructuras diferentes, que está constituida por las variantes de secuencias citadas anteriormente de una proteína viral (preferentemente de GP120) o de una parte de la misma, para la preparación de una vacuna para la prevención y/o terapia de una infección por virus en el ser humano. Además, la presente invención se refiere al uso de una mezcla de moléculas de ADN, que codifican para
\geq 10^{2} variantes de secuencias de una proteína viral o de una parte de la misma, presentando dicha mezcla, debido a la variación de las posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria, para la preparación de una vacuna para la prevención y/o terapia de una infección por virus en el ser humano. Según una forma de realización preferida, la invención se refiere al uso para la preparación de una vacuna para la prevención y/o terapia de una infección por VIH en el ser humano.

En el marco de la invención, la infección por virus puede ser cualquier infección en la cual se forman en el transcurso de la enfermedad variantes de virus que se replican, en la que, según la invención, las secuencias de proteína seleccionadas o las secuencias de ácido nucleico que codifican para proteínas son aquellas secciones de la secuencia de aminoácidos o aquellas secciones de ácido nucleico que codifican para las mismas en las cuales se observan, en el transcurso de enfermedades virales, siempre o frecuentemente variantes, es decir, variaciones de secuencias. Preferentemente, las presentes variantes son variantes de secuencias de la molécula GP120 (a nivel de la proteína) o de la zona que codifica para GP120 (a nivel de ADN) o partes de la misma, en particular variantes de secuencias en el V3-Loop o en el V2-Loop, preferentemente tanto en el V3-Loop como en el V2-Loop.

Por consiguiente, según la invención, se proporcionan composiciones farmacéuticas o vacunas que, durante el tratamiento inmunorreconstitutivo de personas infectadas por virus, activan el sistema inmune de tal manera que se regenera y se estimula de nuevo la defensa inmune adquirida naturalmente contra el virus como para impedir la multiplicación de las variantes de virus que se replican en el paciente. Según una forma de realización preferida de la invención, se proporcionan por primera vez vacunas para el tratamiento inmunorreconstitutivo de personas infectadas por VIH-1.

En la presente invención, las vacunas pueden formularse o administrarse o bien como tales, es decir, como mezclas de ADN y/o proteínas sin otros aditivos, o bien junto con otras sustancias activas, tales como por ejemplo estimulantes inmunes como interleucina-2, quimioquinos del tipo CC y CXC, y/o sustancias adicionales y vehículos farmacéuticamente aceptables. Por lo general, las vacunas según la invención se formulan para su administración intravenosa, tal como por ejemplo intravenosa, intramuscular, subcutánea. Además, las vacunas pueden haberse formulado para su administración oral, mucosal (intravaginal, intrarrectal) y transdermal.

La invención presenta las ventajas siguientes:

La manipulación selectiva por ingeniería genética de la secuencia de ácido nucleico por medio de un cajetín de genes permite preparar cualquier variante de un agente patogénico o de un gen del agente patogénico. Las variaciones se refieren preferentemente a las zonas contra las cuales se forman anticuerpos neutralizantes o células T citotóxicas. Esto permite preparar una vacuna en forma de una mezcla de variantes del agente patogénico o de variantes de los antígenos correspondientes de un agente patogénico. Las ventajas de este concepto respecto a VIH como agente patogénico radican en la preparación de un mezcla de VIH-GP120, la proteína de membrana exterior de VIH, contra la que se dirige la respuesta inmune neutralizante de virus del ser humano. Puesto que especialmente en caso de una enfermedad de VIH cada paciente está expuesto a un gran número de variantes de VIH, que se distinguen todas con respecto a la secuencia de la proteína GP120, es particularmente ventajoso utilizar, como vacuna, un gran número de variantes de GP120, pudiendo dicha mezcla de GP120 utilizarse no sólo para la inmunización de personas normales sanas, sino también para la terapia de personas ya infectadas con VIH. La inmunización con la mezcla de GP120 induce una respuesta inmune tan amplia como sea posible contra el mayor número posible de variantes de virus en el ser humano, que en el caso ideal protege contra todas las variantes de VIH. La terapia con la mezcla de GP120 permite combatir la pérdida de anticuerpos neutralizantes y la pérdida de la respuesta inmune celular específica de VIH.

Además, según la invención, es posible por primera vez preparar clonos de gp120, que corresponden respecto a su tipo y variedad de las variaciones de secuencias observadas a aislados de plasma de personas infectadas con VIH o enfermas con SIDA (ver M. Schreiber et al., J. Virol. 68 No. 6 (1994) 3908-3916). En este contexto, no se utiliza para la inmunización, a diferencia de los diferentes planteamientos seguidos hasta ahora, una molécula aislada de GP120 o un fragmento antigénico de la misma, sino una mezcla de proteínas constituida por un gran número de variantes de secuencias caracterizadas por una secuencia completa de GP120 y que además presentan la estructura terciaria correcta que corresponde al pliegue natural de la molécula GP120. La conformación de las variantes de virus proporcionadas en la vacuna es importante porque de esta manera se proporcionan variantes de secuencias y de estructura que coinciden con las variantes de GP120 detectables en el transcurso de la enfermedad de virus en la mayor medida posible con respecto a las variaciones de secuencias observadas así como con respecto a la conformación necesaria para la unión a CD4 y al co-receptor, consiguiéndose de esta manera una estimulación inmune eficaz.

La invención proporciona una mezcla de proteínas GP120 que constituye la vacuna de proteína. Al mismo tiempo, la invención proporciona una mezcla de los genes que codifican para dicha mezcla de proteínas. Dichos genes pueden transoformarse en un vector apto para su aplicación directa en el ser humano (vacuna de ADN) (Ulmer et al., 1995 Ann NY Acad Sci 772:117-125; Donnelly et al., 1995 Ann NY Acad Sci 1995 772:40 46). Una vacuna de ADN presenta la ventaja de que la heterogeneidad de la mezcla de vectores de ADN puede ser más alta que la mezcla de las proteínas GP120 recombinantes. Es más fácil preparar una alta heterogeneidad de una mezcla de vectores de ADN. Una vacuna de ADN de este tipo cubriría una gama mucho más amplia de variantes de VIH. Considerado desde el punto de vista técnico, la preparación de la mezcla de ADN es más fácil. El prerequisito de la vacuna de ADN es un vector de expresión de gp120 que lleva los dos puntos de corte BstEII y BamHI. Esto permite la traducción de los variables V3-Loop y V2-Loop de los fragmentos de gen env en un vector de este tipo.

Con relación a las proteínas GP120, hay que tener en cuenta de que en la zona del V3-Loop se encuentran 5 lugares potenciales para la N-glicosilación. Los radicales azúcar protegen el V3-Loop contra ser reconocido por anticuerpos neutralizantes. Las variantes de virus que presentan un V3-Loop glicosilado son más difíciles de neutralizar que las variantes de virus en las que la glicosilación es incompleta. Puesto que las variantes de virus con una glicosilación completa del V3-Loop pueden escapar de la respuesta inmune neutralizante, tienen importancia para la transmisión y el establecimiento de la infección. Durante el curso de la enfermedad, cuando una parte de la respuesta inmune neutralizante ha quedado perdida, se imponen las variantes de virus cuyo V3-Loop no está completamente glicosilado. Puesto que el V3-Loop ya no está cubierto por radicales azúcar, dichas variantes de virus se replican más rápidamente que los mutantes del V3-Loop completamente glicosilados. Por tanto, según la invención, es ventajoso tener en cuenta la glicosilación diferente del V3-Loop del GP120 a la hora de construir la vacuna de GP120.

En la presente invención, el principio ilustrado con relación a VIH puede aplicarse a otros virus que, en el curso de la enfermedad viral, pueden formar igualmente variantes. En particular, es posible proporcionar vacunas contra un gran número de virus que inducen una respuesta inmune amplia contra un gran número de variantes de virus en el ser humano, la cual protege en el caso ideal contra todas las variantes. La terapia con vacunas de este tipo permite combatir eficazmente la pérdida de anticuerpos neutralizantes y la pérdida de la respuesta inmune celular, específica de VIH. En este contexto, además es posible o incluso recomendable, en el caso de tipos de agentes patogénicos (virus) que forman variantes de secuencias de varias proteínas durante el curso de una enfermedad, proporcionar varios cajetines de genes según la invención, que contienen la secuencia de ácido nucleico que codifica para las variantes de cada una de dichas proteínas o fragmentos de las mismas, con el fin de contrarrestar la pérdida de anticuerpos neutralizantes contra todo tipo posible de variantes de virus.

En la presente invención, las ventajas de una vacuna de proteína y de una vacuna de ADN pueden combinarse de forma ventajosa, con el fin de aumentar la eficacia de un tratamiento preventivo y/o terapéutico de una enfermedad viral. Por tanto, se proporciona además una composición farmacéutica para la prevención y/o terapia de una infección por virus que comprende una mezcla de proteínas y una mezcla de ácidos nucleicos, en la que la mezcla de proteínas comprende \geq 10^{2} variantes de secuencias de una proteína viral o de una parte de la misma y que es susceptible de ser obtenida por expresión de una mezla de ADN plasmídico que, debido a la variación de las posiciones de nucleótido, presenta combinaciones de secuencias de distribución aleatoria, en la que la mezcla de ácidos nucleicos comprende
\geq 10^{2} moléculas de ADN que codifican para las variantes de secuencias de una proteína viral o de una parte de la misma y en la que la mezcla de ácidos nucleicos, debido a la variación de las posiciones de nucleótido, presenta combinaciones de secuencias de distribución aleatoria. La composición farmacéutica es, en particular, un preparado de combinación que comprende no sólo una mezcla de proteínas que contiene las variantes de secuencias citadas anteriormente de la proteína GP120, sino también una mezcla de ácidos nucleicos derivada de la secuencia env en SQ ID NO: 1 o SEC ID NO: 11 o de un fragmento de la misma.

A continuación, se ilustrará la invención haciendo referencia a ejemplos, figuras y un protocolo de secuencias.

Ejemplos

1. Descripción general del procedimiento de preparación

1.1 Clonación de oligonucleótidos que codifican para el V3-Loop

1.2 Clonación de las variantes V3-env

1.3 Análisis de la variabilidad

2. Materiales y métodos

2.1 Abreviaturas

2.1.1 Abreviaturas generales

2.1.2 Ácidos nucleicos

2.2 Cepas de bacterias

2.3 Plásmidos

2.4 Enzimas

2.5 Productos químicos

2.6 Oligonucleótidos

2.7 Estándares de peso molecular

2.8 Kits de reactivos utilizados

2.9 Medios

2.10 Esterilización de soluciones

2.11 Cultivo y almacenamiento de bacterias

2.12 Preparación de células competentes

2.13 Transformación en E. coli

2.14 Preparación de ADN plasmídico

2.15 Separación de ADN en geles de agarosa

2.16 Purificación de ADN a partir de los geles de agarosa

2.17 Separación de ADN en geles de poliacrilamida

2.18 Corte de ADN

2.19 Ligación de ADN

2.20 Secuenciación de ADN

2.21 Preparación de ADN de doble hebra con ayuda de oligonucleótidos

2.22 Transfección de células COS y células CHO

2.23 Purificación de la mezcla de GP120 por cromatografía

2.24 Preparación de la vacuna de ADN

1. Descripción general del procedimiento de preparación 1.1 Clonación de una mezcla de variantes gp120 del V3-Loop

Los oligonucleótidos se sintetizan tal como se ha descrito en 2.6. A título de ejemplo se ha indicado, como secuencia del V3-Loop, una secuencia mutada del aislado de paciente de VIH-1 F1-01 (M. Schreiber et al., J. Virol. 68 No. 6 (1994) 3908-3916). Cualquier otra secuencia o mezcla de secuencias también es posible. Para poder clonar muchas variantes diferentes de una secuencia del V3-Loop, en posiciones determinadas de la secuencia se utilizan mezclas en lugar de los elementos constituyentes de nucleótido puros. Esto da una mezcla de oligonucleótidos cuyas secuencias son todas diferentes y por tanto codifican para V3-Loops diferentes. Mezclas de oligonucleótidos de este tipos se denominan también oligonucleótidos con secuencias degeneradas. A partir de oligonucleótidos con secuencias degeneradas sintetizados por vía química, se prepara la zona que codifica para los V3-Loops diferentes.

Un oligonucleótido en orientación de retícula de lectura (forward) se sintetiza para la sección de la secuencia env desde el punto de corte Bg1II hasta la primera posición degenerada. Un segundo oligonucleótido en orientación complementaria (reverse) se sintetiza, según la secuencia, a partir de una posición que se encuentra 15 bases antes del inicio de la zona variable (método 2.6). La hibridación de los dos oligonucleótidos se lleva a cabo haciendo solapar la región 3' sobre una longitud de un total de 15 bases. En una reacción subsiguiente con polimerasa de ADN (por ejemplo polimerasa de ADN Taq o fragmento Klenow), los dos oligonucleótidos hibridizados se convierten en una molécula de ADN completamente de doble hebra (método 2.21).

La mezcla de ADN así obtenida se digiere con las endonucleasas de restricción Bg1II y XbaI. La clonación de la mezcla de ADN se lleva a cabo en el vector de expresión \DeltaV3-pBSCenvV3 cortado con Bg1II y XbaI (métodos 2.15 y 2.16).

Este vector contiene la secuencia codificadora del gp160 de la cepa de VIH-1 NL4-3 (IIIB). El gen NL4-3 env se manipuló de tal manera que contiene cada uno de los puntos de corte de restricción Bg1II y XbaI así como ApaLI, PstI y Bc1I sólo una vez. La zona que codifica para el V3-Loop, que está situada entre los puntos de corte Bg1II y XbaI, se eliminó y se reemplazó con una secuencia de 15 pares de bases, introduciéndose un punto de corte analítico para la enzima AscI. En dicho vector se clona la mezcla de ADN del V3-Loop cortada con Bg1II y XbaI (método 2.19). La pérdida del punto de corte AscI en el vector pBSCenvV3 del V3-Loop acabado puede utilizarse para la selección de los clonos que codifican para el V3-Loop (método 2.18).

La mezcla de plásmidos así formada se transforma en bacterias DH5\alpha (método 2.12), debiendo conseguirse una tasa de transformación de > 10^{5}. Esto da una librería de genes de fragmentos del V3-Loop con un tamaño de aproximadamente 10^{5} clonos. Es deseable que la mezcla se analice por secuenciación de ADN (ver 1.3). Este método da una mezcla de clonos que codifican todos para variantes diferentes del V3-Loop de la proteína GP120. Dicha mezcla de vectores sirve de producto de partida para la preparación de la mezcla de proteínas a utilizar como vacuna y como producto de partida a utilizar como vacuna de ADN.

Para la preparación de la mezcla de proteínas GP120, se transfectan los vectores de expresión pBSCenvV3 en células COS y células CHO (método 2.22). La purificación de las proteínas GP120 diferentes, o sea de la mezcla de sustancias activas, se realiza según el método 2.23, tal como se ha descrito en la literatura.

1.2 Clonación de una mezcla de variantes del V2-Loop de gp120

Las variantes del V1-Loop y del V2-Loop se preparan de la misma manera. A tal fin, el vector de expresión
\DeltaV3-pBSCenvV3 posee tres puntos de corte de restricción adicionales. La variación del V1-Loop se lleva a cabo por clonación en los puntos de corte ApaLI y PstI. La variación del V2-Loop se lleva a cabo por clonación en los puntos de corte PstI y Bc1I.

1.3 Análisis de la variabilidad

El análisis de las mezclas del V3-Loop se efectúa por secuenciación de ADN (método 2.20). Está planeada una selección estadística de aproximadamente 100-200 clonos cuyas secuencias del V1-, V2- y V3-Loop deben determinarse. Si todos estos clonos son diferentes, puede determinarse la heterogeneidad de la librería de genes y con esto también la heterogeneidad de la mezcla de proteínas por medio de un cálculo estadístico.

2. Materiales y métodos 2.1 Abreviaturas 2.1.1 Abreviaturas generales

\mug	microgramos

\mul	microlitros
\mumol	micromoles
APS	persulfato de amonio
bp	pares de bases
dNTP	trifosfato de desoxinucleosido
ADN	ácido desoxirribonucleico
DTT	ditiotreitol
EDTA	ácido etilendiaminotetraacético
g	gramos
GP	glicoproteína
h	hora
VIH	virus inmunodeficiente humano
IPTG	\beta-D-tiogalactopiranosido de isopropilo
MOPS	ácido 3-morfolinopropanosulfónico
OD	densidad óptica
PAGE	electroforesis en gel de poliacrilamida
PCR	reacción en cadena de polimerasa
RT	temperatura ambiente
TEMED	N,N,N',N'-tetrametiletilendiamina

2.1.2 Ácidos nucleicos

A	adenina
C	citosina
G	guanidina
T	timidina

2.2 Cepas de bacterias

Escherichia coli DH5\alpha:	F-, endA1, hsdr17, (rk-mk+), supE44, recA1, \lambda-, gyrA96, re1A1,
	\Phi80d lac z \DeltaM15

2.3 Plásmidos

pBSCenvATG

construcción propia, su estructura se ha indicado en SEC ID NO: 10.

2.4 Enzimas

Enzimas de restricción	MBI-Fermentas, Gibco-BRL, Biolabs
Polimerasas de ADN	MBI-Fermentas, Gibco-BRL
Ligasa de ADN T4	MBI-Fermentas

2.5 Productos químicos

[\alpha-35S]dATP	Amersham Life Science
Agarosa, ultrapura	GIBCO BRL
Persulfato de amonio	Merck
Ampicilina	US Biochemical
Bacto-agar	Becton Dickinson
Bacto-triptona	Becton Dickinson
Ácido bórico	Merck
Azul de bromofenol	Merck
Cloruro cálcico	Merck
Desoxirribonucleótidos	MBI-Fermentas
Ditiotreitol	Biotechnik, St. Leon-Rot
Ácido acético glacial	Merck
Bromuro de etidio	Sigma
Ácido etilendiaminotetraacético	Merck

Glicerol	Merck
Urea	ICN Biomedicals
Extracto de levadura	Becton Dickinson
Cloruro potásico	Merck
Fosfato de dihidrógeno y de potasio	Merck
Cloruro de magnesio	Merck
Mezcla de acrilamidas	Roth
Acetato sódico	Merck
Cloruro sódico	Merck
Fosfato de disodio y de hidrógeno	Merck
Fosfato de dihidrógeno y de sodio	Merck
2-Propanol	Merck
Sigmacote (polisiloxano clorado)	Sigma
N,N,N',N'-Tetrametiletilendiamina	Merck
Tris(hidroximetil)aminometano	GIBCO BRL

2.6 Oligonucleótidos

Todos los oligonucleótidos citados se prepararon utilizando el Expedite™ Nucleic Acid Synthesis System de la empresa PE Biosystems (Weiterstadt). Para la clonación de genes env que se distinguen solamente en su secuencia del V3-Loop se utilizan oligonucleótidos. Utilizando el ejemplo de la región V3-Loop del aislado de paciente de VIH-1 F1-01, se han representado las secuencias de los oligonucleótidos.

V3-Loop: para la clonación en pNL4-3/Bg1II-NheI, F1-01, forward:

5'-AAG ATG TAG TAA TTA GAT CTG CCA ATT TCA CAG ACA ATG CTA AAA CCA TAA TAG TAC AGC TGA ACA CAT CGT TAG AAA TTA ATT GTA CAA GAC CCA ACA ACA AT ACA-3' (SEC ID NO: 3)

V3-Loop: para la clonación en pNL4-3/Bg1II-NheI, F1-01:

5'-TTT TGC TCT AGA AAT GTT ACA ATG TGC TTG TCT TAT GTC TCC TGT TGC AGC TTC TGT TGC ATG AAA TGC TCT CCC TGG TCC GAT ATG GAT ACT ATG-(GA)(AT)(GATC) TTT TCT TGT ATT GTT GTT GGG-3' (SEC ID NO: 4)

Para la secuenciación de clonos del V3-Loop, se utilizaron los oligonucleotidos 7010, 7011 y los "primers" (cebadores) estándares M13 (M13, M13r).

Primer 7010:	5'-CCA TGT ACA AAT GTC AG-3' (SEC ID NO: 5)
Primer 7011:	5'-AAA ACT GTG CGT TAC AA-3' (SEC ID NO: 6)
Primer M13:	5'-GTA AAA CGA CGG CCA GT-3' (SEC ID NO: 7)
Primer M13r:	5'-CAG GAA ACA GCT ATG AC-3' (SEC ID NO: 8)

2.7 Estándares de peso molecular

1 kb DNA Ladder	MBI-Fermentas
100 bp DNA Ladder	MBI-Fermentas

2.8 Kits de reactivos utilizados

T7 Sequencing Kit	Pharmacia
Qiaquick PCR Purification Kit	Quiagen
Quiagen Plasmid Kit	Quiagen

2.9 Medios Medio YT

10 g de triptona

5 g de extracto de levadura

5 g de NaCl

Medio dYT

16 g de triptona

10 g de extracto de levadura

5 g de NaCl

Placas de agarosa dYT

10 g de triptona

5 g de extracto de levadura

5 g de NaCl

15 g de agar

Las cantidades indicadas se refieren en cada caso a 1000 ml de agua deionizada. Las mezclas de reacción se trataron en autoclave a 121ºC y a 1,5 bar durante 20 min. En caso de contener antibióticos u otros reactivos sensibles al calor, a los medios, tras su enfriamiento, se adicionaron las sustancias correspondientes previamente filtradas con esterilización.

Ampicilina	3,3 ml/l	(60 mg/ml)
IPTG	3 ml/l	(100 mM)
xgal	3 ml/l	(2% en DMF, no filtrar)

2.10 Esterilización de soluciones y equipos

Las soluciones y medios así como las puntas de pipetas, recipientes de Eppendorf y equipos de vidrio se trataron en autoclave a 121ºC y 1,5 bar durante 20-40 min. Las soluciones sensibles al calor, tales como soluciones de antibióticos y de IPTG, se filtraron con esterilización.

2.11 Cultivo y almacenamiento de bacterias

Los cultivos de bacterias se inocularon cada uno con una colonia indiviudal. Para aislar una colonia individual, se colocaron células de un cultivo líquido en una placa de agar. Tras incubación a 37ºC durante una noche, habían crecido colonias individuales. Para el almacenamiento de las bacterias durante poco tiempo, las placas de agar se sellaron con "parafilm" y se almacenaban a 4ºC. Para un almacenamiento permanente de cepas de bacterias, se mezclaron 0,75 ml de un cultivo YT de una noche con 0,25 ml de glicerol estéril, se enfriaron por congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido y se almacenaron a -70ºC.

2.12 Preparación de células competentes

100 ml del medio YT se inocularon con 100 \mul de un cultivo de una noche. Las bacterias se incubaron a 37ºC en un incubador vibratorio hasta alcanzar una OD_{560} de 0,4, y a continuación se centrifugaron a 4ºC y 1000 g durante 8 min. Todos los trabajos siguientes se llevaron a cabo sobre hielo utilizando recipientes previamente enfriados y soluciones frías de 4ºC. Las células se volvieron a suspender en 50 ml de CaCl_{2} 50 mM y se incubaron sobre hielo durante 30 min. Tras su recentrifugación, las bacterias se suspendieron en 2,5 ml de tampón TFBII estéril y las suspensiones resultantes se dividieron en porciones de 100 \mul cada una. Las porciones de 100 \mul de las células competentes podían almacenarse, en caso de no ser necesarias para una transformación inmediata, tras congelación ultrarrápida en nitrógeno líquido, a -70ºC.

Tampón TBFII

MOPS	pH 7,0	10 mM
CaCl_{2}	75 mM
KCl	10 mM
Glicerol		15%

2.13 Transformación de E. coli

(Hanahan, J. Mol. Biol. 166 (1983) 557-580)

Una porción de 10 \mul de células competentes se descongeló en un baño de hielo y se incubó con 1-100 ng de ADN plasmídico a 0ºC durante 30 min. A continuación, la carga de transformación se incubó a 42ºC durante 1 min. Luego se adicionó 1 ml de medio YT, y la mezcla se agitó a 37ºC durante una hora. Para permitir una selección de las células transformadas, se colocaron 100-150 \mul de la carga en placas de YT/agar que contenían antibióticos. Tras incubación durante una noche a 37ºC, habían crecido sólo colonias que llevaban el gen de resistencia que codificaba para el plásmido. En un transformación de células que no contienen \beta-galactosidasa capaz de funcionar (mutación 1acZ\DeltaM15, por ejemplo DH5\alpha), vectores, tales como el pUC utilizado, permiten una selección directa (blue white screening) de bacterias recombinantes a través de una \beta-galactosidasa que codifica para plásmidos. Para la selección azul/blanco, se colocaron las bacterias sobre places de Amp/IPTG/Xgal/YT/agar. El substrato Xgal es desintegrado por la \beta-galactosidasa en un colorante azul. La destrucción de la retícula de lectura del gen 1acZ produce colonias blancas por inserción de un fragmento de ADN ajeno. Al contrario, colonias azules significan que el gen 1acZ ha quedado capaz de funcionar durante la clonación y la ligación y que no se ha insertado ADN.

2.14 Preparación de ADN plasmídico

(Quiagen, Hilden)

Para aislar ADN plasmídico de E. coli, se utilizó el kit QIAprep Spin Miniprep de la empresa Qiagen. La preparación del ADN se realizó según las instrucciones del fabricante (QIAprep Plasmid Handbook 03/95). Se inocularon bacterias de E. coli que contenían plásmidos en un medio de dYT-amp y se agitaron durante una noche a 37ºC. Para el aislamiento del plásmido, se utilizaron 3 ml del cultivo de una noche de E. coli. Las bacterias se cosecharon (1 min, 14.000 r.p.m., centrífuga de Heraeus) y se suspendieron en 250 \mul de tampón P1. Las bacterias se desintegraron por lisis alcalina (250 \mul, NaOH/SDS 0,2 N al 1%). La mezcla se neutralizó por adición de acetato potásico 3 M (350 \mul, pH 5,5). La purificación del ADN plasmídico se basa en la unión selectiva de ADN plasmídico a columnas de intercambiador de aniones de DEAE. A las concentraciones de sal seleccionadas y en las condiciones de pH, el ADN plasmídico se une a la matriz de DEAE. La matriz de DEAE se lavó (750 \mul, tampón PE, Quiagen). A continuación, el ADN plasmídico se eluyó con 50 \mul de H_{2}O y se almacenó a -20ºC.

Para obtener una mayor cantidad (aproximadamente 100 \mug) del ADN plasmídico, se utilizaron 25 \mul del cultivo de una noche. Para la purificación del ADN, se utilizó el kit QUIAGEN Plasmid Midi. Este tipo de purificación se basa en el principio descrito en "QIAprep Spin Miniprep Kit" y se realizó según las instrucciones del fabricante (QIAGEN Plasmid Purification Handbook 01/97).

2.15 Separación de ADN en geles de agarosa

La separación de ADN se realizó por medio de electroforesis en geles de agarosa. En función del tamaño de los fragmentos examinados, se disolvió por ebullición un 0,8 a un 2% de agarosa en tampón TBE (para geles de agarosa analíticos) o tampón TAE (para geles de agarosa preparativos). Tras enfriar el líquido de gel a aproximadamente 60ºC, el gel se trató con 1 \mul de bromuro de etidio (10 mg/ml), y la mezcla resultante se vertió en un lecho de gel preparado con una peinilla insertada. El gel completamente enfriado se cubrió con una capa de tampón TBE o TAE en una cámara de electroforesis, y se quitó la peinilla. Las muestras de ADN se mezclaron con 1/5 volumen del tampón aplicado y se adicionó con pipeta en las fosas de muestra. Los fragmentos se separaron a 5-10 voltios/cm de longitud de gel durante 0,5-2 h. Para la detección, el gel se fotografió tras la electroforesis por luz UV transmitida. Los pesos moleculares de las bandas de ADN se determinaron comparándolos con marcadores de peso molecular de ADN que se movieron por el gel sincronamente.

Tampón TBE

Tris		100 mM
Ácido bórico	100 mM
EDTA		3 mM

Tampón TAE

Tris		40 mM
EDTA		2 mM
Ácido acético glacial		0,114%

Tampón aplicado

azul de bromofenol	0,25%
xilenocianol	0,25%
glicerol		30%
EDTA		50 mM

2.16 Purificación de ADN a partir de geles de agarosa

Para la extracción del DNA a partir de geles de agarosa, se utilizó el "QIAquick Gel Extraction Kit" (Qiagen, Hilden). Las condiciones de tampón se seleccionaron de tal manera que los ácidos nucleicos se unen a la membrana de sílice de las columnas, mientras que los componentes de bacterias de bajo peso molecular pasan por la membrana (método 2.15). Se procedió según el "QIAquick Gel Extraction Kit Protocol" del QIAquick Spin Handbook 07/97. El ADN purificado se eluyó de la membrana de sílice en cada caso con 50 \mul de H_{2}O.

2.17 Separación de ADN en geles de poliacrilamida

La separación de fragmentos de ADN marcados radiactivamente para la secuenciación de ADN se realizó utilizando geles de poliacrilamida desnaturalizantes. Dos placas de vidrio limpiadas se lavaron con etanol para eliminar residuos de grasa y se recubrieron con 1 ml de Sigmacote por placa, con el fin de obtener una superficie hidrófoba. El recubrimiento tiene por objetivo el de evitar más tarde que el gel se rompa al despegarlo de la placa de vidrio. Entre las dos placas se colocaron distanciadores ("spacers"), que servían al mismo tiempo para el estancamiento lateral. El aparato entero se fijó con varias pinzas. Para la preparación del gel de secuencia, se disolvieron 21 g de urea en aproximadamente 20 ml de agua. Tras la adición de 7,5 ml de la mezcla de acrilamidas y 5 ml de tampón TBE 10x (ver 2.15), la preparación se completó a 50 ml con agua. La polimerización del gel se inició por adición de 300 \mul de APS y 100 \mul de TEMED. Inmediatamente después, se vertió la solución de gel en el aparato de gel preparado, y se formó el fondo de la fosa insertando el reverso plano de la peinilla de diente de sierra. Hasta completarse la polimerización, el gel se almacenó en posición horizontal a temperatura ambiente. Tras insertar el gel en la cámara de gel, esta última se llenó con tampón TBE. Las fosas de aplicación se formaron invirtiendo la peinilla. Para calentar el gel a la temperatura de trabajo óptima, se realizó un precalentamiento de 20 min. Las fosas se lavaron cuidadosamente con tampón TBE y luego se llenaron con 4-5 \mul de las muestras. La electroforesis se llevó a cabo a 2 kV (150 vatios) durante aproximadamente 2-3 h. Tras finalizar la electroforesis, el gel se reitró de la cámara de gel, y una de las placas de vidrio se quitó cuidadosamente levantándola. El gel se trasladó a papel de Schleicher & Schuell (Whatman, Inglaterra) posicionándolo y apretándolo ligeramente. Tras secarlo a 80ºC al vacío, el gel se expuso a una película de rayos X (Kodak BioMax MR-1, Sigma Deisenhofen) a temperatura ambiente durante 1-3 días.

Mezcla de acrilamidas

40% de poliacrilamida

0,8% de bisacrilamida

2.18 Corte de ADN

Las endonucleasas de restricción reconocen y hidrolizan secuencias de ADN palíndromas específicas de la enzima de un longitud de por lo general 4-8 nucleótidos. Según el tipo de enzima, la hidrólisis produce extremos truncados ("blunt ends") o extremos cohesivos ("sticky ends") de ADN monohebra. Para una digestión de restricción, se incubaron 0,1-60 \mug de ADN con 2-120 unidades ("units") de una enzima de restricción en el tampón indicado por el fabricante a 37ºC durante 2-5 h. El volumen total estaba comprendido entre 10 \mul para preparaciones analíticas y 300 \mul para preparaciones preparativas. Para restricciones con dos enzimas diferentes, el tampón seleccionado era uno en el que ambas enzimas presentaban una reactividad suficiente, por ejemplo el tampón EcoRI para una digestión con EcoRI/BamHI o bien, tras la incubación con la primera enzima, se ajustaron las condiciones para la segunda enzima.

2.19 Ligación de ADN

Las ligasas de ADN catalizan la unión de moléculas de ADN consumiendo NAD^{+} o ATP con la formación de un enlace de fosfodiéster entre un grupo 5'-fosfato y un grupo 3'-hidroxi. Un exceso de tres a cinco veces del fragmento de ADN se incubó con 100-500 ng del plásmido cortado y 5 unidades de ligasa T4-ADN así como 10 nmol de ATP a 12ºC durante una noche en tampón de ligación. Se realizaron sólo ligaciones de extremos cohesivos.

Tampón de ligación

Tris-HCl pH 7,8	40 mM
MgCl_{2}	10 mM
DTT	10 mM
ATP	0,5 mM

2.20 Secuencación de ADN

(Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977) 5463-5467)

La secuenciación de ADN se llevó a cabo según el metódo de interrupción de cadena. El substrato utilizado era ADN plasmídico de doble hebra. ADN de doble hebra puede sintetizarse a partir de ADN monohebra, partiendo de un "primer" de oligonucleótido en presencia de dNTPs por medio de una polimerasa de ADN. Si en la mezcla de nucleótidos hay un bajo contenido en didesoxinucleótidos (ddNTPs), este método produce una incorporación de ddNTPs de distribución aleatoria, puesto que la polimerasa de ADN no sabe distinguir entre dNTPs y ddNTPs. Debido a la falta del grupo 3'-hidroxi de los ddNTPs, su incorporación provoca la interrupción de la síntesis de doble hebra, y, debido a que dicha incorporación tiene lugar con una distribución estadística, se obtienen monohebras de ADN de longitudes diferentes. Puesto que la preparación de síntesis se ha divido en cuatro y en cada muestra hay sólo uno de los cuatro ddNTPs, en cada preparación tendrá lugar una interrupción de cadena específica de las bases. Para marcar la monohebra sintetizada, se adiciona \alpha-^{35}S-dATP a la reacción. Tras desnaturalización y separación del ADN por electroforesis en gel de poliacrilamida, las bandas pueden detectarse por autorradiografía y la secuencia de la hebra de ADN puede leerse directamente.

Las secuencaciones se realizaron utilizando el kit de secuenciación T7 (Pharmacia) según las instrucciones del fabricante. El "primer" de oligonucleótidos utilizado era el "M13-Universal-Primer" (Pharamcia) o el "M13r primer". 32 \mul (aproximadamente 2 \mug) de ADN plasmídico purificado de doble hebra se desnaturalizaron con 8 \mul de NaOH
2 M a temperatura ambiente durante 10 min. Tras adición de 7 \mul de acetato sódico 3 M de pH 4,8, 4 \mul de H_{2}O y 120 \mul de etanol de -20ºC, el ADN se precipitó a -70ºC durante 20 min. El ADN se aisló por centrifugación (15 min, 4ºC), se lavó dos veces con etanol frío de -20ºC al 70% y se secó en una centrífuga al vacío. A continuación, el sedimento de ADN se resuspendió en 10 \mul de H_{2}O y, tras adición de 2 \mul de un tampón "annealing" y 2 \mul de una solución de "primer" (10 pmol en agua) se hibridizó con el "primer" de oligonucleótido a 65ºC durante 5 min, a 37ºC durante 10 min y a temperatura ambiente durante 5 min. Inmediatamente después, a fines de prolongación del "primer" y marcaje radiactivo, se adicionaron 3 \mul de "labelling mix", 1 \mul de \alpha-^{35}S-dATP (1000 Ci/mmol, 10 \muCi/\mul) y 2 \mul de solución de polimerasa T7 (diluida 1:5 con el tampón "Enzyme Dilution"), y la mezcla se incubó a temperatura ambiente durante 5 min. A 2,5 \mul de cada una de las cuatro mezclas diferentes de dNTP/ddNTP, que estaban presentes en una placa "Microsample" (Greiner) precalentada a 37ºC, se adicionaran en cada caso 4,5 \mul de dicha preparación. Tras una incubación de cinco minutos a 37ºC, que servía para otra elongación y terminación específica de la base, las reacciones se terminaron por adición de 5 \mul de una solución de paro. Antes de ser aplicadas al gel de poliacrilamida, las muestras se desnaturalizaron a 80ºC durante 2 min. Las muestras se almacenaron a -20ºC.

Tampón "annealing"

Tris-HCl pH 7,6	1 M
MgCl_{2}	100 mM
DTT	160 mM

"Labelling" mix

dCTP	1,375 \muM
dGTP	1,375 \muM
dTTP	1,375 \muM
NaCl	333,5 \muM

Tampón "enzyme dilution"

Tris-HCl pH 7,5	20 mM
DTT	5 mM
BSA	100 \mug/ml
glicerol	5%

Solución de paro

EDTA	10 mM
formamida	97,5%
azul de bromofenol	0,3%
xilenocianol	0,3%

A-Mix:	dCTP	840 \muM C-Mix:	dATP	840 \muM
	dGTP	840 \muM	dGTP	840 \muM
	dTTP	840 \muM	dTTP	840 \muM
	dATP	93,5 \muM	dCTP	93,5 \muM
	ddATP	14 \muM	ddCTP	14 \muM
	Tris-HCl	40 mM pH 7,6	Tris-HCl	40 mM pH 7,6
	NaCl	50 mM	NaCl	50 mM

G-Mix:	dATP	840 \muM T-Mix:	dATP	840 \muM
	dCTP	840 \muM	dCTP	840 \muM
	dTTP	840 \muM	dGTP	840 \muM
	dGTP	93,5 \muM	dTTP	93,5 \muM
	14 \muM	ddGTP	ddTTP	14 \muM
	Tris-HCl	40 mM	Tris-HCl	40 mM
	pH 7,6	\hskip-1cm pH 7,6
	NaCl	50 mM	NaCl	50 mM

2.21 Preparación de ADN de doble hebra por medio de oligonucleótidos

Para la preparación de la mezcla de ADN, se hibridizaron los oligonucleótidos a 60ºC. Por cada oligonucleótido, se utilizaron 100 pmol. De la muestra hibridizada, se utilizó 1 pmol para la PCR o 100 pmol para la reacción de Klenow.

Para la PCR, se realizaron los ciclos siguientes:

Al principio:	\hskip-1cm 10 min 94ºC
30 ciclos:	1 min	94ºC
	1 min	45ºC
	1 min	72ºC
Al final:	10 min	72ºC

El "template" de ADN utilizado era 1 pmol de oligonucleótidos hibridizados. Los "primers" de PCR se utilizaron en todas las reacciones de PCR realizadas en una concentración final de 0.1 pmol/\mul. Por cada 50 \mul de la preparación de reacción, se utilizó 1 unidad de la polimerasa Taq. La concentración de los dNTPs en la preparación de PCR se ajustó en 0,1 mM.

Para la preparación de la mezcla de ADN por medio de la reacción de Klenow, se disolvieron 100 pmol de los oligonucleótidos hibridizados en tampón Klenow (Tris-HCl 50 mM, pH 8,0; MgCl_{2}50 mM, DTT 10 mM, dNTP 0,05 mM). La reacción se inició por adición de 5 unidades de polimerasa I de ADN (fragmento de Klenow). Tras 30 min a 37ºC, la reacción se paró por calentamiento a 75ºC (10 min).

2.22 Transfección de células COS y células CHO

5-10 \mug de ADN plasmídico linearizado se disolvieron en 150 \mul de un medio de cultivo (sin FKS y antibióticos). A la solución se adicionaron 30 \mul del agente de transfección (SuperFect, Qiagen, Hilden). La mezcla se incuba a temperatura ambiente durante 10 min y, tras la adición de 1 ml de medio, se vierte en las células. Las células COS (crecidas con un 80% de confluencia) se cultivaron en placas de 60 mm y se lavaron con PBS un poco antes de la transfección. Tras una incubación de 3 h a 37ºC y un 5% de CO_{2}, se retiró el medio de transfección. A continuación, las células se lavaron 4 veces con PBS y se suspendieron en el medio de selección (DMEM, 5% de FKS, 600 \mug/ml de geneticina.

2.23 Purificación de la mezcla de GP120 por cromatografía

La purificación por cromatografía se lleva a cabo según los métodos estándares (Techniques in HIV Research, Aldovini & Walker, Stockton Press, 1990; S.W. Pyle et al. Purification of 120,00 dalton envelope glycoprotein from culture fluids of human immunodeficiency virus (HIV)-infected H9 cells. AIDS Res Hum Retroviruses 1987, 3:387-400). Extractos de células y sobrenadantes de cultivos de células de células COS que expresan GP120 se utilizaron para el aislamiento de la mezcla de GP120. Tras centrifugación (25.000 g), el lisado se purifica de la manera siguiente:

1.

Filtración en gel (Sephadex G-20)

2.

Cromatografía por inmunoafinidad (anticuerpos anti-GP120 unidos a CH-Sepharose 4B)

3.

Concentración por precipitación de proteína

4.

Concentración por diálisis

2.24 Preparación de la vacuna de ADN

El material de partida para la preparación de la vacuna de ADN es la mezcla de los fragmentos de ADN BstEII-BamHI del gen env, que se utilizaron para la preparación de la mezcla de las proteínas GP120. Un vector de expresión eucariótico para la GP120 VIH-1, aprobado para vacunaciones de ADN (ver, por ejemplo, J.D. Boyer et al. J. Infect Dis 1997, 176:1501-1509; J.D. Boyer et al, Nat Med 1997, 3:526-532; M.L. Bagarazzi et al., J Med Primatol 1997, 26:27-33) se modifica de tal manera que los puntos de corte para BstEII y BamHI en el gen env se encuentran en sitios idénticos del retículo de lectura de gp120. Se clonan los fragmentos del gen env mutados, variables (BstEII-BamHI) en un vector de este tipo. La modificación de los genes env en la zona del V2-Loop y del V3-Loop y su clonación en el vector de vacuna de ADN se lleva a cabo de forma análoga a las etapas de clonación realizadas para la preparación de la mezcla de gp120.

1

2

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<110> Strathmann AG & Co.

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<120> Vacuna viral

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<130> P052348

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<140>

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<141>

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<150> 199 07 485.2

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<151> 1999-02-12

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<160> 12

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<170> PatentIn Ver. 2.1

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<210> 1

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<211> 9709

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<212> ADN

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

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<400> 1

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3

4

5

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<210> 2

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<211> 854

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<212> PRT

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

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<220>

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<223> Envelope polyprotein

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<400> 2

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6

7

8

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<210> 3

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<211> 107

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<212> ADN

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<213> Secuencia original

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótido para la clonación

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

aagatgtagt aattagatct gccatttca cagacaatgc taaaaccata atagtacagc

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgaacacatc gttagaaatt aattgtacaa gacccaacaa caataca

\hfill

107

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<210> 4

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<211> 120

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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\vskip0.333000\baselineskip

<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótido para la clonación

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (97)..(99)

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<223> Secuencia en esta posicón: (GA)(AT)(GATC), es decir, la base en posición 97 puede ser G o A, la base en posición 98 puede ser A o T, y la base en posición 99 puede ser G, A, T o C.

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttttgctcta gaaatgttac aatgtgcttg tcttatgtct cctgttgcag cttctgttgc

\hfill

60

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgaaatgct ctccctggtc cgatatggat actatgrwnt tttcttgtat tgttgttggg

\hfill

120

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<210> 5

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótido para la clonación

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<400> 5

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\hskip-.1em\dddseqskip

ccatgtcacaa atgtcag

\hfill

17

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<210> 6

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótido para la clonación

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<400> 6

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\hskip-.1em\dddseqskip

aaaactgtgc gtacaa

\hfill

17

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<210> 7

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<211> 17

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótido para la clonación

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<400> 7

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\hskip-.1em\dddseqskip

gtaaaacgac ggccagt

\hfill

17

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<210> 8

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<211> 17

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<212> AND

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótido para la clonación

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

caggaaacag ctatgac

\hfill

17

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<210> 9

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<211> 2148

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<212> AND

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótido para la clonación

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (3) .. (9)

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<223> BstHI-Punto de corte

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<400> 9

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9

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10

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11

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<211> 10

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<211> 6229

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia artificial oligonucleótido para la clonación

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<220>

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<221> sig_peptide

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<222> (1293)..(1295)

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<223> env ATG

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1377) .. (1379)

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<223> env AGT, gp120 inicio

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1397) .. (1403)

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<223> BstHI-Punto de corte

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (3537) .. (3542)

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<223> BstHI-Punto de corte

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (3855) .. (3857)

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<223> env TAA, Stop

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(Secuencia pasa a página siguiente)

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<400> 10

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12

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120

13

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<210> 11

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<211> 860

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<212> ADN

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<213> Virus de la inmunodeficiencia humana

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<220>

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<221> misc_feature

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<222> (1) .. (860)

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<223> PI-932 secuencia original V1-V2-V3-Loop

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<400> 11

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14

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<210> 12

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<211> 870

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<212> ADN

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<213> Secuencia original

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<220>

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<223> Descripción de la secuencia original: PI 932 el cajetín de genes incluye los puntos de corte para las enzimas de restricción BspT1, PstI, Bc1I, EcoRI, Bg1II, PvuII, XbaI, NheI

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<400> 12

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15

16

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Claims (50)

1. Vacuna de proteína, que comprende una mezcla de moléculas de proteína virales, caracterizada porque las moléculas son variantes de secuencias de una sola proteína viral o de una parte de la misma, cuya mezcla contiene \geq 10^{2} variantes de secuencias, susceptible de ser obtenida por expresión de una mezcla de ADN plasmídico, que comprende, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria.

2. Vacuna de proteína según la reivindicación 1, caracterizada porque la mezcla contiene \geq 10^{3} variantes de secuencias y preferentemente \geq 10^{4} variantes de secuencias.

3. Vacuna de proteína según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque comprende una mezcla de proteínas GP120 de VIH, que se distinguen una de otra en su secuencia de aminoácido en la zona del bucle V2 y/o del bucle V3.

4. Vacuna de ADN, que codifica para una mezcla de proteínas virales de estructuras diferentes, caracterizada porque la vacuna es una mezcla de variantes de secuencias de una molécula de ADN viral o de una parte de la misma, conteniendo dicha mezcla \geq 10^{2} moléculas de ADN, que se distinguen una de otra en su secuencia de ácido nucleico, y comprendiendo dicha mezcla, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria.

5. Vacuna de ADN según la reivindicación 4, caracterizada porque contiene una mezcla de moléculas de ADN que codifican para variantes de secuencia de una proteína viral o de una parte de la misma.

6. Vacuna de ADN según la reivindicación 4, caracterizada porque la mezcla contiene \geq 10^{3} y preferentemente
\geq 10^{4} moléculas de ADN que se distinguen una de otra en su secuencia de ácido nucleico.

7. Vacuna de ADN según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 6, caracterizada porque codifica para una mezcla de proteínas GP120 de VIH de estructuras diferentes, conteniendo dicha vacuna una mezcla de moléculas de ADN, cuyas secuencias de ácido nucleico se distinguen una de otra en la zona que codifica para el bucle V2 y/o en la zona que codifica para el bucle V3.

8. Vacuna de ADN según la reivindicación 7, caracterizada porque contiene una mezcla de moléculas de ADN que se distinguen una de otra de tal manera que codifica para una mezcla de proteínas GP120, que presentan secuencias de aminoácido que son diferentes en el bucle V2 y/o en el bucle V3.

9. Secuencia de ácido nucleico, derivada de la secuencia env representada en SEC ID NO: 1 o de un fragmento de la misma, caracterizada porque se ha modificado de tal manera que contiene diez puntos de corte de restricción monovalentes a una distancia de aproximadamente 150 pares de bases.

10. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 9, derivada de la secuencia env representada en SEC ID NO: 1 o de un fragmento de la misma, caracterizada porque se ha modificado de tal manera que contiene sitios de escisión de restricción monovalentes que permiten el intercambio específico de las regiones V2 y V3.

11. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 9 ó 10, caracterizada porque la secuencia se ha modificado por introducción de mutaciones silenciosas.

12. Secuencia de ácido nucleico según las reivindicaciones 9 a 11, caracterizada porque presenta la secuencia indicada en SEC ID NO: 9.

13. Secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque presenta la secuencia indicada en SEC ID NO: 11.

14. Secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque presenta la secuencia indicada en SEC ID NO: 12.

15. Secuencia de ácido nucleico monohebra que contiene la zona que codifica para el bucle V3 y/o para el bucle V2 de GP120, caracterizada porque

a) en el bucle V3 se ha reemplazado un fragmento Bg1II-XbaI con una longitud de 247 bp o un fragmento Bg1II-NheI con una longitud de 283 bp con un fragmento modificado que presenta en cada caso, en relación al fragmento original, en por lo menos 6 posiciones inosina, un intercambio de ácido nucleico o una mutación y/o

b) en el bucle V2 se ha reemplazado un fragmento PstI-Bc1I con una longitud de 139 bp o un fragmento PstI-EcoRI con una longitud de 339 bp con un fragmento modificado que presenta en cada caso, en relación al fragmento original, en por lo menos 6 posiciones inosina, un intercambio de ácido nucleico o una mutación.

16. Secuencia de ácido nucleico, caracterizada porque presenta la secuencia complementaria a la secuencia indicada en SEC ID NO: 12.

17. Secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 15 ó 16, caracterizada porque el(los) fragmento(s) en 9 a 20 posiciones presenta(n) inosina, un intercambio de ácido nucleico o una mutación.

18. ADN de doble hebra, que comprende híbridos de la secuencia de ácido nucleico monohebra según la reivindicación 15 ó 17 con la secuencia de ácido nucleico monohebra según la reivindicación 16 ó 17.

19. Mezcla de ácidos nucleicos, que comprende ADNs de doble hebra, cuyas secuencias de ácido nucleico están derivadas de la secuencia env en SEC ID NO: 1 o SEC ID NO: 11 o de un fragmento de la misma, caracterizada porque las secuencias de ácido nucleico se distinguen una de otra en la zona que codifica para el bucle V3 y/o en la zona que codifica para el bucle V2, comprendiendo dicha mezcla, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria y codificando dichas secuencias de ácido nucleico para una mezcla de proteínas que contiene \geq 10^{2} variantes de secuencias.

20. Mezcla de ácidos nucleicos según la reivindicación 19, caracterizada porque la mezcla contiene \geq 10^{3} y preferentemente \geq 10^{4} variantes de secuencias.

21. Mezcla de proteínas, que comprende variantes de secuencias de la proteína GP120, caracterizada porque se trata de una mezcla de proteínas que presenta secuencias de aminoácidos que se distinguen una de otra en el bucle V2 y/o en el bucle V3, conteniendo dicha mezcla \geq 10^{2} variantes de secuencias y pudiendo obtenerse por expresión de una mezcla de ADN plasmídico que comprende, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria.

22. Mezcla de proteínas según la reivindicación 21, caracterizada porque la mezcla contiene \geq 10^{3} y preferentemente \geq 10^{4} variantes de secuencias.

23. Plásmido, que contiene insertado un ADN de doble hebra según la reivindicación 18.

24. Vector de expresión, caracterizado porque contiene insertada una secuencia de ácido nucleico según las reivindicaciones 9 a 14.

25. Vector de expresión según la reivindicación 24, caracterizado porque presenta la secuencia indicada en SEC ID NO: 10.

26. Vector de expresión, caracterizado porque corresponde a DSM 12612.

27. Mezcla de vectores, que contiene una mezcla de plásmidos según la reivindicación 23, caracterizada porque las secuencias de ácido nucleico de los plásmidos se distinguen una de otra en la zona que codifica para el bucle V2 y/o en la zona que codifica para el bucle V3, conteniendo dicha mezcla de plásmidos \geq 10^{2} plásmidos y comprendiendo, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria.

28. Mezcla de vectores según la reivindicación 27, caracterizada porque la mezcla contiene \geq 10^{3} y preferentemente \geq 10^{4} plásmidos que se distinguen uno de otro en su secuencia de ácido nucleico.

29. Mezcla de vectores según la reivindicación 27 ó 28, caracterizada porque los plásmidos pueden expresarse en E.coli como célula huésped.

30. Mezcla de vectores según la reivindicación 27 ó 28, caracterizada porque los plásmidos pueden expresarse en células eucariónticas, preferentemente en células Cos, CHO o BHK, como células huéspedes.

31. Células huéspedes de E. coli, transfectadas con una mezcla de vectores según la reivindicación 29.

32. Células huéspedes eucariónticas, transfectadas con una mezcla de vectores según la reivindicación 30.

33. Células huéspedes eucariónticas según la reivindicación 32, caracterizadas porque se trata de una célula huésped del grupo constituido por células Cos, BHK o CHO.

34. Procedimiento para la preparación de la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 10, caracterizado porque se introducen en una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína viral tantas mutaciones silenciosas que la secuencia de ácido nucleico así obtenida contiene sitios de escisión de restricción monovalentes que permiten el intercambio de las regiones V2 y V3.

35. Procedimiento para la preparación de la secuencia de ácido nucleico según la reivindicación 10, caracterizado porque se introducen en una secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína viral tantas mutaciones silenciosas que la secuencia de ácido nucleico así obtenida contiene diez sitios de escisión de restricción monovalentes a una distancia de aproximadamente 150 pares de bases.

36. Procedimiento según la reivindicación 34 ó 35, caracterizado porque la secuencia de ácido nucleico que codifica para una proteína viral es la secuencia según SEC ID NO: 1 or SEC ID NO: 11 o un fragmento de la misma.

37. Procedimiento para la preparación de la mezcla de vectores según las reivindicaciones 29 y 30, caracterizado porque se ligan los plásmidos, cuyas secuencias de ácido nucleico se distinguen una de otra en la zona que codifica para el bucle V2 y/o en la zona que codifica para el bucle V3 en cada caso por distribución aleatoria de las bases en las posiciones de nucleótido variadas, en un vector que puede expresarse en células huéspedes.

38. Procedimiento según la reivindicación 37, caracterizado porque las células huéspedes son células E.coli, Cos, COS o BHK.

39. Procedimiento para la preparación de las células huéspedes según la reivindicación 31 ó 32, caracterizado porque las células huéspedes se transforman con una mezcla de vectores según la reivindicación 27 ó 28.

40. Procedimiento para la preparación de una vacuna de proteína según cualquiera de las reivinidicaciones 1 a 3, caracterizado porque se cultivan las células huéspedes según cualquiera de las reivinidicaciones 31 a 33 en condiciones tales que permitan la expresión de la mezcla de variantes de secuencias de proteínas virales.

41. Procedimiento para la preparación de una vacuna de ADN según cualquiera de las reivinidicaciones 4 a 8, caracterizado porque se realiza el procedimiento según la reivindicación 37 ó 38, ligando los plásmidos según la invención en un vector que puede expresarse en células huéspedes del organismo a vacunar.

42. Uso de una mezcla de proteínas virales de estructuras diferentes, que son variantes de secuencias de una proteína viral o de una parte de la misma, cuya mezcla contiene \geq 10^{2} variantes de secuencias y puede obtenerse por expresión de una mezcla de ADN plasmídico, que comprende, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de una distribución aleatoria, para la preparación de una vacuna para la prevención y/o terapia de una infección viral en el ser humano.

43. Uso de una mezcla de proteínas según la reivindicación 21 ó 22, para la preparación de una vacuna para la prevención y/o terapia de una infección de VIH en el ser humano.

44. Uso de una mezcla de moléculas de ADN que codifican para \geq 10^{2} variantes de secuencias de una proteína viral o de una parte de la misma, comprendiendo dicha mezcla, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de una distribución aleatoria, para la preparación de una vacuna para la prevención y/o terapia de una infección viral en el ser humano.

45. Uso de una mezcla de ácido nucleico según la reivindicación 19 ó 20, para la preparación de una vacuna para la prevención y/o terapia de una infección viral en el ser humano.

46. Uso de la mezcla de ácido nucleico según la reivindicación 19 ó 20, para la preparación de una mezcla de vectores según la reivindicación 27 ó 28, que puede expresarse en células huéspedes, en el que las células huéspedes se han seleccionado de entre el grupo constituido por células E. coli, Cos, BHK o CHO.

47. Uso de la mezcla de vectores según la reivindicación 27 ó 28 para la expresión de una mezcla de proteínas según la reivindicación 21 ó 22.

48. Uso de la célula huésped según cualquiera de las reivindicaciones 31 a 33, para la preparación de una mezcla de proteínas según la reivindicación 21 ó 22.

49. Composición farmacéutica para la prevención y/o terapia de una infección viral, caracterizada porque comprende una mezcla de moléculas de proteínas y una mezcla de ácidos nucleicos, conteniendo dicha mezcla de proteínas \geq 10^{2} variantes de secuencias de una proteína viral o de una parte de la misma y pudiendo obtenerse por expresión de una mezcla de ADN plasmídico, que comprende, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de una distribución aleatoria, y conteniendo dicha mezcla de ácidos nucleicos \geq 10^{2} moléculas de ADN que codifican para variantes de secuencias de una proteína viral o de una parte de la misma, y comprendiendo dicha mezcla de ácidos nucleicos, debido a la variación de posiciones de nucleótido, combinaciones de secuencias de distribución aleatoria.

50. Composición farmacéutica según la reivindicación 49, caracterizada porque comprende una mezcla de proteínas según la reivindicación 21 ó 22 y una mezcla de ácidos nucleicos según la reivindicación 19 ó 20.