JPS61146187A - プラスミド - Google Patents
プラスミドInfo
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- JPS61146187A JPS61146187A JP59268520A JP26852084A JPS61146187A JP S61146187 A JPS61146187 A JP S61146187A JP 59268520 A JP59268520 A JP 59268520A JP 26852084 A JP26852084 A JP 26852084A JP S61146187 A JPS61146187 A JP S61146187A
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Classifications
-
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- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
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- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/24011—Poxviridae
- C12N2710/24111—Orthopoxvirus, e.g. vaccinia virus, variola
- C12N2710/24141—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/24143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
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Abstract
(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるた
め要約のデータは記録されません。
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Description
【発明の詳細な説明】
（産業上の利用分野）
本発明は医学分野におけるワクチンの製造原料となるプ
ラスミドに関するものである。
ラスミドに関するものである。
（従来の技術および発明が解決しようとする問題点）
現在値われているワクチンは、病原性を弱めた微生物を
含む弱毒化ワクチンと、不活性化した微生物を含む不活
化ワクチンの二種類である。これらのワクチンの投与方
法の組合せで種々の病気が予防されているが、全ての病
気に対して有効で安全なワクチンが製造されているわけ
ではなく、従来の方法では克服することが極めて難しい
難病も多々存在する。不活化すると抗原性が十分でなく
、また弱毒化の難しい病原体の場合である。このような
場合を克服するために遺伝子組換え技術を応用すること
が考えられた。すなわち、抗原性を支配する遺伝子をプ
ラスミドＤＮＡに組込み、大腸菌や酵母で抗原を大量に
作らせる方法である。イこの方法は、上記の問題点のう
ち特に安全性については解消されると思われるが、単一
抗原を生体に投与することによって６導されるのは体液
性抗体のみで、感染防御に主に働くと考えられる細胞性
免疫は誘導されない点や、抗原の精製の手間とコストが
かかる点など問題点も有する。
含む弱毒化ワクチンと、不活性化した微生物を含む不活
化ワクチンの二種類である。これらのワクチンの投与方
法の組合せで種々の病気が予防されているが、全ての病
気に対して有効で安全なワクチンが製造されているわけ
ではなく、従来の方法では克服することが極めて難しい
難病も多々存在する。不活化すると抗原性が十分でなく
、また弱毒化の難しい病原体の場合である。このような
場合を克服するために遺伝子組換え技術を応用すること
が考えられた。すなわち、抗原性を支配する遺伝子をプ
ラスミドＤＮＡに組込み、大腸菌や酵母で抗原を大量に
作らせる方法である。イこの方法は、上記の問題点のう
ち特に安全性については解消されると思われるが、単一
抗原を生体に投与することによって６導されるのは体液
性抗体のみで、感染防御に主に働くと考えられる細胞性
免疫は誘導されない点や、抗原の精製の手間とコストが
かかる点など問題点も有する。
（問題点を解決するための手段）
これらの問題点を解決するために、本発明は、ワクシニ
ア（種痘）ウィルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を含む
プラスミドを作製した。
ア（種痘）ウィルスの血球凝集素（ＨＡ）遺伝子を含む
プラスミドを作製した。
ワクシニアウィルスは天然痘の撲滅のため、世界的に使
用され、その安全性、有効性が実証された大型ＤＩムウ
イルスであり、動物ウィルスのポックスウィルス科、オ
ルトぎツクスウイルス属の一種である。このウィルスＤ
ＮＡの中のウィルスの増殖に必須でない遺伝子の領域に
抗原遺伝子を挿入して作製した組換えワクシニアウィル
スを接種すれば、体内で一定程度増殖し、病原体に対す
る強い免疫力を賦与するが人体には危害を与えないであ
ろう。この方法は高い抗体価を賦与し、安全性が高いと
考えられる上に、さらに細胞性免疫をも誘発し、廉価に
製造し得ると予想される。
用され、その安全性、有効性が実証された大型ＤＩムウ
イルスであり、動物ウィルスのポックスウィルス科、オ
ルトぎツクスウイルス属の一種である。このウィルスＤ
ＮＡの中のウィルスの増殖に必須でない遺伝子の領域に
抗原遺伝子を挿入して作製した組換えワクシニアウィル
スを接種すれば、体内で一定程度増殖し、病原体に対す
る強い免疫力を賦与するが人体には危害を与えないであ
ろう。この方法は高い抗体価を賦与し、安全性が高いと
考えられる上に、さらに細胞性免疫をも誘発し、廉価に
製造し得ると予想される。
従って本発明は、上記のワクシニアウィルスの非必須遺
伝子としての血球凝集素（以下Ｈムと称する）遺伝子の
ウィルスＤＮＡ中での位置（マツピング）と塩基配列を
決定し、このＨＡ遺伝子を組込んだプラスミドにある。
伝子としての血球凝集素（以下Ｈムと称する）遺伝子の
ウィルスＤＮＡ中での位置（マツピング）と塩基配列を
決定し、このＨＡ遺伝子を組込んだプラスミドにある。
このプラスミドは、生ワクチン用の組換えウィルスを作
成する素材となることができる。
成する素材となることができる。
（本発明の説明）
ワクシニアウィルスのＨＡ遺伝子は、第２図に示すよう
に、ワクシニアＤＮＡの塩基配列のうち最下段の５ａ１
１からＨｌｎｄ ｌまでの位置にある。
に、ワクシニアＤＮＡの塩基配列のうち最下段の５ａ１
１からＨｌｎｄ ｌまでの位置にある。
尚、表中ｆ） Ｈｉｎｄ Ｉ ＋ Ｅｃｏ ＲＩ ＋
Ｐｏｔ ＩおよヒＸｂａ工は制限酵素の名称である。
Ｐｏｔ ＩおよヒＸｂａ工は制限酵素の名称である。
ＨＡ遺伝子の塩基配列はサンガー等によって開明細化の
１ｊ１吉（内容に変更なし） 発されメツシング等により改良された方法を用いて決定
した（ジャーナル・オプ・モレキュラー・ビオ田シイ（
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ） １４８ 、 Ｉ ｎ １
〜１７８．１９８０．メソツズ・イン拳エンザイモロジ
−（ＭｅｔｈＯｄ８ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）
１０１ 、２０〜８９．１９８δ、プ田シーデインダ
スφオプ・ザ・ナショナル争アカデミイ・オブ・サイア
ンシズ （Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃ土、Ｕ、Ｓ、Ａ ） ８ ０ ．４９１４〜４９
１８）。
１ｊ１吉（内容に変更なし） 発されメツシング等により改良された方法を用いて決定
した（ジャーナル・オプ・モレキュラー・ビオ田シイ（
Ｊ、Ｍｏ１．Ｂｉｏｌ、 ） １４８ 、 Ｉ ｎ １
〜１７８．１９８０．メソツズ・イン拳エンザイモロジ
−（ＭｅｔｈＯｄ８ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ ）
１０１ 、２０〜８９．１９８δ、プ田シーデインダ
スφオプ・ザ・ナショナル争アカデミイ・オブ・サイア
ンシズ （Ｐｒｏｃ 、 Ｎａｔｌ、Ａｃａｄ、Ｓ
ｃ土、Ｕ、Ｓ、Ａ ） ８ ０ ．４９１４〜４９
１８）。
このようにして決定したＨＡ遺伝子の塩基配列を第１表
に示す。表中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシト
シン、Ｔはチミンを示す。尚、塩基配列から推定された
ＨＡ蛋白のアミノ酸配列も合わせて示す。
に示す。表中、Ａはアデニン、Ｇはグアニン、Ｃはシト
シン、Ｔはチミンを示す。尚、塩基配列から推定された
ＨＡ蛋白のアミノ酸配列も合わせて示す。
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ワクシニアウィルスのＨＡ遺伝子を含むＥｃｏ Ｒ１−
Ｈｌｎｄ Ｉ及びＳａｌ Ｉ −Ｈｉｎｄ １間のＤＮ
Ａ断片（第２図参照）と大腸菌プラスミドｐｔｙｃ ｓ
とが結合したものである。
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ワクシニアウィルスのＨＡ遺伝子を含むＥｃｏ Ｒ１−
Ｈｌｎｄ Ｉ及びＳａｌ Ｉ −Ｈｉｎｄ １間のＤＮ
Ａ断片（第２図参照）と大腸菌プラスミドｐｔｙｃ ｓ
とが結合したものである。
このようにして塩基配列を決定したＨＡ遺伝子領域に抗
原遺伝子を持った組換えワクシニアウィルスを作成する
ためには、まず本発明のＨＡ遺伝子を持ったプラスミド
に抗原遺伝子を挿入しなければならない。続いて、この
キメラプラスミドをワクシニア感染細胞にトランスフェ
クトすることにより、組換えワクシニアウィルスを得る
事ができる。
原遺伝子を持った組換えワクシニアウィルスを作成する
ためには、まず本発明のＨＡ遺伝子を持ったプラスミド
に抗原遺伝子を挿入しなければならない。続いて、この
キメラプラスミドをワクシニア感染細胞にトランスフェ
クトすることにより、組換えワクシニアウィルスを得る
事ができる。
以下第１図に基づきＨＡ８プラスミドを用いて組換えワ
クシニアウィルスを作製する方法を詳しく説明する。Ｈ
ム蛋白の開始コドン位置（４４４番目、第１表参照）よ
り約１００塩基上流までの間がワクシニアウィルスのＲ
Ｎムポリメラーゼの、プロモーターであると推定される
。そこで、開始コドン近傍の制限酵素切断部位（塩基配
列によりその存在が判る。例えば４８４番目の制限酵素
ＡＣＣＩ切断部位）に抗原性を支配する外来遺伝子（抗
原ＤＮＡ ）を通常の方法でＨム遺伝子に挿入する（Ａ
）。次いで、ワクシニアウィルス感染細胞に抗原遺伝子
を持つこのプラスミドをリン酸カルシウム法によってト
ランスフェクトする（Ｂ）。
クシニアウィルスを作製する方法を詳しく説明する。Ｈ
ム蛋白の開始コドン位置（４４４番目、第１表参照）よ
り約１００塩基上流までの間がワクシニアウィルスのＲ
Ｎムポリメラーゼの、プロモーターであると推定される
。そこで、開始コドン近傍の制限酵素切断部位（塩基配
列によりその存在が判る。例えば４８４番目の制限酵素
ＡＣＣＩ切断部位）に抗原性を支配する外来遺伝子（抗
原ＤＮＡ ）を通常の方法でＨム遺伝子に挿入する（Ａ
）。次いで、ワクシニアウィルス感染細胞に抗原遺伝子
を持つこのプラスミドをリン酸カルシウム法によってト
ランスフェクトする（Ｂ）。
ウィルス感染細胞内で、ワクシニアＤＮＡ中に存在する
ＨＡ遺伝子とプラスミドの中の遺伝子の断片がホモロー
ガス組換え機構により、組換えを起こし、従ってプラス
ミド中に挿入されていた抗原遺伝子がワクシニアＤＮＡ
に挿入される（０）。
ＨＡ遺伝子とプラスミドの中の遺伝子の断片がホモロー
ガス組換え機構により、組換えを起こし、従ってプラス
ミド中に挿入されていた抗原遺伝子がワクシニアＤＮＡ
に挿入される（０）。
このようにして得られたウィルスを増殖し、通常の方法
でウィルスを収穫してヒト由来細胞株のＨｅＩ、ａ細胞
上でプラークを作らせ、ブラークツ１イブリツド法によ
って抗原遺伝子を組込んだワクシニアウィルスを固定す
ることができる。
でウィルスを収穫してヒト由来細胞株のＨｅＩ、ａ細胞
上でプラークを作らせ、ブラークツ１イブリツド法によ
って抗原遺伝子を組込んだワクシニアウィルスを固定す
ることができる。
以下、実施例に基づき本発明を更に詳しく説明する。
（実施例）
ワクシニアウィルスの精製
５ ｘ １０８個のＨｅＬａ−８，細胞（ヒト由来細胞
株）にワクシニアウィルスＩ）ＩＤ−Ｊ株（故松本清−
教授から入手）をｍ、 ｏ、 ｉ、 （感染多重度）
０．２にて感染させて、２８後、細胞変性が顕著になっ
た時期にウィルスを回収した。このウィルスを蔗糖密度
勾配遠心法で精製し、約４．５■のウィルスを得た。（
ワクシニアウィルスの精製はＪａｋｌｉｋ、Ｗ。
株）にワクシニアウィルスＩ）ＩＤ−Ｊ株（故松本清−
教授から入手）をｍ、 ｏ、 ｉ、 （感染多重度）
０．２にて感染させて、２８後、細胞変性が顕著になっ
た時期にウィルスを回収した。このウィルスを蔗糖密度
勾配遠心法で精製し、約４．５■のウィルスを得た。（
ワクシニアウィルスの精製はＪａｋｌｉｋ、Ｗ。
Ｋａ（１９６２） Ｂｉｔｅ！ｈｅｍ、 ＆ Ｂｉｏｐ
ｈｙｓ、 ＡＣｔｔａ ６１２９０−８０１を参照する
ことができる。） ワクシニアウィルスＤＮＡの調製 得られた精製ウィルス４．５１１＃９を０．５％Ｈ＆ド
デシル硫酸（ＳＤＳ）と１１１１ＭのＮａ１ＤＴムの存
在下で、１■／−のプロテアーゼにで一晩８７℃で消化
させた。除蛋白のためフェノール／クロロホルムで８回
抽出し、エチルエーテルで８回抽出した。１７１ Ｇ量
の８Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のイソプロパツールを加
えて攪拌し、□凝集したＤＮＡをガラス棒で捲き取った
。ＤＮＡをＴ Ｅ （１０ｒａＭ Ｔｒｉｓ４Ｃｌ。
ｈｙｓ、 ＡＣｔｔａ ６１２９０−８０１を参照する
ことができる。） ワクシニアウィルスＤＮＡの調製 得られた精製ウィルス４．５１１＃９を０．５％Ｈ＆ド
デシル硫酸（ＳＤＳ）と１１１１ＭのＮａ１ＤＴムの存
在下で、１■／−のプロテアーゼにで一晩８７℃で消化
させた。除蛋白のためフェノール／クロロホルムで８回
抽出し、エチルエーテルで８回抽出した。１７１ Ｇ量
の８Ｍ酢酸ナトリウムと２倍量のイソプロパツールを加
えて攪拌し、□凝集したＤＮＡをガラス棒で捲き取った
。ＤＮＡをＴ Ｅ （１０ｒａＭ Ｔｒｉｓ４Ｃｌ。
、ｐＨ８，０、１ｍＭ ＥＤＴＡ ）に溶かした。ＤＮ
Ａの収量は約２００μりであった。
Ａの収量は約２００μりであった。
ＨＡ遺伝子を含むＤＮＡの同定
１００μりのＤ Ｎ Ａ ｔｔ Ｈｉｎｄ Ｉ テ切断
し、０．６％アガロースゲルで各フラグメントを分離し
た。
し、０．６％アガロースゲルで各フラグメントを分離し
た。
各７ラグメントを電気泳動で回収した後、ノ・イブリッ
ド−アレスト法により、ＨＡ遺伝子を含むＤＮＡを同定
した。この方法を詳しく述べると１約２μりのＤＮＡフ
ラグメントと１０μりの全ＲＮＡ （ワクシニアウィル
ス感染細胞より抽出した）を混合した後、−晩４２℃で
８０％ホルムアミド存在下でハイブリッドを形成させた
。それからエタノールで沈澱させたＤＮＡとＲＩムの混
合物を６μｌの純水に溶かし、２０μｌのウサギの網状
赤血球抽出物（５０μＯｉの Ｈ−ロイシンを含む）を
加えて、インビトロ翻訳を行なった。３０℃で１時間保
温後、反応液をＳＤＳとデオキシフール酸、Ｍ Ｐ −
４０（Ｎｏｈｉｄｅｔ Ｐ −４０）を含む溶液で希釈
し、１μｌの抗ＨＡ抗体を加え、−晩水中に放置した。
ド−アレスト法により、ＨＡ遺伝子を含むＤＮＡを同定
した。この方法を詳しく述べると１約２μりのＤＮＡフ
ラグメントと１０μりの全ＲＮＡ （ワクシニアウィル
ス感染細胞より抽出した）を混合した後、−晩４２℃で
８０％ホルムアミド存在下でハイブリッドを形成させた
。それからエタノールで沈澱させたＤＮＡとＲＩムの混
合物を６μｌの純水に溶かし、２０μｌのウサギの網状
赤血球抽出物（５０μＯｉの Ｈ−ロイシンを含む）を
加えて、インビトロ翻訳を行なった。３０℃で１時間保
温後、反応液をＳＤＳとデオキシフール酸、Ｍ Ｐ −
４０（Ｎｏｈｉｄｅｔ Ｐ −４０）を含む溶液で希釈
し、１μｌの抗ＨＡ抗体を加え、−晩水中に放置した。
抗ＨＡ抗体とＨＡの複合体を回収するため、１０μノの
１０％スタフィロコッカスを加え、通常の遠心法により
集めた。沈渣を５回洗浄後、５Ｄｓ−ｙｙリアクリルア
ミドゲル寛気気泳動行い、フルオログラフィ法によりＨ
Ａを分析した。その結果Ａ７ラグメント（第２図参照）
がＨＡ遺伝子を含む事が判明した。
１０％スタフィロコッカスを加え、通常の遠心法により
集めた。沈渣を５回洗浄後、５Ｄｓ−ｙｙリアクリルア
ミドゲル寛気気泳動行い、フルオログラフィ法によりＨ
Ａを分析した。その結果Ａ７ラグメント（第２図参照）
がＨＡ遺伝子を含む事が判明した。
ＨＡ遺伝子を組込んだプラスミド（ＨＡ８ ）の作上記
の精製ウィルスから調製したＨＡ遺伝子を含むＡフラグ
メント１μりを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩまたはＥＣＯＲＩ
とＨｉｎｄ １１の両方で切断した大腸菌のＰＵＯ８プ
ラスミドＤ Ｎ Ａ ５０ ｎｇに結合（ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ ）させた。そして、カルシウム法によりＤＮＡを
受容できるようにした大腸菌ＪＭＩ ０８株にトランス
フェクトした。アンピシリンを含む寒天培地上に形成さ
れたコロニーから大腸菌を回収しくＰＵＯ８を含む大腸
菌のみがアンピシリンに耐性となる）、プラスミドＤＮ
Ａをアルカリ法で抽出した。アガロース電気泳動法でＤ
ＮＡの分子量を決め、前述のハイブリッド−アレスト法
に、より同様にＨＡ遺伝子を含むＤＮＡ７ラグメントを
同定した（分子量？、８ＫｂのＤＮＡを含むプラスミド
が求めるものであった０ ）。
の精製ウィルスから調製したＨＡ遺伝子を含むＡフラグ
メント１μりを制限酵素Ｅｃｏ ＲＩまたはＥＣＯＲＩ
とＨｉｎｄ １１の両方で切断した大腸菌のＰＵＯ８プ
ラスミドＤ Ｎ Ａ ５０ ｎｇに結合（ｌｉｇａｔｉ
ｏｎ ）させた。そして、カルシウム法によりＤＮＡを
受容できるようにした大腸菌ＪＭＩ ０８株にトランス
フェクトした。アンピシリンを含む寒天培地上に形成さ
れたコロニーから大腸菌を回収しくＰＵＯ８を含む大腸
菌のみがアンピシリンに耐性となる）、プラスミドＤＮ
Ａをアルカリ法で抽出した。アガロース電気泳動法でＤ
ＮＡの分子量を決め、前述のハイブリッド−アレスト法
に、より同様にＨＡ遺伝子を含むＤＮＡ７ラグメントを
同定した（分子量？、８ＫｂのＤＮＡを含むプラスミド
が求めるものであった０ ）。
得られた結果は、第２図の中段に示すようにＡフラグメ
ントの最右翼の位置に■ム遺伝子が存在することを示し
た。そこで、このＤＮＡ７ラグメントを含むプラスミド
（７，８０１と略称する）の各種制限酵素地図（Ｐ８ｔ
Ｉ 、 ＸｂａＩ 、 ５ａｌＩ等）を通常の二重消化
法等により作成し、これら制限酵素により断片化したＤ
ＮＡを前述のハイブリッド−アレスト法で分析した。第
２図の下段に示すように、Ｓａｌ Ｉとｕｉｎａｉ切断
部位の間にＨＡ遺伝子が存在することが判明した。
ントの最右翼の位置に■ム遺伝子が存在することを示し
た。そこで、このＤＮＡ７ラグメントを含むプラスミド
（７，８０１と略称する）の各種制限酵素地図（Ｐ８ｔ
Ｉ 、 ＸｂａＩ 、 ５ａｌＩ等）を通常の二重消化
法等により作成し、これら制限酵素により断片化したＤ
ＮＡを前述のハイブリッド−アレスト法で分析した。第
２図の下段に示すように、Ｓａｌ Ｉとｕｉｎａｉ切断
部位の間にＨＡ遺伝子が存在することが判明した。
Ｈム８プラスミドを作製するために、５μりの前記ツー
８０１プラスミドをＨｌｎｄｕと３ａｌＩで切断し、そ
のうち０．５μりを５０ｎ９のｐＵＯ８（前記Ｈｉｎｄ
ｌと５ａｌＩで切断したもの）と結合させた。大腸菌Ｊ
Ｍ１０８株をトランスフオームさせてから、アンピシリ
ンを含む寒天上に生じたコロニーを拾った。得られたプ
ラスミドＤＮＡをアガロース電気泳動法によって分析し
、ＨＡ遺伝子を含むＨｉｎｄｌ−３ａＩＩ部位（１，８
Ｋｂ ）のＤＮＡを有するプラスミドをＨＡ８と命名し
た。求めるフラグメントであることを確認するために、
このＨＡ８プラスミドを制限酵素ＡｃｃＩ 、 Ｎｒｕ
Ｉ 、 ＸｂａＩ等で切断し、予想される大きさに細分
されることをアガロース電気泳動法によって認めた。
８０１プラスミドをＨｌｎｄｕと３ａｌＩで切断し、そ
のうち０．５μりを５０ｎ９のｐＵＯ８（前記Ｈｉｎｄ
ｌと５ａｌＩで切断したもの）と結合させた。大腸菌Ｊ
Ｍ１０８株をトランスフオームさせてから、アンピシリ
ンを含む寒天上に生じたコロニーを拾った。得られたプ
ラスミドＤＮＡをアガロース電気泳動法によって分析し
、ＨＡ遺伝子を含むＨｉｎｄｌ−３ａＩＩ部位（１，８
Ｋｂ ）のＤＮＡを有するプラスミドをＨＡ８と命名し
た。求めるフラグメントであることを確認するために、
このＨＡ８プラスミドを制限酵素ＡｃｃＩ 、 Ｎｒｕ
Ｉ 、 ＸｂａＩ等で切断し、予想される大きさに細分
されることをアガロース電気泳動法によって認めた。
ＨＡ遺伝 の塩基配列の決定
ワクシニアウィルスのＨＡ遺伝子の塩基配列ヲ決定する
実施例を第８図に基づいて説明する。
実施例を第８図に基づいて説明する。
前述のように調製した２５μりの７．８０１プラスミド
ＤＩムを、第８図に示すように、制限酵素５ａｌＩ （
またはＨｌｎｄｕ ）で切断し、さらに５単位の１３ａ
ｌ ７３１エクソヌクレアーゼを加えた。３０℃で保温
し、１分間隔で反応液の１／１０量ずつ取出１、、ＥＧ
ＴＡ（エチレングリフールビス（２−アミンエーテル）
西酢酸）溶液と混合して反応を止めた（■及び■）。
ＤＩムを、第８図に示すように、制限酵素５ａｌＩ （
またはＨｌｎｄｕ ）で切断し、さらに５単位の１３ａ
ｌ ７３１エクソヌクレアーゼを加えた。３０℃で保温
し、１分間隔で反応液の１／１０量ずつ取出１、、ＥＧ
ＴＡ（エチレングリフールビス（２−アミンエーテル）
西酢酸）溶液と混合して反応を止めた（■及び■）。
Ｂａｌ ８１エクソヌクレアーゼで消化したプラスミド
ＤＮＡをＨｉｎｄｌ（または５ａＸＩ）で切断した（■
→■）。そのうち、７）Ｉ２５１をＨｉｎｄｌ （また
は５ａｌＩ ）と制限酵素ＳｍａＩで切断したＭｌ、ｌ
ファージ（−重鎖ＤＮＡファージ） ｍｐ １１または
ｍｐ １０株の複製型分子（ＲＦ ）ＤＮＡ （５ｎ９
’）と連結反応させた（０→■）。
ＤＮＡをＨｉｎｄｌ（または５ａＸＩ）で切断した（■
→■）。そのうち、７）Ｉ２５１をＨｉｎｄｌ （また
は５ａｌＩ ）と制限酵素ＳｍａＩで切断したＭｌ、ｌ
ファージ（−重鎖ＤＮＡファージ） ｍｐ １１または
ｍｐ １０株の複製型分子（ＲＦ ）ＤＮＡ （５ｎ９
’）と連結反応させた（０→■）。
反応生成物を、カルシウム処理した大腸菌ＪＭ１０３株
にトランスフェクションさせ、大腸菌指示菌の上でプラ
ークを作らせたプラークよりファージを吊り上げ、増殖
し、フェノール法で７アージＤＮＡを抽出した（■→■
）。
にトランスフェクションさせ、大腸菌指示菌の上でプラ
ークを作らせたプラークよりファージを吊り上げ、増殖
し、フェノール法で７アージＤＮＡを抽出した（■→■
）。
抽出物についてアマジャムジャパン社のカタログに従っ
て塩基配列を決定した（第４図、第１表）。
て塩基配列を決定した（第４図、第１表）。
（発明の効果）
本発明においてワクシニアウィルスのＤＮＡ中での血球
凝集素（ＨＡ）遺伝子の位置と塩基配列を決定し、５ａ
ＩＩとＨｉｎｄｕとの間のウィルス増殖に必須でない領
域のＤＮＡ断片と、大腸菌のプラスミドとを結合したプ
ラスミドを得ることができた。
凝集素（ＨＡ）遺伝子の位置と塩基配列を決定し、５ａ
ＩＩとＨｉｎｄｕとの間のウィルス増殖に必須でない領
域のＤＮＡ断片と、大腸菌のプラスミドとを結合したプ
ラスミドを得ることができた。
これによりＨム遺伝子領域に抗原遺伝子を組込んだ組換
えワクシニアウィルスを作成できる可能性がでできたの
で、生ワクチン製造に向けて一歩前進したといえる。ま
た、論理的には、これを利用してあらゆる病原体に対す
る生ワクチンが製造可能である。
えワクシニアウィルスを作成できる可能性がでできたの
で、生ワクチン製造に向けて一歩前進したといえる。ま
た、論理的には、これを利用してあらゆる病原体に対す
る生ワクチンが製造可能である。
第１図は本発明のＨＡ遺伝子を含有するプラスミドを用
いた組換えワクシニアウィルスの作製方法を示すｇ図、 第２図は本発明に用いたワクシニアウィルスＤＮＡ中の
ＨＡ遺伝子の存在位置を示す図、第８図は本発明に用い
たＨＡ遺伝子の塩基配列の決定方法を示す概略図、 第４図は本発明に用いたＨＡ遺伝子の塩基配列決定の方
向と長さを示す８１図である。 手 続 補 正 書（方式） 昭和６０年５月９日 特許庁長官 志 賀 学 殿１、事件
の表示 昭和５９年特許願第２６８５２０号 ２、発明の名称 プラスミド ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 京 都 大 学 長 ４、代理人
いた組換えワクシニアウィルスの作製方法を示すｇ図、 第２図は本発明に用いたワクシニアウィルスＤＮＡ中の
ＨＡ遺伝子の存在位置を示す図、第８図は本発明に用い
たＨＡ遺伝子の塩基配列の決定方法を示す概略図、 第４図は本発明に用いたＨＡ遺伝子の塩基配列決定の方
向と長さを示す８１図である。 手 続 補 正 書（方式） 昭和６０年５月９日 特許庁長官 志 賀 学 殿１、事件
の表示 昭和５９年特許願第２６８５２０号 ２、発明の名称 プラスミド ３、補正をする者 事件との関係 特許出願人 京 都 大 学 長 ４、代理人
Claims (1)
- １、ワクシニア（種痘）ウィルスの血球凝集素（ＨＡ）
遺伝子を含有するプラスミド。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59268520A JPS61146187A (ja) | 1984-12-21 | 1984-12-21 | プラスミド |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP59268520A JPS61146187A (ja) | 1984-12-21 | 1984-12-21 | プラスミド |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPS61146187A true JPS61146187A (ja) | 1986-07-03 |
| JPH0154039B2 JPH0154039B2 (ja) | 1989-11-16 |
Family
ID=17459656
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP59268520A Granted JPS61146187A (ja) | 1984-12-21 | 1984-12-21 | プラスミド |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JPS61146187A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6363380A (ja) * | 1986-09-03 | 1988-03-19 | Univ Kyoto | 組換ワクシニアウイルスを用いた人白血病ウイルスワクチン |
-
1984
- 1984-12-21 JP JP59268520A patent/JPS61146187A/ja active Granted
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JPS6363380A (ja) * | 1986-09-03 | 1988-03-19 | Univ Kyoto | 組換ワクシニアウイルスを用いた人白血病ウイルスワクチン |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH0154039B2 (ja) | 1989-11-16 |
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