KR100518977B1 - 저장안정성이증가된삼치환된수용성1,2-디옥세탄화합물,그합성방법및중간체 - Google Patents

저장안정성이증가된삼치환된수용성1,2-디옥세탄화합물,그합성방법및중간체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 수용성 및 저장 안정성이 증가된, 효소에 의해 화학발광 반응이 유도될 수 있는 안정한 1,2-디옥세탄 화합물, 그 제조 방법 및 그 제조에 사용되는 중간체를 제공한다. 상기 디옥세탄 구조내에 위치하는 2개 이상의 수용성 그룹으로 치환된 디옥세탄은, 캡슐 화학 분석 시스템을 이용하여 실시되는 검정법에 사용되는 경우에 발생할 수 있는 시약의 캐리오버 문제점이 제거됨으로써, 더 우수한 성능을 제공한다. 이러한 디옥세탄은 저장시 실질적으로 개선된 안정성을 보여준다. 본 발명은 또한 상기 디옥세탄, 비-폴리머성 양이온 계면활성제 증강제 및 화학발광을 증강시키기 위해 임의적으로 첨가되는 형광제를 포함하여 이루어지는 조성물을 제공한다.

Description

저장 안정성이 증가된 삼치환된 수용성 1,2-디옥세탄 화합물, 그 합성 방법 및 중간체
관련출원
본 출원은 본 발명의 출원인에 의해 1996년 9월 8일 출원되어 본 출원과 함께 계류중인 미국 출원 08/748,107호에 대한 일부 계속 출원이며, 상기 08/748,107출원은 1995년 7월 31일 출원되어 계류중인 미국 특허 출원 08/509,305호 출원에 대한 일부 계속 출원이다.
발명의 배경
(1) 발명의 분야
본 발명은, 효소를 포함한 화학물질에 의해서 화학발광 반응이 유도되는 안정한 1,2-디옥세탄과 상기 디옥세탄을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 디옥세탄은 알콕시 치환기의 일부인 이온화 그룹을 1 이상 포함하고 있다. 이외에도 상기 디옥세탄은 알콕시 치환기의 수소원자들중 하나의 위치에 치환되어 디옥세탄의 저장 안정성을 증가시키는 불소 원자 또는 저급 알킬기를 포함하고 있다. 보다 상세하게는, 본 발명은 이러한 디옥세탄의 합성 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 제공되는 합성 방법에 의해 제조되는 디옥세탄은, 디옥세탄, 양이온성 계면활성제, 및 화학발광 생성량을 증대시키기 위해 임의적으로 첨가되는 형광물질을 포함하는 조성물로서 유용하다. 본 발명의 디옥세탄과 디옥세탄을 포함하는 조성물은 빛(화학발광)을 발생시키는 방법 및 분석물질의 존재 및 그 양을 검출하는 방법에 있어 유용하게 사용된다. 중요한 것은, 디옥세탄에 포함되어 있는 이온화 그룹은 디옥세탄의 수용성을 증가시키고 또한 캡슐 화학 분석 시스템에 있어서 예상치못했던 화학적인 문제점을 해결해주는 반면, 불소 원자 또는 저급 알킬기는 디옥세탄의 저장 안정성을 증가시킨다는 것이다.
(2) 관련 기술에 대한 설명
a.효소에 의해 화학발광 반응이 개시되는 디옥세탄
효소에 의해 디옥세탄의 반응이 유도되는 첫 번째 예는, 미국 특허 출원 (A. P. Schaap, U.S. 특허 출원 887,139호)과 일련의 논문들 (A. P. Schaap, R. S. Handley 및 B. P. Giri, Tetrahedron Lett., 935 (1987); A. P. Schaap, M. D. Sandison 및 R. S. Handley, Tetrahedron Lett., 1159 (1987), A. P. Schaap, Photochem. Photobiol., 47S, 50S (1988))에 기재되어 있다. 보호기로 보호된 아실옥사이드 치환기를 포함하고 있으며 안정성이 매우 높은 아다만틸로 치환된 디옥세탄은, 디옥세탄의 분해율을 극적으로 증가시키는 전자-공여성이 강한 아릴옥사이드를 제공하는 효소와 수용성 완충제의 작용에 의해 빛을 내며 분해되기 시작한다. 그 결과 보호기로 보호된 형태의 디옥세탄이 서서히 열분해 되어 발생하는 화학발광에 비하여 그 강도가 10의 수승배(10X배) 이상이나 되는 화학발광이 발생된다. 스카프(Schaap)에게 허여된 미국 특허 5,068,339호에서는 효소에 의해 반응이 개시될 수 있는 디옥세탄에 대해 개시하고 있는데, 상기 출원에 개시된 디옥세탄은 형광물질이 공유결합되어 있고 분해되는 경우 형광물질에 에너지를 전달하는 과정을 통해 화학발광이 증강된다. 브론스테인(Bronstein)에게 허여된 미국 특허 5,112,960호, 5,220,005호, 및 PCT 출원 (WO88/00695)은 치환된 아다만틸 그룹을 포함하는 반응 유도성 디옥세탄이 개시되어 있다. 에드워드(Edwards)에게 허여된 미국 특허 4,952,707호에는 인산염으로 치환된 디옥세탄이 개시되어 있다. 브론스테인에게 허여된 PCT 출원 (WO94/26726)에는 비-컨쥬게이트위치에 효소에 불안정한 OX 그룹이 치환되어 있고 아릴고리에 부가 치환기가 있는 페닐기 또는 나프틸 그룹을 포함하는 아다만딜 디옥세탄이 개시되어 있다.
다른 반응 유도성 디옥세탄들을 왕(Wang)에게 허여된 PCT 출원 (WO94/10258)에 개시되어 있다. 여기에 개시된 디옥세탄은 일차환 될 수 있는 알콕시 그룹과, 치환된 페닐-OX 그룹을 포함하고 있는데, 상기 페닐-OX 치환 그룹에는 반응 유도성 OX 그룹 외에도 벤젠 고리상에 수소가 아닌 그룹이 하나 이상 존재한다.
상술한 문헌에 개시되어 있는 모든 디옥세탄은, 통상적으로는 히드록시벤조산 또는 히드록시나프토산의 메틸에스테르 등의 방향족 카르복실산의 알킬 에스테르 또는 기타 히드록시아릴 케톤으로 이루어진 발광성 카르보닐 화합물을 생성한다.
본 출원인에 의해 1995년 7월 31일에 출원되어 현재 함께 계류중인 미국 출원 08/509,305호 (이하 305 출원이라 함)에는 이치환된 디옥세탄이 개시되어 있는데, 상기 디옥세탄의 하이드록시 디옥세탄은 수용성이 개선된 것으로 그내용 그대로 본 발명에서 인용되고 있다.
b. 계면활성제에 의해 증강되는 반응 유도성 디옥세탄의 화학발광
안정한 1,2-디옥세탄이 효소에 의해 분해 반응이 개시되어 생성되는 화학발광은 암모늄 계면활성제와 형광물질을 포함하는 수용성 물질의 존재하에서 증강된다는 것이 보고되어 왔다. (A. P. Schaap, H. Akhavan 및 L. J. Romano, Clin. Chem., 35(9), 1863 (1989). 세틸트리메틸암모늄브로마이드 (CTAB)와 5-(N-테트라데카노일)아미노-플루오레신으로 이루어진 형광성 미셀(micell)은 하이드록시로 치환된 디옥세탄 중간체를 포획하며 미셀의 소수성 환경하에서 여기상태(excited state)에 있는 음이온 형태의 에스테르로부터 플루오레신 화합물로 에너지를 효율적으로 전달함으로써, 수득되는 화학 발광량을 400배 증가시킨다.
스카프(Schaap)에게 허여된 미국 특허 4,959,182호와 5,004,565호에는, 4급 암모늄 계면활성제CTAB로 만든 미셀의 존재하에서 안정한 디옥세탄의 분해반응을 화학물질 및 효소에 의해 유도시켜 화학발광을 증강시킨 또 다른 예가 기재되어 있다. 형광성 미셀은 또한, 하이드록시- 및 아세톡시로 치환된 디옥세탄의 분해반응을 염기에 의해 개시시킴으로써 발광을 증강시킨다.
보이타(Voyta)의 미국 특허 5,145,772호에는 4급 암모늄기가 단독으로 결합되어있는 폴리머 또는 플루오레신과 부가 혼합된 폴리머 존재하에서, 1,2-디옥세탄으로부터 생성되는 화학발광을 효소에 의해 증가시킨 예가 개시되어 있다. 화학발광을 증강시키는 것으로 보고된 그 밖의 물질로는 소 알부민과 같은 구형 단백질과 4급암모늄 계면활성제가 있다. 별로 중요하지는 않으나 다른 양이온성 폴리머 화합물도 화학발광 증강제로서의 효과를 갖는다; 일반적으로 비이온성 폴리머 화합물은 화학발광 증강제로서의 효과가 없고 음이온성 폴리머는 발광성을 상당히 감소시킨다. 브론스테인(Bronstein)에게 허여된 PCT 특허출원 WO 94/21821호에는 상기 언급한 폴리머성 4급암모늄 계면활성제 증강제와 증강 첨가제의 혼합물을 사용하는 방법에 대해 기재하고 있다.
CTAB 존재하에서 피라닌(pyranine)을 이용하여 비-반응유도성 디옥세탄의 분해반응을 증강시키는 방법과 그 촉매 반응이 문헌에 기재되어 있다. (Martin Josso, Ph. D. Thesis, Wayne State University (1992), Diss. Abs. Int., Vol. 53, No. 12B, p. 6305)
아카반-타프티 (Akhavan-Tafti)의 미국특허 5,393,469호에서는, 형광성이 있는 에너지 수용체에 의해 임의적으로 치환된 4급포스포늄 폴리머의 존재하에서 효소를 이용하여 1,2-디옥세탄으로부터 생성되는 화학발광을 증강시키는 방법에 대해 개시하고 있다.
유럽 특허 출원 94108100.2호에는 2가 양이온성 인산염의 존재하에서 효소를 이용하여 1,2-디옥세탄으로부터 생성되는 화학발광을 증강시키는 방법이 개시되어 있다. 반응 유도성 디옥세탄으로부터 발생하는 화학발광을 증강시키기 위해 2가 양이온성 증강제와 음이온성 형광제를 조합하여 사용한 예는 어느 문헌에도 개시되어 있지 않다. 본 발명의 디옥세탄과 같은 종류의 치환된 디옥세탄의 화학발광을 증강시킨 예도 현재까지 보고된 바가 없다.
c. 수용성이 개선된 반응 유도성 디옥세탄
효소에 의해 반응이 유도되는 디옥세탄은 현재, 면역검정, 유전자 발현 연구, 웨스턴 블롯팅, 써던 블롯팅, DNA 서열화, 및 감염성 제제(infectious agent)중의 핵산부분의 확인 등 수많은 분야에 있어서, 마커효소에 대한 기질로서 널리 사용되고 있다. 이처럼 디옥세탄의 사용이 증가되고 있음에도 불구하고 일부 검정법에서는 디옥세탄을 사용하는데 한계를 보이고 있다. 반응 유도성 디옥세탄은, 비보호형의 하이드록시 디옥세탄의 수용성이 더 높은 디옥세탄인 것이 바람직하다. 하기 구조식에서 알 수 있듯이, 알칼리 포스파타아제에 의해 디옥세탄 인산염을 탈인산화하여 형성된 하이드록시 디옥세탄은, 수용성이 매우 높고 화학발광 증강제를 포함하여 이루어지는 조성물의 형태인 것이 특히 바람직하다. 이러한 디옥세탄 및 디옥세탄 조성물은, 가수분해 효소 또는 가수분해 효소 컨쥬게이트를 검출하는 일부 용액 검정법에서 중요하다.
본 발명의 더 상세한 배경 기술로서 그리고 후술되는 실시예에서 더욱 상세히 설명되는 바와 같이, 캡슐 화학 분석 원리에 근거하여 자동화 기기상에서 실시되는 검정에 종래의 화학발광성 디옥세탄 시약을 사용하는 경우, 시약이 하나의 유동성 분획에서 다른 유동성 분획으로 캐리오버(carryover)시키는 결과를 가져와, 결국에는 측정이 잠재적으로 부정확하게 되고 결과가 잘못되며 재현성이 없기 때문에 부정확한 결과를 가져오는 것으로 밝혀졌다. 캡슐 화학 분석에 대해서는 미국 특허 5,399,497호에 기재되어 있으며 이 특허는 전체로서 본 발명의 참조 문헌으로 이용되고 있다. 상기 캐리오버의 문제점을 극복하기 위한 여러 가지 가능한 수단중에서도 특히 하이드록시 디옥세탄의 수용성을 증가시키는 방법이, 캡슐 화학 분석 시스템의 인접하는 유동성 분획으로 상기 발광성 반응 중간체가 캐리오버되는 현상을 해소시키거나 또는 최소화시키는 것으로 추정되었다.
상업적 용도로 사용되는 디옥세탄 화합물은 알콕시기에 붙어있는 용해성 그룹을 전혀 포함하지 않는다. 따라서 이러한 디옥세탄은 캐리오버가 전혀 없을 것이 요구되는 검정법에 사용되기 부적절하다. 디옥세탄에 용해성 그룹을 도입하는 방법이 제안되었다(미국 특허 5,220,005호). 상기 특허 문헌에서는 아다만틸 치환기상에 카르복실 치환기를 포함하고 있는 디옥세탄을 청구하고 있으나, 이러한 디옥세탄의 제조 방법에 대해서는 기재하고 있지않다. 중요한 것은, 카르복실기의 부가가 디옥세탄의 용해도 및 다른 성질에 어떠한 영향을 미칠 수 있다면 그 효과가 무엇인지에 대해 개시하고 있지 않다는 것이다. 얼마나 많은 용해성 그룹이 필요한지 또는 용해성 그룹의 도입으로 인해 어떤 특별한 잇점이 생기는지에 대해서는 당업계에 알려져 있는 바가 없다. 발광을 개시하는 보호기의 제거를 방해하거나 그렇지 않으면 광 생성을 방해하는 그러한 용해성 그룹을 사용하는 것은 아무런 가치가 없다. 또한 발광 반응중에 제거될 수 있는 용해성 그룹 역시 마찬가지로 유용성이 없다.
공동-계류중인 본 출원인의 305 출원에서는, 하나의 음이온 용해성 그룹을 도입하는 것은 디옥세탄 인산염의 탈인산화 반응에 의해 생산되는 하이드록시 디옥세탄과 관련된 캐리오버 문제점를 해소하기에는 불충분하다는 것을 보여주었다. 이러한 문제를 해결하기 위해 디옥세탄 인산염의 하이드록시형 생성물의 수용성이 매우 높은 그러한 디옥세탄 인산염과, 상기 디옥세탄 인산염을 포함하는 개량된 조성물이 제공되었다. 곧이어, 캐리오버 문제점에 대한 해결책을 제공하는 디옥세탄은, 실온에서 저장 안정성이 떨어진다는 것이 발견되었다. 따라서, 당업계에 알려져 있는 디옥세탄중 하이드록시 다이옥세탄의 높은 수용성과 장기적인 저장 안정성을 동시에 갖춘 것은 아직 없다.
본 출원인은 08/748,107호 출원에서, 두 개의 음이온 용해성 그룹을 포함하는 알콕시기에 존재하는 하나의 수소원자를, 불소원자 또는 저급 알킬기로 치환하면, 디옥세탄의 저장 안정성이 놀라울 정도로 향상된다는 것에 대해서 개시하였다. 또한 이러한 디옥세탄의 합성 방법에 대해서도 개시하였다. 본 발명에서는, 더욱 개량된 디옥세탄의 합성 방법과 함께 이러한 합성과정에서 사용되는 중간체에 대해서도 개시하기로 한다.
도 1은 캐리오버가 문제점으로 되고 있는 캡슐 화학 분석 시스템을 나타낸 도면이다.
도 2는 캐리오버로 인한 발광이 관찰되는 것을 보여주는 캡슐 화학 분석 시스템에서의 인접 분획의 프로파일로서, 이에 대해서는 실시예에서 더욱 상세히 설명되어 있다.
도 3은 실시예에서 더욱 상세히 설명되고 있는 실험에서 관찰된 인접 분획의 다른 프로파일로서, 캐리오버는 광학적 캐리오버가 아니라는 것을 확인시켜 주는 도면이다.
도 4는 실시예에서 더욱 상세히 설명되고 잇는 실험에서 관찰되는 인접 분획의 프로파일로서, 캐리오버는 화학적 캐리오버라는 것을 확인시켜 주는 도면이다.
도 5는 불소로 치환된 디옥세탄, 염소로 치환된 디옥세탄, 메틸로 치환된 디옥세탄, 및 할로겐 원자를 전혀 포함하고 있지 않는 대조군으로서의 디옥세탄이 25℃에서 분해되는 상대적인 비율을 나타낸 그래프이다.
본 발명의 목적
본 발명의 목적은, 효소에 의해 분해 반응이 개시되는 1,2-다이이옥세탄으로서, 반응 개시 효소의 작용에 의해 생성된 하이드록시 디옥세탄의 수용성이 매우 높고 저장 안정성이 개선된 1,2-다이이옥세탄을 제공하는데 있다. 본 발명의 다른 목적은, 2개 이상의 수용성 이온화 그룹으로 치환되어 있고, 디옥세탄 구조의 알콕시 치환기상에 불소 원자 또는 저급 알킬기가 위치하고 있어 우수한 저장 안정성을 나타내는 1,2-디옥세탄을 제공하는데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은, 2개 이상의 수용성 이온화 그룹을 가지고 있고 불소 또는 저급 알킬기로 치환된 디옥세탄, 디옥세탄의 화학발광을 증강시키기 위해 사용하는 비폴리머성 양이온성 발광 증강제 및 임의적으로 첨가되는 형광제를 포함하여 이루어지는 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은, 캡슐 화학 분석 시스템에서 실시되는검정법에 사용될 때 반응 물질의 캐리오버 문제를 제거하고 저장 안정성이 증강된 디옥세탄 및 이를 포함하는 조성물을 제공하는 데 있다. 본 발명의 또 다른 목적은, 2개 이상의 수용성 이온화 그룹으로 치환되어 있고 디옥세탄 구조의 알콕시 치환기상에 불소 원자 또는 저급 알킬기가 위치하고 있는 1,2-디옥세탄의 합성 방법 및 그 합성 과정중에 사용되는 유용한 중간체를 제공하는 데 있다.
바람직한 실시예에 대한 상세한 설명
본 발명은 저장 안정성이 증가되고, 반응 유도 효소에 의해 형성된 하이드록시 디옥세탄의 수용성이 매우 높으며, 효소에 의해 화학 발광을 생산하는 디옥세탄에 관한 것이다. 상기 반응 유도성 디옥세탄은 미국 특허 5,399,497호에서 기재된 바와 같이, 캡슐 화학 분석 시스템에서 발광성 하이드록시 디옥세탄이 인접 분획으로 캐리오버되는 문제점을 제거하거나 또는 최소화 한다. 캐리오버란, 캡슐 화학 시스템에서 수용성이 낮은 발광성 물질이 분리용 유동액으로서 제공되는 불화탄소 오일로 용해, 침착, 또는 침전되는 결과로 인해 생길 수 있다. 반응 물질의 캐리오버는 부정확한 측정, 잘못된 결과, 및 비재현성으로 인한 부정확성을 초래한다.
함께 계류중인 305 출원에서, 수용액중에서 알칼리 포스파타아제의 화학발광을 검출하는데는 하기의 디옥세탄 1이 특히 효과가 있다는 것을 밝혔다.
비교군으로서 하나의 이온화 그룹만이 도입되어 있는 디옥세탄 2를 제조하였다. 디옥세탄 2는 앞에서 언급한 캐리오버 문제점을 해결하지 못하였다.
미국 특허 5,339,497호에 기재되어 있는 테스트 시스템에 상기 디옥세탄 1을 사용한 결과 캐리오버 문제를 완전히 해결하였다. 그러나, 곧바로 수용성 완충액 중에서의 디옥세탄 1 용액의 저장 안정성이 만족스럽지 못하다는 예상치 못했던 점이 드러났다. 알칼리 완충액중에 디옥세탄 1을 포함하는 용액은 25℃에서 2주간 저장된 후에 상당히 분해되었다. 사실 디옥세탄 1은 알콕시기상에 이온성 용해성 그룹을 갖지 않는 하기 구조식의 화합물 루미겐(Lumigen) PPD 보다 훨씬 덜 안정한 것으로 밝혀졌다.
본 출원인들이 아는한, 디옥세탄 화학분야에 있어서 디옥세탄 1의 안정성이 낮은 원인에 대해서는 알려진 바가 없다. 디옥세탄 1의 구조를 변형시켜 저장 안정성을 개선시키되 디옥세탄 1의 다른 유용한 성질은 그대로 유지시키는 방법이,함께 계류중인 본 출원인의 08/747,107호에 개시되어 있고 그 내용이 그대로 본 발명에 이용되고 있다.
정의 :
저장 안정성이란 자발적 반응에 의해 분해되는 디옥세탄의 분해율과 관련 있고 디옥세탄의 고유한 성질이라 할 수 있다. 반응 유도성 디옥세탄의 분해는, 디옥세탄의 보호기를 제거하는 반응에서 촉매로 작용하여 디옥세탄의 분해 반응을 개시시키는 촉매제가 미량으로 존재하는 상황하에서도 유도될 수 있다. 디옥세탄의 저장 안정성은 기지의 샘플에서 존재하는 디옥세탄의 양을 주기적으로 측정함으로써 평가할 수도 있다. 상기 측정방법은 디옥세탄의 양과 관련되는 성질을 측정하는 기존의 측정방법중 하나의 형태일 수 있다. 분광광도기, NMR 분광기 등과 같은 것들이 그 예가 될 수 있다. 편리한 한가지 방법은, 표준조건하에서 반응 개시제와 기지량의 디옥세탄을 반응시켜 생성되는 광량을 측정하는 것이다. 발생되는 광량 또는 광 강도가 감소되면 디옥세탄 화합물이 손실되었다는 것을 의미한다.
저장 안정성이란 디옥세탄이 완충 용액중에서의 용액 상태 또는 제제 상태로서의 안정성 뿐 아니라 디옥세탄의 순수 형태로서의 안정성도 의미한다. 상기 제제는 생성되는 광량을 증가시키거나 효소에 의한 반응 유도제의 활성을 증가시키기 위해 첨가되는 다양한 첨가제를 포함할 수 있다. 제제내의 디옥세탄은 주위 온도하에서 일정 기간동안 상당히 분해되지 않는 것이 바람직하다. 자동 분석기에 사용되는 조성물은 최소한 1주일 동안은 안정성이 유지되는 것이 바람직하다. 0 ~ 5℃로 냉장되는 경우에는 최소 2 ~ 3 개월 동안은 결코 상당히 분해되지 않는 것이 바람직하다. 더욱 바람직하기로는, 자동 분석기에 사용되는 조성물은 저장 안정성이 관찰되는 인디케이터에서 약 2 ~ 4주가 지날 때 까지 2 ~ 3% 이하의 변화를 보이는 것이다.
저장 안정성 문제점에 대한 해결책은 하기 화학식 1의 구조를 갖는 디옥세탄에서 발견되었다.
[화학식 1]
여기서, Z는 불소원자 및 C1 ~ C4 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, M은 수소, 알칼리 금속 이온 또는 4급암모늄 또는 포스포늄 이온으로부터 선택되고, R3 및 R4는 각각 비고리형, 고리형, 및 다중고리형 유기화합물기로부터 선택되는 것으로 헤테로원자에 의해 임의적으로 치환될 수 있으며 디옥세탄에 안정성을 제공하고, R2는 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 카르보닐, 카르복실, 아미노, 및 알킬아미노기로부터 선택되는 부가적인 치환기를 포함할 수 있는, 페닐 및 나프틸기로부터 선택되는 아릴고리기이고, X는 보호기로서, 활성화제에 의해 분리되어 산소음이온으로 치환된 디옥세탄을 형성하는데 이 디옥세탄은 분해되어 빛과 카르보닐기를 포함하는 두 개의 화합물을 생성하고, 이중 하나의 화합물은 하기 반응식에서 알 수 있듯이 두 개의 카르복실산염을 가지며 산소음이온으로 치환된 에스테르 화합물이다.
M이 수소인 경우에는 상기 각 디옥세탄 화합물은 카르복실산 그룹이 이온화되는 pH, 즉 약 pH 7이상의 조건에서만 사용하는 것이 바람직하다. 더 바람직하기로는 M 은 알칼리 금속이고 가장 바람직하기로는 나트륨 이온이다.
다른 실시예에서 상기 R3 및 R4는, 함께 결합하여 고리형 또는 다중고리형 알킬기인 R5가 되는데, R5는 디옥세탄 고리에 대해 융합된 구조(spiro-fused)를 가지며 열안정성을 제공하는 C6 내지 C30을 포함하고 수소가 아닌 치환기를 부가적으로 포함할 수 있다.
[화학식 2]
R5기는 더욱 바람직하기로는 다중고리그룹으로 그 중에서도 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 카르보닐, 카르복실, 페닐, 치환된 페닐, 아미노, 및 알킬아미노기로 부터 선택된 하나 이상의 치환기 R6가 공유결합되어 있는 아다만틸기 또는 치환된 아다만틸기인 것이 바람직하다.
[화학식 3]
본 발명의 또 다른 실시예에서는, R2 그룹은 페닐 또는 나프틸 그룹이다. R2 그룹은 하기 구조식에 나타나 있듯이 OX 그룹이 디옥세탄 고리에 대해 메타 위치로 있는 것이 특히 바람직하다. 상기 페닐 고리는 할로겐, 알킬, 치환된 알킬, 알콕시, 치환된 알콕시, 카르보닐, 카르복실, 아미노, 및 알킬아미노로 이루어진 군으로부터 선택되는 부가적인 고리 치환기 R7을 포함할 수도 있다. 몇가지 구조식의 예는 다음과 같다.
하기 구조식에서 보인 바와 같이, 상기 구조식 중 R6은 수소 또는 염소이고 R7은 염소인 후자의 두 개의 화합물이 더욱 바람직한 화합물로 인식된다.
상기 OX 그룹은, 분석에 사용되는 반응 유도제에 의해 규정되며, 하이드록실기, O-M+ 그룹 (여기서 M은 수소, 알칼리금속 이온 또는 4급암모늄 이온 또는 포스포늄 이온 중에서 선택되는 것임), OOCR8 그룹 (여기서 R8은 C1 ~ C8을 포함하고 헤테로원자를 임의적으로 더 포함하는 알킬 및 아릴기임), OPO3 -2염, OSO3 -염, 베타-D-갈락토시드옥시 및 베타-D-글루쿠로니딜옥시로부터 선택되는 것이다.
본 발명의 디옥세탄은 다음 구조식을 갖는다:
[화학식 4]
여기서, R2, R3, R4, M, 및 Z는 상술한 바와 같고, 함께 계류중인 본 출원인의 출원 08/748,107 및 디옥세탄 화학 분야에 공지되어 있는 기타의 방법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어 하기 구조식에서, RG는 치환가능한 원자 또는 그룹이고 X'는 수소 또는 알킬 그룹 또는 트리알킬시릴 그룹과 같은 치환가능한 원자 또는 그룹인, 케톤 및 에스테르는 낮은 원자가의 티타늄과 결합하여 비닐에테르 중간체를 형성한다. 제거가능한 그룹으로는 염소, 브롬, 및 요오드중에서 선택되는 할로겐 원자, 황산염, 토실레이트, 메실레이트 및 트리플레이트와 같은 술폰산염, 4급암모늄기 및 아자이드기와 같은 이탈기가 포함된다.
중간체인 비닐에테르는 하나 이상의 반응 단계를 거쳐 전구체인 비닐에테르 포스페이트로 전환한다. 합성의 편의를 위해서 하나의 제거기는 또 다른 제거기로 치환되는 것이 바람직하다. 상기 RG기는 Z-치환된 말로네이트에스테르와 반응과 이어서 에스테르기의 비누화 반응에 의해 CZ(COOM)2 로 치환된다. 상기 X'기는, X'기가 제거되고 X기 또는 보호기로 보호된 X기를 제공하는 반응물질과 반응함으로써 X와 X'기가 동일하지 않은 경우에는 X기로 전환된다. 예를 들어, X'기가 수소이고 X기가 PO3Na2인 경우, 이어 염기로 탈수소 처리한 다음 인산화 반응제와 반응시키면 포스포네이트 트리에스테르로 보호된 비닐에테르가 생성되고 이 화합물은 다시 트리에스테르가 가수분해되어 이나트륨염을 형성함으로써 인산염 화합물로 전환된다. 이러한 다단계 반응 공정에 있어서는 동일 반응 단계에서 2 이상의 작용이 일어나기도 하는데, 예를 들면 카르복실산에스테르 및 인산염에스테르의 가수분해가 동일한 반응 단계에서 일어날 수 있다.
전구체인 비닐에테르 인산염은 예컨대 염료를 광증감(sensitization)시켜서 발생되는 싱글렛 산소(singlet oxygen)의 부가와 같은 공지된 반응에 의해 디옥세탄으로 전환된다.
이러한 각 공정은 후술되는 실시예의 설명에 의해 예시된다. 특히, 반응식 1은 상술한 748,107 출원에서 개시되고 구체화된 바와 같이, 앞서 기술한 반응 단계에 따라 디옥세탄 3 내지 5의 제조에 사용되는 합성 경로를 보여주고 있다.
[반응식 1]
본 발명의 바람직한 일실시예는 하기 구조식Ⅳ의 디옥세탄 염화합물의 제조 방법에 관한 것으로;
상기 화합물은 저장 안정성이 증가된 화합물로서, R3 및 R4는 각각 비고리형, 고리형, 및 다중고리형 그룹으로 헤테로원자에 의해 임의적으로 치환될 수 있고 또 R3와 R4가 함께 결합하여 디옥세탄 고리에 융합된(spiro-fused) 고리 또는 다중고리 그룹을 형성할 수도 있으며, R2 그룹은 부가적인 치환기를 포함할 수 있는 페닐 및 나트틸 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되고, Z는 할로겐 및 C1 ~ C4를 포함하는 알킬기이며, M은 수소, 알칼리금속 이온 또는 4급암모늄 이온 또는 포스포늄 이온 중에서 선택되는 화합물로서, 상기 화합물의 제조 방법은 다음의 반응 단계를 포함한다;
a) 하기 구조식을 갖는 제 1 알켄 화합물 (여기서, RG는 Z-치환된 말로네이트 에스테르를 가진 제거가능기임)을
염기와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 말로네이트-치환 알켄 화합물을 생성하는 단계:
여기서 R'은 C1 ~ C4의 알킬기임;
b) 상기 말로네이트-치환된 알켄을, 일반식이 WP(O)Y2 (여기서, W와 Y는 각각 할로겐 원자임)인 인산화제와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 인산화 알켄 화합물을 형성하는 단계:
c) 상기 인산화 알켄 화합물을, 일반식이 Y'-OH (여기서, Y'는 치환되거나 또는 치환되지 않은 알킬기로부터 선택되는 것임)인 하이드록실 화합물과 반응시켜 하기 구조식을 갖는 제 2 인산화 알켄 화합물을 형성하는 단계:
d) 상기 두 번째 인산화된 알켄 화합물을, 일반식이 M-Q (여기서, Q는 염기성 음이온임)인 염기로 수용액 중에서 가수분해시켜 하기 구조식을 갖는 알켄 염화합물을 형성하는 단계: 및
e) 산소 및 알켄염 화합물의 존재하에서 수용액 중에서 광증감제를 조사시켜 상기 알켄염 화합물을 광산화시킴으로써 디옥세탄 염화합물을 형성하는 단계.
더욱 바람직하게는 상기 제조 방법은, R3 및 R4가 함께 결합하여 디옥세탄 고리에 융합된(spiro-fused) 단고리기 또는 다중고리기 R5를 형성하는, 하기 구조식을 갖는 디옥세탄 및 디옥세탄의 염화합물을 제조하는 데 사용된다:
본 발명의 다른 바람직한 제조 방법에서는, R2 그룹은 메타-페닐기이고, Z는 할로겐 또는 C1~ C4의 알킬기, 보다 바람직하게는 Z는 불소 또는 메틸기이고, M은 알칼리 금속 이온, 보다 바람직하게는 나트륨 이다.
저장 안정성이 증가된 하기 [화학식 Ⅳ]의 화합물이 다음 단계를 포함하는 개선된 방법에 의해 제조될 수 있는 것으로 발견되었다.
[화학식 Ⅳ]
여기서, R3 및 R4는 각각, 임의적으로 함께 결합하여 디옥세탄 고리에 융합된(spiro-fused) 단고리 또는 다중고리 그룹을 형성할 수 있는 가능한 비고리형, 단고리형, 및 다중고리형 유기 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되고, R2는 부가적인 치환기를 포함할 수도 있는 페닐 및 나프틸 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아릴고리 그룹이고, Z는 할로겐 원자 및 C1 ~C4의 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되며, M은 할로겐, 알칼리 금속 이온 또는 3급암모늄 또는 포스포늄 이온으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
a) 하기 구조식을 갖는 제 1 알켄 화합물 (여기서, RG는 Z-치환된 말로네이트 에스테르를 갖는 제거가능기임)을,
염기와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 말로네이트-치환된 알켄 화합물 (여기서, R'은 C1 ~ C4의 알킬기임)을 제조하는 단계:
b) 산소 및 말로네이트-치환된 알켄 화합물 존재하에서 광증감제를 조사하여 상기 말로네이트-치환된 알켄 화합물을 광산화시켜 하기 구조식을 갖는 말로네이트-치환된 디옥세탄을 형성하는 단계:
c) 상기 말로네이트-치환된 디옥세탄을, 일반식이 WP(O)Y2 (여기서 W는 할로겐 중에서 선택되고 Y는 할로겐 원자, 치환 또는 비치환된 알콕시기, 아릴옥시, 아랄킬옥시, 및 트리알킬실릴옥시 그룹중에서 선택되는 것임)인 인산화제와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 인산화된 디옥세탄 화합물을 형성하는 단계: 및
d) 상기 인산화 디옥세탄을 수용액중에서 일반식이 M-Q (여기서, Q는 염기성 음이온임)인 염기로 가수분해시켜 디옥세탄 염화합물을 형성하는 단계.
상기 제조 방법은, R3 및 R4가 서로 결합하여 디옥세탄 고리에 융합된(spiro-fused) 단고리 또는 다중고리 그룹인 R5를 형성하고 여기에 부가적으로 치환기를 포함할 수 있는 디옥세탄 및 디옥세탄염을 제조하는데 사용되는 것이 바람직하다. 상기 디옥세탄염은 하기의 구조식을 갖는다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서, R2는 부가적인 치환기를 포함할 수 있는 메타-페닐기이고, Z는 할로겐 또는 C1 ~ C4 의 알킬기, 더욱 바람직하기로는 불소 또는 메틸기이고, M은 알칼리 금속 이온, 더욱 바람직하기로는 나트륨인, 디옥세탄을 제조하는데 상기의 제조 방법이 사용된다.
제 1 알켄 화합물을 Z-치환된 말로네이트 에스테르 CHZ(COOR')2 및 염기와 반응시켜 말로네이트-치환된 알켄 화합물을 형성하는 단계는 일반적으로 DMSO, DMF, N,N-디메틸아세트아미드, N-메틸피롤리돈과 같은 비양성자성 극성 용매중에서 친핵성이 약한 염기 바람직하게는 소디움 하이드라이드 또는 포타슘 하이드라이드를 이용하여 이루어진다. 상기 반응은 반응 시간의 감소를 위하여 높은 온도에서 실시되는 것이 바람직한데, 일반적으로는 50 내지 150℃, 바람직하기로는 80 내지 120℃에서 반응시킨다. 제거기로는 염소, 브롬 및 요오드중에서 선택된 할로겐 원자, 황산염, 토실레이트, 메실레이트 및 트리플레이트와 같은 술폰산염, 4급암모늄기 및 아자이드 등이 있다.
본 발명에서 설명하는 개량 방법에 있어서, 상기 광산화 단계는 748,107 출원에 기재된 바와 같이, 전체 제조 공정의 최종 단계로서 포스페이트 알켄을 광산화하는 것이 아니라 중간체인 말로네이트-치환된 알켄에 대해 광산화가 진행된다. 이 단계에서, 페놀기를 갖는 상기 말로네이트-치환 알켄 화합물은 유기 용매에 용해되고 광증감제 및 산소 존재하에서 조사되어 말로네이트-치환된 디옥세탄을 형성한다. 통상적으로 가시광선을 이용하여 광증감제와 산소에 대해 광 조사하면 싱글렛 산소가 발생되는데 싱글렛 산소는 말로네이트-치환된 알켄의 비닐에테르형 이중 결합과 반응한다. 상기 광증감제는 용매에 용해될 수 있고 바람직하게는, 당업계에 흔하게 알려져 있듯이, 폴리머입자에 고정화되어 있다. 싱글렛 산소를 발생시키기에 유용한 광증감제로는 로즈 벤갈, 메틸렌 블루, 에오신, 테트라페닐포르피린 (TPP)의 금속 복합체, 특히 아연과 마그네슘과 C60 복합체가 포함된다. 그러나 이에만 한정되는 것은 아니다. 유기 용매로는 CH2Cl2, CHCl3 및 CCl4와 같은 할로겐화탄소, 중수소화 할로겐화탄화수소, 저분자량케톤 및 이의 중수소화 유사체, 지방족 탄화수소와 방향족 탄화수소 및 이들의 중수소화 유사체가 바람직한데, CH2Cl2가 가장 바람직하다. 유기 용매중에서 광산화를 유도하면 싱글렛 산소가 존재하는 시간이 최대가 되는 반응 매질이 제공된다는 잇점이 있다. 이는 반응시간을 상당히 단축하는 효과가 있으며 광산화가 좀더 신속하게 진행되어 완결되도록 하는 효과를 가진다. 생성물의 분리 역시 용이해지는데 대부분의 경우 단순히 광증감제를 여과하고 용매를 증발시키기만 하면 된다.
상기 말로네이트-치환된 디옥세탄과 WP(O)Y2의 식을 갖는 인산화제 (여기서 W는 할로겐중에서 선택되고 Y는 할로겐 원자, 치환된 또는 치환되지 않은 알킬옥시기 및 트리알킬실릴옥시중에서 선택됨)가 반응하여 인산화된 디옥세탄 화합물을 형성하는 반응단계는 유기용매중에서 수행된다; 상기 유기용매는 아민 염기 존재하의 CH2Cl2 또는 CHCl3와 같은 할로겐화탄화수소 또는 디에틸에테르와 같은 에테르 또는 테트라하이드로퓨란 (THF)인 것이 바람직하다. 아민 염기로는, 피리딘 및 트리에틸아민 등이 유용하나, 이에만 한정되는 것은 아니다. Y가 치환된 또는 치환되지 않은 알킬옥시, 아릴옥시, 아랄킬옥시 또는 트리알킬실릴옥시 그룹이면, Y 그룹은 대표적으로는, 예를 들어 OCH3, OCH2CH3와 같은 알콕시 그룹, 시아노에톡시 (OCH2CH2CN) 또는 트리메틸실릴에톡시 (OCH2CH2Si(CH3))와 같은 알콕시, 페녹시, 치환된 페녹시, 벤질옥시, 트리메틸실릴옥시 및 기타 당업계에 일반적으로 공지되어 있는 것들이 포함된다. 상기 두 개의 Y기는 서로 결합하여 하기 시약에서와 같이 에틸렌디옥시와 같은 단일 그룹으로 될 수도 있다.
Y기는 시아노에톡시 그룹인 것이 바람직하다. 더 바람직하게는 Y는 할로겐, 바람직하기로는 Y와 W가 모두 Cl이다.
상기 인산화 단계는 약 -78℃ 내지 약 25℃에서 용액중에서 수행된다. 약 0℃ 내지 5℃의 온도가 특히 편리하다. 반응 용액이 뜨거워지는 것을 방지하기위해 인산화제인 WP(O)Y2를 조절해가며 첨가한다. 상기 인산화제는 아민 염기, 바람직하게는 피리딘과 함께 부가되는 것이 바람직하다.
가수분해 또는 보호기를 제거하는 단계는, 상기 인산화된 디옥세탄을 수용성 용매중에서 화학식이 M-Q인 염기로 가수분해시킴으로써 이루어진다. 여기서, 상기 Q는 보호기인 Y와 R'을 제거시켜 디옥세탄 염화합물을 형성하기에 충분한 양의 염기성 음이온이다. 상기 용매로는 물, 수성완충액 또는 물과 한 종류 이상의 유기 용매와의 혼합물이 포함될 수 있다. 바람직한 유기 용매로는 메탄올, 에탄올, 아세톤 및 THF와 같이 물과 섞일 수 있는 용매가 포함된다. 통상적으로는 4 당량의 염기가 요구되나 편의상 과량으로 사용하는 것이 가능하다. 보호기는 동시에 제거되거나 또는 연속적으로 제거될 수 있다. Y 및 R'의 특정 그룹 및 염기에 따라 부분적으로 가수분해된 중간체를 분리하는 것이 가능할 수도 있고 가능하기 않을 수도 있다.
보호기를 제거하는 염기의 선택은, 어느 정도는 제거기인 Y 및 R'의 성질에 의해 결정될 것이다. 또한 보호기 제거제는, 보호기로 보호된 디옥세탄이 제조되는 과정에서 디옥세탄 고리 그룹의 분해, 또는 비닐에테르 인산염이 일차적으로 제조되는 과정에서 비닐에테르기가 가수분해되는 것과 같은 바람직하지 못한 부반응을 일으키는 것이어서는 안된다. 바람직한 보호기 제거제에는, 수산화나트륨, 수산화칼륨, 탄산칼륨, 메톡시나트륨, 에톡시나트륨, t-부톡시칼륨, 암모니아, 수산화암모늄 등과 같은 유기 및 무기 염기가 포함된다. 또 다른 바람직한 보호기 제거제로는 시안 이온, 불소 이온과 같은 친핵성 시약이 포함된다.
본 발명의 다른 실시예에 있어서, 말로네이트-치환된 디옥세탄 화합물과 인산화제를 반응시키는 과정에는 다음의 단계들이 포함된다:
a) 말로네이트-치환된 디옥세탄 화합물과 화학식이 WP(O)Y'2 (여기에서 W 및 Y'은 각각 할로겐 원자임)인 인산화제를 반응시켜 하기 구조식을 갖는 할로겐화 인산 디옥세탄을 형성하는 단계; 및
b) 상기 할로겐화 인산 디옥세탄 화합물과, 화학식이 Y-OH (여기서, Y는 치환된 또는 치환되지 않은 알킬기로부터 선택되는 것임)인 하이드록실 화합물을 반응시켜 인산화된 디옥세탄 화합물을 형성하는 단계.
상기 할로겐화 인산 디옥세탄 화합물은, 2 당량 이상, 바람직하게는 과량의 하이드록실 화합물과 반응하여 인산화된 디옥세탄 화합물로 전환된다. 상기 하이드록실 화합물 Y-OH로 작용할 수 있는 화합물의 예로는, 메탄올 및 에탄올 같은 저급 알콜, 3-하이드록시프로피오니트릴 (HOCH2CH2CN) 및 2-트리메틸실릴에탄올과 같은 치환된 저급 알콜, 페놀, 치환된 페놀, 벤질 알콜 및 기타 일반적으로 공지되어 있는 것들이 포함된다.
다른 면에서, 본 발명은 디옥세탄의 제조에 사용되는 합성 중간체에 관한 것이다. 특히 하기의 신규 중간체 화합물이 유용하다.
또한, 하기의 신규한 디옥세탄 화합물은 본 발명의 디옥세탄 화합물의 제조에 있어 합성 중간체로서 유용하다.
이러한 개선된 제조 방법에 의해 본 발명의 디옥세탄을 합성하는 예가 하기 반응식 2에 나타나 있다.
[반응식 2]
상기 한 합성 공정에서 출발 물질 (전구체 알켄)은 하기의 구조식을 가지며:
여기서, RG는 제거기로서 당업계에 공지되어 있는 방법에 의해 제조될 수 있다. 그중 한가지 방법에서 상기 비닐 에테르 그룹은, 미국 특허 4,983,779호 및 4,982,192호에 기재된대로 R3R4C=O 케톤과 HOR2COOCH2CH2-G 에스테르를 Ti를 매개로하여 커플링 반응을 시킴으로써 제조된다. 여기서 G는 상기 RG와 동일한 그룹이거나 또는 RG로 치환되거나 전환될 수 있는 그룹이다. RG가 요오드 원자이고 G가 염소 원자인 합성 방법의 예를 이하에서 설명하기로 한다. 편의상 상기 커플링 반응의 에스테르 성분은 보호기로 보호된 형태로 사용될 수 있는데, 즉 하이드록실기가 실릴에테르 또는 알킬에테르와 같이 보호된(masked) 형태로 존재하는 것으로 인식되어 있다. 상기 커플링 반응 후에, 일반적인 합성 방법에 의해 유리 하이드록실기가 방출된다.
더욱이, 상기 비닐에테르를 제조하는 방법에 있어서, 기존에 보고된 방법이 아닌 신규 방법에 의해서도 상기 전구체 알켄이 제조될 수 있다는 것이 본 발명의 발명자들에 의해 밝혀졌다. 앞서 말한 Ti-매개형 방법은, G 또는 RG기를 포함하는 개별적인 에스테르 화합물을 제조해야 하고 이와 더불어 복잡하고 비용이 드는 반면, 신규 방법은 상업적으로 구입할 수 있는 출발 물질로부터 제조될 수 있는 통상의 비닐에테르 중간체를 이용한다.
신규 방법에 의해 상기 전구체 알켄을 제조하는 반응예의 하나는 다음과 같다. 저급 알킬 비닐 에테르 화합물(여기서 저급 알킬 R9는 C1 - C4의 직쇄 또는 분지쇄 알킬기임)은 1 몰당량 이상의 또 다른 알콜 R10-OH, 예컨대 HOCH2CH2G의 화학식을 갖는 알콜 존재하에서 촉매량의 수은염과 반응하여 목적하는 전구체 알켄을 생산한다.
화학식이 CH2=CHORa인 치환되지 않은 비닐 에테르가 화학식이 CH2=CHORb인 치환되지 않은 다른 비닐 에테르기로 전환시키는 방법은 공지되어 있으며 문헌에 기재되어 있고(예:W.H. Watanabe and L.E. Conlon, J. Am. Chem. Soc, 79, 2828 (1957)), 수은염이 촉매로 작용하는 반응에 의해 본 발명의 제조 방법에 사용되는 삼치환된 알켄을 제조하는 방법은 발명자가 아는한 아직 보고된 바가 없다.
이러한 반응 공정에 있어서, R3 및 R4는 각각 비고리형, 고리형 및 다중고리형 유기 그룹 중에서 선택되는 것으로 이들은 헤테로원자에 의해 임의적으로 치환될 수 있고 임의적으로 상호 결합하여 디옥세탄 고리에 융합된(spiro-fused) 고리형 또는 다중고리기 R5를 형성할 수 있고, R2는 부가적인 치환기를 포함할 수 있는 페닐 및 나프틸 그룹으로부터 선택되는 아릴고리 그룹이다. 알켄 전구체를 본 발명의 디옥세탄으로 제조하기 위해 상기 수은-촉매 반응을 사용하는 예중 하나는 다음과 같다.
여기서, G는 염소 원자이다. 상기 수은염으로는 상기 비닐에테르기에 대해 촉매로 작용할 수 있는 수은(Ⅱ)염이면 모두 가능한데, 아세테이트 또는 트리플루오로아세테이트와 같은 약산의 염이 바람직하다. 상기 수은염은 촉매량 정도 사용되는데 일반적으로는 알켄 1몰당 0.01 내지 0.5몰이 사용되고 더 일반적으로는 0.05 내지 0.25몰 정도가 사용된다. 상기 알콜 성분인 R10-OH는 알카놀, 치환된 알카놀, 벤질 알콜, 알릴 알콜과 같은 불포화 알콜일 수 있다. 상기 알콜은 알켄 1몰당 적어도 알콜 2몰, 바람직하게는 알켄 1몰당 알콜 5몰 이상으로 과량 사용한다. 바람직한 제조 방법에 있어서, 상기 알콜은 반응 용매로 사용된다. 상기 반응은 일반적으로 주위 온도 보다 높고 용매의 비점온도에 이르는 정도의 온도 범위에서 일어나지만 반드시 그런 것은 아니다. 바람직한 반응 온도는 70 내지 120℃ 이다. 반응 물질의 용해도를 향상시키거나 극성 또는 비점을 변화시키기 위하여 부가적인 용매를 사용할 수 있다.
상술한 수은-촉매에 의한 비닐에테르 교환 반응은 특히 본 발명의 수용성 삼치환 디옥세탄을 보다 개선시키는데 필요한 중간체를 제조하는데 용도로 사용되나, 더 일반적으로는 다양한 알켄 또는 비닐 에테르 화합물의 제조에 사용될 수 있다.
구체적인 실시예
불소로 치환된 디옥세탄 1의 유사체인 디옥세탄 3, 염소로 치환된 유사체인 디옥세탄 4 및 메틸로 치환된 유사체인 디옥세탄 5를 제조하여 이들의 저장 안정성을 몇 주에 걸쳐 평가하였다. 비교군으로서 상기 디옥세탄 1의 용액의 저장 안정성을 측정하였다. 디옥세탄 자체만 다르고 조성은 동일하게 한 상기 치환체들의 용액을 제조하였다. 일정량의 시험 용액과 일정량의 알칼리 포스파타아제를 사용하여 화학발광 효소 검정법에 의하여 안정성을 평가하였고 25℃에서 평탄역(plateau)의 광 강도를 측정하였다. 예상외로 디옥세탄 3 및 디옥세탄 5를 포함하는 수용액이 디옥세탄 1보다 실질적으로 안정하였고 다이옥세탄 4는 그렇지 못하였다. 디옥세탄 3 또는 5 용액은 25℃에서 4주가 경과한 후에도 본질적으로 분해 반응이 일어나지 않았다. 놀랍게도, 디옥세탄 4의 저장 안정성은 디옥세탄 1의 안정성보다 실질적으로 떨어졌다.
상기 4 종류의 디옥세탄이 성질상 차이를 보이는 이유에 대해서는, 현재로서는 밝혀져 있지 않다. 특히 중요한 것은 디옥세탄 3 과 4는 저장 안정성에 있어 상당히 두드러진 차이를 보이는데 이들은 구조적으로 서로 다른 할로겐 치환기를 갖는다는 사실만이 다를 뿐 이다. 본 발명자가 아는한 디옥세탄 화학분야에 있어서 이러한 결과를 설명하거나 또는 예측한 자료는 없다.
나아가 디옥세탄 3에 대한 시험으로, 디옥세탄 1과 같이 디옥세탄 3은 캡슐 화학 검정 시스템에서 캐리오버를 전혀 일으키지 않는다는 것을 알았다. 따라서, 두 개의 카르복실산염 그룹과 불소 원자 또는 저급 알킬 그룹중의 하나를 갖는 치환기를 포함하고 있는 디옥세탄 3 및 5와 같은 디옥세탄 및 이를 포함하는 조성물은 캡슐 화학 분석 시스템에 사용되는 공지의 다른 디옥세탄 및 그 조성물보다 우수하다.
본 발명의 다른 일면은, 화학발광성이 증가된 조성물을 제공하는 것이다. 화학발광성이 증가된 조성물은 매우 높은 분석 감도를 요구하는 검정에 있어서 유리하다. 디옥세탄의 자발적 분해반응으로 인한 외부 발광을 그대로 유지시키거나 또는 감소시키면서도 디옥세탄의 분해 반응의 화학발광 효율을 증가시키는 방법은, 감도를 증가 또는 향상시킬 수 있는 하나의 방법중의 하나이다.
따라서, 본 발명은 상술한 바와 같이 저장 안정성이 증가된 발광성의 안정한 1,2-디옥세탄과 양이온성 증강제를 포함하는 조성물에 관한것이기도 하다. 화학발광성을 증가시키는 조성물은 상술한 바와 같이 수용액 상태의 디옥세탄과, 증강제가 존재하지 않는 상태에서 생성된 광의 양과 비교하여 활성화제와 디옥세탄의 반응에 의해 생성되는 광의 양을 더 증가시키는 비폴리머성 양이온 증강제를 포함한다. 상기 증강제는 하기 화학식을 갖는 2가 양이온성(dicationic) 계면활성제인 것이 바람직하다:
여기서, 각각의 A는 인 및 질소 원자로부터 개별적으로 선택되고, Link는 치환 및 치환되지 않은 아릴, 알킬, 알케닐 및 알키닐 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 두 개 이상의 탄소원자를 포함하는 유기 결합 그룹으로서 헤테로 원자를 포함할 수 있고, R은 C1 ~ C20의 저급 알킬 또는 아랄킬기로부터 선택되고, Y는 음이온이다. 상기 증강제는 하기 화학식을 갖는 2가 양이온성 계면활성제인 것이 특히 바람직하다:
여기서, Link는 페닐렌이다.
화학발광성을 증가시키는 본 발명의 조성물은, 보충적인 증강제로서 하나 이상의 형광 물질을 임의적으로 포함할 수 있다. 형광물질로는 에너지 전달을 통해 생성된 광의 양을 증가시킬수 있는 화합물이 유용하다. 음이온성 형광물질은 양이온성 증강제와 유리한 정전학적 상호작용을 하므로 특히 효과가 있다고 믿어진다. 특히 바람직한 형광물질에는 음이온성 화합물로서 피라닌과 플루오레신이 포함되나 반드시 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 다양한 면들을 좀 더 상세히 설명하기 위해, 본 발명을 예시하는, 그러나 본 발명이 이에 한정되는 것은 아닌, 구체적인 실시예를 설명하고자 한다.
실시예 1. 디옥세탄 1의 제조
본 발명자들의 미국 특허 5,631,167호에 기재되어 있는 반응 순서에 따라 디옥세탄 [4-(3,3-비스카르복시)프로폭시)-4-(3-포스포릴옥시페닐)]스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로-[3.3.1.13,7]데칸]) 테트라소디움염을 제조하였다. 중간체 알켄인 [(3-하이드록시페닐)-(2-요오드에톡시)-메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸까지의 합성은 본질적으로는 미국 특허 5,013,827호 및 5,068,339호에 기재된 바에 따라 이루어졌다.
실시예 2. 디옥세탄 2의 제조
본 발명자들의 미국 특허 5,631,167호에 기재된 바에 따라 디옥세탄 [4-(3-카르복시프로폭시)-4-(3-포스포릴옥시페닐)]스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.13,7]-데칸] (2)을 제조하였다. 중간체 알켄 [(3-카르복시프로폭시)-(3-하이드록시페닐)메틸렌트리시클로[3.3.1.13,7]-데칸]까지의 합성은 본질적으로는 미국 특허 5,013,827호 및 5,068,339호에 기재된 바에 따라 이루어졌다.
실시예 3. 디옥세탄 3의 제조
상기 디옥세탄은 이하 기술하는 반응 순서에 따라 제조하였다. 중간체 알켄 [(3-하이드록시페닐)-(2-요오드에톡시)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸은 실시예 1에서와 같은 방법으로 합성하였다.
(a) [((3,3-비스카르보에톡시)-3-플루오로프로폭시)-(3-하이드록시페닐)메틸렌트리시클로[3.3.1.13,7]데칸의 합성.
소디움 하이드라이드 (오일에 60% 분산된 분산액으로서 75㎎)를 헥산으로 세척하여 오일을 제거하고 진공상태에서 건조시킨 후 여기에 4㎖의 무수 DMSO를 부가하였다. 디에틸 플루오로말로네이트 (0.3g)를 첨가한 후 이 현탁액을 아르곤 기체환경하에서 15분간 교반하였다. 상기 반응 혼합액에, 무수 DMSO 5㎖와 요오드에톡시 알켄 (0.5g)로 이루어진 용액을 부가하였다. 다음 상기 반응 혼합액을 100℃로 가열하고 2시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후 상기 반응액을 30㎖의 에틸아세테이트로 희석시켰다. 상기 에틸아세테이트 용액을 물로 서너차례 추출하고 증발건조시켰다. 헥산중에 5 내지 20%로 함유되어 있는 에틸아세테이트를 이용하여 상기 비정제 생성물을 크로마토그래피하여 수율 45%로 목적 화합물(0.25g)을 얻었다: 1H NMR (CDCl3) δ1.28(t, 6H), 1.66 - 1.95(m, 12H), 2.45(t, 1H), 2.52(t, 1H), 2.67(br s, 1H), 3.20(br s, 1H), 3.52(t, 2H), 4.23 - 4.30 (q, 4H), 6.74 - 7.22 (m, 4H).
(b) [((3,3-비스카르보에톡시)-3-플루오로프로폭시-(3-(비스-(2-시아노에틸)포스포릴옥시)페닐)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸의 합성.
아르곤분위기 하에서 10㎖의 CH2Cl2가 담겨있는 플라스크를 얼음 용기안에서 냉각시켰다. 피리딘 (1.71㎖)을 부가하고 이어서 POCl3 (0.61㎖)를 천천히 부가한 후 15분 동안 계속 교반하였다. 10㎖의 CH2Cl2중에 상기 (a)단계로부터 얻은 알켄 (0.972g)을 혼합한 용액을 적가하였다. 얼음 용기를 제거한 후 상기 용액을 2.5시간동안 교반하였다. 이 용액에 1.71㎖의 피리딘과 1.44㎖의 2-시아노에탄올을 부가하였다. 상기 반응 혼합액을 12 내지 15시간 동안 교반하여 백색의 침전물을 형성하였다. 상기 혼합액을 CH2Cl2로 희석하고 50㎖의 물로 네차례 세척하였다. 상기 CH2Cl2 추출액을 증발건조시켰다. 비정제 생성물을 헥산중 75% 에틸아세테이트 용액을 이용하여 크로마토그래피법으로 정제하였다. 총 1.2g의 오일 (88%)을 얻었다: 1H NMR (CDCl3) δ1.29(s, 6H), 1.79 - 1.97(m, 12H), 2.46 - 2.53(2t, 2H), 2.63(br s, 1H), 2.83(t, 4H), 3.20(br s, 1H), 3.50(t, 2H), 4.24 - 4.31 (q, 4H), 4.35 - 4.51 (m, 4H), 7.13 - 7.36 (m, 4H); 31P NMR (CDCl3) δ-9.49 (p)
(c)[(3,3-비스카르복시-3-플루오로프로폭시)-(3-포스포릴옥시페닐)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸 테트라소디움염의 합성.
상기 (b)단계에서 얻은 알켄 (1.2g)을 20㎖의 아세톤에 용해시켰다. 물 4㎖중에 수산화나트륨 297㎎을 용해시킨 용액을 첨가한 다음, 이 용액을 밤새 교반하는 동안 침전물이 형성되었다. 상층액을 따라낸 후 침전물을 5㎖의 아세톤으로 10차례 세척하였다. 진공상태에서 건조시켜 백색의 고체 (1.0g)를 얻었다: 1H MNR (D2O) δ1.75-1.89 (m, 12H), 2.29(t, 2H), 2.37(t, 2H), 2.57(br s 1H), 3.12(br s, 1H), 3.56(t, 2H), 6.99-7.30(m, 4H): 31P NMR (D2O) δ 0.69 (S).
(d) [4-(3,3-비스카르복시)-3-플루오로프로폭시)-4-(3-포스포릴옥시페닐)]스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.13,7]데칸] 테트라소디움염 (3)의 합성.
상기 (c)단계에서 얻은 알켄 (348.6㎎)을 10㎖의 중수(D2O)에 용해시켰다. 폴리머에 결합된 로즈 벤갈 (500㎎)을 10㎖의 p-다이옥산에 현탁하여 상기 수용액에 부가하였다. 상기 반응 혼합액에 5℃ 내지 8℃로 냉각시키고, 산소기포가 생기기 시작하면 5 mil KAPTON 필터를 통해 나트륨 램프로 상기 혼합액을 조사하였다. 전체 2.5시간이 경과한 후 폴리머 비드를 여과시켜 버리고 상기 용액을 증발 건조하여 백색의 고체 (3)을 얻었다. 1H NMR (D2O) δ 0.93 - 1.79 (m, 12H), 2.19(br s, 1H), 2.41 - 2.49(m, 2H), 2.97(br s, 1H), 3.40 - 3.49(m, 2H), 7.19 - 7.42(m, 4H); 31P NMR (D2O) δ0.575 (s).
실시예 4. 디옥세탄 4의 제조
상기 디옥세탄을 이하 서술하는 반응 순서에 따라 제조하였다. 중간체 알켄 [(3-하이드록시페닐)-(3,3-비스카르보에톡시)프로폭시메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸은 실시예 1에서 기재한 방법대로 합성하였다.
(a) [((3,3-비스카르보에톡시)-3-클로로프로폭시)-(3-하이드록시페닐)메틸렌트리시클로[3.3.1.13,7]데칸의 합성.
건조상태의 THF 10㎖에 (3,3-비스카르보에톡시프로폭시)-(3-하이드록시페닐)메틸렌트리시클로[3.3.1.13,7]데칸 (1.2g)으로 이루어진 용액을, 아르곤하 -78℃에서 건성 THF 25 내지 30㎖에 LDA 2.4당량이 용해되어 있는 용액에 부가하였다. 상기 반응액을 -78℃에서 30분 동안 교반한 후 15㎖의 건성 THF에 N-클로로숙신이미드(0.56g)이 용해된 용액으로 처리하였다. 상기 반응액을 한 시간 이상 실온으로 될 때까지 데운 다음다시 한 시간동안 교반하였다. 상기 THF를 진공에서 제거하고 잔류물을 100㎖의 에틸아세테이트에 용해시켰다. 상기 유기 용액을 물로 세척하고 증발건조시켰다. 정제되지 않은 생성물질을 칼럼 크로마토그래피로 분리하였다. 1H NMR (CDCl3) δ1.23(t, 6H), 1.7 - 2.00(m, 12H), 2.57(t, 2H), 2.65(br s, 1H), 3.2(br s, 1H), 3.56(t, 2H), 4.22(q, 4H), 6.65 - 7.25(m, 4H).
(b) [((3,3-비스카르보에톡시)-3-클로로프로폭시-(3-(비스-(2-시아노에틸)포스포릴옥시)페닐)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸의 합성.
아르곤 분위기하에서 10㎖의 CH2Cl2가 담겨있는 플라스크를 얼음 용기안에서 냉각시켰다. 피리딘 (1.5g)을 부가하고 이어서 POCl3 (1.82g)를 천천히 부가한 후 15분 동안 계속 교반하였다. 상기 (a)단계로부터 얻은 알켄 (1.5g)과 피리딘 1.5g이 용해된 25㎖의 CH2Cl2를 적가하였다. 얼음 용기를 제거한 후 상기 용액을 1 시간동안 교반하였다. 이 용액을 얼음 용기안에서 다시 냉각시킨 후 이어서 3.0g의 피리딘과 2.8g의 2-시아노에탄올로 처리하였다. 상기 반응 혼합액을 12 내지 15시간 동안 교반하여 백색의 침전물이 형성하였다. 상기 혼합액을 CH2Cl2로 희석하고 물로 세척하였다. 상기 CH2Cl2 추출액을 증발건조시켰다. 비정제 생성물을 50%의 에틸아세테이트 헥산용액을 이용하여 크로마토그래피법으로 정제하였다. 총 1.4g의 오일 생성물을 얻었다: 1H NMR (CDCl3) δ1.278(t, 6H), 1.80 - 1.97(m, 12H), 2.565(t, 2H), 2.63(br s, 1H), 2.826(t, 4H), 3.20(br s, 1H), 3.556(t, 2H), 4.271(q, 4H), 4.40 - 4.47 (m, 4H), 7.15 - 7.36 (m, 4H).
(c) [(3,3-비스카르복시-3-클로로프로폭시)-(3-포스포릴옥시페닐)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸 테트라소디움염의 합성.
상기 (b)단계에서 얻은 알켄 (0.9g)을 25㎖의 아세톤에 용해시켰다. 물 3㎖에 염화나트륨 0.22g을 용해시킨 이루어진 용액을 부가하였다. 상기 용액을 밤새도록 교반하자 교반 중에 침전물이 형성되었다. 액체를 따라낸 후 침전물을 아세톤으로 세척하였다. 상기 백색의 고체를 여과시켜 아세톤으로 더 세척한 후에 진공상태에서 건조시켰다: 1H NMR (D2O) δ1.77 - 1.92 (m, 12H), 2.422(t, 2H), 2.59(br s , 1H), 3.15(br s, 1H), 3.635(t, 2H), 7.02 - 7.33(m, 4H).
(d) [4-(3,3-비스카르복시)-3-클로로프로폭시)-4-(3-포스포릴옥시페닐)]스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.13,7]데칸] 테트라소디움염 (4)의 합성.
상기 (c)단계에서 얻은 알켄 (35㎎)을 1.0㎖의 중수(D2O)에 용해시켰다. 폴리머에 결합된 로즈 벤갈 (500㎎)을 1.0㎖의 p-다이옥산-d8에 5분 동안 담근 다음 상기 수용액에 부가하였다. 상기 반응 혼합액을 0℃로 냉각시키고, 산소 기포가 발생하기 시작하면 5 mil KAPTON 필터를 통해 45분 동안 나트륨 램프로 상기 혼합액을 조사하여 표제 4 화합물을 생성하였으며 NMR로 확인하였다. 상기 혼합액을 여과하고 여과된 용액을 효소 검정을 위해 완충액으로 희석하였다: 1H NMR (D2O) δ 1.05 - 1.96 (m, 12H), 2.19(br s, 1H), 2.60 - 2.62(m, 2H), 3.07(br s, 1H), 3.56 - 3.58(m, 2H), 7.25 - 7.44(m, 4H).
실시예 5. 디옥세탄 5의 제조
하기 반응순서에 따라 상기 디옥세탄을 제조하였다. 중간체 알켄 [(3-하이드록시페닐)-(2-요오드에톡시)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸은 실시예 1에 기재되어 있는 방법대로 합성하였다.
(a) [((3,3-비스카르보에톡시부톡시)-(3-하이드록시페닐)메틸렌트리시클로[3.3.1.13,7]데칸의 합성.
소디움 하이드라이드 (오일에 60% 분산된 분산액으로서 0.866g)를 헥산으로 세척하여 오일이 전혀 없게하고 진공상태에서 건조시킨 후 여기에 15㎖의 무수 DMSO를 부가하였다. 디에틸 메틸말로네이트 (2.4g)를 첨가한 후 이 현탁액을 아르곤 분위기하에서 15분간 교반하였다. 상기 반응 혼합액에, 무수 DMSO 15㎖에 요오드에톡시 알켄 (2.8g)을 용해시킨 용액을 부가하였다. 상기 반응액을 100℃로 가열하고 2시간 동안 교반하였다. 냉각시킨 후 상기 반응액을 30㎖의 에틸아세테이트로 희석시켰다. 상기 에틸아세테이트 용액을 물로 서너 차례 추출하고 증발건조시켰다. 정제되지 않은 생성물을 5 내지 20%의 에틸아세테이트 헥산용액을 이용하여 크로마토그래피법으로 정제하여 수율 25%로 목적 화합물(0.80g)을 얻었다: 1H NMR (CDCl3) δ1.208(t, 6H), 1.347(s, 3H), 1.76 - 1.96(m, 12H), 2.20(t, 2H), 2.66(br s, 1H), 3.20(br s, 1H), 3.41(t, 2H), 4.09 - 4.17 (q, 4H), 6.78 - 7.26 (m, 4H).
(b) [((3,3-비스카르보에톡시부톡시)-3-(비스-(2-시아노에틸)포스포릴옥시)페닐)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸의 합성.
아르곤 분위기하에서 15㎖의 CH2Cl2가 담겨있는 플라스크를 얼음 용기안에서 냉각시켰다. 피리딘 (1.38g)을 부가하고 이어서 POCl3 (0.8g)를 천천히 부가한 후 15분 동안 계속 교반하였다. 상기 (a)단계로부터 얻은 15㎖의 CH2Cl2에 용해되어 있는 알켄 (0.8g)을 적가하였다. 얼음 용기를 제거한 후 상기 용액을 1 시간동안 교반하였다. 이 용액을 얼음 용기안에서 다시 냉각시킨 후 이어서 1.38g의 피리딘과 1.24g의 2-시아노에탄올로 처리하였다. 상기 반응 혼합액을 12 내지 15시간 동안 교반하여 백색의 침전물을 형성하였다. 상기 혼합액을 CH2Cl2로 희석하고 50㎖ 물로 4차례 세척하였다. 상기 CH2Cl2 추출액을 증발 건조시켰다. 정제되지 않은 생성물을 75%의 에틸아세테이트 헥산용액을 이용하여 크로마토그래피하여 정제하였다. 총 1.4g의 오일 생성물을 얻었다: 1H NMR (CDCl3) δ1.208(t, 6H), 1.34(s, 3H), 1.78 - 1.97(m, 12H), 2.18(t, 2H), 2.61(br s, 1H), 2.81(t, 4H), 3.21(br s, 1H), 3.41(t, 2H), 4.09 - 4.16(q, 4H), 4.37 - 4.46(m, 4H), 7.14 - 7.34(m, 4H).
(c) [(3,3-비스카르복시부톡시)-(3-포스포릴옥시페닐)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸 테트라소디움염의 합성.
상기 (b)단계에서 얻은 알켄 (0.47g)을 14㎖의 아세톤에 용해시켰다. 물 3㎖에 수산화나트륨 0.117g을 용해시킨 용액을 부가하였다. 상기 용액을 밤새도록 교반하여 교반 중에 침전물이 형성되었다. 액을 따라낸 후 침전물을 5㎖의 아세톤으로 10차례 세척하였다. 진공상태에서 건조시킨 후 백색의 고체 (0.383g, 92%)를 얻었다: 1H MNR (D2O) δ1.09(s, 3H), 1.75 - 1.90(m, 12H), 2.00(t, 2H), 2.57(br s ,1H), 3.13(br s, 1H), 3.47(t, 2H), 7.01 - 7.29(m, 4H).
(d) [4-(3,3-비스카르복시부톡시)-4-(3-포스포릴옥시페닐)]스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.13,7]데칸] 테트라소디움염 (5)의 합성.
상기 (c)단계에서 얻은 알켄 (65㎎)을 3㎖의 중수(D2O)에 용해시켰다. 폴리머에 결합된 로즈 벤갈 (35㎎)을 3㎖의 p-다이옥산에 현탁시킨 후 상기 수용액에 부가하였다. 이 반응 혼합액을 5℃ 내지 8℃로 냉각시켜, 산소 기포가 발생하기 시작할 때 5 mil KAPTON 필터를 통해 1시간 동안 나트륨 램프로 상기 혼합액에 조사하여 상기 화합물 5를 생성하였다. 상기 폴리머 비드를 여과시켜 버리고 상기 용액을 사용하여 시험용 저장 용액을 제조하였다. 1H NMR (D2O) δ 0.92 - 1.33(m, 5H), 1.38 - 2.21(m, 13H), 2.92(br s, 1H), 3.19 - 3.32(m, 2H), 7.14 - 7.73(m, 4H).
실시예 6. 디옥세탄 3의 다른 제조 방법.
[(3-하이드록시페닐)메톡시메틸렌-트리시클로[3.3.1.13,7]데칸을 출발 물질로 이용하여 하기 반응 순서에 따라 디옥세탄을 제조하였다. 상기 출발 물질 화합물은 미국 특허 4,983,779호에 기재된 방법에 따라 제조될 수 있다.
(a) 알켄 [(3-하이드록시페닐)메톡시메틸렌트리시클로[3.3.1.13,7]데칸 (12g)을 100㎖의 2-클로로에탄올에 부가하고 교반하였다. 다음 촉매량의 Hg(OAc)2 (2.8g)을 아르곤 분위기하에서 상기 혼합액에 부가하였다. 상기 반응액을 110℃에서 5시간 동안 교반하였다. 실온으로 냉각한 후에, 상기 클로로에탄올을 진공하에서 제거하였다. 남은 고체를 에톡시아세테이트에 용해시키고 물로 세척하였다. 에톡시아세테이트층을 Na2SO4로 건조시키고 증발시켜 [(3-하이드록시페닐)-(2-클로로에톡시)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸을 생성하였다.
(b) 본질적으로는 미국 특허 5,013,827호 및 5,068,339호에 기재된 방법에 따라 상기 화합물에서 염소 이온을 요오드 이온으로 치환하였다.
(c) [(3-하이드록시페닐)-(2-요오드에톡시)메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸으로부터 [(3-하이드록시페닐)-(3,3-비스카르보에톡시)-3-플루오로프로폭시메틸렌]트리시클로[3.3.1.13,7]데칸을 합성하는 방법은 상기 실시예 3에 기재되어 있다.
(d) 상기 (c)단계에서 얻은 플루오로말로네이트 알켄 (0.375g)을 15㎖의 CH2Cl2 중에서 약 1㎎의 메틸렌블루을 이용하여 광산화하였다. 상기 용액을 산소 공급하에서 -78℃로 냉각시킨 후에 상기 용액을 5 mil KAPTON 필터를 통해 나트륨 램프로 45분 동안 조사한 다음 용액의 온도를 실온으로 하였다. CH2Cl2를 증발시키고 잔류물을 0 내지 5%의 에틸아세테이트 CH2Cl2 용리액을 이용하여 크로마토그래피법으로 정제하여 [4-(3,3-비스카르보에톡시-3-플루오로프로폭시)-4-(3-하이드록시페닐)]스피로[1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.13,7]-데칸]을 생산하였다: 1H NMR (CDCl3) δ0.97 - 1.02(m, 1H), 1.21 - 1.33(m, 7H), 1.45 - 1.91(m, 10H), 2.23(br s, 1H), 2.48 - 2.80(m, 2H), 2.96(br s, 1H), 3.35 - 3.44(m, 1H), 3.65 - 3.75(m, 1H), 4.21 -4.40(m, 4H), 6.85 - 7.40(m, 4H).
(e) 전단계로부터 얻은 디옥세탄을 다음 방법에 의해 광산화하였다. 2㎖의 무수 피리딘과 10㎖의 CH2Cl2를 아르곤 분위기하에서 0℃로 냉각시켜 여기에 10㎖의 CH2Cl2에 POCl3 0.424g을 용해시킨 용액을 적가하였다. 15분이 경과한 후 이 디옥세탄 0.424g과 CH2Cl2 10㎖로 이루어진 용액을 적가하였다. 상기 용액을 실온으로 만든 다음 4시간 동안 교반하였다. 상기 용액을 다시 0℃로 냉각하고 0.75g의 시아노에탄올이 10㎖의 CH2Cl2에 용해된 이루어진 용액을 적가하였다. 이 용액을 2.5시간 동안 교반함에 따라 상기 용액의 온도가 실온으로 되었다. 증발건조 후, 50 내지 100%의 에틸아세테이트 헥산용액을 용리액으로 하여 잔류물을 크로마토그래피하였다. 다음, 진공하에서 상기 용매를 제거하여 무색의 오일을 수득하였다. 상기 디옥세탄을 100㎖의 CH2Cl2에 용해시키고 물(타입Ⅰ)로 3차례 세척하였다. 다음 유기층을 Na2SO4로 건조시키고 여과시킨 후 증발시켜 인산화된 디옥세탄을 생산하였다: 1H NMR (CDCl3) δ0.90 - 0.95(m, 1H), 1.24 - 1.33(m, 7H), 1.46 - 2.20(m, 11H), 2.50 - 2.86(m, 6H), 2.96(br s, 1H), 3.32 - 3.41(m, 1H), 3.62 - 3.73(m, 1H), 4.20 -4.48(m, 8H), 7.30 - 7.70(m, 4H); 31P (CDCl3) -9.53(p).
(f) 전단계에서 얻은 디옥세탄을, 아르곤 분위기하에서 1㎖의 물(타입Ⅰ) 및 10㎖의 아세톤에 47.2㎎의 수산화나트륨을 용해시킨 용액과 반응시켜 알킬기를 제거하였다. 형성된 오일상 잔류물에서 용매를 따라내었다. 다음 상기 오일을 2㎖의 아세톤으로 두 차례 세척한 후 다시 10㎖의 아세톤을 이용하여 분말화하여 분말상의 백색 고체를 생산하였다. 고체 디옥세탄 3을 흡입 여과하여 수집한 후 또 다시 20㎖의 아세톤으로 세척하였다.
다른 방법으로서, 상기 단계 (d)에서 생성된 디옥세탄 생성물은 하기 반응 과정에 의해 직접 디옥세탄 3으로 전환될 수 있다. 2㎖의 무수 피리딘과 10㎖의 CH2Cl2로된 용액을 아르곤 분위기하에서 0℃로 냉각한 후 여기에 10㎖의 CH2Cl2에 0.424g의 POCl3이 용해된 이루어진 용액을 적가하였다. 15분이 경과한 후 10㎖의 CH2Cl2 에 0.424g의 디옥세탄이 용해된 용액을 적가하였다. 상기 용액의 온도가 실온이 되도록 한 후 4시간 동안 교반하였다. 인산염이 형성되고, 디클로로포스페이트 디옥세탄이 1㎖의 물(타입Ⅰ)과 10㎖의 아세톤에 용해되어 있는 47.2㎎의 수산화나트륨을 용해시킨 용액을 아르곤 분위기하에서 밤새도록 반응시켜 에스테르기가 가수분해 되었다. 생성물을 포함하는 잔류물로부터 용매를 제거한 다음, 아세톤으로 세척하고 , 필용시 아세톤을 이용하여 분말화하여 분말형 백색 고체를 생산하였다. 흡입 여과에 의해 디옥세탄 3을 수집하였다.
실시예 7. 캡슐 화학 분석 시스템에서의 시약의 캐리오버 문제점
하기 실험은 본질적으로는 쿠마르(Kumar) 등이 미국 특허 5,399,497호에 기재한 바와 같은, 광 방출성을 측정할 수 있도록 되어 있는 검출 시스템을 구비한 프로토타입의 캡슐 화학 분석 시스템을 이용하여 실시하였다. 상기 방법 및 기구는 테프론관(Teflon tube)를 통해 유동액을 공급하는 단계를 포함하는데, 상기 테프론관은 내부면에 분리되어 있는 플루오로카본 오일층을 가지고 있다. 샘플과 시약이 상기 테프론관으로 흡입되면 생성되는 액체 분획은 상기 관을 통해 이동한다. 이종 면역 검정법(heterogenouos immuonassay method)에 요구되는 분리 단계 및 세척 단계는 자성장치를 이용하여 촉진시켰는데 이 장치에 의해 자성입자가 한 수용성 분획에서 다른 수용성 분획으로 전달된다. 상기 검출 시스템에는 광자 계수기 (photon counter)와 섬광 해독판(fiber optic read head)이 포함되어 있는데, 테프론관 주위에 상기 섬유가 방사상으로 배열되어 있어 광수집 효율을 극대화시킨다.
발광 시약을 시험하는 대표적인 면역검정법으로서 TECHNICON IMMUNO 1(테크니콘 이뮤노 1 : 상표명) TSH 법 (Bayer Corporation, Tarrytown, NY, USA)을 이용하였다. 상기 방법의 원리는, 항원 TSH가 포함된 샘플을, 플루오레신으로 표지된 항체가 포함되어 있는 제 1 시약 (R1)과 함께 항온 배양(incubation)하고, 동시에 항체-알칼리 포스파타아제 (ALP)가 포함되어 있는 제 2 시약 (R2)과도 항온배양하는 것이다. 상기 각 항체는 TSH항원에 존재하는 서로 다른 에피토프에 대해 특이성을 가지므로, 상기 두 개의 항체와 상기 TSH 항원간에 "샌드위치"의 형성이 촉진된다. 결합형 항-플루오레신을 함유하는 자성 입자를 사용하여 상기 샌드위치를 포획하고 이어서 상기 입자를 세척하여 비결합형 시약을 제거하였다. 다음 상기 입자를, ALP에 대한 기질이 포함되어 있는 광 방출성 시약에 노출시켜 방출되는 광을 측정 하였다.
상기 발광성 R3 시약의 조성은, 0.2mM CSPD (디소디움 3-(4-메톡시스피로{1,2-디옥세탄-3,2'-(5'-클로로)트리시클로[3.3.1.13,7]데칸}-4-일)페닐포스페이트) (Tropix, Inc., Bedford, MA, USA0), 3mM 피라닌 (하이드록시피렌술폰산), 1mM MgCl2, 1M 디에탄올아민 완충액 (pH 10.0), 0.1% 트리톤 X-100 및 0.1% NaN3를 포함하고 있다. 캡슐 화학 분석 시스템의 진행 순서가 도 1에 나타나 있다. 유동성 캡슐 또는 시험 패키지는 6개의 액체 분획으로 이루어져 있고 각 분획의 부피는 28㎕였다. 자성 입자 (TECHNICON IMMUNO 1 시스템에 사용되는 자성입자 시약 1.4㎕)가 제 1 분획 (MP)으로 흡입되고 남은 액은 입자 세척 완충제 (0.2M NaCl, 0.1% Triton X-100 및 보존제를 포함하는 pH 7.5인 25mM의 Tris 용액)로 작용한다. R1(플루오레신으로 표지된 TSH에 대한 항체를 포함하는 혈청 용액 10.4㎕), R2(ALP와 컨쥬케이트된 TSH에 대한 항체를 포함하는 혈청 용액 10.4㎕) 및 S(혈청 샘플 7.2㎕)는 제 2 분획으로 흡입되었다. 그 다음의 두 분획 (W1 과 W2)는 상기 MP 분획에서 사용된 것과 동일한 세척용 완충액을 포함하여 구성하였다. 제 5 분획은 R3로, 발광성 기질과 발광 증강제가 주요 성분으로 포함되어 있다. 제 6 분획은 완충액(inter-test buffer)(상기한 입자 완충액과 동일)으로 인접 테스트를 분리하는데 사용된다. 자성 전달은 도 1에 화살표로써 나타나 있다. 이러한 전달은 두 개의 자성 전달체 (M1 또는 M2)중의 하나에 의해 촉진된다. 13분동안 항온 배양한 후, 상기 샌드위치가 형성되는 동안 M1은 상기 자성입자를 R1+R2+S 분획으로 전달하여 포획을 개시하였다. 다시 6분이 경과한 후, M2가 상기 입자를 제 1 세척 분획으로 전달하였다. 다시 12초가 경과한 후, M2가 상기 입자를 제 2 세척 분획으로 전달하였다. 다시 12초가 경과한 후 M2가 상기 입자를 R3분획으로 전달하였고, 발광측정 해독판을 통해 전후로 통과하는 수용성 분획의 흐름에 의해, 상기 분획으로부터 방출되는 광을 검출하였다.
상기 테프론관이 투광성이므로, 광 파이핑(또는 "광학적 캐리오버")문제가 예상되었다. 보다 상세하게 설명하면, 인접 테스트 R3 분획에서 발생하는 광자의 일부는 테프론 물질에 들어가 테프론관 길이를 따라 전파되어, 본 발명의 측정하고자 하는 테스트의 신호가 측정되는 동안에, 검출기내로 산란될 가능성이 있었다. 그러나, 인접 테스트에서 신호는 검출되었으나 예상했던 방식으로 일어나지는 않았다. 테스트 N으로부터 멀어짐에따라 급속히 기울지 않고, 도 2에서 보이는 바와 같이, 인접 테스트 패키지의 R3 주위에, 광방출 피크가 집중되어 있는 것이 관찰되었다. 도 2에서, 테스트 N은 대략 7,500,000 counts/sec (cps)라는 높은 수준의 발광을 생산했다. 테스트 N-1과 N-2는 테스트 N 에 앞서 관내로 흡입시켜 발광측정기를 통과시켰고, 테스트 N+1 및 N+2는 테스트 N 이후에 실시하였다. 상기 분석 시스템은 흐름내의 각각의 개별적인 기체 및 액체 분획에 대해 계수된 광자를 기록하였다. 도 2의 프로파일 5종류의 테스트에 대해 10회씩 반복 실시하여 얻은 결과의 평균치를 나타내는데, 각각의 데이터는 ALP 없이 생산된 기저 발광 신호에 대해 보정된 값들이다.상기 캐리오버 신호의 크기는 각 인접 테스트의 피크 cps를, ppm으로 표현되는 테스트 N의 피크 cps로 나누는 방법으로 계산하였다.
이러한 거동에 대한 또 다른 설명은, 의도하지 않은 방식으로 테스트 N으로부터 이웃하는 테스트로 ALP가 물리적으로 캐리오버 된다는 것이다. 예를 들어 입자화된 물질이 벽에 침적되어 있는 관의 경우 상기와 같은 캐리오버가 일어나 액체 분획이 관을 원활하게 통과해 나갈수 없게된다. 그러나, 인접 테스트 R3 분획에 10mM의 무기 인산염을 놓으면 인접 테스트에서의 신호 크기에는 아무런 영향이 없었다. 이러한 시험 조건하에서 상기량 정도의 인산염은, ALP를 90% 이상 저해하기 때문에 물리적 캐리오버의 가능성이 배제된 것이다.
광학적 캐리오버를 더욱 더 배제하기 위하여 형광성 증강제인 피라닌을 테스트 N으로 부터만 배제시켰고 인접 테스트에는 그대로 두었다. 그 결과 테스트 N에서의 신호 크기는 약 10만큼 낮았다. 그러나, 도 3에서 보이는 바와 같이, 인접 테스트에서 피크 높이는 크게 변화를 보이지 않았다. 캐리오버 신호의 변화가 인접 테스트들에서 비례적으로 변화하지 않았다는 사실은 이러한 캐리오버가 광학적인 것이 아니라는 것을 분명히 보여주었다.
또 하나 예상치 못한 형태로 발생한 캐리오버는 캐리오버 문제점의 원인이 되었다. 하이드록시 디옥세탄 중간체는 테프론관의 내벽을 코팅하는데 사용되는 플루오로카본에 충분히 용해되고, 따라서 캐리오버는 용해된 하이드록시 디옥세탄 중간체가 오일을 매개로 인접 테스트의 R3 분획으로 전달되기 때문이라는 사실을 알았다. 인접 테스트의 R3분획의 완충제를 pH가 10인 1M의 DEA에서 pH 7의 1M Tris로 변화시켜 상기 과정을 시험하였다. pH 7에서, 상기 R3 분획에 존재하는 용해된 하이드록시 디옥세탄 중간체는, 안정하므로 광을 방출하지 않는다. 도 4에서 보이는 바와 같이, 이러한 pH의 변화로 부차적으로 존재하던 발광 띠(band)가 완전히 없어졌다. N+1 및 N-1 테스트에 잔류하는 작은 캐리오버는 예견된 광학적 캐리오버 때문이었다. 이러한 결과로 인해, 이웃하는 테스트의 피크에서 발광의 원천은, CSPD로부터 인접 테스트의 R3 분획으로의 하이드록시 디옥세탄의 "화학적 캐리오버"라는 것을 확증할 수 있었다.
실시예 8. 디카르복실산으로 치환된 디옥세탄 1에 의한 화학적 캐리오버의 제거
표 1을 보면, 서로 다른 세 개의 디옥세탄이 반응 중간체의 화학적 캐리오버에 미치는 영향이 무엇인지를 알 수 있다. 시험용 제제로 동일한 농도의 LUMIGEN PPD [4-(메톡시)-4-(3-포스포릴옥시페닐)]스피로-[1,2-디옥세탄-3,2'-트리시클로[3.3.1.13,7]-데칸] (Lumigen, Inc., Southfield, MI, USA), 모노카르복실산 유도체인 디옥세탄 2 및 디카르복실산 유도체인 디옥세탄 3을 사용하였다. ppm 칼럼이 N+1 테스트의 신호를 나타내는데, 최악의 경우의 거동을 나타낸다. 변형되지 않은 본래의 화합물 PPD의 캐리오버가 CSPD에서 관찰된 캐리오버의 2배 이상 높다는 것을 알았다. 놀랍게도, 모노카르복실산 유도체인 디옥세탄 3은 화학적 캐리오버의 크기가 단지 84% 감소했다. 이러한 사실은, 1개의 전하를 갖는 그룹은 플루오로카본 오일에 반응 중간체가 용해되는 것을 완전히 막기에 불충분하다는 것을 말해주었다. 그러나, 상기 디카르복실산 유도체는 그 효과가 100%로서, 2개의 전하를 갖는 그룹은 원하는 거동을 달성하는데 매우 적절하다는 것을 말해주었다.
실시예 9. 증강제의 역할
디옥세탄에 기초한 시약을 최적화하기 위한 일환으로서, 수많은 증강제 물질을 시험하였다. pH 9.6에서 증강제 A (1-트리옥틸포스포늄메틸-4-트리부틸포스포늄메틸벤젠 디클로라이드)는 발광 신호를 6.2만큼 증가시켰고, 증강제 B (폴리(비닐벤질트리부틸포스포늄 클로라이드))는 발광 신호를 19.7만큼 증가시켰다. pH 10.0에서 증강제 A는 발광 신호를 4.8만큼 증가시켰고 증강제 B는 18.9만큼 증가시켰다.
증강제 B가 더 높은 광 강도를 달성했음에도 불구하고, 증강제 A가 분자량이 낮은 모노머 화합물이기 때문에 더 적절하게 사용된다. 폴리머 화합물은, 특히 그 폴리머 화합물이 다가양이온성 화합물인 경우 혈청 성분과 상호작용을 하여 침전을 일으키므로 분석 시스템을 작동시키는데 있어서 심각한 문제를 일으킨다.
플로레세인과 피라닌은 양자 모두 증강제 A와 병용사용되는 경우 보충적인 형광제로서의 효과가 있는 것으로 밝혀졌다. 상기 형광제들은 단독으로 사용되는 경우 약 10배의 증강 효과를 이루기 위해서는 상대적으로 고농도 (3mM)로 사용해야만 한다. 그러나, 증강제 A와 병용하면 상승효과가 관찰되고 증강제가 없는 상태에서 필요한 형광제 농도보다도 100배 낮은 농도에서 상당한 증강 효과를 가져온다. 표 2 및 3에서, 증강제 A 1㎎/㎖ 존재하에서의 피라닌과 플루오레신에 의해 발광이 증강된 정도를 알 수 있다.
실시예 10. 캡슐 화학 분석 시스템을 위한 최적 제제
앞서 기술한 바에 따라 캡슐 화학 분석 시스템에 가장 적절한 제제를 개발하게 되었다. 이러한 제제는 0.1 ~ 1mM의 디옥세탄 1, 0 ~ 0.05mM의 피라닌, 0.1 ~ 5mg/ml의 증강제 A, 0 ~ 1mM의 Mg+2, 0.1 ~ 1M의 2-아미노-2-메틸-1-프로판올 (pH 10.0) 및 0.01 ~ 1%의 Triton X-100을 포함하고 있다. 이러한 제제를 사용하면 화학적 캐리오버 문제를 완전히 제거할 수 있고 성능이 증강된다.
실시예 11. 효소 검정법으로 측정한 디옥세탄 1, 3, 4 및 5의 안정성
0.1㎎/㎖의 증강제 A, 0.88mM의 Mg+2, 0.2M의 2-아미노-2-메틸-1-프로판올(pH 10), 0.1%의 Triton X-100에 0.5mM의 디옥세탄 1, 3, 4 및 5를 각각 포함하는 제제를 제조하여 4℃, 25℃ 및 40℃에서 불투명한 폴리에틸렌 병에 담아 저장하였다. 상기 각 병에서 100㎕씩 24회 피펫으로 취해 96개의 구멍(well)을 구비하고 있는 플레이트의 구멍에 담아 37℃에서 항온 배양하였다. 상기 각 구멍에 8×10-17몰의 알칼리 포스파타아제를 함유하는 용액을 10㎕씩 주입하여 5시간 이상에 걸쳐 광 강도를 조사하였다. 각각의 데이터는 상기 24개의 구멍에서의 데이터의 평균치이다. 실험은 각 디옥세탄에 대해 정해진 시간 간격으로 반복하였다. 도 5의 결과를 보면 25℃에서의 상기 세 종류의 제제의 상대적인 안정성을 알 수 있다. 도 5에서 알수 있는 바와 같이, 불소-치환된 디옥세탄 3이 염소-치환된 디옥세탄 4 및 할로겐-비치환된 디옥세탄 1보다 실질적으로 저장안정성이 더 좋았다. 디옥세탄 3 및 5 역시 디옥세탄 1 또는 4보다 40℃에서 실질적으로 더 안정하였다.
실시예 12. 디옥세탄 3의 성능
디옥세탄 3을 포함하고 있는 검출 시약을 실시예 7에서 기재한 바와 같은 테스트 시스템에서 평가하였다. 상기 시험 물질은 자성 입자에 포획되어 있는 플루오레신-표지된 알칼리 포스파타아제 컨쥬케이트였다. 디옥세탄 3을 포함하는 시약을 사용하여 알칼리 포스파타아제를 분석한 결과 디옥세탄 1을 이용하여 얻은 결과에 필적하는 감도, 동적 범위 및 정확도를 가진 결과를 얻었다.
전술한 실시예들은 단지 본 발명을 예시하는 것으로 본 발명의 범위를 한정하지 않는다. 본 발명의 범주는 오직 청구항 및 이와 균등한 것에 의해서만 나타내어 진다.

Claims (41)

  1. 저장 안정성이 증가된 하기 구조식의 디옥세탄 화합물을 제조하는 방법에 있어서,
    여기서, R3 및 R4는 아다만틸 그룹, 또는 할로겐, 알킬, 알콕시, 카르보닐, 카르복실, 페닐, 아미노, 및 알킬아미노기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 공유결합에 의해 치환된 아다만틸 그룹을 형성하고, R2는 부가적인 치환기를 포함할 수 있는 페닐 및 나프틸 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아릴고리 그룹이고, Z는 할로겐 원자 및 C1 ~ C4의 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이며, M은 수소, 알칼리 금속 이온 또는 4급암모늄 또는 포스포늄 이온 중에서 선택되는 것임.
    a) 하기 구조식을 갖는 제 1 알켄 화합물 (여기서, RG는 Z-치환된 말로네이트 에스테르를 가진 제거가능기임)을,
    염기와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 말로네이트-치환 알켄 화합물(여기서 R'은 C1 ~ C4의 알킬기임)을 생성하는 단계:
    b) 산소와 상기 말로네이트-치환된 알켄 화합물의 존재하에서 광증감제를 조사(irradiating) 함으로써 말로네이트-치환된 알켄 화합물을 광산화시켜, 하기 구조식을 갖는 말로네이트-치환된 디옥세탄을 형성하는 단계:
    c) 상기 말로네이트-치환된 디옥세탄을, 일반식이 WP(O)Y2인 인산화제 (여기서 W와 Y는 각각 할로겐원자, 치환된 또는 치환되지 않은 알콕시, 아릴옥시, 아랄킬옥시 및 트리알킬실릴옥시 그룹중에서 선택되는 것임)와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 인산화 디옥세탄 화합물을 형성하는 단계: 및
    d) 상기 인산화 알켄 화합물을 수용액중에서 일반식이 M-Q (여기서 Q는 염기성 음이온임)인 염기로 가수분해시켜 디옥세탄 염화합물을 형성하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 말로네이트-치환된 디옥세탄 화합물을 인산화제와 반응시키는 단계가
    a) 말로네이트-치환된 디옥세탄 화합물을 화학식이 WP(O)Y'2 (여기서, Y'는 할로겐 원자임)인 인산화제와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 할로겐화인산 디옥세탄 화합물을 형성하는 단계; 및
    b) 상기 할로겐화인산 디옥세탄 화합물을 화학식이 Y-OH (여기서, Y는 치환된 또는 치환되지 않은 알킬그룹으로부터 선택되는 것임)인 하이드록실 화합물과 반응시켜 인산화 디옥세탄 화합물을 제조하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항에 있어서, 상기 WP(O)Y2는 POCl3인 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 상기 R2는 치환된 또는 치환되지 않은 메타-페닐 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 상기 Z는 불소 및 메틸기 중에서 선택되는 것이고, 상기 M은 나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 상기 Z는 불소 및 메틸기중에서 선택되는 것이고, 상기 M은 나트륨이며 상기 R2는 치환된 또는 치환되지 않은 메타-페닐 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 Z는 메틸기이고 상기 M은 나트륨이고 상기 R2는 비치환된 메타-페닐 그룹이며, 상기 R3 및 R4는 비치환된 아다만틸 그룹으로서 디옥세탄 염화합물이 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 1항에 있어서, 상기 Z는 불소이고, 상기 M은 나트륨이고, 상기 R2는 비치환된 메타-페닐 그룹이며, 상기 R3 및 R4는 비치환된 아다만틸 그룹으로서 디옥세탄 염화합물이 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 저장 안정성이 증가된 하기 구조식을 갖는 디옥세탄 염화합물의 제조 방법에 있어서,
    여기서, R3 및 R4는 아다만틸 그룹, 또는 할로겐, 알킬, 알콕시, 카르보닐, 카르복실, 페닐, 아미노, 및 알킬아미노기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 공유결합에 의해 치환된 아다만틸 그룹을 형성하고, Z는 할로겐 원자 및 C1~C4의 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이며, M은 수소, 알칼리 금속 이온 또는 4급암모늄 또는 포스포늄 이온 중에서 선택되는 것임.
    a) 하기 구조식을 갖는 제 1 알켄 화합물 (여기서, RG는 Z-치환된 말로네이트 에스테르를 가진 제거가능기임)을,
    염기와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 말로네이트-치환 알켄 (여기서 R'은 C1 ~ C4의 알킬기임)을 생성하는 단계:
    b) 상기 말로네이트-치환된 알켄을, 일반식이 WP(O)Y2 (여기서 W는 할로겐으로부터 선택되는 것이고 Y는 할로겐 원자임)인 인산화제와 반응시켜 하기 구조식을 갖는 인산화 알켄 화합물을 형성하는 단계:
    c) 상기 인산화 알켄 화합물을, 일반식이 Y'-OH (여기서 Y'은 치환되거나 또는 치환되지않은 알킬기로부터 선택되는 것임)인 하이드록실 화합물과 반응시켜 하기 구조식을 갖는 제 2 인산화된 알켄 화합물을 형성하는 단계:
    d) 상기 제 2 인산화된 알켄 화합물을 수성 용매에서 일반식이 M-Q (여기서 Q는 염기성 음이온임)인 염기로 가수분해시켜 하기 구조식을 갖는 알켄염 화합물을 형성하는 단계: 및
    e) 수용액중에서 산소 및 상기 알켄 염화합물의 존재하에 광증감제를 조사시켜 상기 알켄염 화합물을 광산화시킴으로써 디옥세탄 염화합물을 형성하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 상기 R2는 치환된 또는 치환되지 않은 메타-페닐 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 상기 Z는 불소 및 메틸기 중에서 선택되는 것이고, 상기 M은 나트륨인 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 9항에 있어서, 상기 Z는 불소 및 메틸기중에서 선택되는 것이고, 상기 M은 나트륨이며, 상기 R2는 치환된 또는 치환되지 않은 메타-페닐 그룹인 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 9항에 있어서, 상기 Z는 메틸이고, 상기 R2는 비치환된 메타-페닐 그룹이며, 상기 R3 및 R4는 비치환된 아다만틸 그룹으로서 디옥세탄 염화합물이 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 9항에 있어서, 상기 Z는 불소이고, 상기 R2는 비치환된 메타-페닐 그룹이며, 상기 R3 및 R4는 비치환된 아다만틸 그룹으로서 디옥세탄 염화합물이 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 하기 구조식을 갖는 알켄 화합물:
    여기서, Z는 할로겐 원자 및 C1~C4의 알킬 그룹으로부터 선택되는 것이고, R'는 각각 C1~C4의 알킬 그룹임.
  16. 제 15항에 있어서, 상기 Z는 불소이고 상기 R'는 에틸인 것을 특징으로 화합물.
  17. 제 15항에 있어서, 상기 Z는 메틸이고 상기 R'는 에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  18. 하기 구조식을 갖는 알켄 화합물:
    여기서, Z는 할로겐 원자 및 C1 ~ C4의 알킬 그룹으로부터 선택되고, 각각의 R'는 C1~C4의 알킬 그룹이며, 각 Y는 할로겐 원자, 치환된 또는 치환되지 않은 알콕시, 아릴옥시, 아랄킬옥시 및 트리알킬실릴옥시 그룹으로부터 선택되는 것임.
  19. 제 18항에 있어서, 상기 Z는 불소이고 상기 각각의 Y는 2-시아노에틸 그룹인 것을 특징으로 하는 화합물.
  20. 제 18항에 있어서, 상기 Z는 메틸이고 상기 각각의 Y는 2-시아노에틸 그룹인 것을 특징으로 하는 화합물.
  21. 하기 구조식을 갖는 알켄 화합물:
    여기서, Z는 할로겐 원자와 C1~C4의 알킬 그룹으로부터 선택되고, 각 R'는 C1~C4의 알킬 그룹이고, M은 수소, 알칼리 금속 이온, 4급 암모늄 또는 포스포늄 이온으로부터 선택되는 것임.
  22. 제 21항에 있어서, 상기 Z는 불소이고, 상기 각각의 M은 나트륨 원자인 것을 특징으로 하는 화합물.
  23. 제 21항에 있어서, 상기 Z는 메틸이고, 상기 각각의 M은 나트륨 원자인 것을 특징으로 하는 화합물.
  24. 하기 구조식을 갖는 디옥세탄 화합물:
    여기서, Z는 할로겐 원자 및 C1~C4의 알킬 그룹으로부터 선택되고 각각의 R'는 C1~C4의 알킬 그룹임.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 Z는 불소이고 상기 R'는 에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  26. 제 24항에 있어서, 상기 Z는 메틸이고, 상기 R'는 에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  27. 하기 구조식을 갖는 디옥세탄 화합물:
    여기서, Z는 할로겐 원자 및 C1~C4의 알킬기로부터 선택되는 것이고 각각의 R'는 C1~C4의 알킬기이며, 각 Y는 염소 원자 및 2-시아노에틸 그룹으로부터 선택되는 것임.
  28. 제 27항에 있어서, 상기 Z는 불소이고, 상기 Y는 염소이며, 상기 각각의 R'는 에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  29. 제 27항에 있어서, 상기 Z는 메틸이고, 상기 Y는 염소이며, 상기 R'는 에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  30. 제 27항에 있어서, 상기 Z는 불소이고, 상기 Y는 2-시아노에틸 그룹이며 상기 R'는 에틸인 것을 특징으로하는 화합물.
  31. 제 27항에 있어서, 상기 Z는 메틸이고, 상기 Y는 2-시아노에틸 그룹이며, 상기 R'는 에틸인 것을 특징으로 하는 화합물.
  32. 저장 안정성이 증가된 하기 구조식의 디옥세탄:
    여기서, R3 및 R4는 아다만틸 그룹, 또는 할로겐, 알킬, 알콕시, 카르보닐, 카르복실, 페닐, 아미노, 및 알킬아미노기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 공유결합에 의해 치환된 아다만틸 그룹을 형성하고, R2는 부가적인 치환기를 포함할 수 있는 페닐 및 나프틸 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아릴고리 그룹이고, Z는 불소 원자 및 C1 ~ C4의 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것이며, M은 수소, 알칼리 금속 이온 또는 4급암모늄 또는 포스포늄 이온 중에서 선택되는 것이고, 상기 OX 그룹은 O-M+그룹 (여기서, M은 수소, 알칼리 금속 이온, 4급암모늄 및 4급포스포늄 이온임), OOCR8그룹 (여기서, R8은 C2 ~ C8을 포함하는 알킬 및 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임), OPO3 -2염, OSO3 -염, 베타-D-갈락토시독시 및 베타-D-글루쿠로니딜옥시 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임.
  33. 제 32항에 있어서, 하기 구조식을 갖는 디옥세탄.
  34. 저장 안정성이 증가된 하기 구조식의 디옥세탄.
  35. 저장 안정성이 증가된 하기 구조식의 디옥세탄.
  36. 수용액 중에,
    (a) 저장 안정성이 증가된 하기 구조식의 안정한 디옥세탄: 및
    여기서, R3 및 R4는 아다만틸 그룹, 또는 할로겐, 알킬, 알콕시, 카르보닐, 카르복실, 페닐, 아미노, 및 알킬아미노기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 공유결합에 의해 치환된 아다만틸 그룹을 형성하고, R2는 부가적인 치환기를 임의적으로 포함할 수 있는 페닐 및 나프틸 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 아릴고리 그룹이고, Z는 불소 원자 및 C1 ~ C4의 알킬기로 이루어진 군으로부터 선택되고, M은 수소, 알칼리 금속 이온 또는 4급암모늄 또는 포스포늄 이온 중에서 선택되며, 상기 OX 그룹은 O-M+그룹 (여기서, M은 수소, 알칼리 금속 이온, 4급암모늄 및 4급포스포늄 이온임), OOCR8그룹 (여기서, R8은 C2 ~ C8을 포함하는 알킬 및 아릴기로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임), OPO3 -2염, OSO3 -염, 베타-D-갈락토시독시 및 베타-D-글루쿠로니딜옥시 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것임.
    (b) 증강제(enhancer) 부재하에서 생성되는 광생성량에 비하여 상기 디옥세탄과 활성화제가 반응하여 생성되는 광 생성량이 더 많도록 증가시키는 양이온성 계면활성제를 포함하는 것을 특징으로 하는 광 생성 조성물.
  37. 제 36항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 하기 화학식을 갖는 2가 양이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 조성물:
    여기서, 각 A는 인 및 질소 원자로 이루어진 군으로부터 개별적으로 선택되고, Link는 치환된 및 치환되지 않은 아릴, 알킬, 알케닐 및 알키닐 그룹으로 이루어진 군으로부터 선택되는 2개 이상의 탄소원자를 포함하는 유기 연결 그룹으로 상기 Link는 헤테로원자를 포함할 수 있고, R은 C1 ~ C20을 포함하는 저급알킬 또는 아랄킬로부터 선택되며, Y는 음이온임.
  38. 제 36항에 있어서, 상기 양이온성 계면활성제는 하기 화학식을 갖는 2가 양이온성 계면활성제인 것을 특징으로 하는 조성물.
    여기서, Link는 페닐렌임.
  39. 제 36항 내지 제 38항중 어느 한 항에 있어서, 상기 디옥세탄은 하기 구조식을 갖는 것임을 특징으로 하는 조성물.
    여기서, R5는 아다만틸 그룹, 또는 할로겐, 알킬, 알콕시, 카르보닐, 카르복실, 페닐, 아미노, 및 알킬아미노기로부터 선택된 하나 이상의 치환기로 공유결합에 의해 치환된 아다만틸 그룹임.
  40. 제 39항에 있어서, 상기 디옥세탄은 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
  41. 제 39항에 있어서, 상기 디옥세탄은 하기 구조식을 갖는 것을 특징으로 하는 조성물.
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