EP4580680A1 - Lecithin-modifizierte nanoskalierte sauerstoffträger (lenox) - Google Patents

Lecithin-modifizierte nanoskalierte sauerstoffträger (lenox)

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EP4580680A1
EP4580680A1 EP23762414.3A EP23762414A EP4580680A1 EP 4580680 A1 EP4580680 A1 EP 4580680A1 EP 23762414 A EP23762414 A EP 23762414A EP 4580680 A1 EP4580680 A1 EP 4580680A1
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EP
European Patent Office
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albumin
solution
artificial oxygen
lecithin
oxygen carrier
Prior art date
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Pending
Application number
EP23762414.3A
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English (en)
French (fr)
Inventor
Andrea STEINBICKER
Katja FERENZ
Fabian Nocke
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Universitaet Duisburg Essen
Original Assignee
Universitaet Duisburg Essen
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Filing date
Publication date
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Publication of EP4580680A1 publication Critical patent/EP4580680A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • A61K47/06—Organic compounds, e.g. natural or synthetic hydrocarbons, polyolefins, mineral oil, petrolatum or ozokerite
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    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P7/00—Drugs for disorders of the blood or the extracellular fluid
    • A61P7/08—Plasma substitutes; Perfusion solutions; Dialytics or haemodialytics; Drugs for electrolytic or acid-base disorders, e.g. hypovolemic shock

Definitions

  • the present invention relates to new, stable artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons, their production and their use as synthetic blood substitutes.
  • Perfluorocarbons are synthetically produced, perfluorinated carbon compounds (hydrocarbons whose hydrogen atoms are completely replaced by halogens, usually fluorine atoms). Due to the cavities between the individual molecules, they have a high solubility for respiratory gases such as oxygen and carbon dioxide compared to water, depending on the partial pressure, and can therefore take over or support the transport of oxygen in the blood instead of or together with erythrocytes. Oxygen uptake and release occurs two times faster than in erythrocytes and is directly proportional to the oxygen partial pressure. More than 90% of the dissolved oxygen is delivered to the tissue, achieving three times the oxygen extraction rate (oxygen delivery to the tissue) of an RBC.
  • perfluorocarbons Due to the very high carbon-fluorine binding energy, perfluorocarbons are chemically and metabolically inert, so that they do not react even with highly reactive compounds and do not form toxic degradation products. In terms of degradation, the perfluorodecalin (PFD) we use will be excreted in the air we breathe due to its high vapor pressure. High vapor pressure means that a liquid evaporates under mild conditions. Here this means that PFD comes to the lungs as a liquid and is then vaporized and exhaled.
  • PFD perfluorodecalin
  • EP0282948B1 and EP0282949B1 describe aqueous emulsions made from perfluorocarbons in which, among other things, phospholipids are used as emulsifiers. Additional emulsifier additives can also be present, such as: B. Albumin, especially bovine serum albumin (BSA). This can be present in the emulsion in an amount of 0.2-2% by weight as an “oncontic agent”.
  • CN111214459A (“Perfluorocarbon and albumin nanoparticles and application in production of tumor treating medicine thereof”) describes nanoparticles made of perfluorocarbon and albumin as a drug delivery system for “phosphonic acid drugs”.
  • a manufacturing process is described in which the “phosphonic acid drug” is in an emulsion in which, among other things: Lecithin and cholesterol may be included, to which perfluorocarbon/albumin nanoparticles are added to produce biologically active double membrane particles.
  • Lecithin and cholesterol may be included, to which perfluorocarbon/albumin nanoparticles are added to produce biologically active double membrane particles.
  • This publication therefore concerns liposomes. Nanoparticles with a shell made of albumin and lecithin are not described. The registration is not related to artificial oxygen carriers or blood substitute solutions, but to tumor therapy.
  • CN109908085A describes similar emulsions made from BSA, lecithin and perfluorocarbons.
  • the BSA does not serve as an emulsifier, but rather as an example protein for the drug carrier system.
  • nanoparticles with a shell made of albumin and lecithin are not explicitly described in the application.
  • the registration is not related to artificial oxygen carriers or blood replacement solutions, but rather to the therapy of heart failure.
  • EP0033402A1 describes a perfusate fluid which consists of a previously used crystalloid volume replacement solution (Ringer's solution) in which albumin is dissolved and which additionally contains, among other things, may contain a perfluorocarbon and an emulsifying agent.
  • the emulsifying agent can, among other things, be a phospholipid.
  • the albumin is not used as an emulsifier, but rather forms an additive in the carrier solution.
  • US 4,186,253 A describes the non-cooled production of a perfluorocarbon emulsion using nozzle-like emulsifiers, the emulsion being intended to be used in organ transplantation.
  • the emulsion also contains a modified Ringer's solution in which albumin is dissolved.
  • WO 94/18954 A1 describes microemulsions for use as blood substitutes which contain albumin, lecithin and perfluorodecalin.
  • perfluorocarbons are only used as artificial oxygen carriers in the form of emulsions, although the instability of the emulsions or the short half-life still cause difficulties (Lambert, E., Janjic, J.M. Quality by design approach identifies critical parameters Driving oxygen delivery performance in vitro for perfluorocarbon based artificial oxygen carriers. Sci Rep 11, 5569 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-84076-l).
  • Newer preparations e.g. Oxygent® (a 60% PFC emulsion with 58% perfluorooctyl bromide, 2% perfluorodecyl bromide and egg yolk phospholipids), work with a combination of the slightly less stabilizing (but better tolerated) phospholipids, e.g. from egg yolk and high molecular weight PFCs such as perfluorodecyl bromide (CF3(CF2)10Br), perfluorotributylamine (N(CF2CF2CF2CF3)3) or perfluoromethylcyclohexylpiperidine (C12F22N) (Ferenz KB, 2015. Artificial oxygen carriers - how long do we have to wait? Hemotherapy 25, 27-36).
  • PFCs such as perfluorodecyl bromide (CF3(CF2)10Br), perfluorotributylamine (N(CF2CF2CF2CF3)3) or perfluoromethylcyclohexy
  • the above object is achieved by a process for producing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs).
  • the method comprises the steps of a) providing a suitable aqueous albumin solution and mixing with at least one suitable artificial oxygen carrier based on perfluorocarbons, b) appropriate addition of lecithin, c) pre-emulsification by rapid stirring under suitable cooling, d) emulsification of the pre-emulsion from step c) under pressure via a high-pressure homogenizer with suitable cooling and subsequent storage for at least 30 minutes, also under suitable cooling.
  • PFOCs perfluorocarbons
  • albumin is in a concentration between 2-20%, preferably 5-10%, more preferably 5%, perfluorocarbon perfluorodecalin (PFD) in a concentration between 10-50%, preferably from 17%, lecithin in a concentration between 1-16%, preferably from 2%, in a medium selected from water and electrolytes in a plasma-like composition, preferably Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer's solution and hydroxy-ethyl -Starch, STEEN Solution, OCS solution and other crystalloid and colloidal volume replacement solutions.
  • PFD perfluorocarbon perfluorodecalin
  • the above object is achieved by a process for producing artificial oxygen carriers based on perfluorocarbons (PFOCs).
  • the method first includes the step of providing a suitable aqueous albumin solution.
  • Lecithin (97%, Roth, Düsseldorf, DE) was also used for the newly developed oxygen carrier (LENOX).
  • Sterofundin® ISO B.Braun, Melsungen, DE
  • HES 6% Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE
  • Ringer's solution Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE
  • the particle size and the polydispersion index were determined using dynamic light scattering (Stabino Nano-flex, Particle Metrix, Inning am Ammersee, DE).
  • the oxygen capacity was measured with a respirometer (O2k, Oroboros Instruments, Innsbruck, AUT) and the turbidity with a photometer (Specord S600, Analytik) ena, Jena, DE).
  • the viscosity was determined using a rheometer (MCR 92, Anton Paar, Ostfildern, DE). The viscosity was determined at two different shear rates because some emulsions exhibited non-Newtonian behavior. A very low shear rate (50/s) and a physiological shear rate (645/s) were chosen.
  • Organ Life Fluid particles The synthesis of the pure Organ Life Fluid particles (OLF particles) corresponded to that in patent application DE102021211272.2.
  • 20 mL albumin (BSA or HSA) and 4 mL PFD were introduced and pre-emulsified with an Ultra-Turrax (T25 Basic, IKA-Werke, Staufen, DE) at 9,500 revolutions/min.
  • the preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed once at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar).
  • the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
  • Synthesis I-IV is carried out with a pressure of 30,000 PSI and a cycle rate of eight times, from Synthesis V onwards the pressure changes to 20,000 PSI and the cycle number changes to seven times.
  • LENOX For the synthesis of LENOX, 20 mL of a 5% albumin solution (bovine serum albumin (BSA) or human serum albumin (HSA)) and 4 mL of PFD were presented. 0.4 g of lecithin was added to the 2-phase mixture and pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min). The pre-emulsion was then placed in the microfluidizer and the entire thing was processed eight times at a pressure of 30,000 PSI (approx. 2068 bar). During the process, the outlet coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
  • BSA bovine serum albumin
  • HSA human serum albumin
  • BSA bovine serum albumin
  • bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of HES (6%).
  • BSA bovine serum albumin
  • 4 mL of PFD and then 0.4 g of lecithin were added to this solution.
  • the mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax at 9,500 revolutions/min.
  • the preemulsion was then placed in the microfluidizer and the entire volume was processed eight times at a pressure of 30,000 PSI (approx. 2068 bar).
  • the dispenser coil of the device and therefore the product must be cooled with ice. After homogenization, the product was stored in a vessel filled with ice for at least 30 min.
  • the OriginPro® software (version 2020) was used for the statistical evaluation of the analysis data.
  • the experimental data presented below are the mean values of the groups ⁇ standard deviation. The standard deviation is shown in the form of error bars.
  • the LENOX have an average particle diameter of 92.5 ⁇ 8.5 nm (Synthesis I, BSA) or 123.5 ⁇ 2.2 nm (Synthesis I, HSA) and release 3.99 ⁇ 0.2 pmol of oxygen per mL Sample free (at 17 vol.%).
  • the emulsion has properties of a Newtonian fluid, with the viscosity only changing minimally as the shear rate increases. Compared to the LENOXs, the OLF particles form a non-Newtonian fluid, and the viscosity changes significantly as the shear rate changes (see Figure 1).
  • the mean particle diameter and the polydispersion index are significantly different between the OLF particles (HSA) and the LENOXs.
  • HSA OLF particles
  • a visually visible difference between the OLF emulsion and the LENOX emulsion is the turbidity.
  • the LENOX emulsion (Synthesis I, HSA) is significantly (*p ⁇ 0.001) more transparent to light with a wavelength of 860 nm than the OLF emulsion.
  • the OLF emulsion appears very cloudy, whereas the LENOXs emulsion appears clear.
  • bovine serum albumin (BSA) was dissolved in 20 mL of Sterofundin ISO.
  • PFD bovine serum albumin
  • lecithin 4 mL of lecithin were added to this solution.
  • the mixture was pre-emulsified with an Ultra-Turrax (9,500 revolutions/min).
  • the pre-emulsion was then placed into the microfluidizer and at a pressure of 20,000 PSI (approx. 1379 bar) the entire volume was cycled through the microfluidizer seven times.
  • PSI approximately 1379 bar
  • d stands for the hydrodynamic diameter of the particles and S for the range of the particle size distribution.
  • dlO means that 10% of the measured particles are exactly the same size or smaller than the specified particle diameter, d50 corresponds to 50% and d90 corresponds to 90%.
  • dlO 75 nm means that 10% of the measured particles were 75 nm or smaller.
  • Viscosity (at 200 s' 1 ):

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft eine neuartige Zusammensetzung zur Entwicklung stabiler künstlicher Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, deren Herstellung und ihre Verwendung als synthetischer Blut- und Sauerstoffersatzträger sowie Volumenersatz.

Description

Lecithin-modifizierte nanoskalierte Sauerstoffträger (LENOX)
Die vorliegende Erfindung betrifft neue, stabile künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, deren Herstellung und ihre Verwendung als synthetischer Blutersatz.
Hintergrund der Erfindung
Perfluorcarbone (PFCs) sind synthetisch hergestellte, perfluorierte Kohlenstoffverbindungen (Kohlenwasserstoffe, deren Wasserstoff-Atome vollständig durch Halogene, meist Fluor- Atome ersetzt sind). Aufgrund von Hohlräumen zwischen den einzelnen Molekülen weisen sie im Vergleich zu Wasser, in Abhängigkeit vom Partialdruck, eine hohe Löslichkeit für respiratorische Gase wie Sauerstoff und Kohlendioxid auf und können daher anstelle von oder auch zusammen mit Erythrozyten den Sauerstofftransport im Blut übernehmen bzw. diesen unterstützen. Die Sauerstoffaufnahme und -abgabe erfolgt zwei Mal schneller als bei Erythrozyten und direkt proportional zum Sauerstoffpartialdruck. Mehr als 90% des gelösten Sauerstoffs werden an das Gewebe abgegeben, wodurch die dreifache Sauerstoff- Extraktionsrate (Sauerstoffabgabe an das Gewebe) eines Erythrozyten erreicht wird. Aufgrund der sehr hohen Kohlenstoff-Fluor Bindungsenergie sind Perfluorcarbone chemisch und metabolisch inert, so dass sie auch mit hochreaktiven Verbindungen keine Reaktion eingehen und keine toxischen Abbauprodukte bilden. Bezüglich des Abbaus wird das von uns verwendete Perfluorodecalin (PFD), aufgrund seines hohen Dampfdrucks mit der Atemluft ausgeschieden werden. Hoher Dampfdruck bedeutet, dass eine Flüssigkeit unter milden Bedingungen evaporiert. Hier bedeutet das, dass PFD als Flüssigkeit zur Lunge kommt und dann verdampft und ausgeatmet wird.
Aufgrund der LTnlöslichkeit von Perfluorocarbonen sowohl in Wasser als auch in Öl ist entweder eine Emulgierung oder Verkapselung erforderlich, um entsprechende PFC-basierte Sauerstoffträger (PFOCs) als Zusatz zu einem Perfusionsmedium bzw. Transfusionsmedium zu verwenden. EP0282948B1 und EP0282949B1 beschreiben wässrige Emulsionen aus Perfluorcarbonen, bei denen u. a. Phospholipide als Emulgatoren eingesetzt werden. Dabei können noch zusätzlich Emulgatorhilfsstoffe anwesend sein, wie z. B. Albumin, insbesondere bovines Serumalbumin (BSA). Dies kann in der Emulsion in einer Menge von 0,2-2 Gewichts% als „oncontic agent“ vorliegen.
CN111214459A (“Perfluorocarbon and albumin nanoparticles and application in production of tumor treating medicine thereof ‘) beschreibt Nanopartikel aus Perfluorcarbon und Albumin als Drug-Delivery-System für “phosphonic acid drugs“. Es wird ein Herstellungsverfahren beschrieben, in dem die „phosphonic acid drug“ in einer Emulsion, in der u. a. Lecithin und Cholesterin enthalten sein kann, zu den Perfluorcarbon/ Albumin Nanopartikeln gegeben wird, um biologisch aktive Doppelmembran-Partikel zu erzeugen. Diese Publikation betrifft somit Liposomen. Nanopartikel mit einer Hülle aus Albumin und Lecithin werden nicht beschrieben. Die Anmeldung steht nicht in Zusammenhang mit künstlichen Sauerstoffträgem bzw. Blutersatz -Lösungen, sondern der Tumortherapie.
CN109908085A beschreibt ähnliche Emulsionen aus BSA, Lecithin und Perfluorcarbonen. Das BSA dient nicht als Emulgator, sondern als Beispielprotein für das Drug-Carrier-System. Nanopartikel mit einer Hülle aus Albumin und Lecithin werden aber in der Anmeldung nicht explizit beschrieben. Die Anmeldung steht auch nicht in Zusammenhang mit künstlichen Sauerstoffträgem bzw. Blutersatz -Lösungen, sondern der Therapie der Herzinsuffizienz.
EP0033402A1 beschreibt eine Perfusatflüssigkeit, die aus einer früher verwendeten, kristalloiden Volumenersatzlösung (Ringer-Lösung) besteht, in der Albumin gelöst ist und das zusätzlich u. a. einen Perfluorkohlenstoff und ein Emulgiermittel enthalten kann. Das Emulgiermittel kann u. a. ein Phospholipid sein. Das Albumin wird in diesem Fall nicht als Emulgator eingesetzt, sondern bildet einen Zusatz in der Trägerlösung.
Jacoby C, et al. (in: Probing different perfluorocarbons for in vivo inflammation imaging by 19F MRI: image reconstruction, biological half-lives and sensitivity. NMR Biomed. 2014 Mar;27(3):261-71. doi: 10.1002/nbm.3059. Epub 2013 Dec 19. PMID: 24353148) beschreiben PFCE-Emulsionen, die durch Hochdmck-Homogenisierung erzeugt wurden und weiter 10% w/w Kronenether und 4% w/w gereinigtes Ei-Lecithin E 80 S (Lipoid GmbH, Ludwigshafen, Germany) in isotonischem Puffer enthielten. US 4 866 096 A beschreibt eine stabile wässrige Emulsion, welche 10-59% eines Sauerstoffübertragenden, gesättigten Perfluordecalins enthält, Triglyceride von Fettsäuren und 0.5-7% eines oberflächenaktiven Phospholipids sowie gegebenenfalls Albumin. Die Emulsion wird unter Kühlen in einem Mikrofluidizer hergestellt. Des Weiteren wird beschrieben, dass die Emulsion als synthetischer Blutersatz verwendet wird.
Jägers et al. (in: "Perfluorocarbon-based oxygen carriers: from physics to physiology", PFLÜGERS ARCHIV - EUROPEAN JOURNAL OF PHYSIOLOGY, Bd. 473, Nr. 2, 3. November 2020, Seiten 139-150) beschreiben stabile Emulsionen, welche Perfluordecalin (PFD) zusammen mit Lecithin enthalten. Albumin wird in dieser Veröffentlichung ausdrücklich erwähnt als ein Emulgator, um die Stabilität der Emulsion zu erhöhen. Eine Kombination aus Albumin, Lecithin und Perfluordecalin ist jedoch nicht beschrieben.
US 4 186 253 A beschreibt die nicht gekühlte Herstellung einer Perfluorcarbon-Emulsion mittels düsenartigen Emulgatoren, wobei die Emulsion bei der Organtransplantation verwendet werden soll. Die Emulsion enthält weiterhin eine modifizierte Ringerlösung, in welcher Albumin gelöst ist.
WO 94/18954 Al beschreibt Mikroemulsionen für die Verwendung als Blutersatz, die Albumin, Lecithin und Perfluordecalin enthalten.
Bei den bisherigen in-vivo-Forschungsansätzen werden Perfluorcarbone als künstliche Sauerstoffträger nur in Form von Emulsionen eingesetzt, wobei unter anderem die Instabilität der Emulsionen oder die kurze Halbwertszeit noch Schwierigkeiten bereiten (Lambert, E., Janjic, J.M. Quality by design approach identifies critical parameters driving oxygen delivery performance in vitro for perfluorocarbon based artificial oxygen carriers. Sei Rep 11, 5569 (2021). https://doi.org/10.1038/s41598-021-84076-l).
Produkte wie Fluosol-DA®, Perftoran® und Oxycyte® wurden zwar in klinischen Studien geprüft, allerdings ist aufgrund von aufgetretenen Nebenwirkungen bisher keines der Präparate in Europa oder den USA zugelassen (Ferenz KB, Steinbicker AU. Artificial Oxygen Carriers- Past, Present, and Future-a Review of the Most Innovative and Clinically Relevant Concepts. J Pharmacol Exp Ther. 2019 May;369(2):300-310. doi: 10.1124/jpet.118.254664. Epub 2019 Mar 5. PMID: 30837280).
Neuere Präparate, z.B. Oxygent® (eine 60% PFC Emulsion mit 58% Perfluoroctylbromid, 2% Perfluordecylbromid und Eigelb Phospholipiden), arbeiten mit einer Kombination aus den etwas schlechter stabilisierenden (aber besser verträglichen) Phospholipiden, z.B. aus Eigelb und hochmolekularen PFCs wie z.B. Perfluordecylbromid (CF3(CF2)10Br), Perfluortributylamin (N(CF2CF2CF2CF3)3) oder Perfluormethylcyclohexylpiperidin (C12F22N) (Ferenz KB, 2015. Künstliche Sauerstoffträger - wie lange müssen wir noch warten? Hämotherapie 25, 27-36).
Trotz bestimmter Fortschritte in diesem Bereich besteht immer noch das Problem, dass Perfluorkohlenwasserstoffe nicht so stabil in wässriger Lösung emulgiert werden können, dass sie effektiv als Zusatz zu einem Perfusionsmedium bzw. Transfusionsmedium verwendet werden können. Es ist somit Aufgabe der vorliegenden Erfindung, entsprechend verbesserte Verfahren zur Herstellung von künstlichen Sauerstoffträgem auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen und entsprechend verbesserte Zusammensetzungen bereitzustellen. Weitere Aufgaben von künstlichen Sauerstoffträgem werden der Fachperson bei der Lektüre des „Stand der Technik“ im Folgenden in einer detaillierten Beschreibung und in Abbildungen und Beispielen dargestellt.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von künstlichen Sauerstoffträgern auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) gelöst. Das Verfahren umfasst die Schritte von a) Bereitstellen einer geeigneten wässrigen Albuminlösung und Mischen mit mindestens einem geeigneten künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, b) Geeignetes Hinzufügen von Lecithin, c) Präemulgation durch schnelles Rühren unter geeigneter Kühlung, d) Emulgieren der Präemulsion aus Schritt c) unter Druck über einen Hochdruck-Homogeni sator unter geeigneter Kühlung und anschließender Lagerung für mindestens 30 min ebenfalls unter geeigneter Kühlung.
Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei Albumin in einer Konzentration zwischen 2-20 %, bevorzugt von 5-10 %, weiter bevorzugt von 5%, Perfluorkohlenwasserstoff Perfluordecalin (PFD) in einer Konzentration zwischen 10-50 %, bevorzugt von 17 %, Lecithin in einer Konzentration zwischen 1-16%, bevorzugt von 2 %, in einem Medium ausgewählt aus Wasser und Elektrolyten in einer plasma-ähnlichen Zusammensetzung, bevorzugt Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer-Lösung und Hydroxy-Ethyl-Stärke, STEEN- Solution, OCS-Lösung und anderen kristalloiden und kolloidalen Volumenersatzlösungen emulgiert werden.
Weiter bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der künstliche Sauerstoffträger ausschließlich aus den angegebenen Materialien hergestellt wird.
In einem zweiten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe durch einen künstlichen Sauerstoffträger gelöst, der nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt ist.
Der erfindungsgemäße künstliche Sauerstoffträger weist eine höhere Stabilität gegenüber nicht Lecithin-haltigen künstlichen Sauerstoffträgern auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) auf und kann direkt in den typischen kristalloiden und kolloidalen Volumenersatzlösungen, wie etwa Sterofundin® ISO hergestellt werden.
In einem dritten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird die obige Aufgabe durch die Verwendung des künstlichen Sauerstoffträgers gemäß der vorliegenden Erfindung als Perfusions- oder Transfusionslösung oder als synthetischer Blutersatz gelöst.
Von Seiten der vorliegenden Erfinder wurden auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, bereits künstliche Sauerstoffträger entwickelt, die mit 5 % Albumin emulgiert wurden (albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carrier, A-AOC) und die bereits vielversprechende Ergebnisse zeigten (siehe u.a., Wrobeln A, et al. Albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers: A physico-chemical characterization and first in vivo evaluation of biocompatibility. Eur J Pharm Biopharm. 2017 Jun; 115:52-64. https://doi.Org/10.1016/j.ejpb.2017.02.015. Epub 2017 Feb 20. PMID: 28232105).
Bisher konnten diese Sauerstoffträger erfolgreich zur Gewebeoxygenierung im Blutaustauschmodell (in der Ratte) sowie zur Prävention der Taucherkrankheit (in der Ratte) eingesetzt werden (Wrobeln A, Jägers J, Quinting T, Schreiber T, Kirsch M, Fandrey J, Ferenz KB. Albumin-derived perfluorocarbon-based artificial oxygen carriers can avoid hypoxic tissue damage in massive hemodilution. Sei Rep. 2020 Jul 20; 10(1): 11950. Doi: 10.1038/s41598-020- 68701-z. PMID: 32686717; PMCID: PMC7371727, Mayer D, Guerrero F, Goanvec C, Hetzel L, Linders J, Ljubkovic M, Kreczy A, Mayer C, Kirsch M, Ferenz KB. Prevention of Decompression Sickness by Novel Artificial Oxygen Carriers. Med Sei Sports Exerc. 2020 Oct;52(10):2127-2135. Doi: 10.1249/MSS.0000000000002354. PMID: 32251255.). Auch im Bereich der Transplantationsmedizin konnten die Erfinder an extrakorporal perfundierten Organen (Organe ausserhalb des Organismus, wie isoliertes Herz oder isolierte Niere) eine erfolgreiche Gewebeoxygenierung zeigen (Jägers J, Wrobeln A, Ferenz KB. Perfluorocarbon- based oxygen carriers: from physics to physiology. Pflügers Arch. 2021 Feb;473(2):139-150. Doi: 10.1007/s00424-020-02482-2. Epub 2020 Nov 3. PMID: 33141239; PMCID: PMC7607370).
DE102008045152A1 und EP 2 296 635 Bl betreffen künstliche Sauerstoffträger und ihre Verwendung. Allerdings sind die Sauerstoffträger bisher nicht in jeder Trägerlösung stabil, die klinisch wünschenswert ist. Insbesondere in den typischen kristalloiden und kolloidalen Volumenersatzlösungen wie Sterofundin® ISO konnten keine stabilen Emulsionen generiert werden, somit sind die Sauerstoffträger nicht universell einsetzbar.
In einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird - wie oben erwähnt - die obige Aufgabe durch ein Verfahren zur Herstellung von künstlichen Sauerstoffträgem auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) gelöst. Das Verfahren umfasst zunächst den Schritt von Bereitstellen einer geeigneten wässrigen Albuminlösung.
Grundsätzlich sind alle für die Verwendung im Rahmen als künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen geeigneten wässrigen Träger verwendbar. Bevorzugt wird das Albumin in einem geeigneten, wässrigen Puffer, Wasser, einer ausbalancierten vollen Elektrolytlösung für die Infusionstherapie, wie z.B. Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, Ringer- Lösung, STEEN-Solution, OCS-Lösung und/oder in Hydroxy-Ethyl-Stärke gelöst. Besonders geeignet sind die typischen kristalloiden und kolloidalen Volumenersatzlösungen, wie etwa Sterofundin® ISO.
Grundsätzlich ist das verwendete Albumin nicht auf eine Spezies beschränkt. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Albumin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säugetier-Albumin, humanem Serumalbumin (HSA) und bovinem Serumalbumin (BSA), oder geeigneten Derivaten davon, wie etwa pegylierten Albuminen.
Anschließend wird die Albuminlösung mit mindestens einem geeigneten künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen vermischt. Es können alle künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen verwendet werden. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Perfluordecalin, Perfluordecylbromid, Perfluortributylamin, Perfluormethylcyclohexylpiperidin, Perfluordichloroctan, Perfluortertbutylcyclohexan, Perfluor- 15 -kronen-5 -ether, Dodecafluorpentan, Perfluoroctylbromid und Perfluorocyclohexan. Weiter geeignet sind künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen wie publiziert in Wesseler (Eugene P. Wesseler, Ronald Iltis, Leland C. Clark, The solubility of oxygen in highly fluorinated liquids, Journal of Fluorine Chemistry, Volume 9, Issue 2, 1977, Pages 137-146, ISSN 0022-1139, https://doi.org/10.1016/S0022-1139(00)82152-1), dort insbesondere in Tabelle 2.
Anschließend wird auf geeignete Weise Lecithin hinzugefügt. Bevorzugt ist fettfreies pflanzliches Lecithin, zum Beispiel aus Soja mit einer Reinheit von >97%. Diese neuen, stabilen Sauerstoffträger, die von den Erfindern als „Lecithin modified nanoscale oxygen carrier“ (LENOX) bezeichnet werden, unterscheiden sich von den bisherigen Sauerstoffträgern, den Vorläufern, genannt albumin-derived artificial oxygen carrier (A-AOCs) und organ-life fluid (OLF) dadurch, dass nun neu Lecithin bei der Synthese zugesetzt wird. Zur Verbesserung wurde neben einem höheren Betriebsdruck der herstellenden Maschine und einer mehrzyklischen Synthese, zusätzlich das Phospholipid Lecithin in die Albuminhülle eingebaut. Durch diese Änderungen konnten verschiedene Stabilitätsprobleme der bisher bekannten Emulsionen vollständig beseitigt werden. Lecithin ist ein Gemisch aus Phosphatidylcholin und anderen Phospholipiden und Bestandteil tierischer sowie pflanzlicher Zellmembranen.
Die vorliegende Emulsion hat den Vorteil, neben den beiden Emulgatoren Albumin und Lecithin keine weiteren Stabilisatoren zu benötigen. Bevorzugt ist daher ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der künstliche Sauerstoffträger ausschließlich aus den angegebenen Materialien hergestellt wird, bzw. besteht. Sowohl Albumin als auch Lecithin sind bereits zur intravenösen Anwendung klinisch zugelassen. Üblicherweise werden die zur Herstellung einer Emulsion verwendeten Komponenten zunächst zu einer grob dispersen Präemulsion, welche auch als Roh- oder Präemulsion bzw. Prämix bezeichnet werden kann, vorgemischt. Anschließend erfolgt ein Homogenisieren, wobei eine Tropfenzerkleinerung der dispersen Phase stattfindet (Feinemulgieren). Dabei verschiebt sich das Tropfengrößenspektrum der Roh- bzw. Präemulsion deutlich hin zu kleineren Tropfen. O/W-Emulsionen für eine parenterale Anwendung werden üblicherweise hergestellt, indem zunächst eine Ölphase und Wasserphase mittels eines Rotor- Stator-Rührers zu einer Präemulsion vorgemischt werden.
So erfolgt auch erfmdungsgemäß die anschließende Präemulgation des oben hergestellten Gemisches (das gewöhnlich noch in Phasen getrennt vorliegt) durch schnelles Rühren unter geeigneter Kühlung. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Präemulgation durch schnelles Rühren mit einem Homogenisator bei zwischen 8.000 und 12.000 Umdrehungen/min, wie z.B. mit einem Ultra-Turrax® bei 9.500 Umdrehungen/min durchgeführt wird.
Als letzter Schritt erfolgt das Emulgieren der Präemulsion wie oben unter (Hoch-) Druck über einen Hochdruckhomogenisator, z.B. einen Gegenstrahldispergator (siehe z.B. DE 102018205 493 Al) unter geeigneter Kühlung und anschließender Lagerung für mindestens 30 min ebenfalls unter geeigneter Kühlung. Bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei das Emulgieren der Präemulsion bei einem Druck zwischen 10.000 PSI (ca. 689 bar) und 40.000 PSI (ca. 2758 bar), bevorzugt bei 30.000 PSI (2068 bar) stattfindet und gegebenenfalls mehrfach wiederholt wird, bevorzugt zwischen 1 und 12 Male (weiter bevorzugt zwischen 5 und 10, optimalerweise 8-mal wiederholen)
Die Schritte des Verfahrens betreffend insbesondere die Homogenisierung und Emulgation werden unter geeigneter Kühlung bei < 10 °C oder geringer, bevorzugt bei 4 °C. Natürlich soll dabei ein Einfrieren vermieden werden.
Den Erfindern ist es nun erstmals gelungen, künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) zu synthetisieren, die mit lediglich den drei Bestandteilen Albumin, Lecithin und PFD ohne weitere Zusatzstoffe (wie zB Triblock Copolymere wie Pluronic) eine hohe Stabilität aufweisen und sich zudem direkt in einer klinisch zugelassenen kristalloiden oder kolloidalen Volumenersatzlösung (bevorzugt Sterofundin® ISO) und anderen Trägerlösungen stabil herstellen lassen, was vorher nicht möglich war.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei Albumin in einer Konzentration zwischen 2-20 %, bevorzugt von 5-10 %, weiter bevorzugt von etwa 5%, Perfluordecalin (PFD) in einer Konzentration zwischen etwa 10-50%, bevorzugt von etwa 17%, Lecithin in einer Konzentration zwischen etwa 1-16%, bevorzugt von etwa 2%, in Wasser emulgiert werden.
Der verwendete Anteil an Albumin führt als wichtiger Vorteil zu einem physiologischen kolloidosmotischen Druck, wobei überraschenderweise ein Optimum bei etwa 5% gefunden wurde. Die Kombination PFOC + Albumin + Lecithin führt daher in Vollelektrolyt/Volumenersatz -Lösung zu einer stabilen Formulierung und einem ready -to-use- Produkt. Für eine stabile Formulierung sind aber auch artificial oxygen carrier (AOC) mit anderen Albuminanteilen vorteilhaft (zwischen 2 - 20 %, 4 - 10 %, 4 - 6%).
Im Rahmen der vorliegenden Erfindung bedeutet „etwa“ eine Abweichung von ± 10%, wenn nicht anders angegeben.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei die Emulsion bei 20.000 PSI mit BSA in Wasser hergestellt wird und der Partikeldurchmesser in der Emulsion zwischen 50 nm und 400 nm, weiter bevorzugt zwischen 60 nm und 300 nm, optimalerweise zwischen 70 nm und 250 nm beträgt. Siehe dazu insbesondere Synthese 5, unten.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der mittlere Partikeldurchmesser in der Emulsion, hergestellt mit BSA, 92,5 nm ± 8,5 nm und die Sauerstofffreisetzung 3,99 pmol/mL ± 0,20 pmol/mL beträgt.
Besonders bevorzugt ist ein Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung, wobei der künstliche Sauerstoffträger ausschließlich aus den angegebenen Materialien hergestellt wird, bzw. Albumin und Lecithin als einzige Träger und/oder Emulgatoren vorhanden sind. Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen künstlichen Sauerstoffträger, der nach einem Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt ist.
Bevorzugt ist ein künstlicher Sauerstoffträger gemäß der vorliegenden Erfindung, bestehend aus etwa 5% Albumin, Perfluorodecalin (PFD) in einer Konzentration von etwa 17% und Lecithin in einer Konzentration von etwa 2% in einem Medium ausgewählt aus Wasser, Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, STEEN-Solution, OCS-Lösung, Ringer-Lösung und Hydroxy -Ethyl-Stärke.
Der künstliche Sauerstoffträger gemäß der vorliegenden Erfindung zeichnet sich dadurch aus, dass er eine höhere Stabilität gegenüber nicht Lecithin-haltigen künstlichen Sauerstoffträgem auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) aufweist. Dies kann insbesondere durch Messung der Viskosität, der Partikelgröße und -Verteilung des künstlichen Sauerstoffträgers bestimmt werden (siehe Beispiele).
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft einen synthetischen Blutersatz, umfassend den künstlichen Sauerstoffträger gemäß der vorliegenden Erfindung.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft die Verwendung des künstlichen Sauerstoffträgers gemäß der vorliegenden Erfindung als Perfusions- oder Transfusionslösung oder als synthetischen Blutersatz.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft den künstlichen Sauerstoffträger gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung in der Behandlung und Prävention von Sauerstoffmangel und/oder Blutmangel in einem Organ oderPatienten, insbesondere bei einem Menschen.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Behandlung und/oder der Prävention von Sauerstoffmangel und/oder Blutmangel in einem Organ oder Patienten, umfassend die Verwendung des künstlichen Sauerstoffträgers gemäß der vorliegenden Erfindung als Perfusions- oder Transfusionslösung oder als synthetischen Blutersatz, insbesondere bei einem Menschen. Die Zusammensetzung des erfindungsgemäßen Sauerstoffträgers (LENOX) besteht bevorzugt aus Albumin, Perfluorodecalin (PFD) und Lecithin in Wasser, wobei die Konzentration von Albumin zwischen 2-20 %, bevorzugt von 5-10 %, weiter bevorzugt von etwa 5%, die PFD- Konzentration zwischen 10-50% (bevorzugt 17%) und die Lecithin-Konzentration zwischen 1- 16% (bevorzugt 2%) beträgt. Der mittlere Partikel durchmesser beträgt mit BSA 92,5 nm ± 8,5 nm und die Sauerstofffreisetzung beträgt 3,99 pmol/mL ± 0,20 pmol/mL.
Die Zugabe von Lecithin führt zudem überraschenderweise zu wesentlich verbesserten physikochemischen Eigenschaften der so erhaltenen Nanopartikel gegenüber den bisherigen nur auf Albumin basierten OLF-Partikel. Die erfindungsgemäßen Sauerstoffträger (LENOX) sind deutlich kleiner, weniger polydispers und weniger trüb als die bisherigen OLF Sauerstoffträger (Abb. 1). Sie lassen sich insbesondere mit HSA als auch BSA synthetisieren und sind in einem größeren Temperaturbereich (-20 bis +100 °C) stabil.
Darüber hinaus weisen sie eine wesentlich geringere Viskosität als die OLF-Partikel auf (Abb. 2). Insbesondere sind die erfindungsgemäßen Sauerstoffträger jedoch langfristig kompatibel mit Ringer-Lösung, Sterofundin® ISO (Abbildung 3), Ringerfundin®, STEEN- Solution, OCS- Lösung und 6% HES (130/0,4) und lassen sich in diesen Lösungen direkt und stabil synthetisieren. Bisher war es beispielsweise nicht möglich, stabile Sauerstoffträger ohne weitere Hilfsstoffe in zugelassenen Volumenersatzlösungen wie beispielsweise Sterofundin® ISO zu synthetisieren.
Die erfindungsgemäßen Sauerstoffträgerweisen sehr gute Eigenschaften hinsichtlich Stabilität, Viskosität, Partikelgröße und Sauerstoffabgabe auf.
Die vorliegende Erfindung soll nun in den folgenden Beispielen mit Bezug auf die beigefügten Abbildungen weiter beschrieben werden, ohne jedoch hierauf beschränkt zu sein. Für die Zwecke der Erfindung werden alle zitierten Dokumente und Publikationen hiermit durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen. In den Abbildungen wird gezeigt:
Abbildung 1 : Viskositätskurve der OLF-Partikel im Vergleich zu den LENOX (Beispielssynthese I, HSA). Abbildung 2: Durchmesser (A) und Polydispersionsindex (B) der OLF-Partikel im Vergleich zu den LENOX (Beispielssynthese I, HSA).
Abbildung 3: Transmission der OLF-Partikel und der LENOX (Beispielssynthese I, HSA).
Abbildung 4: Durchmesser und Polydispersionsindex der OLF-Partikel und der LENOX, synthetisiert in Sterofundin® ISO (Beispielssynthese II).
Abbildung 5: Mikroskopiebilder der OLF-Partikel (Stand der Technik), synthetisiert in Ringer- Lösung (A), HES 6 % (B) und Sterofundin® ISO (C). Der verrauschte Hintergrund in Bild B und C deutet darauf hin, dass diese Emulsionen zerstört sind. Die Emulsion in Bild A ist noch intakt, zeigt jedoch Partikel > 1 pm. Die LENOX (Beispielssynthese I, BSA) sind im Mikroskop nicht sichtbar, da sie unterhalb der Auflösungsgrenze sind (D). Die Artefakte auf dem Bild D sind verursacht von Rückständen auf der Neubauerkammer und stammen nicht von den Emulsionstropfen.
Abbildung 6: Viskosität der OLF-Partikeln Vergleich zu den LENOX, synthetisiert in 6% HES (130/0,4) (Beispielssynthese IV).
Abbildung 7: Viskosität der OLF-Partikel und der LENOX (Beispielssynthese II) vor und nach einer Lagerung über 4 h bei 37 °C.
Beispiele
Abkürzungsverzeichnis
Lecithin-modifizierter Nanosauerstoffträger LENOX
(Lecithin-modified nano oxygen carrier)
Perfluordecalin PFD
AOC im Organ life fluid OLF
Hydroxy ethyl stärke HES
Universität Duisburg-Essen UDE bovines Serumalbumin BSA humanes Serumalbumin HSA
Perfluorcarbon basierte künstliche Sauerstoffträger PFOCs
(Perfluorocarbon-based oxygen carrier) Albumin basierte künstliche Sauerstoffträger A-AOCs (Albumin-based artificial oxygen carrier) Künstliche Sauerstoffträger AOC (Artificial oxygen carrier) 10./50./90. Perzentil dl0/d50/d90
Spanne der Partikelgrößenverteilung S
Materialien und Geräte:
Für die Synthesen der künstlichen Sauerstoffträger wurden Perfluordecalin HP (F2 Chemicals, Lancashire, UK), Millipore-Wasser (Q-Pod, Merck, Darmstadt, DE) und entweder Albumin Fraktion V (bovines Serumalbumin, Roth, Karlsruhe, DE) oder Albunorm (humanes Serumalbumin, Octapharma, Langenfeld, DE) mit einem Microfluidizer (LM20, Microfluidics, Waterloo, CAN) homogenisiert, nachdem mit einem Ultraturrax (IKA) eine Präemulsion hergestellt worden war.
Für den neu entwickelten Sauerstoffträger (LENOX) wurde noch zusätzlich Lecithin (97 %, Roth, Karlsruhe, DE) verwendet.
Als beispielhafte Salzlösungen wurden Sterofundin® ISO (B.Braun, Melsungen, DE), HES 6 % (Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE) und Ringer-Lösung (Fresenius Kabi, Bad Homburg, DE) verwendet.
Die Partikelgröße und der Polydispersionsindex wurde mittels dynamischer Lichtstreuung (Stabino Nano-flex, Particle Metrix, Inning am Ammersee, DE) bestimmt. Die Sauerstoffkapazität wurde mit einem Respirometer (O2k, Oroboros Instruments, Innsbruck, AUT) und die Trübung mit einem Photometer (Specord S600, Analytik) ena, Jena, DE) gemessen. Die Viskosität wurde mit einem Rheometer (MCR 92, Anton Paar, Ostfildern, DE) bestimmt. Es wurde die Viskosität bei zwei unterschiedlichen Scherraten bestimmt, da einige Emulsionen ein nicht Newton’ sches Verhalten aufwiesen. Dabei wurde eine sehr niedrige Scherrate (50/s) und eine physiologische Scherrate (645/s) gewählt.
Zur Visualisierung der Mikropartikel wurde ein Lichtmikroskop (AXIO Lab. Al, Zeiss, Oberkochen, DE) verwendet. Syntheseverfahren
Die Synthese der reinen Organ Life Fluid-Partikel (OLF -Partikel) entsprach der in der Patentanmeldung DE102021211272.2. Dafür wurden 20 mL Albumin (BSA oder HSA) und 4 mL PFD vorgelegt und mit einem Ultra-Turrax (T25 Basic, IKA-Werke, Staufen, DE) bei 9.500 Umdrehungen/min präemulgiert. Anschließend wurde die Präemulsion in den Mikrofluidizer gegeben, und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen einmal prozessiert.
Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert.
Synthese I-IV wird mit einem Druck von 30.000 PSI und eine Zyklusrate von acht Mal durchgeführt, ab Synthese V ändert sich der Druck auf 20.000 PSI und die Zyklusanzahl ändert sich auf sieben Mal.
Synthese I
Für die Synthese der LENOX wurden 20 mL einer 5 %-igen Albuminlösung (bovines Serum Albumin (BSA) oder humanes Serum Albumin (HSA)) und 4 mL PFD vorgelegt. Das 2- Phasen-Gemisch wurde mit 0,4 g Lecithin versetzt und mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 30.000 PSI (ca. 2068 bar) wird das gesamte acht Mal prozessiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert.
Synthese II
Für die Synthese der LENOX in Sterofundin® ISO wurden in 20 mL Sterofundin® ISO 1 g bovines Serumalbumin gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax bei 9.500 Umdrehungen/min präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben, und bei einem Druck von 30.000 PSI (ca. 2068 bar) wurde das gesamte Volumen acht Mal prozessiert. Während des Prozesses musste die Auslaufspule des Geräts und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert.
Synthese III
Für die Synthese der LENOX in Ringer-Lösung wurden in 20 mL Ringer-Lösung 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax bei 9.500 Umdrehungen/min präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben, und bei einem Druck von 30.000 PSI (ca. 2068 bar) wurde das gesamte Volumen acht Mal durch den Mikrofluidizer zyklisiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Geräts und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert.
Synthese IV
Für die Synthese der LENOXs in Hydroxy-Ethyl-Stärke (HES, 6 %) wurden in 20 mL HES (6 %) 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax bei 9.500 Umdrehungen/min präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben, und bei einem Druck von 30.000 PSI (ca. 2068 bar) wurde das gesamte Volumen achtmal prozessiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Geräts und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefülltem Gefäß gelagert.
Statistik:
Für die statistische Auswertung der Analysedaten wurde die Software OriginPro® (Version 2020) verwendet.
Die im Folgenden dargestellten Versuchsdaten sind die Mittelwerte der Gruppen ± Standardabweichung. Die Standardabweichung wird in Form von Fehlerbalken gezeigt. Um die statistische Signifikanz zwischen zwei Datensätzen zu ermitteln, wurde die Datensätze zunächst auf eine Normalverteilung, mittels Shapiro-Wilk-Test, untersucht. Da alle Datensätze normalverteilt waren, wurden ungepaarte t-Tests bzw. einseitige ANOVA-Test mit anschließender post hoc-Analyse durchgeführt. Als signifikant unterschiedlich gelten zwei Datensätze, bei denen sich der Mittelwert der Grundgesamtheit auf einem Fehlerniveau von *p < 0,05 von der Testdifferenz unterscheidet. Liegt ein signifikanter Unterschied vor, so wurden die beiden Datensätze wie folgt markiert: p < 0.05 (*), p < 0.01 (**), p < 0.001 (***) and p < 0.0001 (****). Beträgt das Fehlemiveau *p > 0,05, so sind die beiden Datensätze nicht signifikant unterschiedlich (ns). Alle Datensätze bestehen aus einem Stichprobenumfang von jeweils n = 3 Proben.
Ergebnisse
Die LENOX besitzen einen mittleren Partikeldurchmesser von 92,5 ± 8,5 nm (Synthese I, BSA) bzw. 123,5 ± 2,2 nm (Synthese I, HSA) und setzen 3,99 ± 0,2 pmol Sauerstoff pro mL Probe frei (bei 17 vol.%). Die Emulsion besitzt Eigenschaften eines Newton‘ sehen Fluids, dabei ändert sich die Viskosität nur minimal mit zunehmender Scherrate. Im Vergleich zu den LENOXs bilden die OLF -Partikel ein nicht-Newton‘sches Fluid, und die Viskosität ändert sich maßgeblich mit Änderung der Scherrate (siehe Abbildung 1).
Der mittlere Partikeldurchmesser und der Polydispersionsindex sind zwischen den OLF- Partikeln (HSA) und den LENOXs signifikant unterschiedlich. Bei den gemessenen Proben wurde ein durchschnittlicher Partikeldurchmesser von 1020,8 ± 85,9 nm für die OLF-Partikel und 123,5 ± 2,2 nm für die LENOX (Synthese I, HSA) gemessen (*p = 0,003). Mit einem Polydispersionsindex von 20,99 ± 1,33 ist die Emulsion der OLF-Partikel signifikant (*p = 0,031) polydisperser als die Emulsion der LENOX (Synthese I, HSA) mit einem Polydispersionsindex von 8,58 ± 3,28.
Ein optisch sichtbarer Unterschied zwischen der OLF-Emulsion und der LENOX-Emulsion ist die Trübung. Durch die Messung der Transmission beider Emulsionen konnte gezeigt werden, dass die LENOX-Emulsion (Synthese I, HSA) signifikant (*p < 0,001) durchlässiger ist für Licht mit einer Wellenlänge von 860 nm, als die OLF-Emulsion. Somit erscheint die OLF- Emulsion stark trüb, wohingegen die LENOXs-Emulsion klar erscheint.
Um die Anwendbarkeit in einem Perfusionsmedium zu untersuchen, wurden sowohl die OLF- Partikel als auch die LENOX in unterschiedlichen Perfusionsmedien (Ringer-Lösung, Sterofundin® ISO und HAES 6 %) synthetisiert. Bei der Synthese in Sterofundin® ISO konnten signifikante Unterschiede im mittleren Partikeldurchmesser (*p = 0,019) und im Polydispersionsindex (*p = 0,001) festgestellt werden. Diese Unterschiede sind vergleichbar mit den Unterschieden in Abbildung 2. Bei der Synthese mit Ringer-Lösung entstand sowohl mit den OLF -Partikeln als auch mit den LENOX eine intakte Emulsion. Jedoch waren die OLF-Partikel unter einem Lichtmikroskop sichtbar, die LENOX Partikel waren hingegen zu klein, um sie im Lichtmikroskop zu sehen. Die OLF-Partikel sind bei der Synthese in Ringer-Lösung somit deutlich größer als die LENOX-Partikel im gleichen Medium. Auf den Aufnahmen mit dem Lichtmikroskop von den OLF-Partikeln in HES 6 % und in Sterofundin® ISO ist ein starkes Hintergrundrauschen zu erkennen. Dies ist ein Zeichen für eine zerstörte Emulsion. Somit bilden sich keine stabilen OLF -Emulsionen in HES 6 % und in Sterofundin® ISO.
Dieses Verhalten spiegelt sich auch in der Viskosität wider. Beispielsweise ist die Viskosität in HES 6 % bei den OLF-Partikeln signifikant (*p = 0,031 bei 50/s und *p = 0,037 bei 650/s) höher als bei den LENOX (Synthese IV). In Abbildung 6 sind die Viskositäten in Abhängigkeit von zwei unterschiedlichen Scherraten angegeben, da die OLF-Partikel einen starken nicht-newtonschen Charakter haben.
Damit der Einfluss der Temperatur einer normothermen Perfusion (37 °C) auf die Emulsionen untersucht werden kann, wurden Proben der OLF-Partikel und der LENOX in Sterofundin® ISO (Synthese II) für 4 h bei 37 °C gelagert und die Viskosität vor und nach der Lagerung bestimmt. Dabei wurde ein signifikanter (*p > 0,001, *p = 0,003, *p = 0,007) Unterschied zwischen den beiden Emulsionen festgestellt. Die OLF-Partikel besitzen sowohl vor als auch nach der Lagerung eine deutlich höhere Viskosität als die LENOX. Lediglich nach der Lagerung bei einer Scherrate von 650/s sind beide Emulsionen nicht signifikant unterschiedlich zueinander (*p = 0,056).
Zusammenfassung:
LENOX sind deutlich kleiner, weniger polydispers und weniger trüb als die OLF-Partikel.
LENOX lassen sich sowohl mit HSA als auch BSA synthetisieren.
LENOX sind stabiler bei verschiedenen Temperaturen (-20 bis +100 °C).
LENOX sind kompatibel mit Ringer-Lösung, Sterofundin® ISO, STEEN-Solution, OCS- Lösung und HAES 6 %, OLF-Partikel zeigen in vielen dieser Lösungen ein inkompatibles Verhalten (Viskosität, Stabilität etc.).
Weitere Versuche Methoden
Dynamische Lichtstreuung
Die Partikelgrößenverteilung wurde durch dynamische Lichtstreuung (DLS) mit Nano-flex (Microtrac) bestimmt. Die Brechungsindizes wurden aus früheren Arbeiten übernommen. Die Hoch- und Tieftemperaturviskosität wurde für jede Charge und jeden Versuch einzeln bestimmt. Nach einer Nullmessung für 300 s mit Wasser wurde 1 ml der Probe in ein 2-mL- Reaktionsgefäß gefüllt und dreimal für 300 s gemessen.
Zur Analyse der Daten wurden die Perzentile dlO, d50 und d90 bestimmt. Außerdem wurde die Spannweite (S) der Partikelgrößenverteilung mit Gleichung (1) berechnet.
Viskosität
Ein Rheometer (MCR 92, Anton Paar) wurde zur Messung der schergeschwindigkeitsabhängigen Viskosität verwendet. Zur Einrichtung und Kalibrierung des Geräts wurde der softwareinterne Kalibrierungsprozess verwendet. Für die Messung wurde 1 mL der Probe auf den Messtisch gegeben und das System in den Messmodus versetzt. Das System wurde auf 20 °C aufgeheizt und die Viskosität bei verschiedenen Schergeschwindigkeiten gemessen. Unmittelbar nach der ersten Messung wurde das System auf 37 °C aufgeheizt und die Messung zur Bestimmung der Hochtemperaturviskosität wiederholt.
Sauerstofffreisetzung
Die Messung der Sauerstofffreisetzung erfolgte mit einem SDR SensorDish Reader (PreSens) unter hypoxischen Bedingungen. Dazu wurden 0,5 ml Wasser oder Salzlösung pro Vertiefung in einer speziellen, mit Sauerstoffsensoren ausgestatteten 24-Well-Platte (OxoDish OD 24, PreSens) zubereitet. Diese Platte wurde unter einer Hypoxie-Workstation (whitley H35) (1 % O2, 5 % CO2, 94 % N2) gelagert, bis sich der Sauerstoffgehalt nicht mehr veränderte. 2,5 mL der Probe wurden in einen gasdichten Kolben überführt und 15 Minuten lang mit 100 % O2 bei einem Gasfluss von 0,5 mL/min oxygeniert. 0,5 ml der zuvor mit Sauerstoff angereicherten Probe wurden in jede Vertiefung gegeben, und die Sauerstoffabgabe wurde gemessen, bis der Wert wieder den Ausgangswert erreichte.
Zeta-Potential Das Zetapotenzial wurde durch Streampotenzialmessung (Stabino Zeta, Microtrac) bestimmt. Für die Zeta-Potenzial-Messungen wurde 1 ml der Probe in den spezifischen Messkolben gefüllt und der Kolben an das Messsystem (Stabino, Microtrac) angeschlossen. Die Probe wurde zehnmal für je 10 s gemessen und die Ergebnisse wurden gemittelt.
Weitere Synthesen
Synthese V
Für die Synthese der LENOX wurden 20 mL einer 5 %-igen Albuminlösung (bovines Serum Albumin (BSA) oder humanes Serum Albumin (HSA)) und 4 mL PFD vorgelegt. Das 2- Phasen-Gemisch wurde mit 0,4 g Lecithin versetzt und mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen siebenmal prozessiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert.
Synthese VI
Für die Synthese der LENOX in Hydroxy-Ethyl-Stärke (HES, 6 %) wurden in 20 mL HES (6 %) 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen siebenmal prozessiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert.
Synthese VII
Für die Synthese der LENOX in Natriumchlorid (NaCl, 0,9 %) wurden in 20 mL NaCl (0,9 %) 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen sieben Mal durch den Mikrofluidizer zyklisiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert.
Synthese VIII
Für die Synthese der LENOX in Ringer-Lösung wurden in 20 mL Ringer-Lösung 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen sieben Mal durch den Mikrofluidizer zyklisiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert.
Synthese IX
Für die Synthese der LENOX in STEEN Solution wurden zu 20 mL STEEN Solution zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra- Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen sieben Mal durch den Mikrofluidizer zyklisiert. Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert.
Synthese X
Für die Synthese der LENOX in Sterofundin ISO wurden in 20 mL Sterofundin ISO 1 g bovines Serumalbumin (BSA) gelöst. Dieser Lösung wurden zuerst 4 mL PFD und anschließend 0,4 g Lecithin zugegeben. Das Gemisch wurde mit einem Ultra-Turrax (9.500 Umdrehungen/min) präemulgiert. Die Präemulsion wurde dann in den Mikrofluidizer gegeben und bei einem Druck von 20.000 PSI (ca. 1379 bar) wurde das gesamte Volumen siebenmal durch den Mikrofluidizer zyklisiert Während des Prozesses muss die Auslaufspule des Gerätes und somit auch das Produkt mit Eis gekühlt werden. Nach der Homogenisation wurde das Produkt für mindestens 30 min in einem mit Eis gefüllten Gefäß gelagert.
Basisdaten der Synthesen Die nachfolgenden Daten beziehen sich jeweils auf eine unverdünnte Synthese, so, wie sie aus dem Mirkofluidizer resultiert.
Synthese V
Partikel größenverteilun :
In nachfolgender Tabelle steht d für den hydrodynamischen Durchmesser der Partikel und S für die Spannbreite der Partikelgrößenverteilung. dlO bedeutet, dass 10% der gemessenen Partikel genau gleich groß oder kleiner als der angegebene Partikeldurchmesser sind, d50 entsprechend 50% und d90 entsprechend 90%. dlO 75 nm bedeutet also, dass 10% der gemessenen Partikel 75 nm oder kleiner waren.
Zeta-Potential: -72,9 ± 0,7 mV
Viskosität (bei 200 s'1):
20 °C: 1,85 ± 0,10 mPa-s (n = 6)
37 °C: 1,21 ± 0,07 mPa-s (n = 6)
Sauerstofffreisetzung: 309 ± 94 hPa (n = 6)
Langzeitstabilität
LENOX wurde in vollständig gefüllten 2-mL-Reaktionsgefäßen stehend bei 4 °C gelagert. Die Emulsion wurde alle 7 Tage über einen Zeitraum von 42 Tagen analysiert. Jede Charge LENOX wurde auf sechs Reaktionsgefäße aufgeteilt, so dass jeden Tag ein geschlossenes Gefäß verwendet wurde und die bereits geöffneten Gefäße verworfen wurden.
Viskosität:
Partikelgrößenverteilung :
S auer stofffrei Setzung Tag 0: 309 ± 94 hPa Tag 42: 379 ± 75 hPa
LENOX in verschiedenen Perfusionslösungen
Die Kompatibilität von LENOX mit klinisch relevanten kristalloiden und kolloidalen Lösungen ist für eine mögliche Anwendung unabdingbar. Kolloidale Volumenersatzlösungen finden in der klinischen Anwendung nur noch in Ausnahmesituationen Anwendung, sind aber in der präklinischen Forschung weit verbreitet. Aus diesem Grund wurden LENOX in verschiedenen Lösungen synthetisiert und analysiert.
Synthese VI, Synthese VII, Synthese VIII, Synthese IX und Synthese X
Partikelgröße Viskosität (bei 200 s'1)
S auer stofffrei Setzung :
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Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Herstellung von künstlichen Sauerstoffträgern auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs), umfassend a) Bereitstellen einer geeigneten wässrigen Albuminlösung und Mischen mit mindestens einem geeigneten künstlichen Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen, b) Geeignetes Hinzufügen von Lecithin, c) Präemulgation durch schnelles Rühren unter geeigneter Kühlung, d) Emulgieren der Präemulsion aus Schritt c) unter Druck über einen Mikrofluidizer unter geeigneter Kühlung und anschließender Lagerung für mindestens 30 min ebenfalls unter geeigneter Kühlung.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Albumin geeignet in einem wässrigen Puffer, Wasser, einer ausbalancierten Vollelektrolytlösung für die Infusionstherapie, wie z.B. Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, STEEN- Solution, OCS-Lösung, Ringer-Lösung oder Hydroxy-Ethyl- Stärke gelöst wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei der künstliche Sauerstoffträger auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Perfluordecalin, Perfluordecylbromid, Perfluortributylamin, Perfluormethylcyclohexylpiperidin, Perfluordichloroctan, Perfluortertbutylcyclohexan, Perfluor- 15-kronen-5-ether, Dodecafluorpentan, Perfluoroctylbromid und Perfluorocyclohexan.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Albumin ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Säugetier-Albumin, humanem Serumalbumin (HSA) und bovinem Serumalbumin (BSA), oder Derivaten davon.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Präemulgation durch schnelles Rühren mit einem Homogenisator bei zwischen 8000 und 12000 Umdrehungen/min, wie z.B. einem Ultra-Turrax® bei 9.500 Umdrehungen/min durchgeführt wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Emulgieren der Präemulsion bei einem Druck zwischen 10.000 PSI (ca. 689 bar) und 40.000 PSI (ca. 2758 bar), bevorzugt bei
30.000 PSI (2068 bar) stattfindet und gegebenenfalls mehrfach wiederholt wird, bevorzugt zwischen 1 und 12, weiter bevorzugt zwischen 5 und 10, noch weiter bevorzugt 8 mal wiederholt wird.
7. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei die Kühlung bei unter 4°C, bevorzugt auf Eis durchgeführt wird.
8. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 7, wobei Albumin in einer Konzentration zwischen 2-20 %, bevorzugt von 5-10 %, weiter bevorzugt von etwa 5%, Perfluordecalin (PFD) in einer Konzentration zwischen 10-50%, bevorzugt von 17%, Lecithin in einer Konzentration zwischen 1-16%, bevorzugt von 2%, in Wasser emulgiert werden.
9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei die Emulsion bei 20.000 PSI mit BSA in Wasser hergestellt wird und der Partikeldurchmesser in der Emulsion zwischen 50 nm und 400 nm, weiter bevorzugt zwischen 60 nm und 300 nm, optimalerweise zwischen 70 nm und 250 nm beträgt.
10. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 9, wobei der mittlere Partikel durchmesser mit BSA 92,5 nm ± 8,5 nm und die Sauerstofffreisetzung 3,99 pmol/mL ± 0,20 pmol/mL beträgt.
11. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei der künstliche Sauerstoffträger ausschließlich aus den angegebenen Materialien hergestellt wird.
12. Künstlicher Sauerstoffträger, der nach einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 11 hergestellt ist.
13. Künstlicher Sauerstoffträger nach Anspruch 12, bestehend aus 5% Albumin, Perfluorodecalin (PFD) in einer Konzentration von 17% und Lecithin in einer Konzentration von 2% in einem Medium ausgewählt aus folgenden Medien: Wasser, Sterofundin® ISO, Ringerfundin®, STEEN- Solution, OCS-Lösung, Ringer-Lösung oder Hydroxy -Ethyl-Stärke.
14. Künstlicher Sauerstoffträger nach Anspruch 12 oder 13, der eine höhere Stabilität gegenüber nicht Lecithin-haltigen künstlichen Sauerstoffträgern auf Basis von Perfluorkohlenwasserstoffen (PFOCs) aufweist, wie durch erhöhte Viskosität des künstlichen Sauerstoffträgers bestimmt.
15. Synthetischer Blutersatz, umfassend den künstlichen Sauerstoffträger nach einem der Ansprüche 12 bis 14.
16. Verwendung des künstlichen Sauerstoffträgers nach einem der Ansprüche 12 bis 14 als Perfusions- oder Transfusionslösung oder als synthetischer Blutersatz.
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