EP4665859A1 - Glykierung von aminobenzoesäure zur verbesserung der effizienz mikrobieller verfahren - Google Patents

Glykierung von aminobenzoesäure zur verbesserung der effizienz mikrobieller verfahren

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EP4665859A1
EP4665859A1 EP24703827.6A EP24703827A EP4665859A1 EP 4665859 A1 EP4665859 A1 EP 4665859A1 EP 24703827 A EP24703827 A EP 24703827A EP 4665859 A1 EP4665859 A1 EP 4665859A1
Authority
EP
European Patent Office
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oab
cells
aqueous composition
total amount
pab
Prior art date
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Pending
Application number
EP24703827.6A
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English (en)
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Inventor
Dirk KREYENSCHULTE
Lena SCHAFFERT
Melanie PRINZ
Wolf KLOECKNER
Frederik Walter
Cedric DAVOUDI
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Covestro Deutschland AG
Original Assignee
Covestro Deutschland AG
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Filing date
Publication date
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Publication of EP4665859A1 publication Critical patent/EP4665859A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/04—Alpha- or beta- amino acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P13/00—Preparation of nitrogen-containing organic compounds
    • C12P13/005—Amino acids other than alpha- or beta amino acids, e.g. gamma amino acids
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
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    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
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    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/185—Escherichia
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/38—Pseudomonas

Definitions

  • the present invention is based on the discovery that glycated aminobenzoic acid (AB) is significantly less toxic to microbial cells than free AB. Therefore, fermentation media and processes are described that enable glycation of AB and thus increase the efficiency of microbial processes in which AB is present or produced in the medium.
  • AB glycated aminobenzoic acid
  • ortho-aminobenzoic acid (oAB) by microbial fermentations is well known in the art (e.g. Balderas-Hernandez et al. (2009) “Metabolic engineering for improving anthranilate synthesis from glucose in Escherichia coli", Microbial Cell Factories 8: 19, WO 2015/124687 and WO 2017/102853).
  • the fermentative production of para-aminobenzoic acid (pAB) has also been described (Kubota et al. (2016) “Production of para-aminobenzoate by genetically engineered Corynebacterium glutamicum and non-biological formation of an /V-glucosyl byproduct", Metab. Eng. 38: 322-330). In this study, it was also observed that pAB was glycated in the presence of glucose. Since the study aimed at an efficient process for the fermentative production of pAB, the formation of this compound was considered undesirable.
  • the present invention relates to an aqueous composition containing a total amount of aminobenzoic acid (AB) of at least 40 g/l, wherein at least 2 g/l of this total amount is present as glycated AB (gly-AB).
  • AB aminobenzoic acid
  • At least 7.5%, more preferably at least 15%, and most preferably at least 20% of the total amount of AB is present as glycated AB.
  • aqueous composition refers to a mixture containing the above-mentioned components with water as a solvent.
  • the presence of organic solvents is preferably limited to at most 5% by weight, more preferably at most 2% by weight, even more preferably at most 1% by weight and most preferably at most 0.5% by weight, in each case based on the total amount of all solvents.
  • the water content based on the total amount of all solvents is at least 95% by weight, more preferably at least 98% by weight, even more preferably at least 99% by weight and most preferably at least 99.5% by weight.
  • the aqueous composition is preferably a nutrient medium that enables metabolic activity of the prokaryotic cells optionally present therein. Therefore, in a preferred embodiment of the present invention, the aqueous composition contains sources of inorganic nutrients that can be used by the prokaryotic cells used, in particular nitrogen, sulfur and phosphorus, as well as the trace elements they require. Depending on the type of prokaryotic cells, the addition of vitamins and/or complex media components such as peptone or yeast extract can be useful. These complex media components can also serve as nitrogen, sulfur and/or phosphorus sources at the same time. The terms "nitrogen source”, “sulfur source” and “phosphorus source” therefore do not necessarily refer to separate chemical compounds, but can also characterize different functions of a compound.
  • the aqueous composition preferably contains at least one fermentable substrate that the prokaryotic cells in question can use as an energy and carbon source.
  • the fermentable substrate is one of the reducing sugars defined further below in this application, in particular a sugar selected from the group consisting of glucose, fructose, mannose, galactose, maltose, lactose and sucrose.
  • aminobenzoic acid (AB) is known to those skilled in the art. It refers to a derivative of benzoic acid which is characterized by the presence of an amino group bonded to the phenyl ring.
  • aminobenzoic acid includes the two known structural isomers which differ in the position of the amino group relative to the carboxyl group: ortho-aminobenzoic acid (oAB) and para-aminobenzoic acid (pAB). If one of the two isomers is specifically meant in this application, it is referred to using one of the aforementioned terms.
  • the aforementioned compounds are molecules which can be positively charged by protonation of the amino group, negatively charged by deprotonation of the amino group and have a neutral overall charge at the isoelectric point. Unless otherwise indicated in individual cases, the terms AB, oAB and pAB refer to molecules of all charge states.
  • the terms “free AB”, “free oAB” and “free pAB” are used when it is intended to indicate that these are present without chemical modification, in particular not glycated. Conversely, the terms “total AB”, “total oAB” and “total pAB” each refer to the sum of the molecules present with the corresponding basic structure, regardless of whether they are chemically modified by glycation or not.
  • glycosation refers to the covalent bonding of a sugar to the amino group of the AB. This occurs preferably by reaction of the aldehyde function of a reducing sugar with the amino group, whereby water is split off. This reaction can be enzyme-catalyzed and take place purely chemically without the involvement of enzymes. The reaction is in aqueous solution reversible and pH-dependent, so that the resulting glycated AB, oAB or pAB can be split back into the starting materials by hydrolysis. Glycated AB then becomes free AB and the sugar bound during glycation.
  • the aqueous composition contains at least one reducing sugar.
  • the molar ratio of the total amount of aldehyde groups of the reducing sugar to total AB is at least 0.3:1.0, preferably at least 0.4:1 and even more preferably at least 0.5:1.
  • the total sugar or the total quantity indicates the sum of the reducing sugar present freely in the aqueous composition and bound to AB through glycation.
  • free reducing sugar we mean the proportion of sugar that is not bound to AB and is present freely in the composition.
  • reducing sugar refers to all sugars that have an aldehyde function and are therefore able to glycate free AB.
  • both simple sugars and polyvalent sugars can be used as long as they have an aldehyde function.
  • Preferred simple sugars are glucose, fructose, xylose, arabinose, mannose and galactose.
  • Preferred polyvalent sugars are maltose, lactose, sucrose and cellobiose.
  • Particularly preferred reducing sugars are glucose, xylose, arabinose and cellobiose. Glucose is particularly preferred.
  • Reducing sugars that cannot be used by Corynebacterium as an energy or carbon source or to form a target product are xylose and cellobiose.
  • the aqueous composition contains prokaryotic cells.
  • the aqueous composition contains a total amount of aminobenzoic acid (AB) of at least 40 g/l and several cells of the genus Corynebacterium.
  • AB aminobenzoic acid
  • the aqueous composition contains a total amount of aminobenzoic acid (AB) of at least 5 g/l and several cells of the genus Escherichia or Pseudomonas.
  • the cell density of prokaryotic cells is preferably at least 10 4 cells per ml.
  • the prokaryotic cells are present in a density of 2 g to 70 g dry mass per liter, more preferably between 10 g and 30 g dry mass per liter.
  • prokaryotic cells present in the aqueous composition in a preferred embodiment of the present invention they are capable of converting a fermentable substrate to AB, particularly preferably to oAB.
  • Cells that have this ability are preferably characterized by the physiological modification (i) defined below compared to the wild type.
  • the cell is additionally characterized by at least one of the modifications (iii), (iv) and (v).
  • the cell is additionally characterized by a reduced activity of the phosphoenolpyruvate carboxylase as defined in (ii).
  • These cells can be all prokaryotic cells suitable according to the invention, since the shikimate pathway used here is phylogenetically highly conserved. However, they are preferably cells of the genus Corynebacterium, preferably Corynebacterium glutamicum and particularly preferably Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
  • the residual activity is preferably between 10% and 60%, more preferably between 20% and 50% of the activity natively present in the respective wild type.
  • This is preferably achieved by a reduced expression of the gene for the anthranilate phosphoribosyltransferase (trpD) compared to the wild type, but the expression is not completely prevented.
  • trpD anthranilate phosphoribosyltransferase
  • This is preferably done by using a promoter sequence which has a lower transcription activity than the endogenously present promoter sequence or by modifying the distance of the ribosome binding site to the start codon of the trpD gene or by changing the start codon itself.
  • the activity of the anthranilate phosphoribosyltransferase is reduced by deleting or inactivating the gene for the endogenous anthranilate phosphoribosyltransferase (trpD) and replacing this gene with a gene for an anthranilate phosphoribosyltransferase with a modified ribosomal binding site and optionally a modified start codon as defined in SEQ ID NO. 1 or 2, preferably SEQ ID NO. 2.
  • the amino acid sequence of the anthranilate phosphoribosyltransferase preferably corresponds to the endogenous anthranilate phosphoribosyltransferase, particularly preferably it is defined by SEQ ID NO. 3 or a variant thereof.
  • (iii) Increased activity of the shikimate kinase This is preferably achieved by increased expression of a corresponding enzyme.
  • the increase in activity is achieved by increased expression of the gene for the endogenously present shikimate kinase as defined in SEQ ID NO. 6 or a variant thereof.
  • this is achieved by expression of an exogenous shikimate kinase, preferably as defined in SEQ ID NO. 7 or a variant thereof.
  • Increased expression of a gene can be achieved by all methods known to the person skilled in the art, in particular by introducing multiple copies of the corresponding gene into the microorganism or by using stronger promoters to express the endogenously present enzyme.
  • a particularly preferred promoter for the expression of foreign genes or the increased expression of endogenous genes is ptuf as defined in SEQ ID NO. 8.
  • the prokaryotic cell defined above is additionally characterized by increased activity of xylose isomerase and xylulokinase.
  • This increased activity preferably occurs through increased expression of the two genes.
  • This increased expression can occur by all methods known to the person skilled in the art, in particular by introducing several copies of the corresponding gene into the microorganism or by using stronger promoters to express the endogenously present enzyme.
  • increased expression of enzymes with amino acid sequences as defined in SEQ ID NO. 12 or SEQ ID NO. 14 or variants thereof is preferred.
  • variant means an enzyme that is obtained by adding, deleting or exchanging up to 10%, preferably up to 5%, of the amino acids contained in the respective enzyme. In principle, the aforementioned modifications can be made continuously or discontinuously at any point on the enzyme.
  • substitutions of amino acids are preferably conservative substitutions, i.e. those in which the modified amino acid has a residue with similar chemical properties to the amino acid present in the unchanged enzyme. It is therefore particularly preferable to exchange amino acids with basic residues for those with basic residues, amino acids with acidic residues for those with acidic residues, amino acids with polar residues for those with polar residues and amino acids with non-polar residues for those with non-polar residues.
  • the specific enzyme activity of a variant is preferably at least 80% of the specific activity of the unchanged enzyme. Enzyme tests to detect the activity of the aforementioned enzymes can be found in the literature by those skilled in the art.
  • variant means an enzyme which is obtained by adding, deleting or exchanging up to 5%, preferably up to 2%, of the amino acids contained in the respective enzyme, with the proviso that positions 76 and 211 remain unchanged. It is further preferred that positions 10, 13, 147, 148, 150, 151, 179, 209, 211 and 212 also remain unchanged. In a more preferred embodiment of the present invention, positions 144, 175 and 215 are also unchanged in the variant. In an even more preferred embodiment of the present invention, in addition to the aforementioned positions, positions 92, 97, 165, 186 and 268 are also unchanged.
  • substitutions of amino acids are preferably conservative substitutions, i.e. those in which the modified amino acid has a residue with similar chemical properties to the amino acid present in the unchanged enzyme.
  • amino acids with basic residues are particularly preferably replaced with those with basic residues, amino acids with acidic residues with those with acidic residues, amino acids with polar residues with those with polar residues and amino acids with nonpolar exchanged for those with non-polar residues.
  • the variant of the DAHP synthase also has a corresponding enzyme activity.
  • the specific enzyme activity of the variant is particularly preferably at least 80% of the specific activity of the unchanged DAHP synthase according to SEQ. ID NO. 11.
  • the prokaryotic cells present in the aqueous composition are metabolically active.
  • metabolic activity refers to a state of the prokaryotic cells in which they absorb a fermentable substrate and biochemically convert it to maintain their vital functions.
  • the metabolic activity is defined by growth, either as an increase in the number of cells or as an increase in the dry biomass of the aqueous composition. If the volume of the aqueous composition remains constant, this means an increase in the cell density or the dry biomass per unit volume. If the volume increases, in particular by adding fresh substrate solution, or if the aqueous composition is partially replaced, these changes must be taken into account when calculating the number of cells or the dry biomass.
  • the number of cells or the dry biomass are preferably determined by changing the light absorption of the culture medium at a wavelength of 600 nm or by determining the backscatter. The latter is preferably carried out at a wavelength of 620 nm.
  • the conversion factor between the dry biomass or cell density and absorption can be determined by methods familiar to the person skilled in the art.
  • the metabolic activity is defined by the consumption of the at least one fermentable substrate in the aqueous composition.
  • the metabolic activity is defined as the production of aminobenzoic acid.
  • toxicity of AB refers to the adverse effect that aminobenzoic acid has on the metabolic activity of prokaryotic cells above a certain concentration. Above a certain threshold, which depends on the organism used and also on the media components used (see WO 2019/073035 and WO 2019/073033), the activity of the prokaryotic cells is increasingly inhibited by increasing AB concentrations. In extreme cases, this leads to the death of the cells.
  • the specific toxicity of glycated AB is lower than the specific toxicity of free AB, i.e. a given molar concentration of free AB in the nutrient medium inhibits the metabolic activity of a prokaryotic cell more than the same molar concentration of glycated AB. It has therefore proven advantageous to create conditions in a nutrient medium that promote glycation of free AB. Due to the influence of other media components on the toxicity of AB, this comparison is preferably carried out with media that differ only in the concentrations of free and glycated AB and, in particular, otherwise have the same concentrations of sodium and ammonium ions.
  • the present application relates to the use of the aqueous composition defined above for the cultivation of prokaryotic cells.
  • cultivation when referring to prokaryotic cells means incubation in an aqueous composition, in particular in a nutrient medium suitable for the cells in question, under conditions which enable metabolic activity of the cells.
  • aqueous composition contains all the components required by the cells, that the pH is kept in a range acceptable for the respective cells, and that the temperature is kept in an acceptable range, preferably between 20 °C and 40 °C.
  • the present invention relates to the use of reducing sugars in concentrations of at least 10 g/l, preferably at least 20 g/l, and more preferably at least 30 g/l total sugars to reduce the toxicity of AB.
  • the present invention relates to a method for reducing the toxicity of AB, comprising the step of contacting free AB in aqueous solution with a reducing sugar.
  • the molar ratio of the total amount of aldehyde groups of the reducing sugar to total AB is at least 0.3:1.0, preferably at least 0.4:1 and even more preferably at least 0.5:1.
  • the contacting can be carried out in any way known to the person skilled in the art.
  • the sugar is dissolved in the aqueous solution, particularly preferably in a nutrient medium.
  • the nutrient medium preferably contains prokaryotic cells which convert a fermentable substrate contained in the nutrient medium into AB.
  • the AB formed by the prokaryotic cells is excreted by the cells and then comes into direct contact with the reducing sugar already present in solution.
  • the present invention relates to a method for culturing prokaryotic cells in the presence of AB and at least one reducing sugar, wherein a) the cells are those of the genus Corynebacterium and the total amount of aminobenzoic acid (AB) is at least 40 g/l; or b) the cells are those of the genus Escherichia or Pseudomonas and the total amount of aminobenzoic acid (AB) is at least 5 g/l; and the molar ratio of the total amount of aldehyde groups of the reducing sugar to total AB is at least 0.3:1.0.
  • the prokaryotic cell is preferably a cell that is able to convert a fermentable substrate to AB. It is particularly preferably able to use the reducing sugar used as a fermentable substrate for this purpose. Therefore, it is preferably a Cultivation process in which prokaryotic cells produce AB, i.e. a production process for AB by microbial fermentation.
  • the incubation of microbial cells in a medium in which part of the AB present is glycated can reduce the toxicity of the AB.
  • This is relevant for all microbial processes in which AB is present in the medium. This primarily concerns processes for the production of oAB or pAB by microbial fermentation. In such processes, AB accumulates as intended and it is advantageous for the efficiency of such processes if the fermentation can be carried out for as long as possible, i.e. until the highest possible AB concentrations are reached, without impairing the activity of the cells.
  • the reduction of the toxicity of AB through glycation is also active for processes in which no AB is produced, but the microorganisms still come into contact with it.
  • the present invention offers advantages whenever microbial cells come into contact with AB and a reduction in their metabolic activity or viability is undesirable.
  • Table 1 shows the proportion of gly-oAB in the total amount of oAB used after 75 h for the different batches. Depending on the initial glucose and oAB concentration, approximately 8.8 - 87.3% of the total oAB present is present as glycated molecules at equilibrium.
  • Table 1 Proportion of gly-oAB in the total amount of oAB used after 75 h for different starting concentrations of glucose and oAB.
  • Table 2 shows the proportion of gly-pAB in the total amount of pAB used after 75 hours for the different batches. Depending on the initial glucose and pAB concentration, approximately 7.8 - 83.3% of the total pAB present is present as a glycated molecule at equilibrium.
  • Table 2 Proportion of gly-pAB in the total amount of pAB used after 75 h for different starting concentrations of glucose and pAB.
  • Example 3 Determination of gly-oAB and gly-pAB by acidic reverse reaction
  • glycated aminobenzoic acid Due to the metabolism of glucose in fermentation processes, glycated aminobenzoic acid cannot be quantified via a decrease in glucose concentration, as this decrease can also be due to glucose consumption.
  • a reverse reaction of gly-oAB or gly-pAB to free glucose and aminobenzoic acid is possible. This enables quantification of gly-oAB or gly-pAB via the free glucose concentration present before and after the reverse reaction, provided that the reverse reaction is almost complete.
  • Table 3 shows the percentage of free glucose measured after acidic reverse reaction based on the glucose concentration initially used for the reverse reaction of gly-pAB. Regardless of the glucose and pAB concentrations used, more than 95.4% of the glucose present can be recovered after acid treatment.
  • Table 3 Reverse reaction of gly-pAB under acidic conditions
  • Table 4 shows the percentage of free glucose measured after acidic back reaction based on the glucose concentration used at the beginning for the back reaction of gly-oAB. As the oAB concentration increases or decreases, the proportion of glucose present that can be recovered after acid treatment decreases. However, at glucose concentrations of 30 g/L or more and oAB concentrations up to 75 g/L, more than 88.2% of the glucose present can be recovered. The acidic back reaction can therefore be used to quantify gly-pAB and, with restrictions, gly-oAB.
  • Example 4 Demonstration of reduced toxicity of glycated oAB or pAB to microorganisms
  • the micro-cultivation system BioLector Pro from m2p-labs (Aachen, Germany) was used, which allows 48 parallel cultivations in one microtiter plate.
  • the bacterial strains were cultivated in an initial 800 pL and a final 1500 pL medium in 48-well flower plates of the type BOH2 (m2p-labs, Aachen, Germany) at 1000 rpm (shaking deflection 3 mm).
  • the plates used contain immobilized indicator substances (optodes), which enable online measurement of the pH value and the oxygen partial pressure pÜ2 in each well. Growth was monitored for all cultivations at 620 nm by measuring the Scattered light signal was observed (gain set to 3).
  • the parallel cultivation system from m2p-labs is known and suitable for the cultivation of bacterial strains.
  • the cultivation temperature and media used depend on the bacterial strain being investigated and are listed in Table 5 along with other cultivation parameters.
  • the bacterial wild-type strains Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Escherichia coli K12 and Pseudomonas putida DSM 6125 were selected for the examples.
  • C. glutamicum CG Xll minimal medium is used in the main cultivation, and for E. coli and P. putida, LB complex medium (Miller's LB broth (L3522, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)) is used, which are typically used for the cultivation of this and related species.
  • Table 5 Pre-culture management, media used and cultivation parameters of the examples shown below.
  • main culture media with different concentrations of oAB and gly-oAB or pAB and gly-pAB were added after an initial growth phase (hereinafter referred to as spike).
  • the preparation of main culture media with gly-oAB or gly-pAB form was based on the kinetics in examples 1 and 2 and was carried out for 70 h with stirring. Media without AB were added as a reference (hereinafter referred to as reference spikes).
  • Tables 7 (oAB) and 8 (pAB) provide an overview of the experimental approaches.
  • the amount refers to a single cultivation well of the microtiter plate. While 800 pL of inoculated medium were used at the beginning of the cultivation, a total of 700 pL of solutions were added to each well after the growth phase.
  • the resulting AB concentration after addition of Sp/ke and the increase in the glucose concentration in the well due to the spike are given.
  • the composition and preparation of the solutions used are also described in Table 6.
  • Table 7 Overview of experimental approaches to investigate the toxicity of oAB or gly-oAB
  • Table 8 Overview of experimental approaches to investigate the toxicity of pAB or gly-pAB
  • Example 4.1 Toxicity of gly-oAB versus free oAB for Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
  • the strain Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 was cultivated in 800 pL minimal medium CG XII in the micro-cultivation system BioLector Pro from m2p-labs as described above. After 7.2 h, different concentrations of oAB or gly-oAB were added. All approaches and references were carried out in triplicates (Table 7: Example 4.1).
  • the toxicity of oAB or gly-oAB was investigated based on growth in comparison to 2 controls without oAB/gly-oAB-Sp/ke (reference 1 and reference 2). For this purpose, the slope of the scattered light signal was analyzed in the first 10 hours after the spike (Table 9). Both oAB and gly-oAB lead to a delay in growth. At the same concentration of oAB in the oAB or gly-oAB spike, however, a lower toxicity of gly-oAB compared to free oAB is evident at all concentrations based on a higher slope in the scattered light signal.
  • Table 9 Slope of the scattered light signal of a cultivation of the strain C. glutamicum ATCC 13032 in the first 10 h after spike with oAB, gly-oAB or a mixture of medium and glucose solution (reference).
  • Example 4.2 Toxicity of gly-oAB versus free oAB for Escherichia coli K12 and Pseudomonas putida DSM 6125
  • the strains Escherichia coli K12 and Pseudomonas putida DSM 6125 were cultivated in 800 pL LB medium in the micro-cultivation system BioLector Pro from m2p-labs as described above. After 4 h (E. coli) or 7 h (P. putida), different concentrations of oAB or gly-oAB were added. All approaches and references were carried out in triplicates (Table 7: Example 4.2). Tables 10 and 11 show the slope of the scattered light signal in the first 2 hours after the spike for E. coli and in the first 10 hours for P. putida.
  • both oAB and gly-oAB have a growth-inhibiting/toxic effect compared to the references.
  • E. coli at the lowest oAB concentration (5 g/L), the growth losses of oAB and gly-oAB are similar.
  • oAB concentration of oAB
  • gly-oAB a lower toxicity of gly-oAB compared to free oAB is evident from the higher slope in the scattered light signal.
  • P. putida even at the lowest concentration (5 g/L), a lower toxicity of gly-oAB compared to free oAB is evident from the slope of the scattered light signal.
  • Table 10 Slope of the scattered light signal of a cultivation of the strain Escherichia coli K12 in the first 2 h after spiking with oAB, gly-oAB or a mixture of medium and glucose solution (reference).
  • Table 11 Slope of the scattered light signal of a cultivation of the strain Pseudomonas putida DSM 6125 in the first 10 h after spike with oAB, gly-oAB or a mixture of medium and glucose solution (reference). 15 g/L oAB (gly-oAB) -0.12
  • Example 4.3 Toxicity of gly-pAB versus free pAB for Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Escherichia coli K12 and Pseudomonas putida DSM 6125
  • Table 12 Slope of the scattered light signal of a culture of the strain Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in the first 4.7 h after spiking with pAB, gly-pAB or a mixture of medium and glucose solution (reference).
  • Table 13 Slope of the scattered light signal of a culture of the Escherichia coli K12 strain in the first 4 h after spiking with pAB, gly-pAB or a mixture of medium and glucose solution (reference).
  • pAB gly-pAB
  • a mixture of medium and glucose solution reference.
  • P. putida DSM 6125 no difference between pAB and gly-pAB is observed after 5 h when 5 and 10 g/L pAB are added.
  • the lower toxic effect of the glycated form is evident from the higher slope of the scattered light signal compared to the pAB-Sp/ke.
  • Table 14 Slope of the scattered light signal of a culture of the strain Pseudomonas putida DSM 6125 in the first 8 h after spiking with pAB, gly-pAB or a mixture of medium and glucose solution (reference).

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Abstract

Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass glykierte Aminobenzoesäure (AB) für mikrobielle Zellen deutlich weniger toxisch ist als freie AB. Deswegen werden Fermentationsmedien und Verfahren beschrieben, die eine Glykierung von AB ermöglichen und so die Effizienz mikrobieller Verfahren, bei denen AB im Medium vorliegt oder entsteht, erhöhen.

Description

Glykierung von Aminobenzoesäure zur Verbesserung der Effizienz mikrobieller Verfahren
Die vorliegende Erfindung beruht auf der Entdeckung, dass glykierte Aminobenzoesäure (AB) für mikrobielle Zellen deutlich weniger toxisch ist als freie AB. Deswegen werden Fermentationsmedien und Verfahren beschrieben, die eine Glykierung von AB ermöglichen und so die Effizienz mikrobieller Verfahren, bei denen AB im Medium vorliegt oder entsteht, erhöhen.
Die Herstellung von ortho-Aminobenzoesäure (oAB) durch mikrobielle Fermentationen ist aus dem Stand der Technik gut bekannt (z.B. Balderas-Hernandez et al. (2009) „Metabolie engineering for improving anthranilate synthesis from glucose in Escherichia coli" , Microbial Cell Factories 8: 19, WO 2015/124687 und WO 2017/102853). Auch die fermentative Herstellung von para- Aminobenzoesäure (pAB) wurde beschrieben (Kubota et al. (2016) „Production of para- aminobenzoate by genetically engineered Corynebacterium glutamicum and non-biological formation of an /V-glucosyl byproduct", Metab. Eng. 38: 322-330). In dieser Studie wurde auch beobachtet, dass pAB in Anwesenheit von Glucose glykiert wurde. Da die Studie auf ein effizientes Verfahren zur fermentativen Herstellung von pAB abzielte, wurde die Bildung dieser Verbindung als unerwünscht betrachtet.
In den vorveröffentlichten Studien wurde festgestellt, dass pAB und oAB als Fermentationsprodukte für die produzierenden Mikroorganismen bereits in solchen Konzentrationen toxisch sein können, die im Rahmen eines ökonomisch sinnvollen Produktionsverfahrens im Fermentationsmedium erreicht werden müssen (WO 2015/124687 und Kubota, 2016). Somit ist die Wirtschaftlichkeit einer derartigen Herstellung von AB durch die erreichbaren Produktkonzentrationen - und damit die erreichbare Raum-Zeit-Ausbeute - beschränkt. Deswegen ist es wünschenswert, Wege zu finden, die eine Anwesenheit höherer AB- Konzentrationen in einem Fermentationsmedium ermöglichen, ohne dass dadurch die Stoffwechselaktivität der AB-produzierenden Mikroorganismen beeinträchtigt wird. Im Stand der Technik werden zur Verringerung der Toxizität von oAB und pAB bestimmte Zusammensetzungen der verwendeten Fermentationsmedien vorgeschlagen. Die Abwesenheit von Ammonium-Ionen (WO 2019/073035) oder die Anwesenheit von Alkali-Ionen (WO 2019/073033) kann die Empfindlichkeit von Mikroorganismen gegenüber oAB und pAB absenken. Trotzdem gibt es einen Bedarf nach weiteren Methoden zum Schutz der Mikroorganismen vor den Auswirkungen hoher AB-Konzentrationen. Averesch & Rothschild (2016, „Metabolie Engineering of Bacillus subtilis for production of para-aminobenzoic acid - unexpected importance of carbon source is an advantage for space application", Microbial Biotechnology, 12: 703-714) beschreiben ohne Angabe weiterer Details zu Konzentrationen und Randbedingungen, dass die Glykierung von pAB deren Toxizität abmildern kann. In der vorliegenden Anmeldung zugrunde liegenden Studie wurde überraschend gefunden, dass die Glykierung von AB ihre Toxizität deutlich verringern kann. Eine Glykierung von AB in wässriger Lösung erfolgt spontan, wenn reduzierender Zucker anwesend sind.
Deswegen betrifft die vorliegende Erfindung in einer ersten Ausführungsform eine wässrige Zusammensetzung enthaltend eine Gesamtmenge an Aminobenzoesäure (AB) von wenigstens 40 g/l, wobei wenigstens 2 g/l dieser Gesamtmenge als glykierte AB (gly-AB) vorliegen.
Bevorzugt liegen wenigstens 3 g/l, stärker bevorzugt wenigstens 4 g/l, noch stärker bevorzugt wenigstens 6 g/l und am stärksten bevorzugt wenigstens 8 g/l der Gesamtmenge von AB als glykierte AB vor.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegen wenigstens 7,5 % stärker bevorzugt wenigstens 15 % und am stärksten bevorzugt wenigstens 20 % der Gesamtmenge an AB als glykierte AB vor.
Wässrige Zusammensetzung
Der Begriff „wässrige Zusammensetzung" bezeichnet ein Gemisch, das die oben genannten Komponenten mit Wasser als Lösungsmittel enthält. Die Anwesenheit organischer Lösungsmittel ist bevorzugt auf höchstens 5 Gew.-%, stärker bevorzugt höchstens 2 Gew.-%, noch stärker bevorzugt höchstens 1 Gew.-% und am stärksten bevorzugt höchstens 0,5 Gew.-%, jeweils bezogen auf die Gesamtmenge aller Lösungsmittel, beschränkt. Dies bedeutet umgekehrt, dass der Wasseranteil bezogen auf die Gesamtmenge aller Lösungsmittel wenigstens 95 Gew.-%, stärker bevorzugt wenigstens 98 Gew.-%, noch stärker bevorzugt wenigstens 99 Gew.-% und am stärksten bevorzugt wenigstens 99,5 Gew.-% beträgt.
Bei der wässrigen Zusammensetzung handelt es sich bevorzugt um ein Nährmedium, das eine metabolische Aktivität der hierin optional vorliegenden prokaryotischen Zellen ermöglicht. Deswegen enthält die wässrige Zusammensetzung in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung für die verwendeten prokaryotischen Zellen verwertbare Quellen anorganischer Nährstoffe, insbesondere Stickstoff, Schwefel und Phosphor sowie die von ihnen benötigten Spurenelemente. Je nach Art der prokaryotischen Zellen kann der Zusatz von Vitaminen und/oder komplexen Medienbestandteilen wie z.B. Pepton oder Hefeextrakt sinnvoll sein. Diese komplexen Medienbestandteile können gleichzeitig auch als Stickstoff-, Schwefel- und/oder Phosphorquellen dienen. Die Begriffe „Stickstoffquelle", „Schwefelquelle" und „Phosphorquelle" bezeichnen deswegen nicht zwingend getrennte chemische Verbindungen, sondern können auch unterschiedliche Funktionen einer Verbindung kennzeichnen. Darüber hinaus enthält die wässrige Zusammensetzung vorzugsweise wenigstens ein fermentierbares Substrat, das die betreffenden prokaryotischen Zellen als Energie- und Kohlenstoffquelle nutzen können. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei dem fermentierbaren Substrat um einen der weiter unten in dieser Anmeldung definierten reduzierenden Zucker insbesondere um einen Zucker ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glucose, Fructose, Mannose, Galactose, Maltose, Lactose und Saccharose.
Besonders geeignete Nährmedien sind in den in dieser Anmeldung enthaltenen Ausführungsbeispielen beschrieben. Grundsätzlich ist der Fachmann aber in der Lage, auf Grundlage der bekannten physiologischen Anforderungen eines Mikroorganismus geeignete Nährmedien auszuwählen.
Aminobenzoesäure
Der Begriff „Aminobenzoesäure" (AB) ist dem Fachmann bekannt. Er bezeichnet ein Derivat der Benzoesäure, das durch die Anwesenheit einer am Phenylring gebundenen Aminogruppe gekennzeichnet ist. Der Begriff Aminobenzoesäure umfasst die beiden bekannten Strukturisomere, die sich durch die Stellung der Aminogruppe relativ zur Carboxylgruppe unterscheiden: ortho- Aminobenzoesäure (oAB) und para-Aminobenzoesäure (pAB). Wenn in dieser Anmeldung eines der beiden Isomere spezifisch gemeint ist, wird es mit einem der vorgenannten Begriffe bezeichnet. Bei den vorgenannten Verbindungen handelt es sich um Moleküle, die durch Protonierung der Aminogruppe positiv geladen, durch Deprotonierung der Aminogruppe negativ geladen und am isoelektrischen Punkt mit neutraler Gesamtladung vorliegen können. Soweit im Einzelfall nicht anders kenntlich gemacht bezeichnen die Begriffe AB, oAB und pAB Moleküle aller Ladungszustände.
In dieser Anmeldung werden nachfolgend die Begriffe „freie AB", „freie oAB" und „freie pAB" verwendet, wenn kenntlich gemacht werden soll, dass diese ohne chemische Modifikation, insbesondere nicht glykiert, vorliegen. Umgekehrt bezeichnen die Begriffe „Gesamt-AB", „Gesamt- oAB" und „Gesamt-pAB" jeweils die Summe der vorliegende Moleküle mit der entsprechenden Grundstruktur unabhängig davon, ob sie chemisch durch eine Glykierung modifiziert sind oder nicht.
Glykierte AB
Der Begriff „Glykierung" bezeichnet die kovalente Bindung eines Zuckers an die Aminogruppe der AB. Dies geschieht vorzugsweise durch Reaktion der Aldehydfunktion eines reduzierenden Zuckers mit der Aminogruppe, wobei Wasser abgespalten wird. Diese Reaktion kann enzymkatalysiert und ohne Beteiligung von Enzymen rein chemisch stattfinden. Die Reaktion ist in wässriger Lösung reversibel und pH-abhängig, so dass die entstandene glykierte AB, oAB oder pAB durch Hydrolyse wieder in die Ausgangsstoffe gespalten werden kann. Aus glykierter AB entstehen dann wieder freie AB und der bei der Glykierung gebundene Zucker.
Reduzierender Zucker
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält die wässrige Zusammensetzung wenigstens einen reduzierenden Zucker. Das molare Verhältnis der Gesamtmenge der Aldehydgruppen des reduzierenden Zuckers zu Gesamt-AB beträgt dabei wenigstens 0,3 : 1,0, bevorzugt wenigstens 0,4 : 1 und noch stärker bevorzugt wenigstens 0,5 : 1.
Da der reduzierende Zucker durch die Glykierung an die AB gebunden wird, muss auch bei der Angabe der Zuckermengen oder -Konzentrationen zwischen dem Gesamtzucker und dem freien Zucker differenziert werden. Der Gesamtzucker bzw. die Gesamtmenge gibt die Summe von frei in der wässrigen Zusammensetzung vorliegendem und durch Glykierung an AB gebundenem reduzierendem Zucker an. Wenn hingegen von „freiem reduzierenden Zucker" die Rede ist, so ist der Anteil des Zuckers gemeint, der nicht an AB gebunden ist und frei in der Zusammensetzung vorliegt.
Der Begriff „reduzierender Zucker" bezeichnet alle Zucker, die über eine Aldehydfunktion verfügen und deswegen in der Lage sind, freie AB zu glykieren. Erfindungsgemäß können sowohl Einfachzucker, als auch mehrwertige Zucker eingesetzt werden, solange sie über eine Aldehydfunktion verfügen. Bevorzugte Einfachzucker sind Glucose, Fructose, Xylose, Arabinose, Mannose und Galactose. Bevorzugte mehrwertige Zucker sind Maltose, Lactose, Saccharose und Cellobiose. Besonders bevorzugte reduzierende Zucker sind Glucose, Xylose, Arabinose und Cellobiose. Ganz besonders bevorzugt ist Glucose. Reduzierende Zucker, die von Corynebacterium nicht als energie- oder Kohlenstoffquelle oder zur Bildung eines Zielprodukts verwendet werden können sind Xylose und Cellobiose.
Prokaryotische Zellen
Die wässrige Zusammensetzung enthält prokaryotische Zellen.
In einer Ausführungsform enthält die wässrige Zusammensetzung eine Gesamtmenge Aminobenzoesäure (AB) von wenigstens 40 g/l und mehrere Zellen des Genus Corynebacterium.
In einer alternativen Ausführungsform enthält die wässrige Zusammensetzung eine Gesamtmenge Aminobenzoesäure (AB) von wenigstens 5 g/l und mehrere Zellen des Genus Escherichia oder Pseudomonas. Die Zelldichte an prokaryotischen Zellen beträgt vorzugsweise wenigstens 104 Zellen pro ml. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform liegen die prokaryotischen Zellen in einer Dichte von 2 g bis 70 g Trockenmasse pro Liter vor, stärker bevorzugt zwischen 10 g und 30 g Trockenmasse pro Liter.
Unabhängig von der Art der in der wässrigen Zusammensetzung vorliegenden prokaryotischen Zellen sind diese in einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung fähig, ein fermentierbares Substrat zu AB, besonders bevorzugt zu oAB, umzusetzen.
Zellen die über diese Fähigkeit verfügen, sind vorzugsweise durch die nachfolgend definierte physiologische Modifikation (i) gegenüber dem Wildtyp gekennzeichnet. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die Zelle zusätzlich durch wenigstens eine der Modifikationen (iii), (iv) und (v) gekennzeichnet. Eine reduzierte Aktivität der Phosphoenolpyruvat Carboxylase wie in (ii) definiert charakterisiert die Zelle in einer besonders bevorzugten Ausführungsform zusätzlich. Bei diesen Zellen kann es sich um alle erfindungsgemäß geeigneten prokaryotischen Zellen handeln, da der Shikimat-Weg, der hier genutzt wird, phylogenetisch stark konserviert ist. Bevorzugt handelt es sich aber um Zellen des Genus Corynebacterium, bevorzugt Corynebacterium glutamicum und besonders bevorzugt Corynebacterium glutamicum ATCC 13032.
(i) Eine gegenüber dem jeweiligen Wildtyp reduzierte Aktivität der Anthranilat- Phosphoribosyltransferase, wobei aber eine Restaktivät vorhanden sein muss. Die Restaktivität liegt vorzugsweise zwischen 10 % und 60 %, stärker bevorzugt zwischen 20 % und 50 % der im jeweiligen Wildtyp nativ vorhandenen Aktivität. Dies wird vorzugsweise durch eine gegenüber dem Wildtyp reduzierte Expression des Gens für die Anthranilat- Phosphoribosyltransferase (trpD) erreicht, wobei die Expression aber nicht vollständig unterbunden ist. Dies erfolgt bevorzugt durch Einsatz einer Promotorsequenz, die gegenüber der endogen vorhandenen Promotorsequenz eine geringere Transkriptionsaktivität aufweist oder durch eine Modifikation des Abstands der Ribosomenbindestelle zum Start -Codon des trpD-Gens oder durch eine Veränderung des Start-Codons selbst. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Reduzierung der Aktivität der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase durch Deletion oder Inaktivierung des Gens für die endogene Anthranilat- Phosphoribosyltransferase (trpD) und den Ersatz dieses Gens durch ein Gen für eine Anthranilat-Phosphoribosyltransferase mit einer veränderten ribosomalen Bindestelle und optional einem veränderten Start-Codon wie in SEQ ID NO. 1 oder 2, bevorzugt SEQ ID NO. 2 definiert. Die Aminosäuresequenz der Anthranilat-Phosphoribosyltransferase entspricht vorzugsweise der endogenen Anthranilat-Phosphoribosyltransferase, besonders bevorzugt wird sie durch SEQ ID NO. 3 oder eine Variante davon definiert. (ii) Deletion oder Inaktivierung des Gens, das für die Phosphoenolpyruvat-Carboxylase wie in SEQ ID NO. 4 definiert kodiert. Dies kann auf alle dem Fachmann geläufigen Weisen geschehen, vorzugsweise durch Deletion des Gens oder einer Teilsequenz davon, durch Einführung wenigstens eines Stop-Codons oder durch Deletion oder Inaktivierung der Promotorsequenz. Besonders bevorzugt ist die Deletion wenigstens eines Teils der proteinkodierenden Sequenz des Gens (SEQ. ID NO. 5).
(iii) Erhöhte Aktivität der Shikimat-Kinase. Dies erfolgt vorzugsweise durch erhöhte Expression eines entsprechenden Enzyms. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung erfolgt die Steigerung der Aktivität durch erhöhte Expression des Gens für die endogen vorhandene Shikimat-Kinase wie in SEQ ID NO. 6 definiert oder einer Variante davon. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform erfolgt dies durch Expression einer exogenen Shikimat-Kinase, bevorzugt wie in SEQ ID NO. 7 definiert oder einer Variante davon. Eine verstärkte Expression eines Genes kann durch alle dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, insbesondere durch die Einführung mehrerer Kopien des entsprechenden Gens in den Mikroorganismus oder durch die Verwendung stärkerer Promotoren zur Expression des endogen vorhandenen Enzyms. Ein besonders bevorzugter Promotor für die Expression von Fremdgenen oder die verstärkte Expression endogener Gene ist ptuf wie in SEQ ID NO. 8 definiert.
(iv) Erhöhte Aktivität der 3-Phosphoshikimat-l-carboxyvinyltransferase und Chorismat- Synthase. Bevorzugt haben diese Enzyme eine Aminosäuresequenz wie in SEQ ID NO 9 oder einer Variante davon und SEQ ID NO. 10 oder einer Variante davon definiert. Dies erfolgt bevorzugt durch die Einführung zusätzlicher Kopien der für diese Enzyme kodierenden Gene in den Mikroorganismus. Bevorzugt wird der ptuf-Promotor zur Steuerung der Expression verwendet.
(v) Anwesenheit einer 3-Desoxyarabinoheptulosanat-7-phosphat-Synthase (DAHP-Synthase), die „feedback-resistent" ist, d.h. nicht durch ihr Produkt oder durch ein aus dem Produkt entstehendes Produkt gehemmt wird. Bevorzugt ist ein Enzym mit der in SEQ ID NO. 11 definierten Aminosäuresequenz oder eine Variante davon.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die oben definierte prokaryotische Zelle zusätzlich durch erhöhte Aktivität der Xylose-Isomerase und der Xylulokinase. Diese erhöhte Aktivität erfolgt vorzugsweise durch verstärkte Expression der beiden Gene. Diese verstärkte Expression kann durch alle dem Fachmann bekannten Methoden erfolgen, insbesondere durch die Einführung mehrerer Kopien des entsprechenden Gens in den Mikroorganismus oder durch die Verwendung stärkerer Promotoren zur Expression des endogen vorhandenen Enzyms. Erfindungsgemäß bevorzugt ist eine erhöhte Expression von Enzymen mit Aminosäuresequenzen wie in SEQ ID NO. 12 bzw. SEQ ID NO. 14 definiert oder Varianten davon.
Bezogen auf die Anthranilat-Phosphoribosyltransferase (SEQ ID NO. 3), Shikimat-Kinase (SEQ ID NO. 6 oder 7), 3-Phosphoshikimat-l-carboxyvinyltransferase (SEQ ID NO. 9), Chorismat-Synthase (SEQ ID NO. 10), Xylose-Isomerase (SEQ ID NO. 12) und die Xylulokinase (SEQ ID NO. 14) bedeutet „Variante" ein Enzym, das durch Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 10 %, bevorzugt bis zu 5 %, der im jeweiligen Enzym enthaltenen Aminosäuren erhalten wird. Grundsätzlich können die vorgenannten Modifikationen an jeder beliebigen Stelle des Enzyms kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Bevorzugt erfolgen sie aber nur am N-Terminus und/oder am C- Terminus des Polypeptids. Bei Substitutionen von Aminosäuren handelt es sich vorzugsweise um konservative Substitutionen, d.h. um solche, bei denen die veränderte Aminosäure einen Rest mit ähnlichen chemischen Eigenschaften besitzt wie die im unveränderten Enzym vorliegende Aminosäure. Es werden also besonders bevorzugt Aminosäuren mit basischen Resten gegen solche mit basischen Resten, Aminosäuren mit sauren Resten gegen solche mit ebenfalls sauren Resten, Aminosäuren mit polaren Resten gegen solche mit polaren Resten und Aminosäuren mit unpolaren gegen solche mit unpolaren Resten ausgetauscht. Die spezifische Enzymaktivität einer Variante liegt vorzugsweise wenigstens bei 80 % der spezifischen Aktivität des unveränderten Enzyms. Enzymtests zum Nachweis der Aktivität der vorgenannten Enzyme kann der Fachmann der Literatur entnehmen.
Bezogen auf die DAHP-Synthase (SEQ ID NO. 11) bedeutet „Variante" ein Enzym, das durch Hinzufügung, Deletion oder Austausch von bis zu 5 %, bevorzugt bis zu 2 %, der im jeweiligen Enzym enthaltenen Aminosäuren erhalten wird, mit der Maßgabe, dass die Positionen 76 und 211 unverändert bleiben. Es ist weiterhin bevorzugt, dass zusätzlich auch die Positionen 10, 13, 147, 148, 150, 151, 179, 209, 211 und 212 unverändert bleiben. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind in der Variante zusätzlich auch die Positionen 144, 175 und 215 unverändert. In einer noch stärker bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind zusätzlich zu den vorgenannten Positionen auch die Positionen 92, 97, 165, 186 und 268 unverändert. Der Fachmann versteht, dass sich die vorgenannten Positionen entsprechend verschieben, wenn Aminosäuren deletiert oder eingefügt werden. Grundsätzlich können die vorgenannten Modifikationen an jeder beliebigen Stelle des Enzyms kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Bevorzugt erfolgen sie aber nur am N-Terminus und/oder am C- Terminus des Polypeptids. Bei Substitutionen von Aminosäuren handelt es sich vorzugsweise um konservative Substitutionen, d.h. um solche, bei denen die veränderte Aminosäure einen Rest mit ähnlichen chemischen Eigenschaften besitzt wie die im unveränderten Enzym vorliegende Aminosäure. Es werden also besonders bevorzugt Aminosäuren mit basischen Resten gegen solche mit basischen Resten, Aminosäuren mit sauren Resten gegen solche mit ebenfalls sauren Resten, Aminosäuren mit polaren Resten gegen solche mit polaren Resten und Aminosäuren mit unpolaren gegen solche mit unpolaren Resten ausgetauscht. Es ist besonders bevorzugt, dass auch die Variante der DAHP-Synthase eine entsprechende Enzymaktivität besitzt. Besonders bevorzugt liegt die spezifische Enzymaktivität der Variante bei wenigstens 80 % der spezifischen Aktivität der unveränderten DAHP-Synthase gemäß SEQ. ID NO. 11.
Metabolische Aktivität
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die in der wässrigen Zusammensetzung vorliegenden prokaryotischen Zellen metabolisch aktiv. Der Begriff „metabolische Aktivität" bezeichnet einen Zustand der prokaryotischen Zellen, in dem sie ein fermentierbares Substrat aufnehmen und zur Aufrechterhaltung ihrer Lebensfunktionen biochemisch umsetzen.
In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung wird die metabolische Aktivität durch Wachstum definiert, entweder als Zunahme der Zellmenge oder als Zunahme der Biotrockenmasse der wässrigen Zusammensetzung. Bei konstantem Volumen der wässrigen Zusammensetzung bedeutet dies Zunahme der Zelldichte bzw. der Biotrockenmasse pro Volumeneinheit. Bei steigendem Volumen, insbesondere durch Zuführung frischer Substratlösung, oder bei teilweisem Austausch der wässrigen Zusammensetzung sind diese Veränderungen bei der Berechnung von Zellmenge bzw. Biotrockenmasse zu berücksichtigen. Zellmenge bzw. Biotrockenmasse werden bevorzugt über die Veränderung der Lichtabsorption des Kulturmediums bei einer Wellenlänge von 600 nm oder durch Bestimmung der Rückstreuung bestimmt. Letzteres erfolgt vorzugsweise bei einer Wellenlänge von 620 nm. Hierbei kann der Umrechnungsfaktor zwischen Biotrockenmasse bzw. Zelldichte und Absorption durch dem Fachmann geläufige Methoden bestimmt werden. In einer stärker bevorzugten Ausführungsform wird die metabolische Aktivität durch den Verbrauch des wenigstens einen fermentierbaren Substrats in der wässrigen Zusammensetzung definiert.
Die dieser Anmeldung zugrundeliegende Studie hat gezeigt, dass die Wachstumsrate prokaryotischer Zellen in Anwesenheit einer definierten Konzentration glykierter AB um wenigstens 30 % höher ist als in Anwesenheit der gleichen Konzentration des Natriumsalzes der freien AB. Für den Effekt der erfindungsgemäßen wässrigen Zusammensetzung ist dabei zu berücksichtigen, dass die darin enthaltene AB im Regelfall nicht vollständig glykiert vorliegen wird, so dass der Effekt bei der realen Anwendung der erfindungsgemäßen Zusammensetzung auch geringer ausfallen kann.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist die metabolische Aktivität als Produktion von Aminobenzoesäure definiert. Toxizität von AB
Der Begriff „Toxizität von AB" bezeichnet den nachteiligen Einfluss, den Aminobenzoesäure ab einer bestimmten Konzentration auf die metabolische Aktivität von prokaryotischen Zellen hat. Ab einem bestimmten Schwellenwert, der vom verwendeten Organismus und auch von den verwendeten Medienbestandteilen (siehe WO 2019/073035 und WO 2019/073033) abhängt, wird die Aktivität der prokaryotischen Zellen durch steigende AB-Konzentrationen zunehmend gehemmt. Dies führt im Extremfall zum Absterben der Zellen.
In der der vorliegenden Patentanmeldung zugrundeliegenden Studie wurde nun überraschend gefunden, dass die spezifische Toxizität glykierter AB geringer ist als die spezifische Toxizität freier AB, d.h. eine gegebene molare Konzentration freier AB im Nährmedium hemmt die metabolische Aktivität einer prokaryotischen Zelle stärker als dieselbe molare Konzentration glykierter AB. Deswegen hat es sich als vorteilhaft erwiesen, in einem Nährmedium Bedingungen zu schaffen, die eine Glykierung der freien AB fördern. Aufgrund des Einflusses von anderen Medienbestandteilen auf die Toxizität von AB wird dieser Vergleich vorzugsweise mit Medien durchgeführt, die sich nur in den Konzentrationen von freier und glykierter AB unterscheiden und insbesondere ansonsten gleiche Konzentrationen von Natrium- und Ammoniumionen aufweisen.
Verwendung der wässrigen Zusammensetzung
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Anmeldung die Verwendung der oben definierten wässrigen Zusammensetzung zur Kultivierung prokaryotischer Zellen.
Alle oben für die wässrige Zusammensetzung gegebenen Definition gelten auch für diese Ausführungsform, soweit nicht explizit anders angegeben.
Der Begriff „Kultivierung", wenn er auf prokaryotische Zellen bezogen wird, bezeichnet die Inkubation in einer wässrigen Zusammensetzung, insbesondere in einem für die betreffenden Zellen geeigneten Nährmedium, unter Bedingungen, die eine metabolische Aktivität der Zellen ermöglichen. Dies setzt insbesondere voraus, dass die wässrige Zusammensetzung alle von den Zellen geforderten Bestandteile enthält, dass der pH in einem für die jeweiligen Zellen akzeptablen Bereich gehalten wird, und dass die Temperatur in einem akzeptablem Bereich, vorzugsweise zwischen 20 °C und 40 °C gehalten wird.
Verwendung reduzierender Zucker
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung reduzierender Zucker in Konzentrationen von wenigstens 10 g/l, bevorzugt wenigstens 20 g/l und stärker bevorzugt wenigstens 30 g/l Gesamtzucker zur Verminderung der Toxizität von AB. Verfahren zur Minderung der Toxizität von AB
In noch einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Verminderung der Toxizität von AB, enthaltend den Schritt des Kontaktierens freier AB in wässriger Lösung mit einem reduzierenden Zucker. Das molare Verhältnis der Gesamtmenge der Aldehydgruppen des reduzierenden Zuckers zu Gesamt-AB beträgt dabei wenigstens 0,3 : 1,0, bevorzugt wenigstens 0,4 : 1 und noch stärker bevorzugt wenigstens 0,5 : 1.
Alle weiter oben gegebenen Definitionen gelten auch für diese Ausführungsform. Die Definitionen für die wässrige Zusammensetzung gelten auch für die hier genannte wässrige Lösung.
Das Kontaktieren kann auf jede für den Fachmann bekannte Weise erfolgen. In einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung liegt der Zucker gelöst in der wässrigen Lösung, besonders bevorzugt in einem Nährmedium, vor. Das Nährmedium enthält vorzugsweise prokaryotische Zellen, die ein im Nährmedium enthaltenes fermentierbares Substrat zu AB umsetzen. Die von den prokaryotischen Zellen gebildete AB wird von den Zellen ausgeschieden und kommt dann unmittelbar in Kontakt mit dem bereits in Lösung vorliegenden reduzierenden Zucker.
Verfahren zur Kultivierung einer prokaryotischen Zelle
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Kultivierung von prokaryotischen Zellen in Anwesenheit von AB und wenigstens eines reduzierenden Zuckers, wobei a) die Zellen solche des Genus Corynebacterium sind und die Gesamtmenge Aminobenzoesäure (AB) wenigstens 40 g/l beträgt; oder b) die Zellen solche des Genus Escherichia oder Pseudomonas sind und die Gesamtmenge Aminobenzoesäure (AB) wenigstens 5 g/l beträgt; und das molare Verhältnis der Gesamtmenge der Aldehydgruppen des reduzierenden Zuckers zu Gesamt-AB wenigstens 0,3 : 1,0 beträgt.
Alle weiter oben gegebenen Definitionen gelten auch für diese Ausführungsform.
Die prokaryotische Zelle ist bevorzugt eine Zelle, die in der Lage ist, ein fermentierbares Substrat zu AB umzusetzen. Besonders bevorzugt ist sie in der Lage, den eingesetzten reduzierenden Zucker hierfür als fermentierbares Substrat zu nutzen. Deswegen handelt es sich bevorzugt um ein Kultivierungsverfahren, bei dem die prokaryotischen Zellen AB bilden, d.h. ein Herstellungsverfahren für AB durch eine mikrobielle Fermentation.
Die Inkubation von mikrobiellen Zellen in einem Medium, in dem ein Teil der dort vorliegenden AB glykiert vorliegt, kann die Toxizität der AB reduzieren. Dies ist für alle mikrobiellen Verfahren relevant, in denen AB im Medium vorliegt. In erster Linie betrifft dies Verfahren zur Herstellung von oAB oder pAB durch mikrobielle Fermentation. In solchen Verfahren reichert sich AB bestimmungsgemäß an und es ist für die Effizienz solcher Verfahren vorteilhaft, wenn die Fermentation möglichst lange, d.h. bis zum Erreichen möglichst hoher AB-Konzentrationen geführt werden kann, ohne die Aktivität der Zellen zu beeinträchtigen. Die Reduzierung der Toxizität von AB durch Glykierung ist aber auch für Verfahren aktiv, bei denen zwar keine AB produziert wird, die Mikroorganismen aber trotzdem mit ihr in Kontakt kommen. Dies sind insbesondere Verfahren, bei denen die AB nicht das gewünschte Produkt ist, sondern der Ausgangsstoff, der durch eine mikrobielle Fermentation zu einem Zielprodukt umgesetzt werden soll. Insgesamt bietet die vorliegende Erfindung immer dann Vorteile, wenn mikrobielle Zellen mit AB in Kontakt kommen und eine Verringerung ihrer Stoffwechselaktivität oder ihrer Lebensfähigkeit unerwünscht ist.
Die nachfolgenden Ausführungsbeispiele dienen nur dazu, die vorliegende Erfindung zu illustrieren. Sie sollen den Schutzbereich der Patentansprüche in keiner Weise beschränken.
Ausführungsbeispiele
Beispiel 1: Reaktion von Glucose und oAB zu gly-oAB
Durch Neutralisation mit 5 M NaOH wurden 150 g/L oAB in Wasser gelöst und auf pH 7,0 eingestellt. Separat wurden 120 g/L Glucose in Wasser gelöst und ebenfalls auf pH 7,0 eingestellt. Aus verschiedenen Anteilen dieser beiden Lösungen und Wasser wurden insgesamt 9 unterschiedliche Ansätze hergestellt mit Glucose-Konzentrationen von 10, 30 bzw. 60 g/L und oAB-Konzentrationen von 5, 40 bzw. 75 g/L. Diese Ansätze wurden in Duplikaten in 2 mL-Reaktionsgefäßen hergestellt und in einem Thermo Mixer® C (Eppendorf) bei 1000 upm und 33 °C inkubiert. Der Verlauf der Reaktion zwischen Glucose und oAB wurde durch die Bestimmung der noch vorhandenen freien Glucose via Cedex Bio Analyzer (Roche) verfolgt. Dabei entspricht eine Abnahme der gemessenen Glucose-Konzentration in mol/L der Zunahme der gly-oAB-Konzentration in mol/L. Nach ca. 75 h war keine weitere Änderung der Glucose-Konzentration erkennbar.
In Tabelle 1 ist der Anteil von gly-oAB an der insgesamt eingesetzten Menge an oAB nach 75 h für die verschiedenen Ansätze dargestellt. Je nach anfänglicher Glucose- und oAB-Konzentration liegen im Gleichgewicht ca. 8,8 - 87,3 % der insgesamt vorhandenen oAB als glykiertes Molekül vor.
Tabelle 1: Anteil von gly-oAB an der insgesamt eingesetzten Menge an oAB nach 75 h für verschiedene Startkonzentrationen an Glucose und oAB.
Beispiel 2: Reaktion von Glucose und pAB zu gly-pAB
Durch Neutralisation mit 5 M NaOH wurden 150 g/L pAB in Wasser gelöst und auf pH 7,0 eingestellt. Separat wurden 120 g/L Glucose in Wasser gelöst und ebenfalls auf pH 7,0 eingestellt. Aus verschiedenen Anteilen dieser beiden Lösungen und Wasser wurden insgesamt 9 unterschiedliche Ansätze hergestellt mit Glucose-Konzentrationen von 10, 30 bzw. 60 g/L und pAB-Konzentrationen von 5, 40 bzw. 75 g/L. Diese Ansätze wurden in Duplikaten in 2 mL-Reaktionsgefäßen hergestellt und in einem ThermoMixer® C (Eppendorf) bei 1000 upm und 33 °C inkubiert. Der Verlauf der Reaktion zwischen Glucose und pAB wurde durch die Bestimmung der noch vorhandenen freien Glucose via Cedex Bio Analyzer (Roche) verfolgt. Dabei entspricht eine Abnahme der gemessenen Glucose-Konzentration in mol/L der Zunahme der gly-pAB-Konzentration in mol/L. Nach ca. 75 h war keine weitere Änderung der Glucose-Konzentration erkennbar.
In Tabelle 2 ist der Anteil von gly-pAB an der insgesamt eingesetzten Menge an pAB nach 75 h für die verschiedenen Ansätze dargestellt. Je nach anfänglicher Glucose- und pAB-Konzentration liegen im Gleichgewicht ca. 7,8 - 83,3 % der insgesamt vorhandenen pAB als glykiertes Molekül vor.
Tabelle 2: Anteil von gly-pAB an der insgesamt eingesetzten Menge an pAB nach 75 h für verschiedene Startkonzentrationen an Glucose und pAB.
Beispiel 3: Bestimmung von gly-oAB und gly-pAB durch saure Rückreaktion
Wegen der Verstoffwechselung von Glucose in Fermentationsprozessen kann glykierte Aminobenzoesäure nicht über eine Abnahme der Glucosekonzentration quantifiziert werden, da diese Abnahme auch auf Glucoseverbrauch beruhen kann. Unter sauren Bedingungen ist jedoch eine Rückreaktion von gly-oAB oder gly-pAB zu freier Glucose und Aminobenzoesäure möglich. Dies ermöglicht eine Quantifizierung von gly-oAB bzw. gly-pAB über die vor und nach Rückreaktion vorhandene freie Glucosekonzentration, sofern die Rückreaktion annähernd vollständig abläuft.
Um dies zu testen, wurden wie in Bsp. 1 und 2 beschrieben verschiedene Glucose- Aminobenzoesäure-Mischungen für ca. 75 h inkubiert, um glykierte Aminobenzoesäure zu bilden. 200 pL des jeweiligen Ansatzes wurden dann mit 800 pL 1 M Salzsäure gemischt und bei Raumtemperatur stehen gelassen. In regelmäßigen Abständen wurde die freie Glucose via Cedex Bio Analyzer (Roche) gemessen. Nach ca. 2 h war keine weitere Änderung der Glucose- Konzentration erkennbar.
In Tabelle 3 ist der prozentuale Anteil der nach saurer Rückreaktion gemessenen freien Glucose bezogen auf die zu Beginn eingesetzte Glucose-Konzentration für die Rückreaktion von gly-pAB dargestellt. Unabhängig von den eingesetzten Glucose- und pAB-Konzentrationen können mehr als 95,4 % der vorhandenen Glucose nach Säurebehandlung wiedergefunden werden. Tabelle 3: Rückreaktion von gly-pAB unter sauren Bedingungen
In Tabelle 4 ist der prozentuale Anteil der nach saurer Rückreaktion gemessenen freien Glucose bezogen auf die zu Beginn eingesetzte Glucose-Konzentration für die Rückreaktion von gly-oAB dargestellt. Mit steigender oAB-Konzentration bzw. sinkender Glucose-Konzentration verringert sich der Anteil der vorhandenen Glucose, die nach Säurebehandlung wiedergefunden werden kann. Bei Glucose-Konzentrationen von 30 g/L oder mehr sowie oAB-Konzentrationen bis zu 75 g/L können jedoch mehr als 88,2 % der vorhandenen Glucose wiedergefunden werden. Die saure Rückreaktion kann daher zur Quantifizierung von gly-pAB und mit Einschränkungen gly-oAB genutzt werden.
Tabelle 4: Rückreaktion von gly-oAB unter sauren Bedingungen
Beispiel 4: Demonstration der reduzierten Toxizität von glykierter oAB oder pAB für Mikroorganismen
Allgemeine Hinweise zum experimentellen Design
Für die nachfolgenden Beispiele wurde das Kleinstkultivierungssystem BioLector Pro von m2p-labs (Aachen, Deutschland) verwendet, welches 48 parallele Kultivierungen in einer Mikrotiterplatte erlaubt. Die Bakterienstämme wurden in initial 800 pL und final 1500 pL Medium in 48-Well- Flowerplates vom Typ BOH2 (m2p-labs, Aachen, Deutschland) bei 1000 rpm (Schüttelauslenkung 3 mm) kultiviert. Die verwendeten Platten enthalten immobilisierte Indikatorsubstanzen (Optoden), über welche eine Online-Messung des pH-Wertes und des Sauerstoffpartialdruckes pÜ2 in jedem Well ermöglicht wird. Das Wachstum wurde für alle Kultivierungen bei 620 nm durch Messung des Streulicht-Signals beobachtet (eingestellter „gain" von 3). Das Parallelkultivierungssystem von m2p- labs ist für die Kultivierung von Bakterienstämmen bekannt und geeignet.
Die Kultivierungstemperatur und verwendeten Medien richten sich nach dem untersuchten Bakterienstamm und werden in Tabelle 5 neben weiteren Kultivierungsparametern näher aufgeführt. Für die Beispiele wurden die bakteriellen Wildtypstämme Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Escherichia coli K12 und Pseudomonas putida DSM 6125 ausgewählt. Für C. glutamicum wird in der Hauptkultivierung CG Xll-Minimalmedium, für E. coli und P. putida LB- Komplex-Medium (Miller's LB-Bouillon (L3522, Sigma-Aldrich, St. Louis, USA)) eingesetzt, welche typischerweise für die Kultivierungen dieser und gattungsverwandter Spezies verwendet werden.
Die genauen Medienzusammensetzungen mit Anpassungen sind in Tabelle 6 näher beschrieben.
Tabelle 5: Vorkulturführung, verwendete Medien sowie Kultivierungsparameter der nachfolgend gezeigten Beispiele.
Tabelle 6: Medienzusammensetzung und Stammlösungen
Um die toxischen Effekte von freier oAB bzw. freier pAB im Vergleich zu der glykierten Form gly- oAB bzw. gly-pAB zu bestimmen, wurden nach einer initialen Anwuchsphase weitere Hauptkulturmedien mit unterschiedlicher Konzentration an oAB und gly-oAB bzw. pAB und gly-pAB zugegeben (im Folgenden Spike genannt). Die Herstellung von Hauptkulturmedium mit gly-oAB bzw. gly-pAB-Form richtete sich nach der Kinetik in Beispiel 1 und 2 und erfolgte für 70 h unter Rühren. Als Referenz wurden Medien ohne AB zugesetzt (im folgenden Referenz-Sp/kes genannt).
Da es durch die gly-oAB- oder gly-pAB-Sp/kes zu einer Erhöhung der zugeführten Kohlenstoffmenge in Form der im Komplex gebundenen sowie noch freien Glucose aus der Gleichgewichtsreaktion kommt, wurde die gleiche Menge an Glucose auch bei den Referenz-Sp/kes sowie den oAB und pAB- Spikes zugeführt, hier allerdings ohne vorherige Inkubation, so dass sich der Komplex zwischen oAB bzw. pAB und Glucose zum Zeitpunkt der Zugabe noch nicht ausgebildet hatte. Dies wurde experimentell über die in Beispiel 3 gezeigte Methode überprüft.
Die Tabellen 7 (oAB) und 8 (pAB) geben eine Übersicht der experimentellen Ansätze. So ist für jeden Ansatz die Art und Menge der unterschiedlichen nach der Anwuchsphase zugegebenen Lösungen aufgelistet. Die Menge bezieht sich dabei jeweils auf ein einzelnes Kultivierungs-Well der Mikrotiterplatte. Während zu Beginn der Kultivierung 800 pL inokuliertes Medium eingesetzt wurden, wurden jedem Well nach der Anwuchsphase in Summe 700 pL an Lösungen hinzugefügt. Zusätzlich ist die jeweils resultierende AB-Konzentration nach Sp/ke-Zugabe sowie die Erhöhung der Glucose-Konzentration im Well durch den Spike angegeben. Die Zusammensetzung und Herstellung der verwendeten Lösungen ist zudem in Tabelle 6 beschrieben. belle 7: Übersicht der experimentellen Ansätze zur Untersuchung der Toxizität von oAB bzw. gly-oAB
belle 8: Übersicht der experimentellen Ansätze zur Untersuchung der Toxizität von pAB bzw. gly-pAB
Beispiel 4.1: Toxizität von gly-oAB gegenüber freier oAB für Corynebacterium glutamicum ATCC 13032
Für das nachfolgende Beispiel wurde der Stamm Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in 800 pL Minimalmedium CG XII im Kleinstkultivierungssystem BioLector Pro von m2p-labs wie vorab beschrieben kultiviert. Nach 7,2 h erfolgte die Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen an oAB bzw. gly-oAB. Alle Ansätze und Referenzen wurden in Triplikaten durchgeführt (Tabelle 7: Beispiel 4.1).
Die Toxizität von oAB bzw. gly-oAB wurde anhand des Wachstums vergleichend zu 2 Kontrollen ohne oAB/gly-oAB-Sp/ke untersucht (Referenz 1 und Referenz 2). Dazu wurde die Steigung des Streulicht- Signals in den ersten 10 h nach erfolgtem Spike analysiert (Tabelle 9). Sowohl oAB als auch gly-oAB führen zu einer Verzögerung des Wachstums. Bei gleicher Konzentration an oAB im oAB- oder gly-oAB- Spike, zeigt sich bei allen Konzentrationen jedoch eine geringere Toxizität von gly-oAB gegenüber freier oAB anhand einer höheren Steigung im Streulicht-Signal.
Tabelle 9: Steigung des Streulicht-Signals einer Kultivierung des Stamms C. glutamicum ATCC 13032 in den ersten 10 h nach Spike mit oAB, gly-oAB oder einer Mischung aus Medium und Glucose-Lösung (Referenz).
Beispiel 4.2: Toxizität von gly-oAB gegenüber freier oAB für Escherichia coli K12 und Pseudomonas putida DSM 6125
Für das nachfolgende Beispiel wurden die Stämme Escherichia coli K12 und Pseudomonas putida DSM 6125 in 800 pL LB-Medium im Kleinstkultivierungssystem BioLector Pro von m2p-labs wie vorab beschrieben kultiviert. Nach 4 h (E. coli) bzw. 7 h (P. putida) erfolgte die Zugabe unterschiedlicher Konzentrationen an oAB bzw. gly-oAB. Alle Ansätze und Referenzen wurden in Triplikaten durchgeführt (Tabelle 7: Beispiel 4.2). In Tabelle 10 und 11 ist die Steigung des Streulicht-Signals in den ersten 2 h nach dem Spike für E. coli und in den ersten 10 h für P. putida dargestellt. Bei beiden Organismen wirken sowohl oAB als auch gly-oAB wachstumsinhibierend/toxisch im Vergleich zu den Referenzen. Bei E. coli sind bei niedrigster oAB-Konzentration (5 g/L) die Wachstumseinbußen von oAB und gly-oAB ähnlich. Bei 10 und 15 g/L oAB zeigt sich jedoch eine geringere Toxizität von gly-oAB gegenüber freier oAB anhand der höheren Steigung im Streulicht-Signal. Bei P. putida zeigt sich bereits bei niedrigster Konzentration (5 g/L) eine geringere Toxizität von gly-oAB gegenüber freier oAB anhand der Steigung des Streulicht-Signals. Bei 10 g/L freier oAB findet kein Wachstum nach dem Spike statt, während die Zellen bei gleicher Konzentration an gly-oAB weiter wachsen. Bei höchster Konzentration (15 g/L) findet weder bei freier oAB noch bei gly-oAB Wachstum nach dem Spike statt.
Die Verringerung der toxischen Wirkung durch Glykierung von oAB lässt sich also nicht nur für C. glutamicum ATCC 13032, sondern auch für E. coli K12 und P. putida DSM 6125 zeigen.
Tabelle 10: Steigung des Streulicht-Signals einer Kultivierung des Stamms Escherichia coli K12 in den ersten 2 h nach Spike mit oAB, gly-oAB oder einer Mischung aus Medium und Glucose-Lösung (Referenz).
Tabelle 11: Steigung des Streulicht-Signals einer Kultivierung des Stamms Pseudomonas putida DSM 6125 in den ersten 10 h nach Spike mit oAB, gly-oAB oder einer Mischung aus Medium und Glucose- Lösung (Referenz). 15 g/L oAB (gly-oAB) -0,12
Beispiel 4.3: Toxizität von gly-pAB gegenüber freier pAB für Corynebacterium glutamicum ATCC 13032, Escherichia coli K12 und Pseudomonas putida DSM 6125
Die Toxizität von pAB und gly-pAB wurde wie vorab in Beispiel 4.1 und 4.2 für oAB und gly-oAB beschrieben und wie in Tabelle 8 dargestellt untersucht. Die Ergebnisse sind in den Tabellen 12, 13 und 14 zusammengefasst. Gezeigt wird hier die Steigung im Streulicht-Signal nach dem Spike für alle drei Stämme.
In allen Fällen zeigen sich Wachstumseinbußen bei Zugabe von freier pAB oder gly-pAB verglichen mit den Referenz-Kultivierungen ohne pAB-Zugabe. Für C. glutamicum ATCC 13032, zeigte sich bei allen Bedingungen die verminderte Toxizität von gly-pAB gegenüber pAB in freier Form anhand der Steigung des Streulicht-Signals (Tabelle 12) analog zu vorherigen Daten zu gly-oAB und oAB (Tabelle 9).
Tabelle 12: Steigung des Streulicht-Signals einer von Kultivierung des Stamms Corynebacterium glutamicum ATCC 13032 in den ersten 4,7 h nach Spike mit pAB, gly-pAB oder einer Mischung aus Medium und Glucose-Lösung (Referenz).
Für E. coli K12 zeigte sich bei einer Zugabe von 5 g/L pAB nach 4 h kein Vorteil von gly-pAB gegenüber pAB in freier Form. Da die Glukose im pAB-Sp/ke in ungebundener Form vorliegt und damit für den Mikroorganismus zugänglich und als C -Quelle verwertbar ist, ist eine höhere Steigung bei pAB-Sp/ke gegenüber gly-pAB-Sp/ke zu erkennen. Bei 10 und 15 g/L wird der geringere toxische Effekt der glykierten Form anhand der höheren Steigung des Streulicht-Signals verglichen mit dem pAB-Sp/ke deutlich. Tabelle 13: Steigung des Streulicht-Signals einer von Kultivierung des Stamms Escherichia coli K12 in den ersten 4 h nach Spike mit pAB, gly-pAB oder einer Mischung aus Medium und Glucose-Lösung (Referenz). Für P. putida DSM 6125 zeigt sich bei einer Zugabe von 5 und 10 g/L pAB nach 5 h kein Unterschied zwischen pAB und gly-pAB. Bei 15 g/L wird der geringere toxische Effekt der glykierten Form anhand der höheren Steigung des Streulicht-Signals verglichen mit dem pAB-Sp/ke jedoch ersichtlich.
Tabelle 14: Steigung des Streulicht-Signals einer von Kultivierung des Stamms Pseudomonas putida DSM 6125 in den ersten 8 h nach Spike mit pAB, gly-pAB oder einer Mischung aus Medium und Glucose-Lösung (Referenz).

Claims

Patentansprüche
1. Wässrige Zusammensetzung enthaltend a) eine Gesamtmenge ortho-Aminobenzoesäure (oAB) von wenigstens 40 g/l und mehrere Zellen des Genus Corynebacterium; oder b) eine Gesamtmenge ortho-Aminobenzoesäure (oAB) von wenigstens 5 g/l und mehrere Zellen des Genus Escherichia oder Pseudomonas; wobei wenigstens 2 g/l dieser Gesamtmenge als glykierte AB (gly-AB) vorliegen .
2. Die wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei wenigstens 15 % der Gesamtmenge an oAB als glykierte oAB vorliegen.
3. Die wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, zusätzlich enthaltend wenigstens einen reduzierenden Zucker, wobei das molare Verhältnis der Gesamtmenge der Aldehydgruppen des reduzierenden Zuckers zu Gesamt-oAB wenigstens 0,3 : 1,0 beträgt.
4. Die wässrige Zusammensetzung nach Anspruch 3, enthaltend wenigstens einen reduzierenden Zucker, der von den in der wässrigen Zusammensetzung enthaltenen Zellen nicht als Energie- oder Kohlenstoffquelle oder zur Bildung eines Zielprodukts verwertet werden kann.
5. Die wässrige Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, zusätzlich enthaltend eine für die Zellen verwertbare Stickstoffquelle, eine für die enthaltenen Zellen verwertbare Schwefelquelle und eine für die enthaltenen Zellen verwertbare Phosphorquelle.
6. Die wässrige Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die Zellen in einer Konzentration von 2 g bis 70 g Trockenmasse pro Liter vorliegen.
7. Die wässrige Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Zellen metabolisch aktiv sind.
8. Verwendung der wässrigen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Kultivierung der darin enthaltenen Zellen.
9. Verfahren zur Verminderung der Toxizität von Aminobenzoesäure (AB) enthaltend den Schritt des Kontaktierens freier AB in wässriger Lösung mit einem reduzierenden Zucker, wobei das molare Verhältnis der Gesamtmenge der Aldehydgruppen des reduzierenden Zuckers zu Gesamt-AB wenigstens 0,3 : 1,0 beträgt.
10. Das Verfahren nach Anspruch 9, wobei die zu entgiftende freie AB in der wässrigen Lösung durch die in der wässrigen Zusammensetzung enthaltenen Zellen erzeugt wird.
11. Die Verwendung reduzierender Zucker in Konzentrationen von wenigstens 10 g/l Gesamtzucker zur Verminderung der Toxizität von AB.
12. Die Verwendung nach Anspruch 11, wobei das molare Verhältnis der Gesamtmenge der Aldehydgruppen von reduzierendem Zucker zu Gesamt-AB wenigstens 0,3 : 1,0 beträgt.
13. Verfahren zur Kultivierung von prokaryotischen Zellen in Anwesenheit von ortho- Aminobenzoesäure (oAB) und wenigstens eines reduzierenden Zuckers, wobei a) die Zellen solche des Genus Corynebacterium sind und die Gesamtmenge Aminobenzoesäure (AB) wenigstens 40 g/l beträgt; oder b) die Zellen solche des Genus Escherichia oder Pseudomonas sind und die Gesamtmenge ortho-Aminobenzoesäure (oAB) wenigstens 5 g/l beträgt; und das molare Verhältnis der Gesamtmenge der Aldehydgruppen des reduzierenden Zuckers zu Gesamt-oAB wenigstens 0,3 : 1,0 beträgt.
14. Das Verfahren nach Anspruch 13, wobei die Zellen in der Lage sind, ein fermentierbares Substrat zu oAB umzusetzen.
15. Das Verfahren nach Anspruch 14, wobei die Zellen in der Lage sind, den reduzierenden Zucker als fermentierbares Substrat zu benutzen.
16. Das Verfahren nach Anspruch 13 oder 14, wobei wenigstens ein reduzierender Zucker anwesend ist, der von den prokaryotischen Zellen nicht als Energie- oder Kohlenstoffquelle verwertet werden kann.
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