ES2206276T3 - Procedimiento para la mejora de la actividad de fertilizacion de los espermatozoides. - Google Patents
Procedimiento para la mejora de la actividad de fertilizacion de los espermatozoides.Info
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Abstract
Procedimiento in vitro para mejorar la actividad de fertilización de los espermatozoides, en particular para aumentar la motilidad de los espermatozoides, que comprende el tratamiento de los espermatozoides in vitro con un inhibidor de fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K), que se selecciona del grupo constituido por 2-(4-morfolinil)-8-fenil4H-1-benzopiran-4-ona (LY294002) y sus derivados y análogos.
Description
Procedimiento para la mejora de la actividad de
fertilización de los espermatozoides.
El invento se refiere a un procedimiento para la
mejora de la actividad de fertilización de los espermatozoides, en
particular para el aumento de la motilidad de los espermatozoides
mediante inhibición de la enzima
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K).
El invento se refiere además a los usos y métodos de inhibidores de
PI3K en la infertilidad y en las técnicas de reproducción asistida,
así como a un medio para el almacenamiento y/o transporte de
espermatozoides que contienen inhibidores de PI3K.
La infertilidad de una pareja se define como la
incapacidad de la mujer para concebir después de al menos un año de
relaciones sexuales regulares sin protección. La infertilidad puede
deberse a multitud de factores, en los que los factores del varón
desempeñan un papel fundamental en aproximadamente un
40-50% de los casos. Una fertilidad reducida en el
varón está generalmente ligada a alteraciones en los parámetros
seminales, tales como morfología, motilidad y recuento de
esperma.
Se han propuesto varias técnicas de fertilización
asistida (ART, assisted fertilization techniques) como tratamiento
para la infertilidad de una pareja, consiguiendo en muchos casos
superar el problema tanto de factores del varón como de la hembra.
Estos métodos, cuya elección depende del tipo de diagnóstico hecho,
pueden incluir la recopilación de gametos del varón y de la mujer
(espermatozoides y oocitos). El tratamiento ulterior varía de
acuerdo a la causa de la infertilidad. Los gametos pueden
transferirse directamente dentro de la trompa de Falopio (GIFT =
Gamete Intra Fallopian Transfer) o se ponen en contacto
entre ellos en un tubo de ensayo. Si este último conduce a la
fertilización del oocito, el cigoto resultante o embrión se
transfiere dentro del útero (IVFET = In Vitro Fertilization
and Embryo Transfer).
Cuando la infertilidad se debe a
factor(es) masculinos, los parámetros del líquido seminal y,
en particular, el recuento y la motilidad de los espermatozoides
determinan la elección del método particular de fertilización
asistida empleado. En los casos más graves de infertilidad por
factor masculino el recuento de espermatozoides y/o su motilidad
son muy bajos. La actividad de fertilización del semen se determina
normalmente en un espermograma. De acuerdo con los estándares WHO,
que pueden tomarse del "manual WHO" (WHO laboratory manual for
the examination of human semen and sperm-cervical
mucus interactions, 4ª edición, Cambridge University Press 1999),
el semen se clasifica en los siguientes grupos:
\bullet Normozoospermia: cuando todos los
parámetros de los espermatozoides son normales, junto con plasma
seminal y células sanguíneas blancas (WBCs = White Blood Cells)
normales y sin aglutinación;
\bullet Oligozoospermia: cuando la
concentración de esperma es <20 millones/ml;
\bullet Teratozoospermia: menos del 50% de
espermatozoides con movimiento progresivo al frente (categorías (a)
y (b)) o menos del 25% de espermatozoides con movimiento de
categoría (a);
\bullet Astenozoospermia: menos del 50% de
espermatozoides con morfología normal;
\bullet Oligoastenoteratozoospermia: indica
alteración de los tres parámetros (también puede considerarse
combinación de sólo dos prefijos);
\bullet Azoospermia: sin espermatozoides en el
eyaculado.
Los valores normales de los parámetros del semen
se han publicado por WHO, que son generalmente utilizados como
referencia. La fracción de esperma móvil en el semen se mide bien
por recuento manual o empleando un sistema de análisis del semen
asistido por ordenador (CASA = Computer Assisted Semen Analysis). La
motilidad se determina en el momento de la licuefacción del semen,
y después de 1 y 3 horas, para detectar astenozoospermia. El
recuento manual clasifica las células de esperma en 4 categorías
(inmóviles, localmente móviles o móviles no lineal o linealmente)
usando criterios de selección cualitativos, subjetivos. Muchos
centros de fertilidad usan en la actualidad sistemas CASA para
mediciones objetivas del movimiento de esperma y se han encontrado
correlaciones positivas entre los parámetros de movimiento, tales
como amplitud del desplazamiento lateral de la cabeza, velocidad
curvilínea, velocidad lineal y en línea recta, y las proporciones de
fertilización in vitro, pero los niveles umbrales para estas
características del movimiento todavía no se han establecido de
manera que se alcance un consenso general.
En caso de infertilidad severa por factor
masculino, se pueden usar técnicas de fertilización
micro-asistida. Entre estas técnicas, la inyección
intracitoplasmática de esperma (ICSI = Intracytoplasmatic Sperm
Injection) es la más común y la que presenta el mayor porcentaje de
éxito. Sin embargo, todavía es motivo de debate la seguridad del
procedimiento ICSI para la salud del conceptus o embrión resultante
(Edwards, 1999; Luetjens et al., 1999). Además, ICSI es mucho más
caro y consume más tiempo que la fertilización in vitro (IVF
= In Vitro Fertilization).
Por tanto, la posibilidad de recuperar un mayor
número de espermatozoides que muestren una mayor motilidad podría
permitir a varios hombres oligoastenospérmicos entrar en programas
IVF antes que en programas ISCI.
Se han ensayado varios métodos para aumentar la
motilidad de los espermatozoides, como por ejemplo el tratamiento
de los espermatozoides con pentoxifileno, con factor activador de
plaquetas o con progesterona. Sin embargo, los resultados obtenidos
son variables y no es predecible la sensibilidad de los
espermatozoides.
Por tanto, es altamente deseable y se precisa
encontrar urgentemente nuevos métodos y agentes que mejoren la
motilidad de las células de esperma y que conduzcan a una mejora de
la actividad de fertilización o de la proporción de
fertilización.
Las
fosfatidilinositol-3-quinasas (PI3K)
pertenecen a una familia de enzimas implicadas en la transducción
de señales de los receptores de tirosina-quinasa.
Las fosfatidilinositol-3-quinasas,
también llamadas
fosfoinosítido-3-quinasas (PI3K),
generan lípidos que están implicados en la señalización estimuladora
del receptor y en la regulación del tráfico de membrana. Se han
identificado varias clases distintas de PI3K que se han conservado
a lo largo de la evolución eucariota. Se han elucidado las
potenciales vías de señalización corriente abajo PI3K y se está
caracterizando la función de PI3K en diversos organismos modelo,
según se revisa en Vanhaesebroeck et al. (1997). Las PI3K son
enzimas heterodímeras presentes en varias isoformas y compuestas
por una subunidad catalítica de 110 kDa que está asociada a una
subunidad reguladora de 85 kDa.
En las células somáticas, las
fosfoinosítido-3-quinasas
(PI3-quinasas) se activan tras interacción tanto
con los receptores de tirosina-quinasa (RTK) como
con las proteínas G que resultan en la producción de las porciones
involucradas en la vía de señalización del fosfolípido inositol. La
enzima está también presente y activa en los espermatozoides
humanos.
Se han descrito varios inhibidores selectivos de
PI3K. Wortmanina es uno de los inhibidores específicos mejor
conocidos. Wortmanina y sus análogos se describen, por ejemplo, en
los documentos EP 0635268 A1, EP 0648492 A2 o EP 0658343 A1. Se
sabe que estos compuestos están implicados en el tratamiento de
neoplasmas, aterosclerosis y osteopatías. Otros inhibidores de
fosfatidilinositol-3-quinasa son,
por ejemplo,
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002), descrita en Vlahos et al. (1994 y 1995) y relacionada
con el bioflavonoide quercetina (Vlahos et al., 1994).
Hasta la fecha, no se ha descrito el LY294002
para mejorar la actividad de la fertilización de los
espermatozoides ni se conoce que esté involucrado en la
fertilización.
De acuerdo con el invento se ha encontrado ahora
que un inhibidor de la enzima
fosfatidilinositol-3-quinasa puede
mejorar significativamente los parámetros que determinan la
actividad de fertilización de las células de esperma, en particular
la motilidad de las células de esperma.
Por tanto, el invento se refiere a un
procedimiento para intensificar la actividad de fertilización de
los espermatozoides, en particular para aumentar la motilidad de
los espermatozoides, que comprende tratar a los espermatozoides con
un inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa
(PI3K),que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos. Además el invento se refiere
a los espermatozoides en los que está inhibida la actividad de la
fosfatidilinositol-3-quinasa, así
como al empleo de un inhibidor de PI3K, que se selecciona del grupo
constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, para mejorar la proporción
de fertilización en las técnicas de reproducción asistida (ART). Un
tercer aspecto del invento atañe al empleo de un inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K),
que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, para la producción de un
medicamento para el tratamiento de la infertilidad, en particular
la infertilidad masculina. Un cuarto aspecto del presente invento
se refiere a los métodos de terapia ART que comprenden tratar a los
espermatozoides con un inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa
(PI3K), que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos. Un quinto aspecto del
invento se refiere a un medio para el almacenamiento y/o transporte
de espermatozoides que incluye un inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa
(PI3K), que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos.
La Fig. 1 muestra el efecto de 10 \muM del
inhibidor de PI3K LY294002 en la motilidad de los espermatozoides.
Fig. 1 A: componente progresivo rápido en 3 pacientes individuales.
Cada símbolo representa un paciente individual. Fig. 1 B: motilidad
progresiva rápida (a) y motilidad progresiva rápida + lenta (a + b)
de los espermatozoides; valores medios \pm EEM (error estándar de
la media). P indica el valor p. LY indica LY294002.
La Fig. 2 muestra el efecto de 100 \muM de
LY294002 en la motilidad progresiva de espermatozoides obtenidos
por el método "swim-up".
La Fig. 3 muestra el efecto de 10 \muM y 100
\muM de LY294002 en la motilidad progresiva de espermatozoides
obtenidos por el método "swim-up"; valores
medios \pm EEM. C indica control, LY indica LY294002. El inserto
muestra los efectos de 100 \muM de LY294002 en la vitalidad de los
espermatozoides obtenidos por el método
"swim-up".
La Fig. 4 muestra el efecto de 10 \muM de
LY294002 en la motilidad progresiva de espermatozoides obtenidos
por el método "swim-up". La Fig. 4 A muestra
el efecto en el componente progresivo rápido (motilidad a) en
pacientes individuales. Cada símbolo representa un paciente
individual. La Fig. 4 B muestra un histograma que representa el
efecto en la motilidad progresiva rápida (a) y en la motilidad
progresiva rápida más lenta (a + b) de los espermatozoides (valores
medios \pm EEM).
La Fig. 5 muestra una curva
dosis-respuesta de concentraciones crecientes de
LY294002 (\muM) (eje X) en la motilidad progresiva rápida de los
espermatozoides (eje Y) obtenida mediante el método
"swim-up".
La Fig. 6 muestra un histograma que representa
los parámetros de esperma VCL (velocidad curvilínea en porcentaje),
VAP (velocidad media de trayectoria), VSL (velocidad en línea
recta) y HA (fracción de esperma hiperactivado), según se determinó
mediante el sistema de análisis de esperma asistido por ordenador
(CASA) en muestras de esperma de 12 individuos oligoastenospérmicos
diferentes.
La Fig. 7 muestra un histograma que representa el
efecto de diferentes cantidades de cloruro de litio (LiCl), con y
sin 10 \muM de LY294002, en el porcentaje de motilidad progresiva
de células de esperma.
Es un propósito del presente invento proporcionar
un procedimiento para mejorar la actividad de fertilización de los
espermatozoides, en particular para aumentar la motilidad de los
espermatozoides. Conforme al invento, el procedimiento comprende
tratar los espermatozoides con un inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K),
que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos.
LY294002 es el compuesto químico
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopirano-4-uno,
según se describe en Vlahos et al. (1994). También pueden usarse sus
derivados y análogos conforme al invento.
Un procedimiento en el que el inhibidor de PI3K
LY294002 es altamente preferido conforme al invento. Este agente ha
mostrado que es particularmente eficaz para la intensificación de
la actividad de fertilización del esperma.
El invento se basa en el hallazgo de que este
inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa tiene
un pronunciado efecto positivo sobre los parámetros que determinan
la actividad de fertilización de las células de esperma, es decir,
los parámetros pertinentes a la capacidad de las células de esperma
para fertilizar un oocito. Los factores más importantes implicados
en la capacidad de fertilizar son el número de espermas activos y
la motilidad de los espermatozoides. Según el manual WHO, una
motilidad del 50% se considera el límite menor de la
normalidad.
De acuerdo con el invento ahora se ha encontrado
que el número de espermas móviles que se obtienen a partir de
muestras de semen, así como la motilidad de espermatozoides
individuales, puede aumentarse significativamente mediante
inhibidores de PI3K, que se seleccionan del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, lo que indica de este modo el
papel de estos inhibidores de PI3K como intensificadores de la
fertilidad. Este efecto se detecta en individuos normospérmicos.
Sin embargo, es incluso más pronunciado en espermatozoides que
presentan características patógenas, como los pacientes
oligoastenospérmicos, es decir, aquellos pacientes que tienen un
número total reducido de espermatozoides y una motilidad de los
espermatozoides reducida. El invento hace posible aumentar el
porcentaje de espermatozoides con motilidad progresiva; de ese modo,
mejora significativamente la probabilidad de fertilización con
éxito. Así, conforme al invento, el procedimiento ayuda a los
pacientes a evitar el uso de ICSI en favor de la menos agresiva
ART, como la IVF convencional.
Los términos "espermatozoides" o "(células
de) esperma" se usan aquí de forma sinónima y se refieren a los
gametos masculinos. El "semen" o "fluido/líquido seminal"
contiene células de esperma, así como plasma seminal.
El término "aumento de la actividad de
fertilización de los espermatozoides" se refiere a cualquier
intensificación, mejora o cambio a mejor de los parámetros que
determinan la calidad o actividad de las células de esperma, tales
como por ejemplo el porcentaje de la velocidad curvilínea (VCL), la
velocidad media de trayectoria (VAP), la velocidad en línea recta
(VSL) y la fracción de esperma hiperactivado (HA). La calidad de los
espermatozoides determina la proporción de fertilización en las
técnicas de reproducción asistida.
El término "aumento" de la motilidad de los
espermatozoides según se usa aquí abarca cualquier mejora,
intensificación, alivio o cambio a mejor de la calidad o actividad
de fertilización o de la motilidad o velocidad de las células.
El término
"fosfatidilinositol-3-quinasa"
o "PI3K" según se emplea aquí abarca cualquier miembro de la
familia PI3K, es decir, aquellas enzimas relacionadas que tienen la
actividad reseñada en la introducción.
Un "inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa",
también referido como de PI3K, inhibe la producción de
D-3 fosfoinosítidos en la célula. El término
D-3 fosfoinosítidos pretende abarcar los derivados
del fosfatidilinositol que están fosforilados en la posición
D-3 del anillo inositol y comprende, por ejemplo, el
fosfatidilinositol(3)monofosfato
(PI(3)P), el
fosfatidilinositol(3,4)bisfosfato
(PI(3,4)P_{2}) o el
fosfatidilinositol(3,4,5)trifosfato
(PI(3,4,5)P_{3}).
En una realización preferida, el tratamiento de
los espermatozoides con un inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K),
que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, se lleva a cabo en el
líquido seminal que contiene espermatozoides. Ejecutar el método
conforme al invento directamente sobre el líquido seminal sin ningún
tratamiento adicional tiene la ventaja de que es simple y rápido.
Dado que el inhibidor de PI3K del invento intensifica la motilidad
de las células de esperma, no es necesario retirar el plasma
seminal.
En una realización adicional preferida, el
procedimiento comprende la separación adicional de los
espermatozoides mediante métodos de separación de espermatozoides
empleados en las técnicas de reproducción asistida (ART).
Dado que el plasma seminal contiene factores que
inhiben la capacitación y fertilización, así como una considerable
cantidad de espermatozoides sin motilidad, incluso en un individuo
fértil, resulta ventajoso separar las células de esperma móviles
del fluido, los espermatozoides sin motilidad y los defectuosos
morfológicamente. Este paso es esencial en las ART tradicionales
como IVF, GIFT o IUI. Conduce a una intensificación de la proporción
de éxito de fertilización en el procedimiento, conforme al invento.
Resulta evidente de los ejemplos que el aumento en la motilidad de
los espermatozoides por un inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa es
incluso más pronunciado en espermatozoides que se han separado del
plasma seminal.
En una realización adicional preferida del
invento, la separación de los espermatozoides se lleva a cabo
mediante un método seleccionado a partir del método de lavado y
centrifugado, del método de sedimentación, del método directo
"swim-up", del método del sedimento y
"swim-up" y del método del gradiente de
densidad de ebullición.
Estos métodos son muy conocidos en la técnica. Se
emplean tradicionalmente en las técnicas de reproducción asistida y
se describen con detalle en las páginas 204 a 208 de "A Textbook
of In Vitro Fertilization and Assisted Reproduction, The
Bourn Hall guide to clinical and laboratory practice, editor: Peter
R. Brinsden, The Parthenon Publishing Group" (1999). Se hará
referencia a este libro de texto de aquí en adelante como la "guía
Bourn Hall".
Preferentemente, la separación de los
espermatozoides se lleva a cabo por el método directo
"swim-up".
Este método implica la
auto-selección de los espermas móviles, lo que
esencialmente comprende depositar una capa de una alícuota de medio
encima de una muestra de semen y permitirla reposar a temperatura
ambiente durante un cierto período de tiempo. Las células de
esperma móviles migrarán hacia la capa superior (de medio), de la
que pueden recuperarse. El método puede también incluir una
etapa(s) de centrifugación.
La ventaja de los espermatozoides seleccionados
por "swim-up" es que las células móviles
presentes en la muestra se aislan y concentran y que la proporción
de esperma morfológicamente normal aumenta. En los ejemplos se
muestra que el procedimiento conforme al invento conduce a un
aumento de la cantidad de espermatozoides recuperados a partir del
fluido seminal por el método "swim-up". Esto es
debido al aumento de motilidad de los espermas, los cuales, por
tanto, migran más rápidamente y en mayores cantidades hacia la fase
superior de la muestra.
El método puede variarse y combinarse con
técnicas de aislamiento/separación adicionales, dependiendo de la
cantidad de células móviles en la muestra. Por ejemplo, el
procedimiento "swim-up" puede llevarse a cabo
por medio del depósito de una capa de 1 ml de medio con albúmina
sobre 1 ml de líquido seminal en un tubo de ensayo. Después de una
hora de incubación a 37ºC en aire o en un 5% de CO_{2} se recoge
la fase superior del medio a la que habrán migrado los
espermatozoides con mejores características de motilidad. Esta
técnica puede también comprender o combinarse con una etapa de
centrifugación, por ejemplo, centrifugación en gradiente de
Percoll. Entonces, los espermatozoides separados, aislados o
enriquecidos se emplean, por ejemplo, en las técnicas de
reproducción asistida o pueden congelarse antes de procesarse
más.
De manera ventajosa, la incubación de los
espermatozoides con el inhibidor de PI3K se lleva a cabo sobre el
fluido seminal y, entonces, se realiza la selección por
"swim-up". Posteriormente, los espermatozoides
pueden lavarse una o varias veces para eliminar el inhibidor de
PI3K, antes de procesarse adicionalmente para fertilización.
Conforme al invento, el procedimiento se realiza
preferentemente sobre espermatozoides de mamíferos, en particular
sobre espermatozoides humanos.
Los espermatozoides se tratan preferentemente con
una cantidad de inhibidor de PI3K en el intervalo de
aproximadamente 0,01 a 1000 \muM, más preferentemente de
aproximadamente 5 a 500 \muM y aún más preferentemente de
aproximadamente 10 a 100 \muM. De manera ventajosa el tratamiento
de los espermatozoides con el inhibidor de PI3K comprende incubar
los espermatozoides durante un período de tiempo en el intervalo de
aproximadamente 30 minutos a 10 horas, preferentemente de
aproximadamente 1 a 8 horas, más preferentemente de aproximadamente
2 a 6 horas, a una temperatura de aproximadamente 37ºC.
Es un propósito adicional del invento
proporcionar espermatozoides que tengan una capacidad mejorada de
fertilización. Por tanto, adicionalmente, el invento se refiere a
espermatozoides en los que la actividad de la
fosfatidilinositol-3-quinasa está
inhibida. El invento también se refiere a los espermatozoides que se
obtienen por el método descrito arriba. Los espermatozoides en los
que está inhibida la
fosfatidilinositol-3-quinasa o que
se obtuvieron en un procedimiento conforme al invento muestran una
actividad de fertilización mejorada, una mayor motilidad comparada
con las células de esperma no tratadas y, por tanto, exhiben un
mejor rendimiento con respecto a la fertilización.
Según se menciona arriba, la actividad de
fertilización de las células de esperma determina la proporción de
fertilización en ART. Por tanto, el invento se refiere
adicionalmente al uso del inhibidor de PI3K, que se selecciona del
grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, para la mejora de la
proporción de fertilización en las técnicas de reproducción
asistida (ART).
Conforme al invento puede emplearse cualquier
método de reproducción asistida conocido en la técnica. En
realizaciones preferidas, las técnicas de reproducción asistida se
seleccionan de entre fertilización in vitro (IVF),
transferencia de gametos intratubárica (GIFT) e inseminación
intrauterina (IUI).
Además, el invento se refiere al empleo de un
inhibidor de PI3K, que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, para la producción de un
medicamento para el tratamiento de la infertilidad, en particular
infertilidad masculina. Mientras que el invento se describe para
las técnicas de fertilización in vitro con más detalle, la
persona especialista en la técnica apreciará que, en términos de
actividad, el compuesto puede ser tan eficiente cuando el
medicamento se administre in vivo.
En este caso, el medicamento se presenta
preferentemente en la forma de una composición farmacéutica que
contiene el inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa junto a
uno o más vehículos y/o excipientes aceptables
farmacéuticamente.
Una "cantidad efectiva" se refiere a una
cantidad de los ingredientes activos que es suficiente para afectar
la actividad de fertilización, en particular a la motilidad de los
espermatozoides. La cantidad efectiva dependerá de la vía de
administración y de la condición del paciente.
"Aceptable farmacéuticamente" indica abarcar
cualquier vehículo que no interfiere con la efectividad de la
actividad biológica del ingrediente activo y que no es tóxico para
el huésped al que se le administra. Por ejemplo, para
administración parenteral, los anteriores ingredientes activos
pueden formularse en unidad de dosis para la inyección en vehículos
como disolución salina, disolución de dextrosa, albúmina sérica y
disolución de Ringer. Aparte del vehículo farmacéuticamente
aceptable, las composiciones del invento pueden llevar también
cantidades minoritarias de aditivos comunes, tales como
estabilizadores, excipientes, tampones y conservantes.
La administración de tal ingrediente activo puede
llevarse a cabo vía intravenosa, intramuscular o subcutánea. Otras
vías de administración, que pueden establecer los niveles
sanguíneos deseados de los respectivos ingredientes, se abarcan por
el presente invento.
El invento se refiere adicionalmente al empleo de
un inhibidor de PI3K, que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, para la producción de un
medicamento para la mejora de la actividad de fertilización de los
espermatozoides, en particular para el aumento de la motilidad de
los espermatozoides.
Fundamentalmente se prefiere el empleo de
LY294002 como inhibidor de la
fosfatidilinositol-3-quinasa.
Es un propósito adicional del presente invento
proporcionar una mejora de la terapia ART. La mejora consiste en
incluir dentro de las técnicas conocidas de fertilización asistida
un paso que comprende tratar los espermatozoides con un inhibidor
de PI3K, que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos. La persona especialista en
la técnica conoce bien los pasos adicionales que se emplean en las
técnicas de reproducción asistida, los cuales pueden extraerse del
manual WHO (supra) o de la guía Bourn Hall
(supra).
En una realización preferida del invento, las ART
se seleccionan de entre fertilización in vitro (IVF),
transferencia de gametos intratubárica (GIFT) e inseminación
intrauterina (IUI).
Es un propósito adicional del presente invento
proporcionar un medio para el almacenamiento y/o transporte de los
espermatozoides que tienen cualidades mejoradas. El invento, por
tanto, también se refiere a un medio que contiene un inhibidor de
PI3K, que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos. Aparte del inhibidor de PI3K,
el medio puede contener cualquier componente adicional conocido de
utilidad para el almacenamiento y/o transporte, dependiendo del
tipo de almacenamiento y/o transporte requerido. Por ejemplo, los
espermatozoides pueden almacenarse a temperatura ambiente o mediante
criopreservación. Este último es común para el almacenamiento de
las células por un mayor período de tiempo. Ejemplos específicos de
componentes adicionales del medio pueden tomarse por ejemplo del
documento WO 97/16965. Por ejemplo, en el Apéndice II, pág. 541 y
542 de la guía Bourn Hall (supra) se incluyen medios
específicos adicionales adecuados para la criopreservación del
semen. Conforme al invento, éstos pueden suplementarse con un
inhibidor de PI3K para mejorar la actividad de fertilización, en
particular la motilidad de los espermas antes de que tenga lugar la
fertilización.
En una realización preferida, el medio incluye
espermatozoides de mamífero, en particular espermatozoides humanos.
En una realización altamente preferida, el inhibidor de PI3K es
LY294002.
En una realización más preferida aún, conforme al
invento, el medio incluye cantidades del inhibidor de PI3K en el
intervalo de aproximadamente 0,01 a 1000 \muM, preferentemente de
aproximadamente 5 a 500 \muM y más preferentemente de
aproximadamente 10 a 100 \muM .
Una vez descrito el invento, éste se entenderá
más fácilmente por referencia a los siguientes ejemplos que se
proporcionan como medio de ilustración y que no pretenden limitar
el presente invento.
En los experimentos en los que se basan los
siguientes ejemplos se han utilizado métodos estándar de
fertilización in vitro. Con respecto a los detalles de estos
métodos se hace referencia al llamado "manual WHO" (WHO
laboratory manual for the examination of human semen and
sperm-cervical mucus interactions, 4ª edición,
Cambridge University Press 1999). En particular, el método
"swim-up" directo puede tomarse de la página
104 a la 106 de este manual.
Se prepararon espermatozoides de acuerdo con los
procedimientos estándar de IVF. Brevemente, se prepararon
espermatozoides a partir de 3 individuos oligoastenospérmicos que
estaban haciéndose análisis de semen por infertilidad en la pareja,
tras consentimiento informado. Se añadieron 10 \muM del inhibidor
de PI3K LY294002 directamente al líquido seminal y se incubó durante
2 horas a 37ºC y 5% CO_{2}. Entonces se evaluó a ciegas la
motilidad de los espermatozoides bajo el microscopio de acuerdo a
los procedimientos del manual WHO. Los resultados de esta
evaluación se muestran en la Fig. 1. La incubación con el compuesto
causa un aumento de la motilidad rápida de los espermatozoides en
el líquido seminal (Fig. 1A). La Fig. 1B muestra que el aumento se
observaba no sólo en la motilidad rápida (a), sino también en el
porcentaje de motilidad progresiva (componentes rápido y lento, a +
b).
En un grupo de 7 muestras tomadas de siete
individuos se añadió el inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa
LY294002 en una concentración superior (100 \muM). Tras la
incubación con el compuesto durante dos horas, se efectuó una
selección de los espermatozoides por "swim-up"
de acuerdo a los procedimientos descritos en el manual WHO. La
incubación de las células de esperma con una concentración de
inhibidor diez veces superior (100 \muM), en combinación con la
selección "swim-up", resultó en un aumento
significativo de la motilidad progresiva en todas las (siete)
muestras, según se muestra en la Fig. 2.
La Tabla I resume los resultados obtenidos en un
experimento similar en 20 pacientes oligoastenospérmicos. El
compuesto se añadió en una concentración de 10 \muM. Los efectos
de la adición de LY294002 al plasma seminal en el porcentaje de
esperma de motilidad progresiva tanto en el plasma seminal como en
la fracción recuperada del "swim-up" medidos
tras incubación con el compuesto resultaron en un aumento del 39% de
la motilidad progresiva del esperma en el plasma seminal y del 26%
en las células de esperma seleccionadas por
"swim-up".
| % Esperma con motilidad progresiva (n = 20) | |||
| Esperma en plasma seminal | Esperma seleccionado por "swim-up" | ||
| C | 10\muM LY | C | 10\muM LY |
| 35,7 \pm 5,1 | 49,8 \pm 4,7 * | 54,2 \pm 4,5 | 68,6 \pm 3,9 * |
| p<0,001 | p<0,001 | ||
| \uparrow 39% | \uparrow 26% |
La Tabla II resume la recuperación del total de
células de esperma en el método "swim-up", el
cual aumentó en un 43% cuando se comparó con el control. De este
modo, la incubación del semen con el inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa
conduce a un aumento significativo en la recuperación de
espermatozoides durante la selección por
"swim-up".
| Esperma recuperado por "swim-up" (10^{6}) | |
| C | LY 10 \muM |
| 13,3 \pm 3,9 | 19,0 \pm 4,8 * p<0,005 |
| (n = 20) | (n = 20) |
| \uparrow 43% |
La Fig. 3 resume los resultados obtenidos en un
experimento similar en muestras de un mayor número de pacientes.
Las células de esperma se sometieron al método de selección
"swim-up". El tratamiento con 10 \muM del
inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa
LY294002 resultó en un aumento del 58% en la motilidad progresiva
(21 pacientes) comparado con el control (40 pacientes, sin
LY294002). El tratamiento de muestras de 29 pacientes con 100 \muM
del inhibidor dió como resultado un aumento de la motilidad del 67%
comparado con el control, es decir, en una intensificación
adicional de aproximadamente el 10% de la motilidad de los
espermatozoides.
También se evaluó el efecto de 100 \muM de
LY294002 en la viabilidad de los espermatozoides (ver inserto de
Fig. 3). La incubación durante dos horas con el LY294002 no alteró
la viabilidad de las células, según se evaluó usando el ensayo de
la eosina y el hinchamiento hipo-osmótico. Incluso
después de 48 horas de incubación no se observó efecto sobre la
viabilidad del esperma en ninguna de las muestras analizadas (no
mostrado).
La Fig. 4 muestra los resultados de un
experimento adicional, llevado a cabo de la misma manera que la
reseñada arriba, sobre 12 pacientes individuales. Se detectó
claramente una mejora del porcentaje de motilidad progresiva después
de 2 horas de incubación de las células de esperma con LY294002,
tanto sobre el componente rápido (a) como sobre el componente
rápido y lento (a + b).
Los experimentos descritos arriba se realizaron
sobre muestras de individuos oligoastenospérmicos. Los efectos sobre
la estimulación de la motilidad progresiva por LY294002 son más
pronunciados a medida que la patología del esperma de los pacientes
es más seria (oligospermia, astenospermia, teratospermia). Sin
embargo, también se pudo observar el efecto de este compuesto en
sujetos normospérmicos. El efecto de la incubación con 10 \muM de
LY294002 durante dos horas seguida de selección por
"swim-up" resultó en un aumento en la
motilidad progresiva de los espermatozoides de 88 sujetos
seleccionados al azar desde 53,5 \pm 2,0% hasta 76,3 \pm 1,5%
(no mostrado).
Este efecto de LY294002 sobre las muestras de
individuos normospérmicos dependía de la dosis, según se muestra en
la Fig. 5. Los valores de la motilidad rápida progresiva aumentaron
al aumentar las dosis aplicadas del inhibidor (desde 0 hasta 1000
\muM). Los valores se calcularon con respecto al valor control
(cero). La curva sigmoidea esperada demuestra el efecto
dosis-respuesta del inhibidor sobre la motilidad
rápida progresiva de los espermatozoides tratados frente a los no
tratados, lo que muestra un EC50 (dosis con un efecto del 50%) de
aproximadamente 1 \muM.
Se han observado similares efectos sobre los
espermatozoides empleando un inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa no
relacionado, wortmanina.
La evidencia experimental descrita arriba
demuestra que dos inhibidores diferentes del enzima
fosfatidilinositol-3-quinasa son
altamente eficientes en mejorar la motilidad de los
espermatozoides. Este efecto es particularmente pronunciado en
espermatozoides patógenos, pero también detectable en individuos
normospérmicos. Los resultados presentados arriba muestran que la
incubación de los espermatozoides con un inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa, si se
incluyese en las técnicas tradicionales de reproducción asistida,
conduciría a un aumento de la motilidad de las células de esperma,
intensificando de este modo la probabilidad de fertilización en
ART.
El aumento en motilidad progresiva, demostrada en
el Ejemplo 1, se asoció con un aumento en parámetros del esperma
relacionados con la actividad de fertilización de los
espermatozoides in vitro tales como porcentaje de velocidad
curvilínea (VCL), velocidad media de trayectoria (VAP), velocidad en
línea recta (VSL) y fracción de esperma hiperactivado (HA). Estos
parámetros se determinaron mediante sistema de análisis del semen
asistido por ordenador (CASA) en muestras de esperma de 12 sujetos
oligoastenospérmicos diferentes. Los resultados se muestran en la
Fig. 6. Cada uno de esos parámetros aumentó de manera significativa
estadísticamente por incubación con 10 \muM de LY294002 cuando se
comparó con la muestra control, lo que indica una mejora
significativa global de la actividad de fertilización de las
células de esperma.
Se han observado similares efectos sobre los
espermatozoides empleando un inhibidor no relacionado de la
fosfatidilinositol-3-quinasa,
wortmanina.
Estos resultados muestran la mejora global de los
parámetros pertinentes relacionados a la actividad de fertilización
de las células de esperma por inhibidores de
fosfatidilinositol-3-quinasa. Dado
que todos los parámetros anteriores son esenciales para la
proporción de fertilización que se obtiene en las técnicas de
reproducción asistida, el invento proporciona un agente útil para
el tratamiento de la infertilidad severamente impedida por factor
masculino.
Es bien conocido que las especies reactivas del
oxígeno (ROS = Reactive Oxygen Species), que pueden generarse
durante la preparación de esperma para IVF, ejercen efectos
perjudiciales sobre el potencial de fertilización del esperma. En
particular, entre las ROS, el H_{2}O_{2} reduce enormemente la
motilidad cuando se añade en concentraciones micromolares a las
muestras de esperma. Por tanto, se evaluó el efecto de LY294002
sobre células de esperma tratadas con H_{2}O_{2}. El compuesto
se añadió a muestras de espermatozoides seleccionadas por
"swim-up" de pacientes oligoastenospérmicos en
cantidades de 10 \muM o solo o en combinación con 200 \muM de
H_{2}O_{2}. Se observó que los efectos perjudiciales ejercidos
sobre la motilidad del esperma por 200 \muM de H_{2}O_{2}
revertían completamente por la adición de LY294002 en el medio de
incubación (Tabla III), lo que demuestra una actividad protectora
del compuesto con respecto a los efectos de ROS.
| Control (%) | LY294002 (%) | H_{2}O_{2} (%) | LY294002 + H_{2}O_{2} (%) |
| 45,4 \pm 5,0 | 71,7 \pm 3,2 ** | 26,5 \pm 4,9 ** | 52,6 \pm 5,5 * |
| (n = 12) | (n = 12) | (n = 12) | (n = 12) |
| *P<0,002 frente a H_{2}O_{2}; **P<0,0001 frente a Control |
El LiCl también es un inhibidor conocido de la
motilidad de las células de esperma. Una incubación de
espermatozoides seleccionados por "swim-up" con
10 \muM de LY294002 durante dos horas con o sin diferentes
concentraciones de LiCl dió como resultado la inversión del efecto
inhibitorio inducido por LiCl sobre la motilidad del esperma (Fig.
7).
Se han observado similares efectos usando un
inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa no
relacionado, wortmanina.
En este ejemplo, se ha demostrado la actividad de
los inhibidores de
fosfatidilinositol-3-quinasa para
rescatar a los espermatozoides de agentes nocivos, que pueden
generarse en las técnicas de reproducción asistida. Por tanto, el
invento proporciona una mayor mejora de ART, lo que conduce a una
proporción de fertilización más elevada y elimina algunos de las
desventajas más serias de estas técnicas.
Edwards RG. "Widening perspectives of
intracytoplasmic sperm injection" (1999). Nature
Medicine 5, 377-378.
Luetjens CM, Payne C,
Schatten G. "Non-random chromosome
positioning in human sperm and sex chromosome anomalies
intracytoplasmatic sperm injection" (1999). The
Lancet 353, 1240.
Vanhaesebroeck B, Leevers SJ,
Panayotou G, Waterfield MD.
"Phosphatidylinositol-3-quinases:
a conserved family of signal transducers" (1997).
Trends. Biochem. Sci. 22, 267-72.
Vlahos CJ, Matter WF, Brown
RF, Traynor Kaplan AE, Heyworth PG, Prossnitz
ER. "Investigation of neutrophil signal transduction using a
specific inhibitor of
phosphatidylinositol-3-kinase"
(1995). J. Immunol. 154, 2413-22.
Vlahos CJ, Matter WF, Hui
KY, Brown RF. "A specific inhibitor of
phosphatidylinositol-3-quinase,
2-(4-morpholinyl)-8-phenyl-4H-1-benzopyran-4-one
(LY294002)" (1994). J. Biol. Chem. 269,
5241-48.
Claims (18)
1. Procedimiento in vitro para mejorar la
actividad de fertilización de los espermatozoides, en particular
para aumentar la motilidad de los espermatozoides, que comprende el
tratamiento de los espermatozoides in vitro con un inhibidor
de fosfatidilinositol-3-quinasa
(PI3K), que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos.
2. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 1, en el que el tratamiento de los espermatozoides
con el inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K)
se lleva a cabo sobre el líquido seminal que contiene los
espermatozoides.
3. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 1 ó 2, que además comprende separar los
espermatozoides por los métodos de separación de espermatozoides
utilizados en las técnicas de reproducción asistida (ART).
4. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 3, en el que la separación de espermatozoides se
lleva a cabo por un método seleccionado entre el método de lavado y
centrifugado, el método de sedimentación, el método de
"swim-up" directo, el método del sedimento y
"swim-up", el método del gradiente de densidad
de ebullición.
5. Procedimiento, de acuerdo con la
reivindicación 4, en el que la separación de espermatozoides se
lleva a cabo por el método de "swim-up"
directo.
6. Procedimiento, de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 5, en el que el procedimiento se lleva a
cabo en espermatozoides de mamífero, en particular en
espermatozoides humanos.
7. Procedimiento, de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 6, en el que los espermatozoides se tratan
con una cantidad de inhibidor de PI3K en el intervalo de
aproximadamente 0,01 a 1000 \muM, aproximadamente de 5 a 500
\muM o aproximadamente de 10 a 100 \muM.
8. Procedimiento, de acuerdo con cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 7, en el que el tratamiento de los
espermatozoides con el inhibidor de PI3K comprende incubar los
espermatozoides durante un período de tiempo en el intervalo de
aproximadamente 30 minutos a 10 horas o aproximadamente 1 a 8 horas
o aproximadamente 2 a 6 horas, a una temperatura de aproximadamente
37ºC.
9. Espermatozoides que se pueden obtener por el
procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a
8.
10. Uso de un inhibidor de PI3K, que se
selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, para mejorar la proporción
de fertilización in vitro en las técnicas de reproducción
asistida (ART).
11. Uso, de acuerdo con la reivindicación 10,
en el que las técnicas de reproducción asistida se seleccionan de
entre fertilización in vitro (IVF), transferencia de gametos
intratubárica (GIFT) o inseminación intrauterina (IUI).
12. Uso de un inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K),
que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, para la fabricación de un
medicamento para el tratamiento de la infertilidad, en particular de
infertilidad masculina.
13. Uso de un inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K),
que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos, para la fabricación de un
medicamento para la mejora de la actividad de fertilización de los
espermatozoides, en particular para aumentar la motilidad de los
espermatozoides.
14. Método para tratar in vitro los
espermatozoides para la terapia ART con un inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K),
que se selecciona del grupo constituido por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos.
15. Método, de acuerdo con la reivindicación 14,
en el que las ART se seleccionan de entre fertilización in
vitro (IVF), transferencia de gametos intratubárica (GIFT) o
inseminación intrauterina (IUI).
16. Un medio para almacenar y/o transportar
espermatozoides que comprende un inhibidor de
fosfatidilinositol-3-quinasa (PI3K),
en el que el inhibidor de PI3K se selecciona del grupo constituido
por
2-(4-morfolinil)-8-fenil-4H-1-benzopiran-4-ona
(LY294002) y sus derivados y análogos.
17. Medio, de acuerdo con la reivindicación 16,
para almacenar y/o transportar espermatozoides de mamífero, en
particular espermatozoides humanos.
\newpage
18. Medio, de acuerdo con las reivindicaciones 16
ó 17, que comprende una cantidad de inhibidor de PI3K en el
intervalo de aproximadamente 0,01 a 1000 \muM, aproximadamente de
5 a 500 \muM o aproximadamente de 10 a 100 \muM.
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| US20060263829A1 (en) | 2003-05-15 | 2006-11-23 | Evans Kenneth M | Efficient haploid cell sorting flow cytometer systems |
| AU2005229073B2 (en) | 2004-03-29 | 2010-08-19 | Inguran, Llc | Sperm suspensions for use in insemination |
| US7833147B2 (en) | 2004-07-22 | 2010-11-16 | Inguran, LLC. | Process for enriching a population of sperm cells |
| EP1726297B1 (en) * | 2005-05-23 | 2010-08-18 | Reckitt Benckiser (UK) Limited | Composition comprising wortmannin and its topical use for reducing human hair growth |
| ES2702793T5 (es) * | 2011-05-20 | 2022-07-15 | Brigham & Womens Hospital Inc | Análisis y clasificación de células móviles |
| ES2797452T3 (es) * | 2012-03-16 | 2020-12-02 | Fertility Innovations Ltd | Procesamiento de espermatozoides |
| PT110231B (pt) * | 2017-08-02 | 2021-02-22 | Universidade Do Porto | Potenciadores de mtor e suas utilizações para melhorar a qualidade e função do esperma durante o armazenamento |
| US10603075B1 (en) | 2018-11-30 | 2020-03-31 | Ohana Biosciences, Inc. | Compositions and methods for enhancing sperm function |
Family Cites Families (6)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4774088A (en) * | 1986-01-08 | 1988-09-27 | The United States Of America As Represented By The Deptment Of Health And Human Services | Method and additives for improving the quality and shelf life of stored blood |
| KR920002285B1 (ko) * | 1989-10-19 | 1992-03-21 | 태평양화학 주식회사 | 세포 보호제 |
| AU668548B2 (en) * | 1992-03-09 | 1996-05-09 | Washington State University Research Foundation | Methods for the regulation of plant fertility |
| US6632789B1 (en) * | 1994-04-29 | 2003-10-14 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Navy | Methods for modulating T cell responses by manipulating intracellular signal transduction |
| JP2991620B2 (ja) * | 1994-08-30 | 1999-12-20 | 科学技術振興事業団 | 細胞活動の制御方法 |
| JP2000345724A (ja) * | 1999-06-03 | 2000-12-12 | Masafumi Miyamoto | アミューズメント施設、アミューズメント施設用コンテナ及びアミューズメント設備の設置方法 |
-
1999
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2000
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