ES2212695B1 - Procedimiento de identificacion de la proteina humana adamts-13. - Google Patents
Procedimiento de identificacion de la proteina humana adamts-13.Info
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Abstract
La invención consiste en identificar fragmentos de genes humanos similares a secuencias de genes de proteínas ADAM, amplificarlos mediante PCR de ARN de tejidos humanos, extender la secuencia de los fragmentos obtenidos hacia los extremos 5'' y 3'' y determinar la secuencia de los clones de ADNc generados. La secuencia identificada es SEQ ID NO :1 y se ha denominado ADAMTS-13. La aplicación de dicha secuencia está relacionada fundamentalmente con la diagnosis y el tratamiento de anomalías en los procesos de angiogénesis, hemostasis, adhesión celular y remodelación tisular.
Description
Procedimiento de identificación de la proteína
humana ADAMTS-13.
La invención se adscribe al campo de los procesos
biológicos de adhesión celular y remodelación tisular, incluyendo
los asociados a condiciones fisiológicas como la respuesta inmune,
la angiogénesis, la coagulación, la cicatrización de heridas, los
procesos reproductivos, la implantación embrionaria, o el
desarrollo fetal, así como procesos patológicos incluyendo los
tumorales, artríticos, cardiovasculares, hematológicos y
neurodegenerativos. En concreto, la presente invención versa sobre
una proteína humana que contiene dominios de adhesión celular y
metaloproteasa, sobre el gen que la codifica, y sobre sus posibles
inhibidores. Más particularmente, la presente invención aborda la
identificación de la proteína humana llamada
ADAMTS-13, y el análisis de su estructura y de sus
posibles funciones normales y patológicas.
Las proteínas denominadas ADAMs (a
disintegrin and metalloproteinase domain) o
desintegrinas celulares, son una familia de enzimas que han
adquirido una notable importancia dada su capacidad de participar
en procesos biológicos que implican fenómenos de adhesión celular y
proteolisis extracelular (Cell 90, 589, (1997)). Estas
proteínas poseen una peculiar organización estructural con dominios
de proenzima, metaloproteasa, desintegrina, rico en cisteína, factor
de crecimiento epidérmico, transmembrana, y citoplasmático. Algunos
de estos dominios son semejantes a los encontrados en una familia
de proteínas aisladas de venenos de serpientes (Methods Enzymol.
248, 345, (1995)). Estas proteínas de serpientes junto con
las ADAMs, constituyen la superfamilia de las reprolisinas,
caracterizadas por la presencia de una secuencia HEXXHXXGXXHD en su
dominio catalítico.
Las ADAMs han sido identificadas en una variedad
de tejidos de mamíferos, así como en otros organismos eucariotas
como Xenopus laevis, Drosophila melanogaster y
Caenorhabditis elegans, pero no en plantas, levaduras o
bacterias. Inicialmente, las ADAMs se asociaron a procesos
reproductivos, pero posteriormente su espectro de funciones se ha
extendido considerablemente (Curr. Ópin. Cell Biol. 10, 654,
(1998)). Así, la meltrina-\alpha
(ADAM-12) se ha implicado en fusión de mioblastos.
Las meltrinas \alpha y \beta también participan en procesos de
diferenciación y actividad osteoblástica. Otras ADAMs como las
denominadas MS2 y decisina, participan en distintos procesos de la
respuesta inmune. Además, estudios recientes han permitido
caracterizar las propiedades enzimáticas y especificidad de
sustrato de varias ADAMs como ADAM-9,
ADAM-10 o ADAM-17 que actúan como
proteasas implicadas en el procesamiento proteolítico de sustratos
celulares relevantes, incluyendo precursores de citoquinas y
factores de crecimiento.
La complejidad estructural y funcional de esta
familia de proteínas se ha extendido considerablemente tras el
reciente hallazgo de una serie de nuevas proteasas relacionadas con
las ADAMs y caracterizadas por la presencia en su secuencia de
aminoácidos de varias copias de dominios trombospondina (J. Biol.
Chem. 274, 25555, (1999)). El primer miembro de esta
subfamilia, denominado ADAMTS-1, se identificó como
consecuencia de su asociación con el desarrollo de caquexia tumoral
y de varios procesos inflamatorios. Posteriormente, se identificó
la ADAMTS-2, con actividad de procolágeno I
amino-proteasa y cuya deficiencia origina el
síndrome de Ehlers-Danlos tipo VIIC (Am. J. Hum.
Gen. 65, 308, (1999)). Otros miembros de la familia son las
proteínas denomminadas ADAMTS-4 y
ADAMTS-11, las cuales poseen la actividad agrecanasa
responsable de la degradación del cartílago articular en
enfermedades artríticas. Por otra parte la ADAMTS-8
y la ADAMTS-1 han sido identificadas como proteínas
capaces de inhibir los procesos de angiogénesis. Finalmente, otras
proteínas como las ADAMTS-3,
ADAMTS-5, ADAMTS-6,
ADAMTS-7 y ADAM-TS12 sólo se han
caracterizado al nivel estructural y sus funciones todavía no han
sido aclaradas. Todas estas proteínas tienen una organización
similar en dominios, pero difieren sustancialmente de la estructura
prototipo de las ADAMs. Así, las ADAMTS-s carecen
del dominio de factor de crecimiento epidérmico, la región
transmembrana, y la cola citoplasmática características de las
ADAMs, pero contienen una serie de copias de trombospondina, que
representan la característica distintiva de los miembros de esta
familia de proteínas. El hallazgo de que las ADAMTS pueden estar
implicadas en una amplia variedad de procesos biológicos y
patológicos ha estimulado la búsqueda de nuevos componentes de la
familia.
Una de las estrategias para la identificación de
nuevas ADAMTS humanas consistiría en la aplicación de métodos de
clonación por homología. Una de las múltiples formas de abordar
este método, persigue en un primer paso la búsqueda en bancos de
datos accesibles públicamente, de fragmentos de secuencias
denucleótidos de genes humanos generados de manera aleatoria y que
tengan similitud con las secuencias de los genes de las
desintegrinas ya conocidas. Tras su identificación, los hipotéticos
fragmentos homólogos se pueden amplificar mediante PCR de ARN
'total de tejidos humanos en los que se sospeche la expresión de
dichos genes, y utilizarlos como sondas para hibridar genotecas de
ADNc preparadas a partir de ARN de los mismos tejidos.
Alternativamente, se puede extender la secuencia hacia los extremos
5' o 3' mediante técnicas de amplificación rápida de los extremos
de los ADNcs (RACE). Finalmente, la secuenciación y posterior
caracterización de los clones humanos aislados mediante técnicas
estándar de Biología Molecular, permitiría confirmar la
identificación de nuevas ADAMTS y definir el posible papel de las
proteínas codificadas por dichos clones en procesos normales y
patológicos de adhesión celular o proteolisis. Basándose en esta
idea, los autores de la invención, tras los pertinentes estudios
experimentales, han llegado a los objetivos antes enumerados que
constituyen los diversos aspectos de la presente invención.
Un objeto de la presente invención es identificar
el gen humano que codifica una nueva proteína humana denominada
ADAMTS-13.
Un segundo objeto de la invención es analizar la
expresión en tejidos humanos del gen de la
ADAMTS-13.
Un tercer objeto de la invención es analizar la
expresión del gen de la ADAMTS-13 en tumores
humanos.
El primer objeto de la invención consistió en la
identificación de un gen humano que pudiera codificar una nueva
ADAM humana. Para ello la secuencia de aminoácidos de regiones
conservadas en las ADAMs descritas se comparó con la división de
Expressed Sequence Tags (ESTs) de la base de datos GenBank
utilizando el programa TBLASTN (J. Mol. Biol. 215, 403,
(1990)). Se identificó una EST humana, cuyo número de acceso es
AI806237. A partir de la secuencia de nucleótidos de esta EST, se
diseñaron y sintetizaron dos oligonucleótidos, AD-1
(5'-CTGCCGGCGGCTGCAGGGGGA-3') y
AD-2
(5'-GGACCCGTCCCTGGGGGCTCA-3'). Estos
oligonucleótidos fueron utilizados para amplificar el fragmento de
ADNc correspondiente, empleando como molde DNA total aislado a
partir de una genoteca de ADNc humano de hígado fetal. Para ello se
utilizaron 20 pmoles de cada oligonucleótido, aproximadamente 1
microgramo de ADNc, 0,2 mM dNTPs y 1,25 U de Taq DNA polimerasa en
un volumen total de 50 microlitros de tampón ExpandLong 3
(Boehringer Mannheim). La amplificación se llevó a cabo en un
aparato GeneAmp2400 de Perkin-Elmer, y consistió en
400 ciclos de desnaturalización (15 s, 94ºC), hibridación (20 s,
64ºC) y extensión (20 s, 72ºC). El fragmento de DNA resultante, de
460 pares de bases (pb) se purificó mediante electroforesis en gel
de agarosa y posterior extracción con GeneClean. La identidad del
fragmento amplificado con la secuencia parcial de la
EST-AI806237 se verificó tras subclonarlo en pUC18 y
determinar su secuencia de nucleótidos mediante técnicas estándar
de Biología Molecular.
Con el fin de obtener una secuencia de ADNc que
contuviera la información codificante de la proteína completa, el
producto de PCR obtenido con los oligonucleótidos
AD-1 y AD-2, se marcó
radiactivamente y se utilizó como sonda para hibridar una genoteca
de ADNc de pulmón fetal humano. Tras el escrutinio de
aproximadamente lx10^{6} unidades formadoras de placa, se obtuvo
un clon con hibridación positiva cuya secuencia de nucleótidos se
determinó mediante métodos convencionales. El análisis de dicha
secuencia reveló que este clon contenía un inserto de 1.4 kb, que
parecía estar incompleto en su extremos 5' y 3'. Dicha región se
extendió mediante técnicas de amplificación rápida de extremos de
ADNcs utilizando ARN de hígado fetal humano y el método Marathon de
Clontech. Tras una serie de amplificaciones sucesivas se obtuvo un
fragmento que contenía un codón de terminación en la misma fase de
lectura que el resto del ADNc identificado. Finalmente, el ADNc
codificante completo se obtuvo por amplificación con los
oligonucleótidos ADTS13F
(5'-ATGCACCAGCGTCACCCCCGG-3') y
ADTS13R
(5'-GGTTCCTTCCTTTCCCTTCCAG-3'). El
análisis informático de la secuencia obtenida reveló la existencia
de una fase abierta de lectura, que codifica una proteína de 1340
aminoácidos a la que denominamos ADAMTS-13. Su
secuencia de aminoácidos, así como la secuencia nucleotídica que la
codifica se muestra como SEQ ID NO :1. La comparación de esta
secuencia de aminoácidos con todas las secuencias presentes en los
bancos de datos accesibles públicamente demostró la existencia de
un grado significativo de similitud con otras ADAMs y más
específicamente con miembros de la subfamilia de las ADAMTS (J.
Biol. Chem. 274, 25555, (1999)). Así, la proteína presenta
todos los motivos característicos de estos enzimas incluyendo la
secuencia señal, el propéptido, los dominios metaloproteasa,
desintegrina y rico en cisteína, así como diversas repeticiones
tipo trombospondina (TS).
Un análisis más detallado de la secuencia de
aminoácidos deducida para la ADAMTS-13, confirmó
que ésta posee el predominio más corto entre todos los miembros de
la familia. En él se localizan dos residuos cisteína (posiciones 27
y 37) que podrían estar implicados en el mantenimiento de la
latencia enzimática. Este predominio termina en un motivo dibásico
que podía corresponder al sitio de activación por furina, que
poseen estos enzimas. El dominio catalítico incluye la secuencia
HEXXHXXGXXHD (posiciones 224-235) implicado en la
coordinación del átomo de zinc en el centro activo de las
metaloproteasas, y con el residuo de ácido aspártico que permite
distinguir las reprolisinas de las MMPs. Este dominio también posee
el residuo de metionina (posición 249) que contribuye a formar la
estructura Met-giro presente en reprolisinas y MMPs.
Tras el dominio catalítico puede reconocerse el dominio
desintegrina, similar en tamaño al de otras ADAMTS y con las ocho
cisteínas altamente conservadas en dicha región. Finalmente, el
dominio rico en cisteínas muestra un alto porcentaje de identidades
(alrededor del 50%) con el dominio equivalente presente en otras
ADAMTS incluyendo los diez residuos de cisteína conservados en
todas ellas. Por todo ello, podemos concluir que la proteína
identificada pertenece a la familia de las ADAMTS y ha sido
denominada ADAMTS-13 La secuencia fue depositada en
el banco de datos EMBL con el número de acceso AJ305314). Tanto el
ADN aislado como el polipéptido codificado, representados en SEQ ID
NO:1, como secuencias parciales obtenidas de ambos, pueden
sintetizarse químicamente también.
El segundo objeto de la invención es analizar la
expresión en tejidos humanos del gen de la
ADAMTS-13. Con este fin, tres membranas conteniendo
ARN poliadenilado procedente de múltiples tejidos humanos adultos
(leucocitos, colon, intestino delgado, ovario, testículo, próstata,
timo, bazo, páncreas, riñón, músculo esquelético, hígado, pulmón,
placenta, cerebro y corazón) y fetales (cerebro, pulmón, hígado y
riñón) se hibridaron con una sonda específica de
ADAMTS-13 (276 pb, correspondiente a la región
comprendida entre los aminoácidos 81 a 172) marcada
radiactivamente. Tras una prehibridación a 42ºC durante tres horas
en formamida al 40%, 5x PBS/EDTA (1x=NaCl 150 mM, NaH_{2}PO_{4}
10 mM, EDTA 1mM, pH 7,4), 10x disolución de Denhardt (lx= Albúmina
de suero bovino, 0,02%, polivinilpirrolidona, 0,02%, ficoll, 0,02%),
SDS 2% y DNA de esperma de salmón 100 mg/ml, se añadió la sonda y
se hibridó durante 20 horas en las mismas condiciones. Los filtros
se lavaron con lx SSC (NaCl 150 mM, citrato sódico 15 mM, pH 7,0)
conteniendo SDS al 0,1% durante 2 horas a 50ºC, y finalmente se
expusieron a autorradiografía (Fig. 1). Como puede observarse en la
figura 1, tras hibridación con la sonda de
ADAMTS-13, se detectó un ARN mensajero de
aproximadamente 4.5 en hígado, tanto fetal como adulto, y un
segundo transcrito de 2.4 kilobases mayoritariamente en hígado
fetal, aunque su expresión también se localiza en otros tejidos como
riñón y pulmón fetales, placenta y músculo de tejidos adultos, y en
diversos tipos celulares incluyendo células endoteliales.
El tercer objeto de la invención consistió en el
estudio de la expresión del gen de la ADAMTS-13 en
muestras obtenidas de carcinomas humanos. Estos estudios se
llevaron a cabo mediante análisis Northern utilizando ARN total
extraido de diversas líneas tumorales humanas. Las correspondientes
membranas se hibridaron con una sonda específica de
ADAMTS-13 (276 pb) marcada radiactivamente
utilizando las mismas condiciones que las descritas para el análisis
de expresión de ADAMTS-13 en tejidos normales. Como
puede observarse en la figura 2, tras hibridación con la sonda de
ADAMTS-13, se detectó un ARN mensajero de
aproximadamente 2.4 kilobases en algunas líneas tumorales como las
denominadas SW480 y G361 derivadas de carcinoma de colon y de
melanoma maligno humanos respectivamente. Estos resultados
demuestran que que la ADAMTS-13 se produce en
carcinomas derivados de tejidos en los que en condiciones normales
no se expresa dicho gen. Estos resultados confirman la propuesta de
que la ADAMTS-13, a través de posibles funciones
como proteasa, y/o como molécula reguladora de procesos de adhesión
celular, hemostasis y angiogénesis, puede también asociarse a
patologías que implican destrucción tisular como el cáncer.
Figura 1. Análisis Northern de la expresión del
gen ADAMTS-13 en tejidos humanos adultos y fetales.
Dos microgramos de ARN poliadenilado de los tejidos indicados se
hibridaron con un fragmento del ADNc de ADAMTS-13.
El origen del ARN de los distintos tejidos, así como el tamaño del
los distintos ARNs utiizados como marcadores quedan indicados. Las
membranas se hibridaron con una sonda de actina para asegurar la
igualdad en la cantidad de ARN cargado en las distintas calles.
Figura 2. Análisis Northern de la expresión del
gen ADAMTS-13 en líneas tumorales humanas. 20
microgramos de ARN total de las líneas tumorales indicadas se
hibridaron con un fragmento del ADNc de ADAMTS-13. A
la derecha se indica el tamaño de los ARNs utilizados como
marcadores.
INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.800000\baselineskip
- SOLICITANTE:
\vskip0.500000\baselineskip
- NOMBRE: Universidad de Oviedo
\vskip0.500000\baselineskip
- CALLE: San Francisco, 3
\vskip0.500000\baselineskip
- CIUDAD: Oviedo
\vskip0.500000\baselineskip
- PAÍS: España
\vskip0.500000\baselineskip
- CODIGO PÓSTAL: 33003
\vskip0.500000\baselineskip
- TELÉFONO: 34 (9)8 510 4058
\vskip0.500000\baselineskip
- FACSÍMIL: 34 (9)8 522 7126
\vskip0.800000\baselineskip
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Procedimiento de identificación de la proteína humana ADAMTS-13
\vskip0.800000\baselineskip
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.500000\baselineskip
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.500000\baselineskip
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.500000\baselineskip
- SISTEMA OPERATIVO: Windows 97
\vskip0.500000\baselineskip
- SOPORTE LÓGICO: Microsoft Word 7.0
\vskip0.800000\baselineskip
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE LA SOLICITUD:
\vskip0.800000\baselineskip
- DATOS DE LA SOLICITUD ANTERIOR
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE LA SOLICITUD:
\vskip0.500000\baselineskip
- FECHA DE PRESENTACIÓN:
INFORMACIÓN CONCERNIENTE A SEQ ID NO: 1
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.500000\baselineskip
- LONGITUD: 4076
\vskip0.500000\baselineskip
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.500000\baselineskip
- NÚMERO DE HEBRAS: doble
\vskip0.500000\baselineskip
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.800000\baselineskip
- TIPO DE MOLÉCULA: ADNc a ARNm
\vskip0.800000\baselineskip
- FUENTE DE ORIGEN:
\vskip0.500000\baselineskip
- ORGANISMO: Homo Sapiens
\vskip0.500000\baselineskip
- TIPO DE CELULA:
\vskip0.800000\baselineskip
- FUENTE INMEDIATA:
\vskip0.500000\baselineskip
- GENOTECA: hígado fetal
\vskip0.500000\baselineskip
- CLON:
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- NOMBRE/CLAVE: codón de iniciación
\vskip0.500000\baselineskip
- LOCALIZACIÓN: 21..24
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- NOMBRE/CLAVE: secuencia codificante
\vskip0.500000\baselineskip
- LOCALIZACIÓN: 21..4040
\vskip0.800000\baselineskip
- CARACTERÍSTICA:
\vskip0.500000\baselineskip
- NOMBRE/CLAVE: codón de parada
\vskip0.500000\baselineskip
- LOCALIZACIÓN: 4041..4043
\vskip0.800000\baselineskip
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEQ ID NO : 1 (Depositada en el GeneBank-Database
\vskip0.800000\baselineskip
- el 6 de Febrero de 2001, con número de acceso AJ305314)
Para la secuencia descrita, se han
encontrado varios transcritos alternativos como el que presenta la
inserción de 93 nucleótidos en la posición
842
que se traduciría a una proteína de
1371 residuos. También se ha determinado la existencia de
transcritos que se traducirían a proteínas truncadas por la
presencia de un codón de terminación (TGA) en posición
843..84.
Claims (9)
1. Procedimiento de identificación de la proteína
humana ADAMTS-13 caracterizado porque
comprende las siguientes etapas:
- a)
- Comparar la secuencia de nucleótidos de regiones conservadas en proteínas ADAMTS con las secuencias parciales de nucleótidos presentes en las bases de datos de genes expresados.
- b)
- Identificar fragmentos homólogos y amplificarlos mediante PCR de RNA total de tejidos humanos en los que se puedan expresar dichas secuencias génicas.
- c)
- Utilizar los fragmentos amplificados como sondas para hibridar genotecas de ADNc humano o como moldes informativos para extender la secuencia hacia los extremos 5' o 3'.
- d)
- Aislar los clones de ADNc obtenidos y determinar su secuencia completa de nucleótidos.
2. Procedimiento de identificación de acuerdo con
la reivindicación 1 caracterizado porque la secuencia génica
identificada codifica una proteína humana denominada
ADAMTS-13.
3. Procedimiento de identificación de acuerdo con
cualquiera de las reivindicaciones anteriores caracterizado
porque la secuencia génica identificada y su secuencia de
aminoácidos deducida son
\hbox{SEQ ID NO :1}.
4. Secuencia génica de SEQ ID NO :1 y sus
polimorfismos, transcritos alternativos, mutaciones, derivados o
secuencias parciales, que codifiquen un enzima con actividad
proteolítica o de regulación de procesos de adhesión celular,
homeostasis y angiogénesis.
5. Utilización de la secuencia SEQ ID NO :1 en el
diseño de inhibidores de la actividad de la
\hbox{ADAMTS-13}.
6. Utilización de la secuencia SEQ ID NO :1 en la
producción de proteínas recombinantes o sintéticas.
7. Utilización de la secuencia SEQ ID NO :1 en la
producción de anticuerpos.
8. Utilización de la secuencia SEQ ID NO :1 en la
producción de sistemas de detección de proteínas con alguna de las
actividades descritas para las ADAMTS-s y/o de los
genes que codifican para las mismas.
9. Utilización de la secuencia SEQ ID NO : 1 en
la producción de composiciones activas en el tratamiento de
procesos patológicos mediados por
\hbox{ADAMTS- s}, y/o por genes que codifican para las mismas.
l0. Secuencia de aminoácidos completa o partes de
la misma, reflejadas en
\hbox{SEQ ID NO:1}.
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AU1305501A (en) * | 1999-11-11 | 2001-06-06 | Kazusa Dna Research Institute | Novel metalloprotease having aggrecanase activity |
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