ES2203640T3 - Papilomavirus recombinante l1. - Google Patents
Papilomavirus recombinante l1.Info
- Publication number
- ES2203640T3 ES2203640T3 ES95918467T ES95918467T ES2203640T3 ES 2203640 T3 ES2203640 T3 ES 2203640T3 ES 95918467 T ES95918467 T ES 95918467T ES 95918467 T ES95918467 T ES 95918467T ES 2203640 T3 ES2203640 T3 ES 2203640T3
- Authority
- ES
- Spain
- Prior art keywords
- protein
- baselineskip
- recombinant
- papillomavirus
- hpv6b
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 106
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims abstract description 101
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 claims abstract description 15
- 241001631646 Papillomaviridae Species 0.000 claims description 39
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 25
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 claims description 16
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 claims description 15
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical compound C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 6
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 claims description 3
- 238000004925 denaturation Methods 0.000 claims description 3
- 230000036425 denaturation Effects 0.000 claims description 3
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 claims description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims 1
- 241000700605 Viruses Species 0.000 abstract description 11
- 230000028993 immune response Effects 0.000 abstract description 2
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 abstract 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 abstract 1
- 230000003449 preventive effect Effects 0.000 abstract 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 abstract 1
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 88
- XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N (2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-[[(2s)-2-amino-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidazol-5-yl)propanoyl]amino]-3-(1h-imidaz Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 XSYUPRQVAHJETO-WPMUBMLPSA-N 0.000 description 51
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 18
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 15
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 14
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 9
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 9
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 9
- PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N Nickel Chemical compound [Ni] PXHVJJICTQNCMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 210000000234 capsid Anatomy 0.000 description 8
- 239000013049 sediment Substances 0.000 description 8
- 241000701447 unidentified baculovirus Species 0.000 description 8
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 241000700618 Vaccinia virus Species 0.000 description 6
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 6
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 6
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 6
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 5
- 241000701806 Human papillomavirus Species 0.000 description 5
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N Hydrochloric acid Chemical compound Cl VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 5
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 5
- 108010093488 His-His-His-His-His-His Proteins 0.000 description 4
- 241000341655 Human papillomavirus type 16 Species 0.000 description 4
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 4
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 4
- 208000009608 Papillomavirus Infections Diseases 0.000 description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 4
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 4
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 4
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 4
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 4
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 4
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 4
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 4
- 229910052759 nickel Inorganic materials 0.000 description 4
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 4
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 4
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 description 4
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 208000027930 type IV hypersensitivity disease Diseases 0.000 description 4
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101100209954 Human papillomavirus type 16 L1 gene Proteins 0.000 description 3
- 108010081690 Pertussis Toxin Proteins 0.000 description 3
- 206010053613 Type IV hypersensitivity reaction Diseases 0.000 description 3
- 238000005273 aeration Methods 0.000 description 3
- WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K aluminium hydroxide Chemical compound [OH-].[OH-].[OH-].[Al+3] WNROFYMDJYEPJX-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 3
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 3
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 3
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 3
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 3
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 3
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 3
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 230000001404 mediated effect Effects 0.000 description 3
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 3
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 3
- 230000005951 type IV hypersensitivity Effects 0.000 description 3
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 2
- 208000009458 Carcinoma in Situ Diseases 0.000 description 2
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 101000742340 Human papillomavirus type 16 Minor capsid protein L2 Proteins 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 2
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 2
- 101710189811 Protein 6b Proteins 0.000 description 2
- 101710132701 Protein L1 Proteins 0.000 description 2
- XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N aluminium Chemical compound [Al] XAGFODPZIPBFFR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 229910052782 aluminium Inorganic materials 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 description 2
- 238000000576 coating method Methods 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O guanidinium Chemical compound NC(N)=[NH2+] ZRALSGWEFCBTJO-UHFFFAOYSA-O 0.000 description 2
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 description 2
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 2
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 2
- 208000037797 influenza A Diseases 0.000 description 2
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 2
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 2
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010039627 Aprotinin Proteins 0.000 description 1
- OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N Arg-Asp-Leu Chemical compound [H]N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(O)=O)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(O)=O OTCJMMRQBVDQRK-DCAQKATOSA-N 0.000 description 1
- 241000701822 Bovine papillomavirus Species 0.000 description 1
- 101100283604 Caenorhabditis elegans pigk-1 gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282472 Canis lupus familiaris Species 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 102000004594 DNA Polymerase I Human genes 0.000 description 1
- 108010017826 DNA Polymerase I Proteins 0.000 description 1
- 241000450599 DNA viruses Species 0.000 description 1
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000282326 Felis catus Species 0.000 description 1
- 241000287227 Fringillidae Species 0.000 description 1
- BJPPYOMRAVLXBY-YUMQZZPRSA-N Gln-Met-Gly Chemical compound CSCC[C@@H](C(=O)NCC(=O)O)NC(=O)[C@H](CCC(=O)N)N BJPPYOMRAVLXBY-YUMQZZPRSA-N 0.000 description 1
- QPTNELDXWKRIFX-YFKPBYRVSA-N Gly-Gly-Gln Chemical compound NCC(=O)NCC(=O)N[C@H](C(O)=O)CCC(N)=O QPTNELDXWKRIFX-YFKPBYRVSA-N 0.000 description 1
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 description 1
- 241000238631 Hexapoda Species 0.000 description 1
- JIUYRPFQJJRSJB-QWRGUYRKSA-N His-His-Gly Chemical compound C([C@H](N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(=O)NCC(O)=O)C1=CN=CN1 JIUYRPFQJJRSJB-QWRGUYRKSA-N 0.000 description 1
- 101000666874 Homo sapiens Visinin-like protein 1 Proteins 0.000 description 1
- 108700025391 Human papillomavirus type 6 L1 Proteins 0.000 description 1
- LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N L-leucine-L-tyrosine Natural products CC(C)CC(N)C(=O)NC(C(O)=O)CC1=CC=C(O)C=C1 LHSGPCFBGJHPCY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N Met-Ala-Ser Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CO)C(O)=O WXHHTBVYQOSYSL-FXQIFTODSA-N 0.000 description 1
- DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N Met-Arg-Gly Chemical compound CSCC[C@H](N)C(=O)N[C@H](C(=O)NCC(O)=O)CCCNC(N)=N DSWOTZCVCBEPOU-IUCAKERBSA-N 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 241001494479 Pecora Species 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 239000012083 RIPA buffer Substances 0.000 description 1
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 1
- IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N Ser-His-His Chemical compound C([C@H](NC(=O)[C@H](CO)N)C(=O)N[C@@H](CC=1NC=NC=1)C(O)=O)C1=CN=CN1 IOVBCLGAJJXOHK-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 description 1
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 1
- 239000013504 Triton X-100 Substances 0.000 description 1
- 229920004890 Triton X-100 Polymers 0.000 description 1
- BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N Tyr-Asp-Asp Chemical compound C1=CC(=CC=C1C[C@@H](C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)N[C@@H](CC(=O)O)C(=O)O)N)O BEIGSKUPTIFYRZ-SRVKXCTJSA-N 0.000 description 1
- 102100038287 Visinin-like protein 1 Human genes 0.000 description 1
- UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N [(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-4-[(2r,3r,4s,5r,6r)-4-[(2s,3r,4s,5r,6r)-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)-4-[(2s,3r,4s,5s,6r)-3,4,5-trihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxyoxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hydroxymethyl)oxan-2-yl]oxy-3,5-dihydroxy-6-(hy Chemical compound O([C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@H]([C@@H]1O)O[C@H]1CC[C@]2(C)[C@H]3CC=C4[C@@]([C@@]3(CC[C@H]2[C@@]1(C=O)C)C)(C)CC(O)[C@]1(CCC(CC14)(C)C)C(=O)O[C@H]1[C@@H]([C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](O[C@H]3[C@@H]([C@@H](O[C@H]4[C@@H]([C@@H](O[C@H]5[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O5)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O4)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O3)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1)O)[C@@H]1O[C@H](CO)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H]1O UZQJVUCHXGYFLQ-AYDHOLPZSA-N 0.000 description 1
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 1
- 229940037003 alum Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 230000005875 antibody response Effects 0.000 description 1
- 229960004405 aprotinin Drugs 0.000 description 1
- 108010069926 arginyl-glycyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 1
- UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N bromophenol blue Chemical compound C1=C(Br)C(O)=C(Br)C=C1C1(C=2C=C(Br)C(O)=C(Br)C=2)C2=CC=CC=C2S(=O)(=O)O1 UDSAIICHUKSCKT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000007975 buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 1
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 1
- 108091092356 cellular DNA Proteins 0.000 description 1
- 210000003679 cervix uteri Anatomy 0.000 description 1
- 238000011210 chromatographic step Methods 0.000 description 1
- 238000012790 confirmation Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 229940009976 deoxycholate Drugs 0.000 description 1
- KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N deoxycholic acid Chemical compound C([C@H]1CC2)[C@H](O)CC[C@]1(C)[C@@H]1[C@@H]2[C@@H]2CC[C@H]([C@@H](CCC(O)=O)C)[C@@]2(C)[C@@H](O)C1 KXGVEGMKQFWNSR-LLQZFEROSA-N 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000000635 electron micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000003480 eluent Substances 0.000 description 1
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 1
- 210000000981 epithelium Anatomy 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N guanidinium chloride Chemical compound [Cl-].NC(N)=[NH2+] PJJJBBJSCAKJQF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000021145 human papilloma virus infection Diseases 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M hydroxide Chemical compound [OH-] XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 230000003463 hyperproliferative effect Effects 0.000 description 1
- 230000008105 immune reaction Effects 0.000 description 1
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 1
- 238000003119 immunoblot Methods 0.000 description 1
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 description 1
- 239000012133 immunoprecipitate Substances 0.000 description 1
- 201000004933 in situ carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N iniprol Chemical compound C([C@H]1C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@H]2CSSC[C@H]3C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@H](C(N[C@H](C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC=4C=CC(O)=CC=4)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)N[C@@H](CCCCN)C(=O)N[C@@H](C)C(=O)NCC(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H](CCC(O)=O)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CO)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](CC=4C=CC=CC=4)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CC(N)=O)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC(=O)[C@H](CCCCN)NC(=O)[C@H](C)NC(=O)[C@H](CCCNC(N)=N)NC2=O)C(=O)N[C@@H](CCSC)C(=O)N[C@@H](CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](NC(=O)[C@H](CC=2C=CC=CC=2)NC(=O)[C@H](CC(O)=O)NC(=O)[C@H]2N(CCC2)C(=O)[C@@H](N)CCCNC(N)=N)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)N[C@@H]([C@@H](C)O)C(=O)NCC(=O)N2[C@@H](CCC2)C(=O)N3)C(=O)NCC(=O)NCC(=O)N[C@@H](C)C(O)=O)C(=O)N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@H](C(=O)N[C@@H](CC=2C=CC=CC=2)C(=O)N[C@H](C(=O)N1)C(C)C)[C@@H](C)O)[C@@H](C)CC)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 ZPNFWUPYTFPOJU-LPYSRVMUSA-N 0.000 description 1
- 238000007912 intraperitoneal administration Methods 0.000 description 1
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 1
- 108010012058 leucyltyrosine Proteins 0.000 description 1
- 239000012160 loading buffer Substances 0.000 description 1
- 239000012139 lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 108010016686 methionyl-alanyl-serine Proteins 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 1
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000002244 precipitate Substances 0.000 description 1
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 1
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 1
- 230000000069 prophylactic effect Effects 0.000 description 1
- 229940021993 prophylactic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 229930182490 saponin Natural products 0.000 description 1
- 150000007949 saponins Chemical class 0.000 description 1
- 235000017709 saponins Nutrition 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 238000000527 sonication Methods 0.000 description 1
- 239000011550 stock solution Substances 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 229940021747 therapeutic vaccine Drugs 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108010060175 trypsinogen activation peptide Proteins 0.000 description 1
- 239000012137 tryptone Substances 0.000 description 1
- 241000712461 unidentified influenza virus Species 0.000 description 1
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/005—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
- A61P31/12—Antivirals
- A61P31/20—Antivirals for DNA viruses
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/08—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses
- C07K16/081—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from viruses from DNA viruses
- C07K16/084—Papovaviridae, e.g. papillomavirus, polyomavirus, SV40, BK virus, JC virus
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20022—New viral proteins or individual genes, new structural or functional aspects of known viral proteins or genes
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/20011—Papillomaviridae
- C12N2710/20023—Virus like particles [VLP]
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/915—Therapeutic or pharmaceutical composition
- Y10S977/917—Vaccine
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/918—Immunological
-
- Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
- Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
- Y10S977/00—Nanotechnology
- Y10S977/902—Specified use of nanostructure
- Y10S977/904—Specified use of nanostructure for medical, immunological, body treatment, or diagnosis
- Y10S977/92—Detection of biochemical
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Virology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Public Health (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Communicable Diseases (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Oncology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
ESTA INVENCION SE REFIERE A UNA PROTEINA RECOMBINANTE DE TIPO L1 DEL VIRUS DEL PAPILOMA QUE PUEDE PROVOCAR UNA RESPUESTA INMUNE QUE RECONOCE EL VIRUS DEL PAPILOMA VLP QUE INCLUYE LA PROTEINA L1 Y PUEDE FORMAR EXTRACELULARMENTE UNA ESTRUCTURA MULTIMERICA O VLP CUYA ESTRUCTURA COMPRENDE UNA PLURALIDAD DE PROTEINAS L1 RECOMBIANNTES DEL VIRUS DEL PAPILOMA. ESTA INVENCION TAMBIEN INCLUYE EL USO DE LA PROTEINA L1 RECOMBINANTE DEL VIRUS DEL PAPILOMA PARA DETECTAR LA PRESENCIA DE DICHO VIRUS Y PUEDE CONSTITUIR LA BASE DE UNA VACUNA PARA USO PREVENTIVO Y TERAPEUTICO.
Description
Papilomavirus recombinante L1.
Esta invención se refiere a papilomavirus con la
proteína L1. En particular, la invención se refiere a la proteína
L1 de papilomavirus recombinantes y a su uso para detectar y tratar
infecciones producidas por papilomavirus.
Los papilomavirus infectan a una serie de
hospedadores incluyendo el ser humano, vacas, ovejas, perros y
gatos. Para una lista más completa, véase "Papilloma Virus
infections in Animals" por J.P. Sundberg, que se describe en
Papilloma Viruses and Human Diseases, editado por K. Syrjanen, L.
Gissman y L.G. Koss, Springer Verlag, 1987.
Los papilomavirus humanos inducen lesiones
hiperproliferativas benignas del epitelio cutáneo y mucoso. De los
70 tipos diferentes de virus que infectan a los seres humanos, más
de 20 están asociados con lesiones anogenitales (de Villiers, 1989,
J. Virol. 63 4898-4903). Los papilomavirus
también se han asociado con diversas formas de cánceres. Los
papilomavirus humanos de tipo 16 y 18 se han asociado con varias
neoplasias intra-epiteliales cervicales y carcinomas
del cuello del útero (Lancaster et al., 1987, Cancer Metast.
Rev. 6 6653-6664 y Pfister, 1987, Adv. Cancer
Res. 48 113-147).
Los papilomavirus son virus de ADN pequeños que
codifican hasta ocho genes tempranos y dos genes tardíos. Los genes
tardíos L1 y L2 codifican proteínas estructurales que se ensamblan
formando una cápsida dentro de la célula (Galloway et al.,
1989, Adv. Virus Res. 37 125-171). La
cápsida de un solo virus es un icosaedro T=7d compuesto de 360
capsómeros pentaméricos, conteniendo cada uno de ellos cinco
moléculas de la proteína principal de la cápsida L1 (Baker et
al., 1991, Biophys. J. 60 1445-1456 y
Finch et al., 1965, J. Mol. Bio. 13
1-12). La proteína minoritaria de la cápsida L2
está presente en una cantidad de aproximadamente un décimo de L1
(Doorbar et al., 1987, J. Virol. 61
2793-2799).
Aún no se ha conseguido la propagación de los
papilomavirus humanos in vitro (Taichman et al, 1984,
J. Invest. Dermatol 83 25) y sólo se han aislado pequeñas
cantidades de proteínas de HPV a partir de tejidos infectados
(Androphy et al., 1987, Embo J. 6 1989; Banks et
al., 1987, J. Gen. Virol. 68 1351; Firzlaff et
al., 1988, Virology 164 467; Oltersdorf et al.,
1987, J. Gen. Virol. 68 2933;
Schneider-Gadicke et al., 1988, Cancer Res.
48 2969; Seedorf et al., Embo J. 6 139 y
Smotkin et al., 1986, PNAS 83 4680). Sin embargo, el
gen que codifica la proteína L1 se ha clonado y expresado en un
sistema de expresión eucariótico usando un virus de vaccinia
recombinante (Browne et al., 1988, J. Gen. Virol. 69
1263-1273; Zhou et al, 1990, J. Gen. Virol.
71 2185-2190 y Zhou et al, 1991,
Virology 185 251-257), en un sistema de
expresión de baculovirus (Park et al, 1993, J. Virol. Meth.
45 303-318) y en un sistema de expresión
bacteriano (Strike et al, 1989, J. Gen. Virol. 70
543-555).
Como la proteína L1 es la proteína principal de
la cápsida, se ha usado como base para el desarrollo de vacunas
para la protección contra la infección por papilomavirus. Zhou et
al. inmunizaron ratones con partículas sintéticas parecidas al
virus HPV16 (VLP) usando un virus de vaccinia doble
recombinante para las proteínas L1 y L2 de HPV16. El antisuero
anti-VLP murino reconocía cápsidas de HPV16 por
ELISA y las proteínas L1 y L2 de HPV16 recombinante de baculovirus
en inmunotransferencia. Sin embargo, el antisuero
anti-VLP murino no reconocía dos péptidos que se
reconocían por anticuerpos monoclonales anti-L1 de
HPV16 inducidos contra una proteína de fusión L1 recombinante (Zhou
et al., 1992, Virology 189 592-599).
Estos investigadores concluyeron que los epítopos inmunorreactivos
de HPV16 definidos usando partículas parecidas a virus diferían
significativamente de los definidos usando proteínas de fusión de
L1 de HPV16 recombinante.
Para solucionar los problemas de presentación, se
crearon vacunas usando partículas parecidas a virus. Se formaron
VLP intracelularmente a partir de proteínas L1 o L1 y L2
recombinantes codificadas por un virus de vaccinia
recombinante (Zhou et al., 1991, Virology 185
251-257, Zhoy et al., 1991, Virology
181 203-210 y Memoria Descriptiva de la
Patente Internacional WO93/02184). Estas vacunas preparadas usando
partículas sintéticas parecidas a virus tienen varios
inconvenientes. En primer lugar, los genes L1 o L1 y L2
recombinantes se expresan a partir de un vector de virus de
vaccinia que puede no ser adecuado para la producción de una
vacuna. En segundo lugar, las partículas parecidas a virus se
producen intracelularmente, lo cual es una etapa limitante de la
velocidad. En tercer lugar, las partículas parecidas a virus pueden
incorporar ADN celular porque se producen intracelularmente y las
partículas parecidas a virus que incorporan ADN no son adecuadas
para uso en vacunas. En cuarto lugar, las partículas parecidas a
virus pueden purificarse sólo parcialmente debido a la necesidad de
retener su integridad y, por lo tanto, la correcta presentación del
epítopo. Por consiguiente, otras proteínas o materias asociadas con
las partículas parecidas a virus pueden contaminar una preparación
de vacuna. En quinto lugar, el proceso de producción de una vacuna
en cantidades comerciales con partículas parecidas a virus a partir
virus de vaccinia recombinantes es comparativamente
caro.
Se aplican inconvenientes similares al uso de
partículas parecidas a virus producidas a partir de virus de
vaccinia recombinantes para la detección de anticuerpos en el
suero de pacientes. Rose, R.C.; Bonnez, W., Reichman, R.C. y
Garcea, R.L. (1993) J. Virol. 67, 1936-1944 enseñan
el autoensamblaje de L1 expresada en células de insectos para
formar partículas parecidas a virus que presentan epítopos
presentes en las partículas de virus nativas. De acuerdo con este
documento, la desnaturalización de L1 conduce a una pérdida de los
epítopos mencionados anteriormente.
La presente invención proporciona un método para
preparar una estructura multimérica que comprende una o más
proteínas L1 de papilomavirus recombinante expresadas en bacterias,
incluyendo dicho método las etapas de:
(i) expresar una molécula de ADN recombinante que
codifica un proteína L1 de papilomavirus recombinante en una célula
bacteriana;
(ii) obtener dicha proteína L1 de papilomavirus
recombinante a partir de dicha célula bacteriana en condiciones de
desnaturalización;
(iii) purificar dicha proteína L1 de
papilomavirus recombinante obtenida en la etapa (ii); y
(iv) formar dicha estructura multimérica a partir
de una o más de dichas proteínas L1 de papilomavirus recombinante
purificadas en la etapa (iii).
Preferiblemente, la formación de dicha estructura
multimérica en la etapa (iv) se realiza en ausencia de sal.
La molécula de ADN recombinante puede comprender
una secuencia de nucleótidos 5' de acuerdo con la SEC ID Nº: 2.
Además, la molécula de ADN recombinante puede comprender una
secuencia de nucleótidos 5' de acuerdo con la SEC ID Nº: 3.
La molécula de ADN recombinante puede comprender
una secuencia de nucleótidos que puede hibridar en condiciones
convencionales con la SEC ID Nº: 2 o la SEC ID Nº: 3.
La molécula de ADN recombinante puede insertarse
en pTrcHisB en una fase de lectura correcta con respecto a la
expresión de la proteína L1 de papilomavirus.
La proteína L1 de papilomavirus puede expresarse
en una célula bacteriana E. coli.
El método de la invención, además, puede incluir
la etapa de incorporar la estructura multimérica en una vacuna.
La proteína L1 de papilomavirus recombinante
puede ser una proteína de fusión.
El método puede usar estructuras multiméricas que
comprenden proteínas L1 de papilomavirus recombinante que tienen
una secuencia de aminoácidos N terminal que incluye
(His)_{6}. La secuencia de aminoácidos N terminal (SEC ID
Nº:1) puede incluir:
La molécula de ADN recombinante puede construirse
a partir de una fuente adecuada de ADN de papilomavirus tal como un
papilomavirus humano o un papilomavirus bovino, usando técnicas de
clonación y/o de PCR convencionales. La molécula de ADN recombinante
también puede incluir un vector de expresión. El vector de
expresión puede ser un plásmido, cósmido, fagémido o un virus. Un
vector de expresión adecuado codifica (en el siguiente orden) un
sitio ATG, un péptido (His)_{6} y después un sitio de
clonación donde puede insertarse la secuencia de ADN de la proteína
L1 de papilomavirus en la fase de lectura correcta de forma que se
obtenga una proteína de fusión
(His)_{6}-proteína L1 tras la traducción.
Un vector de expresión preferido es uno cualquiera de los plásmidos
pTrcHisA, pTrcHisB y pTrcHisC. Un hospedador adecuado es una cepa
de E. coli.
El sistema de expresión preferido es un sistema
de expresión bacteriano con E. coli y el plásmido pTrcHisB.
La introducción de la molécula de ADN recombinante en un hospedador
adecuado puede conseguirse por cualquier método adecuado, incluyendo
transfección y transformación. Una molécula de ADN recombinante
preferida es la secuencia de ADN completa de la proteína L1 de
HPV6b insertada en pTrcHisB en una orientación de fase de lectura
correcta para formar pTrc6bL1. La molécula de ADN recombinante
pTrc6bL1 preferiblemente se utiliza para transformar la cepa DH5 de
E. coli.
Después de la expresión, el sistema de expresión
puede romperse. Cuando el sistema de expresión es un sistema
celular, la célula puede lisarse con técnicas y agentes adecuados
tales como sonicación en un tampón que contiene clorhidrato de
guanidinio. La proteína L1 de papilomavirus recombinante puede
purificarse parcial o completamente. La purificación puede
conseguirse usando uno cualquiera o varios procedimientos
cromatográficos adecuados. La proteína L1 de papilomavirus
recombinante puede purificarse usando una etapa de cromatografía de
afinidad con una columna de níquel. Otras etapas de purificación
adicionales pueden incluir electroforesis en gel preparativa.
En otro aspecto, la invención proporciona una
vacuna profiláctica o terapéutica que incluye dicha proteína L1 de
papilomavirus recombinante. La vacuna puede incluir un adyuvante
adecuado tal como ISCOMS, alumbre, adyuvante incompleto de Freund,
adyuvante completo de Freund, Quil A, otras saponinas, hidróxido de
aluminio, algammulin y toxina pertussis. Como alternativa,
la vacuna puede no incluir adyuvante, cuando la proteína L1 de
papilomavirus recombinante es inmunogénica sin adyuvante.
La Fig. 1 ilustra la secuencia de nucleótidos de
ADN y la secuencia de aminoácidos de la proteína
HPV6bL1
HEXAHIS (SEC ID Nº:3); y
HEXAHIS (SEC ID Nº:3); y
La Fig. 2 es una micrografía electrónica de
estructuras pentaméricas de agregados de la proteína
HPV6bL1
HEXAHIS.
HEXAHIS.
Ahora puede hacerse referencia a diversas
realizaciones preferidas de la invención. En estas realizaciones
preferidas, debe indicarse que las referencias particulares a
papilomavirus, vacunas y construcciones de moléculas de ADN
recombinantes se proporcionan sólo a modo de ejemplo.
La fase de lectura abierta de L1 de HPV6b se
clonó a partir de un aislado clínico por medio de una reacción en
cadena de la polimerasa usando como cebadores:
El producto de PCR de 1,5 kb resultante se
escindió con BamH1 y Sam1 y se clonó en un sitio
BamH1/Eco R1 de extremos romos por la acción el
fragmento de klenow, creado dentro del plásmido pTRCHIS B
(Invitrogen). El plásmido recombinante de L1 resultante fue
pTRC6bL1.
Se inocularon 10 ml de caldo 2YT (16 mg de
triptona, 10 mg de levadura, 5 mg de NaCl) que contenía ampicilina
(concentración final 100 \mug/ml) con 10 \mul de un asa de
bacterias (E. coli DH5) procedentes de una solución madre en
glicerol. El cultivo se incubó a 37ºC con aireación a 120 rpm
durante seis horas.
Se inocularon 200 ml de caldo 2YT que contenía
ampicilina (concentración final 100 \mug/ml) con el cultivo de 10
ml de 6 horas. El cultivo se incubo a 37ºC con aireación a 120 rpm
durante una noche.
En 800 ml del caldo 2YT que contenía ampicilina
(concentración final 100 \mug/ml) se inoculó el cultivo de una
noche de 200 ml. El cultivo se incubó a 37ºC con aireación a 120
rpm hasta que la absorbancia alcanzó un valor comprendido entre 0,6
y 0,8 unidades O.D. a 600 nm (normalmente 2-3
horas). La proteína HPV6b L1 HEXAHIS se indujo por la adición de
IPTG 0,5 mM durante 4-6 horas.
Las bacterias se sedimentaron por centrifugación
(rotor Beckman JA14 centrifugado a 5000 rpm durante 10 minutos a
20ºC). El sedimento se lavó en 50 ml de solución salina tamponada
con fosfato resuspendiendo el sedimento bacteriano en un tubo de
centrifuga de 50 ml. Las bacterias lavadas se volvieron a
sedimentar por centrifugación (Beckman TJ-6 a 3000
rpm durante 10 minutos a 20ºC). El sobrenadante se desechó. El
sedimento se almacenó a -20ºC o a -70ºC hasta que fue
necesario.
Las bacterias se resuspendieron y se lisaron en
50 ml de tampón de lisis de guanidinio (clorhidrato de guanidinio 6
M y 5,8 ml/litro de solución A [NaH_{2}PO_{4} 177 mM, NaCl 5 M]
pH 7,8 usando HCl). La suspensión se sonicó a un
rendimiento del 30% durante 2 minutos. Los desechos celulares se sedimentaron por centrifugación (rotor Beckman JA21 a 10000 rpm durante 30 minutos a 4ºC). Se retuvo el sobrenadante que contenía la proteína HPV6b L1 HEXAHIS.
rendimiento del 30% durante 2 minutos. Los desechos celulares se sedimentaron por centrifugación (rotor Beckman JA21 a 10000 rpm durante 30 minutos a 4ºC). Se retuvo el sobrenadante que contenía la proteína HPV6b L1 HEXAHIS.
La proteína HPV6b L1 HEXAHIS se purificó
substancialmente por medio de un procedimiento de purificación
esencialmente de dos etapas.
El sobrenadante que contenía la proteína HPV6b L1
HEXAHIS se introdujo en una columna de níquel (2,6 cm x 6 cm)
usando un sistema BIORAD ECONO a 4ºC. Antes de introducir el
sobrenadante, la columna se lavó minuciosamente con tampón NA a 1
ml/minuto. El tampón NA comprende urea 6 M, 5,8 ml/litro de
solución A [NaH_{2}PO_{4} 177 mM y NaCl 5 M], y 94 ml/l de
solución B [Na_{2}HPO_{4} 200 mM y NaCl 5 M] a pH 7,8 usando HCl
antes de añadir la urea. El sobrenadante se introdujo en la columna
de níquel a 1 ml/minuto. Se recogieron fracciones de 10 ml cuando la
columna se había sobrecargado y sólo eluyó la proteína no unida a
través de la columna. Después de introducir el sobrenadante, la
columna se lavó con tampón NB a un caudal de 1 ml/minuto. El tampón
NB comprende urea 6 M y 100 ml/litro de solución A
[NaH_{2}PO_{4} 177 M y NaCl 5 M] a pH 4,0 usando HCl antes de
añadir la urea. La columna se lavó con tampón NB de acuerdo con el
procedimiento de la tabla 1 donde la reducción del gradiente del pH
eliminó las proteínas contaminantes. Se recogieron fracciones de 10
ml del eluyente.
Las fracciones que contenían la proteína HPV6b L1
HEXAHIS se determinaron por dot blot, ELISA directo o SDS PAGE.
Después de identificar las fracciones, se continuó el lavado de la
columna con tampón NB al 100% hasta que el pH se niveló. La columna
después se lavó con tampón NA. (La columna se almacenó en etanol al
20%).
Las fracciones que contenían la proteína HPV6b L1
HEXAHIS se reunieron y se dializaron frente a cinco litros de
dH_{2}O o Tris HCl 10 mM, pH 7,5, durante una noche a 4ºC (o dos
horas a temperatura ambiente). La proteína después se precipitó con
acetona en una relación entre acetona y muestra de 8:2, durante dos
horas a -70ºC o durante una noche a -20ºC. La solución de
proteína-acetona se centrifugó (Beckman
TJ-6 a 3000 rpm y 4ºC durante 20 minutos). El
sobrenadante se desechó. El sedimento se secó bajo una corriente de
gas nitrógeno durante cinco minutos para retirar toda la acetona
restante.
El sedimento se resuspendió en 1 ml de ddH_{2}O
y 4-5 ml de 4 x tampón de carga [1,0 ml de Tris 0,5
M, pH 6,8, 0,8 ml de glicerol, 1,6 ml de SDS al 10% p/v, 0,1 g de
DTT al 1% p/v, 0,2 ml de azul de bromofenol al 0,1% p/v y 4,4 ml de
dH_{2}O]. El sedimento resuspendido se calentó a
65-70ºC durante15 minutos para asegurar que se había
disuelto toda la proteína.
La resuspensión se introdujo en una BIORAD Prep
Cell que contenía un gel de separación al 10% (de 4,5 cm de altura
por 4 cm de diámetro) con un gel de adherencia al 4% (de 4 cm de
altura por 4 cm de diámetro). La Prep Cell se hizo funcionar a una
potencia constante de 12 W.
Cuando el colorante en la parte frontal del gel
alcanzó 2 cm desde la parte inferior, se recogieron fracciones de
10 ml a una velocidad de elución de 1 ml/minuto. Las fracciones se
ensayaron con respecto a la proteína HPV6b L1 HEXAHIS por dot blot,
ELISA directo o SDS PAGE (con el sistema Phast). Las fracciones
positivas se ensayaron en SDS PAGE y se reunieron las que se
descubrió que tenían una sola banda de proteína HPV6bL1HEXAHIS. Las
fracciones reunidas se dializaron frente a 5 litros de ddH_{2}O
para retirar la glicina. La diálisis se realizó durante una noche a
una temperatura de 4ºC y usando dos cambios de ddH_{2}O.
La proteína HPV6b L1 HEXAHIS dializada se
precipitó con acetona para retirar el SDS. Se usó una relación
entre acetona y muestra de 8:2 durante 2 horas a -70ºC o durante una
noche a -20ºC. La solución de proteína-acetona se
centrifugó (Beckman TJ-6 a 3000 rpm y a 4ºC durante
20 minutos). El sobrenadante se desechó y el sedimento se secó bajo
una corriente de gas nitrógeno durante cinco minutos para retirar
toda la acetona restante.
Después, la proteína se resuspendió en un tampón
elegido y pudo determinarse su concentración. Posteriormente se
demostró que esta proteína formaba capsómeros por medio de la
purificación de la proteína HPV6b L1 HEXAHIS como se ha descrito, la
eliminación gradual de la urea por diálisis frente a Tris HCl 10 mM
pH 7,5, y el examen del inmunoprecipitado resultante por microscopía
electrónica de barrido. La fig. 2 muestra las estructuras
pentaméricas típicas de agregados de proteína de HPV6b L1
HEXAHIS.
Para producir anticuerpos contra la proteína
HPV6b L1 HEXAHIS, a ratones (cepa C57BI/6) se les inyectaron por
vía subcutánea dos veces, a un intervalo de cuatro semanas, 50
\mug de proteína/ratón siguiendo el protocolo experimental de la
tabla 2. Dos semanas después de la segunda inyección, se extrajo
sangre de los ratones. Se obtuvo suero de los ratones a partir de la
sangre extraída usando procedimientos convencionales.
El suero se ensayó con respecto a la producción
de anticuerpos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS usando tres
antígenos diferentes.
El suero se ensayó frente a una preparación de
cápsida de HPV6B de papilomavirus humano. El suero de diluyó a 1 en
200 y se ensayó frente a una preparación de cápsida de HPV6B en
tampón RIPA (Tris-HCl 20 mM, pH 7,6; EDTA 2 mM; NaCl
50 mM, desoxicolato al 1%; Triton X-100 al 1%, SDS
al 0,25%, aprotinina al 1% y PMSF 1 mM). Los precipitados de
anticuerpo-antígeno se procesaron en SDS PAGE al
10% separando los componentes individuales del complejo inmune. La
presencia de la proteína HPV6b L1 se detectó con anticuerpo
anti-L1 de HPV6b. La presencia de la proteína L1 de
HPV6b indica que se produjo anticuerpo anti-L1 de
HPV6b en el ratón contra la proteína 6bL1HEXAHIS. Los grupos A, B,
C, D, E y F dieron resultados positivos.
El suero también se ensayó por análisis de
transferencia de western con L1 de HPV6b producida a partir de
baculovirus. Un resultado positivo indica que se produjo anticuerpo
anti-L1 de HPV6b en el ratón contra la proteína
HPV6b L1 HEXAHIS. Los grupos A, B, C, D, E y F dieron resultados
positivos, demostrándose los mejores resultados cuando se usó
hidróxido de aluminio como adyuvante. Los grupos de control A, B,
C, D y E dieron resultados negativos.
El suero se ensayó por dot blot y ELISA usando
técnicas convencionales contra la proteína L1 del papilomavirus
bovino. Se consiguió el mejor resultado con suero de ratones del
grupo D (es decir, cuando se usó aluminio como adyuvante) con una
lectura de OD de 0,96. Éste estuvo seguido del suero del grupo C
(es decir, con adyuvante completo de Freund) con una lectura de OD
de 0,70, del suero del grupo E (es decir, con algammulin) con una
lectura de OD de 0,34, después, del suero del grupo B (es decir,
hervido en SDS al 1% y enfriado) con una lectura de OD de 0,24 y del
suero del grupo A (sin adyuvante) con un lectura de OD de 0,34.
Todos los grupos de control tuvieron una lectura de OD de 0,05.
El ensayo del suero frente a tres antígenos
diferentes demostró que la proteína HPV6b L1 HEXAHIS era
inmunogénica y producía anticuerpos anti-L1 de HPV6b
cuando se usaba como un antígeno con o sin adyuvante.
La hipersensibilidad de tipo retrasado implica
reacciones inmunes mediadas por células así como algunas reacciones
inmunes humorales. Se trataron ratones (cepa BALB/c) (por inyección
intraperitoneal) con la proteína HPV6b L1 HEXAHIS en una diversidad
de condiciones indicadas en la tabla 3. En el día 11, la oreja se
expuso (por inyección intradérmica) a la proteína HPV6b L1 HEXAHIS o
a otra proteína HEXAHIS. Se midió el espesor de la oreja en el día
13 y en el día 14. Los ratones que dieron una respuesta positiva en
el día 14 se sacrificaron y se examinó la histología de la
oreja.
En este ejemplo, se demostró que la proteína
HPV6b L1 HEXAHIS sin adyuvante inducía una buena hipersensibilidad
de tipo retrasado con dosis iniciales de 50 \mug/ratón pero no a
5 \mug/ratón. Sin embargo, los ratones necesitaban tratarse con
toxina pertussis para inducir una respuesta de
hipersensibilidad de tipo retrasado.
Con respecto a los tres ejemplos, se ha
demostrado que la proteína L1 de HPV6b expresada y aislada en el
método del ejemplo 1 formaba agregados capsoméricos, y los agregados
capsoméricos de la proteína L1 de HPV6b sin un adyuvante adicional
eran inmunogénicos, produciendo una respuesta de anticuerpos y una
respuesta mediada por células. Por lo tanto, la proteína HPV6b L1
HEXAHIS serviría como base adecuada para una vacuna diseñada para
prevenir la infección por el papilomavirus humano por medio de la
inducción de anticuerpos neutralizadores o para tratar lesiones
existentes por medio de la inducción de inmunidad mediada por
células específica para la proteína L1. Los ejemplos 1 a 3 han
usado la proteína L1 de HPV6b como ejemplo para demostrar la
inmunogenicidad de la preparación y, como ejemplo, la invención no
se restringe a este ejemplo y puede usarse cualquier proteína L1 de
papilomavirus.
Se recubrieron pocillos de placas a 0,2 \mug de
proteína/pocillo con HPV6b L1 HEXAHIS producida en E. coli,
HPV6b VLP-L1 producida en baculovirus y
preparaciones de baculovirus y E. coli (sobrenadantes de
fermentación de células) como controles, en PBS a pH 7,2, y se
dejaron incubar durante una noche a temperatura ambiente. Se realizó
un lavado con PBS a pH 7,2. La unión no específica se bloqueó
incubando las placas con caseína al 1% (p/v) durante una hora a
temperatura ambiente.
Se añadió antisuero de conejo contra HPV6b L1
HEXAHIS a cada uno de los pocillos recubiertos con HPV6b L1
HEXAHIS, HPV VLP-1, controles preparados con
baculovirus o controles preparados con E. coli (preparados
por duplicado), y las placas se diluyeron en serie a la mitad. Como
control negativo se usaron sueros inducidos contra
A/PR-8 del virus de la influenza. Como control
positivo, en placas HPV VLP-L1 se usaron sueros
inducidos contra HPV VLP-L1. Las placas se
incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente y después se lavaron
tres veces con PBS que contenía Tween 20 al 0,05% (v/v) a pH 7,2. A
cada pocillo se le añadió conjugado de IgG-HRP
de
cabra-conejo y las placas se incubaron y se lavaron como se ha indicado anteriormente. La unión específica de
los antisueros al antígeno se detectó usando TMB. La reacción se detuvo después de cinco minutos usando HCl 0,5 M.
cabra-conejo y las placas se incubaron y se lavaron como se ha indicado anteriormente. La unión específica de
los antisueros al antígeno se detectó usando TMB. La reacción se detuvo después de cinco minutos usando HCl 0,5 M.
Los resultados del experimento se muestran en la
tabla 4. Tanto la proteína HPV6b L1 HEXAHIS como la proteína HPV6
VLP-L1 formaron complejos con anticuerpos inducidos
contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS, lo cual indica que HPV6b L1
HEXAHIS presenta correctamente in vivo uno o más epítopos
presentados por HPV VLP-L1. Los sueros inducidos
contra la proteína L1 de HPV6 también fueron negativos en los
pocillos de baculovirus o E. coli, lo que demuestra la
especificidad de la reacción. Esto justifica el uso de HPVL1 HEXAHIS
como un inmunógeno de vacuna adecuado para inducir anticuerpos que
puedan interaccionar y neutralizar potencialmente virus. Además,
este ejemplo justifica un inmunoensayo para la detección de la
proteína L1 de papilomavirus demostrado por el recubrimiento de
varias proteínas en pocillos y uso de anticuerpos inducidos contra
la proteína HPV6b L1 HEXAHIS recombinante. Los pocillos que
contenían un antígeno derivado de HPV6b dieron un resultado
positivo. Este ejemplo también justifica un inmunoensayo para la
detección de anticuerpos específicos para la proteína L1 de
papilomavirus demostrado por el recubrimiento de los pocillos con la
proteína HPV6b L1 HEXAHIS recombinante y el uso de sueros inducidos
contra A/PR-8 del virus de la influenza y sueros
inducidos contra la proteína HPV6b L1 HEXAHIS. En este caso, los
pocillos que contenían sueros inducidos contra la proteína HPV6b L1
HEXAHIS dieron un resultado positivo, mientras que los inducidos
contra el virus de la influenza fueron negativos.
Se realizaron experimentos de transferencia de
western y ELISA como se ha descrito previamente o siguiendo
procedimientos convencionales. Se realizó un ensayo de captura ELISA
por el siguiente método:
(1) se usó un anticuerpo monoclonal (moAb 8)
específico para VLP para recubrir los pocillos de una placa de
microtitulación;
(2) se añadió proteína HPV VLP L1, se incubó en
condiciones adecuadas y se lavó con PBS que contenían Tween 20 al
0,1% a pH 7,4;
(3) se añadieron anticuerpos inducidos contra
diversos inmunógenos (mostrados en la columna 2 de la tabla 5) en
diversos animales (mostrados en la columna 1 de la tabla 5); y
(4) se añadieron agentes de detección adecuados
(en el caso de antisuero de conejo, se usó suero de cabra
anti-conejo conjugado con peroxidasa) para detectar
el complejo de estructura
multimérica/VLP-anticuerpo.
En la tabla 5 se proporciona la cantidad de
HEXAHIS de papilomavirus recombinante capturada por pocillo. Estos
experimentos demuestran que los antisueros inducidos contra
proteínas L1 HEXAHIS de papilomavirus recombinante desencadenan una
respuesta inmune que reconoce VLP de papilomavirus, incluyendo la
proteína L1.
Procedimiento para lavar la columna de níquel con tampón NB | |
Tiempo (Minutos) | % de Tampón NB |
0 | 0 |
30 | 0 |
300 | 100 |
310 | 100 |
320 | 100 |
330 | 100 |
Protocolo experimental para inyectar en ratones proteína 6b L1 HEXAHIS para producir anticuerpos | ||
Grupo de Ratones^{a} | Adición de proteína 6b L1 | Otras condiciones |
HEXAHIS^{b} | ||
A | + | sin adyuvante |
A_{1} | - | sin adyuvante |
B | + | hervido en SDS al 1% y enfriado |
B_{1} | - | hervido en SDS al 1% y enfriado |
C | + | con adyuvante completo de Freund |
C_{1} | - | con adyuvante completo de Freund |
D | + | absorbido en hidróxido de aluminio |
D_{1} | - | absorbido en hidróxido de aluminio |
E | + | con algammulin |
E_{1} | - | con algammulin |
F | + | con L2 (50 \mug) y sin adyuvante |
(Tabla pasa a página
siguiente)
Resultados de ELISA usando antisuero de conejo contra HPV6b L1 HEXAHIS | |
Antígeno | ELISA usando antisuero de conejo contrA |
HPV6b L1 HEXAHIS | |
HPV6 VLP-L1 | >4,0 excede los límites a 1:4000 |
HPV6b L1 HEXAHIS | 2,12 \pm 0,1 a 1:4000 |
preparación de control de baculovirus | 0,63 \pm 0,01 a 1:4000 |
preparación de control de E. coli | 0,12 \pm 0,00 a 1:4000 |
(Tabla pasa a página
siguiente)
Tabla
2
^{a}cada grupo de ratones contiene cuatro
ratones
^{b}la proteína 6b L1 HEXAHIS se administró a
50 \mug de proteína por ratón
Tabla
3
^{a}Los grupos constan de 4 a 6 ratones Balb/C
(68-102)
^{b}L1 denota la proteína L1 HEXAHIS e IRR
denota la proteína HEXAHIS irrelevante
^{c}PBS solución salina tamponada con fosfato y
CFA es adyuvante completo de Freund
^{d}la proteína 6b L1 HEXAHIS se administró a
10 \mug en un volumen máximo de 2 \mul
^{e}se añadieron 30 \mug de toxina
pertussis
^{f}mediciones de la oreja (\mum x 10)
Tabla
5
ND: no puede determinarse técnicamente
Figura
1
Secuencia de nucleótidos de ADN y secuencia de
aminoácidos de la proteína HPV6b L1 HEXAHIS (SEC ID
\hbox{Nº: 3)}
Figura
2
Macrografía electrónica de estructuras
pentaméricas de agregados de la proteína HPV6b L1 HEXAHIS
(1) INFORMACIÓN GENERAL:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- SOLICITANTE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE: Universidad de Queensland
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- CALLE:
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CIUDAD: St. Lucia
\vskip0.333000\baselineskip
- (E)
- PAÍS: Australia
\vskip0.333000\baselineskip
- (F)
- CÓDIGO POSTAL (ZIP): QLD 4072
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TÍTULO DE LA INVENCIÓN: Papilomavirus Recombinante L1
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- NÚMERO DE SECUENCIAS: 7
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- FORMA LEGIBLE POR ORDENADOR:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- TIPO DE MEDIO: Disco flexible
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- ORDENADOR: PC IBM compatible
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- SISTEMA OPERATIVO: PC-DOS/MS-DOS
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- SOFTWARE: PatenIn Release No. 1.0, Versión No. 1.30 (EPO)
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- DATOS DE LA SOLICITUD ACTUAL:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NÚMERO DE SOLICITUD: PCT/AU95/00292
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 1:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 32 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (v)
- TIPO DE FRAGMENTO: N-terminal
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 1:
\vskip1.000000\baselineskip
\sa{Met Arg Gly Ser His His His His His His Gly
Met Ala Ser Met Thr}
\sac{Gly Gly Gln Gln Met Gly Arg Asp Leu Tyr Asp
Asp Asp Asp Lys Asp}
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 2:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 96 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 2:
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATGCGGGGTT CTCATCATCA TCATCATCAT GGTATGGCTA GCATGACTGG TGGACAGCAA
\hfill60
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipATGGGTCGGG ACTTGTACGA CGATGACGAT AAGGAT
\hfill96
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 1599 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: ambas
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICA: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (ix)
- CARACTERÍSTICAS:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- NOMBRE/CLAVE: CDS
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- LOCALIZACIÓN: 1..1596
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- OTRA INFORMACIÓN: /producto = "proteína HPV6bL1 HEXAHIS"
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 3:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 532 aminoácidos
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: aminoácido
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: proteína
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº: 4:
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 5:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 41 pares de bases
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:5:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipGCGGATCCAG ATGTGGCGGC CTAGCGACAG CACAGTATAT G
\hfill41
\vskip0.666000\baselineskip
(2) INFORMACIÓN PARA LA SEC ID Nº: 6:
\vskip0.666000\baselineskip
- (i)
- CARACTERÍSTICAS DE LA SECUENCIA:
\vskip0.333000\baselineskip
- (A)
- LONGITUD: 43 pares de base
\vskip0.333000\baselineskip
- (B)
- TIPO: ácido nucleico
\vskip0.333000\baselineskip
- (C)
- CADENA: sencilla
\vskip0.333000\baselineskip
- (D)
- TOPOLOGÍA: lineal
\vskip0.666000\baselineskip
- (ii)
- TIPO DE MOLÉCULA: otro ácido nucleico
\vskip0.666000\baselineskip
- (iii)
- HIPOTÉTICO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (iv)
- ANTI-SENTIDO: NO
\vskip0.666000\baselineskip
- (xi)
- DESCRIPCIÓN DE LA SECUENCIA: SEC ID Nº:6:
\vskip0.333000\baselineskip
\dddseqskipCGCCCGGGTT ACCTTTTAGT TTTGGCCTCG CTTACGTTTT AGG
\hfill43
Claims (9)
1. Un método para preparar una estructura
multimérica que comprende una o más proteínas L1 de papilomavirus
recombinante expresadas en bacterias, incluyendo dicho método en
las etapas de:
(i) expresar una molécula de ADN recombinante que
codifica un proteína L1 de papilomavirus recombinante en una célula
bacteriana;
(ii) obtener dicha proteína L1 de papilomavirus
recombinante a partir de dicha célula bacteriana en condiciones de
desnaturalización;
(iii) purificar dicha proteína L1 de
papilomavirus recombinante obtenida en la etapa (ii); y
(iv) formar dicha estructura multimérica a partir
de una o más de dichas proteínas L1 de papilomavirus recombinante
purificadas en la etapa (iii).
2. El método de la reivindicación 1, donde en la
etapa (iv) la formación de dicha estructura multimérica se realiza
en ausencia de sal.
3. El método de la reivindicación 1, donde la
molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de nucleótidos
5' de acuerdo con la SEC ID Nº:2.
4. El método de la reivindicación 1, donde la
molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de nucleótidos
de acuerdo con la SEC ID Nº:3.
5. El método de la reivindicación 1, donde la
molécula de ADN recombinante comprende una secuencia de nucleótidos
que puede hibridar en condiciones convencionales con la SEC ID Nº:2
o la SEC ID Nº:3.
6. El método de la reivindicación 1, donde la
molécula de ADN recombinante se inserta en pTrcHisB en una fase de
lectura correcta con respecto a la expresión de la proteína L1 de
papilomavirus.
7. El método de la reivindicación 1, donde la
proteína L1 de papilomavirus se expresa en una célula
bacteriana
E. coli.
E. coli.
8. El método de la reivindicación 1, que incluye
además la etapa de incorporar la estructura multimérica en una
vacuna.
9. El método de la reivindicación 1, donde dicha
proteína L1 de papilomavirus recombinante es una proteína de
fusión.
Applications Claiming Priority (2)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
AUPM566794 | 1994-05-17 | ||
AUPM5667A AUPM566794A0 (en) | 1994-05-17 | 1994-05-17 | Process and product |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
ES2203640T3 true ES2203640T3 (es) | 2004-04-16 |
Family
ID=3780242
Family Applications (2)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES95918467T Expired - Lifetime ES2203640T3 (es) | 1994-05-17 | 1995-05-17 | Papilomavirus recombinante l1. |
ES03006355T Expired - Lifetime ES2275965T3 (es) | 1994-05-17 | 1995-05-17 | Papiloma virus recombinante l1. |
Family Applications After (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
ES03006355T Expired - Lifetime ES2275965T3 (es) | 1994-05-17 | 1995-05-17 | Papiloma virus recombinante l1. |
Country Status (13)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US6013262A (es) |
EP (2) | EP0759935B1 (es) |
JP (3) | JPH10500295A (es) |
KR (1) | KR100384922B1 (es) |
AT (2) | ATE340859T1 (es) |
AU (1) | AUPM566794A0 (es) |
CA (1) | CA2190473C (es) |
DE (2) | DE69531297T2 (es) |
DK (1) | DK0759935T3 (es) |
ES (2) | ES2203640T3 (es) |
NZ (1) | NZ285339A (es) |
PT (2) | PT759935E (es) |
WO (1) | WO1995031476A1 (es) |
Families Citing this family (38)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US8062642B1 (en) | 1993-03-09 | 2011-11-22 | University Of Rochester | Production of papillomavirus capsid protein and virus-like particles |
JP3863559B2 (ja) * | 1994-05-16 | 2006-12-27 | メルク エンド カンパニー インコーポレーテッド | 乳頭腫ウィルスワクチン |
GB9621091D0 (en) | 1996-10-09 | 1996-11-27 | Fondation Pour Le Perfectionem | Attenuated microorganisms strains and their uses |
AU739829B2 (en) * | 1997-04-08 | 2001-10-18 | Merck Sharp & Dohme Corp. | Stabilized human papillomavirus formulations |
US6228368B1 (en) * | 1997-10-06 | 2001-05-08 | Loyola University Of Chicago | Papilloma virus capsomere formulations and method of use |
US6689366B1 (en) * | 1998-12-17 | 2004-02-10 | Merck & Co., Inc. | Synthetic virus like particles with heterologous epitopes |
CA2354444A1 (en) * | 1998-12-17 | 2000-06-22 | Merck & Co., Inc. | Synthetic virus-like particles with heterologous epitopes |
AU763853B2 (en) * | 1998-12-23 | 2003-07-31 | Merck & Co., Inc. | Neutralizing assay using human papillomavirus virus-like particles |
KR20010093290A (ko) | 1999-02-05 | 2001-10-27 | 폴락 돈나 엘. | 사람 파필로마바이러스 백신 제제 |
US8128922B2 (en) * | 1999-10-20 | 2012-03-06 | Johns Hopkins University | Superior molecular vaccine linking the translocation domain of a bacterial toxin to an antigen |
US7026443B1 (en) | 1999-12-10 | 2006-04-11 | Epimmune Inc. | Inducing cellular immune responses to human Papillomavirus using peptide and nucleic acid compositions |
KR100366608B1 (ko) * | 2000-02-15 | 2003-01-09 | 마스터진(주) | 형질전환 식물체로부터 생산된 재조합 인간 파필로마바이러스 백신 |
ATE418997T1 (de) * | 2000-07-06 | 2009-01-15 | Univ Georgetown | Stabile (fixierte) formen von viralen l1 capsidproteinen, deren fusionsproteinen, und deren verwendungen |
US7318928B2 (en) * | 2000-08-01 | 2008-01-15 | The Johns Hopkins University | Molecular vaccine linking intercellular spreading protein to an antigen |
US7342002B2 (en) * | 2000-08-03 | 2008-03-11 | The Johns Hopkins University | Molecular vaccine linking an endoplasmic chaperone polypeptide to an antigen |
AUPR446801A0 (en) | 2001-04-18 | 2001-05-17 | University Of Queensland, The | Novel compositions and uses therefor |
AU2003213060A1 (en) * | 2002-02-14 | 2003-09-04 | Novavax, Inc. | Optimization of gene sequences of chimeric virus-like particles for expression in insect cells |
AU2003296902A1 (en) | 2002-09-03 | 2004-05-04 | Kentucky Bioprocessing, Llc | Production of peptides in plants as viral coat protein fusions |
US9701725B2 (en) * | 2003-05-05 | 2017-07-11 | The Johns Hopkins University | Anti-cancer DNA vaccine employing plasmids encoding signal sequence, mutant oncoprotein antigen, and heat shock protein |
US7354719B2 (en) | 2004-12-08 | 2008-04-08 | Gen-Probe Incorporated | Detection of nucleic acids from multiple types of human papillomaviruses |
WO2006073970A2 (en) * | 2005-01-06 | 2006-07-13 | The Johns Hopkins University | Rna interference that blocks expression of pro-apoptotic proteins potentiates immunity induced by dna and transfected dendritic cell vaccines |
JP2008528004A (ja) * | 2005-01-26 | 2008-07-31 | ザ ジョンズ ホプキンス ユニバーシティー | 突然変異癌タンパク質抗原およびカルレティキュリンをコードするプラスミドを用いる抗癌dnaワクチン |
US7691579B2 (en) * | 2005-04-15 | 2010-04-06 | The United States Of America As Represented By The Secretary Of The Department Of Health And Human Services | Methods and compositions for producing an enhanced immune response to a human papillomavirus immunogen |
US7732166B2 (en) * | 2005-11-15 | 2010-06-08 | Oncohealth Corporation | Detection method for human pappilomavirus (HPV) and its application in cervical cancer |
US7972776B2 (en) * | 2005-11-15 | 2011-07-05 | Oncohealth Corporation | Protein chips for HPV detection |
US20100330105A1 (en) * | 2006-08-22 | 2010-12-30 | John Hopkins University | Anticancer Combination Therapies |
US8859218B2 (en) | 2008-06-13 | 2014-10-14 | Oncohealth Corp. | In situ detection of early stages and late stages HPV infection |
US8916342B2 (en) | 2006-11-13 | 2014-12-23 | Oncohealth Corp. | Identification of high grade or ≧ CIN2 for early stages and late stages detection, screening, and diagnosis of human papillomavirus (HPV) and HPV-associated cancers |
US8968995B2 (en) * | 2008-11-12 | 2015-03-03 | Oncohealth Corp. | Detection, screening, and diagnosis of HPV-associated cancers |
US9085638B2 (en) | 2007-03-07 | 2015-07-21 | The Johns Hopkins University | DNA vaccine enhancement with MHC class II activators |
US20080260765A1 (en) * | 2007-03-15 | 2008-10-23 | Johns Hopkins University | HPV DNA Vaccines and Methods of Use Thereof |
WO2008134934A1 (en) * | 2007-04-29 | 2008-11-13 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | A truncated l1 protein of human papillomavirus 16 |
WO2008134935A1 (fr) | 2007-04-29 | 2008-11-13 | Beijing Wantai Biological Pharmacy Enterprise Co., Ltd. | Protéines 18 l1 de type papillomavirus humain tronqué |
CN101343315B (zh) | 2007-05-29 | 2012-06-13 | 厦门大学 | 截短的人乳头瘤病毒6型l1蛋白 |
US20090285861A1 (en) * | 2008-04-17 | 2009-11-19 | Tzyy-Choou Wu | Tumor cell-based cancer immunotherapeutic compositions and methods |
US9128094B2 (en) | 2010-01-08 | 2015-09-08 | Oncohealth Corp. | High throughput cell-based HPV immunoassays for diagnosis and screening of HPV-associated cancers |
CA2799205A1 (en) | 2010-05-25 | 2011-12-01 | Qiagen Gaithersburg, Inc. | Fast results hybrid capture assay and associated strategically-truncated probes |
EP4141110A1 (en) | 2020-04-24 | 2023-03-01 | Obshchestvo S Ogranichennoy Otvetstvennost'yu "Ingenik" | Method for producing particles of bacteriophages of the genus levivirus |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0133123A1 (en) * | 1983-07-25 | 1985-02-13 | Mgi Pharma, Inc. | Immunogens of papilloma viruses |
DE122007000017I1 (de) * | 1991-07-19 | 2007-07-26 | Univ Queensland | Impfstoffe gegen Papillomavirus |
DK0647140T3 (da) * | 1992-06-25 | 2008-02-04 | Univ Georgetown | Papillomavirusvacciner |
US5618536A (en) * | 1992-09-03 | 1997-04-08 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Chimeric papillomavirus-like particles |
US5437951A (en) * | 1992-09-03 | 1995-08-01 | The United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Self-assembling recombinant papillomavirus capsid proteins |
ES2263406T3 (es) * | 1993-03-09 | 2011-06-06 | The University Of Rochester | Producción de la proteína de capside l1 del papilomavirus humano hpv-11 y partículas de tipo virus. |
-
1994
- 1994-05-17 AU AUPM5667A patent/AUPM566794A0/en not_active Abandoned
-
1995
- 1995-05-17 NZ NZ285339A patent/NZ285339A/en not_active IP Right Cessation
- 1995-05-17 PT PT95918467T patent/PT759935E/pt unknown
- 1995-05-17 ES ES95918467T patent/ES2203640T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-17 US US08/737,336 patent/US6013262A/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-17 DE DE69531297T patent/DE69531297T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-17 DE DE69535249T patent/DE69535249T2/de not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-17 DK DK95918467T patent/DK0759935T3/da active
- 1995-05-17 KR KR1019960706525A patent/KR100384922B1/ko not_active IP Right Cessation
- 1995-05-17 PT PT03006355T patent/PT1325957E/pt unknown
- 1995-05-17 EP EP95918467A patent/EP0759935B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-17 ES ES03006355T patent/ES2275965T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-17 AT AT03006355T patent/ATE340859T1/de active
- 1995-05-17 CA CA2190473A patent/CA2190473C/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-17 JP JP7529247A patent/JPH10500295A/ja not_active Withdrawn
- 1995-05-17 WO PCT/AU1995/000292 patent/WO1995031476A1/en active IP Right Grant
- 1995-05-17 EP EP03006355A patent/EP1325957B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1995-05-17 AT AT95918467T patent/ATE245164T1/de active
-
2005
- 2005-07-05 JP JP2005196551A patent/JP3878197B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2006
- 2006-07-07 JP JP2006187730A patent/JP4016054B2/ja not_active Expired - Lifetime
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
ATE245164T1 (de) | 2003-08-15 |
JP2006001936A (ja) | 2006-01-05 |
WO1995031476A1 (en) | 1995-11-23 |
CA2190473C (en) | 2011-08-30 |
DE69535249D1 (de) | 2006-11-09 |
JP4016054B2 (ja) | 2007-12-05 |
DE69531297D1 (de) | 2003-08-21 |
JP3878197B2 (ja) | 2007-02-07 |
EP1325957A3 (en) | 2003-11-26 |
JP2006321806A (ja) | 2006-11-30 |
DE69535249T2 (de) | 2007-05-10 |
EP1325957B1 (en) | 2006-09-27 |
US6013262A (en) | 2000-01-11 |
ATE340859T1 (de) | 2006-10-15 |
EP1325957A2 (en) | 2003-07-09 |
DE69531297T2 (de) | 2004-05-27 |
EP0759935B1 (en) | 2003-07-16 |
PT1325957E (pt) | 2007-01-31 |
JPH10500295A (ja) | 1998-01-13 |
AUPM566794A0 (en) | 1994-06-09 |
NZ285339A (en) | 1998-04-27 |
ES2275965T3 (es) | 2007-06-16 |
PT759935E (pt) | 2003-11-28 |
EP0759935A1 (en) | 1997-03-05 |
EP0759935A4 (en) | 1999-07-07 |
KR100384922B1 (ko) | 2003-08-21 |
CA2190473A1 (en) | 1995-11-23 |
DK0759935T3 (da) | 2003-11-10 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
ES2203640T3 (es) | Papilomavirus recombinante l1. | |
Suzich et al. | Systemic immunization with papillomavirus L1 protein completely prevents the development of viral mucosal papillomas. | |
ES2337492T3 (es) | Formulaciones y formas de uso de la vacuna capsomero de virus de papiloma. | |
ES2263405T3 (es) | Producción de proteína de capside del papilomavirus humano y partículas de tipo virus. | |
ES2301551T3 (es) | Moleculas l1 de papilomavirus humano (hpv) quimericas y usos de las mismas. | |
US8163557B2 (en) | Chimaeric human papillomavirus 16 L1 virus-like particles and a method for preparing the particles | |
ES2317910T3 (es) | Formas (fijas) estables e proteinas de capside l1 virales, proteinas de fusion y sus utilizaciones. | |
US6352696B1 (en) | Papillomavirus truncated L1 protein and fusion protein constructs | |
ES2273376T3 (es) | Formulaciones de vacunas recombinantes frente a papilomas. | |
AU683564B2 (en) | Recombinant papilloma virus L1 |