EP4666073A1 - Verfahren zur bestimmung des ladungszustandes von proteinen - Google Patents

Verfahren zur bestimmung des ladungszustandes von proteinen

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Publication number
EP4666073A1
EP4666073A1 EP24705124.6A EP24705124A EP4666073A1 EP 4666073 A1 EP4666073 A1 EP 4666073A1 EP 24705124 A EP24705124 A EP 24705124A EP 4666073 A1 EP4666073 A1 EP 4666073A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
wells
proteins
values
microtiter plate
different
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP24705124.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Kristina LECHNER
Christine WOSNITZA
Aris PERROU
Sebstian GIEHRING
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Paia Biotech GmbH
Original Assignee
Paia Biotech GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Paia Biotech GmbH filed Critical Paia Biotech GmbH
Publication of EP4666073A1 publication Critical patent/EP4666073A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/84—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving inorganic compounds or pH
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/544—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being organic
    • G01N33/545—Synthetic resin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids

Definitions

  • the application relates to methods for analyzing charge variants of proteins using microtiter plates whose wells have at least partially different pH values and/or salt concentrations and using functionalized surfaces.
  • Biopharmaceuticals including virus particle-based therapeutics, are generally pharmaceutically useful and active proteins, such as antibodies and virus particles.
  • the byproducts are usually incorrectly assembled, e.g. mispaired proteins or fragments of these proteins or different charge variants of the target protein.
  • Mispairing occurs, for example, when the different amino acid chains produced after the expression of bi- or multispecific antibodies are not assembled in the desired manner. Despite various approaches to optimizing the assembly and shifting it towards the desired target protein, this mispairing represents a major problem.
  • Virus particles that are used in gene therapy can also be charged differently. Loading the virus particles with nucleic acids (DNA or RNA), for example, results in the virus particle surface being more negatively charged than virus particles that are not or only partially loaded. Since loading the virus particles with nucleic acids is essential for the therapeutic effect, it is very important to ensure that the virus particles are loaded in virus particle production processes. Virus particles that are not loaded with nucleic acids are non-functional byproducts and must be removed.
  • nucleic acids DNA or RNA
  • nucleic acids influence the charge of the virus capsid, so that separation based on their charge is possible in ion exchange chromatography.
  • the present invention has the object of developing methods with which charge variants of a target protein, namely antibodies, Fc fusion proteins, antibody fragments, bi- and multispecific antibodies as well as virus particle-based therapeutics, and incorrectly assembled (e.g. mismatched or fragmented) proteins can be quickly detected.
  • a target protein namely antibodies, Fc fusion proteins, antibody fragments, bi- and multispecific antibodies as well as virus particle-based therapeutics
  • incorrectly assembled (e.g. mismatched or fragmented) proteins can be quickly detected.
  • the latter is based on the fact that the target proteins and the proteins incorrectly assembled during their production very often have different charges and thus different isoelectric points.
  • a method that is often used to characterize and purify biological molecules is column chromatography. It can be carried out both under normal pressure and under elevated pressure. The latter often requires expensive equipment such as HPLC or FPLC.
  • Another method is based on the use of biosensors, as described for example in US 5,804,453 B.
  • a biosensor is a device that combines a biological component with a physical or chemical transducer to generate a measurable signal in response to a target analyte.
  • Biosensors can use various physical measurement principles to detect the presence of target analytes.
  • Known examples include piezoelectric biosensors, optical Detection methods based on interferometry or surface plasmon resonance as well as calorimetric measurement methods.
  • Biosensors that use interferometric methods are described, for example, in US 5,804,453 B.
  • Biosensors that use piezoelectric methods are also known and are described, for example, in EP2017613A1.
  • Biosensors that use interferometric methods are particularly frequently used in combination with microtiter plates because the biosensors are easy to manufacture and, due to their shape, can be easily immersed into the wells of the microtiter plates.
  • biosensors used in so-called biolayer interferometry have two reflective surfaces on which a phase shift is measured when biomolecules attach to the second surface further away from the light source.
  • Biosensor surfaces must be functionalized for the binding of the target analytes.
  • the surfaces are often functionalized with amines to realize the further coupling of proteins or peptides via an amide bond and as described, for example, in WO 2008/033535.
  • the functionalization is carried out by bifunctional linkers, which on the one hand react with the surface of the biosensor and on the other hand provide a functionality that enables the binding of the actual binding molecule (e.g. an antibody).
  • these can be siloxanes, for example, a classic method for the functionalization of glass surfaces.
  • copolymers made of e.g. polystyrene and divinylbenzene can be used, which provide reactive groups for further functionalization of the polymer surfaces. These coupling processes are also suitable for introducing groups for cation or anion exchange.
  • column chromatography methods are used to detect and, if necessary, identify charge variants and incorrectly assembled proteins, the use of biosensors is not yet known.
  • the sample is adsorbed onto a so-called stationary phase (the column material, which can consist of various materials).
  • stationary phase the column material, which can consist of various materials.
  • eluent mobile phase(s)
  • salt content/pH value salt content/pH value
  • Cation exchange chromatography uses negatively charged column material combined with a pH and/or salt gradient. If a pH gradient is used, one starts with a low pH value. At this value, the biological molecules (e.g. proteins) in the sample are relatively strongly profaned and thus positively charged. This means that the molecules bind very well to the column material. As the pH value increases, the biological molecules are deprotonated, lose their positive charge, no longer bind the stationary phase and elute successively and depending on their charge.
  • Anion exchange chromatography (AEX) works in a similar way, but with positively charged column material.
  • a salt gradient can also be used to separate different molecules.
  • low salt concentrations are started and the salt concentration is increased during the chromatographic separation.
  • the salt eg NaCl
  • the cations eg Na+
  • a pH gradient or a salt gradient refers to a change in the pH value or the hydrogen ion concentration and/or the salt concentration over a certain spatial or temporal range.
  • mixed-mode ion chromatography is a further development of ion exchange chromatography. It uses surfaces (e.g. in the form of particles) that have both positively and negatively charged groups. Another possibility is multi-mode ion exchange chromatography, in which surfaces (e.g. in the form of particles) are used that can enter into hydrophobic interactions and hydrogen bonds in addition to ionic interactions.
  • the object of the present invention is to provide devices and methods with which proteins such as biopharmaceuticals, in particular antibodies, Fc fusion proteins, antibody fragments, bi- and multispecific antibodies and virus particle-based therapeutics can be qualitatively and quantitatively determined efficiently and quickly directly and without prior sample purification.
  • the measurement should also be simple and preferably be able to be carried out using means routinely available in the laboratory.
  • the invention relates in particular to a method for the analysis of charge variants of proteins using microtiter plates whose wells have at least partially different pH values and/or salt concentrations and using functionalized surfaces.
  • the invention is preferably used for the analysis of charge variants of biopharmaceuticals, in particular therapeutically active proteins, such as antibodies and protein formats derived therefrom, such as Fc fusion proteins, antibody fragments, bi- and multispecific antibodies and virus particle-based therapeutics.
  • therapeutically active proteins such as antibodies and protein formats derived therefrom, such as Fc fusion proteins, antibody fragments, bi- and multispecific antibodies and virus particle-based therapeutics.
  • the functionalized surfaces are preferably ion exchanger particles, in particular anion or cation exchangers, mixed-mode and multi-mode ion exchangers or sensors, such as biosensors, whose measuring surface is designed in such a way that charged molecules are bound and whose shape is such that they can be immersed in the wells of microtiter plates.
  • marker molecules such as mono- or polyclonal antibodies or fragments derived therefrom such as nanobodies or single-domain antibodies as well as peptides and RNA- or DNA-based aptamers are used in the method according to the invention
  • the biopharmaceutical, the target protein has binding sites for the marker molecule(s).
  • the marker molecules can also comprise dyes such as fluorescent dyes. Such markers are referred to below as fluorescent markers.
  • markers in particular fluorescent markers in combination with the PAIA plate
  • markers has the advantage that other proteins that can bind to the functionalized surfaces due to their charge but are not bound by the marker molecule(s) are not detected.
  • proteins are, for example, host cell proteins, as are typically present in cell culture supernatants, or also misassemblies in the production of bi- or multi-specific antibodies that no longer have a binding site for the marker molecule(s).
  • Marker molecules are molecules that can specifically bind the target molecules.
  • Examples of marker molecules are mono- or polyclonal antibodies, or derived fragments, such as the so-called nanobodies or single-domain antibodies as well as peptides and RNA- or DNA-based aptamers.
  • Fluorescent markers are marker molecules to which a fluorescent dye is bound.
  • the dyes can be covalently bound to the fluorescent markers or, for example, via the well-known streptavidin-biotin system, in which a fluorescently labeled streptavidin or other fluorescently labeled biotin-binding proteins such as avidin or neutravidin is coupled to a biotinylated marker molecule.
  • fluorescent markers are particularly suitable for the method according to the invention and the use according to the invention.
  • fluorescent markers that can be used according to the invention are Affibody conjugated with Alexa 647 from Affibody AB or Nano-Secondary® alpaca anti-human IgG/anti-rabbit IgG, recombinant VHH, Alexa Fluor® 647 (Art. No. CTK0101 - ChromoTek GmbH)).
  • Other fluorescent markers are commercially available, e.g. from Jackson Immunoresearch or Abeam. These are already coupled with a fluorescent dye and can be used directly.
  • mono- or polyclonal antibodies can be purchased from these companies and coupled with the various commercially available dyes, e.g. fluorescein, as well as the dyes from Biotium, Atto-Tec and ThermoFisher.
  • the application of the method relates primarily to the analysis, ie the identification and, if necessary, quantification of differently charged proteins (here also called "charge variants of proteins").
  • Proteins are, for example, biopharmaceuticals (ie therapeutically effective proteins), such as antibodies, Fc fusion proteins, antibody fragments or bi- and multi-specific antibodies as well as virus particle-based therapeutics.
  • the charge variants can be the same protein (ie a protein with the same amino acid sequence) of which several charge states exist. For example, antibodies that are differently charged due to different glycosylation, amidation or oxidation of amino acids.
  • Charge variants are also understood here to mean incorrectly assembled proteins. These have different amino acid sequences, or different types of protein domains and possibly also a different number of protein domains, such as light and heavy chains in antibodies, and are therefore often charged differently and have different isoelectric points. Differently charged virus particles also fall under the term “charge variants” if they are charged differently due to their loading with nucleic acids (DNA or RNA), their glycosylation or an amidation or oxidation of the amino acids of their capsid proteins.
  • nucleic acids DNA or RNA
  • test vessels in particular microtiter plates.
  • the advantage of the invention is that a large number of samples can be examined for the presence of charge variants in a relatively short time. Due to the simple and, if desired, automated implementation, a measurement result for more than 100 samples is generally available in less than 60 minutes. The automation available for microtiter plates (e.g. pipetting robots or automatic reading processes) can be used.
  • Microtiter plates are known and usually they are rectangular and have a varying number of wells, also called wells, cavities or depressions. These wells are usually arranged in rows parallel to the long side of the microtiter plate and in columns parallel to the narrow side. [0050] Letters are generally used to designate rows and numbers to designate columns.
  • the wells of a plate with 384 wells are arranged, for example, in 16 rows (from A to P) and 24 columns (from 1 to 24). A schematic drawing of such a 384-well plate is shown in Fig. 1.
  • the wells of a 96-well plate are arranged in 8 rows (A to H) and 12 columns (1 to 12). This allows each well to be clearly identified:
  • the first row of a 96-well plate contains 12 wells, namely wells A1 to A12.
  • the second row contains wells B1 to B12, etc.
  • the specific preparation of the microtiter plate concerns one or more wells or, in the case of the PAIA plate, as described in more detail below, one or more wells forming a measuring chamber.
  • aqueous buffer solutions having different pH values and/or different salt concentrations. These solutions contain different salt concentrations and pH values.
  • the distances between the pH values are chosen as required by the accuracy of the test procedure. Distances between the pH values in the individual wells in the range of 0.02 to 1 or 0.05 to 1.5 or 0.03 to 2 are advantageous. Larger distances are also possible.
  • the buffer solution can have different salt concentrations.
  • the distances between the salt concentrations are chosen as required by the accuracy of the test procedure. Distances between the concentrations in the individual wells in the range of 0.5 up to 500 mmol/L or 0.5 to 100 mmol/L or 1 to 90 mmol/L or 0.8 to 20 mmol/L or 1.5 to 50 mmol/L or 10 to 75 mmol/L.
  • Salts suitable for producing such salt gradients in buffers are usually alkali and alkaline earth metal salts such as NaCl, KCl, MgC, CaCl2, MgSCU and mixtures or combinations thereof. All suitable salts can be used.
  • buffer solutions contain different salt concentrations and pH values, this is a combination of pH and salt gradients. This combination is referred to in the literature as a "salt mediated pH gradient" and is used to optimize the separation performance of chromatography.
  • pH levels are about 0.2 to 1.5 pH units. These levels can, but do not have to, be the same from level to level. For such tests, at least eight different values are usually required (so-called 8-level gradient).
  • the water can now be removed from the wells by drying, preferably at elevated temperature, i.e. temperature greater than 18 °C, at normal pressure or under reduced pressure
  • the buffers with different pH values and/or salt concentrations are most easily obtained by mixing two buffers with different pH values and/or salt concentrations. If a buffer A with a low pH value and/or salt concentration and a buffer B with a high pH value and/or salt concentration are available, the desired pH value or salt concentration can be set by choosing a suitable mixing ratio.
  • Buffers with different pH values and salt concentrations can be prepared by mixing two buffers, a buffer A and a buffer B. Both Buffers have different pH values and one of the buffers also contains a certain salt concentration.
  • All common and known chemicals can be used as buffer substances and the choice depends on the application of the assay.
  • Common buffer systems when dealing with proteins are, for example, PBS systems (phosphate-based saline buffer), ammonium acetate or citrate-based buffers.
  • a suitable buffer system is the CX-1 buffer system from Thermo Fisher Scientific, which provides a very linear buffer gradient. It consists of two buffers with pH values of 5.6 and 10.2, each containing four zwitterionic buffer substances. The desired pH values are set by mixing these two buffers in different volume ratios.
  • a 12-stage buffer system with narrow pH intervals between the buffers P1 to P12, consisting of the buffer substances Na2HPO4 (buffer A) and NaH2PÜ4 (buffer B) in a concentration of 0.02 M each, can be obtained by mixing buffers with pH 5.7 and pH 8.1 as follows.
  • P1 is the buffer with pH 5.8
  • P2 is the buffer 2 with pH 6.0, etc.
  • Table 1 Example of a 12-stage buffer system composed of two PBS buffers [0073] The preparation of such multi-stage (quasilinear) buffer gradients is known and there are now configurators on the Internet (see e.g. https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/phosphate-buffer-ph- 5-8-to-7-4).
  • buffer systems with salts dissolved therein in different concentrations are also used and mixed.
  • the pH of these solutions is the same.
  • the invention relates to a method for analyzing charge variants of proteins using the specially prepared PAIA plates (i.e. in whose wells there are different pH values and/or salt concentrations, as described above) using anion or cation exchangers, mixed-mode or multi-mode ion exchangers as functionalized surfaces and fluorescent markers as markers.
  • the PAIA plate is a microtiter plate in SBS format with a certain number of wells that are designed as measuring chambers in which the elevation (referred to as a structural element in WO 2015/135840 A1) is shaped such that its base area takes up at least 50% of the base area of a measuring chamber or well. They are known and described in WO 2015/135840 A1. They are manufactured and sold under the trade name PAIAplate 384 by PAIA Biotech GmbH. These plates have 384 wells.
  • PAIA plate to be used may have more or less than 384 wells.
  • the elevation has a square base which tapers towards the top (at least slightly) and has the shape of a four-sided pyramid.
  • the upper end of the elevation is pointed, flat or convex, preferably it tapers to a point.
  • the upper end of the elevation has a diameter of less than 50 pm, so that no test components are deposited there.
  • the height of the elevation is at least 10% and at most 50% of the height of the measuring chamber or well, preferably at least 15% and at most 30%.
  • the bottom of the measuring chamber or well is opaque except for the bottom of the elevation.
  • the elevation on the other hand, is transparent and forms a measuring window that is used to measure the fluorescence emission, as described in detail in WO 2015/135840 A1.
  • the PAIA plate is in particular equipped as follows:
  • the desired number of wells (some or all) of the microtiter plate are designed as measuring chambers, in which there is a protrusion which is shaped such that its base area takes up at least 50% of the bottom area of a measuring chamber or well and preferably a square base area which tapers at least slightly towards the top and has the shape of a four-sided pyramid, the upper end of the protrusion being pointed, flat or convex and advantageously the upper end of the protrusion has a diameter of less than 50 pm so that no test components are deposited there, the height of the protrusion being at least 10% and at most 50% of the height of the measuring chamber or well and the bottom of the measuring chamber or well being opaque to the bottom of the protrusion and the protrusion is transparent to light and forms a measuring window which is used to measure the fluorescence emission.
  • the measuring chamber or microtiter plate according to the invention is irradiated from below with excitation light, which is then irradiated into the sample via the elevation.
  • fluorescence readers can be used to read out the fluorescence signal.
  • the following devices can be used as fluorescence readers according to the invention: The devices of the Spectramax series from Molecular Devices, the systems from Tecan (Satire, the Infinite series, or SPARK), readers from BMG Labtech (Omega, Clariostar, Pherastar) and fluorescence microscopes, e.g. from SynenTec (Cellavista and NyONE).
  • the invention using the PAIA plate can be used advantageously in particular in the development of cell culture methods for producing proteins, in particular therapeutically effective proteins, such as antibodies, Fc fusion proteins, antibody fragments, bi- and multi-specific antibodies and virus particle-based therapeutics.
  • the invention therefore also relates to the use of PAIA plates for analysis, ie detection and proof of charge variants of proteins, in particular therapeutically effective proteins, such as antibodies, Fc fusion proteins, antibody fragments, bi- and multi-specific antibodies and virus particle-based therapeutics.
  • therapeutically effective proteins such as antibodies, Fc fusion proteins, antibody fragments, bi- and multi-specific antibodies and virus particle-based therapeutics.
  • the method according to the invention uses a microtiter plate in the wells of which buffer substances and/or salts are present which, when dissolved, result in different pH values and/or different salt contents.
  • Such plates are produced by introducing buffer solutions and/or salt solutions with different pH values and/or salt contents into the wells of the plates and drying them at elevated temperature, advantageously at temperatures from 18 °C, preferably from 25 °C, in particular at 30 °C, at normal pressure or reduced pressure.
  • the invention also relates to a PAIA plate in which buffer solutions with different pH values and/or salt concentrations are present in one or more of the wells and in which anion or cation exchangers, mixed-mode or multi-mode ion exchangers and optionally fluorescent markers are introduced into the optionally functionalized surfaces.
  • steps (a), (b) and (c) can be carried out in any order. If step (b) and/or (c) - in each case in any order - is carried out before step (a), a drying step can be provided after step (b) and/or step (c). In the drying step, the liquid introduced with the test components is removed, preferably by drying at elevated temperature, as described here.
  • step (a) If a drying step is inserted, the process can be interrupted for any length of time after the drying step and continued with step (a).
  • the invention relates to the PAIA plate in which, after the introduction of the buffer solutions, optionally the functionalized surfaces and/or fluorescent markers, the liquid components (water from the buffer solution, etc.) are removed by drying.
  • the invention therefore also relates to a PAIA plate with dried substances, namely buffer substances, optionally functionalized surfaces and/or optionally fluorescent markers, wherein in some of the wells arranged in columns or rows there is a decreasing or increasing pH value and/or salt concentration upon addition of sample solution.
  • the invention further relates to a so-called kit of parts comprising a PAIA plate with dried substances, namely buffer substances and functionalized surfaces and a fluorescent marker, wherein in some of the wells arranged in columns or rows there is a decreasing or increasing pH value and/or salt concentration upon addition of sample solution.
  • the invention can also be carried out using biosensors as functionalized surfaces in microtiter plates.
  • biosensors as functionalized surfaces in microtiter plates.
  • the use of a PAIA plate is then not intended.
  • the invention also relates to a method for analyzing charge variants of proteins using microtiter plates whose wells have at least partially different pH values and/or salt concentrations and using biosensors as functionalized surfaces.
  • the biosensors are equipped in such a way that they are able to act as anion and cation exchangers or as mixed-mode or multi-mode ion exchangers.
  • the method can also include the addition of marker molecules.
  • the biosensors are taken from the microtiter plate and placed in a second microtiter plate containing the same gradient buffer and additionally a marker molecule that specifically binds to the target molecule;
  • biosensors The detection of charge variants using biosensors can be achieved by applying ion exchange surfaces to biosensors, which are placed in the wells of microtiter plates (not PAIA plates) with different pH values or salt concentrations and to which the binding of the target proteins is measured.
  • Optical methods such as so-called biolayer interferometry are mainly used for this purpose, in which a phase shift of the light occurs when molecules bind to the surface of the biosensor. This phase shift is measurable and depends on the number and mass of the molecules bound to the surface.
  • the measurement with biosensors can be carried out simultaneously, i.e. with many biosensors. Alternatively, it can be carried out sequentially, i.e. a biosensor is introduced one after the other into the various wells of the microtiter plate containing a level of the gradient and is regenerated and washed before each measurement of a new well.
  • biosensors If only small amounts of a protein are bound during the measurement or very small proteins are measured and therefore only a very weak measurement signal is generated, it is usual for biosensors to bind a marker that specifically binds to the target molecule, e.g. an antibody with a sufficiently large molecular mass, to the surface after the target molecule has bound to the surface in order to amplify the signal. If this is not sufficient to amplify the signal, another marker (here called a binder, e.g. a secondary antibody) that specifically binds to the primary antibody can also bind to the biosensor.
  • a marker that specifically binds to the target molecule
  • another marker here called a binder, e.g. a secondary antibody
  • non-target molecules proteins
  • the use of a specific marker molecule e.g. an antibody that specifically binds to the target protein, allows the measurement of a phase shift due to the binding of the marker molecule, and this binding depends only on the amount of target molecules bound to the surface.
  • the measurement signal is therefore specific to the target molecule.
  • the sample containing the protein with the charge variants is usually added in portions to the wells of the microtiter plate, which can also be a PAIA plate, after removal without further treatment (eg purification). However, dilution of the sample with water is advantageous in order to reduce the concentration of buffer substances which could interfere with the experiment.
  • Portioning is done manually or automatically with an automated pipetting robot (liquid handler).
  • the special feature of the invention is that when carrying out the method, different pH values and/or salt concentrations are present in the wells of the microtiter plate arranged in rows or columns.
  • a particular advantage of the invention is that the samples can be measured directly (if necessary after dilution with water). Purification before carrying out the methods (the assays) is not necessary.
  • the pH value and/or the salt concentration present in the wells are decisive for the binding properties of the respective charge variant of the protein to the functionalized surface(s).
  • the measurement with the biosensor or - when using the PAIA plate - the fluorescence intensity of the unbound fluorescent markers - provides a value from which the charge state of the measured protein can be deduced.
  • the functionalized surfaces are selected so that they can bind the protein with the charge variants.
  • anion or cation exchangers, mixed-mode or multi-mode ion exchangers and biosensors whose measuring surfaces have the same or similar functionalities as the aforementioned anion or cation exchangers, mixed-mode or multi-mode ion exchangers can be used. - TI -
  • Anion exchangers are known and are classified according to their ionic strength into strong and weak anion exchangers.
  • Strong anion exchangers are those with positively charged functional groups, e.g. quaternary aminoethyl groups, quaternary aminomethyl groups or triethylaminomethyl groups.
  • Weak anion exchangers often contain diethylaminoethyl groups.
  • Strong anion exchangers include, for example, Macro-Prep High Q Support and UNOsphere Q Media, both available from Bio-Rad, or QAE Sephadex A-25 (Cytiva), Capto Q (Cytiva), POROS XQ Strong Anion Exchange Resin (ThermoFisher).
  • weak anion exchangers are DEAE Sepharose Fast Flow (Cytiva), Macro-Prep DEAE Resin (Bio-Rad), TOYOPEARL DEAE-650 (Tosoh), DEAE Ceramic HyperD (Sartorius), Fractogel® EMD DEAE (Merck).
  • Cation exchangers are also known and are also divided into strong and weak cation exchangers.
  • the former contain, for example, sulfonate groups (S), sulfoethyl groups (SE) or sulfopropyl groups (SP) on their surface.
  • the weak cation exchangers contain negatively charged charges, such as carboxymethyl groups (CM).
  • Strong cation exchangers are e.g. SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), SP Sephadex C-25 (Cytiva), TOYOPEARL SP-650 (Tosoh), Macro-Prep High S (Bio-Rad).
  • Weak cation exchangers are known and commercially available, such as Macro-Prep CM (Bio-Rad), CM Sepharose High Performance FF (Cytiva), G-SepTM CM Agarose Fast Flow (G-Bioscience).
  • Mixed-mode ion exchangers are, for example, the CHT (Ceramic Hydroxyapatite) column material Type I and Type II from Bio-Rad, on whose surface negatively charged phosphate groups and positively charged calcium ions are available for interaction.
  • Another mixed-mode or multi-mode (cation) exchanger is the material TOYOPEARL® MX-Trp-650M from Tosoh Bioscience, on whose surface there are negatively charged carboxyl groups as well as hydrophobic tryptophan groups for hydrophobic interactions.
  • Another mixed-mode ion exchanger is a weak cation exchanger with hydrophobic groups, which is available as Capto MMC column material from Cytiva. Another example is Capto Adhere (also from Cytiva), a strong anion exchanger with additional hydrophobic aromatic groups.
  • anion or cation exchangers, mixed-mode or multi-mode ion exchangers which can be used according to the invention have average diameters in the range from about 5 to 200 pm.
  • the particles have average diameters in the range from 5 to 150 pm or 10 to 100 pm.
  • Fig. 1 a shows a schematic labeling of the wells in a 384-well microtiter plate.
  • Fig. 1 b shows a schematic representation of a 384-well plate with a 12-step pH gradient.
  • the 12-step gradient is present per column.
  • Untreated wells are present in columns 5, 10, 14, 18, 22-24.
  • Fig. 1 c shows a schematic representation of a 384-well plate with a 12-step pH gradient.
  • the 12-step gradient is present twice per row (columns 1-12 and columns 13-24). There are no untreated wells.
  • Fig. 2 shows the layout from Example 1 .
  • Fig. 3 refers to Example 1 and shows the measured fluorescence intensities of the unbound fluorescence markers of V1-A trastumab (HER) - unstressed and V1 -B trastumab (HER) - heat treated as a function of pH.
  • Fig. 4 Fig. refers to Example 1 and shows the fluorescence intensity of V1 -C Trastumab (HER) - unstressed and V1 -D Trastumab (HER) - heat treated measured in diluted cell culture supernatant.
  • Fig. 5a refers to Example 1 and represents a comparative example. It shows the result of the chromatographic evaluation, namely a CEX chromatogram of the unstressed trastuzumab sample 2 mg/mL in H2O.
  • Fig. 5b refers to Example 1 and represents a comparative example. It shows the result of the chromatographic evaluation, namely a CEX chromatogram of the trastuzumab sample 2 mg/mL in H2O stressed at 35 degrees.
  • Fig. 6 refers to Example 2 and shows the course of the fluorescence intensities as a function of the pH values shown on the x-axis.
  • Fig. 7 refers to Example 2 and shows a plot of the point-to-point slope as a function of pH
  • Fig. 1 a Schematic labeling of the wells in a 384-well plate.
  • Fig. 1 b Schematic representation of a 384-well plate with a 12-step pH gradient.
  • Fig. 1 c Schematic representation of a 384-well plate with a 12-step pH gradient.
  • Fig. 2 Document scheme from example 1.
  • Fig. 3 Example 1 : Fluorescence intensities of the samples - samples measured in H2O
  • Fig. 4 Example 1: Fluorescence intensities of the samples - samples measured in diluted cell culture supernatant
  • Fig. 5a Example 1 - Comparative example: Chromatographic separation of unstressed samples in H2O
  • Fig. 5b Example 1 - Comparative example: Chromatographic separation of stressed samples in H2O
  • Fig. 6 Example 2 - Course of fluorescence intensities depending on pH value
  • Fig. 7 Example 2 - Representation of the point-to-point slope as a function of pH
  • PAIAplate 384 The wells of a PAIAplate 384 are used as reaction and measuring chambers. It is available from PAIA Biotech GmbH and is used as manufactured in WO 2015/135840 A1. The working volume of a well is 15pL-110pL.
  • a phosphate buffered saline solution a so-called PBS buffer
  • PBS buffer contains 137 mM NaCl, 2.7 mM KCl and 12 mM phosphates.
  • a strong cation exchanger in the form of particles namely CaptoSP ImpRes particles (Cytiva, Art. No. 17546802) with an average diameter of about 10 pm, is used as the functionalized surface.
  • the particles carry ligands with sulfonic acid groups.
  • a 9% particle working solution with a concentration of 10% [v/v] of LPS is prepared from the cation exchanger particle stock solution (slurry) by adding water and LPS (Liquid Plater Sealer, Candor).
  • LPS Liquid Plater Sealer, Candor
  • 30pL of this particle working solution are pipetted into the corresponding wells of the PAIA plate.
  • 7.5pL of a buffer solution with different pH values are added to each of these wells (more details on the pH values can be found in the tables in Examples 1 and 2), whereby the buffer is added according to a certain scheme so that it can be traced which buffer pH was added to which well.
  • the titer plate After adding the buffer, mix briefly. Then the liquid is removed from the plate. To do this, the plate is dried at 35 °C for 48 hours in a drying cabinet or similar. After drying, the titer plate can be stored or used directly for the measurement.
  • a pH gradient system CX-1 from Thermo Fisher Scientific (Article No. 302779) is used. This system consists of four different buffer substances and is characterized by the fact that defined pH values can be set by mixing two buffers (buffer A and buffer B), which result in a pH gradient with intervals between the pH values of 0.2-0.3.
  • Buffer A has a pH of 5.6 and buffer B has a pH of 10.2.
  • the preparation of the measuring chambers in the PAIA plate is carried out as described above, with 7.5 pL of the buffer solutions P1 to P12 - as shown in Table 2 - being added to each of the wells with particles, with the buffer being added according to a specific scheme so that it is possible to trace which of the buffers P1 to P12 is present in which well. Alternatively, it can be noted in which well the respective buffer P1 to P12 is present.
  • the target protein is the antibody trastuzumab:
  • V1 -A Trastuzumab (HER, Herceptin) stored at 4 °C; sample diluted with water before measurement.
  • V1 -B Trastuzumab stored for 14 days at 35 °C; sample diluted with water before measurement.
  • V1 -C Trastuzumab (HER, Herceptin) stored at 4 °C; sample diluted with cell culture supernatant (CSC) before measurement.
  • CSC cell culture supernatant
  • V1 -D Trastuzumab (HER, Herceptin) stored for 14 days at 35 °C; sample diluted with cell culture supernatant (CSC) before measurement.
  • CSC cell culture supernatant
  • the trastuzumab samples are diluted with water or in water-diluted cell culture supernatant (dilution 1:5) to a concentration of 150 pg/mL.
  • the fluorescence intensity is measured from below (bottom reading) in each measuring chamber in a Tecan Satire fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 630 nm and an emission wavelength of 665 nm.
  • Figures 3 and 4 illustrate the differences with regard to the existing charge variants, i.e. the CVA profiles of the temperature-treated samples V1-B and V1-D compared to the non-temperature-treated samples V1-A and V1-C.
  • Thermo ProPac WCX-10 250 x 4 mm and the buffer system CX-1 from ThermoFisher with a flow rate of 1 mL/min.
  • the starting buffer consists of 100% buffer A, to which buffer B is gradually added in the first 15 minutes up to a content of 50% B. In the following 2 minutes, the proportion of buffer B is increased to 100%. This means that a pH gradient buffer of 5.6 to 10.2 is used.
  • the eluted molecules are detected by Absorption measurement at 280 nm. The results are shown in Figures 5a and 5b.
  • the main peak (retention time 16.55 minutes) is significantly smaller than in the unstressed sample and has a significantly smaller peak area (227,437 AU).
  • the acidic charge variants are significantly more present in the stressed sample and show a cumulative peak area of 1,157,381 AU.
  • the fluorescence marker used is Nano-Secondary® alpaca anti-human IgG/anti-rabbit IgG, recombinant VHH, Alexa Fluor® 647 (Art. No. CTK0101 - ChromoTek GmbH). This is used in a concentration of 5 nM in a PBS buffer with 50 ppm BSA.
  • the two monoclonal antibodies bevacizumab (Bev) and rituximab (Rit) as well as three mixtures of these two molecules in the mixing ratios 75:25, 50:50 and 25:75 are used as biological analytes.
  • the total concentration of antibodies in all samples was 50 pg/mL.
  • the fluorescence intensity is measured from below (bottom reading) in each measuring chamber in a Tecan Satire fluorescence plate reader at an excitation wavelength of 630 nm and an emission wavelength of 665 nm.
  • FIG. 6 show the fluorescence intensity curves of the different samples as a function of the pH value in the wells.
  • the sample with 100% Bev shows the largest difference in fluorescence intensity between pH values 6.9 and 7.6. As the Bev content in the samples decreases, this difference decreases and at the same time the increasing Rit content in these samples causes the fluorescence intensity in these samples to increase sharply between pH values 8.9 and 9.5.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Ladungsvarianten von Proteinen unter Verwendung von Mikrotiterplatten, deren Vertiefungen (Wells) zumindest teilweise unterschiedliche pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen aufweisen und unter Verwendung von funktionalisierten Oberflächen.

Description

Verfahren zur Bestimmung des Ladunqszustandes von Proteinen
[0001 ] Die Anmeldung betrifft Verfahren zur Analyse von Ladungsvarianten von Proteinen unter Verwendung von Mikrotiterplatten, deren Vertiefungen (Wells) zumindest teilweise unterschiedliche pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen aufweisen und unter Verwendung von funktionalisierten Oberflächen.
[0002] Der Herstellung von Proteinen und insbesondere der Herstellung und Entwicklung von Biopharmazeutika einschließlich viruspartikelbasierter Therapeutika kommt große wirtschaftliche Bedeutung zu. Die Herstellung von Proteinen und insbesondere von Biopharmazeutika ist jedoch sehr aufwendig und nimmt viel Zeit in Anspruch. Biopharmazeutika sind hinsichtlich ihrer physikalischen Eigenschaften heterogener als chemisch hergestellte Arzneistoffe, sog. niedermolekulare Arzneistoffe (Small Molecule Drugs).
[0003] Biopharmazeutika einschließlich viruspartikelbasierter Therapeutika sind im Allgemeinen pharmazeutisch nutzbare und wirksame Proteine, wie z.B. Antikörper und Virenpartikel.
[0004] Bei der Herstellung und Handhabung von Proteinen und insbesondere von Biopharmazeutika können durch Fehlsynthesen, Degeneration oder andere Reaktionen unerwünschte Nebenprodukte entstehen, die identifiziert und abgetrennt werden müssen, da diese unerwünschten Produkte häufig die biologische Wirksamkeit des Proteins beeinflussen.
[0005] Bei den Nebenprodukten handelt es sich meistens um fehlerhaft assemblierte, z.B. fehlgepaarte (mispaired) Proteine oder Fragmente dieser Proteine oder um verschiedene Ladungsvarianten (charge variants) des Zielproteins.
[0006] Die unterschiedlichen Ladungszustände der Ladungsvarianten des Biopharmazeutikums, insbesondere von Antikörpern, Fc-Fusionsproteinen, Antikörperfragmenten, bi- und multispezifischen Antikörpern sowie viruspartikelbasierten Therapeutika, können zu deutlichen Unterschieden im physikalisch-chemischen Verhalten, wie z.B. Struktur, Stabilität, Bindungsaffinität führen und somit die therapeutische Wirksamkeit beeinflussen. [0007] Bei der Herstellung von Proteinen, insbesondere von Biopharmazeutika ist es daher wichtig, Zelllinien und Kultivierungsbedingungen zu finden, bei denen möglichst wenige fehlerhafte Assemblierungen und Ladungsvarianten auftreten. In diesem sog. Upstream-Development fallen oft hunderte von Proben an, die in kurzer Zeit auf ihre Eignung untersucht werden müssen.
[0008] Gleiches gilt für das sogenannte Downstream-Development, in dem die Aufreinigung der Proteine, insbesondere Biopharmazeutika optimiert wird.
[0009] Mispairing tritt z.B. auf, wenn nach der Expression von bi- oder multispezifischen Antikörpern die produzierten unterschiedlichen Aminosäureketten nicht in der gewünschten Weise zusammengesetzt werden. Trotz verschiedener Ansätze, die Assemblierung zu optimieren und in Richtung des gewünschten Zielproteins zu verschieben, stellt dieses Mispairing ein großes Problem dar.
[0010] Oberstes Ziel bei der Entwicklung von Verfahren zur Herstellung und Aufreinigung von Proteinen, insbesondere Biopharmazeutika sollte es daher sein, Bedingungen zu finden, unter denen möglichst wenig Nebenprodukte entstehen. Dies muss experimentell ermittelt werden und erfordert eine engmaschige Kontrolle des Versuchsansatzes (z.B. der Zellkultur), um zeitnah Änderungen der Versuchsbedingungen vornehmen zu können.
[0011 ] Auch Virenpartikel, die zum Beispiel in der Gentherapie eingesetzt werden, können unterschiedlich geladen sein. Die Beladung der Virenpartikel mit Nukleinsäuren (DNA oder RNA) führt beispielsweise dazu, dass die Viruspartikeloberfläche stärker negativ geladen ist als bei nicht oder nur teilweise beladenen Viruspartikeln. Da die Beladung der Viruspartikel mit den Nukleinsäuren essenziell für die therapeutische Wirkung ist, ist es sehr wichtig auch in Produktionsprozessen von Viruspartikeln darauf zu achten, dass die Viruspartikel beladen sind. Nicht mit Nukleinsäuren beladene Viruspartikel sind nicht funktionale Nebenprodukte und müssen entfernt werden.
[0012] Für den Nachweis der An- oder Abwesenheit von Nukleinsäuren in Viruspartikeln stehen verschiedene Methoden zur Verfügung. Dazu gehören PCR-Verfahren in Kombination mit ELISA-Verfahren, Cryo-Elekronenmikroskopie, dynamische Lichtstreuung (DLS), analytische Ultrazentrifugation oder mehrstufige Verfahren mit verschiedenen Biosensoren unter Verwendung der Biolayer-Interferometrie. Außerdem beeinflussen Nukleinsäuren die Ladung des Viruscapsids, so dass eine Trennung aufgrund ihrer Ladung in der lonenaustauschchromatographie möglich ist.
[0013] Es werden ständig neue Verfahren, Hilfsmittel und Geräte entwickelt, um die Herstellungsmethoden und den Umgang mit Proteinen, insbesondere von Biopharmazeutika zu vereinfachen und damit kostengünstiger zu gestalten.
[0014] Die vorliegende Erfindung hat die Aufgabe, Verfahren zu entwickeln, mit denen Ladungsvarianten eines Zielproteins, nämlich Antikörper, Fc-Fusionsprotein, Antikörperfragment, bi- und multispezifische Antikörper sowie viruspartikelbasierte Therapeutika, und fehlerhaft assemblierte (z.B. fehlgepaarte oder fragmentierte) Proteine schnell detektiert werden können. Letzteres beruht auf der Tatsache, dass die Zielproteine und die bei ihrer Herstellung fehlerhaft assemblierten Proteine sehr häufig unterschiedliche Ladungen und damit unterschiedliche isoelektrische Punkte aufweisen.
[0015] Verfahren und Apparate zum Nachweis und Quantifizierung von Proteinen aufgrund ihrer physikalischen Parameter sind bekannt.
[0016] Eine Methode, die häufig zur Charakterisierung und Reinigung biologischer Moleküle eingesetzt wird, ist die Säulenchromatographie. Sie kann sowohl unter Normaldruck als auch unter erhöhtem Druck durchgeführt werden. Letztere erfordert oft teure Geräte wie HPLC oder FPLC.
[0017] Eine weitere Methode basiert auf der Verwendung von Biosensoren, wie beispielweise in US 5,804,453 B beschrieben.
[0018] Ein Biosensor ist eine Vorrichtung, die eine biologische Komponente mit einem physikalischen oder chemischen Messwandler kombiniert, um als Reaktion auf einen Zielanalyten ein messbares Signal zu erzeugen. Biosensoren können verschiedene physikalische Messprinzipien nutzen, um die Anwesenheit von Zielanalyten zu detektieren. Bekannt sind z.B. piezoelektrische Biosensoren, optische Detektionsverfahren, basierend auf Interferometrie oder Oberflächenplasmonenresonanz sowie kalorimetrische Messverfahren.
[0019] Biosensoren, die interferometrische Verfahren nutzen sind z. B. in US 5,804,453 B beschrieben. Biosensoren, die piezoelektrische Verfahren nutzen sind gleichfalls bekannt und z.B. in EP2017613A1 beschrieben.
[0020] Biosensoren, die interferometrische Methoden verwenden werden besonders häufig in Kombination mit Mikrotiterplatten verwendet, weil die Biosensoren einfach herzustellen sind und aufgrund ihrer Form gut in die Näpfchen der Mikrotiterplatten getaucht werden können.
[0021 ] Die in der sogenannten Biolayer-Interferometrie verwendeten Biosensoren besitzen zwei reflektierende Oberflächen, an denen eine Phasenverschiebung gemessen wird, wenn sich Biomoleküle an der zweiten, weiter von der Lichtquelle entfernten Oberfläche anlagern.
[0022] Biosensoroberflächen müssen für die Bindung der Zielanalyten funktionalisiert werden. Häufig werden die Oberflächen mit Aminen funktionalisiert, um die weitere Kopplung von Proteinen oder Peptiden über eine Amidbindung zu realisieren und wie z.B. in WO 2008/033535 beschrieben.
[0023] Die Funktionalisierung erfolgt durch bifunktioneller Linker, die einerseits mit der Oberfläche des Biosensors reagieren und andererseits eine Funktionalität bereitstellen, die die Bindung des eigentlichen Bindemoleküls (z.B. eines Antikörpers) ermöglicht. Bei Glasoberflächen können dies z.B. Siloxane sein, eine klassische Methode für die Funktionalisierung von Glasoberflächen. Bei Polymeroberflächen können Copolymere aus z.B. Polystyrol und Di-vinylbenzol eingesetzt werden, die reaktive Gruppen zur weiteren Funktionalisierung der Polymeroberflächen bereitstellen. Diese Kopplungsverfahren eignen sich auch zur Einführung von Gruppen für den Kationenoder Anionenaustausch. [0024] Während säulenchromatographische Methoden zum Nachweis und ggf. zur Identifizierung von Ladungsvarianten und fehlerhaft assemblierten Proteinen eingesetzt werden, ist der Einsatz von Biosensoren bisher nicht bekannt.
[0025] Der Nachteil von säulenchromatographischen Methoden ist immer, dass vor der Analyse eine Vorreinigung der Proben notwendig ist. Dies ist wichtig, da sonst das Säulenmaterial sehr schnell irreversibel inaktiviert wird und weil Fremdproteine durch die meist verwendete UV-Absorptionsmessung bei z.B. 280 nm nicht vom Zielprotein unterschieden werden können. Auch die Regeneration des Säulenmaterials zwischen den Läufen ist notwendig und zeitaufwendig.
[0026] Es erfolgt zunächst die Adsorption der Probe an eine sogenannte stationäre Phase (dem Säulenmaterial, das aus verschiedenen Materialien bestehen kann). Durch Zugabe von Laufmittel (mobile Phase(n)), d.h. Lösungen mit unterschiedlichen Eigenschaften (Salzgehalt / pH-Wert) werden die ionischen Wechselwirkungen der Analyten mit der stationären Phase abgeschwächt, die adsorbierten Moleküle desorbiert und eluiert.
[0027] Bei der Kationenaustauschchromatographie (CEX, Cation Exchange Chromatography) wird negativ geladenes Säulenmaterial, kombiniert mit einem pH- und/oder Salzgradienten, verwendet. Wird ein pH-Gradient verwendet, beginnt man mit einem niedrigen pH-Wert. Bei diesem Wert sind die biologischen Moleküle (z.B. Proteine) in der Probe relativ stark profaniert und damit positiv geladen. Dadurch ist die Bindung der Moleküle an das Säulenmaterial sehr gut. Mit steigendem pH-Wert werden die biologischen Moleküle deprotoniert, verlieren ihre positive Ladung, binden nicht mehr die stationäre Phase und eluieren sukzessive und in Abhängigkeit von ihrer Ladung. Entsprechend funktioniert die Anionenaustauschchromatographie (AEX, Anion Exchange Chromatography), allerdings mit positiv geladenem Säulenmaterial.
[0028] Zusammen mit dem pH-Gradienten oder anstelle des pH-Gradienten kann auch ein Salzgradient verwendet werden, um verschiedene Moleküle zu trennen. Dabei wird mit geringen Salzkonzentrationen begonnen und die Salzkonzentration während der chromatographischen Trennung erhöht. Als Folge bindet das Salz (z.B. NaCI), insbesondere die Kationen (z.B. Na+), zunehmend an das negativ geladene Säulenmaterial und verdrängt die dort gebundenen positiv geladenen biologischen Moleküle, die sodann vom Säulenmaterial eluieren.
[0029] Ein pH-Gradient bzw. ein Salzgradient bezieht sich auf eine Veränderung des pH- Werts oder der Wasserstoffionenkonzentration und/oder der Salzkonzentration über einen bestimmten räumlichen oder zeitlichen Bereich.
[0030] Für bestimmte komplexe Trennungen von Proteinen wird auch die sogenannte Mixed-Mode-Ionenchromatographie eingesetzt. Die Mixed-Mode lonenchromatographie ist eine Weiterentwicklung der lonenaustauschchromatographie. Dabei werden Oberflächen (z.B. in Form von Partikeln) verwendet, die sowohl positiv als auch negativ geladene Gruppen besitzen. Eine weitere Möglichkeit stellt die Multi-Mode- lonenaustauschchromatographie dar, in der Oberflächen (z.B. in Form von Partikeln) eingesetzt werden, die neben den ionischen auch hydrophobe Wechselwirkungen sowie Wasserstoffbrückenbindungen eingehen können.
[0031 ] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es Vorrichtungen und Verfahren bereitzustellen, mit denen Proteine, wie Biopharmazeutika, insbesondere Antikörper, Fc- Fusionsproteine, Antikörperfragmente, bi- und multispezifische Antikörper sowie viruspartikelbasierte Therapeutika direkt und ohne vorherige Probenreinigung effizient und schnell qualitativ und quantitativ bestimmt werden können. Die Messung soll zudem einfach und vorzugsweise mit im Labor routinemäßig verfügbaren Mitteln durchführbar sein.
[0032] Die Erfinder haben nun die in den Patentansprüchen geschützten Verfahren und Verwendungen sowie Vorrichtungen gefunden, mit denen Proteine aufgrund ihrer Ladungsunterschiede charakterisiert und getrennt werden können. Damit hat der Anwender die Möglichkeit schnell und unkompliziert Nebenprodukte, basierend auf deren Ladungszustand aufzufinden. Die Nachteile der vorgenannten Verfahren (langwierige Reinigungsprozesse vor der eigentlichen Analyse, etc.) werden dadurch vermieden.
[0033] Die Erfindung betrifft insbesondere ein Verfahren zur Analyse von Ladungsvarianten von Proteinen unter Verwendung von Mikrotiterplatten, deren Vertiefungen (Wells) zumindest teilweise unterschiedliche pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen aufweisen und unter Verwendung von funktionalisierten Oberflächen.
[0034] Die Erfindung wird vorzugsweise zur Analyse von Ladungsvarianten von Biopharmazeutika, insbesondere therapeutisch wirksamen Proteinen, wie Antikörpern und davon abgeleiteten Proteinformaten, wie Fc-Fusionsproteinen, Antikörperfragmenten bi- und mehrspezifische Antikörper sowie viruspartikelbasierten Therapeutika verwendet.
[0035] Bei den funktionalisierten Oberflächen handelt es sich vorzugsweise um Ionenaustauscher-Partikel, insbesondere Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed- Mode- und Multi-Mode-Ionenaustauscher oder um Sensoren, wie Biosensoren, deren Messoberfläche so beschaffen ist, dass geladene Moleküle gebunden werden und deren Form dergestalt ist, dass sie in die Näpfchen von Mikrotiterplatten eingetaucht werden können.
[0036] Werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren Markermoleküle, wie z.B. mono- oder polyklonale Antikörper oder davon abgeleitete Fragmente wie Nanobodies oder Single-Domain-Antikörper sowie Peptide und auf RNA- oder DNA-basierte Aptamere verwendet, so weist das Biopharmazeutikum, das Zielprotein, Bindungsstellen für das oder die Markermoleküle auf. Die Markermoleküle können ferner Farbstoffe, wie z.B. Fluoreszenzfarbstoffe umfassen. Solche Marker werden nachfolgend Fluoreszenzmarker genannt.
[0037] Die Verwendung von Markern, insbesondere Fluoreszenzmarker in Kombination mit der PAIA-Platte, hat den Vorteil, dass andere Proteine, die aufgrund ihrer Ladung an die funktionalisierten Oberflächen binden können, aber nicht von dem oder den Markermolekülen gebunden werden, nicht detektiert werden. Solche Proteine sind z.B. Wirtszellproteine, wie sie typischerweise in Zellkulturüberständen vorliegen, oder auch Fehlassemblierungen bei der Herstellung von bi- oder mehrspezifischen Antikörpern, die keine Bindungsstelle für das oder die Markermoleküle (mehr) besitzen.
[0038] Markermoleküle sind Moleküle, die die Zielmoleküle spezifisch binden können. Beispiele für Markermoleküle sind mono- oder polyklonale Antikörper, bzw. davon abgeleitete Fragmente, wie z.B. die sogenannten Nanobodies oder Single-Domain- Antikörper sowie Peptide und auf RNA- oder DNA-basierte Aptamere.
[0039] Fluoreszenzmarker sind Markermokelüle an die ein Fluoreszenzfarbstoff gebunden ist. Die Farbstoffe können kovalent an die Fluoreszenzmarker gebunden sein oder z.B. über das wohlbekannte Streptavidin-Biotin-System, in dem ein fluoreszenzmarkiertes Streptavidin oder andere fluoreszenzmarkierte Biotin-bindende Proteine wie Avidin oder Neutravidin an ein biotinyliertes Markermolekül gekoppelt wird.
[0040] Der Fachmann findet ohne großen technischen Aufwand heraus, welche Fluoreszenzmarker für das erfindungsgemäße Verfahren und die erfindungsgemäße Verwendung besonders geeignet sind. Beispiele für erfindungsgemäß verwendbare Fluoreszenzmarker sind mit Alexa 647-konjugierte Affibody der Firma Affibody AB oder Nano-Secondary® alpaca anti-human IgG/anti-rabbit IgG, recombinant VHH, Alexa Fluor® 647 (Art.-No. CTK0101 - Fa. ChromoTek GmbH)) Weitere Fluoreszenzmarker sind kommerziell verfügbar, z.B. bei den Firmen Jackson Immmunoresearch, oder Abeam. Diese sind bereits mit einem Fluoreszenzfarbstoff gekoppelt und können direkt verwendet werden. Alternativ können von diesen Firmen mono- oder polyklonale Antikörper gekauft und mit den verschiedenen kommerziell erhältlichen Farbstoffen gekoppelt werden, z.B. Fluorescein, sowie den Farbstoffen der Firmen Biotium, Atto-Tec, und ThermoFisher.
[0041 ] Bei der Auswahl der Fluoreszenzmarker ist darauf zu achten, dass der Fluoreszenzmarker bei keiner der verwendeten Assaybedingungen (pH-Wert und Salz) direkt an die funktionalisierten Oberflächen bindet. Dies ist für den Fachmann leicht herauszufinden, z.B. durch fluoreszenzmikroskopische Untersuchung von Mischungen der Oberflächen mit dem Fluoreszenzmarker.
[0042] Die Anwendung des Verfahrens bezieht sich vor allem auf die Analyse, d.h. die Identifizierung und ggf. Quantifizierung von unterschiedlich geladenen Proteinen (hier auch „Ladungsvarianten von Proteinen“ genannt. Proteine sind z.B. Biopharmazeutika (d.h. therapeutisch wirksame Proteine), wie Antikörper, Fc-Fusionsproteine, Antikörperfragmente oder bi- und mehrspezifische Antikörper sowie viruspartikelbasierte Therapeutika. [0043] Bei den Ladungsvarianten kann es sich um das gleiche Protein (d.h. ein Protein mit gleicher Aminosäuresequenz) handeln, von dem mehrere Ladungszustände vorliegen. Z.B. Antiköper, die aufgrund unterschiedlicher Glykosylierung, Amidierung oder durch Oxidation von Aminosäuren unterschiedlich geladen sind.
[0044] Unter Ladungsvarianten werden hier auch fehlerhaft assemblierte Proteine verstanden. Diese besitzen unterschiedliche Aminosäuresequenzen, bzw. unterschiedliche Arten von Proteindomänen und ggf. auch eine unterschiedliche Anzahl von Proteindomänen, wie z.B. leichte und schwere Ketten bei Antikörpern und sind daher oft unterschiedlich geladen und besitzen unterschiedliche isoelektrische Punkte. Ebenso fallen unterschiedlich geladene Viruspartikel unter den Begriff „Ladungsvarianten“, wenn sie aufgrund ihrer Beladung mit Nukleinsäuren (DNA oder RNA), ihrer Glykosylierung oder einer Amidierung oder Oxidation der Aminosäuren ihrer Kapsidproteine unterschiedlich geladen sind.
[0045] Im erfindungsgemäßen Verfahren werden speziell präparierte Versuchsgefäße, insbesondere Mikrotiterplatten verwendet.
[0046] Werden im erfindungsgemäßen Verfahren Fluoreszenzmarker eingesetzt, so wird die PAIA-Platte, wie hier definiert, verwendet.
[0047] Wenn im erfindungsgemäßen Verfahren Biosensoren als funktionalisierte Oberflächen verwendet werden, kommen keine PAIA-Platten zum Einsatz.
[0048] Der Vorteil der Erfindung liegt darin, dass eine Vielzahl von Proben in relativ kurzer Zeit auf das Vorhandensein von Ladungsvarianten untersucht werden kann. Aufgrund der einfachen und auf Wunsch automatisierten Durchführung liegt in der Regel bereits nach weniger als 60 Minuten ein Messergebnis für mehr als 100 Proben gleichzeitig vor. Die für Mikrotiterplatten vorhandene Automatisierung (z.B. Pipettierroboter oder automatische Ausleseverfahren) kann genutzt werden.
[0049] Mikrotiterplatten sind bekannt und gewöhnlich sind sie rechteckig und haben eine unterschiedliche Anzahl von Vertiefungen, auch Wells, Kavitäten oder Vertiefungen genannt. Diese Wells sind üblicherweise parallel zur Längsseite der Mikrotiterplatte in Reihen und parallel zur Schmalseite in Spalten angeordnet sind. [0050] Für die Bezeichnung der Reihen werden in der Regel Buchstaben und für die Bezeichnung der Spalten Zahlen verwendet. Die Näpfchen einer Platte mit 384 Wells sind z. B. in 16 Reihen (von A bis P) und 24 Spalten (von 1 bis 24) angeordnet. Eine schematische Zeichnung einer solchen 384-Well-Platte ist in Fig. 1 dargestellt.
[0051 ] Die Wells einer 96-Well-Platte sind in 8 Reihen (A bis H) und 12 Spalten (1 bis 12) angeordnet. Dadurch kann jedes Well eindeutig identifiziert werden: So enthält die erste Reihe einer 96-Well-Platte 12 Wells, nämlich die Wells A1 bis A12. Die zweite Reihe enthält die Wells B1 bis B12 usw.
[0052] Die spezielle Präparation der Mikrotiterplatte betrifft eine oder mehrere Wells oder im Falle der PAIA-Platte, wie unten näher beschrieben, eine oder mehrere Wells, die eine Messkammer bilden.
[0053] Die Wells der Mikrotiterplatte werden wie folgt präpariert:
[0054] In einem ersten Schritt, wird die gewünschte Anzahl an Wells mit wässrigen Pufferlösungen befüllt, die unterschiedliche pH-Werte und/oder unterschiedliche Salzkonzentrationen aufweisen. Diese Lösungen enthalten unterschiedliche Salzkonzentrationen und pH-Werte.
[0055] Die pH-Unterschiede zwischen den Wells können je nach den Anforderungen des Versuchs (Assay) variiert werden. Dies gilt auch für die Anzahl der Wells, über die sich der Assay erstreckt. Die Figuren 1 b und 1c zeigen eine mögliche Belegung mit einem 12- Punkte oder 12-stufigen Gradienten.
[0056] Die Abstände zwischen den pH-Werten werden so gewählt, wie es die Genauigkeit der Versuchsdurchführung erfordert. Vorteilhaft sind Abstände zwischen den pH-Werten in den einzelnen Wells im Bereich von 0,02 bis 1 oder 0,05 bis 1 ,5 oder 0,03 bis 2. Größere Abstände sind auch möglich.
[0057] Alternativ oder zusätzlich kann die Pufferlösung unterschiedliche Salzkonzentrationen aufweisen. Die Abstände zwischen den Salzkonzentrationen werden so gewählt, wie es die Genauigkeit der Versuchsdurchführung erfordert. Vorteilhaft sind Abstände der Konzentrationen in den einzelnen Wells im Bereich von 0,5 bis 500 mMol/L oder 0,5 bis 100 mMol/L oder 1 bis 90 mMol/L oder 0,8 bis 20 mMol/L oder 1 ,5 bis 50 mMol/L oder 10 bis 75 mMol/L. Salze, die sich zur Herstellung solcher Salzgradienten in Puffern eignen sind üblicherweise Alkali- und Erdalkalimetallsalze wie z.B. NaCI, KCl, MgC , CaCL2, MgSCU und deren Mischungen oder Kombinationen. Es können alle geeigneten Salze verwendet werden.
[0058] Enthalten die Pufferlösungen unterschiedliche Salzkonzentrationen und pH- Werte, so handelt es sich um eine Kombination von pH- und Salzgradienten. Diese Kombination wird in der Literatur als "salt mediated pH gradient“ bezeichnet und zur Optimierung der Trennleistung der Chromatographie verwendet.
[0059] In Goyon et al. (2020) werden verschiedene Mischungsregime bestehend aus drei Puffern beschrieben, ausgehend von einem 20mM MES-Puffer (2-(N- Morpholino)ethansulfonsäure) mit pH 5,6 (Puffer A), einem Puffer aus 20 mM MES und 20 mM Kalium-HEPES (2-[4-(2-Hydroxyethyl)piperazin-1 -yl]ethan-1 -Sulfonsäure) mit pH 6,8 (Puffer B) und einem 20 mM HEPES-Puffer mit pH 8,2 und 100 mM Kaliumchlorid als Salzkomponente.
[0060] Sollen z.B. Ladungsvarianten mit sehr unterschiedlichen Ladungen in einem Gemisch unterschieden werden, ist es wichtig, mit dem Gradienten einen großen pH- Bereich abzudecken, um alle Ladungsvarianten zu erfassen. In diesem Fall ist es vorteilhaft, wenn der Abstand zwischen den pH-Werten (pH-Stufen) etwa 0,2 bis 1 ,5 pH- Einheiten beträgt. Diese Abstufungen können, müssen aber nicht von Stufe zu Stufe gleich sein. Für solche Prüfungen sind in der Regel mindestens acht verschiedene Werte erforderlich (sog. 8-Stufen-Gradient).
[0061 ] Erfordert die Aufgabenstellung die Unterscheidung verschiedener Ladungsvarianten mit nur geringen Ladungsunterschieden in einem Gemisch, so ist die Verwendung kleinerer pH-Unterschiede zwischen den Stufen des pH-Gradienten, z. B. 0,02 bis 0,1 bzw. 0,1-0, 4 pH-Einheiten von Vorteil.
[0062] Außerdem ist es von Vorteil, die Anzahl der Wells für den Gradienten zu erhöhen, um gleichzeitig einen ausreichend großen pH-Bereich abzudecken. Analoges gilt für die Konzentrationsunterschiede bei der Ausbildung eines Salzgradienten. [0063] Für die Konzentrationsunterschiede bei der Ausbildung eines Salzgradienten gelten die obigen Aussagen zur Unterscheidung von Ladungsvarianten mit großen bzw. kleinen Ladungsunterschieden entsprechend, d.h. um die Auflösung in einem Salzgradienten zu verbessern müssen die Konzentrationsunterschiede zwischen den einzelnen Wells im Salzgradienten klein sein.
[0064] Vorgenanntes gilt analog wenn Salz- und pH-Gradienten im erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden.
[0065] Das Wasser kann nun aus den Wells durch Trocknen entfernt werden, bevorzugt bei erhöhter Temperatur, d.h. Temperatur größer als 18 °C, bei Normaldruck oder unter vermindertem Druck
[0066] Dies hat den Vorteil, dass die so vorbereitete Mikrotiterplatte aufbewahrt werden kann. Selbstverständlich muss die Belegung der Vertiefungen mit den verschiedenen pH- Werten und/oder Salzkonzentrationen notiert werden. Dies kann separat oder auf der Platte erfolgen.
[0067] Es hat sich für die Versuchsdurchführung als vorteilhaft herausgestellt, wenn die die Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten und/oder Salzkonzentrationen in nebeneinander oder untereinander liegende Wells eingebracht werden, so dass Reihen oder Spalten mit jeweils aufsteigendem oder absteigenden pH-Wert und/oder Salzgehalt entstehen. Das ermöglicht eine vereinfachte Handhabung bei der Auswertung der Ergebnisse.
[0068] Die Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten und/oder Salzkonzentrationen werden am einfachsten durch Mischen von zwei Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten und/oder Salzkonzentrationen erhalten. Steht ein Puffer A mit niedrigem pH-Wert und/oder einer Salzkonzentration und ein Puffer B mit hohem pH-Wert und/oder Salzkonzentration zur Verfügung, kann der gewünschte pH-Wert oder Salzkonzentration durch Wahl eines geeigneten Mischungsverhältnisses eingestellt werden.
[0069] Puffer mit unterschiedlichen pH-Werten und Salzkonzentrationen können durch Mischen von zwei Puffern, einem Puffer A und einem Puffer B, hergestellt werden. Beide Puffer haben unterschiedliche pH-Werte und einer der Puffer enthält zusätzlich eine bestimmte Salzkonzentration.
[0070] Als Puffersubstanzen können alle gängigen und bekannten Chemikalien eingesetzt werden und die Wahl richtet sich nach der Anwendung des Assays. Gängige Puffersysteme im Umgang mit Proteinen sind z.B. PBS-Systeme (Phosphat-basierter saliner Puffer), Ammoniumacetat- oder Citratbasierte Puffer.
[0071 ] Ein geeignetes Puffersystem ist das CX-1 Puffersystem der Firma Thermo Fisher Scientific, das einen sehr linearen Puffergradienten bereitstellt. Es besteht aus zwei Puffern mit den pH-Werten 5,6 und 10,2, die jeweils vier zwitterionische Puffersubstanzen enthalten. Die gewünschten pH-Werte werden durch Mischen dieser beiden Puffer in unterschiedlichen Volumenverhältnissen eingestellt.
[0072] Ein 12-stufiges Puffersystem mit engen pH-Abständen zwischen den Puffern P1 bis P12, bestehend aus den Puffersubstanzen Na2HPO4 (Puffer A) und NaH2PÜ4 (Puffer B) in einer Konzentration von jeweils 0,02 M, kann durch Mischen von Puffern mit pH 5,7 und pH 8,1 wie folgt erhalten werden.
Zum Beispiel: P1 ist der Puffer mit pH 5,8, P2 ist der Puffer 2 mit pH 6,0 usw.
Tabelle 1 : Beispiel eines 12-stufigen Puffersystems aufgebaut aus zwei PBS-Puffern [0073] Die Herstellung solcher mehrstufiger (quasilinearer) Puffergradienten ist bekannt und es gibt inzwischen Konfiguratoren im Internet (siehe z.B. https://www.aatbio.com/resources/buffer-preparations-and-recipes/phosphate-buffer-ph- 5-8-to-7-4).
[0074] Zur Herstellung von Salzgradienten, d.h. Puffern mit unterschiedlichen Salzkonzentrationen werden gleichfalls Puffersysteme mit darin gelösten Salzen in unterschiedlichen Konzentrationen verwendet und gemischt. Dabei ist der pH dieser Lösungen gleich.
[0075] In einer besonderen Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren zur Analyse von Ladungsvarianten von Proteinen unter Verwendung der speziell präparierten PAIA-Platten (d.h. in deren Wells sich unterschiedliche pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen befinden, wie oben beschrieben) unter Verwendung von Anionenoder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode-Ionenaustauscher als funktionalisierte Oberflächen und Fluoreszenzmarkern als Marker.
[0076] Die PAIA-Platte ist eine Mikrotiterplatte im SBS-Format mit einer bestimmten Anzahl an Wells Näpfchen (Wells), die als Messkammern ausgebildet sind, in denen die Erhebung (in der WO 2015/135840 A1 als Strukturelement bezeichnet) so geformt ist, dass ihre Grundfläche mindestens 50 % der Bodenfläche einer Messkammer bzw. eines Wells einnimmt. Sie sind bekannt und in WO 2015/135840 A1 beschrieben. Sie werden unter dem Handelsnamen PAIAplate 384 von der Firma PAIA Biotech GmbH hergestellt und vertrieben. Diese Platten haben 384 Wells.
[0077] Es versteht sich von selbst, dass die zu verwendende PAIA-Platte mehr oder weniger als 384 Wells haben kann.
[0078] Vorzugsweise weist die Erhebung eine quadratische Grundfläche auf, die sich nach oben hin (zumindest geringfügig) verjüngt und die Form einer vierseitigen Pyramide aufweist. Das obere Ende der Erhebung ist spitz, flach oder konvex, vorzugsweise läuft es spitz zu. Vorteilhafterweise weist das obere Ende der Erhebung einen Durchmesser von weniger als 50 pm auf, so dass sich dort keine Versuchskomponenten ablagern. Die Höhe der Erhebung beträgt mindestens 10 % und höchstens 50 % der Höhe der Meßkammer bzw. des Wells, vorzugsweise mindestens 15 % und höchstens 30 %. Der Boden der Messkammer bzw. des Wells ist bis auf den Boden der Erhebung lichtundurchlässig. Die Erhebung hingegen ist lichtdurchlässig und bildet ein Messfenster, das zur Messung der Fluoreszenzemission verwendet wird, wie in WO 2015/135840 A1 detailliert beschrieben.
[0079] Die PAIA-Platte ist insbesondere folgendermaßen ausgestattet: Die gewünschte Anzahl von Wells (einige oder alle) der Mikrotiterplatte sind als Messkammern ausgebildet, darin befindet sich eine Erhebung, die so geformt ist, dass ihre Grundfläche mindestens 50 % der Bodenfläche einer Messkammer bzw. eines Wells einnimmt und vorzugsweise eine quadratische Grundfläche, die sich nach oben hin zumindest geringfügig verjüngt und die Form einer vierseitigen Pyramide aufweist , wobei das obere Ende der Erhebung spitz, flach oder konvex ist und vorteilhafterweise weist das obere Ende der Erhebung einen Durchmesser von weniger als 50 pm auf, so dass sich dort keine Versuchskomponenten ablagern, wobei die Höhe der Erhebung mindestens 10 % und höchstens 50 % der Höhe der Meßkammer bzw. des Wells beträgt und der Boden der Messkammer bzw. des Wells bis auf den Boden der Erhebung lichtundurchlässig ist und die Erhebung ist lichtdurchlässig ist und ein Messfenster bildet, das zur Messung der Fluoreszenzemission verwendet wird.
[0080] Hinsichtlich der Messfenster wird auf die Beschreibung in der WO 2015/132840 A1 verwiesen und insoweit vollinhaltlich Bezug genommen. Zur Fluoreszenzmessung wird die erfindungsgemäße Messkammer bzw. Mikrotiterplatte von unten mit Anregungslicht bestrahlt, welches dann über die Erhebung in die Probe eingestrahlt wird. Um das Fluoreszenzsignal auszulesen, können handelsübliche Fluoreszenzreader verwendet werden.
[0081 ] Als Fluoreszenzreader können beispielsweise folgende Geräte erfindungsgemäß verwendet werden: Die Geräte der Serie Spectramax der Fa. Molecular Devices, die Systeme, der Fa. Tecan (Satire, der Infinite-Serie, oder SPARK), Reader der Fa. BMG Labtech (Omega, Clariostar, Pherastar) sowie Fluoreszenzmikroskope, z.B. der Fa. SynenTec (Cellavista und NyONE). [0082] Die Erfindung unter Verwendung der PAIA-Platte kann insbesondere bei der Entwicklung von Zellkulturverfahren zur Herstellung von Proteinen, insbesondere therapeutisch wirksamen Proteinen, wie Antikörpern, Fc-Fusionsproteinen, Antikörperfragmenten, bi- und mehrspezifischen Antikörpern sowie viruspartikelbasierten Therapeutika vorteilhaft eingesetzt werden. Die Erfindung betrifft daher auch die Verwendung von PAIA-Platten zur Analyse, d.h. Detektion und Nachweis von Ladungsvarianten von Proteinen, insbesondere therapeutisch wirksamen Proteinen, wie Antikörpern, Fc-Fusionsproteinen, Antikörperfragmenten, bi- und mehrspezifischen Antikörpern sowie viruspartikelbasierten Therapeutika.
[0083] In einer Ausführungsform der Erfindung wird bei dem erfindungsgemäßen Verfahren eine Mikrotiterplatte verwendet, in deren Wells Puffersubstanzen und/oder Salze vorhanden sind, die in gelöstem Zustand unterschiedliche pH-Werte und/oder unterschiedliche Salzgehalte ergeben. Solche Platten werden hergestellt, indem Pufferlösungen und/oder Salzlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten und/oder Salzgehalten in die Wells der Platten eingebracht und bei erhöhter Temperatur, vorteilhafterweise bei Temperaturen ab 18 °C, bevorzugt ab 25 °C, insbesondere bei 30 °C, bei Normaldruck oder vermindertem Druck getrocknet werden.
[0084] Die Erfindung betrifft auch eine PAIA-Platte, bei der in einer oder mehreren der Wells Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten und/oder Salzkonzentrationen vorhanden sind und in die gegebenenfalls funktionalisierten Oberflächen Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode-Ionenaustauscher und gegebenenfalls Fluoreszenzmarker eingebracht sind.
[0085] Das erfindungsgemäße Verfahren unter Verwendung der PAIA-Platte kann wie folgt durchgeführt werden:
(a) Zugabe von je einem Aliquot der Proteinprobe in die mit Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten und/oder Salzkonzentrationen vorbehandelten Wells;
(b) Zugabe von Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode- Ionenaustauscher, die ladungsspezifisch an das Protein binden in Form von Partikeln; (c) Zugabe eines oder mehrerer Fluoreszenzmarker, die so ausgewählt sind, dass sie spezifisch an das zu bestimmende Protein binden, dessen Ladungsvarianten zu bestimmen sind;
(d) Mischen;
(e) Messen der Intensität der ungebundenen Fluoreszenzmarker, nach dem Absetzen der Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi- Mode-Ionenaustauscher;
(f) Korrelieren der Messung mit dem in den Wells vorliegenden pH-Werten und/oder Salzgehalten, um die verschiedenen Ladungsvarianten des Proteins zu bestimmen.
[0086] Bei dem vorstehenden Verfahren können die Schritte (a), (b) und (c) in beliebiger Reihenfolge durchgeführt werden. Wird Schritt (b) und/oder (c) - jeweils in beliebiger Reihenfolge - vor Schritt (a) durchgeführt, so kann nach Schritt (b) und/oder Schritt (c) ein Trocknungsschritt vorgesehen sein. Im Trocknungsschritt wird die mit den Versuchskomponenten eingebrachte Flüssigkeit entfernt, vorzugsweise durch Trocknen bei erhöhter Temperatur, wie hier beschrieben.
[0087] Wird ein Trocknungsschritt eingefügt, so kann das Verfahren nach dem Trocknungsschritt beliebig lange unterbrochen und mit Schritt (a) fortgesetzt werden.
[0088] Die Erfindung betrifft die PAIA-Platte, bei der nach dem Einbringen der Pufferlösungen, ggf. der funktionalisierten Oberflächen und/oder Fluoreszenzmarker die flüssigen Bestandteile (Wasser aus der Pufferlösung etc.) durch Trocknung entfernt werden.
[0089] Die Erfindung betrifft daher auch eine PAIA-Platte mit eingetrockneten Substanzen, nämlich Puffersubstanzen, ggf. funktionalisierten Oberflächen und/oder ggf. Fluoreszenzmarkern, wobei in einigen der in Spalten oder Reihen angeordneten Wells bei Zugabe von Probelösung ein abnehmender oder zunehmender pH-Wert und/oder Salzkonzentration vorliegt. [0090] Die Erfindung betrifft ferner ein sog. Kit of Parts umfassend eine PAIA-Platte mit eingetrockneten Substanzen, nämlich Puffersubstanzen und funktionalisierten Oberflächen und einen Fluoreszenzmarker, wobei in einigen der in Spalten oder Reihen angeordneten Wells bei Zugabe von Probelösung ein abnehmender oder zunehmender pH-Wert und/oder Salzkonzentration vorliegt.
[0091 ] Die Erfindung kann auch unter Verwendung von Biosensoren als funktionalisierte Oberflächen in Mikrotiterplatten durchgeführt werden. Das Verwenden einer PAIA-Platte ist dann nicht vorgesehen.
[0092] Deshalb betrifft die Erfindung auch ein Verfahren zur Analyse von Ladungsvarianten von Proteinen unter Verwendung von Mikrotiterplatten, deren Vertiefungen (Wells) zumindest teilweise unterschiedliche pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen aufweisen und unter Verwendung von Biosensoren als funktionalisierte Oberflächen. Die Biosensoren sind so ausgestattet, dass sie in der Lage sind als Anionen- und Kationenaustauscher oder als Mixed-Mode- oder Multi-Mode- Ionenaustauscher zu wirken. Das Verfahren kann gleichfalls die Zugabe von Markermolekülen umfassen.
[0093] Das Verfahren umfasst dann folgende Schritte
(a) Verwendung der speziell vorbehandelten Mikrotiterplatte, in deren Wells unterschiedliche pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen vorliegen, wobei nicht jedes Well der Platte belegt sein muss, und
(b) Zugabe von je einem Aliquot der Proteinprobe in die mit Puffern unterschiedlicher pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen vorbehandelten Wells;
(c) Einführung des Biosensors in die behandelten und mit Probe versehenen Wells der Mikrotiterplatte;
(d) Mischen;
(e) Messen des ausgelösten Signals des Biosensors;
(f) Korrelieren der Messung mit dem in den Wells vorliegenden pH-Wert und/oder Salzgehalt, um die verschiedenen Ladungsvarianten des Proteins zu bestimmen. [0094] Das erfindungsgemäße Verfahren zur Analyse von Ladungsvarianten von Proteinen unter Verwendung von Biosensoren kann auch wie folgt durchgeführt werden:
(1 ) Verwenden der speziell präparierten Mikrotiterplatte in dessen Wells ein geeigneter pH- und/oder Salzgradienten vorhanden ist, wobei der pH- oder Salzgradient getrocknet vorhanden ist oder frisch vorgelegt wird;
(2) Zugabe von je einem Aliquot der Proteinprobe in die mit Puffern unterschiedlicher pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen vorbehandelten Wells;
(3) Einführen der Biosensoren mit lonenaustauschoberflächen in die Kavitäten mit dem pH- und/oder Salzgradienten;
(4) Schütteln der Mikrotiterplatte, wodurch die Reaktion beschleunigt wird, und gleichzeitige (Echtzeit-) Messung der Bindung an die lonenaustauschoberflächen auf den Biosensoren;
(5) Bei Verwendung von nicht aufgereinigten Proben, die Fremdproteine enthalten, oder wenn das Messsignal des Zielmoleküls zu niedrig ist, wird das Schütteln nach Erreichen des maximalen Messsignals (d.h. Biosensoren sind gesättigt) beendet;
(6) Die Biosensoren werden aus der Mikrotiterplatte genommen und in eine zweite Mikrotiterplatte gegeben, die denselben Gradientenpuffer und zusätzlich ein Markermolekül enthält, das spezifisch an das Zielmolekül bindet;
(7) Erneutes Schütteln der Mikrotiterplatte und gleichzeitige Messung der Bindung des Markermoleküls an die bereits an die lonenaustauschoberflächen der Biosensoren gebundenen Zielproteine;
(8) Bestimmung der Bindung des Zielproteins an die lonenaustauschoberflächen in allen Kavitäten des Gradienten entweder über das in Schritt (4) oder das in Schritt (7) gemessene Signal und Bestimmung des Ladungsprofils der Probe.
[0095] Der Nachweis von Ladungsvarianten mit Hilfe von Biosensoren kann erfolgen, indem lonenaustauscheroberflächen auf Biosensoren aufgebracht werden, die in die Wells von Mikrotiterplatten (keine PAIA-Platten) mit unterschiedlichen pH-Werten oder Salzkonzentrationen eingebracht werden und an denen die Bindung der Zielproteine gemessen wird. [0096] Dazu werden vor allem optische Methoden wie die so genannte Biolayer- Interferometrie eingesetzt, bei der eine Phasenverschiebung des Lichts auftritt, wenn Moleküle an die Oberfläche des Biosensors binden. Diese Phasenverschiebung ist messbar und hängt von der Anzahl und Masse der an die Oberfläche gebundenen Moleküle ab.
[0097] Die Messung mit Biosensoren kann gleichzeitig, d.h. mit vielen Biosensoren erfolgen. Alternativ kann sie sequentiell erfolgen, d.h. ein Biosensor wird nacheinander in die verschiedenen Kavitäten der Mikrotiterplatte enthaltend eine Stufe des Gradienten eingeführt und vor jeder Messung eines neuen Wells regeneriert und gewaschen.
[0098] Die Regeneration von Biosensoren ist ein bekanntes Verfahren. Moderne Geräte sind in der Lage, mit mehreren Biosensoren gleichzeitig in verschiedenen Wells zu messen und damit einen wesentlich höheren Probendurchsatz zu erreichen.
[0099] Wenn bei der Messung nur kleine Mengen eines Proteins gebunden oder sehr kleine Proteine gemessen werden und deshalb nur ein sehr schwaches Messsignal erzeugt wird, ist es bei Biosensoren üblich, nach der Bindung des Zielmoleküls an die Oberfläche zur Signalverstärkung ein spezifisch an das Zielmolekül bindender Marker, z. B. einen Antikörper mit ausreichend großer Molekülmasse, an die Oberfläche zu binden. Reicht auch dies zur Signalverstärkung nicht aus, kann auch noch ein weiterer Marker, (hier Binder genannt, z.B. ein sekundärer Antikörper), der spezifisch an den primären Antikörper bindet, an den Biosensor binden.
[0100] Der gleiche Ansatz wird verwendet, wenn bei der Bindung des Proteins weitere unerwünschte Moleküle und Proteine ("Nicht-Zielmoleküle") an die Oberfläche gebunden werden. Dies kann z. B. der Fall sein, wenn die Probe nicht gereinigt wurde und Fremdproteine enthält, die ebenfalls an die Oberfläche binden.
[0101 ] In diesem Fall ermöglicht die Verwendung eines spezifischen Markermoleküls, z. B. eines Antikörpers, der spezifisch an das Zielprotein bindet, die Messung einer Phasenverschiebung aufgrund der Bindung des Markermoleküls, und diese Bindung hängt nur von der Menge der an die Oberfläche gebundenen Zielmoleküle ab. Es handelt sich also um ein für das Zielmolekül spezifisches Messsignal. [0102] Die das Protein mit den Ladungsvarianten enthaltende Probe wird nach der Entnahme gewöhnlich ohne weitere Behandlung (z.B. Aufreinigung) portionsweise in die Wells der Mikrotiterplatte, die auch eine PAIA-Platte sein kann, gegeben. Eine Verdünnung der Probe mit Wasser ist jedoch vorteilhaft, um eine den Versuch störende Konzentration an Puffersubstanzen zu erniedrigen.
[0103] Das Portionieren geschieht manuell oder automatisch mit einem automatisierten Pipettierroboter (Liquidhandler).
[0104] Bei der Verwendung der PAIA-Platte kann es für die Effizienz vorteilhaft sein kann, wenn auch der oder die Fluoreszenzmarker und/oder die funktionalisierten Oberflächen bereits getrocknet in der PAIA-Platte vorliegen.
[0105] Die Besonderheit der Erfindung besteht darin, dass bei der Durchführung des Verfahrens in den in Reihen oder Spalten angeordneten Kavitäten der Mikrotiterplatte unterschiedliche pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen vorliegen.
[0106] Ein besonderer Vorteil der Erfindung besteht darin, dass die Proben direkt (ggf. nach Verdünnung mit Wasser) gemessen werden können. Eine Aufreinigung vor Durchführung der Verfahren (der Assays) ist nicht erforderlich.
[0107] Der in den Wells vorhandene pH-Wert und/oder die Salzkonzentration sind entscheidend für die Bindungseigenschaften der jeweiligen Ladungsvariante des Proteins an die funktionalisierte(n) Oberfläche(n). Die Messung mit dem Biosensor oder - bei Verwendung der PAIA-Platte - der Fluoreszenzintensität der ungebundenen Fluoreszenzmarker - liefert einen Wert, aus dem auf den Ladungszustand des gemessenen Proteins geschlossen werden kann.
[0108] Die funktionalisierten Oberflächen werden bei dem erfindungsgemäßen Verfahren so ausgewählt, dass sie das Protein mit den Ladungsvarianten binden können. Erfindungsgemäß verwendbar sind Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode-Ionenaustauscher sowie Biosensoren, deren Messoberflächen die gleichen oder ähnliche Funktionalitäten wie die vorgenannten Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode-Ionenaustauscher aufweisen. - TI -
[0109] Anionenaustauscher sind bekannt und werden nach ihrer lonenstärke in starke und schwache Anionenaustauscher eingeteilt. Starke Anionenaustauscher sind solche mit positiv geladenen funktionellen Gruppen, z.B. quaternäre Anminoethyl-Gruppen, quaternäre Aminomethyl-Gruppen oder Triethylaminomethyl-Gruppen aufweisen. Schwache Anionenaustauscher enthalten häufig Diethylaminoethyl-Gruppen.
[0110] Zu den starken Anionenaustauschern gehören z.B. Macro-Prep High Q Support und UNOsphere Q Media, beide von der Firma Bio-Rad erhältlich oder QAE Sephadex A-25 (Fa. Cytiva), Capto Q (Fa. Cytiva), POROS XQ Strong Anion Exchange Resin (Fa. ThermoFisher).
[0111 ] Schwache Anionenaustauscher sind z.B. DEAE Sepharose Fast Flow (Cytiva), Macro-Prep DEAE Resin (Bio-Rad), TOYOPEARL DEAE-650 (Tosoh), DEAE Ceramic HyperD (Sartorius), Fractogel® EMD DEAE (Merck).
[0112] Kationenaustauscher sind ebenso bekannt und werden gleichfalls in starke und schwache Kationenaustauscher eingeteilt. Erstere enthalten beispielsweise Sulfonat- Gruppen (S), Sulfoethyl-Gruppen (SE) oder Sulfopropyl-Gruppen (SP) an ihrer Oberfläche. Die schwachen Kationenaustauscher enthalten negativ geladene Ladungen, wie z.B. Carboxymethyl-Gruppen (CM).
[0113] Starke Kationenaustauscher sind z.B. SP Sepharose Fast Flow (Cytiva), SP Sephadex C-25 (Cytiva), TOYOPEARL SP-650 (Tosoh), Macro-Prep High S (Bio-Rad).
[0114] Schwache Kationenaustauscher sind bekannt und käuflich erhältlich, wie z.B. Macro-Prep CM (Bio-Rad), CM Sepharose High Performance FF (Cytiva), G-Sep™ CM Agarose Fast Flow (G-Bioscience).
[0115] Mixed-Mode und Multi-Mode Ionenaustauscher sind bekannt und käuflich erhältlich.
[0116] Mixed-Mode Ionenaustauscher sind z.B. das CHT (Ceramic Hydroxyapatite)- Säulenmaterial Typ I und Typ II der Firma Bio-Rad auf dessen Oberfläche negativ geladene Phosphatgruppen und positiv geladene Calciumionen für die Wechselwirkung zur Verfügung stehen. [0117] Ein weiterer Mixed-Mode- oder Multi-Mode-(Kationen-)Austauscher ist das Material TOYOPEARL® MX-Trp-650M der Firma Tosoh Bioscience, an dessen Oberfläche sich neben negativ geladenen Carboxylgruppen auch hydrophobe Tryptophan-Gruppen für hydrophobe Wechselwirkungen befinden. Ein weiterer Mixed- Mode Ionenaustauscher ist ein schwacher Kationenaustauscher mit hydrophoben Gruppen, der als Capto MMC- Säulenmaterial der Firma Cytiva erhältlich ist. Ein weiteres Beispiel ist Capto Adhere (ebenfalls von Cytiva), ein starker Anionenaustauscher mit zusätzlichen hydrophoben aromatischen Gruppen.
[0118] Bevorzugt weisen erfindungsgemäß verwendbare Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode-Ionenaustauscher mittlere Durchmesser im Bereich von etwa 5 bis 200 pm auf. Bevorzugt weisen die Partikel mittlere Durchmesser im Bereich von 5 bis 150 pm oder 10 bis 100 pm auf.
[0119] Beschreibung der Figuren:
Fig. 1 a zeigt eine schematische Beschriftung der in einer 384-Wells Mikrotiterplatte vorhandenen Vertiefungen (Wells).
Fig. 1 b zeigt eine schematische Darstellung einer 384-Well-Platte mit einem 12-stufigen pH-Gradienten. Pro Spalte liegt der 12-stufige Gradient vor. Unbehandelte Wells sind in den Spalten 5, 10, 14, 18, 22-24 vorhanden.
Fig. 1 c zeigt eine schematische Darstellung einer 384-Well-Platte mit einem 12-stufigen pH-Gradienten. Pro Zeile liegt 12-stufige Gradient 2x vor (Spalte 1 -12 und Spalte 13-24). Es sind keine unbehandelten Wells vorhanden.
Fig. 2 zeigt das Belegschema aus Beispiel 1 .
Fig. 3 bezieht sich auf Beispiel 1 und zeigt die gemessenen Fluoreszenzintensitäten der ungebundenen Fluoreszenzmarker von V1-A Trastumab (HER) - ungestresst und V1 -B Trastumab (HER)- hitzebehandelt in Abhängigkeit vom pH-Wert.
Fig. 4 Fig. bezieht sich auf Beispiel 1 und zeigt die Fluoreszenzintensitätend V1 -C Trastumab (HER) - ungestresst und V1 -D Trastumab (HER)- hitzebehandelt in verdünntem Zellkulturüberstand gemessen. Fig. 5a bezieht sich auf das Beispiel 1 und stellt ein Vergleichsbeispiel dar. Dargestellt ist das Ergebnis der chromatographischen Auswertung, nämlich ein CEX-Chromatogramm der ungestressten Trastuzumab-Probe 2 mg/mL in H2O.
Fig. 5b bezieht sich auf das Beispiel 1 und stellt ein Vergleichsbeispiel dar. Dargestellt ist das Ergebnis der chromatographischen Auswertung, nämlich ein CEX-Chromatogramm der der bei 35 Grad gestressten Trastuzumab-Probe 2 mg/mL in H2O.
Fig. 6 bezieht sich auf Beispiel 2 und zeigt den Verlauf der Fluoreszenzintensitäten in Abhängigkeit der auf der x-Achse dargestellten pH-Werte.
Fig. 7 bezieht sich auf Beispiel 2 und zeigt eine Darstellung der Punkt-zu-Punkt Steigung in Anhängigkeit des pH-Werts
[0120] Beschriftung der Figuren
Fig. 1 a: Schematische Beschriftung der in einer 384-Wells Platte vorhandenen Wells.
Fig. 1 b: Schematische Darstellung einer 384-Well-Platte mit einem 12-stufigen pH- Gradienten.
Fig. 1 c: Schematische Darstellung einer 384-Well-Platte mit einem 12-stufigen pH- Gradienten.
Fig. 2: Belegschema aus Beispiel 1.
Fig. 3: Beispiel 1 : Fluoreszenzintensitäten der Proben - in H2O gemessene Proben
Fig. 4: Beispiel 1 : Fluoreszenzintensitäten der Proben - in verdünntem Zellkulturüberstand gemessene Proben
Fig. 5a: Beispiel 1 - Vergleichsbeispiel: Chromatographische Trennung ungestresster Proben in H2O
Fig. 5b: Beispiel 1 - Vergleichsbeispiel: Chromatographische Trennung gestresster Proben in H2O
Fig. 6: Beispiel 2 - Verlauf der Fluoreszenzintensitäten in Anhängigkeit des pH-Werts Fig. 7: Beispiel 2 - Darstellung der Punkt-zu-Punkt Steigung in Anhängigkeit des pH- Werts
[0121 ] Die Erfindung wird anhand der in den Figuren gezeigten und nachstehend beschriebenen Beispiele erläutert, ohne die Erfindung darauf zu beschränken.
Versuchsbeispiele:
[0122] Soweit nichts anderes angegeben werden in den nachfolgenden Beispielen 1 und
2 folgende Hilfsmittel und Reagenzien verwendet:
[0123] Als Reaktions- und Meßkammern werden die Wells (Näpfchen) einer PAIAplate 384 verwendet. Sie ist erhältlich von PAIA Biotech GmbH, und wird wie in WO 2015/135840 A1 hergestellt, verwendet. Das Arbeitsvolumen eines Wells beträgt 15pL- 110pL.
[0124] Wenn nichts anderes erwähnt ist, wird eine phosphatgepufferte Salzlösung, ein sogenannter PBS-Puffer, verwendet, der auf einen pH-Wert von 7,4 eingestellt ist. Der PBS Puffer enthält 137 mM NaCI, 2,7 mM KCl und 12 mM Phosphate.
[0125] Als funktionalisierte Oberfläche wird ein starker Kationenaustauscher in Form von Partikeln, nämlich CaptoSP ImpRes Partikel (Fa. Cytiva, Art-Nr. 17546802) mit einem durchschnittlichen Durchmesser von ca. 10 pm, verwendet. Die Partikel tragen Liganden mit Sulfonsäuregruppen.
[0126] Soweit nichts anderes angegeben, werden die Messkammern vor der Messung wie folgt behandelt:
Vorbereitung der Messkammern / der Mikrotiterplatte
[0127] Aus der Kationenaustauscher-Partikel-Stammlösung (Slurry) wird durch Zugabe von Wasser und LPS (Liquid Plater Sealer, Fa. Candor) eine 9%-ige Partikel- Arbeitslösung mit einer Konzentration von 10% [v/v] an LPS hergestellt. [0128] 30pL dieser Partikel-Arbeitslösung werden in die entsprechenden Wells der PAIA- Platte pipettiert. In jedes dieser Wells werden 7,5pL von einer Pufferlösung unterschiedlicher pH-Werte zugegeben (genaueres zu den pH-Werten ist den Tabellen in Bsp. 1 und 2 zu entnehmen), wobei die Pufferzugabe nach einem gewissen Schema erfolgt, so dass nachvollzogen werden kann, in welchem Well welcher Puffer-pH eingebracht wurde.
[0129] Nach Zugabe der Puffer wird kurz gemischt. Danach wird die Flüssigkeit aus der Platte entfernt. Dafür wird die Platte bei 35 °C für 48 Stunden in einem Trockenschrank oder ähnlichem getrocknet. Nach der Trocknung kann die Titerplatte gelagert oder direkt für die Messung verwendet werden.
Beispiel 1 : Messung der Ladungsvarianten (CVAs) thermisch gestresster Antikörperproben
Herstellung des Puffergradientens:
[0130] Verwendet wird ein pH-Gradienten-System CX-1 der Firma Thermo Fisher Scientific (Art-Nr. 302779). Dieses System besteht aus vier verschiedenen Puffersubstanzen und zeichnet sich dadurch aus, dass durch Mischung von zwei Puffern (Puffer A und Puffer B) definierte pH-Werte eingestellt werden können, die einen pH- Gradienten ergeben mit Abständen zwischen den pH Werten von 0,2-0, 3.
[0131 ] Puffer A besitzt den pH-Wert von 5,6 und Puffer B den pH-Wert von 10,2.
[0132] Folgende Mischungen werden eingesetzt, um einen 12-Punkte-Gradienten im Bereich von 7,3 bis 10,2 herzustellen.
Tabelle 2: 12-Punkte Gradient, hergestellt mit CX-1 Puffersystems der Fa. Thermo Fisher Scientific
[0133] Die Vorbereitung der Messkammern in der PAIA-Plate erfolgt wie oben beschrieben, wobei in jedes der Wells mit Partikel 7,5pL der Pufferlösungen P1 bis P12 - wie in Tabelle 2 dargestellt - gegeben werden, wobei die Pufferzugabe nach einem bestimmten Schema erfolgt, so dass nachvollzogen werden kann, in welchem Well welcher der Puffer P1 bis P12 vorhanden ist. Alternativ dazu kann notiert werden, in welchem Well der jeweilige Puffer P1 bis P12 vorhanden ist.
[0134] Getestet wurden folgende Proben, Zielprotein ist der Antikörper Trastuzumab:
V1 -A: Trastuzumab (HER, Herceptin) bei 4 °C gelagert; Probe vor Messung mit Wasser verdünnt.
V1 -B: Trastuzumab 14 Tage bei 35 °C gelagert; Probe vor Messung mit Wasser verdünnt.
V1 -C: Trastuzumab (HER, Herceptin) bei 4 °C gelagert; Probe vor Messung mit Zellkulturüberstand (ZKÜ) verdünnt.
V1 -D: Trastuzumab (HER, Herceptin) 14 Tage bei 35 °C gelagert; Probe vor Messung mit Zellkulturüberstand (ZKÜ) verdünnt.
[0135] Durch die Hitzebehandlung entstehen saure Ladungsvarianten von Trastuzumab.
[0136] Die Trastuzumab-Proben werden mit Wasser oder in mit Wasser verdünntem Zellkulturüberstand (Verdünnung 1 :5) auf eine Konzentration von 150 pg/mL verdünnt.
[0137] 1 OpL dieser Probelösung wurden in jeweils 3 der mit P1 bis P12 behandelten Wells gegeben. Somit sind 36 Wells belegt und man erhält pro Puffer P1 bis P12 jeweils drei Datenwerte. In diese belegten Wells wird 50 pL des Fluoreszenzmarkers (mit Alexa 647- konjugierter Affibody (Fa. Affibody AB, Schweden)) zugegeben und alles gemischt.
[0138] Zugegeben werden 50pL des oben genannten Fluoreszenzmarkers, der in einer Konzentration von 12 nM in einem PBS-Puffer mit 50 ppm BSA vorliegt.
[0139] Die Belegung der Platte ist in Fig. 2 exemplarisch dargestellt.
[0140] Die gesamte Mikrotiterplatte wurde bei Raumtemperatur bei 1400 rpm auf einem Eppendorf Thermomixer Comfort 30 Minuten lang geschüttelt und die Platte anschließend bei 500 x g eine Minute zentrifugiert.
[0141 ] Anschließend erfolgt die Messung der Fluoreszenzintensität von unten (bottom reading) in jeder Messkammer in einem Tecan Satire Fluoreszenzplattenreader bei einer Anregungswellenlänge von 630 nm und einer Emissionswellenlänge von 665 nm.
[0142] Die Figuren 3 und 4 verdeutlichen die Unterschiede im Hinblick auf die vorhandenen Ladungsvarianten, d.h. der CVA-Profile der temperaturbehandelten Proben V1 -B und V1 -D gegenüber den nicht temperaturbehandelten Proben V1-A und V1 -C.
[0143] Die Kurven der temperaturbehandelten und damit gestressten Proben zeigen eine Verschiebung des Fluoreszenzanstiegs zu niedrigeren (sauren) pH-Werten, d.h. es gibt in diesen Proben einen Anteil an Trastuzumab-Antikörpern, die bereits bei leicht sauren Puffern von den Partikeln abgelöst werden (bzw. schwächer an die Partikel binden), was darauf hindeutet, dass es sich bei diesen Antikörpern um saure Ladungsvarianten von Trastuzumab handelt.
[0144] Zur Überprüfung der Ergebnisse werden dieselben Proben mittels konventioneller Kationenaustauschchromatographie analysiert. Das System verwendet eine Kationenaustauschersäule vom Typ Column Thermo ProPac WCX-10, 250 x 4 mm und das Puffersystem CX-1 von ThermoFisher mit einer Flussrate von 1 mL/Min. Der Ausgangspuffer besteht aus 100 % Puffer A, dem in den ersten 15 Minuten sukzessive der Puffer B bis zu einem Gehalt von 50 % B zugemischt wird. In den folgenden 2 Minuten wird der Anteil des Puffers B auf 100% erhöht. Somit wird mit einem pH-Gradientenpuffer von 5,6 bis 10,2 gearbeitet. Der Nachweis der eluierten Moleküle erfolgt durch Absorptionsmessung bei 280 nm. Die Ergebnisse sind in den Figuren 5a und 5b dargestellt.
[0145] Die Ergebnisse der Versuche erfindungsgemäß und mit der konventionellen Methode (CEX-Chromatographie) stimmen gut überein. Die Messungen der Proben in Wasser und dem verdünnten Zellkulturüberstand stimmen ebenfalls überein.
[0146] Betrachtet man die Ergebnisse der konventionellen Kationenaustauschchromatographie, so fällt auf, dass der Hauptpeak, d.h. die in der Probe am häufigsten vorkommende Ladungsvariante in der nicht gestressten Trastuzumab-Probe nach einer Retentionszeit von 16,54 Minuten von der Säule eluiert wird. Die Peakfläche beträgt 870.278 AU.
[0147] Vor diesem Hauptpeak ist ein Anstieg der Basislinien zu erkennen, der auf das Vorhandensein einiger saurer Ladungsvarianten hinweist, sowie ein saurer Peak bei einer Retentionszeit von 14,92 Minuten. Insgesamt haben die sauren Varianten eine Peakfläche von 526.724 AU.
[0148] In dieser Probe wird auch eine basische Ladungsvariante bei einer Retentionszeit von 17,23 Minuten mit einer Peakfläche von 278.435 AU registriert.
[0149] In der bei 35 °C gestressten Probe ist der Hauptpeak (Retentionszeit 16,55 Minuten) deutlich kleiner als in der ungestressten Probe und besitzt eine deutlich kleinere Peakfläche (227.437 AU).
[0150] Die sauren Ladungsvarianten sind in der gestressten Probe deutlich präsenter und weisen eine kumulierte Peakfläche von 1.157.381 AU auf.
[0151 ] Der in beiden Proben detektierte basische Peak weist in beiden Chromatogrammen eine quasi identische Peakfläche auf.
[0152] Dies bedeutet, dass durch die Temperaturbehandlung saure Ladungsvarianten erzeugt werden. Dies ist auch in der Literatur entsprechend beschrieben (Spanov et al . Change of charge variant composition of trastuzumab upon stressing at physiological conditions, Journal of Chromatography A 1655 (2021 ) 462506). Beispiel 2: Bestimmung von zwei Antikörpern mit unterschiedlichem isoelektrischen Punkt
[0153] Die Herstellung der Pufferlösungen mit unterschiedlichen pH-Werten erfolgt wie in Beispiel 1 beschrieben, wobei zur Herstellung das 8-stufige Puffersystem gemäß Tabelle 3 - wie unten wiedergegeben - verwendet wird.
Tabelle 3: 8-Punkte Gradient, hergestellt mit CX-1 Puffersystems der Fa. Thermo Fisher Scientific
[0154] Als Fluoreszenzmarker wird der Nano-Secondary® alpaca anti-human IgG/anti- rabbit IgG, recombinant VHH, Alexa Fluor® 647 (Art.-No. CTK0101 - Fa. ChromoTek GmbH) verwendet. Dieser wird in einer Konzentration von 5 nM in einem PBS-Puffer mit 50 ppm BSA verwendet.
[0155] Als biologische Analyten werden die beiden monoklonalen Antikörper Bevacizumab (Bev) und Rituximab (Rit) sowie drei Mischungen dieser beiden Moleküle in den Mischungsverhältnissen 75:25, 50:50 und 25:75 verwendet. Die Gesamtkonzentration der Antikörper in allen Proben betrug 50 pg/mL.
[0156] Jeweils 10 pl dieser Probenlösungen werden in drei Wells mit unterschiedlichen pH-Werten (insgesamt 24 Kavitäten pro Probe) gegeben und mit 50 pl der Fluoreszenzmarkerlösung versetzt. Die gesamte Mikrotiterplatte wird bei Raumtemperatur für 30 Minuten bei 1400 rpm in einem Eppendorf Thermomixer Comfort geschüttelt und anschließend für eine Minute bei 500 x g zentrifugiert.
[0157] Anschließend erfolgt die Messung der Fluoreszenzintensität von unten (bottom reading) in jeder Messkammer in einem Tecan Satire Fluoreszenzplattenreader bei einer Anregungswellenlänge von 630 nm und einer Emissionswellenlänge von 665 nm.
[0158] Die Diagramme in Fig. 6 zeigen die Verläufe der Fluoreszenzintensität der verschiedenen Proben in Abhängigkeit vom pH-Wert in den Wells.
[0159] Die Probe mit 100 % Bev zeigt den größten Unterschied in der Fluoreszenzintensität zwischen den pH-Werten 6,9 und 7,6. Mit abnehmendem Bev- Anteil in den Proben nimmt dieser Unterschied ab und gleichzeitig bewirkt der zunehmende Rit-Anteil in diesen Proben, dass die Fluoreszenzintensität in diesen Proben zwischen den pH-Werten 8,9 und 9,5 stark ansteigt.
[0160] Dies bedeutet, dass Bev bereits bei pH-Werten von ca. 7 von den Partikeln abgelöst wird und Rit erst bei pH-Werten von ca. 9. Das bedeutet, dass Bev ein deutlich saurerer Antikörper ist als Rit. Dies stimmt mit den in der Literatur angegebenen isoelektrischen Punkten von 8,5 für Bev und 9,5 für Rit überein. (Siehe Goyon et al. 2017: Determination of isoelectric points and relative charge variants of 23 therapeutic monoclonal antibodies Journal of Chromatography B Volumes 1065-1066, 15 October 2017, pp 119-128).
[0161 ] Stellt man statt der Fluoreszenzintensität die Punkt-zu-Punkt-Steigung der Proben dar, so erhält man eine Chromatogramm-ähnliche Darstellung, in der Peaks erkennbar sind (Fig. 7). Die Höhe der Peaks entspricht zudem den in den Proben eingestellten Mischungsverhältnissen, d.h. es können quantitative Aussagen getroffen werden.

Claims

Ansprüche:
1 . Verfahren zur Analyse von Ladungsvarianten von Proteinen unter Verwendung von Mikrotiterplatten, deren Vertiefungen (Wells) zumindest teilweise unterschiedliche pH-Werte und/oder Salzkonzentrationen aufweisen und unter Verwendung von funktionalisierten Oberflächen.
2. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Proteine therapeutisch wirksame Proteine sind, wie Antikörper, Fc-Fusionsproteine, Antikörperfragmente, bi- und mehrspezifische Antikörper sowie viruspartikelbasierte Therapeutika.
3. Verfahren nach Anspruch 1 , wobei die Ladungsvarianten fehlgepaarte und fehlassemblierte Proteine und deren Fragmente umfassen, die bei der Herstellung auftreten oder viruspartikelbasierte Therapeutika, die eine fehlerhafte Nukleinsäure-Beladung aufweisen.
4. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die Proteine Viruspartikel sind, die mit Nukleinsäuren beladen sein können.
5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Vertiefungen der Mikrotiterplatte wie folgt präpariert werden:
Befüllen der Wells in der Mikrotiterplatte mit wässrigen Pufferlösungen, die unterschiedliche pH-Werte aufweisen, wobei die Abstände der pH-Werte in den einzelnen Wells im Bereich von 0,02 bis 1 ,5 liegen, wobei nicht alle Wells befüllt werden müssen; und/oder
Befüllen der Wells in der Mikrotiterplatte mit wässrigen Pufferlösungen, die unterschiedliche Salzkonzentrationen aufweisen, wobei die Abstände der Konzentrationen in den einzelnen Wells im Bereich von 0,5 bis 500 mMol/L liegen, wobei nicht alle Wells befüllt werden müssen; oder Befüllen der Wells in der Mikrotiterplatte mit wässrigen Pufferlösungen, die unterschiedliche pH-Werte und Salzkonzentrationen aufweisen, wobei die Abstände der pH-Werte in den einzelnen Wells im Bereich von 0,02 bis
1 ,5 liegen und die Abstände der Salzkonzentration im Bereich von 0,5 bis 500 mMol/L liegen, wobei nicht alle Wells befüllt werden müssen; und optional Entfernung des Wassers aus den Wells.
6. Verfahren nach Anspruch 5, bei dem die Puffer mit unterschiedlichen pH- Werten und/oder Salzkonzentrationen in nebeneinander oder untereinander liegende Wells eingebracht werden, so dass Reihen oder Spalten mit jeweils aufsteigendem oder absteigenden pH-Wert und/oder Salzgehalt entstehen.
7. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, unter Verwendung von Markermolekülen, die spezifisch an das Protein binden dessen Ladungsvarianten analysiert werden.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Markermoleküle mono- oder polyklonale Antikörper oder davon abgeleitete Nanobodies oder Single-Domain-Antikörper sowie Peptide und RNA- oder DNA-basierte Aptamere sind und diese ggf. gekoppelt an Fluoreszenzfarbstoffe Fluoreszenzmarker bilden.
9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die funktionalisierten Oberflächen Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode-Ionenaustauscher sind, die Markermoleküle Fluoreszenzmarker sind, und die Mikrotiterplatte wie folgt ausgestattet ist: Einige oder alle Wells der Mikrotiterplatte sind als Messkammern ausgebildet; in denen sich eine Erhebung befindet, die so geformt ist, dass ihre Grundfläche mindestens 50% der Bodenfläche einer Messkammer bzw. eines Wells einnimmt und vorzugsweise eine quadratische Grundfläche, die sich nach oben hin zumindest geringfügig verjüngt und die Form einer vierseitigen Pyramide aufweist, wobei das obere Ende der Erhebung spitz, flach oder konvex ist und vorteilhafterweise weist das obere Ende der Erhebung einen Durchmesser von weniger als 50 pm auf, so dass sich dort keine Versuchskomponenten ablagern, wobei die Höhe der Erhebung mindestens 10 % und höchstens 50 % der Höhe der Meßkammer bzw. des Wells beträgt und der Boden der Messkammer bzw. des Wells bis auf den Boden der Erhebung lichtundurchlässig ist und die Erhebung ist lichtdurchlässig ist und ein Messfenster bildet, das zur Messung der Fluoreszenzemission verwendet wird.
10. Verfahren nach Anspruch 9, das die folgenden Schritte umfasst: a. Verwendung der Mikrotiterplatte, deren Wells zumindest teilweise mit dem Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 vorbehandelt wurden; b. Zugabe von je einem Aliquot der Proteinprobe in die vorbehandelten Wells; c. Zugabe von Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi- Mode-Ionenaustauscher, die ladungsspezifisch an das Protein binden in Form von Partikeln; d. Zugabe eines oder mehrerer Fluoreszenzmarker, die so ausgewählt sind, dass sie spezifisch an das Protein binden, dessen Ladungsvarianten zu bestimmen sind; e. Mischen; f. Nach Absetzen der Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode-Ionenaustauscher, Messen der Intensität der ungebundenen Fluoreszenzmarker; g. Korrelieren der Messung mit dem in den Wells vorliegenden pH-Werten und/oder Salzgehalten, um die verschiedenen Ladungsvarianten des Proteins zu bestimmen.
11 . Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, worin die funktionalisierten Oberflächen Biosensoren sind, die in der Lage sind als Anionen- und Kationenaustauscher oder als Mixed-Mode- oder Multi-Mode- Ionenaustauscher zu wirken; und ggf. Markermoleküle vorhanden sind, insbesondere mono- oder polyklonale Antikörper oder davon abgeleitete Nanobodies oder Single-Domain-Antikörper sowie Peptide und auf RNA- oder DNA-basierte Aptamere.
12. Verfahren nach Anspruch 11 , das die folgenden Schritte umfasst: a. Verwendung der Mikrotiterplatte, deren Wells zumindest teilweise mit dem Verfahren nach Anspruch 5 oder 6 vorbehandelt sind; b. Zugabe von je einem Aliquot der Proteinprobe in die mit Puffern mit unterschiedlichen pH-Werten und/oder Salzkonzentrationen vorbehandelten Wells; c. Einführung des Biosensors in die behandelten und mit Probe versehenen Wells der Mikrotiterplatte; d. Mischen; e. Messen des ausgelösten Signals des Biosensors; f. Korrelieren der Messung mit dem in den Wells vorliegenden pH-Wert und/oder Salzgehalt, um die verschiedenen Ladungsvarianten des Proteins zu bestimmen.
13. Mikrotiterplatte hergestellt nach einem der Verfahren gemäß Anspruch 5 oder 6 im getrockneten Zustand.
14. Mikrotiterplatte nach Anspruch 13, wobei vor Trocknung noch der folgende Verfahrensschritte durchgeführt wird, nämlich Zugabe von Anionen- oder Kationenaustauscher, Mixed-Mode- oder Multi-Mode-Ionenaustauscher in Form von Partikeln.
15. Kit enthaltend die Mikrotiterplatten nach Anspruch 13 oder 14 und ein Markermolekül.
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US5804453A (en) 1996-02-09 1998-09-08 Duan-Jun Chen Fiber optic direct-sensing bioprobe using a phase-tracking approach
WO2008033535A2 (en) 2006-09-14 2008-03-20 Fortebio, Inc. Amine-reactive biosensor
EP2017612A1 (de) 2007-07-20 2009-01-21 Genetel Pharmaceuticals Limited Piezoelektrischer Biosensor und Biosensoren-Array zur parallelen Erkennung mehrerer Biomarker
WO2015132840A1 (ja) 2014-03-03 2015-09-11 株式会社日立製作所 ひずみセンサモジュールまたはひずみ計測システム
US10914732B2 (en) * 2014-03-10 2021-02-09 Paia Biotech Gmbh Method and device for determining biological analytes

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