ES2205053T3 - Virus herpeticos avirulentos utiles como agentes tumoricidas y como vacunas. - Google Patents

Abstract

SE DESCRIBEN VIRUS HERPETICOS TUMORICIDAS AISLADOS, EN PARTICULAR HERPESVIRUS NEUROTROFICOS, VIRUS T VIRUS B ICARSE DE FORMA SELECTIVA EN CELULAS NEOPLASICAS Y DESTRUIRLAS, Y COMPOSICIONES FARMACEUTICAS, VACUNAS Y PROCEDIMIENTOS PARA DESTRUIR CELULAS NEOPLASICAS QUE EMPLEAN LOS VIRUS HERPETICOS TUMORICIDAS AISLADOS. TAMBIEN SE DESCRIBE UN PROCEDIMIENTO PARA AISLAR VIRUS HERPETICOS TUMORICIDAS MEDIANTE LA TRANSFERENCIA SECUENCIAL DE VIRUS HERPETICOS AVIRULENTOS ATENUADOS SOBRE CELULAS NEOPLASICAS QUE NO SON CAPACES DE MANTENER LA REPLICACION DE LOS VIRUS HERPETICOS, Y AISLAR LOS VIRUS QUE CRECEN SOBRE LAS CELULAS NEOPLASICAS. TAMBIEN SE DESCRIBEN MUTANTES DEL VIRUS DEL HERPES SIMPLEX QUE PRESENTAN UN GENOMA EN EL CUAL SE HAN SUPRIMIDO LOS GENES GA}34.5 Y QUE REQUIEREN AL MENOS OTRA MUTACION PARA PRODUCIR UN VIRUS DEL HERPES SIMPLEX NO NEUROVIRULENTO QUE SE REPLICA DE FORMA SELECTIVA EN CELULAS NEOPLASICAS Y LAS DESTRUYE.

Description

Virus herpéticos avirulentos útiles como agentes tumoricidas y como vacunas.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un método de aislamiento de virus herpéticos, en particular virus herpes neurotróficos, virus linfotróficos T y virus linfotróficos B, que son avirulentos y que son capaces de replicarse en células neoplásicas y de destruirlas, mediante la propagación por pases secuenciales de virus herpéticos atenuados avirulentos en células neoplásicas que no permiten la replicación de los virus herpéticos avirulentos, y el aislamiento de los virus que proliferan en las células neoplásicas. La invención se refiere, además, a composiciones farmacéuticas, vacunas y métodos de destrucción de células neoplásicas que emplean los virus herpéticos aislados.

Antecedentes de la invención

Los virus son parásitos intracelulares obligados que han desarrollado relaciones muy complejas y especializadas con sus hospedadores. Aunque algunos virus pueden provocar infecciones persistentes, relativamente asintomáticas, otros son más virulentos y su infección es causa de una significativa morbilidad. Dado que los virus son organismos especializados que dependen de sus células hospedadoras para la replicación y diseminación de la progenie, los virus necesitan asegurarse de la supervivencia del hospedador que han escogido. Cada vez está más claro que muchos virus codifican funciones que pueden estimular la supervivencia de la célula infectada. La extensión del tiempo de supervivencia es bastante variable y es sensible a parámetros del ambiente externo y al estado del hospedador. En el caso de los virus más virulentos, sólo es necesario asegurar la supervivencia del hospedador lo suficiente para permitir la replicación y la propagación del virus infeccioso. En ausencia de las funciones de supervivencia dominantes del virus, se activan los programas intrínsecos de muerte celular del hospedador y se pone fin de modo eficaz al proceso infeccioso. El desarrollo de nuevas formas de quimioterapia antivírica y la modulación de la virulencia vírica dependen de una comprensión detallada de este proceso.

Hace tiempo que se ha reconocido la importancia médica de los parámetros que controlan la virulencia. La observación de Jenner, a finales del siglo XVIII, de que las lecheras expuestas a la viruela vacuna no contraían la viruela humana, le llevó a estudiar la utilización del virus de la viruela de las vacas como vacuna contra la viruela humana. En aquella época se desconocía que los principales componentes responsables del éxito de esta estrategia eran el alto grado de similitud en la capacidad antigénica general de los dos virus relacionados y el hecho de que el virus de la viruela vacuna era significativamente menos virulento que su pariente, el virus de la viruela humana. La base molecular de esta diferencia en la virulencia sigue siendo un misterio en la actualidad. Más recientemente se han aislado virus atenuados que carecen de la propiedades de virulencia de sus homólogos de tipo salvaje. Estas preparaciones de virus vivos pueden utilizarse como vacunas, ya que presentan un conjunto relativamente normal de antígenos víricos en el contexto de una infección vírica leve. Ambas estrategias han conducido a la eliminación eficaz de la viruela humana y a una gran disminución de la incidencia de la poliomielitis.

Además de su utilización como cepas para vacunas, se han descrito efectos tumoricidas de las infecciones víricas que se remontan a principios de siglo. Estas observaciones sugieren que las lesiones malignas podrían remitir en respuesta a la infección vírica. Sin embargo, la utilización de virus como tratamiento de neoplasias malignas implica el aislamiento de cepas con virulencia selectiva. Para que sean eficaces en el tratamiento de neoplasias malignas, dichas cepas sólo deberían proliferar de forma productiva, y presentar virulencia, en células neoplásicas, y no deberían ser capaces de propagar una infección productiva en el tejido circundante normal, diferenciado terminalmente. Dado que la virulencia se controla por genes víricos específicos, una estrategia sería intentar alterar genéticamente la virulencia del virus para obtener virus que destruyan selectivamente las células neoplásicas.

El cáncer es una enfermedad proliferante en la que las células neoplásicas, que provienen de una sola célula maligna, proliferan de forma descontrolada y se propagan por todo el cuerpo. Además de la extirpación quirúrgica de tumores aislados, las terapias actuales para el tratamiento de varias formas de cáncer se centran en la alta sensibilidad de las células malignas a diversos agentes tóxicos. Esto es una consecuencia de que las células neoplásicas no diferenciadas, que se dividen rápidamente, presentan una mayor sensibilidad al efecto destructivo de la radiación y de los fármacos. Las células normales, diferenciadas terminalmente, son más resistentes a las lesiones o son, quizás, más capaces de reparar las lesiones de su ADN. Los avances recientes en el ámbito de la radioterapia y la quimioterapia han tratado de mejorar la orientación selectiva de radioligandos o agentes citotóxicos a las células neoplásicas.

Las modalidades actuales de tratamiento, cirugía, radioterapia y quimioterapia, han tenido un escaso impacto en el pronóstico de algunos cánceres, tales como gliomas. Los gliomas comprenden las clases más comunes de tumores cerebrales humanos. Las lesiones cerebrales no extirpables por cirugía y de crecimiento agresivo, como el glioblastoma, el glioma más frecuente, suelen ser mortales en la inmensa mayoría de los casos. Lo que se necesita para combatir los gliomas es un virus avirulento que pueda dirigirse al tejido enfermo y replicarse en él de forma selectiva, destruyendo las células malignas y respetando al mismo tiempo el tejido neural normal circundante. Dicho tratamiento requiere la utilización de un virus neurotrófico con propiedades de virulencia radicalmente atenuadas, que sea al mismo tiempo capaz de infectar el sistema nervioso central. Dado que el virus del herpes simple-1 (HSV-1) puede replicarse en el cerebro, dicho virus podría ser útil como agente tumoricida.

La infección por HSV-1, un \alpha-herpesvirus miembro de la familia Herpesviridae, se inicia en la cavidad bucal. Aunque muchas infecciones primarias son asintomáticas, se produce una replicación limitada en este tejido epitelial periférico, seguido por la producción de una respuesta de inmunidad celular. Sin embargo, algunos de los virus producidos migran a través de los axones que inervan este tejido y colonizan los cuerpos de las neuronas del ganglio trigémino. El virus persiste aquí en forma latente e inmunológicamente encubierto frente al individuo infectado. Periódicamente, en respuesta al estrés o a la exposición a la luz ultravioleta, tiene lugar una infección productiva en estas neuronas y los viriones maduros migran a través de los axones de vuelta al epitelio bucal. Se inicia una infección productiva, o fenómeno de reactivación. La neutralización del virus producido en este episodio y el líquido que se acumula forma una úlcera peribucal o calentura. Esta dolencia leve y benigna afecta a millones de personas en todo el mundo. Sin embargo, el HSV-1 también puede dar lugar a una infección productiva del sistema nervioso central. Con una frecuencia de aproximadamente 1 de cada 250.000, los viriones del HSV-1 pueden alcanzar el cerebro, donde la infección puede causar una encefalitis mortal.

Se ha demostrado que la neovirulencia del HSV-1 está afectada por mutaciones en diversos marcos de lectura abiertos del HSV. Martuza describe, en la publicación de solicitud de patente europea nº 0 514 603, la utilización de un HSV-1 mutante, dlsptk, como medio para destruir las células de glioblastoma. Una desventaja importante del virus HSV-1 mutante dlsptk es que este virus HSV-1 mutante es aún capaz de causar una encefalitis mortal. Véase, Markert, J.M., et al., Neurosurgery, 32:597-603 (1993); Chambers, R., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92:1411-1415 (1995).

Un tipo distinto de mutación que afecta a la neovirulencia se ha descrito en Roizman, patente U.S. nº 5.328.688 ("Roizman"). Roizman describe mutantes del HSV-1 que tienen mutaciones en ambas copias del gen \gamma_{1}34.5, para evitar la codificación de un producto activo del gen \gamma_{1}34.5. Los mutantes HSV-1 de Roizman presentan unas propiedades de neovirulencia muy atenuadas. Sin embargo, los virus mutantes \gamma_{1}34.5 de Roizman no proliferan en el tejido tumoral neuronal, lo que hace que sean candidatos poco satisfactorios para agentes específicos contra tumores capaces de destruir células tumorales. Chambers, R., et al., Proc. Nat. Acad., Sci. USA, 92:1411-1415 (1995). Roizman descubrió que un virus mutante \gamma_{1}34.5, denominado R4009, parecía ser más eficaz que los otros mutantes para destruir neuronas tumorales. El R4009 inserta un codón de terminación en los tres marcos de lectura del marco de lectura abierto de \gamma_{1}34.5. El aumento en la destrucción del tejido tumoral neuronal presentado por R4009 puede deberse, por tanto, a un bajo nivel de la expresión de \gamma_{1}34.5 causado por la "lectura" de estos codones de terminación. Chambers, R., et al., Proc. Natl. Acad., Sci. USA, 92:1411, 1415 (1995). Esta reconstrucción parcial del fenotipo salvaje ilustra los peligros potenciales de la utilización, como agentes terapéuticos, de virus que contienen mutaciones puntuales. Los virus que contienen mutaciones puntuales que alteran su proliferación pueden, con el tiempo, revertir al tipo salvaje y causar encefalitis.

En la publicación PCT nº WO 96/00007 (que se cita con arreglo al Artículo 54(3) del CPE), Martuza combinó una mutación en la ribonucleótido-reductasa con el virus mutante por deleción \gamma_{1}34.5 de Roizman denominado R3616. Esencialmente, la estrategia de Martuza no difiere de la de los estudios descritos por Chambers, R., et. al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92: 1411-1415 (1995). Como el virus mutante \gamma_{1}34.5 de Roizman descrito anteriormente, este virus mutante doble no sería eficaz como agente antineoplásico por su escasa proliferación en el tejido tumoral. De hecho, la mutación en la ribonucleótido-reductasa combinada con la mutación \gamma34.5 no repara el profundo defecto de proliferación de los virus mutantes \gamma34.5 en el tejido tumoral. Por el contrario, esta mutación adicional sirve para inactivar el virus aún más, como se pone de manifiesto por el aumento de la sensibilidad de este virus mutante doble al ganciclovir. Otra importante desventaja de este virus mutante doble es que la mutación en la ribonucleótido-reductasa es una inserción que podría fácilmente revertir y dar lugar a un virus que contenga una mutación \gamma34.5. Aunque existen pruebas que apoyan la idea de que los virus mutantes \gamma34.5 están suficientemente atenuados como para garantizar la administración intracraneal segura, dichos virus están limitados por su incapacidad de proliferar de modo eficaz y destruir células neoplásicas. Por consiguiente, sería muy deseable crear un virus que conserve las propiedades de atenuación del virus mutante \gamma34.5, pero que presente proliferación selectiva y robusta en células malignas.

Así pues, un objeto de la presente invención es proporcionar virus que son avirulentos y que pueden replicarse selectivamente en el tejido tumoral, por lo que tienen la capacidad de destruir una masa localizada de células tumorales y de respetar el tejido normal circundante. Un objetivo adicional de la presente invención es proporcionar un método de tratamiento de tumores empleando dichos virus. Otro objeto de la presente invención es proporcionar una vacuna que proteja contra las infecciones de herpes. Éstos y otros objetivos y características de la invención pueden apreciarse en la siguiente descripción.

Sumario de la invención

La presente invención proporciona un virus del herpes simple 1 (HSV-1) que tiene un genoma del que se han eliminado por deleción los genes \gamma34.5 que controlan la virulencia, y que tiene por lo menos una mutación adicional en el genoma entre los sitios BstEll y NcoI del fragmento de restricción BamHI Z correspondiente a los nucleótidos 145316 y 146592 (Número de acceso a Genbank: X14112, cepa 17), en el que el virus mutado es avirulento y se replica selectivamente en las células neoplásicas, destruyéndolas. Sorprendentemente, estos virus herpéticos son al mismo tiempo avirulentos y capaces de replicarse selectivamente en células neoplásicas. También se proporciona una composición farmacéutica que contiene el virus herpético mutante de la presente invención.

Una ventaja del virus herpético mutante es que el virus destruye células neoplásicas sin infectar productivamente la células normales diferenciadas circundantes, y sin generar una infección mortal del sistema nervioso central.

La presente invención también proporciona la utilización de un virus como se ha descrito anteriormente en la preparación de un medicamento para la replicación selectiva en, y la destrucción de, de células neoplásicas en un mamífero.

Una ventaja de este método es que puede administrarse una cantidad eficaz del virus herpético a un mamífero para destruir células neoplásicas en dicho mamífero sin peligro de generar una infección mortal del sistema nervioso central.

La presente invención proporciona además una vacuna para inmunizar a un mamífero contra virus herpéticos, que comprende el virus de la presente invención y un diluyente, adyuvante o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

Una ventaja de esta vacuna es que el virus herpético no puede causar una infección productiva del sistema nervioso central del receptor.

La presente invención proporciona además un método de aislamiento de virus herpéticos tumoricidas por atenuación de un virus herpético para convertirlo en avirulento; identificación de las células neoplásicas que no permiten la replicación del virus avirulento; propagación por pases secuenciales del virus atenuado en las células neoplásicas para producir cepas del virus atenuado que pueden replicarse en las células neoplásicas; y aislamiento de los virus resultantes.

Una ventaja de este método es que la separación de los determinantes genéticos de neovirulencia de las funciones que permiten al virus replicarse en células neoplásicas hace posible la selección de virus que son avirulentos y que son capaces de replicarse en células tumorales, pero no en células normales diferenciadas terminalmente.

Tras el estudio de la descripción y de las reivindicaciones adjuntas, los expertos en la materia apreciarán objetos y ventajas adicionales de la presente invención.

Breve descripción de los dibujos

La Fig. 1 es un esquema de la sustitución de las secuencias codificantes de 34.5 del HSV-1 con el gen de la \beta-glucuronidasa. Las letras correspondientes a las abreviaturas de los sitios de corte de las endonucleasas de restricción son B=BamHI, S=Sacl y N=Ncol. U_{L}=Región larga única del HSV-1, U_{S}=Región corta única del HSV-1, La región sombreada en la construcción para sustitución dirigida en el extremo 3' del gen de la \beta-glucuronidasa representa el sitio de poliadenilación Us10 del citomegalovirus humano.

La Fig. 2 es un esquema del aislamiento de mutantes supresores del segundo sitio a partir de reservas del virus progenitor SPBg5e con la deleción 34.5 (\Delta34.5).

La Fig. 3 es un dibujo que presenta los resultados de un análisis de proliferación de una cepa supresora seleccionada. ufp = unidades formadoras de placas. \Delta34.5= virus SPBg5e. wt= HSV-1 de tipo salvaje, cepa Patton. REV 4= una cepa supresora.

La Fig. 4 es una autorradiografía de una transferencia de Southern que presenta en detalle la estructura genética del fragmento BamHI Z de las cepas supresoras 1 a 8 y 10 y REV4; el mutante por deleción 34.5 SPBg53e; y el HSV-1 de tipo salvaje (W.T (cepa Patton)).

La Fig. 5 es un dibujo en el que se destaca la zona de unión entre la región corta única y las repeticiones terminales cortas del fragmento BamHI Z del HSV-1 de tipo salvaje,

Las Figs. 6A-D son dibujos que identifican las secuencias nucleotídicas en el fragmento BamHI Z en las que las secuencias nucleotídicas de las cepas supresoras se desvían de las secuencias nucleotídicas del HSV-1 de tipo salvaje (cepa Patton). Todos los números de nucleótidos en las Figs. 6A-D corresponden a los números de nucleótidos de la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317. La Fig. 6A muestra cómo, en el caso de las cepas supresoras SUP1 y SUP10, hay una deleción de 583 pares de bases en el fragmento BamHI Z entre el nucleótido 145415 y el nucleótido 145999. Los pares de bases que flanquean la deleción a la izquierda se designan en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº: 1 y los pares de bases que flanquean la deleción a la derecha se designan en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº: 2. La Fig. 6B muestra cómo, en el caso de cepas supresoras SUP5 y SUP8, hay una deleción de 497 pares de bases en el fragmento BamHI Z entre el nucleótido 145421 y el nucleótido 145919. Los pares de bases que flanquean la deleción a la izquierda se designan en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº: 3 y los pares de bases que flanquean la deleción a la derecha se designan en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº:4. La Fig. 6C muestra cómo, en las cepas supresoras SUP2 y SUP6, hay inserciones de elementos de ADN repetitivo junto con deleciones de material genético. Los pares de bases a la izquierda de los rectángulos a cuadros se designan en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº: 5. Hay dos SUP6 en la Fig. 6 debido a que se obtuvieron dos clones SUP6 de una cepa supresora. los rectángulos a cuadros representan una repetición de secuencias del HSV-1 normalmente presentes desde los nucleótidos número 145462 a 145477, designada en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº: 6. El pequeño óvalo sombreado representa secuencias del HSV-1 que tienen los nucleótidos número 145481-145491, designada en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº: 7. El óvalo alargado sombreado representa secuencias que tienen homología con secuencias del HSV-1 contenidas en la porción repetitiva del genoma vírico. La Fig. 6D muestra las inserciones, en la cepa supresora SUP3, de elementos de ADN repetitivo junto con deleciones de material genético. El óvalo alargado rayado representa secuencias que tienen homología con secuencias del HSV-1 contenidas en la porción repetitiva del genoma vírico. Los pares de bases a la izquierda del óvalo alargado rayado se designan en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº: 8.

La Fig. 7 es una autorradiografía de un gel de poliacrilamida con SDS que muestra las proteínas sintetizadas en los períodos tardíos de la infección por cepas supresoras seleccionadas en células de glioblastoma humano U373. La calle 1 corresponde a células de glioblastoma humano U373 (U373) no infectadas. La calle 2 corresponde al virus SPBg5e (MUT). La calle 3 corresponde a la cepa supresora SUP10. La calle 4 corresponde a la cepa supresora SUP4. La calle 5 corresponde a la cepa supresora REV4. La calle 6 corresponde al HSV-1 de tipo salvaje, cepa Patton (W.T.). La calle 7 corresponde a marcadores de peso molecular (M).

La Fig. 8 es un gráfico que muestra los resultados de supervivencia de ratones que habían recibido inyecciones intracraneales de diferentes cantidades de la cepa supresora SUP1, el mutante \Delta34.5 SPBg5e (5e) o el HSV-1 de tipo salvaje, cepa Patton (wt). \bullet =3.000 ufp del HSV-1 de tipo salvaje, cepa Patton. \circ =300 ufp del HSV-1 de tipo salvaje, cepa Patton. \Delta = 60.000 ufp de la cepa supresora SUP1. \blacktriangle=300.000 ufp del virus mutante \Delta34.5 SPBg5e y \blacktriangle =600.000 ufp de la cepa supresora SUP1, ya que los datos fueron idénticos entre sí.

La Fig. 9 es un esquema de la técnica experimental utilizada para rescatar el fenotipo supresor de los mutantes supresores del segundo sitio.

La Fig. 10 es una autorradiografía de una transferencia de Southern en la que se detalla la estructura genética del fragmento BamHI Z de las cepas supresoras rescatadas 1, 3, 5 y 6 (SUP1, SUP3, SUP5 y SUP6) y del mutante por deleción 34.5 SBg53e (\Delta34.5). Las calles marcadas con una "C" contenían el ADN clonado del plásmido utilizado en la transfección para rescate de marcadores, que se digirió después con BamHI. Las calles marcadas con una "V" contienen ADN vírico digerido con BamHI, recuperado tras el pase del lisado de transfección en células U373.

Descripción detallada de la invención

Debe entenderse que, aunque la presente invención está destinada principalmente a los seres humanos, también está destinada a su utilización en medicina veterinaria.

La presente invención proporciona un nuevo método de aislamiento de virus herpéticos que son al mismo tiempo avirulentos y capaces de replicarse en células neoplásicas, pero no en células normales diferenciadas, por lo que poseen la capacidad de destruir una masa localizada de células neoplásicas o tumorales.

Antes de la presente invención, los virus se transformaban en avirulentos mediante diversas técnicas. Sin embargo, o bien los virus avirulentos resultantes no podían crecer en células tumorales y, por consiguiente, no podían utilizarse para destruir las células tumorales, o bien no estaban lo suficientemente atenuados y eran aún capaces de dar lugar a una infección productiva en el sistema nervioso central. Por primera vez, las funciones de virulencia y la capacidad de proliferar en células tumorales de un virus herpético han sido separadas genéticamente y se ha producido un virus herpético avirulento capaz de crecer en células tumorales.

En el método de aislamiento de virus herpéticos tumoricidas, el virus herpético está atenuado para que sea avirulento. El virus herpético es preferiblemente un virus neurotrófico, un virus linfotrófico B o un virus linfotrófico T. El virus neurotrófico es preferiblemente un virus del herpes simple, y es más preferiblemente HSV-1, HSV-2 o el virus de la varicela zóster (VZV). El virus linfotrófico T es preferiblemente el virus del herpes humano-6 (HHV-6). El virus linfotrófico B es preferiblemente el virus de Epstein-Barr. El virus herpético se transforma en avirulento alterando el gen o genes que controlan la virulencia utilizando técnicas conocidas en la materia, que incluyen mutaciones puntuales (sustituciones), inserciones o deleciones en un gen o genes. Se prefiere transformar el virus herpético en avirulento eliminando completamente el gen o genes que controlan la virulencia, para reducir al mínimo la posibilidad de reversión a la forma virulenta del virus de tipo salvaje. Cuando el virus herpético es un virus del herpes simple, ambas copias del gen \gamma34.5 están completamente eliminadas.

La siguiente etapa del método es identificar una célula neoplásica que no permita la replicación o que, como mucho, permita una replicación limitada del virus herpético avirulento, en comparación con la replicación del virus herpético de tipo salvaje en la célula neoplásica. Dichas células neoplásicas incluyen células de tumores, carcinomas, sarcomas, leucemia, linfomas y similares. Los tumores del sistema nervioso incluyen astrocitomas, oligodendrogliomas, meningiomas, neurofibromas, ependimomas, Schwannomas, neurofibrosarcomas y gliomas tales como glioblastomas.

Una vez identificada la célula neoplásica, el virus avirulento se propaga por pases secuenciales en la célula neoplásica identificada hasta producir cepas víricas capaces de presentar una proliferación productiva eficaz, en comparación con el virus progenitor avirulento de partida (que no prolifera en células neoplásicas). La propagación por pases secuenciales se lleva a cabo infectando células neoplásicas, que o bien son confluentes o se aproximan a la confluencia, con el virus avirulento a multiplicidades de infección de 10^{-1} a 10^{-4}. Se examinan cada día los cultivos en busca de signos del efecto citopático. Cuando los cultivos presentan el efecto citopático completo o cuando las células

\hbox{neoplásicas}

han agotado completamente el medio, se prepara un lisado por congelación-descongelación y sonicación durante aproximadamente un minuto en un baño de agua. Un segundo cultivo de células neoplásicas se infecta con 0,1 ml del lisado y se repite el procedimiento completo de propagación por pases durante cuatro veces sucesivas. Se aíslan los cultivos capaces de provocar un efecto citopático sustancial en las células neoplásicas antes de que las células agoten el medio y se someten a dos rondas de purificación por placas. Después se preparan reservas a gran escala en las células neoplásicas.

Sólo aquéllos virus avirulentos que han recobrado la capacidad de proliferar en la célula neoplásica identificada se replicarán en dichas células neoplásicas y formarán cepas de las que podrán obtenerse estos virus. Para que se recobre la capacidad de proliferar en la célula neoplásica identificada, debe tener lugar por lo menos una mutación adicional en el genoma del virus herpético. Cuando el virus avirulento es un virus del herpes simple, por lo menos una de las mutaciones adicionales del gen puede afectar a la secuencia nucleotídica entre BstElI (correspondiente al nucleótido número 145316 de la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317) y Ncol (correspondiente al nucleótido número 146592 de la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317) del fragmento BamHI Z del HSV-1. Dado que esta cepa ha sufrido una mutación en un sitio distinto de los genes \gamma34.5, se trata de un mutante supresor del segundo sitio, también denominada una cepa supresora, que rescata el defecto de proliferación de los virus con la deleción \gamma34.5 en células neurales neoplásicas.

Una muestra de una cepa supresora del HSV-1 según la presente invención, denominada SUP1, ha sido depositada, conforme a los términos del Tratado de Budapest, en la American Type Culture Collection (ATCC) de 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852, USA, con el número de acceso ATCC VR-2510.

El HSV-1 avirulento aislado se utiliza para destruir células neoplásicas en un mamífero, dada su capacidad de infectar dichas células neoplásicas, y de replicarse en las mismas. La administración de la cepa vírica herpética a un mamífero en una cantidad eficaz proporciona virus circulante que penetra en una masa de células tumorales malignas e inicia y propaga una infección en las células malignas que da lugar a su destrucción. Alternativamente, la cepa vírica herpética se inyecta en el mamífero en el sitio de crecimiento neoplásico, o en sus cercanías. La cantidad de virus que debe administrarse oscila entre una concentración de aproximadamente 10^{1} a aproximadamente 10^{10} unidades formadoras de placas (ufp), preferiblemente de aproximadamente 5 x 10^{4} ufp a 1 x 10^{6} ufp y más preferiblemente de aproximadamente 1 x 10^{5} a aproximadamente 4 x 10^{5} ufp, aunque los intervalos más eficaces pueden variar de hospedador a hospedador. Cuando las células neoplásicas que se van a destruir son células de glioma, el virus herpético aislado preferido es un virus del herpes simple tal como HSV-1 o HSV-2, que tiene ambas copias del gen \gamma34.5 eliminadas y una mutación adicional que permite al virus del herpes simple replicarse de modo selectivo en las células de glioma. La cepa supresora del HSV-1 (SUP1) depositada con el número de acceso de la ATCC: VR-2510 se utiliza en este método de destrucción de células neoplásicas.

Una composición farmacéutica que contiene el virus herpético aislado se utiliza para tratar tumores en un mamífero. La composición farmacéutica comprende el virus herpético aislado de la presente invención y un excipiente, adyuvante o diluyente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. La composición farmacéutica puede estar en forma inyectable.

Los virus herpéticos aislados de la presente invención también se emplean como una vacuna contra los virus herpéticos, cuando se asocian con un diluyente, adyuvante o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Se inocula un hospedador mamífero, preferiblemente humano, con una vacuna que comprende una dosis, que provoca inmunidad, de una o más de las cepas víricas herpéticas vivas de la invención por vía parenteral, preferiblemente por inyección intramuscular o subcutánea. La inoculación puede efectuarse también por escarificación superficial, o por inoculación en una cavidad corporal. Típicamente, una o varias inoculaciones de entre aproximadamente 10 y 1.000.000 ufp cada una, medidas en líneas celulares susceptibles de primates humanos o no humanos, son suficientes para lograr la inmunización de un hospedador humano.

La vacuna puede utilizarse cómodamente en forma líquida o en forma liofilizada, en éste último caso asociada a uno o más conservantes y agentes protectores adecuados, para proteger a las cepas de la vacuna durante el proceso de liofilización.

En una realización preferida, se creó un virus HSV-1 recombinante (cepa Patton) en el que ambas copias del gen \gamma34.5 estaban sustituidas por secuencias de ADN que codifican la \beta-glucuronidasa, como se ilustra en la Fig. 1. Brevemente, la Fig. 1 presenta un dibujo esquemático del genoma del HSV-1, en el que se destaca la localización de ambas copias del gen \gamma34.5 en una región repetitiva del genoma. La construcción para sustitución dirigida mostrada en la Fig. 1 es un plásmido que inserta el gen de la \beta-glucuronidasa en el locus genético 34.5. El plásmido se creó clonando las secuencias del HSV-1 que normalmente flanquean al gen 34.5, en las correspondientes posiciones para rodear al gen de la \beta-glucuronidasa. Tras la utilización de la construcción para sustitución dirigida junto con el ADN del HSV-1 de tipo salvaje para cotransfectar células Vero mediante la técnica de precipitación con fosfato de calcio (ppt. con fosfato-Ca), el virus recombinante, denominado el virus SPBg5e progenitor, se aisló por purificación por placas en presencia de cromóforo indicador o sustrato colorimétrico, para facilitar la identificación de placas recombinantes en células Vero.

Las células de neuroblastoma SKNSH, obtenidas de la ATCC, no permiten la proliferación de mutantes 34.5 del HSV-1. Presumiblemente, esta reducción en la proliferación vírica es una consecuencia del hecho de que toda la síntesis de proteínas cesa al comienzo de la replicación del ADN vírico. Véase, Chou, J. y Roizman, B., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89:3266-3270 (1992). El mutante recombinante del HSV-1 denominado SPBg5e tampoco llegó a sintetizar los niveles de proteínas tardías del tipo salvaje en células SKNSH. La terminación prematura de la síntesis de proteínas en células de neuroblastoma infectadas con este mutante por deleción 34.5 provoca una reducción dramática del rendimiento vírico. La Fig. 3 muestra la diferencia en rendimiento entre el mutante por deleción 34.5 (\Delta34.5) y el virus de tipo salvaje (wt). Por ejemplo, a 100 ufp, la diferencia en rendimiento es de 56.000 veces. Se empleó este defecto de proliferación y se comprobó que era un medio poderoso para la selección biológica de cepas mutantes supresoras del segundo sitio.

El virus SPBg5e progenitor, que carece completamente de todas las secuencias codificantes del gen 34.5, se propagó por múltiples pases sucesivos en células de neuroblastoma SKNSH, como se ilustra en la Fig. 2. Varias cepas independientes purificadas por placas fueron capaces desarrollar síntesis de proteínas y proliferación sostenidas en células de origen neuronal, especialmente células de neuroblastoma SKNSH y de glioblastoma humano U373 (véase la Figs. 3 y 7). La Figura 3 es un esquema del procedimiento utilizado para analizar la proliferación de las cepas supresoras seleccionadas en células SKNSH a diferentes multiplicidades de infección. La Figura 3 muestra, como ejemplo, la utilización de 10, 100 ó 1.000 ufp del HSV-1 de tipo salvaje, del mutante \Delta34.5 (SPBg5e) o de REV4 (una cepa supresora según la presente invención) para infectar células SKNSH. Tras incubar durante 48 horas a 37ºC, se obtuvo un lisado por congelación-descongelación y se determinó el título vírico en células Vero. A todas las multiplicidades de infección estudiadas, la cepa supresora REV4 proliferó 50 a 100 veces mejor que el mutante progenitor por deleción \Delta34.5 en células SKNSH. El análisis del ADN vírico demostró que todos lo supresores presentaban una reordenación en una región del fragmento BamHI Z del HSV-1 (cepa Patton) en la que el componente corto único se une a la región corta repetitiva terminal. Estas mutaciones afectan a las secuencias que actúan en cis y que dirigen la transcripción del marco de lectura abierto Us11 y alteran la región que codifica el marco de lectura abierto Us12 (véase la Fig. 5). El análisis de proteínas víricas producidas en la fase tardía de la infección confirmó que la proteína Us11 o bien no se producía o se producía a niveles enormemente reducidos (véase la Fig. 7).

Las reordenaciones genéticas afectan muy probablemente a uno o más componentes de una ruta de señalización en la que está implicada la proteína codificada por el gen \gamma34.5. En ausencia del producto del gen 34.5, el virus presumiblemente genera una señal que da lugar al cese de la síntesis de proteínas. Esta inhibición de la traducción se traduce en la muerte de la célula infectada antes de que tenga lugar el montaje de cantidades óptimas de progenie infecciosa. El gen \gamma34.5 codifica un factor que estimula la supervivencia de la célula infectada y el montaje y la diseminación de virus infecciosos. La ausencia combinada de la señal que potencia el cese de la traducción y la deleción de la función de supervivencia neuronal 34.5 crea un nuevo virus que puede replicarse eficazmente en tejido de glioblastoma maligno, pero que no causa una encefalitis mortal. Dado que todas las secuencias codificantes de 34.5 están eliminadas en los virus de esta realización de la invención, no es posible reconstruir el fenotipo salvaje por producción de pequeñas cantidades del producto del gen 34.5, evitándose de este modo la infección del sistema nervioso central. En estas cepas han tenido lugar nuevos cambios genéticos que restablecen la capacidad del virus de proliferar de forma productiva en células neoplásicas. El método de la presente invención da lugar a la separación de los determinantes genéticos de neovirulencia de las funciones que permiten que el virus se replique en células neoplásicas.

La presente invención demuestra por primera vez que es posible que un virus herpético no neurovirulento incapaz de proliferar de forma productiva en células neoplásicas vuelva a adquirir la capacidad de proliferar de forma productiva en células neoplásicas sin adquirir un fenotipo neurovirulento. Cuando el virus del herpes simple tiene un único elemento genético, el gen \gamma34.5, eliminado, el virus del herpes simple pierde su neovirulencia, pero también pierde la capacidad de replicarse en células neurales neoplásicas SKNSH y U373. La presente invención ha solucionado este problema proporcionando un nuevo virus del herpes simple del que el gen \gamma34.5 ha sido eliminado y que contiene una mutación en un elemento genético diferente que restablece la capacidad del virus de replicarse en células neurales neoplásicas, incluidas las células SKNSH y U373, pero que mantiene el fenotipo no neurovirulento.

Sin desear constreñirnos por la teoría, se cree que la inoculación de estas cepas supresoras 34.5 por vía intracraneal en cerebros afectados de glioblastoma da lugar a la destrucción selectiva de tejido maligno. Cuando el virus destruye una masa de células tumorales y encuentra tejido cerebral normal, se inicia una infección autolimitante en esta zona periférica que restringe la propagación del virus infeccioso. Dado que estas cepas pueden replicarse en células de glioblastoma, se ha superado una característica limitante del mutante por deleción 34.5 descrito por Roizman, que no se replica en células de glioblastoma. Ya que las cepas supresoras se replican eficazmente en células de glioblastoma, pequeñas cantidades de virus circulante que penetran en una masa de células malignas son capaces de iniciar y propagar una infección exclusivamente en las células malignas. Una posible explicación de la capacidad de las cepas supresoras de replicarse en células de glioblastoma es que los mutantes supresores son ahora dependientes de la capacidad proliferante de la célula hospedadora y han perdido la capacidad de proliferar eficazmente en células que están diferenciadas de forma terminal. Dado que las células malignas han perdido su fenotipo terminalmente diferenciado, constituyen ahora hospedadores adecuados para la proliferación de los mutantes supresores.

En el caso de que los títulos víricos en las masas tumorales alcancen niveles potencialmente peligrosos, la infección puede controlarse administrando un compuesto antivírico tal como aciclovir, ya que todos estos virus supresores tienen un gen de la timidina-quinasa (tk) de tipo salvaje. Su actividad replicativa puede restringirse aún más combinando mutaciones en otras funciones replicativas no esenciales del genoma supresor, por ejemplo, la ribonucleótido-reductasa. Así se impone un límite en el título de los virus que se replican en las cercanías de la masa tumoral y se proporciona especificidad adicional en el hospedador para las células que se dividen activamente, ya que la enzima celular que sirve de complemento está bajo control riguroso del ciclo celular.

La mutación adicional en las cepas supresoras también altera el marco de lectura abierto Us12. El producto proteico codificado por Us12 es el polipéptido intermediario temprano \alpha47. Dado que este producto proteico se acumula en las etapas tempranas posteriores a la infección, necesitaría desempeñar una función tardía, no descrita previamente, para estar implicado en la terminación prematura de la síntesis de proteínas tardías. Se ha demostrado que el polipéptido \alpha47 regula a la baja la expresión de las moléculas del MHC de la clase I en células infectadas y, como tal, es un modulador importante del sistema inmunitario. El hecho de que las células infectadas con cepas supresoras presentan en su superficie moléculas funcionales del MHC de la clase I implica que la presentación del antígeno vírico puede regularse al alza en estas células (en comparación con aquéllas infectadas con un virus que porta un alelo de \alpha47 de tipo salvaje).La presencia de antígenos víricos en la superficie de células tumorales puede facilitar adicionalmente la destrucción del tumor por componentes del sistema inmunitario del hospedador.

Además, estas cepas supresoras son útiles como posibles cepas para vacunas. Como en el caso de los mutantes por deleción 34.5 progenitores, las cepas supresoras no infectan el sistema nervioso central ni causan encefalitis. Dado que las cepas supresoras de la presente invención se replican mejor que los mutantes por deleción 34.5 progenitores en algunas células cultivadas, es esperable que las cepas supresoras se repliquen también mejor que los mutantes por deleción 34.5 progenitores en el tejido periférico y, de este modo, produzcan la respuesta inmunitaria necesaria capaz de inducir la inmunidad productiva.

Con el objeto de que se comprenda mejor la presente invención, se presentan los siguientes ejemplos. Los ejemplos se presentan sólo a efectos de ilustración y no deben considerarse limitantes del alcance de la invención.

Ejemplos Ejemplo 1 Sustitución de las secuencias codificantes de 34.5 en el HSV-1 con el gen de la \beta-glucuronidasa

El plásmido pBgdUs10, descrito en Jones, T., et al., J. Virol., 65:5860-5872 (1991), se digirió con Apal, se rellenaron sus extremos con la polimerasa de Klenow y después se digirió con Xbal. El fragmento de 2,1 kb que contiene el gen de la \beta-glucuronidasa (comercializado por Clontech, San Diego, California as pRAJ275b) fusionado con el sitio de poliadenilación Us10 del citomegalovirus humano (un fragmento Apal-Smal correspondiente a la cepa AD169 del citomegalovirus humano, nucleótidos número 13527-13782; número de acceso a GENBANK: X04650) en su extremo 3', se aisló y se clonó en pT7-1 (U.S.Biochemical, Cleveland, Ohio) que se había digerido con Xbal y Smal, para crear pBg10pA. El fragmento BamHI SP del HSV-1 (cepa Patton) (correspondiente a los nucleótidos número 123459-129403 en la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317), descrito en Jones, T.R. y Hyman, R.W., Virology, 131:555-560 (1983), se clonó en el sitio BamHI de pBR322 y se digirió con Ncol. El fragmento Ncol de 1,8 kb (correspondiente a los nucleótidos número 127666-125855 en la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317) que contiene el promotor y el primer codón ATG del gen 34.5 se aisló y se clonó en pBg10pA digerido con Ncol. Este plásmido (p5'\gamma34.5Bg10pA) se digirió con EcoRI, se rellenaron sus extremos con la polimerasa de Klenow y después se digirió con Sacl. El clon BamHI SP del HSV-1 se digirió con BamHI, se rellenaron sus extremos con la polimerasa de Klenow y se digirió con Sacl. El fragmento terminal Sacl - BamHI (con sus extremos rellenados con la polimerasa de Klenow) de 1,6 kb (correspondiente a los nucleótidos número 123459-125066 en la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317) se aisló y se ligó en p5'\gamma34.5Bg10pA digerido con EcoRI (con sus extremos rellenados con la polimerasa de Klenow)/Sacl, para crear p5'\gamma34.53'\gamma34.5, que se ha abreviado pSPBg. Este plásmido coloca el gen de la \beta-glucuronidasa bajo control del promotor endógeno del 34.5 y rodea el gen de la \beta-glucuronidasa con secuencias del HSV-1 que normalmente flanquean el gen 34.5. Cinco \mug de plásmido purificado (linealizado con Hindlll), 2 \mug de ADN purificado del HSV-1 (cepa Patton) purificado y ADN de esperma de salmón sonicado, como portador, se agruparon y se introdujeron en células Vero mediante la técnica de fosfato de calcio. Una vez desarrollado el efecto citopático en toda la monocapa, se obtuvo un lisado por congelación-descongelación, seguido por una descarga de un minuto en un sonicador en un baño de agua. Se prepararon diluciones y se sometieron las cepas a dos rondas de purificación por placas en células Vero, en presencia del cromóforo indicador X-gluc. La cepa utilizada en los estudios subsiguientes se denominó SPBg5e. La digestión con enzimas de restricción y el análisis de Southern demostraron que el gen de la \beta-glucuronidasa había sustituido a ambas copias del gen \gamma34.5.

Ejemplo 2 Procedimiento de selección para la obtención de mutantes supresores

Placas de sesenta mm con células de neuroblastoma SKNSH que eran confluentes o que estaban a punto de alcanzar la confluencia, se mantuvieron en DMEM enriquecido con suero bovino fetal (FBS) al 2% y se infectaron con SPBg5e a multiplicidades de infección de 10^{-1} a 10^{-4}. Se observaron los cultivos cada día en busca de signos del efecto citopático. Generalmente, los cultivos presentaron o bien un efecto citopático completo (a elevadas multiplicidades de infección) o bien las células de neuroblastoma habían agotado completamente el medio a los cinco a siete días posteriores a la infección. En ese momento, se preparó un lisado por congelación-descongelación, se sonicó durante un minuto en un baño de agua y se utilizaron 0,1 ml de este lisado para infectar una segunda placa de 60 mm. Este procedimiento se repitió sucesivamente cuatro veces. En ese momento, algunos de los cultivos fueron capaces de generar un efecto citopático sustancial en células SKNSH, antes de que las células agotasen el medio. Después, las cepas fueron sometidas a dos rondas de purificación por placas en células Vero y a continuación se prepararon reservas a gran escala en células SKNSH. La tinción de las placas con X-gluc demostró que las placas aisladas conservaban el gen de la \beta-glucuronidasa del virus progenitor y eran capaces de proliferar tanto en células Vero como en células SKNSH.

Ejemplo 3 Análisis del ADN vírico de cepas supresoras

Se utilizaron reservas de las cepas supresoras preparadas en células SKNSH según los procedimientos del Ejemplo 2 para infectar células Vero a una multiplicidad de infección de uno. Los cultivos celulares infectados se mantuvieron en Medio 199 (m199) (Gibco BRL, Bethesda, MD) con suero de ternero al 1% y se incubaron a 34ºC hasta observar el efecto citopático máximo. Se recogieron las células, se resuspendieron en Tris 10 mM, pH 8,4, NaCl 140 mM, MgCl_{2} 10 mM y se lisaron por adición del mismo tampón que contenía Triton X-100™ al 1%. Tras reposar durante cinco minutos en hielo, los extractos se centrifugaron a 14.000 x g durante dos minutos. Se ajustó la concentración del sobrenadante (extraído con una punta de diámetro ancho) hasta una concentración final de SDS de 0,4%, EDTA 10 mM, RNasa A 25 \mug/ml, Pronasa 1 mg/ml y se incubó durante por lo menos una hora a 37ºC. El ADN se purificó por dos extracciones de fenol:cloroformo, una extracción con cloroformo y después se precipitó con etanol. Tras un lavado con ETOH al 70%, se dejó secar el sedimento a temperatura ambiente y se resuspendió en Tris-HCl 10 mM, pH 8,0, EDTA 0,1 mM. Estas minipreparaciones de ADN vírico ofrecieron suficientes cantidades para la clonación molecular.

Al principio, el ADN vírico se clonó como una serie de fragmentos EcoRI en pBR322 digerido con EcoRI. La digestión con enzimas de restricción y el análisis de Southern demostró que los puntos de ruptura parecían limitarse al fragmento BamHI Z (correspondiente a los nucleótidos número 144875-146828 en la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317). Para aislar después los fragmentos BamHI Z, el ADN vírico se digirió con BamHI y se seleccionaron, atendiendo al tamaño, fragmentos que migraban entre 1 y 3 kb por electroforesis en gel de agarosa, se purificaron y se clonaron en pBR322 digerido con BamHI. Los clones que contenían los insertos BamHI Z se identificaron por hibridación de colonias y se confirmaron por transferencia de Southern. Los fragmentos BamHI Z de las cepas supresoras se digirieron con diversos enzimas que cortaban en un sólo punto, para cartografiar la extensión de la deleción. Dado que todas las cepas mantuvieron el sitio BstEII presente en la porción única de BamHI Z, se diseño un cebador de secuenciación para leer a partir de este punto y hacia la región repetitiva. El cebador de secuenciación tenía la siguiente secuencia:

5' CCCTCCGCCCAGAGACTCG 3'

La secuencia del cebador de secuenciación corresponde a los nucleótidos número 145270-145288 en la secuencia publicada de la cepa 17 (número de acceso a GENBANK: X14112D00317) y se designa en lo sucesivo en la presente memoria SEC ID Nº: 9. La secuenciación del ADN se realizó utilizando un kit Sequenase™ de USB (U.S. Biochemical, Cleveland, Ohio) siguiendo las instrucciones del fabricante.

La Figura 4 es una autoradiografía de una transferencia de Southern en la que los ADN de las cepas supresoras SUP1 a 8, SUP10 y REV4; del mutante por deleción 34.5 SPBg5e; y del HSV-1 de tipo salvaje (cepa Patton) se prepararon como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3 y se digirieron con BamHI. Tras separar los fragmentos por electroforesis en gel de agarosa y efectuar la transferencia, la membrana se analizó con una sonda del fragmento BamHI-BstEII marcado con ^{32}P, correspondiente a la porción única del fragmento BamHI Z (correspondiente a los nucleótidos número 144875-145316 en la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317). La digestión con enzimas de restricción y el análisis de Southern de cada cepa demostró todos los supresores habían experimentado una reordenación en su ADN. En una de las cepas (REV4), apareció un complejo de inversión, mientras que todas las demás presentaban deleciones o inserciones (véase la Fig. 4).

El fragmento BamHI Z de cada una de las diversas cepas supresoras, incluidas las identificadas en la Figura 4, se aisló por técnicas de clonación molecular, como se ha descrito anteriormente en el Ejemplo 3. Aunque la región corta única BamHI-BstEII de 440 pb era de tipo salvaje según el análisis de restricción, estaba claro que había tenido lugar una reordenación en todas las cepas entre el sitio BstEII y el sitio EcoRI. La Figura 5 presenta un mapa físico típico de un segmento del fragmento BamHI Z de tipo salvaje que comienza en el sitio BamHI de la región corta única y se extiende hasta el sitio Nru en las repeticiones terminales cortas (correspondiente a los nucleótidos número 144875-146008 de la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317). Se diseñó el cebador de secuenciación que tenía la secuencia 5' CCCTCCGCCCAGAGACTCG 3' (SEC ID Nº: 9) para leer desde el sitio BstEII hacia el final de las secuencias cortas únicas. La secuenciación se realizó como se ha descrito anteriormente. Se identificaron los puntos en los que las secuencias de las cepas supresoras se desvían en el fragmento BamHI Z del HSV-1 de tipo salvaje y se muestran en la Fig. 6.

Las Figuras 6A-D identifican las secuencias nucleotídicas en el fragmento BamHI Z en las que las secuencias nucleotídicas de las cepas supresoras se desvían de las secuencias nucleotídicas del HSV-1 de tipo salvaje (cepa Patton). Todos los números de nucleótidos en las Figs. 6A-D corresponden a los números de nucleótidos de la secuencia publicada de la cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317. Como se muestra en la Fig. 6A, una deleción de 583 pares de bases aparece en el fragmento BamHI Z entre el nucleótido 145415 y el nucleótido 145999 de las cepas supresoras SUP1 y SUP10. Como se muestra en la Fig. 6B, una deleción de 497 pares de bases aparece en el fragmento BamHI Z entre el nucleótido 145421 y el nucleótido 145919 de las cepas supresoras SUP5 y SUP8. Como se muestra en la Fig. 6C, aparecen inserciones de elementos de ADN repetitivo junto con deleciones de material genético en las cepas supresoras SUP2 y SUP6. El punto en el que la secuencia nucleotídica de la cepa supresora se desvía de la secuencia nucleotídica del HSV-1 de tipo salvaje (cepa Patton) en el fragmento BamHI Z es el nucleótido 145477. Hay repeticiones de secuencias del HSV-1 normalmente presentes desde los nucleótidos número 145462 a 145477 (SEC ID Nº: 6); secuencias del HSV-1 que tienen los nucleótidos número 145481-145491 (SEC ID Nº: 7); y secuencias que tienen homología con las secuencias del HSV-1 presentes en la porción repetitiva del genoma vírico. La secuencia nucleotídica de la unión más distal no se conoce por el momento. Como se muestra en la Fig. 6D, aparecen inserciones de elementos de ADN repetitivo junto con deleciones de material genético en la cepa supresora SUP3. El punto en el que la secuencia nucleotídica de la cepa supresora se desvía de la secuencia nucleotídica del HSV-1 de tipo salvaje (cepa Patton) en el fragmento BamHI Z es el nucleótido 145473. Hay secuencias que tienen homología con secuencias del HSV-1 presentes en la porción repetitiva del genoma vírico. La secuencia nucleotídica de la unión más distal no se conoce por el momento.

El análisis de estos datos de secuenciación demostró que todos los supresores compartían las características comunes de una reordenación en una región del fragmento BamHI Z del HSV-1 (cepa Patton) en la que el componente corto único se une al segmento repetitivo corto terminal. Estas mutaciones afectan a las secuencias que actúan en cis y que dirigen la transcripción del marco de lectura abierto Us11 y alteran la región que codifica el marco de lectura abierto Us12 (véase la Fig. 5). El análisis de proteínas víricas producidas en el período tardío de la infección confirmó que la proteína Us11 o bien no se produce, o lo hace a niveles enormemente reducidos (véase la Fig. 7). Las reordenaciones genéticas afectan muy probablemente a uno o más componentes de una ruta de señalización en la que está implicada la proteína codificada por el gen \gamma34.5.

Ejemplo 4 Análisis de la síntesis de proteínas víricas totales

Las células de glioblastoma humano U373, obtenidas de la ATCC, se infectaron o bien con el SPBg5e (mutante por deleción 34.5), o con el HSV-1 de tipo salvaje (cepa Patton) o con las cepas supresoras SUP10 y SUP4, a una multiplicidad de infección de aproximadamente diez, o se infectaron con la cepa supresora REV4 a una multiplicidad de infección de uno, durante aproximadamente una hora a 37ºC. Las células recibieron después DMEM enriquecido con FBS al 2% y se incubaron durante toda la noche. En cualquier momento después de 12 horas de infección (generalmente a las 15,5 horas), se extendió una capa, sobre las células infectadas, de un ml de DMEM que contenía 50-70 \muCi/ml de ^{35}S-Express™ (una mezcla comercial de metionina y cisteína, procedente de DuPont New England Nuclear, Boston, Massachusetts) y se continuó la incubación durante una hora. Las proteínas celulares totales se solubilizaron en tampón de Laemli 1 X, se hirvieron durante tres minutos y una porción se resolvió en geles de poliacrilamida al 12,5% con SDS. También se utilizaron calles distintas en el gel para las células U373 no infectadas y para una mezcla de alto peso molecular (MW) marcada con ^{14}C de Amersham, para su utilización como marcadores de alto peso molecular a efectos comparativos. Los geles se fijaron en MeOH al 25%, ácido acético al 10%, se secaron y se expusieron a una película Kodak XAR.

Los resultados se muestran en la Figura 7. La Figura 7 es una autoradiografía de un gel de poliacrilamida con SDS que muestra las proteínas víricas producidas en los períodos tardíos tras la infección en células U373 infectadas bien con el mutante \Delta34.5 (MUT), o con las cepas supresoras SUP10, SUP4 o REV4, o con el HSV-1 de tipo salvaje (W.T.). Aunque la infección de células U373 con el mutante por deleción 34.5 da lugar al cese de la síntesis de proteínas, las cepas supresoras son capaces de síntesis de proteínas sostenida en estas células.

Ejemplo 5 Análisis de la neovirulencia

El virus HSV-1 de tipo salvaje, el virus mutante por deleción 34.5 SPBg5e, y la cepa supresora SUP1 se diluyeron por separado en DMEM enriquecido con suero de ternero al 1%. Antes de la dilución, se eliminó el material particulado de las reservas víricas mediante una centrifugación corta en una microcentrifugadora. Se inocularon ratones Balb/C hembras (Charles River Laboratories, Massachusetts) de veintiún días de edad por vía intracraneal con 30 \mul del virus diluido. Los ratones, distribuidos en grupos de cinco, recibieron inyecciones por vía intracraneal de 300 ó 3.000 ufp del HSV-1 de tipo salvaje (wt); 300.000 ufp de SPBg5e; o bien 60.000 ó 600.000 ufp de la cepa supresora (SUP1). Tras la inyección, se hizo un seguimiento de los ratones durante 21 días y se tomó nota de su supervivencia. Los resultados se ilustran en la Figura 8. Todos los ratones que habían recibido inyecciones de 300 ó 3.000 ufp del virus de tipo salvaje murieron. En contraposición, los ratones que habían recibido inyecciones de la cepa supresora SUP1 sobrevivieron, así como los ratones que habían recibido inyecciones del mutante por deleción 34.5 no neurovirulento. Las propiedades de neovirulencia de la cepa supresora SUP1 fueron idénticas a las propiedades de neovirulencia del mutante por deleción 34.5.

Ejemplo 6 Análisis de rescate de marcadores

Se obtuvieron múltiples cepas independientes con puntos de ruptura agrupados en la misma región, lo que sugería que esta reordenación era un componente necesario del fenotipo supresor. Para probar que era tanto necesario como suficiente para conferir este fenotipo en los virus mutantes \gamma34.5, se realizaron experimentos de rescate de marcadores.

Las regiones reordenadas en todos los clones SUP6, menos uno, estaban contenidas completamente entre los sitios BstEII y NruI. Estos fragmentos BstEII-NruI reordenados se utilizaron después para sustituir el fragmento BstEII-NruI de tipo salvaje en el vector para sustitución dirigida pSXZY. El inserto en pSXZY contiene secuencias del HSV-1, cepa Patton, desde el sitio SalI en el nucleótido 143481 hasta el sitio BstEII en el nucleótido 147040. Las coordenadas de nucleótidos hacen referencia a la secuencia publicada del HSV-1 cepa 17, número de acceso a GENBANK: X14112D00317. Este inserto se clonó entre los sitios únicos SalI y HindIII del vector pGEM9zf (Promega, Wisconsin). Dado que el sitio BstEII en 147040 y que el sitio único HindIII de pGEM9zf- fueron rellenados antes del tratamiento con el fragmento de Klenow de la ADN-polimerasa I, ambos sitios se destruyeron. El pSXZY tiene, por consiguiente, sitios BstEII y NruI únicos, para facilitar el intercambio de fragmentos BstEII - NruI de la región BamHI Z. Las secuencias flanqueantes, que se extienden en ambas direcciones a partir del fragmento BstEII - NruI interno, sirven para dirigir la recombinación homóloga dentro de esta región del cromosoma vírico. La Fig. 9 ilustra la estrategia experimental empleada para rescatar el fenotipo supresor.

El ADN del HSV-1 de virus mutantes \gamma34.5 se utilizó para transfectar, por separado o junto con un plásmido de rescate específico, células Vero permisivas. Cada plásmido de rescate contenía el fragmento BstEII-NruI de una cepa supresora específica y podía ser reconocido por su movilidad electroforética alterada, en comparación con la del fragmento BamHI Z de tipo salvaje especificado en el mutante \gamma34.5 progenitor del HSV, como se muestra en la Fig. 10 comparando la calle correspondiente a \Delta34.5, denominada C, con las calles C de SUP1, SUP3, SUP5 y SUP6. Cada transfección dio lugar a la aparición de aproximadamente 90 - 200 placas en células Vero permisivas. Los lisados exentos de células preparados a partir de estas transfecciones por congelación-descongelación se utilizaron después para infectar células de glioblastoma U373 no permisivas. Cuando apareció por primera vez el efecto citopático, se preparó nuevamente un lisado por congelación-descongelación y se utilizó para infectar un segundo conjunto de células U373. En ese momento, las células U373 que se habían infectado con lisados provenientes de transfecciones realizadas sólo con el ADN vírico 34.5 aparecieron como monocapas no infectadas. Sin embargo, las células U373 infectadas con lisados provenientes de cotransfecciones realizadas con el ADN vírico 34.5 y con cada plásmido de rescate específico presentaron todas un efecto citopático sustancial (datos no mostrados). El ADN se preparó a partir de cultivos rescatados, para analizar el genotipo de los nuevos virus resultantes.

La Fig. 10 presenta un análisis de Southern de la región BamHI Z de las cepas rescatadas. En cuatro ocasiones independientes, los virus rescatados habían adquirido el fragmento BamHI Z especificado por el plásmido supresor presente en la transfección, como se muestra en la Fig. 10 comparando las calles C y V de SUP1, SUP3, SUP5 y SUP6. Solamente los fragmentos BstEII-NruI de cada uno de estos plásmidos eran distintos del tipo salvaje. En el caso de SUP1, este fragmento mínimo era de 109 pares de bases. Las bandas adicionales que se hibridan en las calles \Delta34.5, SUP1, SUP5 y SUP6 se deben a variaciones del componente repetitivo del fragmento BamHI Z. Pueden observarse alteraciones similares en las calles correspondientes al tipo salvaje y a SPBg5e en la Figura 4. La movilidad reducida del fragmento BamHI clonado de SUP6 en la Fig. 10 se debe asimismo a variaciones del componente repetitivo.

El análisis de Southern presentado en la Fig. 10 demuestra que los virus que han adquirido el fenotipo supresor, determinado por el efecto citopático en células U373, han adquirido el genotipo especificado por el plásmido específico utilizado para la cotransfección con el ADN del mutante \gamma34.5 del HSV-1. De esta forma, los virus que portaban fragmentos BamHI Z reordenados habían superado a toda la población de virus mutantes \gamma34.5 en un único pase en células no permisivas. Esta generación de alta frecuencia del fenotipo supresor en un único pase contrasta con los múltiples pases necesarios para seleccionar estas cepas.

Claims (17)

1. Virus del herpes simple 1 (HSV-1) que tiene un genoma del que se han eliminado los genes \gamma34.5 que controlan la virulencia, y que tiene por lo menos una mutación adicional en el genoma entre los sitios BstEII y NcoI del fragmento de restricción BamHI Z, correspondiente a los nucleótidos 145316 y 146592 (número de acceso a Genbank: X14112, cepa 17), en el que el virus mutado es avirulento y se replica selectivamente en las células neoplásicas, destruyéndolas.

2. HSV-1 depositado con el número de acceso de la ATCC: VR-2510.

3. Composición farmacéutica que comprende el virus herpético según la reivindicación 1 y un excipiente, adyuvante o diluyente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

4. Composición farmacéutica según la reivindicación 3, en la que el virus herpético es un HSV-1 depositado con el número de acceso de la ATCC: VR-2510.

5. Vacuna que comprende el virus herpético según la reivindicación 1 y un diluyente, adyuvante o excipiente aceptable desde el punto de vista farmacéutico.

6. Vacuna según la reivindicación 5, en la que el virus herpético es un HSV-1 depositado con el número de acceso de la ATCC: VR-2510.

7. Virus según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para su utilización en la inmunización de un mamífero contra un virus herpético.

8. Virus para su utilización según la reivindicación 7, en el que el virus es un HSV-1 depositado con el número de acceso de la ATCC: VR-2510.

9. Utilización de un virus según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la preparación de un medicamento para inmunizar un mamífero contra un virus herpético.

10. Utilización de un virus según la reivindicación 9, en la que el virus es un HSV-1 depositado con el número de acceso de la ATCC: VR-2510.

11. Virus según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la destrucción selectiva de células neoplásicas en un mamífero, en el que el virus es un HSV-1 depositado con el número de acceso de la ATCC: VR-2510.

12. Utilización de un virus según la reivindicación 1 o la reivindicación 2, para la preparación de un medicamento para la replicación selectiva en, y destrucción de, células neoplásicas en un mamífero.

13. Utilización según la reivindicación 12, en la que el virus es un HSV-1 depositado con el número de acceso de la ATCC: VR-2510.

14. Método de aislamiento de virus herpéticos tumoricidas, que comprende las etapas siguientes:

(a)

atenuar un virus herpético para transformarlo en avirulento;

(b)

identificar las células neoplásicas que no permiten la replicación del virus de la etapa (a);

(c)

propagar por pases secuenciales el virus atenuado de la etapa (a) en las células neoplásicas de la etapa (b) para producir cepas del virus atenuado de la etapa (a) capaces de replicarse en las células neoplásicas de la etapa (b); y

(d)

aislar las cepas víricas de la etapa (c).

15. Método según la reivindicación 14, en el que el virus aislado se selecciona a partir del grupo formado por virus neurotróficos, virus linfotróficos T y virus linfotróficos B.

16. Método según la reivindicación 14, en el que los virus herpes neurotróficos se seleccionan a partir del grupo formado por HSV-1, HSV2 y VZV, el virus linfotrófico T es HHV-6 y el virus linfotrófico B es el virus de Epstein-Barr.

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17. Método según la reivindicación 14, en el que el virus aislado es el HSV-1 depositado con el número de acceso de la ATCC: VR-2510.