ES2197140T3 - Medio fisiologico para la perfusion, conservacion y almacenamiento de muestras de celulas, tejidos y organos aislados. - Google Patents
Medio fisiologico para la perfusion, conservacion y almacenamiento de muestras de celulas, tejidos y organos aislados.Info
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Abstract
Un medio fisiológico, que comprende una solución acuosa en agua purificada esterilizada de (i) un componente de sal que comprende: (a) de 100 a 150 mmoles /L de iones de sodio, (b) de 2, 5 a 6, 2 mmoles /L de iones de potasio, (c) de 0, 1 a 2, 5 mmoles /L de iones de calcio, (d) de 0, 4 a 25 mmoles /L de iones de magnesio, y (e) de 96 a 126 mmoles /L de iones cloruro; (ii) un componente tampón que comprende: (f) de 21 a 27 mmoles /L de iones bicarbonato, y (g) de 1 a 12 mmoles /L de TES, MOPS o BES; (iii) un componente de substrato que comprende: (h) 2 a 11 mmoles /L de glucosa, (i) 50 a 150 µmoles /L de glicerol, y (j) 7 a 15 µmoles /L de colina; (iv) un componente de aminoácido que comprende: (k) 5 a 400 µmoles /L de glutamato, (l) 5 a 200 µmoles /L de aspartato, y (m) 100 a 2000 µmoles /L de glutamina; (v) un componente de coenzima que comprende: (n) 1 a 120 nmoles /L de tiamina cocarboxilasa; (vi) un componente vitaminoide que comprende: (o) 40 a 70 µmoles /L de D- o DL- o L-carnitina;(vii) un componente de proteína que comprende: (p) 5 a 200 m l.U./L de insulina humana.
Description
Medio fisiológico para la perfusión, conservación
y almacenamiento de muestras de células, tejidos y órganos
aislados.
La presente invención se refiere a la formulación
de un medio líquido fisiológico que tiene los componentes
sinérgicos básicos para permitir su aplicación universal a la
conservación de la integridad celular y funcional in vitro
de diferentes tipos de células, tejidos y órganos aislados
procedentes de diferentes especies de mamíferos.
Históricamente, el diseño de soluciones de
perfusión fisiológica se remonta a la tesis propuesta por el
fisiólogo francés Claude Bernard en los años 1870 quien expuso su
teoría en el medio interior, afirmando básicamente que para
mantener el todo (persona) uno deberá asegurarse de que el ambiente
extracelular circundante esté equilibrado en todos los aspectos.
Desgraciadamente, la defectuosa interpretación o la falsa idea del
medio interior de Bernard ha conducido a los investigadores a
confundir las fases extracelulares con las fases
intracelulares de la función de las células y a pasar por
alto la necesidad de mantener la célula como una entidad
total. Las soluciones de sales básicas utilizadas actualmente
para estudios de órganos/tejidos in vitro o aislados
derivan de la formulación sencilla utilizada por Sydney Ringer para
el corazón de rana perfundido aislado. Se han utilizado soluciones
de sales básicas similares, empíricamente ideadas, para
preparaciones aisladas de mamíferos. El uso convencional de
soluciones salinas tamponadas con fosfato/bicarbonato fue instigado
por Krebs y Henseleit (Z. Physiol. Chem. 210:
33-66) para estudios sobre homogenados
aislados de mitocondria, es decir, organelas intracelulares,
de hígado de paloma. Posteriormente, Krebs, en su documento clásico
(Biochem. Biophys. Acta. 4: 249-269) sobre el
análisis de consumo de oxígeno en trozos de tejido de diferentes
órganos de una diversidad de especies animales, reconocía que el
empobrecimiento del substrato en preparaciones de tejidos/órganos
aislados con el tiempo era una consideración que no había
sido tratada en la composición de soluciones fisiológicas previas.
Como ya se ha demostrado, una interpretación correcta de la
hipótesis de Bernard necesita que toda la célula subtienda
homeostasis metabólica.
Tradicionalmente, se han utilizado tampones de
fosfato/bicarbonato durante sesenta años y se utilizan todavía
actualmente, con validez cuestionable, en soluciones de
perfusión/conservación para tejidos/órganos de mamíferos y seres
humanos. Tiene interés hacer observar que se ha conocido durante 40
años que los iones de fosfato inorgánico inhiben la
glicolisis y fosforilación oxidativa, la creatina quinasa y las
enzimas que intervienen en el barrido de radicales libres de
oxígeno, estando implicado lo último en daños de reperfusión y en la
formación de edemas en numerosos sistemas de órganos. El
mantenimiento del pH en el transcurso del tiempo es además
complicado por la inestabilidad de las soluciones de perfusión y
conservación tamponadas con fosfato producidas por la precipitación
de fosfato y bicarbonato de calcio, acentuado por el cambio en sus
constantes de disociación sobre el margen de temperaturas de
\hbox{4 - 37ºC}.
El documento
GB-A-2 270 614 describe una solución
acuosa para la perfusión, el almacenamiento y la reperfusión de
órganos, que comprende cloruros de calcio, potasio y magnesio,
histidina, manita, lactiobionato, glutamato y glutatión.
El documento
GB-A-2 213 362 describe una solución
de perfusado que comprende un lactobionato y un almidón de
hidroxietilo. La sección descriptiva de ese documento pone énfasis
en la importancia de incluir un trifosfato de adenosina (ATP) tal
como adenosina, a fin de mantener el nivel de ATP durante la
reperfusión.
El documento WO 98/04127 describe una solución
para transplantes que comprende agua, un sistema tampón y
piruvato.
La presente invención da respuesta a la necesidad
aún existente de proporcionar una solución para superar los efectos
perjudiciales de los iones de fosfato inorgánico sobre el
metabolismo de las células y la función celular asociada, al tiempo
que sirve también para aumentar los procesos fisiológicos naturales
esenciales para conservar células, tejidos y órganos aislados
procedentes de especies de mamíferos, por ejemplo, durante el
transporte de órganos para transplante. Tales órganos se deterioran
rápidamente y muchos órganos útiles no pueden usarse a causa de que
transcurre demasiado tiempo entre la recogida y la entrega a un
receptor previsto. La solución de acuerdo con la presente
invención alarga el período de seguridad.
La presente invención proporciona un medio
fisiológico que comprende una solución acuosa en agua purificada
esterilizada de: (i) un componente de sal que comprende: (a) de
100 a 150 mmoles /L de iones de sodio, (b) de 2,5 a 6,2 mmoles /L de
iones de potasio, (c) de 0,1 (preferiblemente de 0,15) a 2,5 mmoles
/L de iones de calcio, (d) de 0,4 a 25 mmoles /L de iones de
magnesio, y (e) de 96 a 126 mmoles /L de iones cloruro; (ii) un
componente de tampón que comprende (f) de 21 a 27 mmoles /L de
iones bicarbonato, y (g) de 1 a 12 mmoles /L de TES, MOPS o BES;
(iii) un componente de substrato que comprende: (h) 2 a 11 mmoles /L
de glucosa, (i) 50 a 150 \mumoles /L de glicerol, y (j) 7 a 15
\mumoles /L de colina; (iv) un componente de aminoácido que
comprende: (k) 5 a 400 \mumoles /L de glutamato, (l) 5 a 200
\mumoles /L de aspartato, y (m) 100 a 2000 \mumoles /L de
glutamina; (v) un componente de coenzima que comprende: (n) 1 a 120
nmoles /L de tiamina cocarboxilasa; (vi) un componente vitaminoide
que comprende: (o) 40 a 70 \mumoles /L de D- o DL- o
L-carnitina; (vii) un componente de proteína que
comprende: (p) 5 a 200 m I.U./L de insulina humana o de animales
porcinos.
\newpage
De acuerdo con una realización, el componente de
sal comprende (c) de 1,0 a 2,5 mmoles /L de iones de calcio, y (d)
de 0,4 a 2,4 mmoles /L de iones de magnesio.
La presente invención proporciona también un
método para producir un medio fisiológico como se describe en lo que
antecede, que comprende añadir en el siguiente orden cloruro de
sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio,
TES, MOPS, o BES, tiamina, carnitina, colina, glicerol, insulina,
aspartato, glucosa, glutamato, glutamina, y bicarbonato de sodio a
agua purificada esterilizada, con agitación constante, preparando
hasta el volumen deseado, filtrar y almacenar en recipientes
esterilizados herméticamente cerrados.
Se apreciará que las composiciones de acuerdo con
la invención no contienen proteína de suero derivada de animales,
tal como suero fetal de bovino o albúmina de suero de bovino, que
han sido prohibidos por la FDA para tales aplicaciones en
biotecnología de célula única o de tejidos/órganos humanos.
Con respecto a los componentes de las soluciones
de acuerdo con la invención se ha adoptado un sistema tampón
fisiológico natural, es decir, NaHCO_{3}/pCO_{2}, para la
solución de acuerdo con la invención, en combinación con el tampón
zwitteriónico Good's, BES (Good y otros, Biochemistry 5:
467-477), que actúa en virtud de su pK_{a} ideal
sobre un margen de temperaturas de 10-37ºC, para
proporcionar un pH estable, requisito esencial para la conservación
celular. Se ha demostrado que el BES no es tóxico para células de
mamíferos, incluso cultivadas, en estudios de larga duración y
presenta unión despreciable de Ca^{2+} o Mg^{2+}, eliminando de
este modo el potencial peligro de precipitación de iones divalentes
que se produce cuando se utilizan soluciones tampón convencionales
de bicarbonato/fosfato o de fosfato doble. Ciertamente, se ha
demostrado experimentalmente que concentrados 10x de soluciones de
acuerdo con la invención tienen una vida en anaquel (almacenados a
3-8ºC) superior a 14 meses. Como alternativa al uso
de ácido
N,N-bis-(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico
(BES), es posible utilizar ácido morfolinopropanosulfónico (MOPS) o
ácido
N-tris-hidroximetil)metil-2-aminoetanosulfónico
(TES).
Una característica diferenciadora importante de
la solución de acuerdo con la invención, en comparación con
soluciones salinas convencionales de perfusión, es la ausencia de
fosfato inorgánico que, durante los pasados 80 años, ha sido
utilizado como vehículo tampón en soluciones convencionales de
perfusión, aun cuando se ha demostrado durante los últimos 40 años
que radicales de fosfato inorgánico, inhiben la glicolisis y la
fosforilación oxidativa, la actividad de la creatina quinasa y las
enzimas de barrido de radicales libres.
Se ha informado que el fosfato inorgánico tiene
un efecto inhibitorio sobre la glicolisis interfiriendo en
cooperación con Mg^{2+} con las enzimas limitadoras de régimen,
hexoquinasa y fosfofructoquinasa, y sobre la solubilidad de la
creatina quinasa. Numerosos investigadores, en un intento para
compensar el efecto inhibitorio sobre la glicolisis y la
disminución asociada en el rendimiento fisiológico producida por
las soluciones salinas tamponadas con fosfato, han incluído
piruvato a niveles de suero no fisiológico (es decir,
2,0-25,0 mmoles frente a 0,2 mmoles) en sus
soluciones salinas de perfusado o en soluciones de transplante
(véase el documento anteriormente mencionado WO 98/04127). Los
experimentos realizados en el hígado aislado perfundido/perifundido
de ratas han demostrado que se producía fuga de lactato
deshidrogenasa (LDH) después de sólo 10 minutos con solución salina
Krebs & Henseleit pero no durante 300 minutos con una solución
de acuerdo con la invención (véase el Ejemplo 1). En las últimas
condiciones, la adición ulterior de piruvato estaría contraindicada
ya que se sabe que el piruvato produce inhibición de las
subunidales H_{4} y H_{3}M de LDH en el hígado e,
incidentalmente, en el corazón. Puede resaltarse otra vez que para
la conservación de tejidos/órganos aislados todos los intentos
deberán hacerse con la finalidad de retener la homeostasis
metabólica al nivel celular manteniendo ``autorregulación'' de
función enzimática.
El componente de sal preferido comprende: 135,32
mmoles /L de iones de sodio, 5,00 mmoles /L de iones de potasio,
1,25 mmoles /L de iones de calcio, 0,45 mmoles /L de iones de
magnesio, en forma de sales cloruro, y 118,40 mmoles /L de iones
cloruro en forma de sales de sodio, potasio, calcio y magnesio.
El componente tampón preferido comprende: 25,00
mmoles /L de iones bicarbonato en forma de sal de sodio y 5,0
mmoles /L de ácido
N,N-bis(2-hidroxietil)-2-aminoetanosulfónico
(BES).
La solución de acuerdo con la invención
proporciona una pluralidad de substratos esenciales para retener la
homeostasis metabólica de los órganos/tejidos aislados. Se ha
demostrado que la glucosa y el glicerol son satisfactorios para
satisfacer las demandas de energía de tejidos y órganos aislados,
aun cuando no sean el substrato preferido para el órgano (por
ejemplo, el corazón) por la inclusión de niveles fisiológicos
de insulina. Aparte de su capacidad para ser metabolizados, el
glicerol y la glucosa tienen también propiedades de barrido de
radicales libres y de estabilización de membrana, que han
demostrado ser extremadamente importantes para mantener la
viabilidad fisiológica de tejidos y órganos aislados.
Preferiblemente, el componente de substrato comprende 10 mmoles /L
de D-glucosa, 110 \mumoles /L de glicerol y 10,0
\mumoles /L de colina en forma de sal cloruro.
Se han incluído también aspartato y glutamato en
soluciones de acuerdo con la invención para favorecer el
metabolismo oxidativo reponiendo los productos intermedios de ciclo
(TCA), manteniendo de este modo niveles de fosfato de alta energía
incluso durante una lesión isquémica. De manera similar, está
implicado el glutamato en el mantenimiento de potenciales
intracelulares de oxidación- reducción. Esencialmente, se sugiere
que, optimizando los vectores lanzadera de
aspartato-malato y glicerol fosfato, las células
mantendrán un equilibrio óptimo (NAD/NADH) y soportarán así niveles
de nucleótido de adenina.
Preferiblemente, el componente de aminoácido
comprende 300 \mumoles /L de L-glutamato en forma
de sal de sodio, 20 \mumoles /L de L-aspartato en
forma de sal de sodio y 400 \mumoles /L de
L-glutamina.
La tiamina cocarboxilasa juega un papel esencial
en la oxidación de ácidos \alpha-ceto y se
incluye en las composiciones para impedir la acumulación de
piruvato y aldehido de piruvato y con ello la toxicidad de las
células.
En el ciclo de ácido tricarboxílico, TPP es un
cofactor en el metabolismo del ácido
\alpha-cetoglutárico para formar
sucinil-coenzima A, por descarboxilación oxidativa,
o para formar glutamato, por animación reductiva.
En esencia, TPP está implicado en numerosas vías
bioquímicas interrelacionados, especialmente las vías Pentosa
Fosfato y Glicolítica.
La tiamina puede emplearse, por ejemplo, como
tiamina-pirofosfato o como tiamina diamida.
Preferiblemente, el componente de coenzima
comprende 40,0 nmoles /L de tiamina en forma de cloruro de
tiamina-pirofosfato.
Se ha informado que el vitaminoide carnitina
tiene múltiples efectos en la mejora de la función cardíaca
distinta de optimizar simplemente el metabolismo oxidativo, tal
como favoreciendo la utilización de substratos alternativos, y
puede mejorar adicionalmente el flujo sanguíneo coronario. Se
prefiere L-carnitina a los D- o
DL-isómeros, a causa de que no produce inhibición de
acetil coenzima A/metabolismo libre de ácidos grasos.
Preferiblemente, el componente vitaminoide comprende 50,0 \mumoles
/L de
[-]-\beta-hidroxi-\gamma-trimetilamino-butirato
hidrocloruro (L-carnitina). En esta invención, se
pretendió la inclusión del L-isómero de carnitina en
la formulación de la solución para optimizar el transporte de
ácidos grasos de cadena larga desde el citosol dentro de la matriz
mitocondrial al lugar de \beta-oxidación y para
tamponar con ello la relación intramitocondrial acetil CoA/COA
estimulando la síntesis de acetil carnitina desde carnitina
acetiltransferasa. Esta reducción en la relación acetil CoA/COA dará
por resultado una salida de acetilcarnitina desde el mitocondria
con una estimulación asociada del piruvato deshidrogenasa y el
cambio de la inhibición de ácidos grasos de oxidación de glucosa.
Por último, la optimización de la utilización de ácidos grasos
libres como fuente de energía es esencial para todos los tipos de
células, pero esto tiene que realizarse con mantenimiento de
utilización de carbohidratos (glucosa) mediante la función
optimizada de las enzimas implicadas en la glicolisis, por ejemplo,
hexoquinasa, glucoquinasa, fosfofructoquinasa.
D- o DL-isómeros de carnitina son
menos eficaces para cumplir esta función.
El uso de insulina recombinante humana (expresada
en E. Coli) no sólo evita el riesgo de contaminación
antigénica o viral en células/tejidos/órganos receptores, como
puede ser el caso con insulina derivada de otras especies de
mamíferos o animales, sino que conduce a que se consiga una mejor
acomodación de las moléculas de insulina a la estructura receptora
de insulina humana, es decir, se optimizará la especificidad del
receptor para retener muchas funciones asociadas de la insulina en
procesos celulares.
Preferiblemente, el componente de proteína
comprende 28,0 m.I.U./L de insulina humana recombinante (expresada
en E. Coli).
Pocas de las formulaciones descritas para
soluciones de perfusado y de conservación durante los últimos 60
años han incluído insulina, y las que lo han hecho, han utilizado
insulina a niveles no naturales, por ejemplo, 10-50
x 10^{6} mIU/L (es decir, aproximadamente un millón de veces más
concentrado que en las composiciones de acuerdo con la invención).
La razón de esto guarda relación con el hecho de que solamente
existe una pequeña cantidad de la insulina en forma de moléculas
individuales en tales concentraciones. El resto de la insulina
existe en forma de grandes grupos de moléculas de insulina que son
de acción ineficaz, es decir, son necesarias moléculas individuales
de insulina para estimular a los receptores de insulina en las
membranas de las células.
Esencialmente, los efectos bioquímicos de la
insulina no se refieren simplemente a su capacidad para regular el
metabolismo de los carbohidratos y al fácil transporte de la
glucosa circulante dentro de las células, sino también a (i) la
mejora de la actividad de la glucoquinasa intracelular y la
incorporación de aminoácidos en proteínas, (ii) estimulación de la
traslación de ADN, (iii) síntesis de lípidos incrementada, (iv)
estimulación de fosfato de sodio, potasio e inorgánico dentro de las
células.
La invención reconoce que en ausencia de insulina
específica de la especie habrá cambios profundos en el equilibrio
total del metabolismo celular, por ejemplo, gluconeogenesis
incrementada desde proteína, lipolisis incrementada y cetogenesis.
El resultado neto será una disrupción total en la homeostasis
metabólica y en la función celular.
El uso de insulina recombinante humana en las
composiciones de acuerdo con la invención, de preferencia insulina
derivada de suero animal, guarda relación no sólo con el
cumplimiento de las normas de la FDA sino también con el hecho de
que se conseguirá una mejor acomodación de la insulina a los
receptores de insulina humana, es decir, se optimizará la
especificidad del receptor.
Por consiguiente, se han utilizado niveles
normales de suero de insulina en las composiciones de acuerdo con
la invención y esto solamente podría conseguirse acidificando la
insulina para impedir que se formen grupos de insulina, permitiendo
de este modo que existan en solución especies moleculares
individuales de insulina.
Utilizando soluciones de pH alcalino o neutro no
se consigue esta dispersión molecular de moléculas de insulina.
Preferiblemente, se incluye un componente
antibiótico para asegurar que, si se produjera cualquier
contaminación accidental por microorganismos durante el transporte,
podría impedirse la multiplicación de tales microorganismos.
Preferiblemente, el componente antibiótico comprende 10 a 150 mg/L,
más preferiblemente 100 mg/L, de ácido de
D-[-]-teo-2-dicloroacetamida-I-(p-nitrofenil)-1,3-propano
(cloranfenicol). Pueden utilizarse otros antibióticos, pero tiene
que ponerse cuidado para asegurar que el antibiótico particular
empleado no interfiere con los tejidos u órganos que están siendo
transportados o almacenados.
Las concentraciones de especies iónicas en
soluciones de acuerdo con la invención reconocen los coeficientes
de actividad de cada especie iónica y no simplemente sus
concentraciones totales de suero. Por ejemplo, la unión de suero de
Ca^{2+} y Mg^{2+} tiene que diferenciarse de los niveles reales
libres ionizados de estos iones. Los iones de magnesio son
importantes en una pluralidad de reacciones celulares críticas, y
se informa que su presencia extracelular estimula la actividad
respiratoria mitocondrial y modula los efectos de la rápida entrada
de calcio y salida de potasio. Igualmente, tiene que estar presente
una concentración adecuada de iones de calcio en la solución de
conservación para evitar la paradoja del calcio, observada tras la
exposición subsiguiente del órgano donante a niveles de calcio de
suero total tras reperfusión y transplante. Adicionalmente, la
conductividad iónica de soluciones de acuerdo con la invención es
comparable a la del suero humano, es decir, 12,6 mS cm^{-1} y
como tal mantiene el estado ionizado de la membrana celular y las
actividades de los restos enzimáticos. En la mayoría de las
soluciones de conservación tienen un gran interés los niveles de
potasio y sodio, ya que la concentración de iones de potasio es
unas veinticinco veces más alta y de sodio cinco a quince veces más
baja que sus niveles de suero.
Una solución de acuerdo con la invención es
isostómica al suero humano (alrededor de 290 mOsmoles/L) y no
parece necesitar la inclusión de expansores de plasma, como lo
demuestra el hecho de que solamente se producen cambios secundarios
(alrededor del 8%) en hidratación durante perfusión hipodérmica de
larga duración (es decir, 4-52 h) de las
preparaciones de corazón de rata y nervio-músculo
visceral aislados. Esto puede explicarse por el hecho de que la
membrana de las células se encuentra a continuación de una fase
intersticial del 99% de gel proporcionando así un tamponado
coloidal natural superior al intercambio de equilibrio iónico Donnan
a través de la membrana de las células. La mayor parte de la
presión osmótica es proporcionada por Na^{+} y sus aniones
acompañantes y solamente un pequeño componente (alrededor del 0,5%)
puede atribuirse a proteínas de plasma y de este modo no ha
justificado la inclusión de agentes oncóticos en soluciones de
acuerdo con la invención. La práctica de incluir agentes oncónicos,
como en otras soluciones de perfusado/conservación comercialmente
disponibles, se ve además comprometida por su afinidad por
Ca^{2+} y Mg^{2+}, necesitando diálisis anterior en solución de
nueva aportación para no perturbar la composición catiónica del
perfusado. La naturaleza lábil de los expansores de polipéptidos
hace también que no sean prácticos por su predisposición a la
desnaturalización mecánica como ocurre en su preparación y
circulación a través del aparato de perfusión. Lamentablemente,
aunque estos expansores coloidales son esencialmente no tóxicos, su
uso en fluidos de conservación está contraindicado en cuanto a que,
por ejemplo, (1) la viscosidad elevada aumenta el grosor de la capa
``no agitada'' alrededor de las células obstaculizando así la
difusión de metabolitos, (2) la alteración del potencial
bioeléctrico de la membrana superficial perturbando así el
metabolismo celular y las actividades del receptor, (3) la
antigenicidad de los expansores proteínicos, (4) la aglutinación y
la hemólisis de RBC, y (5) el bloqueo de microvasculatura e
isquemia.
Entre los potenciales usos de las soluciones de
acuerdo con la invención se encuentran como un medio de
lavado/retención/conservación/transporte para células de médula
ósea humana a 4ºC (véase el Ejemplo 6) y embriones de mamíferos
(entre otros) durante 12-48 horas a 20 a 37ºC (véase
el Ejemplo 4). En agricultura esto podría utilizarse para embriones
de especies tales como ovejas, cabras, ciervos, ganado, cerdos y
caballos.
Otro potencial uso es como solución no congelada
para su uso como medio para almacenar semen durante
24-48 horas a 20 a 25ºC. Las técnicas hasta ahora
utilizadas con esta finalidad se limitan solamente a congelar el
esperma con éxito altamente variable. La solución es
particularmente útil para semen de animales porcinos ya que el
semen de animales porcinos no puede ser congelado en comparación
con el semen de ganado bovino.
En aplicaciones in vitro para acomodarse a
una diversidad de preparaciones de órganos/tejidos de animales se
utilizaron en técnicas fisiológicas y farmacológicas de bioensayo
para experimentación científica a niveles de exploración de
estudiante de investigación, por ejemplo,
- a)
- preparaciones perfundidas (canuladas)/perifundidas de corazón/corazón-pulmón, hígado, riñón de ratón, rata y cobaya
- b)
- preparaciones perifundidas de músculo visceral, por ejemplo, vasos sanguíneos, tracto G.I., biopsias de tracto reproductor
- c)
- biopsias perifundidas de músculos del esqueleto de mamíferos, por ejemplo, de ratón, rata, conejo y seres humanos,
- d)
- trozos de tejido perifundido, por ejemplo, hígado y cerebro.
La preparación de soluciones de acuerdo con la
invención es sensible al método mediante el cual se preparan y
almacenan soluciones de partida, y al orden en que son
incorporadas. Se da el siguiente Ejemplo como un caso del método
preferido de combinar los diversos ingredientes en las
composiciones.
En lo que sigue, se preparó
tiamina-pirofosfato (cocarboxilasa), Sigma C4655,
en forma de una solución de partida de 0,4 mg/mL en agua purificada
MilliQ (exenta de endotoxinas), y se almacenó congelado en frascos
de vidrio oscuro. Se preparó cloruro de colina (Sigma C7527) en
forma de una solución de partida de 17,5 mg/mL en agua purificada
MilliQ exenta de endotoxinas y se almacenó congelada en frascos de
vidrio. Se preparó insulina recombinante humana (Sigma 10259) en
forma de una solución de partida de 0,5 I.U./mL en agua purificada
MilliQ exenta de endotoxinas acidificada hasta pH 2,4 con 0,1 N
ácido clorhídrico y se almacenó congelada en frascos de vidrio.
En las siguientes preparaciones, se utilizó en
todo el proceso agua purificada MilliQ exenta de endotoxinas, tanto
en la agitación inicial como en la dilución final.
Para la preparación, se llenó un recipiente de
acero inoxidable con 8 litros de MilliQ y se pesaron y se
añadieron, al tiempo que se agitaban constantemente, los siguientes
ingredientes, en el siguiente orden: 642,96 gramos de cloruro de
sodio (CFK0484), 37,28 gramos de cloruro de potasio (BDH10198),
18,38 gramos de cloruro de calcio dihidrato (BDS10117), 9,14 gramos
de cloruro de magnesio hexahidrato (BDH101494) y 106,61 gramos de
ácido libre de BES (Sigma B6266), 1,84 miligramos de
tiamina-pirofosfato (Sigma C9655) (utilizando 4,6 mL
de la solución de partida), 0,9899 gramos de
L-carnitina (Sigma C0238), 0,1397 gramos de cloruro
de colina (Sigma 7527) en forma de 8 ml de la solución de partida,
1,013 gramos de glicerol (Sigma G2025), 2,8 I.U. de insulina
recombinante humana (5 ml de la solución de partida), 0,310 gramos
de sal de L-aspartato sodio (Sigma A6683), 180,2
gramos de D-glucosa anhidra (Sigma G7021), 5,07
gramos de sal de L-glutamato sodio (Sigma G5889) y
5,84 gramos de L-glutamina (Sigma G5763). Todo el
conjunto se agitó hasta que se disolvió completamente y luego se
produjo el volumen final de 10 litros añadiendo además agua
purificada MilliQ.
Se filtró la solución a través de un filtro
esterilizado (0,2 \mum Sartobran PH) en botellas de vidrio
herméticamente cerradas esterilizadas de 100 mL.
Esta solución es un concentrado 10x de la
solución prevista para su uso. Cuando sea necesario, puede diluirse
con la cantidad apropiada de MilliQ.
Para uso como solución de perfusión y
conservación, pueden diluirse 100 ml del concentrado con 900 mL de
agua purificada MilliQ doblemente desionizada o exenta de
endotoxinas hasta 1 litro con la adición de 2,5 g de bicarbonato de
sodio exento de endotoxinas (Sigma S4019) y almacenarse a
8-10ºC antes del uso. No se añade bicarbonato de
sodio a los concentrados antes de que se almacenen, ya que el
almacenamiento prolongado del concentrado que contiene iones
bicarbonato puede producir precipitaciones de carbonato de
calcio.
Para su uso como solución de perfusión y
conservación, cada litro de solución puede contener 100 mg/L de
cloranfenicol (Sigma C3175) para evitar el riesgo de contaminación
bacteriana como puede ocurrir durante períodos prolongados de
experimentación in vitro en condiciones de exposición a la
atmósfera.
Los siguientes factores son muy importantes en la
preparación de composiciones de acuerdo con la invención. Los
factores más críticos son:
\newpage
- 1.
- El método de unión de las soluciones de acuerdo con la invención y específicamente:
- 2.
- El uso de agua MilliQ exenta de endotoxinas para preparar todas las soluciones de partida y las botellas de concentrado 10x de soluciones fabricadas de acuerdo con la invención.
- 3.
- El método de preparar soluciones de partida esterilizadas de acuerdo con la invención y concentrados en que no interviene autoclave o irradiación - por ejemplo, la irradiación para conseguir esterilidad daría por resultado la degradación de la glutamina y probablemente del TPP.
- 4.
- El uso de botellas de vidrio para todo el almacenamiento de materia prima y concentrados 10x de soluciones de acuerdo con la invención.
- 5.
- Preparación de insulina solubilizada por acidificación a pH 2,4 más almacenamiento de soluciones de partida de insulina congeladas.
- 6.
- Preparación de tiamina-pirofosfato más soluciones de partida de TPP almacenadas congeladas en condiciones de oscuridad (véase a continuación la razón de ello).
- 7.
- La preparación de cloruro de colina más soluciones de partida almacenadas congeladas.
- 8.
- El uso de cloruro de magnesio hexahidrato (es decir, 6 H_{2}O). Esto es debido a que, si se utiliza la sal deshidrato, entonces, como adsorbe agua, el peso utilizado para calcular el contenido preciso de iones de magnesio dará error - ésta es una razón corriente de que se preparen incorrectamente soluciones de Krebs en función de niveles correctos de iones de Mg y de iones de Ca.
No es posible omitir ninguno de los componentes
preferidos cuando se formulan soluciones de acuerdo con la
invención. Todos estos componentes actúan en sinergia para producir
el efecto fisiológico global equilibrado. Este es el motivo por el
cual el uso de insulina humana y L-carnitina
solamente se añadirá a la obtención global de viabilidad de este
medio líquido versátil de mamíferos.
1. Soluciones de partida: se han preparado
y experimentado con éxito diversas concentraciones de partida de
soluciones de acuerdo con la invención, a saber, 1x, 10x y 20x para
almacenamiento de larga duración, pero los concentrados de partida
preferidos son concentrados 10x que utilizan agua MilliQ exenta de
endotoxinas y filtrada y esterilizada en botellas herméticamente
cerradas de 100 mL para almacenamiento en condiciones de oscuridad a
3-8ºC. Se reconstituyen soluciones de partida para
su uso como soluciones de concentrado 1x mediante la adición de 100
mL de concentrados 10x de soluciones de partida a 900 mL de agua
purificada MilliQ doblemente desionizada o exenta de endotoxinas
con la adición de 2,1 g de bicarbonato de sodio para dar un pH final
de 7,22 \pm 0,04 a 20ºC. Las concentraciones 10x de materia prima
esterilizada de soluciones de acuerdo con la invención tienen un pH
de 4,6 \pm 0,2 y se ha demostrado que se retienen como tales
durante períodos de hasta cinco años. La vida en anaquel
recomendada por el fabricante de los concentrados de partida 10x de
soluciones de acuerdo con la invención es de 14 meses cuando se
almacenen a 3-8ºC.
2. Cocarboxilasa: se preparan soluciones
de partida de cloruro de tiamina-pirofosfato
(cocarboxilasa) a 18,4 g/mL utilizando agua filtrada esterilizada
purificada MilliQ exenta de endotoxinas en frascos oscuros
herméticamente cerrados para impedir la degradación fotónica del
tiamina-pirofosfato y se almacenan congelados antes
de la unión de los concentrados de partida 10x de soluciones de
acuerdo con la invención.
3. Insulina: se prepara insulina
recombinante humana en forma de soluciones concentradas de partida
acidificadas (pH 2,4) a 0,5 m I.U/mL utilizando agua purificada
MilliQ exenta de endotoxinas y se filtra esterilizada en frascos
herméticamente cerrados y se almacena congelada antes de la unión de
los concentrados de partida de soluciones de acuerdo con la
invención.
4. Colina: se preparan soluciones de
partida de cloruro de colina a 17,45 mg/mL utilizando agua
purificada MilliQ exenta de endotoxinas y se almacenan congeladas
en frascos herméticamente cerrados antes de la unión de los
concentrados de partida de soluciones de acuerdo con la
invención.
5. El cloranfenicol no es un componente esencial
de soluciones de acuerdo con la invención, pero se añade
preferiblemente, durante el almacenamiento, o después de que se
hayan abierto los frascos almacenados, para asegurar la esterilidad
durante la exposición prolongada de las soluciones a la atmósfera,
por ejemplo, durante la perfusión o perifusión, o procedimientos de
conservación no perfundida.
Los siguientes ejemplos adicionales muestran el
uso de soluciones de acuerdo con la invención.
Los dibujos que se acompañan son gráficos que se
explican en los ejemplos, de la manera siguiente:
La figura 1 es un gráfico explicado en el Ejemplo
2;
La figura 2 es un gráfico explicado en el Ejemplo
3;
Las figuras 3, 4, y 5 son gráficos explicados en
el Ejemplo 6.
Se ha utilizado con resultados satisfactorios un
medio fisiológico de acuerdo con la invención, preparado según el
Ejemplo 1, y llamado en lo que sigue solución RS-I,
como medio de perfusión y conservación en experimentos fisiológicos
y farmacológicos, que utilizan una diversidad de tejidos y órganos
diferentes, aislados de una diversidad de especies de mamíferos,
incluídas biopsias humanas.
El diseño de la formulación se basa en la
composición química y física del suero humano que se refiere aquí a
su aplicación ``universal'' y los resultados conseguidos hasta la
fecha (véase la Tabla 1).
El uso de un sistema tampón que no usa fosfato
para mantener valores de pH estables de embriones aislados (véase
el Ejemplo 5) y células humanas (véase el Ejemplo 6), y
tejidos/órganos durante el almacenamiento a 3-10ºC o
perfusión a 20-37ºC (Tabla 1) soporta el uso
contradictorio de medios convencionales tamponados con fosfato
(Tabla 2).
Este punto ha sido validado en experimentos
diseñados para comparar los efectos adversos de medios tamponados
con fosfato (por ejemplo, Krebs & Henseleit; Dulbecco) frente a
la solución RS-I no tamponada con fosfato (véase la
Tabla 3). El uso de soluciones tamponadas con fosfato está
contraindicado en el almacenamiento de transplantes de hígado
basándose en los resultados obtenidos en biopsias de hígado de rata
aislado, en que se observó una pérdida importante de lactato de
hidrogenasa (LDH) después de sólo 10 minutos de perfusión con
perfusado Krebs & Henseleit (Figura 1). La adición de piruvato
al perfusado (como ha sido propuesto por otros, por ejemplo, véase
el documento WO98/04127) para compensar la inhibición de glicolisis
por iones fosfato, está contraindicado, ya que se sabe que el
piruvato produce la inhibición de las subunidades H_{4} y
H_{3}M de LDH en el hígado y simplemente acentuaría el deterioro
observado.
| Especie | Tejido/Organo | Máx. Días | Condiciones de conservación | |
| Preparaciones | Almacenadas in vitro °C | Exp. °C | ||
| Rata | yeyuno | 9,0 | 8-12 | 35 |
| '' | '' | 1,5 | - | 35 |
| '' | íleon | 8,0 | 8-12 | 35 |
| '' | '' | 1,3 | - | 35 |
| '' | colon | 5,0 | - | 20-35 |
| '' | útero | 3,0 | - | 35 |
| '' | '' | 10,0 | 8-12 | 35 |
| '' | músculo detrusor | 2,0 | - | 20-35 |
| '' | músculo de diafragma | 0,6 | - | 35-37 |
| '' | '' | 2,0 | - | 20-35 |
| '' | músculo sóleo | 1,1 | - | 20-35 |
| '' | corazón | 0,8 | - | 35-37 |
| '' | '' | 2,1 | - | 20-25 |
| '' | corazón-pulmón | 1,2 | - | 20-35 |
| '' | RBC's | 4,0 | No hemolisis a 4°C | |
| '' | riñón | 1,0 | - | 20-35 |
| '' | hígado | 0,3 | - | 35 |
| conejo | intestino | 5,0 | 8-12 | 37 |
| '' | '' | 2,0 | - | 20-37 |
| '' | útero | 7,0 | 8-12 | 37 |
| '' | ganglio cervical superior | 2,0 | 8-12 | 37 |
| '' | '' \quad '' | 0,8 | - | 37 |
| '' | RBC's | 3,0 | No hemolisis a 4°C |
TABLA 1
(continuación)
| Especie | Tejido/Organo | Máx. Días | Condiciones de conservación | |
| Preparaciones | Almacenadas in vitro °C | Exp. °C | ||
| cobaya | íleon | 7,0 | 8-12 | 37 |
| '' | músculo detrusor | 4,0 | 8-12 | 37 |
| '' | '' | 1,0 | - | 20-37 |
| '' | corazón | 0,4 | - | 20-37 |
| ratón | sóleo | 0,9 | - | 20-35 |
| '' | diafragma | 1,5 | - | 20-35 |
| '' | intercostal mepp | 0,9 | - | 20-35 |
| '' | diafragma descarga | 1,5 | - | 20-35 |
| humana | intercostal análisis | 1,3 | - | 37 |
(Tabla 2 pasa a página
siguiente)
Se llama la atención a la Figura 1, una
comparación de la actividad del lactato deshidrogenasa (LDH) medido
en perfusados procedentes del hígado de rata aislado durante
perfusión/perifusión con solución RS-I
(\multimapdotboth) y solución salina
Krebs-Henseleit (\multimapboth) en un baño de
perfusión Res-Del(r). Un análisis del
transcurso de tiempo de fuga de LDH utilizando un programa Anova
de medición repetida indica una fuga muy importante (p<0,001) de
esta enzima intracelular procedente de preparaciones de hígado de
rata aislado (n = 5) mantenidas en solución salina K & H frente
a solución RS-I. Obsérvese que la fuga de Lactato
Deshidrogenasa (LDH) desde preparaciones mantenidas en solución
salina Krebs-Henseleit se produjo dentro de los 10
primeros minutos, mientras que la fuga de LDH en perfusados
\hbox{RS-I} no fue importante hasta los
90 minutos y sólo mostró una fuga definitiva después de 240
minutos.
Cada barra indica un error estándar del medio
(SEM).
La composición normalizada y estable de solución
RS-I en función del tiempo de almacenamiento,
característica no encontrada con soluciones convencionales
tamponadas con fosfato, asegura que las preparaciones aisladas en
cada prueba de fármacos presenten respuestas fisiológicas normales
en comparación con la capacidad de respuesta decremental observada
en soluciones tamponadas con fosfato (por ejemplo, soluciones
salinas Krebs & Henseleit, Tyrode's, Hank's).
En experimentos destinados a probar la validez de
utilizar una solución RS-I con preferencia a
solución salina convencional Krebs & Henseleit en preparaciones
aisladas de diafragma de rata, se observó que después de 1 hora de
perfusión había una disminución del 18,6% en la respuesta nerviosa
neuralmente evocada en comparación con una disminución del 2,9% en
preparaciones perfundidas RS-I (Tabla 3).
Esta observación fue validada además en
experimentos para demostrar el efecto potenciador de la
betametasona (Betnesol(r); Glaxo Ltd, NZ), en respuestas
nerviosas neuralmente evocadas en esta preparación (Parr y otros.
British J. Anaesthesia, 67, 447-451; Robinson y
otros Anesth. Analg. 74, 762-765), en que era
imperativo que las preparaciones no presentaran ningún decremento
en palidez tetánica bajo condiciones de ``control'' durante los
períodos de tiempo experimentales, a fin de validar la hipótesis de
que la betametasona tuviera un efecto potenciador de liberación
neurotransmisora. No se encontró que fuera el caso utilizando
solución salina Krebs and Henseleit, incluso durante los 30
primeros minutos del período de tiempo experimental (véanse la
Tabla 3 y la Figura 2).
En otra serie de experimentos, se probó la
preparación clásica de íleo de cobaya en solución
RS-I y se encontró que continuaba funcionando y
presentando respuestas farmacológicas normales hasta durante 7
días. Tales preparaciones se han almacenado alternativamente en
solución RS-I a 8 - 10ºC y se han utilizado luego
con resultados satisfactorios en pruebas de fármacos, ahorrando de
este modo la cantidad de animales que tenían que ser
sacrificados.
Por consiguiente, se cree que la validez de
cualesquiera respuestas de bioensayo de fármacos registradas
utilizando una solución tamponada con fosfato en forma de perfusado
de diagnóstico se ve seriamente comprometida por los efectos
perjudiciales que se producen, como se informó previamente (Tabla
2).
| Datos de respuesta nerviosa registrados desde preparaciones de diafragma de rata | ||||
| perfundidas con soluciones RS-I y Krebs \textamp Henseleit a 35ºC | ||||
| Tiempo (min) | Solución RS-I | Solución salina Krebs \textamp Henseleit | ||
| n | % de respuesta\ddagger | n | % de respuesta\ddagger | |
| [medio \pm SEM] | [medio \pm SEM] | |||
| 30 | 8 | 02\pm1,7 | 10 | 115\pm2,7 |
| 60 | 8 | 2,9\pm1,8 | 9 | 18,6\pm2,7 |
| 90 | 8 | 7,0\pm1,3 | 8 | 27,2\pm4,3 |
| 120 | 8 | 10,2\pm2,6 | 9 | 31,2\pm3,8 |
| 150 | 8 | 14,9\pm3,5 | 10 | 36,1\pm3,7 |
| 180 | 7 | 18,8\pm4,0 | 9 | 38,0\pm3,6 |
| \ddagger Las respuestas se expresan como el porcentaje de contracción nerviosa a intervalos | ||||
| de 30 minutos en comparación con la contracción nerviosa inicial en el instante cero. |
El advenimiento de la cirugía de
by-pass y de los transplantes de corazón ha
acelerado la investigación de vehículos cardioplégicos mejorados, a
causa de que el incremento del tiempo de retención cardioplégica
permitirá que se realice una cirugía cardíaca más comprometida, sin
las actuales limitaciones de tiempo de 45 minutos.
Igualmente, se agrandaría el área del grupo de
donantes en función del tiempo y las restricciones geográficas
actuales, y se facilitaría un uso más eficaz de los órganos de
donantes superando la adaptación cruzada de tejido en el
receptor.
Puede utilizarse una solución cardioplégica para
servir a dos fines principales. En primer lugar, en la situación
de cirugía in vivo, tal como by-pass
coronario y cirugía de sustitución de válvulas, en que se para el
corazón durante un período relativamente corto (inferior a 45
minutos), con una combinación de hipotermia (moderada o extrema) y
una de una pluralidad de soluciones cardioplégicas.
En segundo lugar, puede darse una situación para
el uso de una solución cardioplégica en caso de cirugía de
transplante, en que se extirpa el corazón del donante y se
transporta en una solución de conservación cardioplégica
RS-C, por ejemplo, RS-I con 25,0
mmoles/L de sulfato de magnesio, al receptor para conservar el
estado metabólico del tejido.
Los principales objetivos de una solución
cardioplégica son resumidos por Buckberg (J. Thoracic Cardiovasc.
Surg. 77, 803-815):
- \bullet
- proteger el miocardio de los efectos perjudiciales de la isquemia,
- \bullet
- reducir los requisitos de energía del músculo, pero proporcionando un ambiente en el que continúa la producción de energía,
- \bullet
- detener el corazón con seguridad.
Una solución cardioplégica tiene que satisfacer
estos objetivos así como también impedir los efectos negativos de
la acidosis y edema y estabilizar la membrana para impedir la
pérdida innecesaria de iones intracelulares.
En este estudio, se aisló una versión
horizontalmente alineada de la preparación de corazón
Langendorff en un sistema de baño de perfusión
Res-Del(r) 589 y se utilizó para determinar
la viabilidad de la RS-C cardioplégica. La
preparación Langendorff modificada utilizada hizo posible
mediciones simultáneas del ritmo cardíaco y de los cambios
isovolumétricos en la preparación, a través de un transductor de
presión en línea.
Se midieron también caudales coronarios y un
análisis de la actividad electrocardiográfica.
Las técnicas cardioplégicas empleadas fueron una
de infusión continua de la solución cardioplégica en el sentido
retrógrado o, como se practica convencionalmente en la cirugía de
by-pass de corazón, una ``sola'' inyección de bolo
opuesto de la solución cardioplégica. Se supuso que una infusión
continua evitaría el desarrollo de isquemia o hipoxia durante
episodios cardioplégicos. Los resultados obtenidos en las tablas
4-6 indicaron que se había conseguido una
conservación del 100% de actividad funcional en los corazones
detenidos durante períodos de hasta seis horas en un margen de
temperaturas de 20-35ºC.
Como cuestión interesante, la recuperación de
porcentaje no pareció que dependiera de los caudales coronarios que
eran negativos en los experimentos realizados durante
3-6 horas.
| Efecto de solución RS-C perfundida sobre la preparación de rata Langendorff Res-Del(r) | |||||
| Cora- | CP- | CFR % | % Recuperación | % Recuperación | CFR % |
| zón | Periodo | Cambio | WD @ 5 min | WD @ 40 min | Cambio |
| Nos. | (hora) | durante | @ 40 | ||
| CP | min | ||||
| 6 | 1 | +3 | +83 | +22 | -12 |
| 6 | 3 | -40 | -68 | -7 | -46 |
| 6 | 6 | -49 | -20 | +5 | -56 |
| Tiempos medios hasta cesación y recuperación de preparaciones ``cardioplégicas'' de | ||||||
| corazón de rata Langendorff Res-Del(r) | ||||||
| Corazón | 1 hora | 3 horas | 6 horas | |||
| Nos. | CP-Periodo | CP-Periodo | CP-Periodo | |||
| Parada | Inicio | Parada | Inicio | Parada | Inicio | |
| 6 | 34 | 142 | 25 | 93 | 44 | 91 |
| Efecto de soluciones RS-C de bolo ``Individual'' sobre la preparación de corazón de rata | ||||
| Working Res-Del(r) | ||||
| Corazón | CD-Periodo | % | % | CFR % |
| Nos. | Recuperación | Recuperación | cambio @ | |
| WD | WD | 40 min | ||
| @ 10 min | @ 40 min | |||
| 4 | 1 | +1 | +18 | -56 |
| 4 | 3 | +33 | +21 | -40 |
En pruebas independientes, se probó la solución
RS-I como medio de ``lavado'', ``retención'' e
incubación para embriones de mamíferos (entre otros) contra medios
tamponados con fosfato comercialmente disponibles durante
12-18 horas.
En estos experimentos se incubó embrión de cabra
en medios Dulbecco's, Whittingham's y RS-I a 38ºC
durante 12-18 horas para evaluar el índice de
supervivencia.
Los resultados indicaron que la solución
RS-I ofrecía conservación superior (75%) en
comparación con Dulbecco's (24%) y Whittingham's (38%) para
incubación de media a larga duración de embriones (Tabla 7).
En otro estudio independiente realizado en
embriones de ganado, se evaluó la selección del tampón Good's, BES,
en comparación con los tampones Good's, HEPES y MOPS y solución
convencional de tamponado con fosfato, PBI.
Estos resultados indicaron que solamente en la
solución tamponada con RS- I/BES los embriones mostraron alguna
mejora en el desarrollo (Tabla 8), aun cuando estuvieron
comprometidos por la incubación inicial en solución PBI y una
inhibición anticipada de su estado metabólico (se hace referencia
a la Tabla 2).
| Estudio comparativo en solución RS-I como medio para conservación de embriones de cabra | |||
| Medio de | Números de embriones^{a} | ||
| Prueba | Supervivientes | Degenerados | Totales |
| Dulbecco's PBS + | 13 | 42 | 55 |
| 10% de suero | (24%) | (76%) | |
| de cabra | |||
| Whittingham's | 22 | 36 | 58 |
| + 10% de suero | (38%) | (62%) | |
| de cabra | |||
| Solución RS-I | 36 | 12 | 48 |
| (75%) | (25%) |
^{a} Se incubaron embriones
12-18 horas a 38ºC con 100% de humedad
| Evaluación de soluciones RS-I [BES], HEPES-HOLD, MOPS-HOLD y PBI-HOLD como | ||||
| medio de cultivo para embriones de ganado | ||||
| Medio | N | % | % | % |
| más pobre | igual | mejorado | ||
| HEPES / HOLD | 12 | 17 | 75 | 8 |
| MOPS / HOLD | 13 | 8 | 92 | 0 |
| BES / RS-I | 15 | 40 | 40 | 20 |
| HOLD | 15 | 27 | 73 | 0 |
| PBI-HOLD |
Los resultados de RS-I en estas
pruebas estuvieron comprometidos a causa de que TODOS los
embriones de ganado fueron ``lavados'' y ``retenidos'' en
solución de fosfato (PBl) enriquecida con BSA por espacio de hasta 6
horas antes de la experimentación en los diferentes tipos de medios
tamponados con Good's.
El uso adicional de RS-I en tales
aplicaciones en la conservación de embriones durante las ``fases de
retención'' reside en el hecho de que ha demostrado que es
igualmente eficaz en condiciones hipotérmicas moderadas en
términos de conservación de células, tejidos y órganos.
En pruebas independientes realizadas en Life
Technologies Inc. N.Y. EE.UU., se evaluó solución
RS-I frente a formulaciones convencionales
suplementadas con suero o de medios exentos de suero como medio de
retención durante el almacenamiento temporal de células de médula
ósea humana recientemente recogidas.
Los procedimientos experimentales implicaban
mezclar un mL de médula ósea con un mL de los siguientes medios de
prueba:
\bullet IMDM + 20% FBS
\bullet StemPro(tm)-34
sin factores de crecimiento recombinante
\bullet lote 3106 de medios
RS-I/Res-Del
\bullet lote 7002 de medios
RS-I/Res-Del
Luego se pusieron las muestras de medios y médula
a 4ºC. Partes alícuotas de la médula se mancharon con anticuerpos
para análisis citométrico de flujo.
Partes alícuotas adicionales de la médula ósea se
sembraron en StemPro(tm)-34 suplementándose
con los factores de crecimiento recombinante humano: Stem Cell
Factor (100 ng/mL), lL-3 (50 ng/mL) y
GM-CSF (25 ng/mL). Las células se incubaron durante
seis días a 37ºC en una atmósfera humidificada de 5% de CO_{2} y
aire.
Después de almacenamiento a 4ºC durante 24 y 48
horas, se tomaron partes alícuotas de la médula ósea en los medios
indicados para recuentos de células y viabilidad como se ha
descrito en lo que antecede. Se mancharon también partes alícuotas
para análisis citométrico de flujo y expansión de células ex
vivo como se ha descrito.
Durante el transcurso se este estudio, la
viabilidad de las células determinada por exclusión de colorante
Trypan Blue, permanecía esencialmente al 100% para las células de
médula ósea, independientemente de la formulación de los medios.
Durante el almacenamiento a 4ºC hubo un ligero, pero no importante,
aumento en el número de células en todas las formulaciones probadas
(véase la Figura 3).
El potencial de proliferación de las células
progenitoras en la médula ósea cultivando partes alícuotas de la
médula ósea en StemPro(tm)-34 con suplemento
de una combinación de factores de crecimiento recombinante humano
demostró que favorecía la expansión de las células.
Se cultivaron partes alícuotas de las células de
médula ósea almacenadas en las diversas formulaciones de medios
probadas en StemPro(tm)-34 con suplemento de
los factores de crecimiento recombinante humano SCF (100 ng/mL),
IL-3 (50 ng/mL) y GM-CSF (25
ng/mL). Las células se desarrollaron durante 6 días, y luego se
determinaron cómputos de células utilizando un Contador Coulter.
Todas las formulaciones de medios probadas
demostraron una disminución similar en la proliferación de las
células progenitoras después de 24 y 48 horas de almacenamiento
(Figura 4).
Se concluyó que podía utilizarse solución
RS-I como alternativa a los medios tamponados con
fosfato para evitar los efectos perjudiciales publicados sobre
células, tejidos y órganos aislados de mamíferos (véase la Tabla
2).
Claims (14)
1. Un medio fisiológico, que comprende una
solución acuosa en agua purificada esterilizada de (i) un componente
de sal que comprende: (a) de 100 a 150 mmoles /L de iones de sodio,
(b) de 2,5 a 6,2 mmoles /L de iones de potasio, (c) de 0,1 a 2,5
mmoles /L de iones de calcio, (d) de 0,4 a 25 mmoles /L de iones de
magnesio, y (e) de 96 a 126 mmoles /L de iones cloruro; (ii) un
componente tampón que comprende: (f) de 21 a 27 mmoles /L de iones
bicarbonato, y (g) de 1 a 12 mmoles /L de TES, MOPS o BES; (iii) un
componente de substrato que comprende: (h) 2 a 11 mmoles /L de
glucosa, (i) 50 a 150 \mumoles /L de glicerol, y (j) 7 a 15
\mumoles /L de colina; (iv) un componente de aminoácido que
comprende: (k) 5 a 400 \mumoles /L de glutamato, (l) 5 a 200
\mumoles /L de aspartato, y (m) 100 a 2000 \mumoles /L de
glutamina; (v) un componente de coenzima que comprende: (n) 1 a 120
nmoles /L de tiamina cocarboxilasa; (vi) un componente vitaminoide
que comprende: (o) 40 a 70 \mumoles /L de D- o DL- o
L-carnitina; (vii) un componente de proteína que
comprende: (p) 5 a 200 m I.U./L de insulina humana.
2. Un medio fisiológico según la reivindicación
1, que comprende (viii) un componente antibiótico que incluye: (q)
10 a 150 mg/L de cloranfenicol.
3. Un medio fisiológico según la reivindicación 1
ó 2, en el que el componente de sal comprende: (c) de 1,0 a 2,5
mmoles/L de iones de calcio, y (d) de 0,4 a 2,4 mmoles/L de iones
de magnesio.
4. Un medio fisiológico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 3, en el que el componente de sal comprende
135,32 mmoles/L de iones de sodio, 5,00 mmoles/L de iones de
potasio, 1,25 mmoles/L de iones de calcio, 0,45 mmoles/L de iones
de magnesio, en forma de sales cloruro, y 118,40 mmoles/L de iones
cloruro en forma de sales de sodio, potasio, calcio y magnesio.
5. Un medio fisiológico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, en el que el componente tampón
comprende 25,00 mmoles/L de iones bicarbonato en forma de sal de
sodio y 5,0 mmoles/L de ácido N,N-Bis
(2-hidroxietil)-2-amino-etanosulfónico
(BES).
6. Un medio fisiológico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 5, en el que el componente de substrato
comprende 10 mmoles/L de D-glucosa, 110 \mumoles/L
de glicerol y 10,0 \mumoles/L de colina en forma de sal
cloruro.
7. Un medio fisiológico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, en el que el componente de aminoácido
comprende 300 \mumoles/L de L-glutamato en forma
de sal de sodio, 20 \mumoles/L de L-aspartato en
forma de sal de sodio y 400 \mumoles/L de
L-glutamina.
8. Un medio fisiológico según cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 7, en el que el componente de coenzima
comprende 400 nmoles/L de tiamina en forma de cloruro de
tiamina-pirofosfato.
9. Un medio fisiológico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 8, en el que el componente vitaminoide
comprende 50,0 \mumoles/L de hidrocloruro de
[-]-\beta-hidroxi-\gamma-trimetilaminobutirato
(L-carnitina).
10. Un medio fisiológico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 9, en el que el componente de proteína
comprende 28,0 m.I.U./L de insulina humana recombinante (expresada
en E.coli).
11. Un medio fisiológico según una cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 10, en el que el componente antibiótico
comprende 100 mg/L de ácido de
D-[-]-teo-2-dicloroacetamida-I-(p-nitrofenil)-1,3-propano
(cloranfenicol).
12. Un método para producir un medio fisiológico
según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende
añadir, en el siguiente orden, cloruro de sodio, cloruro de
potasio, cloruro de calcio, cloruro de magnesio, TES, MOPS, o BES,
tiamina, carnitina, colina, glicerol, insulina, aspartato, glucosa,
glutamato, glutamina, y bicarbonato de sodio a agua purificada
esterilizada, con constante agitación, haciéndolo hasta el volumen
deseado, filtrar y almacenar en recipientes esterilizados
herméticamente cerrados.
13. Concentrados para la preparación de un medio
fisiológico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que
comprenden los componentes de sal, tampón, substrato, aminoácido,
coenzima, vitaminoide y proteína, y diluibles con agua purificada
esterilizada para formar dicho medio fisiológico.
\newpage
14. Concentrados para la preparación de un medio
fisiológico según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que
comprenden los componentes de sal, tampón, substrato, aminoácido,
coenzima, vitaminoide y proteína, excepto bicarbonato de sodio, y
diluibles con agua purificada esterilizada con la adición de
bicarbonato de sodio para formar dicho medio fisiológico.
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