ES2197376T3 - Compuestos de 1,2-dioxetanos sustituidos solubles en agua con una estabilidad al almacenamiento mejorada, procedimientos sinteticos y productos intermedios. - Google Patents

Compuestos de 1,2-dioxetanos sustituidos solubles en agua con una estabilidad al almacenamiento mejorada, procedimientos sinteticos y productos intermedios.

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ES2197376T3 ES97949349T ES97949349T ES2197376T3 ES 2197376 T3 ES2197376 T3 ES 2197376T3 ES 97949349 T ES97949349 T ES 97949349T ES 97949349 T ES97949349 T ES 97949349T ES 2197376 T3 ES2197376 T3 ES 2197376T3
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Abstract

SE PRESENTAN 1,2-DIOXETANOS ESTABLES DE EXCITACION ENZIMATICAMENTE EXCITADA CON UNA SOLUBILIDAD EN EL AGUA Y UNA ESTABILIDAD EN EL ALMACENAMIENTO MEJORADAS ASI COMO PROCESOS SINTETICOS Y PRODUCTOS INTERMEDIOS UTILIZADOS EN SU PREPARACION. ADEMAS LOS DIOXETANOS SUSTITUIDOS CON DOS O MAS GRUPOS ADICIONALES, SOLUBILIZANTES EN EL AGUA, DISPUESTOS EN LA ESTRUCTURA DEL DIOXETANO Y UN ATOMO DE FLUOR O UN GRUPO DE ALQUILO INFERIOR ADICIONAL SUMINISTRAN UN RENDIMIENTO SUPERIOR ELIMINANDO EL PROBLEMA DEL ARRASTRE DEL REACTIVO CUANDO SE UTILIZAN EN ENSAYOS REALIZADOS EN SISTEMAS ANALITICOS QUIMICOS ENCAPSULADOS. ESTOS DIOXETANOS MUESTRAN UNA ESTABILIDAD BASICAMENTE MEJORADA DURANTE EL ALMACENAMIENTO. TAMBIEN SE SUMINISTRAN COMPOSICIONES QUE COMPRENDEN ESTOS DIOXETANOS, UN MEJORADOR SURFACTANTE CATIONICO NO POLIMERICO Y OPCIONALMENTE UN AGENTE FLUORESCENTE, PARA SUMINISTRAR UNA QUIMIOLUMINISCENCIA MEJORADA.

Description

Compuestos de 1,2-dioxetanos sustituidos solubles en agua con una estabilidad al almacenamiento mejorada, procedimientos sintéticos y productos intermedios.
(1) Campo de la invención
La presente invención se refiere en general a 1,2-dioxetanos y a composiciones que se pueden activar mediante reactivos químicos, incluyendo las enzimas, para producir quimioluminiscencia. Los dioxetanos contienen más de un grupo ionizable que forman parte de un sustituyente alcoxi. Los dioxetanos contienen además un átomo de flúor o un grupo alquil inferior sustituido por uno de los átomos de hidrógeno en el sustituyente alcoxi que mejoran la estabilidad al almacenado del dioxetano. La presente invención se refiere además, en particular, a procedimientos de síntesis de dichos dioxetanos.
Los dioxetanos que se preparan por los procedimientos de síntesis de la presente invención son útiles en composiciones que contienen el dioxetano, un tensioactivo catiónico y opcionalmente una sustancia fluorescente que aumenta la cantidad de quimioluminiscencia que se produce. Los dioxetanos y las composiciones potenciadas de la presente invención son útiles en los procedimientos para generar luz (quimioluminiscencia) y en procedimientos de análisis para detectar la presencia o la cantidad de un analito. Los grupos ionizables proporcionan, de forma importante, un dioxetano más soluble en agua y resuelven un problema de arrastre químico inesperado en sistemas de análisis químico en cápsula, mientras que la presencia del átomo de flúor o del grupo alquil inferior mejora la estabilidad al almacenado del dioxetano.
(2) Descripción de la técnica relacionada a. Dioxetanos activables enzimáticamente
Los primeros ejemplos de activación enzimática de dioxetanos se describen en una solicitud de patente U.S. (A.P Schaap, solicitud de patente U.S. serie nº 887.139) y en una serie de publicaciones (A.P Schaap, R.S. Handley y B.P. Giri, Tetrahedron Lett, 935 (1987); A.P. Schaap, M.D. Sandison y R.S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159 (1987) y A.P. Schaap, Photochem. Photobiol. 47S, 50S (1988)). Los dioxetanos adamantil sustituidos muy estables que llevan un sustituyente arilóxido protegido se activan para descomponerse con emisión de luz mediante la acción tanto de una enzima como de un tampón acuoso para dar un anión arilóxido fuertemente donante de electrones que aumenta drásticamente la velocidad de descomposición del dioxetano. Como resultado, la quimioluminiscencia se emite a intensidades de varios órdenes de magnitud sobre la resultante de la descomposición térmica lenta de la forma protegida del dioxetano. La patente U.S. nº 5.068.339 de Schaap da a conocer los dioxetanos enzimáticamente activables con grupos fluorescentes de descomposición unidos covalentemente de los que se produce aumento de quimioluminiscencia mediante transferencia de energía a la sustancia fluorescente. Las patentes U.S. nº 5.112.960 y nº 5.220.005 y una solicitud PCT (WO 88/00695) de Bronstein dan a conocer dioxetanos activables que llevan grupos adamantil sustituidos. La patente U.S. nº 4.952.707 de Edwards da a conocer dioxetanos sustituidos con fosfato. Una solicitud PCT (WO 94/26726) de Bronstein da a conocer adamantildioxetanos que llevan un grupo fenil o naftil sustituido en una posición no conjugada con un grupo OX de enzima lábil y con un grupo adicional en el anillo arilo.
Otros dioxetanos activables se dan a conocer en una solicitud PCT (WO 94/10258) de Wang. Los dioxetanos descritos por Wang contienen un grupo alcoxi que puede estar monosustituido y un grupo fenil-OX sustituido en el que uno o más grupos sin hidrógeno están presentes en el sustituyente con anillo bencénico además del grupo OX activable.
Los dioxetanos descritos en todas las publicaciones anteriores generan un compuesto de carbonilo emisor de luz que comprende un alquil éster y un ácido carboxílico aromático, típicamente el metil éster de un ácido hidroxibenzoico o hidroxinaftoico o cualquier hidroxiarilcetona.
La solicitud de patente U.S. en trámite de los solicitantes, nº de serie 08/509.305 (solicitud 305) presentada el 31 de julio de 1995, da a conocer dioxetanos disustituidos, que presentan una solubilidad en agua mejorada y se incorpora en su totalidad a la presente memoria como referencia.
b. Potenciación tensioactiva de la quimioluminiscencia procedente de dioxetanos activables
Se ha descrito la potenciación de la quimioluminiscencia procedente de la descomposición activada por enzimas de un 1,2-dioxetano estable en presencia de sustancias solubles en agua que comprenden un tensioactivo de amonio y una sustancia fluorescente (A.P. Schaap, H. Akhavan y L.J. Romano, Clin. Chem., 35(9), 1863 (1989)). Las micelas fluorescentes que están constituidas por bromuro de cetiltrimetilamonio (CTAB) y 5-(N-tetradecanoil)amino-fluoresceína capturan el dioxetano intermedio sustituido con hidroxi y conducen a un aumento de 400 veces en el rendimiento de la cantidad de quimioluminiscencia en virtud de una transferencia eficaz de energía desde la forma aniónica del éster en estado excitado al compuesto de fluoresceína en el medio hidrófobo de la micela.
Las patentes U.S. nº 4.959.182 y nº 5.004.565 de Schaap describen ejemplos adicionales de la potenciación de la luminiscencia a partir de la activación química y enzimática de dioxetanos estables en presencia de micelas formadas por el tensioactivo de amonio cuaternario CTAB. Las micelas fluorescentes aumentan asimismo la emisión de luz a partir de la descomposición activada por una base de los dioxetanos sustituidos con hidroxi-y acetoxi-.
La patente U.S. nº 5.145.772 de Voyta da a conocer la potenciación de la quimioluminiscencia producida enzimáticamente a partir de 1,2-dioxetanos en presencia de polímeros con grupos de amonio cuaternario colgantes solos o mezclados con fluoresceína. Otras sustancias descritas para potenciar la quimioluminiscencia comprenden las proteínas globulares tales como la albúmina bovina y los tensioactivos de amonio cuaternario. Otros compuestos de polímeros catiónicos fueron dudosamente eficaces como potenciadores de quimioluminiscencia; los compuestos poliméricos no iónicos fueron generalmente ineficaces y un polímero aniónico disminuyó significativamente la emisión de luz. Una solicitud PCT (documento WO 94/21821) de Bronstein describe la utilización de mezclas de potenciadores de tensioactivo polimérico de amonio cuaternario citadas anteriormente con aditivos de potenciación.
Está descrita la potenciación y la catálisis de un dioxetano no activable por piranina en presencia de CTAB (Martin Josso, Ph. D. Thesis. Wayne State University (1992), Diss. Abs. Int., Vol. 53, nº 12B. pág. 6305).
La patente U.S. nº 5.393.469 de Akhavan-Tafti da a conocer la potenciación de la quimioluminiscencia producida enzimáticamente a partir de 1,2-dioxetanos en presencia de sales de fosfonio cuaternario polimérico opcionalmente sustituidas con aceptores de energía fluorescente.
El documento EP-A-0 473 984 describe 1,2-dioxetanos quimioluminiscentes activables para su utilización en inmunoanálisis y análisis de hibridación de ADN.
La solicitud de patente europea nº 94108100.2 da a conocer la potenciación de la quimioluminiscencia producida enzimáticamente a partir de 1,2-dioxetanos en presencia de sales de fosfonio dicatiónicas. Ningún documento da a conocer la combinación de una sustancia fluorescente aniónica ni de un potenciador dicatiónico para potenciar la quimioluminiscencia a partir de un dioxetano activable. No se ha publicado ningún ejemplo de potenciación de dioxetanos sustituidos del tipo de la presente invención.
c. Dioxetanos activables con mejor solubilidad en agua
Los dioxetanos enzimáticamente activables están experimentando actualmente una utilización amplia como sustratos para enzimas marcadores en numerosas aplicaciones, que incluyen el inmunoanálisis, los estudios de expresión génica, la transferencia de Western, la transferencia de Southern, la secuenciación del ADN y la identificación de segmentos de ácido nucleico en agentes infecciosos. A pesar de la utilización creciente de estos compuestos, existen limitaciones para su utilización en algunos procedimientos analíticos. Se desean los dioxetanos activables cuyas formas desprotegidas de hidroxidioxetano son más solubles en agua. Como se muestra en las siguientes estructuras, se desea especialmente que el hidroxidioxetano formado por desfosforilación de un fosfato de dioxetano mediante la fosfatasa alcalina sea muy soluble en agua y en soluciones tamponadas y en composiciones que contienen sustancias que potencian la quimioluminiscencia. Tales dioxetanos y composiciones son de importancia en determinados procedimientos analíticos de la solución para detectar enzimas hidrolíticas o conjugados de enzimas hidrolíticas.
1
Como nuevo antecedente de la presente invención, y como se explicará con más detalle en los ejemplos siguientes, se ha observado que la utilización de reactivos de dioxetano quimioluminiscentes convencionales en análisis realizados en instrumentos automáticos basados en los principios del análisis químico en cápsula, produce arrastre de reactivo desde un segmento de fluido a otro, produciendo mediciones potencialmente inexactas, resultados erróneos e imprecisión debida a la falta de reproducibilidad. El análisis químico en cápsula se describe en la patente U.S. nº 5.399.497, que se incorpora en su totalidad como referencia en la presente memoria. Se ha pretendido que entre otros posibles medios para superar el problema del arrastre, la solubilidad en agua mejorada del hidroxidioxetano en particular, puede eliminar o minimizar el arrastre de esta reacción de luminiscencia intermedia en segmentos de fluido adyacentes de un sistema de análisis químico en cápsula.
Los compuestos de dioxetano para utilización comercial no incorporan ninguno de los grupos solubilizantes que están adjuntos al grupo alcoxi. Como tales, estos dioxetanos son inadecuados para utilizar en procedimientos de análisis que requieren arrastre cero. Se ha propuesto incorporar un grupo solubilizante en un dioxetano (patente U.S. nº 5.220.005). Se reivindica un dioxetano con un grupo carboxilo sustituido con un sustituyente de adamantilo, sin embargo, la preparación de tal dioxetano no se ha descrito. Significativamente, no se ha publicado qué efecto tiene la adición de un grupo carboxilo, si lo tiene, sobre la solubilidad y otras propiedades del dioxetano. No existe experiencia en la técnica de cuántos grupos solubilizantes son necesarios o sobre qué particular ventaja podría conferir. La utilización de grupos solubilizantes que interfieren en la separación del grupo protector que inicia la emisión de luz o que de otro modo interfieren con la producción de luz, podría ser o no válida. Los grupos solubilizantes que se separarían durante la reacción luminiscente asimismo no serían útiles.
En la solicitud de patente 305 en trámite de los solicitantes se demostró que la incorporación de un grupo solubilizante iónico fue insuficiente para eliminar el problema de arrastre asociado con el hidroxidioxetano producido por desfosforilación de un fosfato de dioxetano. Para resolver este problema se proporcionaron los fosfatos de dioxetano cuyo producto hidroxidioxetano es muy soluble en agua y se mejoraron las composiciones que contienen dichos fosfatos de dioxetano. Se descubrió posteriormente que los dioxetanos que proporcionaron la solución al problema de arrastre, presentaban insuficiente estabilidad al almacenado a temperatura ambiente. Por lo tanto, ningún dioxetano conocido en la técnica poseía tanto la gran solubilidad del hidroxidioxetano como la estabilidad al almacenado a largo plazo.
La solicitud 08/748.107 de los solicitantes dio a conocer que la sustitución de un átomo de hidrógeno en el grupo alcoxi que lleva dos grupos iónicos solubilizantes con un átomo de flúor o un grupo alquil inferior mejora la estabilidad al almacenado de estos dioxetanos. Se dieron a conocer los procedimientos de síntesis para preparar dichos dioxetanos. En la presente solicitud, se dan a conocer procedimientos no probados además de productos intermedios útiles en la presente memoria.
Objetivos
Un objetivo de la presente invención consiste en proporcionar 1,2-dioxetanos activados enzimáticamente, con estabilidad al almacenado mejorada cuyo producto hidroxidioxetano formado por la acción de una enzima activadora es muy soluble en solución acuosa. Un segundo objetivo de la presente invención consiste en proporcionar 1,2-dioxetanos sustituidos con dos o más grupos iónicos solubilizantes y un átomo de flúor o un grupo alquil inferior dispuesto en un sustituyente alcoxi de la estructura de dioxetano que proporciona una estabilidad al almacenado superior. Un objetivo adicional de la presente invención consiste en proporcionar una composición que comprende un flúor o dioxetano sustituido con un grupo alquil inferior con dos o más grupos iónicos solubilizantes en agua, un potenciador catiónico no polimérico y opcionalmente una sustancia fluorescente, para proporcionar quimioluminiscencia potenciada. Es además un objetivo de la presente invención proporcionar dioxetanos y composiciones que, cuando se utilizan en los análisis realizados en sistemas analíticos químico en cápsula, eliminan el problema del arrastre del reactivo y presentan una estabilidad al almacenado aumentada. Es todavía otro objetivo de la presente invención proporcionar un procedimiento de síntesis y los productos intermedios útiles en la presente memoria para la preparación de 1,2-dioxetanos sustituidos con dos o más grupos iónicos solubles en agua y un átomo de flúor o un grupo alquil inferior dispuesto en un sustituyente alcoxi de la estructura de dioxetano.
Sumario de la invención
Un nuevo procedimiento según la presente invención comprende la etapa de:
a) hacer reaccionar un primer compuesto de alqueno de fórmula:
2
en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales y RG es un grupo eliminable con un éster de malonato sustituido con Z, en el que Z se selecciona de entre el grupo constituido por átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y una base para producir un compuesto de alqueno sustituido con malonato de fórmula:
3
en la que R' es un grupo alquilo de 1 a 4 carbonos.
La presente invención proporciona asimismo los siguientes materiales de partida, productos intermedios y compuestos del producto nuevos:
i) un compuesto de alqueno de fórmula:
4
en la que Z se selecciona de entre átomos de halógeno y los grupos alquilo de 1 a 4 carbonos y cada R' es un grupo alquilo de 1 a 4 carbonos;
ii) un compuesto de alqueno de fórmula:
5
en la que Z se selecciona de entre el grupo constituido por átomos de halógeno y grupos alquilo de 1 a 4 carbonos, cada R' es un grupo alquilo de 1 a 4 carbonos y cada Y se selecciona de entre átomos de halógeno, grupos alcoxi, ariloxi, aralquiloxi y trialquilsililoxi sustituidos o insustituidos;
iii) un compuesto de alqueno de fórmula:
6
en la que Z se selecciona de entre átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino, un ión de amonio cuaternario o un ión fosfonio;
\newpage
iv) un compuesto de dioxetano de fórmula:
7
en la que Z se selecciona de entre átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y cada R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos;
v) un compuesto de dioxetano de fórmula:
8
en la que Z se selecciona de entre átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos, cada R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos y cada Y se selecciona de entre un átomo de Cl y un grupo 2-cianoetil;
vi) dioxetano de fórmula:
9
en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales, en la que Z es un átomo de flúor, M se selecciona de entre hidrógeno, un metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio y en la que X es un grupo protector que se puede eliminar mediante un agente activador para producir luz; y
vii) dioxetano de fórmula:
10
en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales, en la que Z es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos, M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio y en la que X es un grupo protector que se puede eliminar mediante un agente activador para producir luz;
La invención proporciona además una nueva composición para producir luz que comprende, en solución acuosa:
(a) un dioxetano estable de fórmula:
11
en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos conjuntamente para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales, en la que Z es un átomo de flúor, M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio y en la que X es un grupo protector que se puede eliminar mediante un agente activador para producir luz; y
(b) una sustancia potenciadora catiónica no polimérica que aumenta la cantidad de luz producida al reaccionar el dioxetano con dicho agente activador comparada con la cantidad que se produce en ausencia del potenciador.
La invención proporciona además una nueva composición para producir luz que comprende en solución acuosa;
(a) un dioxetano estable de fórmula:
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en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos conjuntamente para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales, en la que Z es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos, M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio y en la que X es un grupo protector que se puede eliminar mediante un agente activador para producir luz; y
(b) una sustancia potenciadora catiónica no polimérica que aumenta la cantidad de luz producida al reaccionar el dioxetano con dicho agente activador comparada con la cantidad que se produce en ausencia del potenciador.
Dibujos
La Figura 1 es un diagrama de un sistema de análisis químico en cápsula en el que se determinó que el arrastre representa un problema.
La Figura 2 es un perfil de segmentos adyacentes en el sistema de análisis químico en cápsula que muestra la luminiscencia observada atribuida al arrastre tal como se describe de forma más detallada en los Ejemplos siguientes.
La Figura 3 es un perfil adicional de segmentos adyacentes observados en los experimentos que se describen de forma más detallada en los Ejemplos siguientes y que demuestran que el arrastre no era de naturaleza óptica.
La Figura 4 es un perfil adicional de segmentos adyacentes observados en los experimentos que se describen de forma más detallada en los Ejemplos siguientes y que demuestran que el arrastre era de hecho de naturaleza química.
La Figura 5 es un gráfico que representa las velocidades relativas de descomposición a 25ºC de un dioxetano sustituido con flúor, de un dioxetano sustituido con cloro, dioxetano sustituido con metil y de un dioxetano de referencia que no contiene átomos de halógeno.
Descripción de las formas de realización preferidas
La presente invención se refiere a dioxetanos con estabilidad al almacenado mejorada y cuyo producto hidroxidioxetano formado mediante la acción de una enzima activadora es muy soluble en solución acuosa y que son activables por una enzima para producir quimioluminiscencia. Tales dioxetanos activables eliminan o minimizan el arrastre del hidroxidioxetano luminiscente en segmentos adyacentes en sistemas analíticos químicos en cápsula tal como se describe en la patente U.S. nº 5.399.497. El arrastre puede resultar de la solubilización, la deposición o la precipitación de material que emite luz de baja solubilidad en agua en el aceite de fluorocarbono que sirve como fluido aislante en los sistemas químicos en cápsula. El arrastre del reactivo puede conducir a mediciones inexactas, resultados erróneos e imprecisiones atribuibles a la irreproducibilidad.
En la solicitud de patente 305 en trámite se descubrió que el dioxetano 1 siguiente fue particularmente eficaz en la detección de la quimioluminiscencia de la fosfatasa alcalina en solución acuosa.
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Para fines de comparación, se preparó el dioxetano 2 que incorpora únicamente un grupo ionizable. Este dioxetano no eliminó el problema de arrastre descrito anteriormente.
La utilización del dioxetano 1 en el sistema de prueba descrito en la patente U.S. nº 5.399.497 condujo a la eliminación completa del problema de arrastre. Sin embargo, posteriormente se descubrió de forma inesperada, que las soluciones de dioxetano 1 en tampón acuoso presentaban una estabilidad al almacenado insatisfactoria. Las soluciones que contienen 1 en tampón alcalino presentaban una descomposición significativa después del almacenado a 25ºC durante dos semanas. De hecho, se observó que el dioxetano 1 era significativamente menos estable que un compuesto relacionado, Lumigen PPD, mostrado a continuación que no tiene grupos solubilizantes iónicos en el grupo alcoxi.
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Hasta donde los solicitantes conocen, no existe ninguna instrucción en la técnica de la química de los dioxetanos de la causa de la menor estabilidad de 1. Los medios para modificar estructuralmente 1 para mejorar su estabilidad al almacenado mientras se preservan sus demás propiedades beneficiosas, se dieron a conocer en la solicitud de patente en trámite de los solicitantes, serie nº 08/748.107 que está incorporada en su totalidad en la presente memoria como referencia.
Definiciones
La estabilidad al almacenado se refiere a la velocidad de descomposición del dioxetano debida a la reacción espontánea y es una propiedad intrínseca. La descomposición de dioxetanos activables se puede también provocar por la presencia de pequeñas cantidades de agentes que catalizan la eliminación del grupo protector e inician de este modo la descomposición. La estabilidad al almacenado de un dioxetano se puede evaluar midiendo a intervalos periódicos la cantidad de dioxetano presente en una muestra conocida. La medición puede tomar cualquier forma conocida que mida una propiedad relacionada con la cantidad de dioxetano. Son ejemplos las técnicas tales como la espectrofotometría, o la espectrometría de RMN. Un medio práctico consiste en medir la cantidad de luz producida al reaccionar una cantidad conocida de dioxetano con un agente activador bajo una serie de condiciones normales. Una disminución de la cantidad o intensidad de la luz emitida indica una pérdida de compuesto dioxetano.
La estabilidad al almacenado se refiere a la estabilidad del dioxetano tanto en forma pura y en solución como a la formulación en una solución tampón. La formulación puede contener asimismo varios aditivos para aumentar la cantidad de luz emitida o para mejorar la actividad de un agente de activación enzimático. Es deseable que el dioxetano en una formulación no experimente una descomposición importante a temperatura ambiente durante un periodo de tiempo razonable. Las composiciones que se han de utilizar con analizadores automáticos deberían ser convenientemente estables durante por lo menos 1 semana. En la refrigeración de 0 a 5ºC, es conveniente que no se observe ninguna descomposición significativa durante por lo menos 2 a 3 meses. De forma más conveniente, las composiciones que se han de utilizar en analizadores automáticos no deberían presentar más del 2 al 3% de cambio en el indicador de la estabilidad al almacenado observado en aproximadamente 2 a 4 semanas.
La solución al problema de la estabilidad al almacenado se descubrió en los dioxetanos de fórmula I:
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en la que Z se selecciona de entre el grupo constituido por un átomo de flúor y un grupo alquil de 1 a 4 carbonos y M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio, en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que proporcionan estabilidad al dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales seleccionados de entre grupos de halógenos, alquil, alquil sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, carbonil, carboxil, amino y alquilamino y en la que X es un grupo protector que se puede eliminar mediante un agente activador para formar un dioxetano sustituido con un oxianión que se descompone y produce luz y dos compuestos que contienen carbonil, uno de los cuales es un compuesto del éster sustituido con un oxianión que contiene dos grupos carboxilato, tal como se muestra a continuación.
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Cuando M es H se reconoce que el respectivo compuesto de dioxetano se utilizará con preferencia únicamente en condiciones de pH en las que los grupos funcionales del ácido carboxílico estén ionizados, es decir, pH \geq aproximadamente 7. Preferentemente, M es un ión metálico alcalino, más preferentemente un ión de sodio.
Los grupos R_{3} y R_{4} en otra forma de realización se combinan en un grupo R_{5} cíclico o alquilpolicíclico que está espirofusionado al anillo de dioxetano, que contiene de 6 a 30 átomos de carbono que proporciona estabilidad térmica y que pueden incluir sustituyentes adicionales sin hidrógeno.
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El grupo R_{5} es más preferentemente un grupo policíclico, con preferencia un grupo adamantil o un grupo adamantil sustituido con uno o más grupos R_{6} sustituyentes seleccionados de entre los grupos de halógenos, alquil, alquil sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, carbonil, carboxil, fenil, fenil sustituido, amino y alquilamino unidos covalentemente a éste.
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En otra forma de realización preferida el grupo R_{2} es un grupo fenil o naftil. Se prefiere especialmente que R_{2} sea un grupo fenil en el que el grupo OX está orientado en meta con respecto al grupo del anillo de dioxetano como se muestra a continuación. El anillo de fenil puede contener sustituyentes R_{7} con anillo adicional seleccionados independientemente de entre grupos de halógenos, alquil, alquil sustituido, alcoxi, alcoxi sustituido, carbonil, carboxil, amino y alquilamino. Algunos ejemplos de estructuras incluyen a título de ilustración:
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Compuestos de las dos últimas fórmulas estructurales en las que R_{6} es H ó Cl y R_{7} es Cl como se muestra a continuación, se reconocen como compuestos adicionales preferidos.
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La naturaleza del grupo OX está dictada por el agente de activación utilizado en el análisis para el que se ha de utilizar y se puede seleccionar de entre hidroxilo, O^{-}M^{+} en el que M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio, OOCR_{8}, en el que R_{8} se selecciona de entre el grupo constituido por grupos alquil y aril que contienen de 1 a 8 átomos de carbono y opcionalmente que contienen heteroátomos, sal de OPO_{3}^{-2}, sal de OSO_{3}^{-}, grupos \beta-D-galactosidoxi y \beta-D-glucuronidiloxi. El grupo OX es preferentemente un grupo salino OPO_{3} ^{-2}.
Dioxetanos de la presente invención de fórmula:
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en la que R_{2}, R_{3}, R_{4}, M y Z descritos anteriormente, se pueden preparar utilizando los procedimientos descritos en la solicitud de patente en trámite de los solicitantes nº 08/748.107 y otros procedimientos conocidos en la técnica de la química de los dioxetanos. Por ejemplo, una cetona y un éster que tiene las fórmulas siguientes, en las que RG es un átomo o un grupo sustituible y X' es un átomo o un grupo sustituible tal como un hidrógeno o un grupo alquil o un grupo trialquilsilil que puede estar acoplado mediante un reactivo de titanio con valencia baja para formar un vinil éter intermedio. Los grupos eliminables incluyen los grupos salientes tales como los átomos de halógeno seleccionados de entre Cl, Br e I, sulfatos, sulfonatos tales como tosilato, mesilato y triflato, grupos de amonio cuaternario y azida.
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El vinil éter intermedio se convierte en un procedimiento de una o más etapas en un precursor de la sal fosfato del vinil éter. Se puede desear por conveniencia de síntesis sustituir un grupo eliminable por otro grupo eliminable. El grupo RG se sustituye por un fragmento CZ(COOM)_{2} por reacción con un éster de malonato sustituido con Z y posterior saponificación de los grupos éster. El grupo X' se transforma en el grupo X, en caso de que X y X' no sean idénticos, eliminando X' y haciéndole reaccionar con un reactivo que añade el grupo X o una forma protegida del grupo X. Por ejemplo, cuando X' es H y X es PO_{3}Na_{2}, el tratamiento con la base para desprotonizar seguido de la reacción con un agente de fosforilación produce un vinil éter protegido por fosfato triéster que se transforma en la sal fosfato por hidrólisis del triéster en la sal disódica. En este procedimiento multietapa, pueden tener lugar dos o más operaciones en la misma etapa del procedimiento, por ejemplo, se puede efectuar en la misma etapa la hidrólisis de los ésteres carboxílicos y de los ésteres de fosfato.
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El precursor sal fosfato de vinil éter se transforma directamente en dioxetano mediante conocidas reacciones que incluyen, por ejemplo, la adición de un oxígeno con singlete generado por sensibilización del colorante.
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Cada uno de estos procedimientos está ejemplificado a título de ilustración en los ejemplos específicos siguientes. En particular, el Esquema 1 describe esquemáticamente una vía de síntesis utilizada para preparar los dioxetanos 3 a 5 según las etapas descritas anteriormente como se describe e incorpora en la solicitud nº 748.107 mencionada anteriormente.
Esquema 1
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Una forma de realización preferida de la presente invención se refiere a un procedimiento para preparar un compuesto de sal de dioxetano de fórmula IV:
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que presenta estabilidad al almacenado aumentada en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos conjuntamente para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales, en la que Z se selecciona de entre el grupo constituido por átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio que se puede preparar por un procedimiento mejorado, que comprende las etapas de:
a) hacer reaccionar un primer compuesto de alqueno de fórmula:
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en la que RG es un grupo eliminable con un malonato éster sustituido con Z y una base para producir un compuesto de alqueno sustituido con malonato de fórmula:
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en la que R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos;
b) hacer reaccionar el alqueno sustituido con malonato con un reactivo de fosforilación con la fórmula WP(O)Y_{2}, en la que W e Y se selecciona cada uno de entre átomos de halógeno para formar un compuesto de dioxetano fosforilado de fórmula:
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c) hacer reaccionar el compuesto de alqueno fosforilado con un compuesto hidroxilo de fórmula Y'-OH, en la que Y' se selecciona de entre grupos alquil sustituidos o insustituidos para formar un segundo compuesto de alqueno fosforilado de fórmula:
30
y
d) hidrolizar el segundo compuesto de alqueno fosforilado en un disolvente acuoso con una base de fórmula M-Q, en la que Q es un anión básico para formar un compuesto de sal de alqueno de fórmula:
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y
e) fotooxidar el compuesto de la sal de alqueno irradiando un sensibilizador en presencia de oxígeno y del compuesto de la sal de alqueno en solución acuosa para formar el compuesto de la sal de dioxetano.
Se prefiere mejor utilizar este procedimiento para preparar un dioxetano en el que R_{3} y R_{4} estén combinados para formar un grupo R_{5} con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano y el compuesto de la sal de dioxetano tiene la fórmula:
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En otros procedimientos preferidos, el grupo R_{2} es un grupo meta-fenil, Z es un halógeno o un grupo alquil con 1 a 4 átomos de carbono, mas preferentemente Z es F ó CH_{3} y M es un ión metálico alcalino, más preferentemente M es Na.
Se ha descubierto ahora que los compuestos de fórmula IV
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que presentan estabilidad al almacenado aumentada, en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos conjuntamente para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales, en la que Z se selecciona de entre el grupo constituido por átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio que se puede preparar ventajosamente por un procedimiento mejorado, que comprende las etapas de:
a) hacer reaccionar un primer compuesto de alqueno de fórmula:
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en la que RG es un grupo eliminable con un malonato éster sustituido con Z y una base para producir un compuesto de alqueno sustituido con malonato de fórmula:
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en la que R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos;
b) fotooxidar el compuesto de alqueno sustituido con malonato irradiando un sensibilizador en presencia de oxígeno y del compuesto de alqueno sustituido con malonato para formar un dioxetano sustituido con malonato de fórmula:
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c) hacer reaccionar el dioxetano sustituido con malonato con un reactivo de fosforilación de fórmula WP(O)Y_{2}, en la que W se selecciona de entre halógenos e Y se selecciona de entre átomos de halógeno, grupos alcoxi, ariloxi, aralquiloxi y trialquilsililoxi sustituidos o insustituidos para formar un compuesto de dioxetano fosforilado de fórmula:
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y
d) hidrolizar el dioxetano fosforilado en un disolvente acuoso con una base de fórmula M-Q, en la que Q es un anión básico para formar un compuesto de la sal de dioxetano.
Se prefiere mejor que este procedimiento se utilice para preparar un dioxetano en el que R_{3} y R_{4} se combinan conjuntamente para formar un grupo R_{5} con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano y que puede contener sustituyentes adicionales y el compuesto de sal de dioxetano tiene la fórmula:
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En otras formas de realización preferidas, el procedimiento se utiliza para preparar un dioxetano en el que el grupo R_{2} es un grupo meta-fenil que puede contener sustituyentes adicionales, Z es un halógeno o un grupo alquil con 1 a 4 átomos de carbono, más preferentemente Z es F ó CH_{3} y M es un ión metálico alcalino, más preferentemente M es Na.
La etapa de hacer reaccionar el primer compuesto de alqueno con el éster del fosfato sustituido con Z, CHZ(COOR')_{2} y una base para producir un compuesto de alqueno sustituido con malonato, se realiza generalmente en un disolvente aprótico polar tal como DMSO, DMF, N,N-dimetilacetamida, N-metilpirrolidona utilizando una base poco nucleófila, preferentemente hidruro de sodio o de potasio. La reacción se realiza preferentemente a temperatura elevada para disminuir el tiempo de reacción, generalmente entre 50 y 150ºC, más frecuentemente entre 80 y 120ºC. Los grupos eliminables comprenden los grupos salientes tales como los átomos de halógeno seleccionados de entre Cl, Br y I, sulfatos, sulfonatos tales como tosilato, mesilato y triflato, grupos de amonio cuaternario y azida.
En el procedimiento mejorado descrito en la presente memoria, la etapa de fotooxigenación se realiza en el producto intermedio alqueno sustituido con malonato en lugar de fotooxigenar un alqueno fosfato como etapa final del procedimiento en conjunto, tal como se describe en la solicitud nº 748.107. En esta etapa, el compuesto de alqueno sustituido con malonato que lleva un grupo fenol se disuelve en un disolvente orgánico y se irradia en presencia de un sensibilizador y oxígeno para formar un dioxetano sustituido con malonato. La irradiación de un sensibilizador y oxígeno con luz, generalmente luz visible, genera oxígeno con singlete que reacciona con el doble enlace de tipo vinil éter del alqueno sustituido con malonato. El sensibilizador se puede disolver en un disolvente o, preferentemente, inmovilizar sobre una partícula polimérica, como es sabido generalmente en la materia. Los sensibilizadores útiles para generar oxígeno con singlete comprenden, sin limitación, Rosa de Bengala, azul de metileno, eosina, tetrafenilporfirina (TPP), complejos metálicos de TPP, especialmente de cinc y manganeso y C_{60}. Los disolventes orgánicos preferidos comprenden halocarburos tales como CH_{2}Cl_{2}, CHCl_{3} y CCl_{4}, halocarburos deuterados, cetonas de bajo peso molecular y sus análogos deuterados, hidrocarburos alifáticos y aromáticos y sus análogos deuterados. El más preferido es CH_{2}Cl_{2}. Llevar a cabo la fotooxigenación en un disolvente orgánico proporciona, de manera ventajosa, un medio de reacción en el que se minimiza el periodo de vida del oxígeno con singlete. Esto presenta el efecto de tiempos de reacción que disminuyen de forma significativa y que permiten la fotooxigenación al proceder más fácilmente a la terminación. También se facilita el aislamiento del producto, necesitando únicamente en la mayoría de los casos una simple filtración del sensibilizador y la evaporación del disolvente.
La etapa de hacer reaccionar el dioxetano sustituido con malonato con un reactivo de fosforilación de fórmula WP(O)Y_{2}, en el que W se selecciona de ente halógenos e Y se selecciona de entre átomos de halógenos, grupos alcoxi sustituidos e insustituidos y grupos trialquilsililoxi para formar un compuesto de dioxetano fosforilado se realiza en un disolvente orgánico, preferentemente un halocarburo tal como CH_{2}Cl_{2} ó CHCl_{3} ó un éter tal como el dietil éter o tetrahidrofurano (THF) en presencia de una base de amina. Las bases de amina útiles incluyen, sin limitación, piridina y trietilamina. Cuando Y es un grupo alcoxi sustituido o insustituido, un grupo ariloxi, aralquiloxi o trialquilsililoxi, los grupos Y representativos incluyen, a título de ejemplo, alcoxi tal como OCH_{3}, u OCH_{2}CH_{3}, alcoxi sustituido tal como cianoetoxi (OCH_{2}CH_{2}CN) o trimetilsililetoxi (OCH_{2}CH_{2}Si(CH_{3})_{3}), fenoxi, fenoxi sustituido, benciloxi, trimetilsililoxi y otros tal como son conocidos generalmente por expertos químicos orgánicos. Los dos grupos Y se pueden también combinar conjuntamente como un sólo grupo tal como etilendioxi como sucede en el reactivo
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Los grupos Y preferidos son los grupos cianoetoxi. En una forma de realización preferida, Y es un halógeno, preferentemente Y y W son ambos Cl.
La etapa de fosforilación se lleva a cabo en solución a una temperatura comprendida en el intervalo entre aproximadamente-78ºC y aproximadamente 25ºC. Es particularmente conveniente una temperatura de aproximadamente 0 a 5ºC. El agente de fosforilación WP(O)Y_{2} se añade de manera controlada con el fin de no dar lugar a que se caliente la solución de la reacción. El reactivo de fosforilación está acompañado preferentemente por una base de amina durante la adición, preferentemente piridina.
La hidrólisis o etapa de desprotección se realiza hidrolizando el dioxetano fosforilado en un disolvente acuoso con una base de fórmula M-Q, en la que Q es un anión básico en una cantidad suficiente para producir la separación de los grupos protectores Y y R' para formar el compuesto de la sal de dioxetano. El disolvente puede comprender agua, un tampón acuoso o una mezcla de agua y uno o más disolventes orgánicos. Los disolventes orgánicos preferidos son los disolventes miscibles en agua tal como metanol, etanol, acetona y THF. Típicamente se necesitan cuatro equivalentes de la base, sin embargo por comodidad, se puede emplear un exceso. La separación de los grupos protectores se puede realizar secuencial o simultáneamente. Dependiendo de los grupos concretos Y y R' y de la base puede o no puede ser posible aislar parcialmente los productos intermedios hidrolizados.
La elección del agente desprotector básico se determinará, en parte, por la naturaleza de los grupos Y y R' que se han de separar. El agente desprotector puede también no producir la reacciones secundarias no deseadas tal como la hidrólisis del grupo vinil éter en el procedimiento en el que se prepara la sal fosfato del vinil éter en primer lugar o la descomposición del grupo con anillo de dioxetano en el procedimiento en el que se prepara el dioxetano protegido. Los agentes desprotectores preferidos comprenden bases orgánicas e inorgánicas tales como el hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, carbonato de potasio, metóxido de sodio, etóxido de sodio, t-butóxido de potasio, amoniaco o hidróxido de amonio. Otros agentes desprotectores preferidos incluyen los agentes nucleófilos tales como el ión cianuro y el ión fluoruro.
En otra forma de realización, la etapa de hacer reaccionar el compuesto de dioxetano sustituido con malonato con el reactivo de fosforilación comprende las etapas de:
a) hacer reaccionar el compuesto de dioxetano sustituido con malonato con el reactivo de fosforilación de fórmula WP(O)Y'_{2}, en el que W e Y' son cada uno átomos de halógeno para formar un compuesto de fosforil haluro dioxetano de fórmula
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y
b) hacer reaccionar el compuesto de fosforil haluro dioxetano con un compuesto de hidroxilo de fórmula Y-OH, en el que Y se selecciona de entre grupos alquil sustituidos o insustituidos para formar el compuesto de dioxetano fosforilado.
El compuesto de fosforil haluro dioxetano se transforma en el compuesto de dioxetano fosforilado mediante la reacción con, por lo menos, dos equivalentes de un compuesto de hidroxilo Y-OH y preferentemente en exceso. Ejemplos de compuestos que pueden servir como compuesto de hidroxilo Y-OH comprenden, sin limitación, los alcoholes inferiores tales como metanol y etanol, alcoholes inferiores sustituidos tales como 3-hidroxipropionitrilo (HOCH_{2}CH_{2}CN) y 2-trimetilsililetanol, fenol, fenoles sustituidos, alcohol bencílico y otros como se conoce generalmente.
En otro aspecto, la presente invención se refiere a productos intermedios sintéticos utilizados en el procedimiento para preparar los presentes dioxetanos. En particular, son útiles los nuevos compuestos intermedios de alqueno siguientes.
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Además los nuevos compuestos de dioxetano siguientes son útiles como productos intermedios en le preparación de los presentes compuestos de dioxetano.
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En el Esquema 2 se muestra un ejemplo de síntesis de un dioxetano de la presente invención por este procedimiento mejorado.
Esquema 2
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La materia prima (alqueno precursor) en los procedimientos sintéticos descritos anteriormente de fórmula:
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en la que RG es un grupo eliminable que se puede preparar por los procedimientos conocidos en la materia. En un procedimiento, la función vinil éter se prepara por acoplamiento mediado por Ti como una cetona R_{3}R_{4}C=O y un éster HOR_{2}COOCH_{2}CH_{2}-G tal como se describe en las patentes U.S. nº 4.983.779 y nº 4.982.192, en la que G es un grupo que puede ser idéntico a RG o puede ser un grupo que se puede sustituir por RG o transformar en RG. Un procedimiento sintético ejemplar en el que RG es un átomo de yodo y G es un átomo de cloro se presenta a continuación en la presente memoria. Se reconoce además que por comodidad, el componente éster de la reacción de acoplamiento se puede utilizar en forma protegida en la que el grupo hidroxilo está presente en forma enmascarada tal como un silil éter o un alquil éter. Después de la reacción de acoplamiento, el grupo hidroxilo libre se libera a continuación utilizando medios de síntesis normales.
Los solicitantes han descubierto además que estos alquenos precursores se puede preparar también por un nuevo procedimiento, no publicado anteriormente, para la preparación de este tipo de vinil éter. Aunque el procedimiento anterior mediado por Ti necesita la preparación de compuestos de éster individuales que llevan el grupo G ó RG, lo que añade complejidad y coste adicionales, el nuevo procedimiento utiliza un producto intermedio corriente de vinil éter que se puede preparar a partir de materiales de partida disponibles.
A continuación se describe un ejemplo de reacción para preparar el alqueno precursor por el nuevo procedimiento. Un compuesto de alquil inferior vinil éter, en el que el alquil inferior, R_{9}, indica aquí un grupo alquil C_{1}-C_{4} lineal o ramificado, se hace reaccionar con una cantidad catalítica de una sal de mercurio en presencia de, por lo menos, un mol equivalente de otro alcohol R_{10}-OH, p. ej. que tenga la fórmula HOCH_{2}CH_{2}G, para producir el alqueno precursor deseado.
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Es conocida la conversión de vinil éteres insustituidos de fórmula CH_{2}=CHOR_{a} en otros éteres insustituidos de fórmula CH_{2}=CHOR_{b} y está descrita, p. ej. en W.H. Watanabe y L.E. Conlon, J. Am. Chem. Soc. 79, 2828 (1957), la preparación mediante una reacción catalizada por la sal de mercurio de alquenos trisustituidos utilizada en los presentes procedimientos no ha sido descrita según la mejor información de los solicitantes.
En este procedimiento de reacción, R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos conjuntamente para formar un grupo R_{5} con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales. Un ejemplo de la utilización de esta reacción catalizada por mercurio para la preparación de un precursor de alqueno a un dioxetano de la invención es
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en la que G es un átomo de cloro. La sal de mercurio es cualquier sal Hg (II) cuyos grupos funcionales catalicen los grupos vinil éter y es preferentemente una sal de un ácido débil tales como acetato o trifluoracetato. La sal de mercurio se utiliza en cantidad catalítica, típicamente comprendida entre 0,01 a 0,5 moles por mol de alqueno, más típicamente comprendida entre 0,05 y 0,25. El componente alcohólico R_{10}-OH puede ser cualquier alcanol, alcanol sustituido, alcohol bencílico, alcohol insaturado, tal como alcohol alílico. El alcohol se utiliza en exceso, por lo menos dos moles por mol de alqueno y preferentemente 5 moles por mol de alqueno. En un procedimiento preferido, el alcohol se utiliza como disolvente de la reacción. La reacción se realiza típica, pero no necesariamente, aproximadamente a temperatura ambiente hasta el punto de ebullición del disolvente. Las temperaturas de reacción preferidas están comprendidas en el intervalo entre aproximadamente 70 y 120ºC. Se pueden utilizar disolventes adicionales con objeto de mejorar la solubilidad de los reactivos o de alterar la polaridad o el punto de ebullición.
Se reconoce que aunque la reacción de intercambio de vinil éter catalizada por mercurio descrita anteriormente encontrará una utilización particular en la preparación de productos intermedios utilizados para la elaboración adicional del dioxetano trisustituido soluble en agua de la presente invención, es más aplicable generalmente en la preparación de una amplia variedad de compuestos de alqueno o de vinil éter.
Formas de realización específicas
Se han preparado un análogo de dioxetano 1 sustituido con flúor, identificado como 3, un análogo sustituido con cloro 4 y un análogo sustituido con metil 5 y se ha evaluado su estabilidad al almacenado a lo largo de varias semanas. Se midió la estabilidad al almacenado de una solución de 1 para comparación. Todas las soluciones se prepararon con la misma composición, diferenciándose únicamente en la identidad del dioxetano. Se evaluó la estabilidad mediante el análisis con enzima quimioluminiscente con un volumen fijo de solución de prueba, se fijó una cantidad limitativa de fosfatasa alcalina y se midió la intensidad de la luz en la meseta a 25ºC. De forma inesperada, las soluciones acuosas que contienen los dioxetanos 3 y 5 eran sustancialmente más estables que 1, mientras que el dioxetano 4 no lo era. Las soluciones de los dioxetanos 3 ó 5 no experimentaron descomposición después de cuatro semanas a 25ºC. Sorprendentemente, la estabilidad al almacenado del dioxetano 4 fue realmente peor que la de 1.
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Las razones de esta diferencia en las propiedades de estos cuatro dioxetanos no se comprenden actualmente. Es particularmente significativo que los dioxetanos 3 y 4 mostrasen dichas diferencias marcadas en la estabilidad al almacenado cuando se diferencian estructuralmente sólo en que tienen diferentes sustituyentes de halógeno. Los solicitantes no disponen de ninguna conocimiento en la técnica de la química de los dioxetanos para explicar estos resultados predichos.
Además, las pruebas en el dioxetano 3, demostraron que, como en el dioxetano 1, no se produjo arrastre en el sistema de análisis químico en cápsula. Los dioxetanos tales como 3 y 5 que llevan un sustituyente que contiene dos grupos carboxilato y un átomo de flúor o un grupo alquil inferior y las composiciones que contienen dichos dioxetanos son por lo tanto superiores a otros dioxetanos y composiciones conocidas para su utilización en sistemas de análisis químicos en cápsula.
En otro aspecto de la invención, se proporcionan composiciones que aportan aumento de quimioluminiscencia. Las composiciones potenciadas presentan ventajas en los análisis que requieren la máxima sensibilidad analítica. Aumentando la eficacia de quimioluminiscencia de la reacción de descomposición del dioxetano mientras se mantiene o se reduce la emisión de luz extraña procedente de la descomposición espontánea del dioxetano es una manera en que se puede aumentar o mejorar la sensibilidad.
La presente invención, por lo tanto, se refiere asimismo a composiciones que comprenden un potenciador catiónico y un 1,2-dioxetano estable tal como se describió anteriormente con estabilidad al almacenado aumentada que puede ser activado para generar quimioluminiscencia. Dichas composiciones para proporcionar aumento de quimioluminiscencia comprenden un dioxetano, tal como el que se describió anteriormente, en una solución acuosa y una sustancia potenciadora catiónica no polimérica que aumenta la cantidad de luz producida al hacer reaccionar el dioxetano con el agente activador, comparada con la cantidad que se produce en ausencia del potenciador. Es preferible que la sustancia potenciadora sea un tensioactivo dicatiónico de fórmula:
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en la que cada A se selecciona independientemente de entre átomos de P y N y en la que el enlace es un grupo de enlace orgánico que contiene por lo menos dos átomos de carbono seleccionados de entre el grupo compuesto por grupos aril, alquil, alquenil y alquinil sustituidos y insustituidos y en la que el enlace puede contener heteroátomos y en la que R se selecciona de entre alquil o aralquil inferiores que contienen de 1 a 20 átomos de carbono y en la que Y es un anión. Se prefiere especialmente que la sustancia potenciadora sea un tensioactivo dicatiónico de fórmula:
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y en la que el enlace es fenileno.
Las composiciones de la presente invención para proporcionar aumento de quimioluminiscencia pueden contener opcionalmente por lo menos una sustancia fluorescente tal como un potenciador complementario. Las sustancias fluorescentes útiles son los compuestos que son capaces de aumentar la cantidad de luz producida mediante transferencia de energía. Las sustancias fluorescentes aniónicas son especialmente eficaces se cree que debido a interacciones electrostáticas favorables con el potenciador catiónico. Las sustancias fluorescentes particularmente preferidas son los compuestos aniónicos e incluyen, sin limitación, la piranina y la fluoresceina.
Para describir más completamente los diversos aspectos de la presente invención, se presentan los siguientes ejemplos no limitativos que describen las formas de realización particulares con objeto de ilustrar la invención.
Ejemplos Ejemplo 1 Preparación de dioxetano 1
Se preparó la sal tetrasódica de dioxetano [4-(3,3-biscarboxi)propoxi)-4-(3-fosforiloxifenil)]espiro[1,2-dioxetano-3,2'-triciclo-[3,3,1,1^{3,7}]decano], mediante la secuencia de reacciones descrita en la patente U.S. nº 5.631.167 de los solicitantes. La síntesis hasta el alqueno intermedio [(3-hidroxifenil)-(2-yodoetoxi)metilen]triciclo- [3.3.1.1^{3.7}]decano se llevó a cabo fundamentalmente tal como se describe en las patentes U.S. nº 5.013.827 y nº 5.068.339.
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Ejemplo 2 Preparación de dioxetano 2
El dioxetano [4-(3-carboxipropoxi)-4-(3-fosforiloxifenil)]espiro[1,2-dioxetano-3,2'-triciclo-[3,3,1,1^{3,7}]decano] (2) se preparó mediante la secuencia de reacciones descrita en la patente U.S. nº 5.631.167 de los solicitantes. La síntesis hasta el alqueno intermedio [(3-carboxipropoxi)-(3-(hidroxifenil)metilen]-triciclo [3.3.1.1^{3,7}]decano se llevó a cabo fundamentalmente tal como se describe en las patentes U.S. nº 5.013.827 y nº 5.068.339.
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Ejemplo 3 Preparación de dioxetano 3
Este dioxetano se preparó mediante la secuencia de reacciones descrita a continuación. La síntesis hasta el alqueno intermedio [(3-hidroxifenil)-(2-yodoetoxi)metilen]-triciclo [3.3.1.1^{3,7}]decano se llevó a cabo tal como se describe en el Ejemplo 1.
52
(a) Síntesis de [((3,3-biscarboetoxi)-3-fluorpropoxi)-(3-hidroxifenil)metilentriciclo [3,3,1,1^{3,7}]decano
Se lavó el hidruro de sodio (75 mg de una dispersión al 60% en aceite) exento de aceite con hexano, se secó al vacío y se añadió a 4 ml de DMSO anhidro. Se añadió fluormalonato de dietilo (0,3 g) y se agitó la suspensión en Ar durante 15 min. Se añadió a la mezcla de reacción una solución de yodoetoxi alqueno (0,5 g) en 5 ml de DMSO anhidro. Se calentó la reacción a 100ºC y se agitó durante 2 h. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con 30 ml de acetato de etilo. La solución de acetato de etilo se extrajo 3 a 4 veces con agua, se secó y se evaporó. El material en bruto se cromatografió utilizando acetato de etilo del 5 al 20% en hexano. Se obtuvo el compuesto deseado (0,25 g) con un rendimiento del 45%: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,28 (t, 6H), 1,66-1,95 (m, 12H), 2,45 (t, 1H), 2,52 (t, 1H), 2,67 (br s, 1H), 3,20 (br s, 1H), 3,52 (t, 2H), 4,23-4,30 (q, 4H), 6,74-7,22 (m, 4H).
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(b) Síntesis de [((3,3-biscarboetoxi)-3-fluorpropoxi)-(3-(bis-(2-cianoetil)fosforiloxi)-fenil)metilen] triciclo-[3,3,1,1^{3,7}]decano
Se enfrió en un baño con hielo un matraz que contenía 10 ml de CH_{2}Cl_{2} bajo una capa de argón. Se añadió piridina (1,71 ml) seguido de una adición lenta de POCl_{3} (0,61 ml) y se continuó agitando durante 15 min. se añadió gota a gota una solución del alqueno (0,972 g) de la etapa (a) en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se retiró del baño de hielo y se agitó la solución durante 2,5 h. A esta solución se añadió 1,71 ml de piridina y 1,44 ml de 2-cianoetanol. Se agitó la mezcla de reacción durante 12 a 15 h dando como resultado la formación de un precipitado blanco. La mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con 4 \times 50 ml de agua. Se secó el extracto de CH_{2}Cl_{2} y se evaporó. El producto en bruto se purificó por cromatografía utilizando acetato de etilo al 75% en hexano. Se obtuvo un total de 1,2 g de un aceite (88%): ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,29 (s, 6H), 1,79-1,97 (m, 12H), 2,46-2,53 (2t, 2H), 2,63 (br s, 1H), 2,83 (t, 4H), 3,20 (br s, 1H), 3,50 (t, 2H), 4,24-4,31 (q, 4H), 4,35-4,51 (m, 4H), 7,13-7,36 (m, 4H); ^{31}P RMN (CDCl_{3}) \delta-9,49 (p).
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(c) Síntesis de la sal tetrasódica de [(3,3-biscarboxi-3-fluorpropoxi)- (3-fosforiloxifenil)metilen] triciclo[3,3,1,1^{3,7}]-decano
Se disolvió el alqueno (1,2 g) de la etapa (b) en 20 ml de acetona. Se añadió una solución de 297 mg de hidróxido de sodio en 4 ml de agua. Se agitó la solución toda la noche durante cuyo tiempo se formó un precipitado. Se decantó el líquido y se lavó el sólido con 10 \times 5 ml de acetona. Después de secar al vacío, se obtuvo un sólido blanco (1,0 g): ^{1}H RMN (D_{2}O) \delta 1,75-1,89 (m, 12H), 2,29 (t, 2H), 2,37 (t, 2H), 2,57 (br s, 1H), 3,12 (br s, 1H), 3,56 (t, 2H), 6,99-7,30 (m, 4H); ^{31}P RMN (D_{2}O) \delta 0,69 (s).
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(d) Síntesis de la sal tetrasódica de [4-(3,3-biscarboxi)-3-fluorpropoxi)-4-(3-fosforiloxifenil)] espiro[1,2-dioxetano-3,2'-triciclo[3,3,1,1^{3,7}]decano (3).
Se disolvió el alqueno (348,6 mg) de la etapa (c) en 10 ml de D_{2}O. Se puso en suspensión Rosa de Bengala unido al polímero (500 mg) en 10 ml de p-dioxano y se añadió a la solución acuosa. La mezcla de reacción se enfrió entre 5 y 8ºC, se inició un barboteo con oxígeno y se irradió la mezcla con una lámpara de sodio a través de un filtro KAPTON de 5 mil. Después de un total de 2,5 h, se filtraron los granos de polímero y se evaporó a sequedad la solución produciendo un sólido blanco (3). ^{1}H RMN (D_{2}O) \delta 0,93-1,79 (m, 12H), 2,19 (br s, 1H), 2,41-2,49 (m, 2H), 2,97 (br s, 1H), 3,40-3,49 (m, 2H), 7,19-7,42 (m, 4H); ^{31}P RMN (D_{2}O) \delta 0,575 (s).
Ejemplo 4 Preparación de dioxetano 4
Este dioxetano se preparó mediante la secuencia de reacciones descrita a continuación. La síntesis hasta el alqueno intermedio [(3-hidroxifenil)-(3,3-biscarboetoxi)propoximetilen]triciclo[3.3.1.1^{3,7}]decano se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.
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(a) Síntesis de [((3,3-biscarboetoxi)-3-cloropropoxi)-(3-hidroxifenil)metilentriciclo [3,3,1,1^{3,7}]decano
Se añadió una solución de (3,3-biscarboetoxipropoxi)- (3-hidroxifenil)metilentriciclo[3,3,1,1^{3,7}]decano (1,2 g) en 10 ml de THF anhidro a 2,4 eq. de LDA en 25 a 30 ml de THF anhidro a-78ºC bajo argón. La reacción se agitó durante 30 min a-78ºC y se trató con una solución de N-clorosuccinimida (0,58 g) en 15 ml de THF anhidro. Se dejó calentar la reacción a temperatura ambiente durante una hora y se agitó durante una hora adicional. Se eliminó el THF al vacío y se disolvió el residuo en 100 ml en acetato de etilo. La solución orgánica se lavó con agua, se secó y se evaporó. El material en bruto se separó por cromatografía en columna. ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,23 (t, 6H), 1,7-2,00 (m, 12H), 2,57 (t, 2H), 2,65 (br s, 1H), 3,2 (br s, 1H), 3,56 (t, 2H), 4,22 (q, 4H), 6,65-7,25 (m, 4H).
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(b) Síntesis de [((3,3-biscarboetoxi)-3-cloropropoxi-(3-(bis- (2-cianoetil)fosforiloxi)-fenil)metilen] triciclo [3,3, 1,1^{3,7}] decano
Se enfrió en un baño con hielo un matraz que contenía 25 ml de CH_{2}Cl_{2} en una capa de argón. Se añadió piridina (1,5 g) seguido de una adición lenta de POCl_{3} (1,82 g) y se continuó agitando durante 15 min. Se añadió gota a gota una solución del alqueno (1,5 g) de la etapa (a) y 1,5 g de piridina en 25 ml de CH_{2}Cl_{2}. A continuación se retiró del baño de hielo y se agitó la solución durante 1 h. La solución se enfrió de nuevo en un baño de hielo y se trató sucesivamente con 3,0 g de piridina y 2,8 g de 2-cianoetanol. Se agitó la mezcla de reacción durante 12 a 15 h dando como resultado la formación de un precipitado blanco. La mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con agua. Se secó el extracto de CH_{2}Cl_{2} y se evaporó. El producto en bruto se purificó por cromatografía utilizando acetato de etilo al 50% en hexano. Se obtuvo un total de 1,4 g de producto como aceite: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,278 (t, 6H), 1,80-1,97 (m, 12H), 2,565 (t, 2H), 2,63 (br s, 1H), 2,826 (t, 4H), 3,20 (br s, 1H), 3,556 (t, 2H), 4,271 (q, 4H), 4,40-4,47 (m, 4H), 7,15-7,36 (m, 4H).
58
(c) Síntesis de la sal tetrasódica de [(3,3-biscarboxi-3-cloropropoxi)- (3-fosforiloxifenil)metilen] triciclo [3,3, 1,1^{3,7}]-decano
Se disolvió el alqueno (0,9 g) de la etapa (b) en 25 ml de acetona. Se añadió una solución de 0,22 g de hidróxido de sodio en 3 ml de agua. Se agitó la solución toda la noche, durante cuyo tiempo se formó un precipitado. Se decantó el líquido y se disgregó el sólido con acetona. Se filtró el sólido blanco, se lavó además con acetona y secó al vacío: ^{1}H RMN (D_{2}O) \delta 1,77-1,92 (m, 12H), 2,422 (t, 2H), 2,59 (br s, 1H), 3,15 (br s, 1H), 3,635 (t, 2H), 7,02-7,33 (m, 4H).
59
(d) Síntesis de la sal tetrasódica de [4-(3,3-biscarboxi)-3-cloropropoxi)-4-(3-fosforiloxifenil)] espiro[1,2-dioxetano-3,2'-triciclo[3,3,1,1^{3,7}]decano](4)
Se disolvió el alqueno (35 mg) de la etapa (c) en 1,0 ml de D_{2}O. Se empapó Rosa de Bengala unido al polímero (500 mg) en 10 ml de p-dioxano-d_{8} durante 5 min y a continuación se añadió a la solución acuosa. La mezcla de reacción se enfrió a 0ºC, se inició un barboteo con oxígeno y se irradió la mezcla con una lámpara de sodio a través de un filtro KAPTON de 5 mil durante 45 min para producir 4 según se terminó por RMN. Se filtró la mezcla y se diluyó la solución en tampón de análisis de enzimas: ^{1}H RMN (D_{2}O) \delta 1,05-1,96 (m, 12H), 2,19 (br s, 1H), 2,60-2,62 (m, 2H), 3,07 (br s, 1H), 3,56-3,58 (m, 2H), 7,25-7,44 (m, 4H).
Ejemplo 5 Preparación de dioxetano 5
Este dioxetano se preparó mediante la secuencia de reacciones descrita a continuación. La síntesis hasta el alqueno intermedio [(3-hidroxifenil)-(2-yodoetoxi)metilen]triciclo-[3.3.1.1^{3,7}]decano se llevó a cabo como se describe en el Ejemplo 1.
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(a) Síntesis de [((3,3-biscarboetoxibutoxi)-(3-hidroxifenil)metilen]triciclo [3,3,1,1^{3,7}] decano
Se lavó el hidruro de sodio (0,866 g de una dispersión al 60% en aceite) exento de aceite con hexano, se secó al vacío y se añadió a 15 ml de DMSO anhidro. Se añadió metilmalonato de dietilo (2,4 g) y se agitó la suspensión en Ar durante 15 min. Se añadió a la mezcla de reacción una solución de yodoetoxi alqueno (2,8 g) en 15 ml de DMSO anhidro. Se calentó la reacción a 100ºC y se agitó durante 2 h. Después de enfriar, se diluyó la mezcla con 30 ml de acetato de etilo. La solución de acetato de etilo se extrajo 3 a 4 veces con agua, se secó y se evaporó. El material en bruto se cromatografió utilizando acetato de etilo del 5 al 20% en hexano. Se obtuvo el compuesto deseado (0,80 g) con un rendimiento del 25%: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,208 (t, 6H), 1,347 (s, 3H), 1,76-1,96 (m, 12H), 2,20 (t, 2H), 2,66 (br s, 1H), 3,20 (br s, 1H), 3,41 (t, 2H), 4,09-4,17 (q, 4H), 6,78-7,26 (m, 4H).
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(b) Síntesis de [((3,3-biscarboetoxibutoxi-3-(bis-(2-cianoetil)fosforiloxi)fenil) metilen]triciclo-[3,3,1,1^{3,7}]decano
Se enfrió en un baño con hielo un matraz que contenía 15 ml de CH_{2}Cl_{2} bajo una capa de argón. Se añadió piridina (1,38 g) seguido de una adición lenta de POCl_{3} (0,8 g) y se continuó agitando durante 15 min. Se añadió gota a gota una solución del alqueno (0,8 g) de la etapa (a) en 15 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se retiró del baño de hielo y se agitó la solución durante 1 h. A esta solución se añadió 1,38 g de piridina y 1,24 g de 2-cianoetanol. Se agitó la mezcla de reacción durante 12 a 15 h dando como resultado la formación de un precipitado blanco. La mezcla se diluyó con CH_{2}Cl_{2} y se lavó con 4 \times 50 ml de agua. Se secó el extracto de CH_{2}Cl_{2} y se evaporó. El producto en bruto se purificó por cromatografía utilizando acetato de etilo al 75% en hexano. Se obtuvo un total de 0,55 g de un aceite. 50% ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 1,208 (t, 6H), 1,34 (s, 3H), 1,78-1,97 (m, 12H), 2,18 (t, 2H), 2,61 (br s, 1H), 2,81 (t, 4H), 3,21 (br s, 1H), 3,41 (t, 2H), 4,09-4,16 (q, 4H), 4,37-4,46 (m, 4H), 7,14-7,34 (m, 4H).
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(c) Síntesis de la sal tetrasódica de [(3,3-biscarboxibutoxi)-(3-fosforiloxifenil) metilen]triciclo[3,3,1,1^{3,7}]decano
Se disolvió el alqueno (0,47 g) de la etapa (b) en 14 ml de acetona. Se añadió una solución de 0,117 g de NaOH en 1,5 ml de agua. Se agitó la solución toda la noche, durante cuyo tiempo se formó un precipitado. Se decantó el líquido y se lavó el sólido con 10 x 5 ml de acetona. Después de secar al vacío, se obtuvo un sólido blanco (0,383 g, 92%): ^{1}H RMN (D_{2}O) \delta 1,09 (s, 3H), 1,75-1,90 (m, 12H), 2,00 (t, 2H), 2,57 (br s, 1H), 3,13 (br s, 1H), 3,47 (t, 2H), 7,01-7,29 (m, 4H).
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(d) Síntesis de la sal tetrasódica de [4-(3,3-biscarboxibutoxi)-4-(3-fosforiloxifenil)] espiro[1,2-dioxetano-3,2'-triciclo[3,3,1,1^{3,7}]decano] (5)
Se disolvió el alqueno (65 mg) de la etapa (c) en 3 ml de D_{2}O. Se puso en suspensión Rosa de Bengala unido al polímero (35 mg) en 3 ml de p-dioxano y se añadió a la solución acuosa. La mezcla de reacción se enfrió entre 5 y 8ºC, se inició un barboteo con oxígeno y se irradió la mezcla con una lámpara de sodio a través de un filtro KAPTON de 5 mil durante 1 h para producir (5). Se filtraron los granos de polímero y se utilizó la solución para preparar soluciones madre para análisis. ^{1}H RMN (D_{2}O) \delta 0,92-1,33 (m, 5H), 1,38-2,21 (m, 13H), 2,92 (br s, 1H), 3,19-3,32 (m, 2H), 7,14-7,73 (m, 4H).
Ejemplo 6 Preparación alternativa de dioxetano 3
El dioxetano se preparó mediante la secuencia de reacciones descrita a continuación utilizando como material de partida [(3-hidroxifenil)metoximetilen-triciclo[3.3.1.1^{3,7}]decano. Este compuesto se puede preparar como se describe en la patente U.S. nº 4.983.779.
(a) Se añadió el alqueno [(3-hidroxifenil)metoximetilen-triciclo[3.3.1.1^{3,7}]decano (12 g) a 100 ml de 2-cloroetanol y se agitó. A continuación se añadió a la mezcla una cantidad catalítica de Hg(OAc)_{2} (2,8 g) en una atmósfera de argón. La reacción se agitó durante 5 h a 110ºC. Después de enfriar a temperatura ambiente, se eliminó el cloroetanol al vacío. Se disolvió el sólido en EtOAc y se lavó con agua. La capa de EtOAc se secó sobre Na_{2}SO_{4} y se evaporó para producir [(3-hidroxifenil)-(2-cloro-etoxi)metilen]triciclo[3.3.1.1^{3,7}]decano.
(b) La sustitución del átomo de cloro en el compuesto anterior por un átomo de yodo se realizó fundamentalmente según se describe en las patentes U.S. nº 5.013.827 y 5.068.339.
(c) La síntesis de [(3-hidroxifenil)-(3,3-biscarboetoxi)-3-fluoropropoximetilen] triciclo [3.3.1.1^{3,7}]decano a partir de [(3-hidroxifenil)-(2-yodoetoxi)metilen] triciclo [3.3.1.1^{3,7}] decano se describe en el Ejemplo 3 anterior.
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(d) El alqueno de fluoromalonato (0,375 g) de la etapa (c) se fotooxigenó con aprox. 1 mg de azul de metileno en 15 ml de CH_{2}Cl_{2}. Después de enfriar la solución a-78ºC con barboteo de O_{2}, se irradió la solución con una lámpara de sodio a través de un filtro KAPTON de 5 mil durante 45 min y a continuación se dejó calentar a temperatura ambiente. Se evaporó el CH_{2}Cl_{2} y se cromatografió el residuo utilizando EtAc de 0 al 5% en CH_{2}Cl_{2} como eluyente para producir [4-(3,3-bis-carboetoxi-3-fluorpropoxi)-4-(3-hidroxifenil)] espiro[1,2-dioxetano-3,2'-triciclo[3,3,1,1^{3,7}]-decano]: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 0,97-1,02 (m, 1H), 1,21-1,33 (m, 7H), 1,45-1,91 (m, 10H), 2,23 (br s, 1H), 2,48-2,80 (m, 2H), 2,96 (br s, 1H), 3,35-3,44 (m, 1H), 3,65-3,75 (m, 1H), 4,21-4,40 (m, 4H), 6,85-7,40 (m, 4H).
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(e) El dioxetano de la etapa anterior se fosforiló mediante el procedimiento siguiente. Se enfrió a 0ºC una solución de 2 ml de piridina anhidra y 10 ml de CH_{2}Cl_{2} en argón y se añadió gota a gota una solución de 0,424 g de POCl_{3} en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. Después de 15 min, se añadió gota a gota una solución de 0,424 g de dioxetano en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se dejó calentar la solución a temperatura ambiente y se agitó durante 4 h. Se enfrió de nuevo la solución a 0ºC y se añadió gota a gota una solución de 0,75 g de cianoetanol en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se dejó calentar esta solución a temperatura ambiente y se agitó durante 2,5 h. Después de evaporar a sequedad, se cromatografió el residuo utilizando acetato de etilo del 50 al 100% en hexanos como eluyente. A continuación se eliminaron los disolventes al vacío dando un aceite incoloro. A continuación se disolvió el dioxetano en 100 ml de CH_{2}Cl_{2} y se le lavó tres veces con agua tipo I. Se secó a continuación la capa orgánica sobre Na_{2}SO_{4}, se filtró y se evaporó para producir el dioxetano fosforilado: ^{1}H RMN (CDCl_{3}) \delta 0,90-0,95 (m, 1H), 1,24-1,33 (m, 7H), 1,46-2,20 (m, 11H), 2,50-2,86 (m, 6H), 2,96 (br s, 1H), 3,32-3,41 (m, 1H), 3,62-3,73 (m, 1H), 4,20-4,48 (m, 8H), 7,30-7,70 (m, 4H); ^{31}P (CDCl_{3})-9,53 (p).
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(f) Se eliminaron los grupos alquil haciendo reaccionar el dioxetano de la etapa anterior con 47,2 mg de NaOH en 1 ml de agua tipo I y 10 ml de acetona en argón toda la noche. Se decantó el disolvente del residuo aceitoso que se había formado. Se lavó dos veces a continuación el aceite con 2 ml de acetona y se disgregó a continuación con otros 10 ml de acetona para producir un sólido blanco en polvo. Se recogió el dioxetano 3 sólido mediante filtración por aspiración y se lavó con otros 20 ml de acetona.
En un procedimiento alternativo, el producto de dioxetano de la etapa (d) se puede transformar directamente en el dioxetano 3 por el siguiente procedimiento. Se enfría a 0ºC una solución de 2 ml de piridina anhidra y 10 ml de CH_{2}Cl_{2} en argón y se añadió gota a gota una solución de 0,424 g de POCl_{3} en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. Después de 15 min, se añade gota a gota una solución de 0,424 g de dioxetano en 10 ml de CH_{2}Cl_{2}. Se deja calentar la solución a temperatura ambiente y se agita durante 4 h. Se forma la sal del fosfato y los grupos éster se hidrolizaron haciendo reaccionar el diclorofosfato de dioxetano con 47,2 mg de NaOH en 1 ml de agua tipo I y 10 ml de acetona en argón toda la noche. Se elimina el disolvente procedente del residuo que contiene el producto. Se lava a continuación el producto con acetona y, si es necesario, se disgrega en acetona para producir un sólido blanco en polvo. El dioxetano 3 se recoge por filtración con aspiración.
Ejemplo 7 Descubrimiento del problema de arrastre de reactivo en el sistema de análisis químico en cápsula
Se realizaron los experimentos descritos a continuación en un sistema de análisis químico en cápsula prototipo esencialmente tal como describe Kumar et al. en el documento U.S. nº 5.399.497, con el sistema de detección configurado para medir la emisión de luz (luminiscencia). El procedimiento y el aparato comprenden la alimentación de una corriente de segmentos de fluido a través de un tubo de teflón, en cuyo tubo hay una capa aislante de aceite de fluorocarbono en la superficie interna. La muestra y los reactivos se aspiran dentro de este tubo y los segmentos líquidos producidos se transportan a través del tubo. Las etapas de separación y las etapas de lavado que se necesitan para los procedimientos de inmunoanálisis heterogéneo se facilitaron mediante imanes, que transfirieron las partículas magnéticas desde un segmento acuoso al otro. El sistema de detección estaba compuesto por un contador de fotones y un cabezal lector de fibra óptica, en el que las fibras se dispusieron radialmente alrededor del tubo de teflón para maximizar la eficacia de la captación de luz.
Se utilizó el procedimiento de TECHNICON IMMUNO 1® TSH (Bayer Corporation, Tarrytown, NY, USA) como un procedimiento de inmunoanálisis representativo para el análisis de los reactivos luminógenos. El principio del procedimiento implicaba la incubación de una muestra que contenía el antígeno TSH con un primer reactivo (R1), que contenía un anticuerpo marcado con fluoresceína y simultáneamente con un segundo reactivo (R2), que contenía un conjugado de fosfatasa alcalina-anticuerpo (ALP). Cada anticuerpo era específico para un epítopo diferente en el antígeno de TSH, a fin de facilitar la formación de un ``sandwich'' entre estos dos anticuerpos y el antígeno de TSH. Las partículas magnéticas que contenían anti-fluoresceína unida se utilizaron para capturar el sandwich y las partículas se lavaron posteriormente para eliminar los reactivos no unidos. Las partículas se expusieron a continuación al reactivo luminógeno, que contenía un sustrato para ALP y se midió la luminiscencia.
El reactivo luminógeno R3 estaba compuesto por CSPD 0,2 mM (fosfato disódico de 3-(4-metoxiespiro(1,2-dioxietano-3,2'-(5'-cloro)triciclo [3.3.1.1^{3,7}]decano)-4-il)fenil, (Tropix, Inc., Bedford, MA, USA), piranina 3 mM (ácido hidroxipirensulfónico), MgCl_{2} 1 mM, tampón de dietanolamina 1 M (pH 10,0), Triton X-100 al 0,1% y NaN_{3} al 0,1%. La secuencia de acontecimientos en el sistema de análisis químico en cápsula se representa en la Fig. 1 de los dibujos. La cápsula de fluido del paquete de la prueba estaba compuesta por seis segmentos líquidos, cada uno de los cuales tenía un volumen de 28 \mul. Las partículas magnéticas (1,4 \mu) del reactivo de la partícula magnética utilizada en el sistema TECHNICON IMMUNO 1 se aspiraron dentro del primer segmento (MP), con el resto de fluido que era tampón de lavado de partículas (Tris 25 mM, pH 7,5, conteniendo NaCl 0,2 M, Triton X-100 al 0,1% y conservante). R1 (
\hbox{10,4  \mu l}
de solución en relación con el suero que contiene anticuerpo marcado con fluoresceína en THS), R2 (
\hbox{10,4  \mu l}
de solución en relación con el suero que contiene anticuerpo en THS conjugado con ALP) y S (7,2 \mul de muestra de suero) se aspiraron dentro del segundo segmento. Los dos segmentos siguientes (W1 y W2) estaban compuestos por el mismo tampón de lavado de suero utilizado anteriormente en el segmento MP. El quinto segmento era R3, de la composición descrita anteriormente, siendo los elementos clave el sustrato luminógeno y el potenciador de luminiscencia. El sexto segmento era un tampón de prueba intermedia (igual al tampón de partículas descrito anteriormente), que se utilizó para aislar las pruebas sucesivas. Las transferencias magnéticas se representaron mediante flechas en la Fig. 1. Estas transferencias se facilitaron mediante uno de los dos conjuntos de transferencia magnética (M1 ó M2). Después de una incubación de 13 minutos, durante los cuales tuvo lugar la formación de sandwich, M1 transfirió las partículas magnéticas al segmento R1+R2+S para iniciar la captura. Después de un periodo adicional de 6 minutos, M2 transfirió las partículas al primer segmento de lavado. Después de un periodo adicional de 12 segundos, M2 transfirió las partículas al segundo segmento de lavado. Después de otro periodo de 12 segundos, M2 transfirió las partículas al segmento R3 y la emisión de luz desde este segmento se detectó como corriente de segmentos acuosos que pasaban de una parte a otra a través del cabezal lector del luminómetro.
Como el tubo de teflón (marca registrada) es transparente a la luz, era de esperar un problema con la tubería transparente (o ``arrastre óptico''). Particularmente, alguno de los fotones emitidos desde el segmento R3 de una prueba sucesiva podría entrar en el material de teflón, propagarse por la parte inferior a lo largo del tubo y ser barridos dentro del detector durante la medición de la señal de la prueba en cuestión. Sin embargo, mientras se detectaba una señal en las pruebas sucesivas, no sucedió de la forma esperada. En lugar de disminuir rápidamente con la distancia desde la prueba N, los picos de salida de luz se observaron centrados alrededor de los segmentos R3 de los paquetes de la prueba sucesiva, tal como se muestra en los dibujos de la Fig. 2. En la Fig. 2, la prueba N produjo un alto nivel de luminiscencia, aproximadamente 7,5 millones de cuentas por segundo (cps). Las pruebas N-1 y N-2 se aspiraron dentro del tubo antes de la prueba N y precedieron a esta prueba a través del luminómetro y las pruebas N+1 y N+2 siguieron después de la prueba N. El sistema de análisis registró los fotones contados por cada segmento individual de aire y líquido en la corriente. El perfil de la Fig. 2 representa la media de 10 paneles duplicados de 5 pruebas cada una corregida para la señal de fondo de luminiscencia producida en ausencia de ALP. Los valores blancos del reactivo sustraídos de cada punto de datos fueron una media obtenida de 10 paneles duplicados de 5 pruebas cada uno. La magnitud de la señal de arrastre se informatizó dividiendo las cps del pico en cada prueba sucesiva por las cps del pico en la prueba N, expresadas en partes por millón (ppm).
Otra posible explicación para este comportamiento fue el arrastre físico de ALP desde la prueba N a las pruebas inmediatas de una manera no deseada. Esto podría suceder, por ejemplo, si el tubo contuviera materiales particulares depositados en las paredes, que podrían destruir el movimiento suave de los segmentos de líquido a lo largo del tubo. Sin embargo, la colocación de fosfato inorgánico 10 mM en los segmentos R3 de las pruebas sucesivas no tuvo efecto sobre la magnitud de las señales en las pruebas sucesivas. Ya que esta cantidad de fosfato habría inhibido el ALP en por lo menos el 90% en estas condiciones de la prueba, se controló la posibilidad del arrastre físico.
Para controlar además el arrastre óptico, la piranina del potenciador fluorescente se suprimió solamente de la prueba N, pero estuvo presente en las pruebas sucesivas. Como resultado, la magnitud de la señal en la prueba N fue más baja por un factor de aproximadamente 10. Sin embargo, tal como se muestra en la Fig. 3 de los dibujos, la altura de los picos en las pruebas sucesivas no cambió significativamente. El hecho de que la señal de arrastre no cambiara en las pruebas sucesivas demostró de forma clara proporcionalmente que este arrastre no era óptico.
Un tipo adicional e inesperado de arrastre fue la causa del problema de arrastre. Se observó que el hidroxidioxetano intermedio era suficientemente soluble en el aceite de fluorocarbono utilizado para recubrir la pared interna del tubo de teflón (marca registrada), de tal modo que el arrastre fue debido a la transferencia del hidroxidioxetano intermedio disuelto mediante el aceite en los segmentos R3 de las pruebas inmediatas. Este procedimiento se probó cambiando el tampón de los segmentos R3 en las pruebas sucesivas desde DEA 1 M a pH 10 hasta Tris 1 M a pH 7. A pH 7, el hidroxidioxetano intermedio disuelto en estos segmentos R3 es estable y no emite luz. Tal como se muestra en los dibujos de la Fig. 4, este cambio en el pH dio como resultado la eliminación completa de las bandas laterales de luminiscencia. El arrastre residual menor en las pruebas N+1 y N-1 fue debido al arrastre óptico anticipado. Estos resultados verificaron que la fuente de emisión de luz en los picos en las pruebas inmediatas fue el ``arrastre químico'' del hidroxidioxetano procedente de CSPD dentro de los segmentos R3 de las pruebas sucesivas.
Ejemplo 8 Eliminación del arrastre químico observado con dioxetano 1 sustituido con ácido dicarboxílicos
La Tabla 1 muestra el efecto de utilizar otros tres dioxetanos sobre el arrastre químico del producto intermedio. LUMIGEN PPD [4-(metoxi)-4-(3-fosforiloxifenil)]-espiro [1,2-dioxetano-3,2'-triciclo[3.3.1.1^{3,7}]-decano], (Lumigen, Inc., Southfield, MI, USA), dioxetano 2, derivado del ácido monocarboxílico y dioxetano 1, derivado del ácido dicarboxílico, se utilizaron cada uno en formulaciones de la prueba a la misma concentración. La columna de ppm es la señal para la prueba N+1, que representa el comportamiento en el peor de los casos. El arrastre del compuesto precursor no modificado, PPD se observó que era más de dos veces superior al observado con CSPD. Sorprendentemente, el derivado del ácido monocarboxílico, dioxetano 3, presentó una reducción de sólo el 84% en la magnitud del arrastre químico. Esto indicó que un único grupo con carga era insuficiente para evitar completamente la solubilización de la reacción intermedia en el aceite de fluorocarbono. Sin embargo, el derivado del ácido dicarboxílico, fue 100% eficaz, indicando que dos grupos con carga eran totalmente adecuados para conseguir el comportamiento deseado.
TABLA 1 
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|l|r|r|}\hline\multicolumn{3}{|c|}{Reducción
del arrastre químico}\\\hline  Compuesto  \+ ppm  \+ % de reducción
\\\hline  LUMIGEN PPD (marca registrada)  \+ 1640 \+ \\  Dioxetano 2
 \+ 260  \+ 84 \\  Dioxetano 1  \+ 0  \+ 100
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 9 El papel de los potenciadores
Como parte de la optimización de un reactivo basado en el dioxetano 1, se examinaron numerosos materiales potenciadores. A pH 9,6, el potenciador A (dicloruro de 1-trioctilfosfoniometil-4-tributilfosfoniometilbenceno) aumentó la señal luminiscente por un factor de 6,2, y el potenciador B (poli(cloruro de vinilbenciltributilfosfonio)) aumentó la señal por un factor de 19,7. A pH 10,0, el potenciador A aumentó la señal por un factor de 4,8 y el potenciador B aumentó la señal por un factor de 18,9.
A pesar el hecho de que el potenciador B consiguió intensidades luminosas superiores, el potenciador A se prefirió para la utilización en el sistema de análisis ya que es un compuesto monomérico de peso molecular bajo. Los compuestos poliméricos, especialmente si son policatiónicos, interactúan con los componentes del suero, produciendo precipitación, lo que plantearía problemas importantes para la operación del sistema de análisis.
Se observó que tanto la fluoresceína como la piranina eran eficaces como sustancias fluorescentes complementarias junto con el potenciador A. Solas, estas sustancias fluorescentes se deben utilizar en concentraciones relativamente elevadas (3 mM) para conseguir una potenciación de aproximadamente 10 veces. Sin embargo, en combinación con el potenciador A, se observó un efecto sinérgico, en el que resultó una potenciación comparable a concentraciones 100 veces más bajas de sustancia fluorescente que la necesaria en ausencia del potenciador. Las Tablas 2 y 3 muestran el alcance de la potenciación por piranina y fluoresceína, respectivamente, en presencia de 1 mg/ml del potenciador A.
TABLA 2 
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|}\hline\multicolumn{2}{|c|}{Potenciación
por piranina con potenciador A}\\\hline  [Piranina] (mM)  \+ Factor
de potenciación \\\hline  0,01  \+ 3,7 \\  0,02  \+ 7,3 \\  0,03  \+
9,8 \\  0,04  \+ 12,2 \\  0,05  \+ 13,7
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
TABLA 3 
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|}\hline\multicolumn{2}{|c|}{Potenciación
por fluoresceína con potenciador A}\\\hline  [Fluoresceína] (mM)  \+
Factor de potenciación \\\hline  0,01  \+ 2,6 \\  0,02  \+ 4,0 \\ 
0,05  \+ 7,1 \\  0,10  \+ 8,7
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 10 Formulación optimizada para sistema de análisis químico en cápsula
Las observaciones descritas anteriormente han conducido al desarrollo de una formulación optimizada para el sistema de análisis químico en cápsula. Esta formulación comprende dioxetano 1 de 0,1 a 1 mM, piranina de 0 a 0,05 mM, potenciador A de 0,1 a 5 mg/ml, Mg^{+2} de 0 a 1 mM, 2-amino-2-metil-1-propanol de 0,1 a 1 M (pH 10,0) y Triton X-100 de 0,01 a 1%. La utilización de esta formulación produce la eliminación completa del problema de arrastre químico y un aumento de rendimiento.
Ejemplo 11 Estabilidad de 1, 3, 4 y 5 medida por análisis de enzima
Se prepararon formulaciones que comprenden 0,1 mg/ml de potenciador A, Mg^{+2} 0,88 mM, 2-amino-2-metil-1-propanol 0,2 M, pH 10, Triton X-100 al 0,1% y dioxetano 1, 3, 4 y 5 0,5 mM, respectivamente, y se almacenaron en botellas opacas de polietileno a 4ºC, 25ºC y 40ºC. Se pipetearon veinticuatro alícuotas de 100 \mul de cada botella en los pocillos de una placa de 96 pocillos y se encubaron las soluciones a 37ºC. Se inyectaron en cada pocillo 10 \mul de las soluciones conteniendo 8 x 10^{-17} moles de AP y se integró la intensidad luminosa durante cinco horas. Los datos son el promedio de los 24 pocillos. Se repitió el experimento en los intervalos de tiempo indicados para cada dioxetano. Los resultados de la Figura 5 muestran la estabilidad comparada de las tres formulaciones a 25ºC. Como se muestra en la Figura 5, el dioxetano 3 sustituido con flúor se observó que presenta fundamentalmente estabilidad al almacenado mejorada que el dioxetano 4 sustituido con cloro y que el dioxetano 1 sin halógeno sustituido. Los dioxetanos 3 y 5 fueron asimismo fundamentalmente más estables que el 1 ó el 4 a 40ºC.
TABLA 4 
\catcode`\#=12\nobreak\centering\begin{tabular}{|c|c|c|c|c|}\hline\multicolumn{5}{|c|}{Estabilidad
al almacenado de las formulaciones}\\\hline  Tiempo (semanas) 
\+\multicolumn{4}{|c|}{% de dioxetano restante}\\\dddcline{2}{5}  
\+ 1  \+ 3  \+ 4  \+ 5 \\\hline  0  \+ 100  \+ 100  \+ 100  \+ 100
\\  1  \+ 94,8  \+  \+  \+ 100 \\  2  \+ 91,1  \+  \+  77,0  \+ 99,8
\\  3  \+ 87,5  \+ 99,1  \+ 66,0 \+ \\  4  \+ 84,1  \+  \+ 65,6  \+
99,4 \\  5  \+ 81,8 \+ \+ \+ \\  6  \+ 80,7 \+ \+ \+ \\  9  \+ 76,5 
\+  96,9 \+ \+ \\  10  \+  \+  \+ 57,5 \+ \\  12  \+  \+ 96,7 \+ \+
\\  14  \+  \+ 93,8 \+ \+ \\  21  \+  \+ 93,6 \+ \+
\\\hline\end{tabular}\par\vskip.5\baselineskip
Ejemplo 12 Rendimiento de 3
Se evaluó un reactivo de detección que incorpora dioxetano 3 en un sistema de prueba tal como el descrito en el Ejemplo 7. El material de prueba fue un conjugado de fosfatasa alcalina marcada con fluoresceína que fue capturado dentro de partículas magnéticas. Los análisis de AP utilizando el reactivo que contiene 3 produjo resultados con sensibilidad, amplitud dinámica y precisión comparables con los resultados utilizando dioxetano 1.

Claims (38)

1. Procedimiento que comprende la etapa de:
a) hacer reaccionar un primer compuesto de alqueno de fórmula:
67
en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales y RG es un grupo eliminable con un éster de malonato sustituido con Z, en el que Z se selecciona de entre el grupo constituido por átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y una base para producir un compuesto de alqueno sustituido con malonato de fórmula:
68
en la que R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende las etapas adicionales de:
b) fotooxidar el compuesto de alqueno sustituido con malonato irradiando un sensibilizador en presencia de oxígeno y del compuesto de alqueno sustituido con malonato para formar un dioxetano sustituido con malonato de fórmula:
69
c) hacer reaccionar el dioxetano sustituido con malonato con un reactivo de fosforilación de fórmula WP(O)Y_{2}, en la que W e Y se seleccionan cada uno de entre átomos de halógeno, grupos alcoxi, ariloxi, aralquiloxi y trialquilsililoxi sustituidos o insustituidos para formar un compuesto de dioxetano fosforilado de fórmula:
70
y
d) hidrolizar el dioxetano fosforilado en un disolvente acuoso con una base de fórmula M-Q, en la que Q es un anión básico para formar un compuesto de la sal de dioxetano de fórmula.
71
en la que Z se seleccionado de entre el grupo constituido por átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos, y M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, en el que la etapa de hacer reaccionar el compuesto de dioxetano sustituido con malonato con el reactivo de fosforilación comprende las etapas de:
a) hacer reaccionar el compuesto de dioxetano sustituido con malonato con un reactivo de fosforilación de fórmula WP(O)Y'_{2}, en la que Y' es un átomo de halógeno para formar un compuesto de fosforil haluro dioxetano de fórmula:
72
y
b) hacer reaccionar el compuesto de fosforil haluro dioxetano con un compuesto hidroxílico de fórmula Y-OH, en la que Y se selecciona de entre grupos alquilo sustituido o insustituidos para formar el compuesto de dioxetano fosforilado.
4. Procedimiento según la reivindicación 2 ó 3, en el que el reactivo WP(O)Y_{2} es POCl_{3}.
5. Procedimiento según la reivindicación 1, que comprende las etapas adicionales de:
b) hacer reaccionar el alqueno sustituido con malonato con un reactivo de fosforilación de fórmula WP(O)Y_{2}, en la que W se selecciona de entre halógenos e Y es un átomo de halógeno, para formar un compuesto de alqueno fosforilado de fórmula:
73
c) hacer reaccionar el compuesto de alqueno fosforilado con un compuesto hidroxilo de fórmula Y'-OH, en la que Y' se selecciona de entre grupos alquil sustituidos o insustituidos para formar un segundo compuesto de alqueno fosforilado de fórmula:
74
y
d) hidrolizar el segundo compuesto de alqueno fosforilado en un disolvente acuoso con una base de fórmula M-Q, en la que Q es un anión básico para formar un compuesto de sal de alqueno de fórmula:
75
y
e) fotooxidar el compuesto de la sal de alqueno irradiando un sensibilizador en presencia de oxígeno y del compuesto de la sal alqueno en solución acuosa para formar un compuesto de la sal de dioxetano de fórmula:
76
en la que Z se seleccionado de entre el grupo constituido por átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos, y M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino y un ión de amonio cuaternario o de fosfonio.
6. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, en el que Z se selecciona de entre F y CH_{3} y M es Na.
7. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, en el que R_{3} y R_{4} se combinan conjuntamente para formar un grupo R_{5} con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano.
8. Procedimiento según la reivindicación 7, en el que R_{5} es un grupo adamantil sustituido o insustituido.
9. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que R_{2} es un grupo meta-fenil sustituido o insustituido.
10. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que Z es CH_{3}, M es Na, R_{2} es un grupo meta-fenil insustituido, R_{5} es un grupo adamantil insustituido y el compuesto de la sal de dioxetano tiene la fórmula:
77
11. Procedimiento según la reivindicación 8, en el que Z es F, M es Na, R_{2} es un grupo meta-fenil insustituido, R_{5} es un grupo adamantil insustituido y el compuesto de la sal de dioxetano tiene la fórmula:
78
12. Compuesto de alqueno de fórmula:
79
en el que Z se selecciona de entre átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y cada R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos.
\newpage
13. Compuesto de alqueno de fórmula:
80
en el que Z se selecciona de entre el grupo constituido por átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos, cada R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos y cada Y se selecciona de entre átomos de halógeno, grupos alcoxi, ariloxi, aralquiloxi y trialquilsililoxi sustituidos o insustituidos.
14. Compuesto de alqueno de fórmula:
81
en la que Z se selecciona de entre átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino, un ión de amonio cuaternario o un ión de fosfonio.
15. Compuesto de dioxetano de fórmula:
82
en el que Z se selecciona de entre átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y cada R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos.
16. Compuesto de dioxetano de fórmula:
83
en el que Z se selecciona de entre átomos de halógeno y grupos alquil de 1 a 4 carbonos y cada R' es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos y cada Y se selecciona de entre un átomo de Cl y un grupo 2-cianoetil.
17. Compuesto según la reivindicación 16, en el que Y es Cl.
18. Compuesto según la reivindicación 16, en el que Y es el grupo 2-cianoetil.
19. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12, 13 y 15 a 18, en el que Z es F y R' es etil.
20. Compuesto según cualquiera de las reivindicaciones 12, 13 y 15 a 18, en el que Z es CH_{3} y R' es etil.
21. Dioxetano de fórmula:
84
en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos, que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales, en la que Z es un átomo de flúor, M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio y en la que X es un grupo protector que se puede eliminar mediante un agente activador para producir luz.
22. Dioxetano según la reivindicación 21, de fórmula:
85
en el que R_{5} se selecciona de entre el grupo constituido por grupos alquil cíclicos y policíclicos que están espirofusionados al anillo de dioxetano y que contienen de 6 a 30 átomos de carbono y que pueden incluir opcionalmente sustituyentes adicionales.
23. Dioxetano según la reivindicación 22, en el que R_{5} es un grupo adamantil sustituido o insustituido.
24. Dioxetano según la reivindicación 23, de fórmula:
86
25. Dioxetano según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 24, en el que el grupo OX se selecciona de entre el grupo constituido por un grupo O^{-}M^{+} en el que M se selecciona de entre el grupo constituido por hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario y un ión de fosfonio cuaternario, un grupo OOCR_{8}, en el que R_{8} se selecciona de entre el grupo constituido por grupos alquil y aril que contienen de 1 a 8 átomos de carbono y que contienen opcionalmente heteroátomos, sal de OPO_{3}^{-2}, sal de OSO_{3}^{-}, grupos \beta-D-galactosidoxi y \beta-D-glucuronidiloxi.
26. Dioxetano según la reivindicación 25, de fórmula:
87
27. Composición para producir luz, que comprende en solución acuosa:
(a)
un dioxetano estable según cualquiera de las reivindicaciones 21 a 26; y
(b)
una sustancia potenciadora catiónica no polimérica que aumenta la cantidad de luz producida haciendo reaccionar el dioxetano con dicho agente de activación comparada con la cantidad que se produce en ausencia del potenciador.
28. Composición según la reivindicación 27, en la que la sustancia potenciadora es un tensioactivo dicatiónico de fórmula:
88
en la que cada A se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por los átomos de P y N, en la que el enlace es un grupo de enlace orgánico que contiene por lo menos dos átomos de carbono seleccionados de entre el grupo constituido por grupos aril, alquil, alquenil y alquinil sustituidos e insustituidos y en la que el enlace puede contener opcionalmente heteroátomos y en la que R se selecciona de entre alquil o aralquil inferiores que contienen de 1 a 20 átomos de carbono y en la que Y es un anión.
29. Composición según la reivindicación 28, en la que la sustancia potenciadora es un tensioactivo dicatiónico de fórmula:
89
y en la que el enlace es fenileno.
30. Dioxetano de fórmula:
90
en la que R_{3} y R_{4} se seleccionan cada uno de entre el grupo constituido por grupos orgánicos acíclicos, cíclicos y policíclicos que pueden estar opcionalmente sustituidos con heteroátomos y que pueden opcionalmente estar unidos para formar un grupo con anillo cíclico o policíclico espirofusionado al anillo de dioxetano, en la que R_{2} es un grupo con anillo de arilo seleccionado de entre el grupo constituido por grupos fenil y naftil que pueden incluir sustituyentes adicionales, en la que Z es un grupo alquil de 1 a 4 carbonos, M se selecciona de entre hidrógeno, un ión metálico alcalino o un ión de amonio cuaternario o de fosfonio y en la que X es un grupo protector que se puede eliminar mediante un agente activador para producir luz.
31. Dioxetano según la reivindicación 30 de fórmula:
91
en el que R_{5} se selecciona de entre el grupo constituido por grupos alquil cíclicos y policíclicos que están espirofusionados al anillo de dioxetano y que contienen de 6 a 30 átomos de carbono y que pueden incluir opcionalmente sustituyentes adicionales.
32. Dioxetano según la reivindicación 31, en el que R_{5} es un grupo adamantil sustituido o insustituido.
\newpage
33. Dioxetano según la reivindicación 32, de fórmula:
92
34. Dioxetano según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 33, en el que el grupo OX se selecciona de entre el grupo que consiste en un grupo O^{-}M^{+} en el que M se selecciona de entre el grupo que consiste en hidrógeno, un ión metálico alcalino, un ión de amonio cuaternario y un ión de fosfonio cuaternario, un grupo OOCR_{8}, en el que R_{8} se selecciona de entre el grupo constituido por grupos alquil y aril que contienen de 1 a 8 átomos de carbono y opcionalmente que contienen heteroátomos, sal de OPO_{3}^{-2}, sal de OSO_{3}^{-}, grupos \beta-D-galactosidoxi y \beta-D-glucuronidiloxi.
35. Dioxetano según la reivindicación
93
36. Composición para producir luz, que comprende en solución acuosa:
(a)
un dioxetano estable según cualquiera de las reivindicaciones 30 a 35; y
(b)
una sustancia potenciadora catiónica no polimérica que aumenta la cantidad de luz producida haciendo reaccionar el dioxetano con dicho agente de activación comparada con la cantidad que se produce en ausencia del potenciador.
37. Composición según la reivindicación 36, en la que la sustancia potenciadora es un tensioactivo dicatiónico de fórmula:
94
en la que cada A se selecciona independientemente de entre el grupo constituido por los átomos de P y N, en la que el enlace es un grupo de enlace orgánico que contiene por lo menos dos átomos de carbono seleccionados de entre el grupo constituido por grupos aril, alquil, alquenil y alquinil sustituidos e insustituidos y en la que el enlace puede contener opcionalmente heteroátomos y en la que R se selecciona de entre alquil o aralquil inferiores que contienen de 1 a 20 átomos de carbono y en la que Y es un anión.
38. Composición según la reivindicación 37, en la que la sustancia potenciadora es un tensioactivo dicatiónico de fórmula:
95
y en la que el enlace es fenileno.
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