ES2210492T3 - Nuevas cepas de levadura sensibles al frio. - Google Patents
Nuevas cepas de levadura sensibles al frio.Info
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Abstract
LA INVENCION SE REFIERE A UNA CEPA DE LEVADURA DE PANIFICACION. SE CARACTERIZA POR QUE PERMITE OBTENER LEVADURA FRESCA DE PANIFICACION EN UNA CANTIDAD DE AL MENOS 100 ML EN 2 HORAS A 30 (GRADOS) C EN LA PRUEBA A 1 , CON PREFERENCIA 100 ML POR LO MENOS, Y MEJOR AUN 150 ML POR LO MENOS; Y POR QUE OBEDECE A LA RELACION SIGUIENTE: LIBERACION DE CO 2 EN 48 HORAS A 8 (GRADOS) C EN LA PRUEBA A 1 /LIBERACION CO 2 EN 2 HORAS A 30 (GRADOS) C EN LA PRUEBA A 1 INFERIOR AL 45 %, PREFERENTEMENTE INFERIOR AL 40 % Y PREFERIBLEMENTE AUN INFERIOR AL 30 %. SE REFIERE ASIMISMO A LOS PROCEDIMIENTOS DE UTILIZACION DE DICHA CEPA EN PANIFICACION.
Description
Nuevas cepas de levadura sensibles al frío.
La presente invención tiene por objeto nuevas
cepas de levaduras sensibles al frío y los procedimientos de
utilización de dichas cepas en panificación.
Los mutantes de Saccharomyces cerevisiae
sensibles al frío (en inglés "cold sensitive"), es decir los
mutantes sensibles a temperaturas bajas positivas comprendidas entre
0 y 15ºC, están extensamente descritos desde hace tiempo en la
bibliografía científica. Los puntos de mutación correspondientes son
diversos y se pueden obtener numerosos fenotipos diferentes. La
mutación puede afectar el crecimiento en frío, la fermentación en
frío o ambos, esta ausencia de crecimiento y/o de fermentación puede
ser diferente según los azúcares presentes, y puede ser o no
reversible, es decir desaparecer o no desaparecer cuando la
temperatura aumenta. El empleo en panificación de mutantes, cuya
fermentación de azúcares de las pastas está limitada en frío pero
restablecida al menos a 20ºC, se ha estudiado esencialmente con
objeto de obtener pastas para croissants o para panaderías, o
también pastas para bases de pizza destinadas a ser preparadas por
el ama de casa como producto fresco, es decir después de
almacenamiento a temperaturas refrigeradas, en principio a +4ºC,
pero en la práctica comprendidas entre 0 y +12ºC o más, en el
circuito de distribución, y a continuación hasta su preparación.
Preferentemente estas pastas refrigeradas destinadas al ama de casa
están listas para cocer. Se puede citar a este respecto las dos
solicitudes de patente europea EP 487878 y EP 663441 y las dos
solicitudes de patente internacionales WO 93/01724 y WO
94/19955.
En los dos primeros documentos citados, los
documentos EP 487878 y EP 663441, en los que se ha puesto un gran
cuidado en el bloqueo de la fermentación de la maltosa,
prácticamente la totalidad de las mediciones de desprendimiento de
CO_{2} a diferentes temperaturas en función del tiempo se efectúan
en el medio sintético con maltosa en el que la maltosa es el único
azúcar fermentable. La aplicación principal descrita es una pasta
para pizza que se puede conservar a temperaturas refrigeradas, y que
a causa de esta conservación está lista para ser cocida por el ama
de casa.
En las solicitudes de patente internacionales WO
93/01724 y WO 94/19955, se describen numerosos medios para obtener
pastas destinadas al ama de casa y que se conservan mucho tiempo a
baja temperatura. El empleo de mutantes denominados lts (low
temperature sensitive: sensibles a baja temperatura) disponibles en
los centros de colecciones universitarias como el Yeast Genetic
Stock Center del laboratorio Donner en el Departamento de Biología
celular y molecular de la Universidad de California en Berkeley es
una de las opciones estudiadas, siendo la solución preferida al
parecer el empleo de cepas incapaces de fermentar la glucosa, pero
pudiendo fermentar bien la fructosa o la galactosa, estando presente
el azúcar destinado a ser fermentado exactamente en la cantidad
necesaria para asegurar el levantamiento deseado de la pasta.
La solicitud de patente europea EP 667099
describe la obtención y el empleo en panificación de un mutante
sensible al frío obtenido a partir de una cepa comercial de levadura
clásica de panadería para pastas azucaradas, es decir de una cepa
lenta no adaptada a la maltosa. Se puede citar igualmente de memoria
la solicitud de patente EP 556905 que se limita a describir
diferentes protocolos operatorios susceptibles de permitir en teoría
la obtención de mutantes sensibles al frío.
La solicitud de patente europea
EP-A-0 818 535, considerada
comprendida en el estado de la técnica en virtud del artículo
54(3) CPE, describe un gen correspondiente al gen YLR087c de
Saccharomyces cerevisiae que codifica una proteína que es
capaz de complementar la mutación correspondiente a una fermentación
de levaduras sensible a las bajas temperaturas, de levaduras
construidas con una inactivación de este gen, así como de las pastas
realizadas con dichas levaduras.
Esta abundante bibliografía ha dado lugar a muy
pocas aplicaciones prácticas. Se pueden citar solamente dos
ejemplos:
- -
- la comercialización en Europa de una pasta para pizza que se conserva mucho tiempo en frío y está lista para cocer después de esta conservación en frío;
- -
- la comercialización en Japón a un precio muy elevado y de forma bastante limitada de una levadura para pastas azucaradas cuya actividad fermentadora se ralentiza a baja temperatura.
Se puede observar que la fabricación de la pasta
para pizza es una fabricación para la que se han deseado
generalmente levaduras poco activas desde el punto de vista del
desprendimiento de gases, presentando la levadura al principio un
papel de aportación de aromas. Se puede observar que la cepa
comercializada en Japón es una cepa lenta no adaptada a la maltosa,
mientras que las cepas más utilizadas para la producción de
levaduras de panificación en el mundo son las cepas rápidas
adaptadas a la maltosa.
La invención tiene por objeto nuevas cepas
obtenidas por procedimientos clásicos de mutación y que presentan
avances con relación al estado de la técnica, las levaduras de
panificación frescas y secas obtenidas con estas cepas, la
aplicación de estas cepas en los diferentes procedimientos de
fabricación de panes o de otros productos de panificación,
principalmente de panes de tipo francés.
La invención tiene por objeto igualmente las
nuevas cepas obtenidas por mutagénesis dirigida, efectuada por
biología molecular, que consiste en reproducir específicamente en
las cepas industriales de las levaduras de panificación, o en los
haploices de partida que hayan servido para la construcción de
dichas cepas industriales, las mutaciones monogénicas o no, que
proporcionan el fenotipo buscado en las cepas seleccionadas después
del tratamiento de mutación clásico, por ejemplo, a los agentes
químicos. Una variante, según la invención, de la construcción de
cepas que tienen la fermentación bloqueada a baja temperatura y
restablecida por encima de 20ºC, es la transformación de las cepas
industriales de levadura de panificación con un gen seleccionado
para que tenga una acción directa o indirecta sobre la fermentación
de los azúcares y cuya expresión está condicionada por la
temperatura.
La invención tiene por objeto principalmente una
nueva cepa de levadura de panificación que proporciona levaduras
frescas o secas que pueden ser calificadas como levaduras rápidas a
30ºC sobre la pasta sin adición de azúcar, es decir levaduras
frescas que dan por lo menos 100 ml de CO_{2} en la prueba A_{1}
en 2 horas a 30ºC, preferentemente al menos 110 ml de CO_{2} y
preferentemente aún al menos150 ml. Estas nuevas levaduras frescas y
secas obedecen además a la relación siguiente:
\frac{desprendimiento \ de \
CO_{2} \ en \ 48 \ horas \ a \ 8^{o}C \ en \ la \ prueba \
A_{1}}{desprendimiento \ de \ CO_{2} \ en \ 2 \ horas \ a \ 30^{o}C
\ en \ la \ prueba \ A_{1}}
=
inferior al 45% preferentemente inferior a 40% y
aún preferentemente inferior al 30%. Preferentemente, estas nuevas
levaduras frescas y secas obedecen a los mismos porcentajes, si esta
relación se mide con la prueba A_{5} y preferentemente con esta
prueba A_{5} esta relación será inferior o igual al
20%.
La invención tiene por objeto igualmente la
utilización de nuevas cepas obtenidas en los procedimientos de
panificación retardada de producción de panes, principalmente de
panes de tipo francés o de panes con bajo índice de azúcar, es decir
con menos del 5% de azúcar.
Un procedimiento de panificación retardada se
define como cualquier procedimiento en que transcurran más de 6
horas entre el amasado y la cocción y generalmente más de 12 horas.
Principalmente, la utilización de levaduras frescas o secas
obtenidas con una cepa de levadura de panificación sensible al frío
aporta un avance importante en todos los procedimientos de
panificación retardada como los procedimientos de crecimiento lento
o de crecimiento bloqueado definido más adelante; esta utilización
permite conducir con toda seguridad pastas que quedan listas para
cocer durante un periodo de al menos 4 horas y preferentemente de al
menos 8 horas, proporcionando los productos cocidos sin
defectos.
La invención, por último, tiene por objeto
numerosos procedimientos de panificación, como los procedimientos de
elaboración de levaduras o de utilización de pastas a granel,
basadas en el empleo de levaduras de panificación sensibles al
frío.
Las pruebas utilizadas por la solicitante para
caracterizar dichas levaduras se realizan con la ayuda del
fermentómetro de Burrows y Harrison descrito en el "Journal of
the Institute of Brewing", vol. LXV, nº 1,
enero-febrero 1959 y se definen exactamente de la
manera siguiente:
Prueba
A_{1}
A 20 g de harina incubada a la temperatura
seleccionada para la medición, se añade un peso de levadura
comprimida correspondiente a 160 mg de materias secas, estando
retardada esta levadura en 15 ml de agua que contiene 27 g de NaCl
por litro y 4 g de (NH_{4})_{2}SO_{4} por litro; se
amasa con ayuda de una espátula durante 40 segundos, para obtener
una pasta que se coloca al baño-maría controlada a
la temperatura seleccionada; trece minutos después del comienzo del
amasado, se cierra herméticamente el recipiente que contiene la
pasta; se mide la cantidad total de gas producido después de 60,
después 120 minutos o varias horas; esta cantidad se expresa en ml a
20ºC y a 760 mm de Hg.
Para todas las levaduras susceptibles de dar en
120 minutos un desprendimiento de gases igual o superior a 150 ml de
CO_{2}, la cantidad de azúcares fermentables aportada únicamente
por la harina es limitante; por consiguiente, la prueba se modifica
de la forma siguiente: se añade un peso de levadura correspondiente
a 106 mg de materias secas de levadura, en lugar de 160 mg, y la
lectura de la cantidad de gas producido se multiplica, por convenio,
por 1,5.
Prueba
A'_{1}
Idéntica a la prueba A_{1}, pero antes del
amasado, se rehidratan en 15 minutos los 160 mg de materias secas de
levadura que se presentan bajo la forma de levadura seca activa en
agua destilada, a 38ºC, a este efecto se utiliza el 40% del volumen
de agua de hidratación empleada; el complemento en agua, añadido de
405 mg de NaCl, se añade al final de los 15 minutos de
rehidratación.
Prueba
A_{3}
Prueba idéntica a la prueba A_{1}, pero se
añade a la harina 2 g de sacarosa; la cantidad total de gas
producido se mide después de 60, 120 minutos o varias horas.
Prueba
A'_{3}
Prueba idéntica a la prueba A'_{1}, pero se
añade a la harina 2 g de sacarosa; la cantidad total de gas
producido se mide después de 60 y 120 minutos o varias horas.
Prueba
A_{5}
Prueba idéntica a la prueba A_{1}, pero se
añade a la harina 4 g de sacarosa; la cantidad total de gas
producido se mide después de 60 y 120 minutos o varias horas.
Prueba
A'_{5}
Prueba idéntica a la prueba A'_{1}, pero se
añade a la harina 4 g de sacarosa; la cantidad total de gas
producido se mide después de 60 y 120 minutos o varias horas.
Prueba
A_{6}
A 25 g de harina incubada a 30ºC, se añade 6,5 g
de azúcar cristal y un peso de levadura comprimida correspondiente a
320 mg de materias secas, a continuación se procede como para la
prueba A_{1} y se mide la cantidad total de gas producido después
de 60 y 120 minutos o varias horas.
Prueba
A'_{6}
Prueba idéntica a la prueba A_{6}, procediendo
para rehidratar los 320 mg de materias secas de levadura en forma de
levadura seca activa como en la prueba A'_{1}.
Los medios de cultivo utilizados son los
siguientes:
| YPG | 20 g/l de glucosa, 20 g/l de bactopectona, 10 g/l de extracto de levadura. |
| YPM | 20 g/l de maltosa, 20 g/l de bactopectona, 10 g/l de extracto de levadura. |
| YPM/G | 20 g/l de maltosa, 2 g/l de glucosa,20 g/l de bactopectona, 10 g/l de extracto de levadura. |
| YEG-Agar | 20 g/l de glucosa, 5 g/l de extracto de levadura, 30 g/l de agar. |
Siendo así, para construir las nuevas cepas que
conforman la invención, se procede de la forma siguiente.
En una primera etapa se seleccionan las cepas
paternas que serán sometidas al tratamiento de mutación. Se
seleccionan, preferentemente, cepas ya conocidas para ser utilizadas
industrialmente para la producción de levaduras de panificación,
teniendo estas cepas ya las propiedades de base indispensables; la
mayor parte de estas cepas se pueden obtener en los centros de
colección internacionales y principalmente en el ATCC (American Type
Culture Collection), en donde están depositadas. Se pueden aislar
igualmente a partir de las levaduras de panificación frescas o secas
del comercio.
- Se
- pueden clasificar en tres grandes grupos:
- -
- las cepas rápidas sobre pasta sin azúcar, es decir bien adaptadas a la maltosa que presentan actividades de maltosa permeasa y maltasa, constitutivas y no reprimidas por la glucosa;
\newpage
- -
- las cepas lentas bien adaptadas a las pastas azucaradas, cepas osmotolerantes que presentan actividades débiles, incluso muy débiles de maltosa permeasa y/o maltasa después del cultivo en glucosa;
- -
- las cepas construidas para reunir las propiedades de los dos grupos anteriores, como las descritas en la solicitud de patente europea nº 92 401168.7 del 23-04-1992 publicada bajo el nº 0 511 108.
Se seleccionan como cepas paternas, las mejores
cepas de levaduras de panadería conocidas hasta entonces en estos
diferentes grupos. Una cepa será en general tanto más activa a baja
temperatura, cuanto que sea menos activa a 30ºC, temperatura
utilizada habitualmente para las mediciones de actividad
fermentadora. Si en la aplicación final no se tiene necesidad de una
actividad fermentadora elevada, existe interés a partir de cepas con
poco rendimiento, no adaptadas a la maltosa en investigar después de
la mutagénesis los mutantes cuya fermentación será ralentizada a
baja temperatura con relación a la cepa paterna. Es por esto que la
técnica anterior enseña en general que no hay que partir de cepas
rápidas adaptadas a la maltosa. Sin embargo, dichas cepas no pueden
interesar más que a segmentos muy específicos. Según la presente
invención, las cepas paternas sometidas al tratamiento de
mutagénesis serán preferentemente cepas bien adaptadas a la maltosa.
Estas cepas, diploides o poliploides, serán en general cepas
poliploides.
Las cepas diploides o poliploides seleccionadas
de este modo se someten entonces a un tratamiento de mutagénesis
clásica, por ejemplo con ayuda de agentes químicos. Los mutantes
obtenidos se incuban en el medio clásico de glucosa, como el medio
YPG, en condiciones aerobias (frascos agitados), durante algunas
horas a 30ºC, sometidas después a una primera selección por cultivos
estrictamente anaerobios en medio glucosado con enriquecimiento con
nistatina o cualquier agente conocido que destruya las células con
actividad metabólica, siendo efectuados estos cultivos estrictamente
anaerobios a una temperatura seleccionada entre 10ºC y 15ºC. Se
extiende a continuación la suspensión celular resultante del
enriquecimiento con nistatina o cualquier agente similar, a una
dilución apropiada para obtener colonias aisladas de mutantes que no
han sido destruidas porque no tienen actividad metabólica a la
temperatura seleccionada entre 10ºC y 15ºC. Agentes equivalentes a
la nistidina son por ejemplo los derivados del tritio descritos por
LITTLEWOOD, B.S. y DAVIES, J.E. en el artículo "Enrichment for
temperature sensitive and auxotrophic mutants in Saccharomyces
cerevisiae by Tritium suicide", Mutation Research
1973, 17, 315-322.
Las cepas diploides o poliploides obtenidas por
el procedimiento clásico de mutagénesis descrito anteriormente se
seleccionan por medición de su consumo de diferentes azúcares en
anaerobiosis a baja temperatura.
Los diferentes azúcares que intervienen en la
fermentación del pan se describen a continuación. En las pastas
constituídas únicamente de harina, agua, sal y levadura
(panificación de tipo francés), se encuentra en general:
- -
- menos del 0,1% en peso con relación a la harina de hexosas sencillas fermentables directamente, esencialmente en forma de glucosa;
- -
- un poco menos de alrededor del 1% de hexosas sencillas (glucosa y fructosa) liberadas por la acción de la invertasa de la levadura;
- -
- algunos porcentajes de maltosa (del orden del 2 al 3%) provienen de la acción de las amilasas presentes en la pasta. La maltosa es el azúcar principal y debe ser fermentada al mismo tiempo, o al menos sin retraso después del consumo de fructosa y de glucosa liberado por la invertasa de las levaduras. Se observará que a menos que se parta de una cepa de levadura sin invertasa, se tendrá siempre, en el momento del arranque de la fermentación del pan, glucosa y fructosa presentes a la vez que la maltosa. En las pastas en las que hay adición de azúcares, ésta es bien de sacarosa, glucosa o incluso de isoglucosa (mezcla de glucosa y de fructosa). La invertasa de las levaduras invierte la sacarosa en glucosa y fructosa.
Según las pruebas de selección utilizadas para
realizar la presente invención, se prueba una biomasa conocida de
mutantes diploides o poliploides seleccionados como se describió
anteriormente, midiendo el consumo de esta biomasa de glucosa (medio
glucosado) o de maltosa y glucosa (medio maltosado con un poco de
glucosa) o incluso de maltosa sola en anaerobiosis a una temperatura
que implica la sensibilización al frío, preferentemente, entre 8 y
15ºC, durante un tiempo tal que alrededor del 90% de los azúcares
presentes en el medio son consumidos por la cepa paterna de partida.
Los azúcares residuales son dosificados por el reactivo con
dinitrosalicilato de sodio.
Esta prueba de selección se puede realizar
ventajosamente de la forma siguiente. Los mutantes seleccionados
como se describió anteriormente, después del cultivo en condiciones
que destruyen las células que tienen metabolismo activo en
anaerobiosis a una temperatura seleccionada entre 10 y 15ºC, se
cultivan en el medio YEG-AGAR durante 24 horas. Las
biomasas obtenidas se recogen de forma que se obtiene una suspensión
en agua destilada de densidad óptica constante, por ejemplo 15, lo
que corresponde a alrededor de 7 mg de materias secas de levadura de
biomasa por mililitro. Se incuban 10 microlitros de esta suspensión
de levadura en presencia de 100 microlitros de medio de cultivo en
placas de microvaloración, 1 placa de microvaloración que permite
hacer la prueba en al menos 90 mutantes a la vez. Las placas de
microvaloración se incuban a continuación a la temperatura
seleccionada, durante un tiempo tal que el o los testigos consumen
el 90% de los azúcares testigo. Los azúcares presentes se dosifican
mediante la adición de 100 \mul por pocillo o cúpulas de reactivo
dinitrosalicilato de sodio al 1% después de la calefacción de la
placa de microvaloración a 55ºC durante 30 min. El consumo de los
azúcares de partida se puede medir:
\newpage
- -
- ya sea por medición directa de la absorbencia a 550 nanómetros por un lector de placas de microvaloración tras la transferencia del medio de reacción desprovisto de levadura a otra placa de microfiltración,
- -
- ya sea por una medición en el espectrofotómetro a 550 nm tras la dilución al segundo medio de reacción.
En el marco de esta medición, se seleccionan los
mutantes que en el medio YPM/G consumen menos del 60% de azúcar
consumido por el testigo.
Estas pruebas se pueden realizar igualmente en el
medio YPG o en el medio YPM.
Este procedimiento de selección ha permitido
obtener entre otras las 3 cepas siguientes que han sido depositadas
en el Centro Nacional de Cultivo de Microorganismos (CNCM),
Instituto Pasteur Paris:
- -
- la cepa S47-12b1 depositada en el CNCM con el nº I-1645, el 05-12-1995,
- -
- la cepa L30-13 depositada en el CNCM con el nº I-1647, el 05-12-1995,
- -
- la cepa L30-91 depositada en el CNCM con el nº I-1646, el 05-12-1995.
La cepa S47-12b1 es un mutante de
una cepa de levadura rápida, adaptada a la maltosa, utilizada
industrialmente para la producción de levaduras de panificación.
Esta cepa S47-12b1 permite
obtener levaduras frescas prensadas comparables a las levaduras
frescas prensadas de tipo rápido del comercio cuando se utiliza en
condiciones normales. Permite obtener levaduras frescas prensadas
que, cuando se cultivan para contener el 7% de nitrógeno en materias
secas, dan por lo menos 100 ml de CO_{2} en la prueba A_{1} en 2
horas a 30ºC y preferentemente por lo menos 110 ml, y que cuando se
cultivan para contener el 8,2% en materias secas, dan por lo menos
150 ml de CO_{2} en la prueba A_{1} en 2 horas a 30ºC, y
preferentemente por lo menos 160 ml de CO_{2}. Esta cepa permite
obtener levaduras secas que dan por lo menos 100 ml de CO_{2} en
la prueba A_{1} en 2 horas a 30ºC. Estas levaduras frescas tienen
además la propiedad de respetar las relaciones:
\frac{desprendimiento \ de \
CO_{2} \ en \ 48 \ horas \ a \ 8^{o}C \ en \ la \ prueba \
A_{1}}{desprendimiento \ de \ CO_{2} \ en \ 2 \ horas \ a \ 30^{o}C
\ en \ la \ prueba \ A_{1}} del orden del
40%
\frac{desprendimiento \ de \
CO_{2} \ en \ 2 \ horas \ a \ 30^{o}C \ en \ la \ prueba \
A_{5}}{desprendimiento \ de \ CO_{2} \ en \ 48 \ horas \ a \ 8^{o}C
\ en \ la \ prueba \ A_{5}} del orden del
20%
mientras que estas relaciones son más del 100%
para las levaduras frescas obtenidas con la cepa paterna, levaduras
frescas que están permanentemente disponibles en el comercio, de
manera muy corriente y habitual en
Europa.
Estas relaciones las cumplen igualmente las
levaduras secas obtenidas con esta cepa.
Las cepas L30-13 y
L-30-91 depositadas en en CNCM
respectivamente bajo los nº I-1647 e
I-1646 son mutantes de una cepa osmotolerante
utilizada industrialmente para la producción de levaduras de
panificación para pastas azucaradas, comercializadas de manera
habitual en el mercado europeo. Estas dos cepas permiten obtener
levaduras prensadas frescas o levaduras secas comparables a las
levaduras comerciales obtenidas con la cepa paterna. Estas levaduras
tienen la propiedad de respetar las relaciones siguientes:
| Relación entre 48 horas de fermentación a 8^{o}C/2 horas de fermentación a 30ºC expresada en % | ||
| prueba A_{1} | prueba A_{5} | |
| L30-13 | 20% | 3% |
| L30-91 | 5% | 1% |
mientras que estas dos relaciones son más del
100% para levaduras frescas de panificación obtenidas con la cepa
paterna de partida.
La cepa S47-12b1 es un mutante de
cepa rápida que ha mantenido por encima de 20ºC, todas las
propiedades de la cepa "comercial" de que esta provista. Es
particularmente interesante en panificación retardada de tipo
francés, es decir en panificación en la que no hay azúcar o se ha
añadido poco azúcar a la pasta.
Esta cepa es particularmente interesante para ser
utilizada en un procedimiento de crecimiento controlado clásico en
el que la fermentación se bloquea después de la elaboración de las
pastas y antes de la última fermentación o capa de acabado. Este
bloqueo de la fermentación se puede hacer a temperatura más elevada
que habitualmente, hasta por lo menos 8ºC ó 10ºC o a la misma
temperatura que habitualmente (entre-2ºC y +4ºC)
pero durante periodos más prolongados que habitualmente. Es asimismo
particularmente interesante en los procedimientos denominados de
crecimiento bloqueado o de crecimiento lento. El crecimiento
bloqueado es un procedimiento en el que la fermentación se bloquea
después de la capa de acabado, inmediatamente antes de ponerlo en el
horno. La cepa S47-12b1 permite bloqueos de 4 a 24
horas a alrededor de 8ºC (es decir entre 4 y 10ºC). El crecimiento
lento es un procedimiento en el que el apresto que es muy lento se
realiza a unas temperaturas entre 10 y 18ºC, o sea alrededor de 15ºC
durante 15 a 24 horas. Estos dos procedimientos son interesantes
pues permiten un intervalo de puesta en el horno muy amplio, para
extender la cocción en el tiempo y ofrecer permanentemente panes
calientes que acaban de ser cocidos, sin todos los inconvenientes de
un recurso a la congelación.
Las cepas L30-13 y
L30-91 son particularmente interesantes para las
panificaciones de pastas azucaradas. Estas dos cepas permiten
realizar todos los esquemas de panificación retardada de las pastas
azucaradas con las ventajas relacionadas con su fenotipo de
sensibilidad en frío. La cepa
L-30-91 es particularmente
interesante para todas las pastas destinadas al ama de casa, por el
hecho de su actividad fermentadora extremadamente débil a 8ºC. Estas
dos cepas permiten preparar principalmente pastas para panadería
principalmente de croissants para el ama de casa, pudiendo
conservarse durante 1 mes a 8ºC, siendo cocidas estas pastas tras un
apresto de una noche a 20ºC.
Las levaduras de panificación obtenidas con estas
cepas sensibles al frío son igualmente interesantes para la
realización de trozos de pasta congelados, pues permiten bloquear
más fácilmente cualquier arranque de la fermentación en el momento
del amasado, de la división y de la elaboración de las pastas,
realizadas a baja temperatura, entendiéndose que es bien conocido
que los metabolitos salidos de la fermentación del pan son tóxicos
para las células de levadura presentes en los trozos de pasta
congelados.
De manera general, las levaduras de panificación
sensibles al frío pueden aportar una ayuda importante al trabajo del
panadero. Pueden permitir obtener piezas de panificación listas para
cocer en 4 a 8 horas. Pueden permitir igualmente el avance o el
desarrollo de nuevos procedimientos en el aspecto de la preparación
de la conservación de pastas o fermentos en masa (es decir a
granel).
Las levaduras de panificación sensibles al frío
permiten realizar en masa pastas o fermentos que pueden, después de
haber sido llevadas a una temperatura por debajo de 10ºC, ser
almacenadas varios días si es necesario después ser transportadas.
Permiten realizar la fermentación previa del pan correspondiente al
fermento y/o la primera fermentación del pan, y de manera
reagrupada, mientras que se trate de operaciones que necesitan poco
tiempo. Estas pastas en masa o a granel se pueden almacenar en cubas
o bandejas en las cámaras frigoríficas o en cubos. Estas
aplicaciones son particularmente interesantes en panificación
francesa, pero no se limitan a esta panificación. Permiten por
ejemplo una fabricación y una distribución en cubos de pastas
amarillas fermentadas como pastas para pancakes o pastas para
blinis que a alrededor de 4ºC pueden ser distribuidas a todos
los puntos de la cocción.
Las levaduras sensibles al frío permiten realizar
fermentos líquidos de tipo poolish, flour brew,
liquid sponge y conservarlos varios días antes de su empleo.
Permiten igualmente de la misma forma realizar fermentos pastosos,
como los fermentos-levaduras, las esponjas. Todos
estos fermentos pueden servir para hacer panes, pero también
brioches, doughnuts,crackers.
Una aplicación particularmente interesante es
realizar con las levaduras sensibles al frío, y preferentemente con
una levadura sensible al frío rápida y adaptada a la maltosa, pastas
completas que hayan sufrido una primera fermentación prolongada (en
términos profesionales un punteado prolongado), para obtener con
estas pastas a continuación en 2 a 3 horas máximo panes muy
aromáticos. Esto permite principalmente volver otra vez al pan
corriente francés (panes obtenidos por amasado únicamente con
harina, agua, levadura y eventualmente fermento, sal, sin ningún
aporte de azúcar o de materias grasas) a procedimientos antiguos con
primeras fermentaciones prolongadas y aprestos cortas. El empleo de
una levadura sensible al frío, y preferentemente una levadura rápida
sensible al frío y adaptada a la maltosa permite tener una masa de
pasta a granel que ha sufrido un punteado prolongado disponible para
las fabricaciones rápidas de panes franceses a la antigua.
Una nueva aplicación de levaduras de panadería
sensibles al frío es su utilización en la regulación por temperatura
del crecimiento de diferentes microorganismos en un fermento ácido
que contiene levaduras y bacterias.
Si el fermento del pan se siembra de forma que
sea un cultivo mixto de un microorganismo sensible al frío con
índice de crecimiento elevado y otro microorganismo psicrófilo, se
puede controlar entonces la proporción de las dos poblaciones
determinando o haciendo variar la temperatura de fermentación.
Se puede orientar de este modo la producción de
biomasa, y por consiguiente los metabolitos producidos por la
biomasa y favorecer o no así la producción de bacterias y por
consiguiente de los ácidos láctico y acético.
Una variante de la construcción de las nuevas
cepas según la invención reside en la construcción de dichas cepas
por técnicos de la biología molecular, como a continuación.
Una primera etapa puede consistir ventajosamente
en poner de manifiesto las diferencias de la síntesis de las
proteínas solubles y/o de las proteínas membranosas de las levaduras
a 10ºC y a 30ºC entre un mutante seleccionado, como sensible al frío
y la cepa paterna. Un mutante seleccionado sensible al frío es un
mutante cuya fermentación está bloqueada o al menos muy ralentizada
a temperaturas iguales o inferiores a 15ºC y es normal por encima de
20ºC, cuando esta fermentación se mide con relación a la cepa
paterna de partida.
Estas comparaciones se pueden hacer por la
técnica de electroforesis bidimensional de las proteínas por
comparación con electroforegramas 2-D por un
programa informático de análisis apropiado, como el programa
informático 2-D Analyzer®, comercializado en Francia
por BIOIMAGE, 777, E. Eisenhower Parkway, Suite 950, Ann Arbor,
Michigan 48108, USA. El objeto de estas comparaciones es el de
descubrir las diferencias importantes en la síntesis de las
proteínas y si estas últimas son identificables a partir de las
codificaciones gen-proteína conocidas, como las
descritas en el artículo "Two-dimensional Protein
Map of Saccharomyces cerivisiae: Construction of a
Gene-Protein Index", que tiene por título
abreviado: "S. cerevisiae 2D protein map", de BOUCHERIE
H. et al., publicado en "Yeast" 1995, 11(7),
601-613. Si la proteína no es conocida, en
determinados casos es posible recogerla sobre el gel de
electroforesis, determinar su secuencia
NH_{2}-terminal y retroceder al gen que se ha
mutado, tanto más cuanto que el genoma del fermento es hoy
prácticamente conocido por completo. El conocimiento del o de los
genes objeto de la mutación, permite entonces por técnicas clásicas
de biología molecular identificar la o las mutaciones clonando el o
los genes mutados e introducir esta mutación en las cepas
industriales.
Una aproximación directa puede efectuarse
igualmente por clonación del gen mutado responsable del fenotipo de
sensibilidad al frío en el mutante que presenta este fenotipo. Los
resultados obtenidos permiten pensar que la mutación responsable del
fenotipo de sensibilidad al frío de mutantes poliploides
S47-12b1, L30-13 y
L-30-91 es alternativamente
dominante y monogénico.
Se construye un banco de ADN genómico de un
mutante de una cepa poliploide industrial, para la cual,
preferentemente, se ha confirmado el carácter dominante y monogénico
de la mutación por las técnicas clásicas de la biología molecular en
un vector centrómero como el vector YCp50, disponible normalmente,
que posee además el marcador URA3. Se transforma a continuación una
cepa de levadura de laboratorio ura3- , no sensible al frío, con
este banco de ADN y se busca, entre los transformadores URA3^{+},
las que han adquirido el carácter de sensibilidad al frío por el
procedimiento de selección que ha conducido a la selección de
mutantes sensibles al frío descrito anteriormente, a saber el
procedimiento consistente en destruir las células que tienen un
metabolismo activo en condiciones anaerobias estrictas a una
temperatura comprendida entre 10 y 15ºC. Es fácil a continuación
volver a aislar el plásmido de un transformador que expresa el
fenotipo de sensibilidad en frío, analizar el fragmento de ADN de
levadura clonado en este plásmido (cartografía de restricción,
secuenciado) para identificar el gen y reintroducir este gen mutado
en una cepa de levadura industrial por las técnicas de integración
por recombinación homóloga en un gen no esencial para el crecimiento
y para la fermentación o en el gen no mutado.
Se pueden emplear otras técnicas de biología
molecular para construir cepas industriales transformadas para
presentar el fenotipo de sensibilidad en frío de los mutantes objeto
de la invención y más especialmente del mutante
S47-12b1, es decir para obtener cepas de levadura
rápida que expresen un fenotipo de sensibilidad al frío.
Una técnica interesante consiste en hacer
esporular cepas industriales, y principalmente cepas de levadura
rápida, y aplicar el tratamiento de mutación y de selección descrito
anteriormente a los segregantes o haploides obtenidos de este modo.
Si después del crecimiento de los segregantes seleccionados para
llevar la mutación buscada, se comprueba que la mutación es
dominante y monogénica, se procede como se describió anteriormente
para los poliploides que llevan una mutación monogénica y dominante.
Si ésta es por el contrario recesiva y monogénica, se procede
entonces como se indica a continuación.
Se aísla, en un primer momento, un clon ura3- del
segragante o haploide que lleva una mutación con sensibilidad al
frío monogénica y recesiva extendiéndola sobre un medio que contiene
5-fluoro-orotato o disgregando sus
alelos URA3 mediante un marcador positivo o incluso combinando estas
dos técnicas. El mutante ura3- es transformado a continuación por un
banco genómico de una cepa salvaje (wt) como por ejemplo el banco de
ADN genómico construido por el vector centrómero YCp50 y vendido por
la ATCC con la referencia 37415. Se busca a continuación, entre los
transformadores URA3^{+} obtenidos, los que han perdido el
fenotipo de sensibilidad al frío, aprovechando su metabolismo mucho
más rápido en condiciones anaerobias a 10ºC que los segragantes
mutados de partida.
La identificación del gen salvaje que complementa
el fenotipo de sensibilidad al frío se realiza por cartografía y
secuenciado. Esta identificación permite aislar fácilmente el alelo
mutado en el segregante que lleva una mutación con sensibilidad al
frío por la técnica de amplificación génica (PCR) o por la técnica
de "gap-filling". El alelo mutado será, por
consiguiente, utilizado para sustituir todas las copias naturales de
este gen, por recombinación homóloga, en la cepa industrial que se
desee hacer sensible al frío.
Esta variante es el procedimiento predilecto
según la invención para obtener mutantes interesantes por
mutagénesis dirigida que consiste en introducir en las cepas
industriales de levaduras de panificación la mutación que confiere
el fenotipo de sensibilidad al frío. Ella ha permitido en el
contexto de un segregante de cepa de levadura rápida industrial,
bien adaptada a la fermentación de la maltosa que el propio
segregante tenga esta propiedad, de poner de manifiesto que una
mutación sobre el gen YLR087c, según el código adoptado en el bando
resultante del secuenciado sistemático del genoma del
Saccharomyces cerevisiae, tal como la sintetizada y
coordinada por el MIPS (Martinsried Institute for Protein
Sequences-Max Planck Institute for
Biochemistry-82152 Martinsried-FRG)
permitía, si todos los genes YLR087c llevan bien la mutación,
obtener cepas industriales con el fenotipo de sensibilidad al frío
en fermentación, cualquiera que sea su contexto genético.
Este resultado es particularmente interesante
para la construcción de cepas industriales de levaduras de
panificación, y de manera general de cepas industriales que conducen
a alimentos o bebidas fermentadas para el hombre, y principalmente
vino o cerveza. Este resultado es independiente del contexto
genético, pues la mutación de este gen YLR087c ha sido identificada
en una fuente bien adaptada a la fermentación de la maltosa y
reintroducida con la obtención del fenotipo en dos cepas
independientes una de la otra y de la cepa de partida. Esta mutación
corresponde a un fenómeno de sensibilidad al frío en la
fermentación, con desaparición total del fenotipo a más de 20ºC. Es
esencial que la mutación haya sido identificada en una cepa
industrial con un fenotipo de sensibilidad al frío en fermentación.
En efecto, se han estudiado las tres mutaciones siguientes,
descritas en la bibliografía como que dan mutantes "cold
sensitive":
- -
- el mutante prp28-1 descrito por STRAUSS, E.J. y GUTHRIE, C. (1991) "Genes and Development" 5, 629-641,
- -
- la disgregación de una parte del gen LTE1 (Low Temperature Essential) descrito por WICKNER, R.B. et al., (1987) Yeast 3, 51-57,
- -
- la mutación dirigida del gen BCY1 descrita por YAMANO, S. et al., (1987) "Mol. Gen. Genet." 210, 413-18.
Los mutantes prp28-1 y
lte-1 han sido obtenidos de los autores citados
anteriormente. La mutación dirigida del gen bcy1 que conduce a un
fenotipo de sensibilidad al frío ha sido reproducida en una cepa de
laboratorio. Aunque estas tres mutaciones conducen a un fenotipo sin
crecimiento a baja temperatura (10ºC) en placa de medio gelatinoso
como la descrita por los autores de estos trabajos, ninguno de estos
tres mutantes presentaba un fenotipo de sensibilidad al frío en
condiciones de fermentación en las pruebas de fermentación de tipo A
descritas. Estas tres mutaciones no tienen pues ningún interés para
obtener levaduras de panificación, de vinicultura o de
cervecería.
La invención tiene por consiguiente por objeto
principalmente:
- -
- el segregador HL13.2.30 depositado en el CNCM con el nº I-1841 que da levaduras bien adaptadas a la maltosa y que presenta un fenotipo de sensibilidad en la fermentación en frío,
- -
- el gen mutado tal como el existente en el plásmido YCp50-10.39mut en la cepa E. coli DH5\alpha depositada en el CNCM con el nº I-1842,
- -
- cualquier cepa de levadura industrial de panificación, de la que todos los genes YLR087c llevan una mutación con codón stop no letal que confiere el fenotipo de fermentación en frío.
Es posible por último obtener cepas industriales,
principalmente cepas rápidas y muy rápidas, que poseen una
sensibilidad al frío tal como la definida en el marco de la presente
invención, haciendo expresar en esta cepa de manera condicional, es
decir únicamente a baja temperatura (0 a 15ºC hasta 20ºC), un gen
cuya expresión tenga como resultado una disminución muy fuerte de la
actividad fermentadora de la cepa referida.
Se han descrito en la bibliografía los genes o
alelos mutados de los genes cuya expresión conduce a una disminución
muy fuerte de la asimilación de los azúcares por la levadura y/o una
importante disminución de su actividad fermentadora. La expresión de
uno de estos genes (o alelos mutados) dependiente de un activador
condicionado por la temperatura que conduce a una fuerte expresión
del gen a baja temperatura y a una expresión casi nula del gen por
encima de 20ºC, como por ejemplo los iniciadores de los genes que
codifican proteínas "cold shock" de los que se han descrito
varios, es un medio de construir directamente una cepa de levadura
sensible al frío, a partir de las cepas industriales más
productivas.
Activadores condicionales son por ejemplo los
activadores del gen TIP1 o de los genes homólogos de TIP1 o sus
alelos mutados, descritos principalmente en el artículo
"Identification of cis-and
trans-acting elemens involved in the expression of
cold shock inducible TIP1 gene of Yeast Saccharomyces
cerevisiae", de MUNOS-DORADO J. et
al., publicado en "Nucleic Acids Research", 1994,
Vol. 22, nº 4, 560-568, o también en el artículo
"Cold shock induction of a family of TIP1 related proteins
associated with the membrane in Saccharomyces cerevisiae",
de KOWALSKI, L. et al., aparecido en "Molecular
Microbiology" 15, nº 2 (Enero 1995), 341-353.
Estos iniciadores condicionales en función de la temperatura, como
los de la familia del iniciador del gen TIP1 pueden también estar
acoplados a un gen que codifica un factor de regulación
transcripcional con una acción de tipo represor, por ejemplo como el
gen MIG1. Este gen MIG1 codifica una proteína en dedos de cinc que
intervienen en la vía principal de represión de la glucosa y bloquea
la transcripción de los genes que tienen en su iniciador una
secuencia de consenso URS (Upstream Regulatory Sequence), como se
describe en el artículo publicado por NEHLIN J.O. y RONNE H.
aparecido en EMBO J. 1990, 9, 2891-2898 y que
tiene por título "Yeast MIG1 repression is related to the
mammalian early growth response and Wilm's tumour finger
proteins". Para completar la construcción, una secuencia de
consenso, reconocida por la proteína codificada por el gen represor
puesto bajo la dependencia de un iniciador condicional, se inserta
en el iniciador de un gen esencial de la fermentación. Por ejemplo,
la secuencia de consenso reconocida por la proteína codificada por
el gen MIG1 descrita en el artículo de NEHLIN et al., citado
anteriormente, está integrada en los iniciadores de todos los alelos
del gen de la piruvato cinasa.
Se puede buscar igualmente una expresión
condicional de un gen esencial en la fermentación de levaduras, como
por ejemplo un gen de la glicolisis como los genes que codifican la
piruvato cinasa o también la piruvato descarboxilasa. Esta expresión
condicional se puede provocar clonando este gen bajo la dependencia
de un iniciador cuya expresión es casi nula por debajo de 15ºC y es
normal a 30ºC. Un procedimiento alternativo interesante para obtener
una expresión condicional de un gen es el descrito en el artículo
"Control of Gene Expression by Artificial Introns in
Saccharomyces cerevisiae", de YOSHIMATSU T. y VAGANA F.,
aparecido en "Science" 1988, 244 (4910),
1346-1348.
Siendo así, la invención se ilustra con los
ejemplos siguientes:
Se seleccionan cepas de levadura de panificación
del comercio, principalmente cepas de levadura prensadas
comercializadas en Europa y más particularmente las cepas utilizadas
para la fabricación de levaduras rápidas prensadas destinadas a
panificaciones de tipo francés, sin azúcar añadido o con poco azúcar
añadido.
Se les somete al tratamiento de mutación
siguiente:
Las células recogidas en fase estacionaria se
mutagenizan mediante etilmetilsulfonato (EMS) para obtener del 10 al
20% de supervivencia. Las células mutagenizadas se regeneran a
continuación mediante un cultivo en medio rico: YPG durante 3 h a
30ºC, después se ponen a incubar en condiciones de fermentación
anaerobia estricta durante 48 h a 10ºC (YPG). Se añade entonces
nistatina o cualquier agente inhibidor de células en división y se
incuba de nuevo 2 h a 10ºC.
El tratamiento después de la mutagénesis de
enriquecimiento se puede repetir ventajosamente de 2 a 3 veces. Se
ajusta la concentración de nistatina para obtener una tasa de
supervivencia del 0,01%. Se extiende la suspensión celular
resultante del enriquecimiento con nistatina a una dilución
apropiada para obtener colonias aisladas de los mutantes
obtenidos.
Se seleccionan los mutantes obtenidos de este
modo midiendo los azúcares consumidos con relación a la cepa de
partida no mutada.
Los mutantes se cultivan en el medio
YEG-AGAR durante 24 horas. Se recogen las levaduras
y se ponen en suspensión las células de levadura en agua destilada,
de manera que esta suspensión tenga una densidad óptica de 15.
Se incuban 10 microlitros de esta suspensión de
levadura en presencia de 100 microlitros de medio de cultivo YPM e
YPM/G en la placa de microvaloración.
Las placas de microvaloración se incuban bien a
30ºC durante 8 horas, o a 10ºC durante 60 horas.
Al final del tiempo de incubación, se bloquea la
fermentación del o de los azúcares con ayuda del reactivo
dinitrosalicilato de sodio, que sirve para dosificar los azúcares
reductores mediante reacción colorimétrica después de la calefacción
de la placa de microfiltración a 55ºC durante 30 minutos.
Se seleccionan los mutantes que por una parte,
después de 60 horas a 10ºC, han fermentado como máximo el 60% de la
mezcla glucosa/maltosa del medio YPG/M y como máximo 30% de la
maltosa del medio YPM con relación a los azúcares fermentados para
la cepa de partida no mutada y que por otra parte a 30ºC en 8 horas
han consumido por lo menos el 90% de azúcares consumidos por la cepa
de partida no mutada.
Esta medida del consumo del azúcar o de los
azúcares a bajas temperaturas permite cuantificar el carácter de
sensibilidad al frío de las cepas y eliminar los mutantes muy poco
sensibles al frío. Una primera eliminación se puede hacer a simple
vista. Las cepas cuya fermentación está ralentizada a 10ºC dan una
coloración marrón oscuro, las cepas mutadas poco sensibles dan una
coloración naranja indicando un índice pequeño de azúcares
reductores residuales. Esta primera selección a primera vista
permite un primer apartado, se completa a continuación con
mediciones del consumo de azúcar.
La medición del consumo de azúcar o de azúcares a
30ºC permite eliminar los mutantes cuya fermentación esté afectada
en su conjunto cualquiera que sea la temperatura.
A continuación, se comprueba mediante pruebas de
cultivos los rendimientos de las cepas seleccionadas de este modo.
Se pueden hacer pruebas anaerobias en serie de laboratorio dando una
recogida suficiente para permitir mediciones de actividad
fermentadora según la serie de pruebas A descritas anteriormente. Se
pueden hacer igualmente cultivos anaerobios en volumen reducido, por
otra parte cada vez más importantes.
Se comprueba que los mutantes son estables y se
pueden multiplicar en condiciones equivalentes y con rendimientos
equivalentes a la cepa no mutada de partida, que es una cepa
utilizada industrialmente para la producción de levaduras de
panificación.
En el marco de este ejemplo, se han seleccionado
principalmente tres cepas:
- -
- la cepa S47-12b1, mutante estable de una cepa de levadura rápida utilizada normalmente en Europa para la producción de levaduras frescas prensadas, este mutante estable S47-12b1 ha sido depositado en el CNCM con el nº I-1645 el 05-12-1995;
- -
- las cepas L30-13 y L30-91, mutantes estables de una cepa de levadura utilizada normalmente en Europa para la producción de levaduras frescas prensadas. Estos mutantes estables han sido depositados en el CNCM, el mutante L30-13 con el nº I-1647, el mutante L30-91 con el nº I-1646, estos dos depósitos se han efectuado el 05-12-1995.
Estas tres cepas han dado los resultados
siguientes en las pruebas de selección de consumo de azúcar 60 h a
10ºC en la placa de microvaloración, siendo realizada la lectura de
la densidad óptica con un lector de placa de marca Metertech
\Sigma960®, Micro Elisa Autoreader en las condiciones descritas a
continuación:
| 60 horas a 10ºC | |||||
| Medio | Cepa comercial | Mutante | Cepa comercial levadura | Mutante | Mutante |
| levadura rápida S47 | S47-12b1 | para pasta azucarada L30 | L30-13 | L30-91 | |
| YP maltosa | |||||
| DO: 2,25 | 0,102 | 2,02 | 0,13 | 1,71 | 2,00 |
| % azúcar | 95,5% | 9,8% | 94% | 24% | 11% |
| consumido | |||||
| YP maltosa/ | |||||
| glucosa | |||||
| DO: 2,63 | 0,135 | 1,19 | 0,21 | 1,13 | 1,70 |
| % azúcar | 95% | 55% | 92% | 57% | 35% |
| consumido |
| 8 horas a 30ºC | |||||
| Medio | Cepa comercial | Mutante | Cepa comercial levadura | Mutante | Mutante |
| levadura rápida S47 | S47-12b1 | para pasta azucarada L30 | L30-13 | L30-91 | |
| YP maltosa | |||||
| DO: 2,25 | 0,15 | 0,18 | 0,183 | 0,22 | 0,25 |
| % azúcar | 93% | 92% | 92% | 91% | 89% |
| consumido | |||||
| YP maltosa/ | |||||
| glucosa | |||||
| DO: 2,63 | 0,12 | 0,155 | 0,17 | 0,205 | 0,23 |
| % azúcar | 95% | 94% | 93% | 92% | 91% |
| consumido |
Se han cultivado los tres mutantes estables
S47-12b1, L30-13 y
L30-91 de la forma siguiente.
Con la excepción del empleo de los procedimientos
y materiales especificados a continuación, se han propagado las
cepas en varias etapas de multiplicación aerobia, la levadura fresca
se ha recogido, lavado, filtrado con la ayuda de los materiales
clásicos empleados en fermentación y según los procedimientos de
fabricación habituales como los materiales y procedimientos
descritos en la obra "Yeast Technology" de Gerald Reed y Henry
J. Peppler (1973), The Avi Publishing Company Inc. o en el capítulo
"Production of Baker's Yeast", Gerald Reed, publicado por
Prescott and Dunn's Industrial Microbiology, 4ª edición, editado por
Gerald Reed, The Avi Publishing Company Inc., segunda edición
1983.
Se ha controlado particularmente que todos los
alimentos necesarios en pequeñas cantidades en la levadura,
minerales (macroelementos y oligoelementos), vitaminas (biotina,
vitaminas del grupo B) estén presentes al menos en las mayores
cantidades recomendadas en las obras de referencia citadas
anteriormente. En general, estos ensayos se realizan como se indica
en los procedimientos patentados de la solicitante, como en la
solicitud de patente europea nº 92401168.7 del
23-04-92. Se ha cuidado
principalmente en obtener levaduras bien lavadas y en enfriar
rápidamente la crema y las levaduras filtradas a 2ºC.
La última etapa de multiplicación de la levadura
que conduce a una levadura fresca comprimida muy activa se realiza
más específicamente de la forma siguiente:
\text{*} dilución del medio de cultivo para
multiplicación comercial:
\frac{Peso \ del \ mosto \
fermentado \ en \ la \ cuba}{Cantidad \ de \ melaza \ al \ 50% \ de
\ azúcares \ totales \ expresados \ como \
sacarosa}=5,2
Preferentemente, estos ensayos se realizan con
una mezcla de 90% de melazas de remolacha, 10% de melazas de caña,
estas dos melazas deben ser de buena calidad, es decir de buena
pureza y no contener inhibidores o sustancias tóxicas para las
levaduras. Se debe comprobar particularmente en ensayos de cultivos
testigos que las melazas no contienen aditivos tóxicos añadidos a
veces en el momento de la operación de extracción y de purificación
del azúcar en la azucarera. El azúcar de las melazas de remolacha se
mide por el método Clerget (determinación de la sacarosa por doble
polarización), el azúcar de las melazas de caña se determina por
medición enzimática de la sacarosa, glucosa y fructosa realmente
presentes y el conjunto de estos azúcares se calcula en equivalentes
de sacarosa;
- * índice de multiplicación horario medio en el último ciclo de multiplicación de 14 horas: 1,12 a 1,14
- * índice máximo de brotes de la levadura recogida: 3%
- * índice de nitrógeno/materias secas de la levadura recogida: 7%
- * índice P_{2}O_{5}/materias secas de la levadura recogida: 2,5%.
Estos ensayos han dado levaduras frescas de
panificación con alrededor del 32% de materias secas con las
características siguientes. Todos los resultados dados en las tablas
son para levaduras frescas llevadas al 32% de materias secas.
| Mediciones a 30ºC | |||||
| Cepa | Rendimiento de cultivo en equivalente | Prueba | Prueba A_{3} | Prueba A_{5} | Prueba A_{6} |
| de melaza con 50% de sacarosa | A_{1} 2h 30ºC | 2h 30ºC | 2h 30ºC | 2h 30ºC | |
| en ml de CO_{2} | |||||
| cepa S47 | 90% | 140 | 120 | 90 | |
| cepa S47-12b1 | 88% | 115 | 97 | 65 | |
| cepa L30 | 82% | 88 | 125 | 110 | 165 |
| cepa L30-13 | 87% | 88 | 120 | 103 | 145 |
| cepa L30-91 | 82% | 70 | 117 | 98 | 135 |
| Mediciones a 8ºC con subida de temperatura | |||||
| Cepa | Prueba | 48 h 8ºC | subida a 30ºC durante 1 h 30 | 30ºC 1 h | Total 30ºC 2 h |
| S47 | A_{1} | 167 | 34 | 12 | 18 |
| S47-12b1 | A_{1} | 44 | 48 | 54 | 118 |
| S47 | A_{5} | 171 | 81 | 69 | 135 |
| S47-12b1 | A_{5} | 13 | 42 | 35 | 76 |
| L30 | A_{1} | 121 | 36 | 18 | 30 |
| L30-13 | A_{1} | 12 | 50 | 47 | 100 |
| L30-91 | A_{1} | 2 | 42 | 24 | 43 |
| L30 | A_{5} | 174 | 68 | 66 | 127 |
| L30-13 | A_{5} | 6 | 36 | 44 | 99 |
| L30-91 | A_{5} | 1 | 23 | 47 | 98 |
Las tablas anteriores permiten calcular la
relación:
\frac{Desprendimiento \ de \
CO_{2} \ después \ de \ 48 \ horas \ de \ fermentación \ a \
8^{o}C}{Desprendimiento \ de \ CO_{2} \ después \ de \ 2 \ horas \
de \ fermentación \ a \ 30^{o}C} en
%
Se obtiene la tabla siguiente:
| Cepa | Relación en la prueba A_{1} | Relación en la prueba A_{5} |
| S47 | 119% | 190% |
| S47-12b1 | 44\div115=38% | \approx20% |
| L30 | 138% | > 158% |
| L30-13 | 14% | 6% |
| L30-91 | 3% | 1% |
Las levaduras frescas de panificación obtenidas
en el conjunto de este ejemplo son estables en una prueba de
conservación 7 días a 21ºC.
La cepa estable S47-12b1 y la
cepa testigo S47 se cultivan en las mismas condiciones que en el
ejemplo 2, a no ser que:
- * índice de multiplicación horario medio en el último ciclo de multiplicación de 14 horas: 1,18
- * índice máximo de brotes de la levadura recogida: 5%
- * índice de nitrógeno/materias secas de la levadura recogida: 8,2%
- * índice P_{2}O_{5}/materias secas de la levadura recogida: 2,7%.
Se obtienen los resultados siguientes:
| Mediciones a 30ºC | ||||
| Cepa | Rendimiento de cultivo en equivalente | Prueba A_{1} | Prueba A_{3} | Prueba A_{5} |
| de melaza con 50% de sacarosa | 2h 30ºC | 2h 30ºC | 2h 30ºC | |
| en ml de CO_{2} | ||||
| cepa S47 | 91% | 170 | 155 | 105 |
| cepa S47-12b1 | 91% | 172 | 149 | 103 |
| Mediciones a 8ºC de temperatura con subida de temperatura | ||||||
| Cepa | Prueba | 48 h 8ºC | subida a 30ºC durante | 30ºC | ||
| 1 h | 2 h | 3 h | ||||
| en ml de CO_{2} | ||||||
| S47 | A_{1} | 195 | 32 | 10 | 8 | 2 |
| S47 | A_{5} | 190 | 65 | 65 | 70 | 50 |
| S47-12b1 | A_{1} | 66 | 50 | 62 | 53 | 11 |
| S47-12b1 | A_{5} | 8 | 36 | 40 | 42 | 48 |
Esto permite calcular las relaciones del
desprendimiento de CO_{2} en las pruebas A_{1} y A_{5}:
\frac{Desprendimiento \ de \
CO_{2} \ después \ de \ 48 \ horas \ de \ fermentación \ a \
8^{o}C}{Desprendimiento \ de \ CO_{2} \ después \ de \ 2 \ horas \
de \ fermentación \ a \
30^{o}C}
\vskip1.000000\baselineskip
| S47 | prueba A_{1} | 115% |
| prueba A_{5} | 110% | |
| S47-12b1 | prueba A_{1} | 66\div172=38,4% |
| prueba A_{5} | 8\div103=8% |
Las levaduras frescas de panificación obtenidas
con estas dos cepas son estables de la misma manera en una prueba de
conservación 7 días a 21ºC.
Se hacen esporular, según las técnicas
habituales, cepas industriales de levadura rápida, adaptadas a la
maltosa, como por ejemplo la cepa NCYC 995, objeto de la patente de
los Estados Unidos de América nº 4.396.632 del 2 de agosto de 1983 a
nombre de Philippe Clément y Annie Loiez. Se obtiene así un
determinado número de haploides del cual el haploide o segregador
designado con el nº HL13.2. Se somete a los haploides así obtenidos
al tratamiento de mutación y de selección de mutantes descritos en
el ejemplo 1. Se selecciona de este modo la cepa haploide denominada
HL13.2.30 sensible al frío. Este mutante haploide industrial
HL13.2.30 se caracteriza por el hecho de que después del cultivo,
permite obtener una levadura con las características siguientes:
prueba A_{1} 2 horas a 30ºC: 132 ml de
CO_{2}
\frac{Desprendimiento \ de \
CO_{2} \ en \ la \ prueba \ A_{1} \ después \ de \ 48 \ horas \ de \
fermentación \ a \ 8^{o}C}{Desprendimiento \ de \ CO_{2} \ en \ la \
prueba \ A_{1} \ después \ de \ 2 \ horas \ de \ fermentación \ a \
30^{o}C}=0,35
Este mutante haploide presenta según estos
resultados una buena adaptación a la maltosa por el hecho de su
actividad superior a 100 en la prueba A_{1} y un carácter de
sensibilidad en frío por el hecho de la relación calculada
anteriormente de 0,35. El estudio por crecimiento de sensibilidad al
frío de este mutante HL13.2.30 demuestra que se trata de una
mutación ya que es transmisible y recesiva. El fenotipo conferido
por esta mutación no depende a priori del contexto genético de la
cepa.
Habida cuenta de estos resultados, la clonación
del gen responsable del fenotipo de sensibilidad al frío de esta
cepa haploide mutada denominada con el nº HL13.2.30 ha sido
propuesta según la estrategia general siguiente de la que cada etapa
será retomada de manera más detallada a continuación. La cepa
haploide mutada HL13.2.20 se ha depositado en el Centro Nacional de
Cultivo de Microorganismos (CNCM), Institut Pasteur Paris, con el nº
I-1841 el
30-01-1997.
- -
- Aislamiento de un mutante ura3- de la cepa HL13.2.30 a fin de poderla transformar con el banco de ADN genómico referencia ATCC 37415 construido en el vector centromérico YCp50 (marcador URA3). [ROSE, M.D. et al. (1987) Gene 60, 237-243].
- -
- Transformación de un mutante HL13.2.30 ura3- por el banco de ADN genómico y el aislamiento de clones transformados en URA3^{+} (clones que han recibido un plásmido).
- -
- Investigación de los clones transformadores que han perdido el fenotipo de sensibilidad al frío.
- -
- Comprobación de los clones que han perdido el fenotipo de sensibilidad al frío.
- -
- Aislamiento y caracterización del plásmido después del reaislamiento de este último a partir de un transformador que ha perdido el carácter de sensibilidad al frío.
- -
- Reconversión de la cepa HL13.2.30 ura3- con el plásmido reaislado y comprobación que complementa eficazmente la mutación.
- -
- Localización cromosómica del fragmento de ADN genómico insertado en el plásmido por secuenciado de los extremos 3' y 5' de la inserción.
- -
- Identificación del ORF (marco de lectura abierto=Open Reading Frame) responsable del aumento del carácter de sensibilidad al frío.
- -
- Aislamiento del gen que lleva la mutación a partir del mutante HL13.2.30.
- -
- Secuenciado del gen mutado y de su alelo "wt" (=wild type o natural) de la cepa HL13.2 para identificar y localizar la mutación.
- -
- Reconversión de la cepa HL13.2.30 ura3- (mutante) con el gen mutado de manera que se verifique que no se trata de un gen supresor.
- -
- Reintroducción (por recombinación homóloga) del gen mutado en un segregador no sensible al frío (cepa de laboratorio n=16 cromosomas), comprobación de la obtención del fenotipo de sensibilidad al frío y obtención de este modo de la demostración de monogenicidad y de la no dependencia del contexto genético de la cepa mutada de origen.
Todas las construcciones se han realizado según
las técnicas habituales y principalmente según la obra "MOLECULAR
CLONING", J. Sambroock, E.F. Fritsch, T. Maniatis, Cold Spring
Harbor Laboratory Press 1989.
Esta etapa ha sido necesaria a fin de poder
transformar la cepa HL13.2.30 por el banco genómico y seleccionar
los transformadores que han cambiado a URA^{+} por introducción
del plásmido.
La gestión emprendida para volver ura3- la cepa
HL13.2.30 es una disgregación de los alelos URA3 de esta cepa por el
gen de resistencia a la fleomicina. Se ha construido un módulo de
disgregación del gen URA3 por la fleomicina en el plásmido Ylp lac
211 (URA3) [GIETZ R.D. y SUGINO, A. (1988) Gene 74,
527-534].
La construcción (esquematizada en la figura 1)
comprende las etapas siguientes:
- -
- preparación del fragmento pTEF1/Tn5Ble/t CYC1 (gen de resistencia a la fleomicina) mediante una doble hidrólisis Hind III/Kpn I del plásmido pUT332 [GATIGNOL, A. et al. (1987) "Mol. Gen. Genet." 207, 342-348]. El fragmento se recupera en el gel de agarosa LMP (Low Melting Point), purificado mediante el kit QIAEX (vendido por QIAGEN) y obtenido con terminales libres por la T4 ADN polimerasa.
- -
- abertura del plásmido Ylp lac 211 por el enzima Stu I que corta en el interior del gen URA3 (punto único) y genera terminales libres. El plásmido abierto se desfosforila a continuación mediante la CIF (Calf Intestine Phosphatase) para impedir la recirculación del plásmido en el momento de la clonación.
- -
- clonación del fragmento pTEF1/Tn5 Ble/tCYC1 con terminales abiertas en el plásmido Ylp lac 211-Stu I-desfosforilado por la acción de la T4 ADN ligasa.
- -
- transformación de la cepa E. coli DH5\alpha (vendida por LIFE TECHNOLOGIES) mediante el ligante anterior y aislamiento de los clones que tienen integrado el gen de resistencia a la fleomicina.
- -
- liberación del módulo de disgregación ura3::PH^{R} (gen URA3 disgregado por el gen de resistencia a la fleomicina) por una doble hidrólisis Nde I/Nsi I, obtención de la liberación de un fragmento de 2,1 kb=ura3::PH^{R}.
\newpage
La cepa HL13.2.30 se ha transformado por
electroporación con un fragmento ura3::PH^{R} de 2,1 kb (1
\mug). Se han obtenido varios clones PH^{R} pero todos eran
todavía URA^{+}, demostrando de este modo la existencia de un
segundo alelo URA3 (por lo menos) en la cepa HL13.2.30.
Se ha efectuado una segunda disgregación con el
mismo módulo de ADN pero la selección a la vez se ha realizado en un
medio mínimo + uracilo + 5FOA (5-Fluoro Orotato),
medio que permite una selección directa de los clones ura3- : se han
obtenido varios clones FOA^{+}, todos eran ura3-. La cepa
HL13.2.30 contiene pues dos copias del gen URA3.
Se han realizado varias transformaciones de la
cepa HL13.2.30 ura3- con el ADN plasmídico del banco genómico ATCC
37415 construido en el vector centrómero YCp50. Las transformaciones
se han realizado por la técnica del acetato de litio: 10^{8}
células/transformación en presencia de 630 ng de ADN (tal como la
descrita por GIETZ, D. et al. (1992) "Nucl. Acids
Res." 20, 1425).
Se han obtenido más de 5000 clones
transformadores de los que 4500 se han cribado en una prueba de
preselección constituida por una prueba de gotas en medio de glucosa
0,1% preferentemente con antimicina (5 \mug/ml).
Los transformadores se cultivan en el medio
mínimo YBN-agar DIFCO® que contiene 2% de glucosa
durante 24 horas. Las levaduras recogidas se ponen en suspensión en
agua destilada; la suspensión se ajusta a una densidad óptica 1. Se
depositan gotas de 5 microlitros de esta suspensión en el medio
mínimo YNB-agar DIFCO®que contiene 0,1% de glucosa y
5 \mug/ml de antimicina A (referencia A 8674 en el catálogo
SIGMA), siendo la antimicina A un agente que bloquea la respiración.
Se incuban a 10ºC durante 10 días placas que contienen este medio
mínimo y sembradas de este modo. Se seleccionan los transformadores
que se han multiplicado gracias a la energía producida por la
fermentación, ya que su respiración está bloqueada por la antimicina
A, más rápidamente que el mutante de partida HL13.2.30 ura3-
transformado por el plásmido YCp50 vacío, es decir sin
inserción.
Esta preselección ha permitido retener unos
cincuenta clones que presentan un crecimiento mejorado a 10ºC con
relación al testigo, es decir que presentan una reversión hacia el
fenotipo natural. Todos estos clones han sido objeto de un estudio
más apresurado a fin de ver si, entre estos candidatos, un clon
había perdido efectivamente su carácter de sensibilidad al frío por
transformación con el banco.
Las pruebas complementarias que se han efectuado
en estos clones son las siguientes:
- -
- Prueba con glucosa a 10ºC: medición del consumo de glucosa a 10ºC en condiciones de fermentación comparada con los testigos HL13.2.30 ura3- /YCp50 (mutante sensible al frío) y HL13.2 (cepa natural) para comprobar la existencia o no del fenotipo de sensibilidad al frío en fermentación, habiendo sido correlacionada esta prueba con pruebas en el fermentómetro de Burrows y Harrison de tipo A tales como las descritas anteriormente.
La descripción de la prueba de glucosa es la
siguiente: se cultivan diferentes clones en medio mínimo durante 24
h. Se recogen las levaduras y se ponen en suspensión las células de
levadura en agua destilada, de forma que esta suspensión tenga una
densidad óptica de 15. Se incuban 10 microlitros de esta suspensión
de levaduras en presencia de 100 microlitros de medio mínimo (yeast
nitrogen base, w/o Amino-acid DIFCO®) que contiene
0,02% de glucosa, en placa de microvaloración. Las placas de
microvaloración se incuban bien a 30ºC durante 4 h o a 10ºC durante
20 h. Al final del tiempo de incubación, la glucosa no fermentada
por las levaduras se revela mediante una reacción colorimétrica, con
la glucosa oxidasa (Diagnostic Kits Sigma nº
315-100). Esta prueba es una variante de la prueba
en placa de microvaloración del consumo de azúcar con
dinitrosalicilato de sodio descrito en el ejemplo 1.
- -
- Fermentómetro 48 h a 8ºC según la prueba A_{1} para comprobar la pérdida del carácter de sensibilidad al frío.
- -
- Identificación de los clones por una técnica de PCR fingerprinting (Ness et al., 1993, "J. Sci. Food Agric.", 62, 89-94) para comprobar que no se trata de contaminantes.
- -
- Crecimiento en el medio YEG-Agar + fleomicina 100 \mug/ml para comprobar la presencia del carácter de resistencia a la fleomicina aportado en el momento de la disgregación de los alelos URA3 de la cepa HL13.2.30.
- -
- Comprobación de la presencia de un plásmido: aislamiento del ADN total y reconversión de la cepa E. coli DH5\alpha para aislar el plásmido.
Entre la cincuentena de clones marcados por la
prueba de las gotas, se ha conservado un clon que cumple todas estas
pruebas: el clon YCp50-10.39. Este gen tiene por
objeto una caracterización completa.
Para comprobar que la pérdida del carácter de
sensibilidad al frío estaba muy relacionada con la presencia de un
fragmento de ADN genómico aportado por el plásmido, hemos comparado,
en el fermentómetro a 8ºC, los desprendimientos de gases de las
cepas siguientes:
| HL13.2: | testigo |
| HL13.2.30 ura3- [YCp50]: | \begin{minipage}[t]{95mm} testigo levadura sensible al frío (cepa transformada por el plásmido "vacío")\end{minipage} |
| HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39]: | \begin{minipage}[t]{95mm} clon YCp50-10.39 aislado después de la transformación de la cepa HL13.2.30 ura3- (levadura sensible al frío) por el banco de ADN genómico.\end{minipage} |
| HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39 RT]: | \begin{minipage}[t]{95mm} clon aislado después de la reconversión de la cepa HL13.2.30 ura3- por el plásmido aislado del clon YCp50-10.39 original.\end{minipage} |
| HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39 FOA]: | \begin{minipage}[t]{95mm} clon aislado en 5-FOA (ura^{-}) después de la pérdida del plásmido en medio rico del clon YCp50-10.39 original.\end{minipage} |
Las mediciones de desprendimientos de gases
(CO_{2}) en el fermentómetro de Burrows y Harrison en la prueba
A_{1} a 8ºC durante 24 a 48 horas muestran:
- \text{*}
- que las tres cepas HL13.2, H13.2.30 ura3- [YCp50-10.39] y HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39RT] dan un desprendimiento de CO_{2} del mismo orden de magnitud, y como la cepa HL13.2 no presentan ningún fenotipo de sensibilidad al frío
- \text{*}
- mientras que las dos cepas HL13.2.30 ura3- [YCp50] y HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39 FOA] dan las dos un desprendimiento de CO_{2} aproximadamente 3 veces más débil que el del grupo formado por las 3 cepas anteriores, estas dos cepas presentan pues un fenotipo de sensibilidad al frío.
Estos resultados, comprobados varias veces y en
varios clones independientes, que muestran sin ambigüedad que el
carácter de sensibilidad al frío de la cepa HL13.2.30 ura3- está
complementado con el clon YCp50-10.39 y que la
complementación está muy relacionada con la presencia del plásmido
recombinante.
Se ha aislado el plásmido del clon transformador
YCp50-10.39 después de la transformación de la cepa
E. coli DH5\alpha con el ADN total del clon
YCp50-10.39 preparado con el kit QIAGEN.
Una cartografía resumida del plásmido a permitido
mostrar que:
- -
- el plásmido contenía más de una inserción,
- -
- el tamaño de la inserción era superior a 15 kb.
Se han secuenciado los terminales 5' y 3' de la
inserción a fin de localizar este fragmento de ADN genómico en el
genoma de Saccharomyces cerevisiae. La secuencia obtenida ha
permitido determinar, consultando en INTERNET el banco de datos del
MIPS (Martinsried Institute for Protein
Sequences-Max Planck Institute for
Biochemistry-82152 Martinsried-FRG)
en la dirección de Internet:
htpp://speedy.mips.biochem.mpg.de/mips/yeast/index.htmlx,
que:
- -
- la inserción correspondía a un fragmento de ADN del cromosoma XII,
- -
- el tamaño de la inserción es 18.178 pb,
- -
- el fragmento de ADN se alinea con el cromosoma XII (a la derecha del centrómero) al nivel de los nucleótidos 305.116 a 323.293.
La inserción comprende los 5 marcos de lectura
abiertos (o ORF) completos siguientes, numerados a continuación en
números romanos del I al V:
\newpage
| I | YLR087c | - ORF de 8874 pb (pares de bases) correspondiente a una proteína de 2958 AA |
| (aminoácidos) | ||
| - proteína denominada "hipotética" en la medida en que nunca ha sido aislada- | ||
| ninguna homología o similitud conocida | ||
| - 4 zonas transmembranosas | ||
| II | YLR088w | - ORF de 1842 pb: proteína de 614 AA |
| - gen conocido: GAA1 (=END2) que codifica una proteína que interviene en la | ||
| transposición de los anclajes GPI (N-glucosil fosfatidil inositol) en las proteínas | ||
| unidas a la membrana por estos anclajes | ||
| - la rotura de este gen es letal | ||
| III | YLR089c | - ORF de 1776 pb: proteína de 592 AA |
| - proteína que presenta una fuerte homología con las alanina transaminasas | ||
| IV | YLR090w | - ORF de 1377 pb: proteína de 459 AA |
| - proteína que presenta homologías con la proteína Dna J (=heat shock protein | ||
| en E. coli) | ||
| - la expresión no manifestada en S. cerevisiae podría ser un gen críptico | ||
| - deleción del gen viable: ningún fenotipo | ||
| V | YLR091w | - ORF de 879 pb: proteína de 293 AA |
| - proteína hipotética. Ninguna homología conocida |
Esta mutación YLR187c para el primer ORF
corresponde en el banco de datos al código siguiente:
- Y=Yeast=levadura Saccharomyces cerevisiae
- L=Cromosoma XII
- R=a la derecha del centrómero
- 087=ORF nº 087
- c=proteína codificada por la cadena Crick
Para precisar exactamente el gen responsable del
complemento de sensibilidad al frío de la cepa HL13.2.30 ura3-, se
han realizado diversas subconaciones y deleciones para llegar al
resultado.
- -
- han sido realizadas deleciones directamente a partir del plásmido YCp50-10.39
- -
- se han efectuado subclonaciones de los fragmentos de la inserción de 18.178 pb en el plásmido YCp lac33 [GIETZ R.D. y SUGINO, A. (1988) Gene 74, 527-534].
La estrategia empleada se presenta en la figura 2
con los resultados obtenidos con la prueba de glucosa ("+":
complementación del carácter de sensibilidad al frío; "-":
ninguna complementación). Estos resultados han sido confirmados por
las mediciones de desprendimiento de gases en el fermentómetro
después de 24 h ó 48 h a 8ºC según la prueba A_{1}.
| HL13.2: | testigo no sensible al frío |
| HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39]: | \begin{minipage}[t]{95mm} YCp50-10.39 aislado después de la transformación de la cepa HL13.2.30 ura3- (levadura sensible al frío) por el banco de ADN genómico.\end{minipage} |
| HL13.2.30 ura3- [YCp lac33-YLR087c]: | \begin{minipage}[t]{95mm} cepa HL13.2.30 ura3- transformada por el plásmido YCp lac33 en la que se ha clonado el gen YLR087c natural (fragmento Nael-Nael del plásmido de YCp50.10.39).\end{minipage} |
| HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39mut]: | \begin{minipage}[t]{95mm} cepa HL13.2.30 ura3- transformada por el plásmido [YCp-5010.39mut] obtenido por la técnica de "gap-filling" descrita anteriormente en el párrafo d). Este plásmido contiene el gen YLRO87c que lleva la mutación.\end{minipage} |
| HL13.2.30 ura3- [YCp50]: | \begin{minipage}[t]{95mm} cepa HL13.2.30 ura3- transformada por el plásmido YCp-50 "vacío" (plásmido de origen del banco genómico ATCC).\end{minipage} |
| HL13.2.30 ura3- [YCp lac33]: | \begin{minipage}[t]{95mm} cepa HL13.2.30 ura3- transformada por el plásmido YCp lac33 "vacío" (plásmido centrómero URA3 que ha servido en diversas subclonaciones).\end{minipage} |
Los desprendimientos en el fermentómetro a 8ºC
según la prueba A_{1} de estas diferentes cepas han dado los
siguientes resultados:
- \text{*}
- las tres cepas HL13.2, HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39] y HL13.2.30 ura3- [YCp lac33-YLR087c] dan un desprendimiento de CO_{2} del mismo orden de magnitud, y por consiguiente como la cepa HL13.2 no presenta ningún fenotipo de sensibilidad al frío;
- \text{*}
- mientras que las tres cepas HL13.2.30 ura3- [YCp50-10.39mut], HL13.2.30 ura3- [YCp50] y HL13.2.30 ura3- [YCp lac 33] dan un desprendimiento gaseoso de CO_{2} alrededor de 3 veces más débil que el del grupo anterior y presentan por consiguiente un fenotipo de sensibilidad al frío.
De los resultados de la prueba con glucosa y del
fermentómetro a 8ºC, resulta claramente que el gen responsable de la
complementación es el gen YLR187c, que codifica una proteína de 2958
AA (Aminoácidos), de función totalmente desconocida y de
localización probablemente membranosa.
Para comprobar que se trataba del gen buscado,
responsable del fenotipo y no del gen supresor, se ha clonado el gen
mutado de la cepa HL13.2.30 ura3- por la técnica del "gap
filling" [IWASAKI, T. et al. (1991) Gene 109,
81-87] o "Allele rescue"
[ORR-WEAVER, T.L. et al. (1983) "Methods
Enzymol." 101, 228-245]. El principio del
procedimiento se da más particularmente en la figura 2 "Basic
strategy for cloning GAP regions", página 83 del artículo de
IWASAKI, T. et al.
Este procedimiento se ha aplicado a la cepa
HL13.2.30 ura3- en la transformación con el plásmido
YCp50-10.39 \Delta SacI (véase la fig. 2) digerido
por Esp I y Afl II. La utilización de un plásmido con la inserción
eliminada (por Sac I) es necesaria para comprobar que ha habido un
relleno (y que no se trata de una hidrólisis incompleta del
plásmido). Se han obtenido 3 clones correspondientes al resultado
alcanzado (denominados GF2, GF4 y GF5).
La reconversión de la cepa HL13.2.30 ura3- con el
ADN aislado del clon GF2 (=YCp50-10.39 mut.) ha
permitido demostrar que los transformadores URA^{+} obtenidos eran
todos sensibles al frío.
Este resultado demuestra que el gen YLR087 no es
un gen supresor del carácter de sensibilidad al frío de la cepa
HL13.2.30 ura3-. En efecto, si YLR037c (era un gen supresor (por
consiguiente no mutado), su expresión episómica después de la
transformación de la cepa HL13.2.30 ura3- por el ADN del GF2 habría
conducido a un aumento del carácter de sensibilidad al frío.
El plásmido YCp50-10,39mut en la
cepa Escherichia coli DH5\alpha se ha depositado en la
Colección Nacional de Cultivos de Microorganismos, Institut Pasteur,
con el nº I-1842 el 30 de enero de 1997.
El gen YLR037c de la cepa HL13.2.30 (depositado
en el CNCM con el número I-1841) se ha secuenciado
en su totalidad por la técnica de secuenciado directo en los
productos de PCR obtenidos por amplificación de fragmentos de
alrededor de 1 kb que abarca todo el gen. Todos los fragmentos de
PCR secuenciados se superponen a fin de que no persista ninguna zona
no secuenciada del gen. La secuencia se ha determinado a partir de
los extremos de los ORF YLR086w e YLR088w contiguos al gen
YLR087c.
La secuencia obtenida se ha comparado con la
secuencia del gen YLR087c publicada en las bases de datos y que se
pueden obtener en el MIPS (Martinsried Institute for Protein
Sequences-Max Planck-Institute for
Biochemistry-82152 Martinsried-FRG)
y principalmente en el sitio de Internet:
htpp://speedy.mips.biochem.mpg.de/mips/yeast/index.htmlx.
La comparación de secuencias ha permitido
identificar 35 cambios (o indeterminaciones) de nucleótidos en la
zona codificadora del gen:
- -
- 27 cambios (o indeterminaciones) que no producen ninguna modificación del aminoácido en la cadena polipeptídica
- -
- 7 cambios que producen el cambio del aa
- -
- 1 cambio que provoca la aparición de un codón STOP (posición nº 7865 del gen-secuencia SEC ID nº. 1, esta posición corresponde a la posición nº 308242 en el cromosoma XII en la secuencia del MIPS).
Para comprobar si se trataba o no de mutaciones
verdaderas, el gen YLR087c de la cepa HL13.2 (cepa natural a partir
de la cual se ha obtenido el mutante HL13.2.30) se ha secuenciado
según la misma estrategia al nivel de las zonas o de las
modificaciones que se habían identificado.
Todas las modificaciones citadas anteriormente se
han encontrado en la secuencia del gen natural excepto la
modificación identificada en la posición nº 7865 (C\rightarrowG)
que conduce al cambio Ser\rightarrowSTOP
(TCA\rightarrowTGA).
Esta modificación, que corresponde a una
mutación verdadera del gen YLR087c de la cepa HL13.2.30 (ya
que no se ha encontrado en la secuencia del gen natural), provoca
una interrupción de la traducción de la proteína codificada por este
gen que ocasiona la síntesis de una proteína truncada de 2496AA en
el mutante mientras que la proteína normal sintetizada por una cepa
natural está constituida por 2958AA (Aminoácidos).
El ADN plasmídico de los clones
[YCp50-10.39] y [YCp50-10.39mut] se
ha secuenciado igualmente en 120 pb (secuenciado de doble cadena en
el ADN plasmático) al nivel de la zona de la inserción que abarca el
codón STOP. El resultado obtenido ha permitido confirmar la
existencia de una mutación identificada en el ADN genómico. La
secuencia Iue (posición 7864\rightarrow7866 en la secuencia SEC ID
nº. 1) es:
- TCA (Ser) para el clon
[YCp50-10.39]
- TGA (STOP) para el clon
[YCp50-10.39mut]
El clon
DH5\alpha[YCp50-10.39mut] que incluye el
plásmido que contiene el gen YLR087c mutado depositado en el CNCM
con el nº I-1842, comprende por consiguiente
efectivamente esta mutación.
Se da la secuencia del gen YLR087c mutado de la
cepa HL13.2.30 depositada en el CNCM con el número
I-1841, obtenida por secuenciado directo (SEC ID nº.
1), así como la de la proteína codificada por este último (SEC ID nº
2).
Para verificar que la única mutación STOP
identificada por el secuenciado era necesaria y suficiente para
conferir un fenotipo de sensibilidad a una levadura, se ha
subclonado un fragmento de 3162 pb (fragmento HindIII, nucleótidos
6035-9196 del gen YLR087c mutado, en la secuencia
SEC ID nº 1, que contiene la mutación STOP en la posición 7865). Se
ha introducido a continuación un marcador resistente a la geneticina
(G418) en el punto Eco RV único (posición 8379 del gen) de manera
que se puedan seleccionar levaduras que han sido transformadas por
este fragmento mediante recombinación homóloga.
El detalle de la construcción se da a
continuación (y se explica de manera esquemática en la figura
3):
- \text{*}
- Aislamiento del fragmento Hind III de 3162 bp por hidrólisis del plásmido YCp50-10.39mut que contiene el gen YLR087c mutado. El fragmento se separa por electroforesis en agarosa de bajo punto de fusión (agarosa LMP) y se purifica mediante el kit QIAEX QIAGEN).
- \text{*}
- Clonación del fragmento Hind III de 3162 pb descrito anteriormente en el plásmido pUC_{9} al nivel del punto único Hind III presente en el punto único de clonación de este vector. Se obtiene entonces el plásmido denominado pUC_{9}-3162.
- \text{*}
- Abertura del plásmido pUC_{9}-3162 al nivel del punto único Eco RV incluido en el fragmento de 3162 pb (posición nº 8379 del gen-SEC ID nº 1). Este enzima Eco RV libera terminales abiertos que se desfosforilan a continuación por acción de la CIP (Calf Intestine Phosphatase).
- \text{*}
- Preparación del fragmento de ADN pPGK/Tn903/tPGK correspondiente al gen resistente a la geneticina (G418) mediante doble hidrólisis HindIII/AccI del plásmido pUC_{19}-G418. Se recupera por electroforesis el fragmento de 3,1 kb en gel de agarosa LMP seguida de una purificación por el kit QIAEX. Este fragmento se vuelve a continuación con los extremos abiertos por la acción de la ADN polimerasa (fragmento de Klenow) en presencia de 4 dNTP.
- \text{*}
- El gen resistente al G418 vuelto con los extremos abiertos (descripción anterior) se clona a continuación en el punto Eco RV del plásmido pUC_{9}-3162 mediante la acción de la T4 ADN ligasa. Después de la transformación de la cepa DH5\alpha de E. coli, se obtiene el plásmido pUCq-3162\DeltaG418 que lleva un fragmento de ADN de alrededor de 6,2 kb que contiene la mutación STOP y el gen resistente al G418.
- \text{*}
- La hidrólisis del plásmido pUC_{9}-3162\DeltaG418 permite liberar un fragmento de ADN lineal de 6,2 kb que puede, por recombinación homóloga, sustituir la 1ª parte correspondiente de un gen YLR087c natural por el mismo fragmento que lleva la mutación STOP. La integración se hace por sustitución del gen, mediante un mecanismo de doble "crossing-over" como el descrito por RODSTEIN, R. (1991) Methods in Enzymology, 194, 281-301. El gen resistente al G418, introduce 514 pb después de la mutación STOP (en el sentido 5'\rightarrow3' de lectura del ORF) no es útil más que para la selección de transformadores.
- \text{*}
- Dos cepas independientes haploides de laboratorio de Saccharomyces cerevisiae: M5 (MATA, ura3, trp1, leu2) y OL1 (MAT\alpha, leu2, his3, ura3) se han transformado con ADN lineal 3162\DeltaG418 (fragmento Hind III de 6,2 kb del plásmido pUC_{9}-3162\DeltaG418) por electroporación según el procedimiento descrito por MEILHOC, E. et al. (1990) Biotechnology, 8, 223-227. Las condiciones de electroporación son las siguientes:
- -
- 2500 V/cm
- -
- 10^{8} células en 50 \mul
- -
- 1 \mug de ADN lineal.
Varias centenas de clones transformadores
resistentes al G418 se han obtenido con las dos cepas. El análisis
de 20 clones cogidos al azar para cada una de las dos cepas ha
permitido mostrar que todos estos clones presentaban un fenotipo de
sensibilidad al frío.
La cepa M5 es un haploide verdadero 16n (16
cromosomas) descendiente de la cepa M5 2n descrita por SCHAAFF et
al. (1989) Curr. Genet. 15, 75-81. La
cepa OL1 es un haploide verdadero 16n descrito por
BOY-MARCOTTE, E. y JACQUET, M. (1982) Gene
20, 433-440.
Este resultado muestra que mientras la mutación
se reintroduce en una cepa de levadura haploide por la técnica de
sustitución del gen, ella confiere un fenotipo de sensibilidad al
frío en los clones transformados.
La mutación STOP identificada en el gen YLR087c y
descrita anteriormente es una mutación recesiva, transmisible y no
dependiente de un determinado contexto genético de la cepa (véase la
transformación de dos cepas de laboratorio independientes descritas
anteriormente en 5).
Para construir una cepa de levadura industrial
sensible al frío, es necesario introducir la mutación STOP
identificada en todos los alelos del gen YLR087c presentes en
la cepa para conferir el fenotipo de sensibilidad al frío. Las
construcciones descritas en 5 anteriormente
(pUC_{9}-3162 y
pUC_{9}-3162\DeltaG418) permiten alcanzar este
objetivo. Sobre el mismo modelo de la construcción del vector
pUC_{9}-3162\DeltaG418, se puede introducir
otros marcadores positivos, como por ejemplo los genes resistentes a
la fleomicina, a la cicloheximida, a los herbicidas, a los metales
(Cu, Cd). Según el mismo procedimiento (sustitución del gen) que el
descrito anteriormente, todos los alelos naturales del gen YLR087c
se pueden transformar de manera que se introduzca la mutación STOP y
un marcador positivo diferente para cada alelo del gen YLR087c. La
obtención de una cepa "apropiada" que no contenga más que el
único cambio del nucleótido 7865 de la secuencia SEC ID nº 1
(mutación STOP, posición 308242 del cromosoma XII de
Saccharomyces cerevisiae según el banco de datos del MIPS) se
realiza a continuación transformando varias veces la cepa mediante
una técnica de transformación conjunta que pone en juego el
fragmento de ADN lineal de 3162 pb (obtenido por digestión HindIII
del plásmido pUC_{9}-3162) y un plásmido de tipo
YEP que contiene un marcador positivo además de los utilizados en
las transformaciones por integración. Los clones obtenidos después
de la transformación conjunta se replican a continuación en placas
que contienen un medio apropiado que incluye cada una una sustancia
tóxica (antibiótico, herbicida, ...) utilizada en el momento de las
etapas de integración. Se seleccionan los clones que han perdido por
lo menos uno de los caracteres de resistencia. Como resultado de
esta selección por réplicas, el plásmido replicante utilizado en el
momento de la transformación conjunta se elimina cultivando el/los
clon(es) seleccionado(s) en el medio rico sin ninguna
presión de selección. Se retiene, como resultado de este cultivo, un
clon que ha perdido el carácter de resistencia alcanzado por el
plásmido.
La repetición de esta secuencia de sucesos de
transformación permite reemplazar uno a uno los alelos mutados que
llevan un marcador de resistencia por alelos que llevan la mutación
sola sin otro ADN heterólogo de tipo marcador de resistencia.
Preferentemente se utilizará una cepa de levadura
de panadería que posee un número limitado de copias del gen YLR087c.
Preferentemente todavía, se transformarán en un primer momento los
ascendientes (segregadores) de esta cepa que se recrecerá una vez
que el fenotipo de sensibilidad al frío haya sido obtenido para cada
uno de los ascendientes.
De manera alternativa, se puede aprovechar el
procedimiento de selección por enriquecimiento a la nistatina
descrito en el ejemplo 1.
En este caso, se procede igualmente por
transformación conjunta poniendo en juego el ADN lineal que lleva la
mutación STOP (fragmento Hind III de 3162 pb del plásmido
PUC_{9}-3162) y un plásmido replicador de tipo
YEp que lleva un marcador positivo (resistencia al G418 o a la
fleomicina). Los clones resistentes al antibiótico obtenidos después
de la transformación conjunta se reunen y someten al protocolo de
enriquecimiento a la nistatina que permite seleccionar las células
que tienen el fenotipo de sensibilidad al frío. El plásmido
replicador que lleva un marcador de resistencia se elimina a
continuación por cultivo de un clon (seleccionado como sensible al
frío) en el medio rico sin presión de selección (pérdida del
plásmido). Esta alternativa permite seleccionar directamente sucesos
de integración (por sustitución del gen) múltiples que habrían
podido tener lugar. Incluso, es preferible trabajar con una cepa que
posee un número limitado de copias de genes YLR087c o mejor todavía
transformar previamente los ascendientes de esta cepa.
La comprobación de esta construcción se puede
controlar secuenciando un producto de PCR que abarca la zona del
sitio de la manipulación genética deseada.
Se puede emplear igualmente una tercera
alternativa para llegar al objetivo deseado que consiste en
reemplazar cada alelo YLR087c de una cepa industrial por alelos que
lleven la mutación STOP. Este procedimiento está descrito en el
artículo publicado por ALANI, E. et al. (1987)
"Genetics" 116, 541-545. Consiste en
flanquear un marcador positivo, como por ejemplo el gen resistente
al G418 por dos secuencias repetidas directas, preferentemente
secuencias idénticas al gen YLR087c. El cultivo de un transformador
G418 resistente en un medio rico sin G418 permite una escisión del
marcador por un mecanismo de "pop-out". La
repetición de esta secuencia de integración/excisión permite, como
se describe en el artículo citado anteriormente, sustituir uno a uno
cada uno de los alelos naturales por alelos que llevan la mutación
STOP.
Este ejemplo es no limitativo, y se puede pensar
que un resultado idéntico se puede obtener con mutaciones no letales
de otros genes comparables al gen YLR087c que codifican proteínas
membranosas, debiendo entenderse que cada uno de los genes similares
o que presenta las mismas propiedades que el gen YLR087c debe llevar
la misma mutación no letal. Estos genes similares al gen YLR087c son
por ejemplo:
- -
- los genes con una función comparable
- -
- los genes que codifican proteínas asociadas a la proteína codificada por el gen YLR087c
- -
- los genes que codifican proteínas que tienen similitudes de secuencias, es decir por lo menos el 50% de homología, preferentemente el 60% de homología y más preferentemente por lo menos el 70% de homología con la proteína codificada por el gen YLR087c.
Las levaduras de panificación frescas obtenidas
según el ejemplo 2 con las cepas S47 y S47-12b1 se
prueban según la fórmula y el esquema de panificación
siguientes:
| - harina | 100 (u 8000 g) |
| - agua | 61 (o 4880 g) |
| - sal | 2,1 (o 168 g) |
| - levadura fresca | 3 (o 240 g) |
| - Croustiliss® détente | 1 (u 80 g) |
| - gluten | 1 (u 80 g) |
Croustiliss® détente es la marca registrada de un
mejorador de panificación comercializado por la Sociedad Lesaffre
Ingredients, 26 rue Gabriel Péri, 59700
Marcq-en-Baroeul, Francia y que
aporta mono- y diglicéridos de ácidos grasos (emulsionante E471),
levaduras desactivadas con poder reductor, ácido ascórbico y
alfa-amilasas fúngicas con efecto secundario.
- La harina es una harina de tipo 55 que da en el alveógrafo Chopin:
- W=256-P=79-L=92-P/L=0,86
y que no contiene ácido ascórbico. Estas
características de las harinas están definidas en la obra: "Guide
Pratique d'Analyses dans les Industries des Céréales",
coordinadores B. GODON y W. LOISEL, Technique et Documentation
LAVOISIER, 1984.
- -
- amasado en amasadora espiral KEMPER® 3 minutos en 1ª velocidad + 5 minutos en 2ª velocidad
- -
- temperatura de la pasta 25ºC
- -
- reposo 10 minutos
- -
- división en trozos de pasta de 350 g
- -
- expansión 15 minutos
- -
- elaboración en forma de baguette
- -
- apresto a 28ºC a volumen constante alrededor de 110 minutos
- -
- bloqueo de los trozos de pasta para el apresto a 8ºC durante 4 horas, 19 horas y 22 horas
- -
- cocción después del bloqueo a 8ºC, entendiéndose que después del bloqueo durante 19 horas y 22 horas, se observa un periodo de recalentamiento de los trozos de pasta de una hora a 28ºC.
La amasadora utilizada es una amasadora KEMPER®
del tipo "Mixhneter Standard" fabricada por EMIL KEMPER GBMH
4835 Rietberg
2-Neueckirchen-Alemania.
Las baguettes obtenidas con la levadura de
panificación obtenida de la cepa S47 han crecido demasiado en 4
horas a 8ºC, dando pocos golpes en la chapa. Estos defectos se
acentúan después de 19 horas y de 22 horas. Las baguettes
obtenidas con la levadura de panificación salida de la cepa
S47-12b1 han crecido mucho, dando muchos golpes en
la chapa y presentan un buen aspecto exterior después de los
bloqueos de 4 horas, 19 horas y 22 horas.
Las levaduras de panificación frescas obtenidas
según el ejemplo 2 con las cepas S47 y S47-12b1 se
prueban según la fórmula y el esquema de panificación
siguientes:
- -
- harina 100 (u 8000 g)
- -
- agua 61 (o 4880 g)
- -
- sal 2,1 (o 168 g)
- -
- levadura fresca 1 (u 80 g)
- -
- Croustiliss® pousse lente 1 (u 80 g)
- -
- gluten 0,5 (o 40 g).
La harina es del mismo tipo que en el ejemplo
anterior.
Croustiliss® pousse lente es la marca registrada
de un mejorador de panificación comercializado por la Sociedad
Lesaffre Ingredients y que aporta mono- y diglicéridos de ácidos
grasos, ácido ascórbico y alfa-amilasas fúngicas en
calidades y dosis óptimas para los procedimientos de tipo
crecimiento lento.
- -
- amasado en amasadora espiral KEMPER® 3 minutos en 1ª velocidad + 5 minutos en 2ª velocidad
- -
- temperatura de la pasta 24ºC
- -
- reposo 15 minutos
- -
- división en trozos de pasta de 350 g
- -
- expansión 15 minutos
- -
- elaboración en forma de baguette
- -
- apresto de 16 horas a 24 horas a 15ºC después de la cocción.
Las baguettes obtenidas con la levadura de
panificación obtenida de la cepa S47 han crecido demasiado al cabo
de 16 horas, son demasiado voluminosas, se han dado pocos golpes de
la chapa. Se ha sobrepasado o está en el límite el periodo de
fermentación máximo para esta levadura.
En cambio en el intervalo de 16 a 24 horas, se
consigue con la levadura de panificación obtenida con la cepa
S47-12b1 baguettes con un buen aspecto
exterior, con golpes secos de la chapa. Al cabo de 16 horas, se han
desarrollado un poco menos, al cabo de 24 horas, se obtienen
baguettes en el límite superior de volumen. Durante 8 horas,
se tiene con una pasta amasada y elaborada la víspera, trozos de
pasta listos para cocer bajo demanda y dando baguettes con
buen aspecto.
Naturalmente, estos ejemplo no son limitativos.
Por ejemplo, está claro que con la nueva levadura de panificación
obtenida con la cepa S47-12b1, se puede acoplar el
crecimiento lento y el crecimiento bloqueado para prolongar el
intervalo de cocción. Ésta permite obtener fácilmente trozos de
pasta listos para cocer bajo demanda en periodos prolongados de
tiempo, por lo menos de 4 horas, preferentemente por lo menos de 8
horas.
La fórmula utilizada es una fórmula estándar de
pan francés caracterizada por una hidratación superior de la pasta
de al menos 4 puntos, en razón del esquema de fabricación con un
punteado o primera fermentación que es prolongada, lo que da a la
pasta una fuerza importante.
Esta fórmula es:
- -
- harina 100
- -
- agua 66
- -
- sal 2
- -
- levadura fresca 3
- -
- mejorador 1
Las levaduras frescas utilizadas son levaduras
obtenidas según el ejemplo 2 con las cepas S47 (testigo) y
S47-12b1 (cepa que presenta el fenotipo de
sensibilidad al frío en fermentación).
El mejorador utilizado puede ser mejorador Ibis®
azul, o preferentemente un mejorador de la gama Croustiliss®,
mejoradores vendidos por Lesaffre Ingredients. Cuanto más tiempo se
haya de conservar la pasta, más necesario será un mejorador
Croustiliss® que aporta monoglicéridos de ácido grasos y
enriquecimiento dosificado en ácido ascórbico.
El amasado se realiza en una amasadora espiral de
la Sociedad VMI, ZI Nord, F-85601 Montaigu, 4
minutos en la primera velocidad, seguido de 8 minutos en la segunda
velocidad. La pasta se obtiene a 24ºC.
Las pastas obtenidas en bandejas de 8 kg se
colocan en la cámara frigorífica a -10ºC hasta que la temperatura en
el centro de la pasta sea de +4ºC, después se conservan a +4ºC.
Durante el periodo de disminución de la
temperatura, existe una primera fermentación o punteado.
Después de 3 días de bloqueo a 4ºC, la pasta con
la levadura testigo ha fermentado demasiado, mientras que la pasta
con la levadura sensible al frío (cepa S47-12b1)
permanece estable. La pasta testigo no es casi tolerante al apresto.
Después de 7 días de bloqueo la pasta testigo no se puede utilizar.
En todas las fabricaciones de panes que comprenden las operaciones
complementarias de división de la pasta, puesta en forma de bola,
elaboración de la pasta, apresto corto, cocción, se obtiene durante
los 7 días con la pasta realizada con la levadura obtenida con la
cepa S47-12b1 baguettes a la antigua con
excelente calidad organoléptica. Estas operaciones complementarias,
habida cuenta del empleo de una pasta fermentada que ha sufrido un
punteado largo que da fuerza y aroma, se pueden realizar en menos de
3 horas, preferentemente en menos de 2 horas. Este esquema de
fabricación con empleo de una levadura de panificación obtenida con
una cepa que presenta un fenotipo de sensibilidad al frío en la
fermentación, presenta las ventajas siguientes:
- -
- producción de pasta en masa en gran cantidad que se conserva sin problemas durante al menos 7 días,
- -
- control de la temperatura de enfriamiento de forma que tenga una primera fermentación o punteado que da fuerza y aroma a la pasta, y conservando a continuación sus propiedades reológicas durante al menos 7 días,
- -
- obtención de un pan de calidad organoléptica muy alta con un esquema de fabricación final corto de 3 horas de duración máxima y preferentemente menos de 2 horas.
En general, el empleo de levaduras obtenidas con
una cepa con un fenotipo de sensibilidad al frío en fermentación
permite obtener pastas en masa cualquiera que sea su composición
conservándose bien a 4ºC, fáciles de transportar. Estas pastas en
masa acondicionadas en grandes envases, por ejemplo en cubos o en
bandejas (lo que equivale a granel) presentan grandes ventajas en el
aspecto de la centralización o reagrupamiento de fabricaciones,
posibilidades de distribución de la pasta en masa sobre numerosos
puntos de fabricación final. Este empleo de levaduras con un
fenotipo de sensibilidad al frío es interesante principalmente para
preparar pastas listas para su empleo o a la cocción para su
distribución en los diferentes puntos de cocción.
Estas ventajas logísticas se obtienen en general
cualquiera que sea el momento en que se interrumpe el procedimiento
de fabricación a temperaturas inferiores o iguales a 10ºC: fermento,
pasta fermentada en masa, pasta elaborada, pasta lista para
cocer.
Además estas ventajas se pueden acoplar con la
elección de procedimientos de fabricación que proporcionan
importantes ventajas adicionales en la fabricación del pan:
- -
- la utilización de pastas de panadería para panes de tipo francés en masa bloqueada en el enfriamiento está controlada de manera que tenga una primera fermentación prolongada o un punteado largo, es un ejemplo de estas ventajas. Permite obtener rápidamente a continuación panes a la antigua muy aromáticos;
- -
- el control de la composición y de los aromas producidos en los fermentos que contienen una flora compuesta por una cepa de levadura sensible al frío y por bacterias lácticas preferentemente psicrófilas, es decir que se desarrollan rápidamente al frío, es otro ejemplo de aplicación nueva particularmente interesante en panificación.
(1) INFORMACIONES GENERALES:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: LESAFFRE ET CIE
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE: 41 rue Etienne Marcel
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: PARIS
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: FRANCE
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL: 75001
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Nuevas cepas de levadura sensibles al frío
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 2
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- LISTADO DESCIFRABLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE SOPORTE: Disquete
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: IBM PC compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- PROGRAMA INFORMÁTICO: PatentIn Release nº 1.0. Versión nº 1.30 (OEB)
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- DATOS ACTUALES DE LA SOLICITUD ANTERIOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: FR 96 01562
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FECHA DE SOLICITUD: 8-FEB-1996
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CLASIFICACIÓN: A21D C12N
\vskip0.666000\baselineskip
- (vii)
- INFORMACIONES RELATIVAS AL CONSULTOR O AL APODERADO:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: KOCH Gustave
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE REFERENCIA: DPE970018/GK
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- INFORMACIONES RELATIVAS A LAS COMUNICACIONES:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TELÉFONO: 01-44-63-41-11
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- FAX: 01-42-80-01-59
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- E-MAIL: info@plass.com
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIONES RELATIVAS A LA SEC ID nº 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 9621 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- NÚMERO DE CADENAS: simple
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: ADN genómico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO, la secuencia presentada está escrita en el sentido de traducción de la proteína.
\vskip0.666000\baselineskip
- (vi)
- ORIGEN:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- ORGANISMO: Saccharomyces cerevisiae
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CEPA: HL13.2.30, cepa depositada en el CNCM con el número I-1841
\vskip0.666000\baselineskip
- (viii)
- POSICIÓN EN EL GENOMA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- CROMOSOMA: XII
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- COORDENADAS: Nucleótidos 306483 a 316106 (cadena Crick)
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- FUENTE INMEDIATA:
- CLON: DH5\alpha[YCp50-10.39mut], cepa depositada en el CNCM con el número I-1842
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: gen YLR187c mutado
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 1...9621
\newpage
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- PROCEDIMIENTO DE IDENTIFICACIÓN: por similitud con las secuencias presentes en las bases de datos de ácidos nucleicos
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: secuencia codificadora
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 376...7863
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICA ADICIONAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: mutación
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- POSICIÓN: 7865
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- OTRA INFORMACIÓN: codón STOP (TGA)
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
3) INFORMACIONES RELATIVAS A LA SEC ID nº 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 2496 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CONFIGURACIÓN: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- DESCRIPCIÓN DE LA SEC ID nº 2:
Claims (17)
1. Cepa de levadura de panificación,
caracterizada porque permite obtener levaduras frescas de
panificación:
- * que dan por lo menos 100 ml de CO_{2} en 2 horas a 30ºC en la prueba A_{1}, preferentemente por lo menos 110 ml de CO_{2}, preferentemente también menos de 150 ml de CO_{2},
- * que obedece a la relación siguiente:
\frac{desprendimiento \ de \
CO_{2} \ en \ 48 \ horas \ a \ 8^{o}C \ en \ la \ prueba \
A_{1}}{desprendimiento \ de \ CO_{2} \ en \ 2 \ horas \ a \ 30^{o}C
\ en \ la \ prueba \
A_{1}}
inferior al 0,45, preferentemente inferior a 0,40
y más preferentemente inferior a
30
debiendo entenderse que, según la prueba A_{1},
a 20 g de harina incubada a la temperatura seleccionada para la
medición, se añade un peso de levadura comprimida correspondiente a
160 mg de materias secas, estando retardada esta levadura en 15 ml
de agua que contiene 27 g de NaCl por litro y 4 g de
(NH_{4})_{2}SO_{4} por litro; se amasa con ayuda de una
espátula durante 40 segundos, para obtener una pasta que se coloca
al baño-maría controlada a la temperatura
seleccionada; trece minutos después del comienzo del amasado, el
recipiente que contiene la pasta se cierra herméticamente; la
cantidad total de gas producido se mide después de 60, tras 120
minutos o varias horas; esta cantidad se expresa en ml a 20ºC y a
760 mm de Hg.
2. Cepa S47-12b1 depositada en el
CNCM con el nº I-1645.
3. Cepa L30-13 depositada en el
CNCM con el nº I-1647.
4. Cepa L30-91 depositada en el
CNCM con el nº I-1646.
5. Cepa HL13.2.30 depositada en el CNCM con el nº
I-1841.
6. Cepa caracterizada porque posee el
mismo fenotipo que las cepas según una de las reivindicaciones 1 a 5
y que lleva una mutación no letal en todos los genes YLR087c, siendo
dicha mutación un codón stop.
7. Procedimiento de obtención de una cepa según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, que comprende la
transformación de una cepa industrial de panificación que consiste
en condicionar la expresión de uno de estos genes de esta cepa que
ejercen una acción directa o indirecta en la fermentación de los
azúcares en función de la temperatura con la ayuda de un iniciador
cuya acción sobre la expresión de dicho gen depende de la
temperatura.
8. Utilización de levaduras frescas o secas
obtenidas con una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6 en un
procedimiento de panificación retardada.
9. Utilización según la reivindicación 8, en la
que el procedimiento de panificación retardada es un procedimiento
de crecimiento lento en el que el acabado se realiza a temperaturas
comprendidas entre 10 y 18ºC, preferentemente alrededor de 15ºC,
durante 15 a 24 horas.
10. Utilización según la reivindicación 8, en la
que el procedimiento de panificación retardada es un procedimiento
de crecimiento bloqueado o la fermentación se bloquea después del
apresto, inmediatamente antes meterlo en el
horno.
horno.
11. Utilización de levaduras frescas o secas
obtenidas con una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6 en un
procedimiento de panificación retardada que conduce a pastas que
quedan listas para cocer durante un periodo de por lo menos 4 horas,
y preferentemente durante por lo menos 8 horas.
12. Utilización según cualquiera de las
reivindicaciones 8 a 11, en el que el procedimiento de panificación
retardada conduce a un pan de tipo francés.
13. Utilización de levaduras frescas o secas
obtenidas con una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, para
la obtención de pastas en masa.
14. Utilización según la reivindicación 13, según
la cual las pastas en masa son pastas prefermentadas, fermentos o
pastas de primera fermentación.
15. Utilización según la reivindicación 13, según
la cual las pastas en masa son pastas amarillas fermentadas.
\newpage
16. Utilización de levaduras frescas o secas
obtenidas con una cepa según una de las reivindicaciones 1 a 6, para
la producción de pastas fermentadas en masa correspondientes a una
fermentación prolongada, que permite obtener a continuación con un
apresto corto panes aromáticos de tipo francés.
17. Utilización de levaduras frescas o secas
obtenidas con una cepa según las reivindicaciones 1 a 6, para la
obtención de fermentos, bacterias y levaduras.
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