ES2210277T3 - Procedimiento de separacion y polimeros de sintesis que pueden ser utilizados como medios de separacion en este procedimiento. - Google Patents

Procedimiento de separacion y polimeros de sintesis que pueden ser utilizados como medios de separacion en este procedimiento.

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ES2210277T3 ES95901673T ES95901673T ES2210277T3 ES 2210277 T3 ES2210277 T3 ES 2210277T3 ES 95901673 T ES95901673 T ES 95901673T ES 95901673 T ES95901673 T ES 95901673T ES 2210277 T3 ES2210277 T3 ES 2210277T3
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Abstract

UN METODO DE SEPARACION QUE CONSTA DE LOS PASOS: (I) CONTACTAR UN LIQUIDO ACUOSO QUE CONTIENE UNA SUSTANCIA DISUELTA A ENRIQUECER CON UN POLIMERO BAJO CONDICIONES QUE PERMITAN LA PARTICION SELECTIVA DE DICHA SUSTANCIA A DICHO POLIMERO, DESPUES DE LO CUAL (II) DICHO POLIMERO QUE CONTIENE DICHA SUSTANCIA SE EXTRAE DE DICHO LIQUIDO ACUOSO. EL POLIMERO EMPLEADO ES UN POLI(VINIL ETER) CON SUBUNIDADES DE ETER DE VINIL IDENTICAS O DIFERENTES (1) DONDE X E Y SE SELECCIONAN ENTRE HIDROGENO Y METIL; Y R SE SELECCIONA DE GRUPO S ORGANICOS. UNA PLURALIDAD DE R ES IGUAL A UN GRUPO ORGANICO HIDROFILICO. UNO O MAS R CONSTA DE UN LIGANDO DE BIOAFINIDAD; UN GRUPO DE INTERCAMBIO DE IONES, ETC. EL METODO PUEDE APLICARSE A LA BIOSEPARACION TAL COMO GEL, AFINIDAD, INTERCAMBIO DE IONES Y CROMATOGRAFIA COVALENTE Y PROCEDIMIENTOS CORRESPONDIENTES. TAMBIEN SE EXPONEN POLIMEROS DE ETER VINL QUE PUEDEN EMPLEARSE EN EL METODO.

Description

Procedimiento de separación y polímeros de síntesis que pueden ser utilizados como medios de separación en este procedimiento.
1.1. Antecedentes de la invención
La invención se refiere a medios para separaciones que implican la partición de una sustancia o grupo de sustancias deseadas entre un polímero y un líquido. Los polímeros usados se denominan normalmente medio de separación y pueden ser solubles o insolubles en el líquido. Para la separación de biomoléculas, el líquido es habitualmente acuoso. De acuerdo con el concepto de la invención, el polímero es un poli(éter de vinilo) hidrófilo.
Normalmente, los medios de separación insolubles se basan en matrices hidrófilas porosas compuestas por un polímero sintético o un biopolímero, por ejemplo, poli(hidroxialquil metacrilato), dextrano o agarosa. Las matrices pueden estar en forma de perlas, partículas o monolitos (formas continuas). Habitualmente, la superficie de la matriz se ha modificado con una funcionalidad específica para proporcionar la interacción real entre las moléculas de soluto y los ligandos inmovilizados en la matriz.
El documento EP-A-10425 describe la purificación de líquidos usando una membrana semipermeable compuesta y ósmosis inversa. La membrana comprende un material polimérico con cadenas laterales reticuladas con un compuesto que tiene 2 grupos funcionales.
En la actualidad, el intercambio iónico es la técnica cromatográfica usada más frecuentemente para la separación de biomoléculas. Otras técnicas importantes son filtración en gel, interacción hidrófoba, fase inversa, cromatografía en quelato metálico, cromatografía covalente y cromatografía por afinidad. Para una revisión, ver J-C. Janson et al^{(1)}. Los principios de adsorción de estas técnicas también se han aplicado a otras metodologías de separación, por ejemplo, procedimientos por lotes, electroforesis, centrifugación, etc.
Los éteres de vinilo se han sugerido como monómeros en polimerizaciones radicales para sintetizar partículas cromatográficas de soporte^{16,17)}. Sin embargo, los éteres de vinilo no son susceptibles a la polimerización radical, lo que indica que los poli(éteres de vinilo) no están permitidos en este tipo de publicaciones.
Los poli(alcoholes de vinilo) se prepararon por polimerización radical de acetato de vinilo con hidrólisis del éster posterior. Debido a la abstracción del radical hidrógeno y a la polimerización de cabeza a cabeza se introducirá una cantidad significativa de configuraciones inestables/desestabilizadas tales como dioles vecinos y ramificaciones carbono-carbono [-CH_{3-n}(-C(-)_{3})_{n}, donde n es 2 ó 3].
La síntesis de poli(éteres de vinilo) esencialmente lineales que contienen una cantidad baja de subunidades de éter de vinilo mediante polimerización catiónica en vivo se ha descrito previamente^{18-21} para el alquilvinil éter, 2-acetoxietil vinil éter, 2-hidroxietil vinil éter, 2-aminoetil vinil éter, 3-dicarboxipropil vinil éter y ésteres y amidas de los mismos, 2-carboxietil vinil éter, etc. Ver también las citas en las referencias 18-21. Las publicaciones describen las propiedades anfífilas de los oligómeros.
La polimerización catiónica en vivo del 2-(viniloxi)etoxi-acetato de etilo con la hidrólisis posterior de los grupos éster colgantes ha permitido obtener poli(éteres de vinilo) lineales que contienen un gran número de subunidades éter de vinilo. El grupo colgante del polímero final ha sido OCH_{2}CH_{2}OCH_{2}COOH^{22)} de forma uniforme.
Se han descrito polímeros que tienen cadenas -(CH_{2}CH_{2}-)_{n} en las que un hidrógeno de cada subunidad está sustituido con un metileno, un éter y/o una función carbonilo, que a su vez están unidos a grupos más o menos hidrófilos^{23)}. Se han usado principalmente en membranas semipermeables para la desalinización de agua salobre por ósmosis inversa.
1.2 Requisitos para los medios de separación y mejoras deseadas
Las matrices actuales (medios de separación) en las que se divide una sustancia soluble en agua tienen que mostrar una gran hidrofilia hacía un líquido acuoso, baja interacción no específica con proteínas, estabilidad de pH en el intervalo de 2-14, etc. Las mejoras en relación con estas variables son deseables. Además, es de gran interés mejorar los parámetros relacionados con la química de superficie incluyendo la capacidad de gel y la cinética, lo que dará un productividad considerablemente mayor en una separación.
Estrategia de la invención
Las mejoras mencionadas anteriormente pueden lograrse utilizando matrices de separación que proporcionan superficies con buena adsorción (enlaces hidrófobos) o enlaces covalentes (con preferencia por los enlaces amino, éter y tioéter).
Los monómeros apropiados y las condiciones de polimerización apropiadas permitirán controlar la reacción con el efecto de obtener de manera reproducible polímeros bien caracterizados óptimos para la aplicación que se la pretende dar (medio para filtración en gel, medio de afinidad, medio de intercambio iónico, polímero a funcionalizar con diversos grupos predeterminados, etc).
Se ha descubierto que los poli(éteres de vinilo) hidrófilos cumplirán los criterios mencionados anteriormente. La síntesis preferida es polimerización catiónica^{2)}. Para nuestro propósito, es probable que la "polimerización catiónica en vivo" sea extremadamente eficaz porque puede conducir a polímeros que contienen bloques y secuencias de monómeros bien definidos en la cadena del polímero.
2. La invención
Un primer aspecto de la invención es un nuevo método de separación cromatográfica que utiliza ciertos tipos de polímeros de éter de vinilo hidrófilos. El método se define en el punto 2.5. Un segundo aspecto son nuevos polímeros hidrófilos de éter de vinilo.
2.1 Definición de los poli(éteres de vinilo) hidrófilos que se pueden usar en el método de separación de la invención
La característica de estos polímeros es que comprenden una cadena de poli(éter de vinilo) que contiene subunidades de vinilo idénticas o diferentes. Las subunidades tienen la Fórmula I:
---
\uelm{CH}{\uelm{\para}{X}}
---
\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}{C}{\uelm{\para}{Y}}
---
Para que sean útiles en agua y otros líquidos acuosos R se selecciona de forma que el polímero sea hidrófilo. La cadena del polímero no tiene prácticamente ramificaciones carbono-carbono y/o grupos éter próximos formados durante la reacción de polimerización [CH_{3-n}(-C(-)_{3})_{n}, donde n es 2 ó 3].
X e Y pueden ser idénticos o diferentes y se seleccionan entre hidrógeno y metilo. En el caso de que uno sea metilo, se prefiere que sea X.
R se selecciona entre grupos orgánicos que proporcionan un átomo de carbono saturado o aromático unido directamente al átomo de oxígeno. Los grupos orgánicos apropiados son grupos hidrófobos y grupos hidrófilos. En toda la memoria descriptiva un carbono saturado significa un átomo de carbono hibridado sp^{3} que une solamente carbono y/o hidrógeno y como mucho un oxígeno o nitrógeno o azufre.
Los grupos hidrófobos R son grupos hidrocarbilo que están saturados o que contienen estructuras insaturadas, tales como anillos aromáticos u otros enlaces carbono-carbono insaturados, etc. Más específicamente son alquilo, arilalquilo, alquilarilo o alquenilo. Preferiblemente, los grupos hidrocarbilo tienen de 1-25, tal como 1, 2, 3, 4, etc. hasta 20 o hasta 15 átomos de carbono. Uno o más hidrógeno(s) del grupos hidrocarbilo se pueden sustituir con un grupo funcional, preferiblemente no iónico, por ejemplo un hidroxilo alcohólico o fenólico, un éster, un éter, un tioéter, etc. La relación molar C/(O+N+S) es normalmente mayor de 5.
Los grupos hidrófilos (R) contienen una cadena lineal, ramificada o cíclica de átomos de carbono hibridados en sp^{3} (saturados), a los que se unen hidrógenos, carbonos saturados y al menos un grupo hidroxi y/o amino. La cadena puede estar rota, en una o más posiciones, por un átomo de oxígeno o de nitrógeno. Hay como mucho un átomo de oxígeno o nitrógeno unido a uno y al mismo átomos de carbono. La relación molar (O+N)/C es mayor que o igual a 0,5. El átomo de oxígeno o nitrógeno mediante el cual estos grupos se unen al esqueleto polimérico de carbono se incluye en la suma (O+N). Los grupos de 2-15 átomos de carbono son ejemplos ilustrativos.
R es R'-B- donde B es un enlace orgánico hidrófilo que consta de una cadena de carbono saturado lineal, ramificada o cíclica de 2-24, tal como de 2-12 carbonos hibridados en sp^{3}. La cadena puede estar rota, en una o más posiciones, por un átomo de oxígeno o de nitrógeno y/ contener al menos un grupo hidroxi y/o al menos un amino primario (NH_{2}) unido directamente a uno de dichos átomos de carbono hibridados en sp^{3}. Hay como mucho un átomo de oxígeno o nitrógeno unido a uno y al mismo átomo de carbono. La relación molar (O+N)/C es mayor que o igual a 0,5. El átomo de oxígeno o nitrógeno mediante el cual estos grupos se unen al esqueleto polimérico de carbono se incluye en la suma (O+N). Los grupos de 2-15 átomos de carbono son ejemplos ilustrativos.
Un grupo R particularmente preferido es R'-B, donde B es un enlace orgánico hidrófilo que consta de una cadena de carbono saturado lineal, ramificada o cíclica de 2-24, tal como de 2-12 carbonos hibridados en sp^{3}. La cadena puede estar rota, en una o más posiciones, por un átomo de oxígeno o de nitrógeno y/ contener al menos un grupo hidroxi y/o al menos un grupo amino primario (NH_{2}) unido directamente a uno de dichos átomos de carbono hibridados en sp^{3}. Hay como mucho un átomo de oxígeno o nitrógeno unido a uno y al mismo átomo de carbono de la cadena. La relación molar (O+N)/C es mayor que o igual a 0,5. La suma (O+N) incluye átomos de oxígeno y nitrógeno que se unen directamente a las posiciones terminales de B. Preferiblemente, B cumple con la fórmula [(CH_{2})_{n}-O]_{m} donde n es un número entero que puede ser 2-4 y m es un número entero que puede ser 1-10.
R' (en R'-B) se selecciona entre OH, NH_{2} y formas sustituidas de los mismos, en las que uno o dos hidrógenos se han sustituido con un resto orgánico R''. En el caso de que se requiera estabilidad hidrolítica para las formas sustituidas de los grupos OH y NH_{2}, existen preferiblemente en forma de éter respecto de una amina secundaria, terciaria o cuaternaria, es decir, el resto orgánico R'' proporciona un átomo de carbono saturado o aromático unido directamente al oxígeno o nitrógeno.
Se sabe que los enlaces tioéter tienen aproximadamente la misma estabilidad y basicidad hidrolítica que los enlaces éter. Por lo tanto, en el contexto de la presente invención, es probable que los enlaces tioéter funcionen de forma equivalente a los enlaces éter. Esto implica además que OH se puede sustituir con SH.
El resto orgánico R'' se puede seleccionar entre: (A) grupos que comprenden ligandos de afinidad; (B) grupos que permiten la unión reversible disulfuro de compuesto tiol con el poli(éter de vinilo) (por ejemplo, cromatografía covalente); (C) grupos notablemente hidrófilos; y (D) grupos que hacen al poli(éter de vinilo) insoluble en líquidos acuosos (por ejemplo, agua). Los grupos A y/o B están presentes en el poli(éter de vinilo) de acuerdo con el segundo aspecto de la invención.
Algunos ejemplos ilustrativos de ligandos de afinidad son:
a. Un miembro en un par de compuestos que ejercen una afinidad bioespecífica entre ellos (ligandos de bioafini- dad). Algunos ejemplos de tales pares son antígenos/haptenos y entidades anticuerpos activos (anticuerpos intactos y sus fragmentos de anticuerpos activos (Fab, Fv, F(ab)_{2}, etc); hormonas y sus receptores; proteínas de unión a IgG (proteína A, G y L) y fragmentos que contienen IgG que contienen un región Ig constante; ácidos nucleicos complementarios; oligonucleótidos complementarios; lecitinas y compuestos que contienen estructuras carbohidratos; biotina y (estrep)avidina etc.
b. Grupos de intercambio iónico seleccionados entre carboxi (-COO^{-} unido a carbono), ácido sulfónico (-SO_{3}^{-} unido a carbono), ácido fosfónico (-PO_{3}^{2-} unido a carbono), amina primaria, secundaria, terciaria o cuaternaria (formas cargadas positivamente), grupos iónicos bipolares que contiene grupos cargados positiva y negativamente seleccionados entre aquellos que se han mencionado previamente y grupos anfífilos que contienen partes hidrófobas e iónicas distintas. Los átomos de carbono a los que se unen -COO^{-}, -SO_{3}^{-} y -PO_{3}^{2-} están preferiblemente saturados aunque también pueden ser aromáticos. Además del grupo iónico estos carbonos solo llevan hidrógeno y carbono.
c. Grupos hidrófobos como los definidos anteriormente para R.
d. Grupos quelato que comprenden un ión metálico fuertemente quelado, por ejemplo, los iones apropiados de cinc, hierro, cobre, cobalto, etc.
e. Restos orgánicos R'' que permiten que las uniones disulfuro reversibles muestren un grupo funcional que se selecciona entre: tiol (HS-), disulfuros reactivos (R^{1}-S-S-), tiosulfonatos (R^{2}-SO_{2}-S-) y tiosulfenatos (R^{3}-SO-S-) todos ellos con su valencia libre unida directamente a un carbono saturado. R^{1} se selecciona de forma que R^{1}-S-S reaccione cuantitativamente con compuestos tiol en una reacción de intercambio tiol-disulfuro con liberación de un tiol (R^{1}-SH) que se tautomeriza cuantitativamente con la tiona correspondiente (HR'^{1}=S). Algunos ejemplos típicos de R^{1} son 2-piridilo y 4-piridilo. R^{2} y R^{3} son, en principio, cualquier grupo orgánico que proporciona un carbono (preferiblemente saturado) junto al átomo de azufre, lo que significa que R^{2}-SO_{2}-S y R^{2}-SO-S- formarán disulfuros con compuestos tiol de forma análoga a R^{1}-S-S-. La expresión "enlace disulfuro reversible" significa que el disulfuro se puede dividir en presencia de un exceso de un compuesto tiol de bajo peso molecular.
f. Grupos hidrófilos como los definidos anteriormente para R. Otros ejemplos son restos poliméricos de polímeros solubles en agua, por ejemplo polisacáridos tales como dextrano, hidroxietilalmidón, carboximetilcelulosa, etc. Los restos poliméricos R'' pueden comprender también una o más unidades de repetición de fórmula I unidas al átomo de nitrógeno u oxígeno de HO-B- o NH_{2}-B-, respectivamente.
El poli(éter de vinilo) puede ser insoluble en medio líquido acuoso. La insolubilidad puede estar causada por la presencia de subunidades de fórmula 1 donde R' es una forma sustituida de OH o NH_{2} en la que al menos un hidrógeno está sustituido con un resto orgánico (R'') seleccionado entre:
g. grupos que están unidos de forma covalente a un vehículo (matriz vehículo) que es insoluble en el medio líquido acuoso; y
h. grupos que proporcionan insolubilidad mediante reticulación inter- y/o intramolecular de la cadena de poli(éter de vinilo).
La insolubilidad también estar causada por la presencia de subunidades de fórmula I en las que
i. Grupos hidrófobos R o restos orgánicos hidrófobos R'' en R' están adsorbidos físicamente a un vehículo hidrófobo (matriz vehículo) que es insoluble en el medio líquido acuoso.
Preferiblemente, la insolubilidad está causada por una unión covalente mediante una forma sustituida de dicho grupo OH o NH_{2} (punto g anterior).
La insolubilidad también puede estar causada por la unión a vehículos matriz en posiciones distintas que las mencionadas de forma explícita anteriormente, por ejemplo en una posición terminal de la cadena polimérica lineal (ver a continuación).
Los vehículos matriz insolubles en agua puede tener distintas formas físicas tales como perlas, monolitos, bolas, partículas, paredes tubulares, membranas, etc. Los vehículos matriz pueden ser orgánicos o inorgánicos. Pueden ser porosos o no porosos. El material de los vehículos matriz puede ser hidrófilo y basado en polisacáridos insolubles tales como agarosa o dextrano reticulado. El vehículo matriz también puede ser hidrófobo, por ejemplo, estar hecho de poliestireno.
El poli(éter de vinilo) usado en la presente invención se representa por la Fórmula 2:
1
donde las valencias libres terminales se unen a grupos que se han introducido mediante la iniciación y terminación, respectivamente, de la polimerización, incluyendo dichos grupos derivatizados. La valencia libre de la izquierda se puede unir a un hidrógeno 5 o a un carbono de un carbocatión de inicio. La valencia libre de la derecha se puede unir a un grupo vinilo (pérdida de hidrógeno (H^{+}) en el último monómero añadido) o a un grupo formado por reacción del centro carbocatiónico de la cadena de propagación con una base de Lewis, tal como un carbanión [^{-}C(-)_{3}, donde (-)_{3} representa enlaces a grupos que permiten la formación del carbanión] y un alcohol y el correspondiente ión alcóxido. Los iones alcóxido dan grupos finales acetal (Y_{m+1}= hidrógeno) o grupos finales cetal (Y_{m+1}= metilo) y el carbanión da funciones éter [-C(OR_{m'+1})Y_{m'+1}-C(-)_{3}]. "m+1" indica que es una subunidad terminal situada a la derecha. Un ejemplo típico de un carbanión útil es el anión diéster del ácido malónico [^{-}CH(COOR_{a})_{2} con R_{a} = alquilo o arilo)] que da -CY_{m'+1}(OR_{m'+1})CH(COOR_{a})_{2} como grupo final. Las bases de Lewis tales como amoniaco y aminas primarias tienen como resultado grupos finales inestables. Los grupos terminales introducidos debidos a reacciones de inicio y/o terminación se pueden procesar adicionalmente en muchos casos y emplearse con propósitos específicos. Por ejemplo -CY_{m'+1}(OR_{m'+1})CH(COOR_{a})_{2}se puede hidrolizar en -CY_{m'+1}(OR_{m'+1})CH(COOH)_{2}que a su vez se pueden descarboxilar en -CY_{m'+1}(OR_{m'+1})CH_{2}COOH y unirse posteriormente de forma covalente a un vehículo matriz que tiene grupos hidroxilo o amino.
R_{1}, R_{2} ... R_{m} son grupos seleccionados de la misma manera que R (en la fórmula I anterior). Se seleccionan, por ejemplo, entre (i) grupos hidrófobos, tales como grupos hidrocarbilo y grupos hidrófilos, y (ii) R_{1} = R'_{1}-B_{1}-, R_{2} = R'_{2}-B_{2}- ... R_{m'} = R'_{m'} -B_{m'}-B_{m'}-R'_{1}, R'_{2} ... R'_{m} y B_{1}, B_{2} ... B_{m} se seleccionan de la misma forma que R' y B, respectivamente.
X_{1}, X_{2}, X_{3} ... X_{m} e Y_{1}, Y_{2}, Y_{3} ... Y_{m}se seleccionan de la misma forma que los X e Y anteriores.
n_{m} es un número entero que indica el número de bloques que contienen idénticas subunidades de vinilo de repetición. Para cualquier bloque dado al menos uno de X, Y y R difiere de su homólogo en el(los) bloque(s) vecino(s) más próximo(s).
n_{1}, n_{2}, ... n_{m} son números enteros mayores de cero y n_{1} + n_{2} + ... + n_{m} = n, donde n es el número de subunidades de éter de vinilo en la cadena lineal del polímero. n es preferiblemente < 20.000, tal como < 15.000. Para el polímero como tal, existe novedosamente para cadenas más largas, es decir, n > 150, tal como > 200 o > 300 o > 500 o > 1.000. Para el método de separación definido en el apartado 2.5, el límite inferior puede ser potencialmente igual a 10, 50, 100, 200, 300, 500 ó 1.000.
B puede ser uniforme para esencialmente todas las subunidades de vinilo en las que R cumple con R'-B-.
Para proporcionar suficiente hidrofilia, una diversidad, preferiblemente al menos un 5%, tal como al menos un 25 de las subunidades de vinilo de la cadena lineal del polímero tienen grupos R seleccionados entre los grupos hidrófilos mencionados anteriormente. Los R adecuados (R_{1},R_{2}, ... R_{m}) se seleccionan entre HO-B-, H_{2}N-B- y formas sustituidas de los mismos en las un hidrógeno hidroxi o un hidrógeno amino se sustituye con el grupo hidrófilo mencionado anteriormente (resto orgánico, R''). El límite superior correspondiente es habitualmente del 75% y en algunos casos prácticamente del 100%.
Los restos orgánicos R'' de acuerdo con las alternativas a, b, c, d, e, f, g, h o i están presentes en al menos un R. Algunos límites superiores ilustrativos para cada una de estas alternativas son del 50% o del 75%. En el segundo aspecto de la invención siempre están presentes grupos R'' que (A) comprenden ligandos de afinidad y/o (B) permiten la unión reversible disulfuro de los compuestos de tiol con el poli(éter de vinilo).
Los polímeros definidos en la fórmula 2 (con subunidades de vinilo como las definidas en la fórmula 1 y n > 150) en los que están presentes OH y/o NH_{2} junto con las formas sustituidas de las mismas de acuerdo con al menos una de a, b, c, d, e, f, g, h e i son nuevos como tales.
Una realización particular de la invención es el complejo que se forma durante una separación (como se define en el apartado 2.5) entre el polímero de vinilo y la sustancia a dividir con el polímero. Algunos ejemplos de sustancias que pueden formar complejos con los polímeros de la presente invención son moléculas bio-orgánicas tales como proteínas y polipéptidos, lípidos, carbohidratos, ácidos nucleicos, oligonucleótidos, nucleótidos, esteroides, aminoácidos, etc. La sustancia forma un complejo con el polímero de vinilo debido a (a) grupos unidos con disulfuro introducidos mediante el uso de reacciones de intercambio de tiol como las definidas anteriormente para las uniones reversibles disulfuro o (b) restos orgánicos R'' que muestran grupos seleccionados entre grupos de afinidad (por ejemplo, grupos de bioafinidad, grupos de intercambio iónico, grupos de quelato metálico, grupos hidrófobos como se han definido anteriormente).
2.1 Síntesis de monómeros
Los éteres de vinilo como tal están bien adaptados a la polimerización catiónica. Sin embargo, la presente invención requiere la introducción de grupos nucleófilos/hidrófilos, cuya presencia está prohibida durante la polimerización catiónica. Como consecuencia, se tienen que introducir grupos protectores en los monómeros que se van a usar.
Sawamoto et al.^{3)} han demostrado que el 2-acetoxietil vinil éter (AcOVE) se puede sintetizar por la ruta (Fórmula 3):
2
El AcOVE también se puede obtener por acetilación de 2-hidroxietil vinil éter (HEVE).
Se puede introducir un grupo protector conveniente mediante la reacción de HEVE con dicarbonato de di-terc-butilo (Fórmula 4):
3
Las fórmulas 3 y 4 dan dos grupos protectores que tienen distintas estabilidades inherentes hacia ácido y base. El grupo acetoxi se puede retirar en condiciones alcalinas mientras que el grupo t-BOC se puede retirar con ácido^{4)}. El grupo protector t-BOC es ventajoso en nuestro caso porque experimenta una eliminación catalizada con ácido para dar productos secundarios gaseosos y el polímero de vinil hidroxialquil éter en solución^{5-6)}. La reacción será (Fórmula 5):
4
Un tercer grupo protector que se puede usar es el grupo 5-butil dimetil siloxilo.
La ftalimida como grupo protector ha sido descrita por Higashimura et al.^{7)} (Fórmula 6):
5
Después de la polimerización, la desprotección se consigue con hidrazina y se obtiene poli(2-aminoetil vinil éter).
En los libros de texto se proporcionan más grupos protectores para grupos amino e hidroxi. Véase Protective Groups in Organic Chemistry (TW Greene, John Wiley & Sons, 1981).
2.3 Síntesis del polímero 2.3.1 Características generales de la polimerización catiónica
Las polimerizaciones se consideran "catiónicas" cuando implican una especie activa cargada positivamente que actúa como un electrófilo hacia el monómero. Los éteres de vinilo (Fórmula 7)
CH_{2}=
\delm{C}{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}
H
que tienen un sustituyente alcoxi fuertemente donador de electrones, forman fácilmente polímeros al ser tratados con un ácido, es decir el crecimiento de la cadena se activa con un iniciador ácido, tal como un ácido 5 protónico, ácido de Lewis o más recientemente con distintos "Sistemas Vivos"^{8)}.
Wislicenus informó en 1878 de la transformación de etil vinil éter en un material viscoso cuando había yodo presente^{9)}. Las primeras investigaciones sistemáticas de la polimerización del éter de vinilo comenzaron en 1928 en I.G. Farberindustrie en Alemania. Para revisarlo ver Schildknecht et al^{10)}. Dos décadas después, en 1947, Schildknecht et al reconocieron que el poli(isobutil vinil éter) obtenido con el ácidos de Lewis trifluoruro de boro o su etearato (BF_{3}OEt_{2}) es cristalino (no viscoso) o amorfo (viscoso) dependiendo de las condiciones de polimerización.
Hasta el momento se han usado distintos ácidos de Lewis para el inicio de polimerizaciones catiónicas. Una fórmula representativa es MtX_{n} (Mt = metal incluyendo boro; X = halógeno; y n es una cifra que hace que MtX_{n} sea un ácido de Lewis).
2.3.2 Síntesis de poli(éteres de vinilo)
Prioritariamente, nuestra elección de ácido de Lewis es BF_{3}O(Et)_{2}, que da un protón iniciador al reaccionar con pequeñas cantidades de agua presentes en el sistema de polimerización.
Una ruta general de polimerización para un éter de vinilo es (Fórmula 8):
6
Las etapas de la reacción son: (1) = inicio; (2) = propagación; (3) = terminación.
Usando formas protegidas de 2-aminoetil vinil éter y 2-hidroxietil vinil éter, polimerizando y finalmente con desprotección, hemos logrado sintetizar poli(2-hidroxietil vinil éter), poli(2-aminoetil vinil éter) y los copolímeros análogos que contienen tanto grupos amino como hidroxi en relaciones predeterminadas. Añadiendo vinil hidrocarbil éteres a la mezcla de polimerización, se pueden introducir en la cadena bloques de subunidades en los que R es un grupo puramente hidrófobo.
2.4 Derivatización de poli(éteres de vinilo)
La desprotección conduce a la introducción de grupos OH- y/o NH_{2} que permiten el acoplamiento de distintos restos orgánicos R''.
Los métodos para acoplar un resto orgánico R'' a grupos OH y/o NH_{2} son conocidos en la técnica anterior. Hacen uso habitualmente de compuestos bifuncionales A-(enlace)_{n}-C donde
(a)
n puede ser 1 ó 0
(b)
A es una función reactiva que es capaz de formar un enlace covalente con un grupo amino o grupo hidroxi (por ejemplo HO-B- o H_{2}N-B-) del polímero base (de fórmula 2),
(c)
el término "enlace" representa un enlace orgánico, y
(d)
C es un grupo que tiene la propiedad/función que se va a unir al polímero de vinilo o un grupo que se puede transformar en dicha función/propiedad.
Los métodos comprenden poner en contacto un poli(éter de vinilo) de fórmula 2 que muestra grupos HO- y/o -NH_{2} con un compuesto bifuncional A-(enlace)_{n}-C en condiciones que permiten la formación de un enlace covalente entre A y un grupo HO- o H_{2}N- del poli(éter de vinilo), seguido, si es necesario, de la transformación de C en el grupo deseado y la desprotección y derivatización de más grupos HO- y/o NH_{2}- para introducir otros restos orgánicos R''.
Preferiblemente, A se selecciona de forma que se crea un enlace éter o amino (secundario, terciario o cuaternario). Algunos ejemplos ilustrativos de A son epóxidos y el grupo de análogos de nitrógeno (en el que -O- se sustituye con -NH-), halohidrinas, dihaluros de alquilo próximos, haluros de alquilo en los que el átomo halo es á con un carbono sp^{2} y ciertos enlaces dobles C-C que están unidos directamente a un sustituyente fuertemente aceptor de electrones.
El enlace orgánico es inerte, conteniendo preferiblemente sólo grupos hidrocarbilo, grupos éter y otros grupos difíciles de hidrolizar. Con el término "inerte" se contempla que, en las condiciones empleadas, el enlace no se deteriora ni participa en reacciones secundarias. Para n=0 el significado de "enlace" se vuelve redundante.
El grupo C se selecciona entre los mismos grupos reactivos que A. Además, C puede ser un vehículo matriz (incluyendo polímeros solubles e insolubles) que se han activado para contener el grupo reactivo A.
Ciertos reactivos bifuncionales son estructuralmente monofuncionales aunque con una función reactiva que les permite reaccionar dos veces con nucleófilos. Algunos ejemplos son CNBr, carbodiimidas y carbonil diimizadol. Para este tipo especial de reactivos n es igual a 0 y A es estructuralmente no distinguible de C.
2.4-1-2 Síntesis del intercambiador catiónico y aniónico
Los polímeros de intercambio iónico de fórmula 2 se pueden obtener haciendo reaccionar un compuesto bifuncional A-(enlace)_{n}-C como se ha definido anteriormente en el que C es un grupo de intercambio aniónico o catiónico o un grupo que se puede transformar en tal grupo, con un polímero de fórmula 2 que contiene grupos HO- y/o NH_{2}. Las condiciones de reacción aplicadas, la selección del poli(éter de vinilo) de partida, las posibles etapas posteriores para introducir otros restos orgánicos unidos a dichos grupos HO- y/o NH_{2} y las opciones preferidas entre estas variables son las descritas en el apartado 2.4 anterior. Una forma adecuada es comenzar con un poli(éter de vinilo) soluble en agua, introducir el resto orgánico de intercambio iónico y acoplar el polímero derivatizado de éter de vinilo de intercambio iónico a un vehículo matriz (vehículo) en una reacción posterior.
Algunos ejemplos ilustrativos de grupos de compuestos bifuncionales son haluros de alilo (que después de la reacción con el polímero se pueden procesar adicionalmente con bisulfito o aminas primarias o secundarias para introducir grupos de ácido sulfónico o grupos amino, respectivamente), clorhidrato de cloruro de N,N-dietil aminoetilo, cloruro de glicidil trimetilamonio, ácidos a-haloacéticos, etc.
La cantidad de grupos de intercambio iónico introducida se controla con la cantidad relativa de grupos OH- y NH_{2} libres (desprotegidos) en el polímero de partida, la cantidad relativa de compuesto bifuncional añadido (A (enlace)_{n}-C) y la reactividad y selectividad del grupo reactivo A, etc.
2.4.3 Acoplamiento de otros grupos que permiten reacciones específicas (grupos hidrófobos, grupos de quelato metálico, grupos reactivos disulfuro y ligandos de bioafinidad)
Se puede aplicar el principio general para la introducción de restos orgánicos R'' descrito en el apartado 2.4 anterior, con la excepción de que el compuesto bifuncional A-(enlace)_{n}-C ahora se selecciona de forma que C contiene un grupo de acuerdo con los puntos a-e anteriores o un grupo que se pueda transformar en un grupo que contiene uno de estos grupos. Las condiciones de reacción aplicadas, la selección del poli(éter de vinilo) de partida y las posibles etapas posteriores para introducir otros restos orgánicos son análogas con las que se han mencionado en el apartado 2.4 anterior.
2.4.4 Acoplamiento del polímero a un vehículo matriz (vehículo)
La reacción de acoplamiento se realiza con los procedimientos convencionales descritos anteriormente en el apartado 2.4. El poli(éter de vinilo) de partida muestra grupos HO- y/o NH_{2}- como los definidos para la fórmula 1 y puede ser soluble en agua o insoluble en agua. Además, el polímero puede mostrar subunidades de vinilo que tienen restos orgánicos R'' de acuerdo con al menos una de los puntos a-f de la fórmula 1, con preferencia por los restos que tienen grupos de intercambio iónico o grupos hidrófobos. En el compuesto bifuncional A-(enlace)_{n}-C es grupo A y "enlace" tienen el mismo significado que el indicado en el apartado 2.4. El grupo C está restringido a comprender un vehículo matriz o un grupo que puede formar un enlace hidrófobo adsorbente o un enlace covalente con un vehículo matriz.
La reacción de acoplamiento comprende la reacción de un compuesto bifuncional A-(enlace)_{n}-C con un polímero como el definido en la fórmula 2 en condiciones que permiten la formación de un enlace covalente entre A y el polímero, y después, si C no comprende un vehículo matriz, la unión de C a un vehículo matriz. El polímero de éter de vinilo se puede derivatizar adicionalmente, por ejemplo introduciendo uno o más restos orgánicos R''.
Como alternativa, el polímero también se puede adsorber físicamente al vehículo matriz, por ejemplo el poli(éter de vinilo) tiene grupos hidrocarbilo y el vehículo matriz es hidrófobo.
El vehículo matriz (vehículo) puede ser soluble o insoluble en un medio acuoso tal como agua.
El polímero de la invención también puede formar su propio vehículo matriz reticulándose con ayuda de un compuesto bifuncional A-(enlace)_{n}-C en el que A y C pueden formar enlaces covalentes con grupos OH- o NH_{2}-.
2.5 Aplicaciones generales de los polímeros de la invención
El poli(éter de vinilo) descrito en este documento se puede usar de acuerdo con los principios de separación que comprenden las etapas de:
a. poner en contacto un líquido acuoso que en forma disuelta contiene una sustancia (incluyendo un grupo de sustancias) que se va a enriquecer con un polímero en condiciones que permiten la partición selectiva de dicho polímero de dicha sustancia o grupo de sustancias, después de lo cual
b. dicho polímero de parte del mimos que contiene la sustancia o grupo de sustancias se retira de dicho líquido acuoso.
Los polímeros usados previamente en este tipo de separaciones eran solubles o insolubles en los líquidos acuosos usados.
La(s) sustancia(s) separadas del polímero pueden ser contaminantes para retirar o sustancias que se desean aislar. En el primer caso, el tratamiento continúa con el líquido acuoso restante. En el último caso, el tratamiento continúa con el polímero.
El líquido acuoso es habitualmente agua.
El método general comprende distintos procedimientos cromatográficos, procedimientos en lotes, electroforesis en geles y otras matrices adecuadas, adsorciones realizadas en inmunoensayos, centrifugaciones que utilizan separación en polímeros, filtraciones con membrana, métodos de separación basados en la formación de complejos, precipitación y sedimentación con ayuda de un polímero.
De acuerdo con el concepto de la invención, la propiedad característica del polímero es que cumple con la fórmula 2, es decir, un polímero que tiene subunidades de éter de vinilo como las definidas en la fórmula 1 y que este polímero está en contacto directo con el medio líquido acuoso durante la etapa de separación (etapa a anterior).
Los subaspectos de este aspecto de la invención utilizan
A. el polímero de fórmula 2 como una matriz para la filtración en gel (las subunidades muestra grupos OH libres incluyendo restos orgánicos de acuerdo con f y opcionalmente también grupos/restos de acuerdo con g, h e i como se han definido para la fórmula 1), o B técnicas de absorción/adsorción basadas en que el polímero de vinilo de fórmula 2 tiene al menos un tipo de resto orgánico R'' que proporciona la unión/interacción entre la sustancia a dividir y el polímero (las subunidades muestran por ejemplo grupos a, b, c, d y e como se han definido para la fórmula 1).
La separación por cromatografía se describirá en detalle por propósitos ilustrativos.
La separación por cromatografía depende de la separación diferencial de biomoléculas entre una fase estacionaria (el medio cromatográfico) y una fase móvil (la solución tampón, fase líquida acuosa). Normalmente la fase estacionaria se sitúa en una columna vertical de plástico, vidrio o acero inoxidable mientras que la solución tampón se pasa a través de esta columna.
Desde la fabricación de los primeros intercambiadores iónicos de celulosa de Peterson y Sober^{12)} y desde el primer medio práctico de filtración en gel de Porath y Flodin^{13,14)} se han introducido una diversidad de adsorbentes que explotan distintas propiedades de las proteínas. Algunas propiedades importantes y sus métodos cromatográficos son:
7
El principio de unión/separación subyacente se puede aplicar también a otras técnicas de separación tales como procedimientos por lotes, electroforesis, centrifugaciones, etc.
El método de la invención está adaptado particularmente a la separación de compuestos que tienen una estructura de proteína o polipéptido, estructura de lípido, estructura de carbohidrato, estructura de ácido nucleico u oligonucleótido, estructura de esteroide, estructura de aminoácido, etc.
La evaluación de los nuevos polímeros descritos en este texto se ha realizado hasta el momento por Filtración en Gel y Cromatografía de Intercambio Iónico.
2.5.1 Cromatografía de filtración en gel
En la filtración en gel, las moléculas en solución se separan de acuerdo con diferencias en sus tamaños al pasar a través de una columna cargada con medio de gel cromatográfico. Los medios adecuados tienen un intervalo de tamaño de poros cuidadosamente controlado y se forman habitualmente reticulando un polímero hidrófilo adecuado con una red tridimensional.
Se puede preparar geles compuestos injertando un segundo polímero en una matriz preformada. En Superdex® las cadenas de dextrano están unidas covalentemente a una matriz de gel de agarosa altamente reticulada (Superdex® y Superose® (a continuación) son marcas registradas de Pharmacia Bio Tech AB, Suecia).
Hemos injertado poli(2-hidroxietil vinil éter) en Sepharose®HP (basado en agarosa reticulada) y hemos evaluado el producto obtenido por comparación con Superdex® 30 PG. Este tipo de matriz compuesta llevará a un sistema más definido porque los polímeros basados en éter de vinilo fabricados sintéticamente pueden variar en composición prácticamente como se desee. Los parámetros del polímero a cambiar son el peso molecular y su distribución, el volumen hidrodinámico que depende de los grupos laterales del polímero etc.
La comparación ha implicado parámetros tales como la tendencia a interacciones no deseadas y curvas de selectividad. Se ha demostrado claramente que el poli(2-hidroxietil vinil éter) unido a Sepharose® HP tiene iguales o mejores características que Superdex® 30 PG en una aplicación representativa de filtración en gel.
2.5.2 Cromatografía de adsorción
La cromatografía de adsorción depende de distintos tipos de interacciones entre moléculas de soluto y los ligandos inmovilizados en una matriz cromatográfica. La cromatografía de afinidad, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía covalente, cromatografía de quelato metálico y la cromatografía de interacción hidrófoba son ejemplos ilustrativos de cromatografía de adsorción.
En este punto se compararon el polímero de intercambio catiónico preparado sintéticamente de fórmula 10 injertado en Sepharose® HP y el polímero de intercambio aniónico de fórmula 9 injertado en Sepharose® HP con productos comerciales representativos de Pharmacia AB.
3. Mejor forma
Los mejores resultados experimentales hasta el momento se han conseguido con los vehículos cromatográficos presentados en la parte experimental. Sin embargo, los solicitantes creen que se obtendrán mejores resultados con poli(éteres de vinilo) producidos mediante la denominada polimerización catiónica "viva" o "controlada".
4. Experimental 4.1.1 Materiales
El 2-cloroetil vinil éter (98%), bromuro de alilo (98%) y etil etearato de trifluoro de boro (48% BF_{3}(O(C_{2}H_{5})_{2})) se compraron en Fluka (Schweiz). El 2-hidroxietil vinil éter (98,5%) era de nisso Marutzen (Japón). El acetato sódico, hidrogenosulfato de tetra-n-butilamonio (98%), sulfato de magnesio (anhidro) y Celite 545 eran de Merck, Alemania). El dicarbonato de di-terc-butilo (97%), yoduro de tetra-n-butilamonio (98%), bromuro de tetra-n-butilamonio (99%), ftalimida potásica (99%) y la hidrazina monohidrato (99%) se compraron en Janssen (Bélgica). El hidruro sódico (dispersión al 80% en aceite mineral), bisulfito sódico e hidruro de calcio (95+%) eran de Aldrich (Alemania). La transferina, ovalbúmina, \beta-lactoglobulina, ribonucleasa, aprotinina y vitamina B12 eran de Sigma (U.S.A.). El cloruro de glicidiltrimetilamonio fue suministrado por Pharmacia AB (Suecia). Los productos químicos se usaron sin purificación adicional.
El tolueno, hexano y cloruro de metileno usados para la polimerización eran de Aldrich (U.S.A.) y se suministraron en recipientes cerrados con cierre hermético de seguridad.
4.1.2 Análisis
Los monómeros y polímeros sintetizados se caracterizaron por FTIR usando un Perkin Elmer 15PC FTIR y por ^{1}H y ^{13}C usando un JEOL EX270. El análisis de elementos lo realizó Mikro-Kemi AB en Uppsala, Suecia. El MWD de los polímeros se determinó por cromatografía de permeación en gel (GPC) en THF en un sistema Waters-GPC equipado con dos columnas de gel de poliestireno (Ultrastyragel® 10^{4} A y Ultrastyragel® 10^{3} A; de 7,8 x 300 mm cada una (U.S.A.)). El peso medio molecular en número (M_{n}) y la relación de polidispersión (M_{w}/M_{n}) se calcularon con las curvas GPC en base a una calibración del poliestireno. La ultrafiltración se realizó en un Filtron Ultrapump II equipado con filtros Ultrasette 8K y 30K respectivamente. La filtración en gel se realizó en un sistema de Cromatografía Líquida. La columna de vidrio tenía un diámetro interior de 10 mm y la altura de las perlas era de 30 cm. El flujo de eluyente era 0,5 cm/min. La solución tampón era fosfato sódico 50 mM + cloruro sódico 100 mM que da un pH = 7,4. El detector era un monitor sencillo UV 1® a 280 nm (Pharmacia AB, Suecia).
4.1.3 Síntesis del monómero Ejemplo 1 2-Acetoxietil vinil éter
Se cargó un matraz de 1000 ml de tres bocas con acetato sódico (164 g, 2 mol), 2-cloroetil vinil éter (250 ml, 2 mol), 2-cloroetil vinil éter/2-acetoxetil vinil éter (1/1) (200 ml) y yoduro de tetra-n-butilamonio (2 g). La mezcla de reacción se calentó a reflujo durante una noche (aproximadamente 12 horas) con agitación magnética y en una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente se añadieron 250 ml de agua destilada y 300 ml de éter dietílico. La fase orgánica se lavó posteriormente con 3 x 100 ml de agua destilada, 3 x 150 ml de HCl 1M, 5 x 100 ml de agua destilada y 4 x 100 ml de salmuera. El secado con sulfato de magnesio, filtrado a través de Celite 545, evaporación del disolvente y finalmente destilación dio 200 g del producto bruto en forma de líquido ligeramente amarillo. Una destilación adicional sobre hidruro de calcio dio 160 g (rendimiento del 62% con respecto al acetato sódico) de 2-hidroxietil vinil éter puro en forma de líquido incoloro. Punto de ebullición 75ºC/35 mbar. El producto se confirmó por ^{1}H RMN (CDCl_{3}) d (ppm) = 2,1 (s, 3HH), 3,90 (m, 2H), 4,05 (d, 1H), 4,20 (d, 1H), 4,30 (m, 2H), 6,47 (m, 1H).
Ejemplo 3 Ftalimida de 2-viniloxietilo
Se cargó un matraz de 1000 ml de tres bocas con ftalimida de potasio (100 g, 540 mol), 2-cloroetil vinil éter (100 g, 940 mmol), bromuro de tetra-n-butilamonio (2 g) y 250 ml de dimetilformamida. La mezcla de reacción se calentó a reflujo a 100ºC durante una noche (aproximadamente 12 horas) con agitación magnética en una atmósfera de argón. Después de enfriar a temperatura ambiente, la mezcla de reacción se vertió en 1000 ml de agua destilada lo que precipita el producto en bruto. La filtración y recristalización en 3x500 ml de etanol y 2x500 ml de acetato de etilo con tratamiento de carbón y secado en la última etapa con sulfato de magnesio dio 55 g (47% basado en ftalimida de potasio) de la ftalimida de 2-viniloxietilo pura en forma de agujas ligeramente amarillas. El producto se confirmó por ^{1}H RMN (CDCl_{3}) d (ppm)= 3,95 (s, 2H+2H+1H), 4,20 (d, 1H), 6,40 8m, 1H), 7,70 (m, 2H), 7,85 (m, 2H).
4.2 Síntesis de polímero 4.2.1 General
Todo el equipo usando en estas polimerizaciones se secó a 110ºC durante una noche y se mantuvo en una atmósfera de argón durante los procedimientos experimentales.
4.2.2 Procedimientos de síntesis Ejemplo 4 Poli(2-acetoxietil vinil éter)
En un ejemplo representativo se enfría una solución de 2-acetoxietil vinil éter (15 ml, 118 mmol) y 50 ml de tolueno a -45ºC. A la solución de monómero refrigerada se le añaden 600 ml (da 6\cdot10^{-2}mmol BF_{3}(O(C_{2}H_{5})_{2}) de una solución pre-refrigerada de iniciador/tolueno. Después de esto, se dejó que la temperatura aumentase hasta -20ºC, que fue la temperatura de polimerización. Finalmente, la reacción se terminó con metanol después de una hora. El polímero se caracterizó por FTIR: (1736, 1380, 1234, 1116 y 1054 cm^{-1}), GPC (PM = 200.000; M_{n} = 80.000; H = 2,5) y DSC (Tg = -25ºC).
Ejemplo 5 Poli(2-(terc-butoxicarboniloxietil) vinil éter)
En un ejemplo representativo se enfría una solución de 2-(terc-butoxicarboniloxietil) vinil éter (0,5 ml, 2,7 mmol) a 0ºC y se le añaden 10 \mul (da 1\cdot10^{-3}mmol BF_{3}(O(C_{2}H_{5})_{2}) de una solución pre-refrigerada de iniciador/tolueno. La polimerización en bruto se terminó después de una hora con metanol frío. El polímero se caracterizó por FTIR: (1750, 1370, 1220, 1076 cm^{-1}), GPC (PM = 429.000; M_{n} = 110.000; H = 3,9).
Ejemplo 6 Poli(2-viniloxietil ftalimida)
Típicamente, se disolvió 2-viniloxietil ftalimida (50 g, 230 mmol) en diclorometano y la solución se enfrió a -30ºC. A la solución de monómero refrigerada se le añadieron 2,5 ml (da 2,5\cdot10^{-1}mmol BF_{3}(O(C_{2}H_{5})_{2}) de una solución pre-refrigerada de iniciador/tolueno. Después de esto, la temperatura se dejó aumentar hasta -20ºC, que fue la temperatura de polimerización. Finalmente, la reacción se terminó con metanol frío después de una hora. El disolvente se evaporó y el polímero se caracterizó por FTIR: (1772, 1708, 1390, y 1320 cm^{-1}), GPC (PM = 27.000; M_{n} = 17.000; H = 1,6) y DSC (Tg = 64ºC).
Ejemplo 7 Poli(2-viniloxietil ftalimida-co-2-acetoxietil vinil éter)
Típicamente, se disolvió 2-viniloxietil ftalimida (10 g, 46 mmol) y 2-acetoxietil vinil éter (6 ml, 47 mmol) en 60 ml de diclorometano y la solución se enfrió a -30ºC. A la solución de monómero refrigerada se le añadieron 600 ml (da 6\cdot10^{-2} mmol BF_{3}(O(C_{2}H_{5})_{2}) de una solución pre-refrigerada de iniciador/tolueno. Después de esto, la temperatura se dejó aumentar hasta -20ºC, que fue la temperatura de polimerización. Finalmente, la reacción se terminó con una solución refrigerada de amoniaco 7N en metanol. El disolvente se evaporó y el polímero se caracterizó por análisis de elementos (C_{teórica} = 62, C_{obtenida}= 61,8; O_{t} = 28, O_{o} = 29,0; N_{t} = 4; N_{o} = 3,6; H_{t} = 6; H_{o} = 6,4; GPC (PM = 67.000; M_{n} = 27.900; H = 2,4) y DSC (Tg = 22ºC).
4.3 Desprotección del polímero Ejemplo 8 Poli(2-hidroxietil vinil éter)
El poli(2-acetoxietil vinil éter) del ejemplo 4 se disolvió en 200 ml de tetrahidrofurano. A esta solución se le añadieron 138 ml de NaOH (ac.) 1M en porciones durante un periodo de seis horas y la solución se dejó reposar durante 48 horas a temperatura ambiente con agitación magnética. Después de esto, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl (ac.) 2M. El disolvente se evaporó y la ultrafiltración posterior retiró los restos de sal y también los polímeros/oligómeros con un peso molecular por debajo de aproximadamente 30.000. Finalmente, el producto puro se liofilizó. El polímero se identificó por FTIR (el pico carbonilo en 1736 cm^{-1}desapareció).
Ejemplo 9 Poli(éter de 2-aminoetil vinilo)
La poli(2-viniloxietil ftalimida) del ejemplo 6 se disolvió en 600 ml de diclorometano y 250 ml de metanol. A esta solución se le añadieron 24 ml de hidrazina monohidrato. La mezcla de reacción se dejó reposar durante 14 horas a temperatura ambiente con agitación magnética. Después de esto se evaporó todo el disolvente y se añadieron 500 ml de agua destilada y 250 ml de HCl (ac.) 2M. Esta solución se calentó a reflujo durante 45 minutos. Después de enfriar, el residuo sólido se filtró y la solución restante se neutralizó con NaOH 2M (ac.). La solución se concentró y la ultrafiltración posterior retiró el residuo en forma de sal y también los polímeros/oligómeros de pesos moleculares por debajo de aproximadamente 8.000. Finalmente se liofilizó el producto puro. El polímero se identificó por FTIR (los picos en 1772 y 1708 cm^{-1} desaparecieron).
Ejemplo 10 Poli(2-aminoetil vinil éter co-2-hidroxietil vinil éter)
La poli(2-viniloxietil ftalimida-2-acetoxietil vinil éter) del ejemplo 7 se disolvió en 200 ml de tetrahidrofurano. A esta solución se le añadieron 138 ml de NaOH 1M (ac.) en porciones durante un periodo de seis horas y la solución se dejo reposar durante 48 horas a temperatura ambiente con agitación magnética. Después de esto, la mezcla de reacción se neutralizó con HCl 2M (ac.). El disolvente se evaporó y la ultrafiltración posterior retiró los residuos de sales y también los polímeros/oligómeros con pesos moleculares por debajo de aproximadamente 8.000.
Este polímero parcialmente desprotegido se disolvió en 50 ml de agua destilada y 4,4 ml de hidrazina monohidrato. La mezcla de reacción se dejó reposar durante 14 horas con agitación magnética. Después de esto, el pH se redujo a aproximadamente 1-2 con la adición de HCl 2M (ac.). Esta solución se calentó a reflujo durante 45 minutos. Después de enfriar, los residuos sólidos se filtraron y la solución restante se neutralizó con NaOH 2M (ac.). La solución se concentró y la ultrafiltración posterior retiró los residuos en forma de sal y también los polímeros/oligómeros con pesos moleculares por debajo de aproximadamente 8.000. Finalmente, el producto puro se liofilizó. El polímero se identificó por FTIR (los picos en 1772, 1736 y 1708 cm^{-1}, respectivamente, desaparecieron).
4.4 Funcionalización del polímero Ejemplo 11 Poli(éter de 2-aminoetil vinilo-éter de co-2-hidroxietil vinilo) funcionalizado con cloruro de glicidiltrimetilamonio
Fórmula 9
Fórmula de reacción para la síntesis de un polímero de intercambio aniónico
8
El copolímero del ejemplo 10 se disolvió en agua junto con cloruro de glicidiltrimetilamonio (GMAC) a pH 10 a temperatura ambiente. La concentración de GMAC se mantuvo al 75% del nivel de grupos amino primarios del polímero. La mezcla de reacción se dejó reposar durante 5 horas y el producto de la solución se usó directamente para la posterior reacción de acoplamiento.
Ejemplos 12-13
Síntesis de un intercambiador catiónico
Fórmula de reacción (Fórmula 10) para la síntesis de un polímero de intercambio catiónico.
9
Ejemplo 12 Poli(2-hidroxietil vinil éter-co-2-aliloxietil vinil éter)
En un ejemplo representativo el poli(2-hidroxietil vinil éter) (2 g, 22 mmol grupos OH) del ejemplo 8 se disolvió en 50 ml de NaOH (ac.) (30% p/p) y se añadió bromuro de alilo (2,8 g, 24 mmol). La mezcla de reacción se dejó reaccionar a 60ºC durante 4 horas. Después de enfriar, el polímero, que era insoluble en agua, se separó y se secó al vacío a temperatura ambiente durante una noche. El polímero se caracterizó por RMN de ^{13}C, RMN de ^{1}H, FTIR y GPC para cada caso específico y normalmente el contenido de alilo fue del 50%.
Ejemplo 13 Introducción de grupos de intercambio catiónico
El poli(2-hidroxietil vinil éter-co-2-aliloxietil vinil éter) del ejemplo 12 se disolvió en 100 ml de agua/THF (1:1), se trató con hidrogenosulfito sódico (13 g, 125 mmol) a pH = 6 (se usó NaOH (ac.) al 45%). La mezcla de reacción se dejó reaccionar durante 12 horas. La cantidad de grupos sulfonato se determinó por valoración y estuvo de acuerdo con los grupos alilo presentes en el inicio de la reacción. Los grupos hidroxilo restantes se usaron en un ejemplo típico para la unión covalente del polímero funcionalizado con intercambiador catiónico con perlas de Sepharose HP.
4.5 Unión covalente de poli(éteres de vinilo) a una matriz hidrófila Ejemplo 14 Unión de poli(2-hidroxietil vinil éter) (polímero hidrófilo)
Se disolvieron 23 g de poli(2-hidroxietil vinil éter) del ejemplo 7 en 40 ml de agua destilada (solución 1). Se suspendieron 40 g de Sepharose® HP funcionalizada con alilo en 20 ml de agua destilada y se añadieron 1,25 g de acetato sódico. El gel se activó con bromo hasta que quedaba un color ligeramente amarillo. Se añadió formiato sódico hasta que el gel se volvió blanco de nuevo. Esta es la solución 2.
Las soluciones se termofijaron a una temperatura constante de 30ºC y se mezclaron y agitaron durante una hora. Se añadieron 5 g de NaOH y 0,1 g de NaBH_{4} y después de continuar agitando a 30ºC durante 17 horas, la solución se neutralizó y la matriz se lavó con agua/etanol/agua.
Ejemplo 15 Unión del intercambiador catiónico
Se aplicaron las mismas condiciones que en el ejemplo 14 para la unión del polímero del ejemplo 13 a Sepharose HP funcionalizada con epoxi.
Ejemplo 15 Unión del intercambiador aniónico
Se aplicaron las mismas condiciones que en el ejemplo 14 para la unión del polímero del ejemplo 11 a Sepharose HP funcionalizada con epoxi.
4.6 Valoración
En un procedimiento típico la matriz del intercambiador aniónico se suspendió en HCl 0,5 M y se saturó posteriormente con HCl 1 mM, se traspasó 1 ml de matriz en gel a un recipiente de valoración usando una pequeña cantidad de agua destilada. Después de diluir a un volumen conveniente para la valoración posterior, se añadieron "2 gotas" de HNO_{3} concentrado. Esta solución se valoró con AgNO_{3}. La capacidad de Cl^{-} se determinó normalmente como 0,16 mmol/ml de gel para el intercambiador iónico preparado en el ejemplo 16.
4.7 Evaluación cromatográfica 4.7.1 Filtración en gel usando poli(2-hidroxietil vinil éter)
El producto del ejemplo 14, es decir poli(2-hidroxietil vinil éter) unido covalentemente a una matriz de Sepharose® EP se comparó con Superdex® 30 PG en una separación de proteínas representativa. Las proteínas se disolvieron en la solución tampón y la filtración en gel dio los valores K_{av}^{-} que se muestran en la tabla para la albúmina de suero bovino (BSA), ribonucleasa, aprotinina y vitamina B12, respectivamente.
TABLA 1
10
En esta tabla se muestra claramente que este nuevo polímero es apropiado para la preparación de medios de filtración en gel.
4.7.2 Cromatografía de intercambio aniónico
El producto del ejemplo 16, es decir, el polímero de intercambio aniónico del ejemplo 11 unido covalentemente a una matriz de Sepharose® HP se comparó con Q Sepharose® HP en una separación de proteínas representativa. Las proteínas (transferina, ovalbúmina y \beta-lactoglobulina) se disolvieron en una solución tampón y se aplicaron a columnas cargadas con las matrices. Los dos cromatogramas muestran perfiles de elución parecidos para la mezcla de proteínas.
5. Referencias
1) J-C Janson et al., en "Protein Purification" VCH Publishers, Inc., 1989
2) T. Higashimura et al., Compr. Polym. Sci.,3, 673 (1989)
3) Sawamoto et al., Macromolecules, 18, 2097 (1985)
4) M. Bodansky et al., "The Practice of Peptide Synthesis", Springer-Verlag, Berlin, 1984.
5) J.M.J. Frechet et al., Polym. J., 19, 31 (1987)
6) J. Ericsson et al., Makromol. Chem., 192, 1621 (1991)
7) T. Hashimoto et al., J. Polym. SCi.: Part A: Polym. Chem., 26, 3361 (1988).
8) J.P. Kennedy/Béla Iván, Design Polymers by Carbocationic Macromolecular Engineering: Theory and Practice, Carl Hanser Verla, Munich, Germany)
9) J. Wislicenus, Justus Liebigs Ann. Che., 92, 106 (1878)
10) C.E. Schildknecht, "Vinyl and Related Polymers", Wiley, New York, 593 (1952).
11) C.E. Schildknecht et al., Ind. Eng. Chem., 39, 180 (147)
12) E.A. Peterson et al., J. Am. Chem. Soc., 78, 751 (1956)
13) J. Porath et al., Nature, 183, 1657 (1959).
14) J-C. Janson, Chromatographia, 23, 361 (1987).
15) J. Bonnerjera et al., Biotechnology, 4, 954 (1986).
16) Hitachi Chemical KK, Derwent Abstract 92-111582/14 (1992)
17) Hitachi Chemical KK, e.g. Derwent Abstract 92-111583/14 (1992)
18) S. Kanaika et al., Macromolecules 24(21) (1991) 5741-5745
19) M. Minoda et al., Macromolecules 23(7) (1990) 1897-1901
20) M. Minoda et al., Macromolecules 25 (1992) 2796-2801
21) S. Kanaoka et al., J. Polym. Sci. 28 (1990) 1127-1136
22) E. Takeuchi et al., J. Polym. Sci. 27 (1989) 3303-3314
23) Hayashi et al., Tejin Limited, EP 010425

Claims (15)

1. Un método cromatográfico de separación que comprende las etapas de:
i. poner en contacto un líquido acuoso, que contiene una sustancia disuelta que se va a enriquecer, con un polímero para proporcionar la separación selectiva de dicha sustancia de dicho polímero, después de lo cual
ii dicho polímero o parte del mismo que contiene dicha sustancia se retira de dicho líquido acuoso;
caracterizado porque dicho polímero es un poli(éter de vinilo) que comprende subunidades de vinilo idénticas o diferentes con la estructura (Fórmula I)
---
\uelm{CH}{\uelm{\para}{X}}
---
\melm{\delm{\para}{\delm{O}{\delm{\para}{R}}}}{C}{\uelm{\para}{Y}}
---
donde
a. X e Y se seleccionan entre hidrógeno y metilo.
b. R se selecciona entre grupos orgánicos que proporcionan un átomo de carbono unido directamente al átomo de oxígeno;
con la condición de que R en al menos un 5% de las subunidades de éter de vinilo, sea un grupo hidrófilo orgánico que tiene una relación molar (O+N)/C mayor de 0,5 y que comprende al menos un grupo hidroxi y/o amino primario (H_{2}N-),
y donde R se selecciona entre
(a) grupos hidrocarbilo hidrófobos seleccionados entre el grupo compuesto por alquilo, arilalquilo, alquiarilo y alquenilo, y
(b) grupos hidrófilos con la fórmula
R'-B-
donde R' es OH, NH_{2} o formas sustituidas de los mismos en las que un hidrógeno se ha sustituido con un resto orgánico R'', y
B es un enlace orgánico hidrófilo que consta de una cadena cíclica de carbono de carbonos hibridados en sp^{3}, rompiéndose dicha cadena en una o más posiciones con un átomo de oxígeno o de nitrógeno que contiene además al menos un grupo hidroxi y/o al menos un grupo amino primario (NH_{2}) unido directamente a uno de dichos átomos de carbono hibridados en sp^{3}, con las condiciones de que haya como máximo un átomo de oxígeno o nitrógeno unido a uno y al mismo átomo de carbono y de que la relación molar (O+N)/C en B sea mayor o igual que 0,5.
2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque R comprende al menos un grupo hidroxi y/o amino primario (H_{2}N-) junto con al menos un grupo seleccionado entre grupo éter (-O-), grupo amino secundario y grupo amino terciario.
3. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-2, caracterizado porque el poli(éter de vinilo) tiene > 10 subunidades que cumplen la fórmula 1 unidas consecutivamente.
4. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque al menos una de las subunidades de vinilo lleva el resto orgánico R'' y porque este resto se selecciona entre:
a. grupos que comprenden ligandos de afinidad que permiten la unión entre la sustancia y el polímero; y
b. grupos orgánicos hidrófilos
5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, caracterizado porque al menos una de las subunidades de éter de vinilo lleva un ligando de afinidad seleccionado entre:
a. ligandos de bioafinidad
b. grupos de intercambio iónico,
c. grupos hidrocarbilo;
d. grupos quelato que comprenden un ión de quelato metálico
6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-5, caracterizado porque el enlace orgánico hidrófilo cumple con la fórmula ((CH_{2})_{n}-O)_{m}, donde n es un número entero que es 2, 3 ó 4 y m es un número entero que puede ser 1-10.
7. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-6, caracterizado porque el poli(éter de vinilo) es insoluble en el líquido acuoso por
a. al menos uno de dichos restos orgánicos R'' unido covalentemente a una matriz vehículo que es insoluble en el líquido acuoso;
b. una diversidad de dichos restos orgánicos R'' que participan en la reticulación inter- y/o intramolecular del poli(éter de vinilo); o
c. una diversidad de dichos grupos R que comprenden grupos hidrófobos que están adsorbidos físicamente a un vehículo hidrófobo.
8. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque el método de separación se selecciona entre procedimientos cromatográficos, procedimientos por lotes, procedimientos de electroforesis, métodos de centrifugación que utilizan separación de polímeros, filtraciones con membranas y métodos basados en la formación de complejos, precipitación o sedimentación con ayuda de tal polímero.
9. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-8, caracterizado porque dicha sustancia muestra una estructura seleccionada entre estructura de proteína, estructura de polipéptido, estructura de lípido, estructura de carbohidrato, estructura de ácido nucleico, estructura de oligonucleótido, estructura de nucleótido, estructura de esteroide y estructura de aminoácido.
10. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-9, caracterizado porque el método explota una o más de las siguientes propiedades de la sustancia: tamaño y forma, carga neta, punto isoeléctrico, hidrofobia, unión a metal, presencia de grupos tiol y afinidad bioespecífica.
11. Un poli(éter de vinilo) apropiado para el uso en un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-10, que comprende una cadena de subunidades de éter de vinilo repetidas y tiene la estructura:
11
donde
a. las valencias libres terminales se unen a grupos que derivados de la terminación o inicio de la reacción de polimerización usada para sintetizar el poli(éter de vinilo);
b. X_{1}, X_{2}, X_{3} ... X_{m} e Y_{1}, Y_{2}, Y_{3} ... Y_{m} se seleccionan entre hidrógeno y metilo, prefiriéndose que todos las X e Y sean hidrógenos.
c. R_{1}, R_{2} ... R_{m} son grupos que se seleccionan entre
A. grupo (A) grupos hidrófobos seleccionados entre el grupo compuesto por alquilo, arilalquilo, alquilarilo y alquenilo, y
B. grupos hidrófilos con las fórmulas R_{1} = R'_{1}-B_{1}-, R_{2} = R'_{2}-B_{2}- ... R_{m'} = R'_{m'} -B_{m'} donde a su vez R'_{1}, R'_{2} ... R'_{m} se seleccionan entre OH, NH_{2} y formas sustituidas de los mismos en los que un hidrógeno se ha sustituido con un resto orgánico R'', y B_{1}, B_{2} ... B_{m'} (=B) son enlaces orgánicos hidrófilos, respectivamente, estando R'' presente en al menos una subunidad de éter de vinilo y seleccionándose R'' entre grupos que comprenden ligandos de afinidad selecionados entre el grupo compuesto por ligandos de bioafinidad, grupos de intercambio iónico; grupos hidrocarbilo; y grupos quelato que comprenden un ión quelato metálico;
d. m' es un número entero que indica el número de bloques que contienen idénticas subunidades de vinilo de repetición.
e. n_{1}, n_{2}, ... n_{m} son números enteros mayores de cero y n_{1} + n_{2} + ... + n_{m} = n, donde n es el número de subunidades de éter de vinilo en la cadena con la condición de que al menos un 5% de las subunidades de éter de vinilo tengan R_{1}, R_{2} ... o R_{m'} que se seleccionan entre HO-B o H_{2}N-B- o formas de los mismos en las que un hidrógeno hidroxi o un hidrógeno amino están sustituidos con un grupo orgánico hidrófilo.
12. El poli(éter de vinilo) de acuerdo con la reivindicación 11, caracterizado porque cada uno de los enlaces hidrófilos orgánicos (B_{1}, B_{2} ... B_{m'}) consta de una cadena lineal, ramificada o cíclica saturada de átomos de carbono hibridados en sp^{3}, estando dicha cadena opcionalmente rota en una o más posiciones con un átomo de oxígeno o un átomo de nitrógeno y/o conteniendo adicionalmente al menos un grupo hidroxi y/o al menos un grupo amino primario unido directamente a uno de dichos átomos de carbonos hibridados en sp^{3}, con las condiciones de que
(a) hay como máximo un átomo de oxígeno o nitrógeno unido a uno y al mismo átomo de carbono de la cadena, y
(b) la relación molar (O+N)/C en B es mayor o igual que 0,5
13. El poli(éter de vinilo) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-12, caracterizado porque cada uno de los enlaces orgánicos B_{1}, B_{2} ... B_{m'} cumple la fórmula [(CH_{2})_{n}-O]_{m} donde n es un número entero que es 2, 3 ó 4 y m es un número entero que puede ser 1-10.
14. El poli(éter de vinilo) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-13, caracterizado porque dicho poli(éter de vinilo) es insoluble en agua o líquidos acuosos mediante
a. al menos uno de dichos restos orgánicos R'' unido covalentemente a una matriz vehículo que es insoluble en el líquido acuoso;
b. una diversidad de dichos restos orgánicos R'' que participan en la reticulación inter- y/o intramolecular del poli(éter de vinilo); o
c. una diversidad de dichos grupos R que comprenden grupos hidrófobos que están adsorbidos físicamente a un vehículo hidrófobo.
15. El poli(éter de vinilo) de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 11-14, caracterizado porque dicho poli(éter de vinilo) está en forma de un complejo con una molécula bioorgánica seleccionada entre sustancias que tienen: estructura de proteína, estructura de polipéptido, estructura de lípido, estructura de carbohidrato, estructura de ácido nucleico, estructura de oligonucleótido, estructura de nucleótido, estructura de esteroide y estructura de aminoácido.
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JP2002500088A (ja) * 1998-01-12 2002-01-08 ハー マジェスティ イン ライト オブ カナダ アズ リプレゼンティッド バイ ザ ミニスター オブ アグリカルチャー アンド アグリ−フード カナダ 非極性抽出物の単離、回収及び精製方法
US6780327B1 (en) * 1999-02-25 2004-08-24 Pall Corporation Positively charged membrane
SE0004808D0 (sv) * 2000-12-20 2000-12-20 Apbiotech Ab Method for the purification of an enzyme
SE0103403D0 (sv) * 2001-10-12 2001-10-12 Protista Internat Ab Separation medium, ITS preparation and ITS use
JP2005510609A (ja) * 2001-11-26 2005-04-21 アメルシャム・バイオサイエンシーズ・アクチボラグ 多孔性支持体の後修飾
CA2464302A1 (en) * 2001-11-26 2003-06-05 Amersham Biosciences Ab Post-modification of a porous support
SE0201623D0 (sv) 2002-05-30 2002-05-30 Amersham Biosciences Ab Macroporous cross-linked polymer particles
KR101289911B1 (ko) 2005-08-03 2013-07-26 메르크 파텐트 게엠베하 친수성 가교 중합체
EP1754534A1 (de) 2005-08-03 2007-02-21 MERCK PATENT GmbH Hydrophiles vernetztes Polymer
WO2011146775A1 (en) * 2010-05-19 2011-11-24 Dionex Corporation Functionalized substrates with aromatic stacking properties
EP2570182A1 (en) 2011-09-15 2013-03-20 InstrAction GmbH Sorbent comprising on its surface a cationic or protonizable aliphatic residue for the purification of organic molecules
ES2920381T3 (es) * 2014-08-15 2022-08-03 Merck Patent Gmbh Purificación de inmunoglobulinas a partir de plasma
CN104387469A (zh) * 2014-11-24 2015-03-04 江南大学 一种聚乙烯醚磷酸盐双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术
CN104479009A (zh) * 2014-11-24 2015-04-01 江南大学 一种聚乙烯醚羧酸盐双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术
CN104387468A (zh) * 2014-11-24 2015-03-04 江南大学 一种聚乙烯醚醇胺双水相萃取螺旋藻藻蓝蛋白的分离技术
US20170066839A1 (en) † 2015-09-08 2017-03-09 Merck Patent Gmbh Novel affinity chromatography media for removal of anti-a and/or anti-b antibodies
CA3145763A1 (en) * 2019-07-03 2021-01-07 Merck Patent Gmbh Antibody drug conjugate purification

Family Cites Families (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US2933460A (en) * 1956-05-29 1960-04-19 Rohm & Haas Ion-exchange fibers, films and the like from sulfur containing alkoxymethyl monomers
US3247133A (en) * 1956-06-18 1966-04-19 American Mach & Foundry Method of forming graft copolymer ion exchange membranes
SE328716B (es) * 1961-12-15 1970-09-21 Rio Rad Lab
US3450630A (en) * 1963-02-07 1969-06-17 Yeda Res & Dev Method of separating metal ions
US3645890A (en) * 1969-05-06 1972-02-29 Hercules Inc Reverse osmosis membranes from crystalline polymers of vinyl methyl ether
JPS5554004A (en) * 1978-10-18 1980-04-21 Teijin Ltd Selective permeable membrane and its manufacturing
CA1329800C (en) * 1987-12-29 1994-05-24 Hiroaki Takayanagi Composite separating agent
DE4024517C1 (es) * 1990-08-02 1991-11-21 Metallgesellschaft Ag, 6000 Frankfurt, De
EP0525204B1 (en) * 1991-02-13 1998-05-06 Mitsubishi Rayon Co., Ltd. Method for preparing hydrophilic porous fibers an membranes
US5470463A (en) * 1992-06-19 1995-11-28 Sepracor Inc. Passivated porous supports and methods for the preparation and use of same
DE4309081A1 (de) * 1993-03-20 1994-09-22 Basf Ag Klebstoffe auf Basis von Polyvinylethercopolymerisaten

Also Published As

Publication number Publication date
US5759404A (en) 1998-06-02
ATE253402T1 (de) 2003-11-15
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DE69433303T2 (de) 2004-09-09
DE69433303D1 (de) 2003-12-11
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EP0729381B1 (en) 2003-11-05
JPH09505844A (ja) 1997-06-10
EP0729381A1 (en) 1996-09-04
AU1081595A (en) 1995-06-06

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