EP4544038A1 - Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen - Google Patents

Verfahren und kit zur manuellen und automatisierten probenvorbereitung von long-read-sequenzierungen

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Publication number
EP4544038A1
EP4544038A1 EP23750915.3A EP23750915A EP4544038A1 EP 4544038 A1 EP4544038 A1 EP 4544038A1 EP 23750915 A EP23750915 A EP 23750915A EP 4544038 A1 EP4544038 A1 EP 4544038A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dna
library
rough
polyethylene glycol
lysis
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23750915.3A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Timo Hillebrand
Elmara Graser
Kristin WESSEL
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
IST Innuscreen GmbH
Original Assignee
IST Innuscreen GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by IST Innuscreen GmbH filed Critical IST Innuscreen GmbH
Publication of EP4544038A1 publication Critical patent/EP4544038A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1003—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor
    • C12N15/1006—Extracting or separating nucleic acids from biological samples, e.g. pure separation or isolation methods; Conditions, buffers or apparatuses therefor by means of a solid support carrier, e.g. particles, polymers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1034—Isolating an individual clone by screening libraries
    • C12N15/1093—General methods of preparing gene libraries, not provided for in other subgroups
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Definitions

  • NGS New Generation Sequencing
  • the goal of comprehensive genome sequencing is not only to identify specific target sequences (pathogen detection, mutation detection, etc.), but also to extensively clarify the entire sequence of an organism.
  • new sequencing technologies e.g. nanopore sequencing; Oxford Nanopore Technologies
  • the focus is on the length of the sequenced genome sections: the larger the sequencing reading distances are, the easier and more resource-saving is the bioinformatic analysis of the generated sequences and their assignment to the entire genome .
  • transposase fragmentation based DNA Libraries DNA libraries
  • DNA libraries transposase fragmentation based DNA Libraries
  • the adapters coupled to the so-called motor protein are connected.
  • the unbound adapters must be removed from the library so that they do not unnecessarily overload the capacities of the sequencing pores.
  • This purification must be carried out without isopropanol or ethanol etc. so that the motor protein is not destroyed. This means that it is not possible to use known classical purification processes, which are known to work highly efficiently and quickly (e.g. binding of DNA to solid phases using ethanol or isopropanol and using washing buffers containing isopropanol or ethanol).
  • a kit from Circulomics (Matthew W. Mitchell et al. High molecular weight DNA extraction and long-read next-generation sequencing of human genomic reference standards. ASHG Virtual Meeting 2020) is commercially available.
  • a Circulomix Nanobind disc is added to the prepared library and bound to the disc using an alcohol-free binding buffer, washed alcohol-free and then eluted.
  • This kit is very expensive. Beyond that, he can't can be used for the previous extraction of high molecular weight DNA. For this you need another kit. The process is also not automated.
  • the state of the art also includes the two German patent applications DE 10 2017 204 267 Al and DE 10 2015 216 558 Al as well as the corresponding patent applications WO2018/167138 Al, EP3596215 Al, US20200255820 Al, and the German patent no. DE 10 2017 204 267 B4 on the one hand and on the other hand the publications WO2016/169678 Al and the patents US 10,934,540 B2 and EP 3 286 325 AL DE 10 2017 204 267 Al describe the detachment of DNA bound to glass particles with a washing solution.
  • DE 10 2015 216 558 A1 discloses the use of a rough surface for binding nucleic acids.
  • the invention was based on the object of providing a simple and, above all, rapid method for purifying generated libraries for nanopore sequencing and, moreover, of generally having a method and a kit that enables the entire sample preparation for nanopore sequencing (extraction of high molecular weight DNA and purification of the DNA library).
  • the process should be able to be carried out manually and also automatically.
  • the invention preferably uses the possibility of adsorbing DNA known, among other things, from the patent documents (US 10,851,368 B2; US 10,704,039 B2; US 10,936,540 B2). on rough or structured surfaces. These patents describe the adsorption of DNA on rough or structured surfaces of nucleic acid released after lysis in the presence of (preferably) ethanol or isopropanol, the subsequent washing of the nucleic acids with ethanol-containing buffers and the final detachment of the nucleic acids using a low-salt buffer or using water. However, there is no indication of purifying DNA for the production of a library for subsequent nanopore sequencing using the Ultra-Long DNA Sequencing Kit (SQK-ULK001; Oxford Nanopore Technologies).
  • alcoholic components such as ethanol or isopropanol must not be used, as these components would lead to the denaturation of the motor protein coupled to the adapters. Therefore, there was a need for a method that allows efficient adsorption of the long-chain DNA fragments of the DNA library produced without the use of ethanol or isopropanol.
  • ethanol or isopropanol is always used to adsorb the DNA.
  • the washing buffers must also not contain these components.
  • a combination of polyethylene glycol (a polyether) with a monovalent or multivalent salt is ideal for adsorbing the DNA fragments on known rough or structured surfaces.
  • the adsorbed fragments are then washed using the method according to the invention without the alcohol-containing washing buffer previously used. It turns out that a washing buffer using a Tris solution is completely sufficient for this. This washing buffer also has the advantage that alcohol removal is no longer necessary.
  • the process which is based on the new components according to the invention, is very simple and quick.
  • the same materials that are known from the patent specifications listed can be used as rough or structured surfaces.
  • magnetic plastic materials of different shapes and sizes with rough surfaces are preferably used.
  • roughened plastic materials are used, which are normally used for the separation of magnetic beads in commercially available extraction machines. These machines are so-called walk-away platforms that use plastic combs to separate magnetic beads.
  • a globally known system in this regard is the so-called Magnetic Particle Processor “KingFisher” from Thermo.
  • KingFisher Magnetic Particle Processor
  • the plastic combs are slightly roughened. This then enables the DNA fragments to be directly adsorbed onto the plastic combs using the method according to the invention.
  • polyethylene glycol and a monovalent or divalent salt are added to the reaction mix in a reaction vessel and brought into contact with a material with a rough or structured surface, which is preferably magnetic or paramagnetic.
  • the vessel is carefully inverted several times so that the long-chain DNA fragments are not sheared.
  • the DNA fragments adsorb on the surface.
  • the vessel is placed in a magnetic rack.
  • the rough material is fixed and the supernatant is poured off.
  • a washing buffer without ethanol or isopropanol is then added, preferably a Tris buffer is used, the vessel is left in the magnet rack and carefully inverted a few times.
  • the supernatant is poured off.
  • the washing step is repeated one more time.
  • ddEEO double-distilled water
  • the purification is also carried out using the reagents described.
  • the DNA fragments are adsorbed onto the plastic combs by slowly moving the comb vertically into the reaction cavity in which the reaction mixture is located. After the adsorption step has been completed, the comb moves into the cavity with the washing buffer. Washing is done by briefly dipping the comb into the buffer. The washing step is repeated. In the final step, the DNA is dissolved in water again. This is done by a slow dipping and rising movement of the comb. The dissolved DNA can then be used immediately for nanopore sequencing or stored in the refrigerator for later use.
  • the automated purification is also completed in less than an hour.
  • the method and means according to the invention therefore provide a very simple, efficient and rapid option which allows DNA fragments of a generated DNA library to be purified for subsequent nanopore sequencing.
  • the process can be carried out automatically or manually.
  • Another advantage was revealed when a mixture of polyethylene glycol and monovalent or multivalent salts was used to adsorb DNA onto rough surfaces.
  • the method is suitable not only for the purification of the DNA library, but also for the extraction of high molecular weight DNA, which is required for the production of the DNA library.
  • the purification of high molecular weight DNA is usually laborious and time-consuming. Automated applications are hard to find commercially.
  • Another significant disadvantage is that the available methods and reagents or kits used for the extraction of high molecular weight DNA and the necessary purification of libraries prepared for sequencing differ. There is no kit that allows both procedures to be implemented.
  • kits to both isolate high molecular weight DNA from a biological sample and to enable the library to be purified.
  • the person skilled in the art would be aware of the advantage of the availability of such a solution.
  • Such a kit only requires additional reagents for sample lysis (lysis buffer and proteolytic enzyme) and, if necessary, a washing buffer, which can also contain an ethanol-containing component.
  • a kit for a manual extraction of high molecular weight DNA from a biological sample and the subsequent purification of the library would contain the following components:
  • the high molecular weight DNA can be used directly to produce a DNA library for nanopore sequencing. It is of course also possible to store the DNA properly afterwards and use it at a later date.
  • the DNA can now be applied directly to the flow cell for sequencing, but can also be stored and used at a later point in time.
  • the combined extraction of high molecular weight DNA and the subsequent purification of the library can be implemented automatically. This is done using the already described use of walk-away platforms using rough plastic combs. The procedure is easy to carry out and very quick. In addition, very long fragments can be sequenced using nanopore sequencing. This is a very important quality feature.
  • the vessel was inverted twice and the Tris solution was poured off. This final washing step with a solution that does not contain ethanol means that a final drying step to completely remove ethanol is no longer necessary.
  • the DNA on the beads was dissolved after adding 200 ⁇ l of ddH2O, whereby the vessel was incubated for approx. 30 min at 300 rpm and a temperature of 37°C.
  • the high molecular weight DNA was transferred to a new vessel using a wide-bore pipette tip and carefully pipetted up and down several times.
  • the DNA was measured spectrophotometrically and an amount of 45 pg of DNA in a volume of 400 ⁇ l was used for further nanopore sequencing using the Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies). After the DNA library has been prepared, it is necessary to remove excess adapters. This was done below using the method according to the invention. For this purpose, a PEG solution (40%) and magnesium chloride solution (400 mM) as well as roughened paramagnetic plastic beads were added to the mixture. The vessel was then carefully inverted 30 times by 180° to adsorb the high molecular weight DNA onto the rough surface of the paramagnetic beads. The vessel was then placed in a magnetic rack to fix the beads and the reaction mixture was poured out.
  • Embodiment 2 Automated extraction of high molecular weight DNA from blood for subsequent nanopore sequencing using the Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) including purification of the generated DNA library using a walk-away platform (KingFisher Flex; Thermo )
  • the comb After the adsorption step of the high-molecular-weight DNA has been completed, the comb successively moves into the deep well plate cavities with the washing buffers, with the high-molecular-weight DNA being extracted being washed with a washing buffer containing ethanol. The final washing step is then carried out again with a Tris solution.
  • the high-molecular DNA was transferred from the cavity of the deep-well plate into a new vessel using a wide-bore pipette tip and carefully pipetted up and down several times. The DNA was measured spectrophotometrically and an amount of 45 pg of DNA in a volume of 400 ⁇ l was used for further nanopore sequencing using the Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies).
  • Example 1 After DNA Library production was then carried out using the reagents already listed in Example 1, which automated the purification of the DNA library in order to remove the excess adapters. During the automated purification of the DNA library, only the Tris solution is used for washing. Washing is done by briefly dipping the comb into the respective buffer. In the final step, the DNA is dissolved in water again. This is done by a slow dipping and rising movement of the comb. After the automated extraction of high molecular weight DNA, the preparation of the DNA library and the automated purification of the DNA library, the sample is transferred to the Minion device (Oxford Nanopore Technologies) to carry out long-read sequencing.
  • Minion device Olford Nanopore Technologies
  • reading lengths can be achieved using the method according to the invention of combining automated extraction of high molecular weight DNA and purification of the DNA library (reading lengths of up to > 300,000 base pairs).
  • the entire procedure is completed in approximately 2 hours, allowing sequencing to begin on the same working day.
  • the procedure is very easy to carry out.
  • Alcohols with only one OH group such as ethanol or isopropanol
  • polyethers also polyalkylene glycols
  • polyether polyols polyalkylene oxides
  • examples of this group of polymeric ethers are polyethylene glycol and polypropylene glycol.
  • DNA with greater than or equal to 100,000 bp DNA with greater than or equal to 100,000 bp.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren und Kit zur Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe und / oder die Aufreinigung einer DNA-Library, wobei nach ggf. Lyse der biologischen Probe und / oder nach Herstellung der DNA-Library der Ansatz mit einer Kombination aus einem Polyether, vorzugsweise Polyethylenglycol, und mindestens einem Salz, vorzugsweise Magnesiumchlorid, sowie in Abwesenheit einwertiger Alkohole in Kontakt gebracht wird, wobei anschließend die DNA an eine feste Phase gebunden und anschließend die DNA ohne Verwendung einwertiger Alkohole gereinigt wird. Das Verfahren kann manuell oder automatisch durchgeführt werden.

Description

VERFAHREN UND KIT ZUR MANUELLEN UND AUTOMATISIERTEN
PROBENVORBEREITUNG VON LONG-READ-SEQUENZIERUNGEN
Stand der Technik
[0001] Die Technologie New Generation Sequencing (NGS) gewinnt immer stärker an Bedeutung in Naturwissenschaften, Medizin und anderen anliegenden Gebieten. Das Ziel der umfassenden Genom- Sequenzierung liegt dabei nicht nur in der Identifikation von bestimmten Zielsequenzen (Erregernachweis, Mutationsnachweis etc.), sondern auch in einer weitgehenden Aufklärung der Gesamtsequenz eines Organismus. Logischerweise steht bei solchen Fragestellungen unter Verwendung dieser neuen Sequenzierungstechnologien (z.B. Nanoporensequenzierung; Oxford Nanopore Technologies) die Länge der sequenzierten Genomabschnitte im Vordergrund: je größer die Sequenzierungs-Leseweiten sind, desto einfacher und ressourcensparender ist deren bioinformatische Analyse der erzeugten Sequenzen und deren Zuordnung zum Gesamtgenom.
[0002] Auf dem Markt befinden sich z.Z. eine Reihe von Sequenzierplattformen mit einer unterschiedlichen Fähigkeit, längere DNA -Fragmente zu erfassen. So können z.B. mittels der Nanopore-Sequenzierplattform der Fa. Oxford Nanopore Technologies ohne eine Pre- Amplifizierung unter der Voraussetzung qualitativ hochwertiger hochmolekularer DNA, Sequenzierungen von Fragmenten in Megabasen-Länge erfolgen (Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001).
[0003] Für den Erfolg des gesamten Sequenzierungsprozesses reicht aber die theoretische Möglichkeit, längere Fragmente zu sequenzieren, nicht aus. Sowohl die DNA-Probe sollte ursprünglich die erforderliche DNA-Fragment-Länge beinhalten als auch sollte diese DNA in der erforderlichen Menge nach der sogenannten Tagmentation (Herstellung einer DNA- Library für die nachfolgende Nanoporensequenzierung) wieder zu gewinnen sein. Für die Vorbereitung der DNA-Probe werden von Oxford Nanopore Technologies die Monarch HMW DNA Extraction Kits (New England Biolabs) empfohlen. Der gesamte Zeitaufwand wird im Protokoll auf 100 Minuten eingeschätzt. Diese Methode ist aber nicht für die Wiederaufarbeitung der DNA nach der Tagmentation geeignet. Die Kits basieren auf der Bindung von hochmolekularer DNA an Glaskugeln. Das Verfahren benötigt aber alkoholische Komponenten (Isopropanol und Ethanol) sowohl für die Bindung der DNA als auch für die notwendigen Waschschritte. Das Problem liegt darin, dass zur Durchführung einer Sequenzierung der ultralangen DNA sog. Transposase-Fragmentierung basierte DNA- Bibliotheken (DNA-Libraries) hergestellt werden. Nach der Fragmentierung der DNA mit Transposasen, begleitet von einem simultanen Einbau von Transposon-Sequenzen, erfolgt die Anbindung der mit dem sogenannten Motor-Protein gekoppelten Adaptoren. Nach der Erzeugung dieser DNA Library müssen die nichtgebundenen Adaptoren von der Bibliothek entfernt werden, damit diese die Kapazitäten der Sequenzierporen nicht unnötig überlasten. Diese Aufreinigung muss zwingend ohne Isopropanol oder Ethanol etc. erfolgen, damit das Motor-Protein nicht zerstört wird. Das bedeutet, dass es nicht möglich ist, bekannte klassische Aufreinigungsverfahren zu nutzen, welche bekannter Weise hoch effizient und schnell funktionieren (z.B. Bindung der DNA an feste Phasen unter Vermittlung von Ethanol oder Isopropanol und unter Verwendung von Isopropanol oder Ethanol enthaltenden Waschpuffern).
[0004] Für die Aufreinigung einer DNA Library für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung empfiehlt die Fa. ONP die Durchführung einer Spermin-Fällung (Zeitaufwand ca. 12 Stunden). Hierfür wird empfohlen, eine 16,8 millimolare Spermin- Lösung herzustellen und diese 1 : 1 mit der vorbereiteten DNA-Bibliothek zu vermischen. Nach einer Rotator-Mixer-Inkubation wird die Probe zentrifugiert, um das DNA-Pellet zu erzeugen. Das Pellet soll mindestens 12 Stunden in einem Elution Buffer gelöst werden. Das Problem dieser Methodik liegt dabei am Verhältnis zwischen der Spermin - und DNA- Konzentration. Je niedriger die DNA -Konzentration ist, desto höher soll die Spermin- Konzentration sein (E. Raspaud et al. Precipitation of DNA by Polyamines: A Poly electrolyte Behavior, Biophysical Journal 1998). Somit führt die geringste Abweichung der angegebenen DNA-Konzentration zu einer ineffizienten Fällungsreaktion und damit zum Verlust an DNA. Eine Erhöhung der Spermin-Konzentration führt dann wieder zum Risiko einer potenziellen „Verstopfung“ der Sequenzierporen. Darüber hinaus macht eine über 12 Stunden dauernde Resuspension der pelletierten DNA es unmöglich, das Experiment an einem Tag vorzubereiten.
[0005] Beschrieben sind alternative Varianten zur Aufreinigung einer DNA Library für die Nanoporensequenzierung. Kommerziell verfügbar ist ein Kit der Fa. Circulomics (Matthew W. Mitchell et al. High molecular weight DNA extraction and long-read nextgeneration sequencing of human genomic reference standards. ASHG Virtual Meeting 2020). Eine Circulomix Nanobind-Disc wird zu der vorbereiteten Bibliothek zugegeben und mittels eines alkoholfreien Bindungspuffers an die Disk gebunden, alkoholfrei gewaschen und anschießend eluiert. Auch hier soll mindestens 12 Stunden gewartet werden, bevor die DNA für die Sequenzierung eingesetzt werden kann. Dieser Kit ist sehr teuer. Darüber hinaus kann er nicht für die vorhergehende Extraktion hochmolekularen DNA eingesetzt werden. Dazu benötigt man einen weiteren Kit. Auch ist das Verfahren nicht automatisiert umgesetzt.
[0006] Eine weitere publiziert Methode zur Aufreinigung der DNA Library basiert auf der Verwendung von Hexamminecobalt (III) Chlorid und Glasbeads (Inswasti Cahyani et al. FindingNemo in OneDay: Ultra-Long ONT Library Preparation from Cell to Flowcell in One Day, ww . protocol s . i o) .
[0007] Zum Stand der Technik zählen auch die beiden deutschen Patentanmeldungen DE 10 2017 204 267 Al und DE 10 2015 216 558 Al sowie die entsprechenden daraus hervorgegangenen Patentanmeldungen WO2018/167138 Al, EP3596215 Al, US20200255820 Al, das deutsche Patent Nr. DE 10 2017 204 267 B4 einerseits und anderseits die Druckschriften WO2016/169678 Al und die Patente US 10,934,540 B2 und EP 3 286 325 AL DE 10 2017 204 267 Al beschreibt die Ablösung von an Glaspartikel gebundener DNA mit einer Waschlösung. In DE 10 2015 216 558 Al wird die Verwendung einer rauen Oberfläche zur Anbindung von Nukleinsäuren offenbart.
[0008] Keine dieser aufgeführten Methoden liefert aber eine ganzheitliche Lösung für die Probenvorbereitung für Nanoporensequenzierung (Extraktion hochmolekularer DNA und Aufreinigung der DNA-Library nach Tagmentation). Dies sowohl in Form einer manuellen Umsetzung als auch in Form eines automatisierten Protokolls.
Aufgabe der Erfindung
[0009] Der Erfindung lag die Aufgabe zugrunde, ein einfaches und vor allem schnelles Verfahren zur Aufreinigung erzeugter Bibliotheken für die Nanoporensequenzierung bereitzustellen bzw. darüber hinaus generell ein Verfahren und einen Kit zu haben, der die gesamte Probenvorbereitung für eine Nanoporensequenzierung ermöglicht (Extraktion hochmolekularer DNA und Aufreinigung der DNA Library). Dabei sollte das Verfahren manuell und auch automatisiert durchgeführt werden können.
Lösung der Aufgabe
[0010] Überraschenderweise kann die Aufgabe mittels der vorliegenden Erfindung in idealer Weise gemäß den Merkmalen der Patentansprüche gelöst werden.
[0011] Die Erfindung nutzt vorzugsweise die u.a. aus den Patent-Schriften (US 10,851,368 B2; US 10,704,039 B2; US 10,936,540 B2) bekannte Möglichkeit der Adsorption von DNA an rauen oder strukturierten Oberflächen. Diese Patentschriften beschreiben die Adsorption von DNA an raue oder strukturierte Oberflächen von nach Lyse freigesetzter Nukleinsäure in Anwesenheit von (vorzugsweise) Ethanol oder Isopropanol, dem nachfolgenden Waschen der Nukleinsäuren mit ethanolhaltigen Puffern und der finalen Ablösung der Nukleinsäuren mittels eines Niedrigsalzpuffers bzw. mittels Wasser. Es findet sich aber kein Hinweis darauf, DNA für die Herstellung einer Bibliothek für die nachfolgende Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit (SQK-ULK001; Oxford Nanopore Technologies) aufzureinigen. Hierbei besteht die Schwierigkeit darin, dass alkoholische Komponenten wie Ethanol oder Isopropanol nicht eingesetzt werden dürfen, da diese Komponenten zur Denaturierung des an die Adaptoren gekoppelten Motor-Proteins führen würden. Deshalb bedurfte es eines Verfahrens, welches eine effiziente Adsorption der erzeugten langkettigen DNA-Fragmente der hergestellten DNA-Bibliothek ohne die Verwendung von Ethanol oder Isopropanol erlaubt. In den schon obig zitierten Patentschriften wird für die Adsorption der DNA immer Ethanol oder Isopropanol eingesetzt. Auch dürfen die Waschpuffer diese Komponenten nicht enthalten. Überaschenderweise eignet sich eine Kombination von Polyethylenglycol (ein Polyether) mit einem monovalenten oder auch multivalenten Salz in hervorragender Weise zur Adsorption der DNA- Fragmente an bekannte raue oder strukturierte Oberflächen. Die adsorbierten Fragmente werden mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens dann ohne die bisher Verwendung findenden alkoholhaltigen Waschpuffer gewaschen. Es zeigt sich, dass ein Waschpuffer unter Verwendung einer Tris- Lösung völlig ausreichend dafür ist. Dieser Waschpuffer hat darüber hinaus auch den Vorteil, dass eine Alkoholentfernung nicht mehr notwendig ist. Das Verfahren, welches auf den erfindungsgemäßen neuen Komponenten basiert, ist sehr einfach und schnell. Als raue oder strukturierte Oberflächen können dieselben Materialien eingesetzt werden, welche aus den aufgeführten Patentschriften bekannt sind. Dabei werden für die manuelle Durchführung vorzugsweise magnetische Plastikmaterialien unterschiedlicher Formen und Größen mit rauen Oberflächen eingesetzt. Für die automatisierte Umsetzung werden angeraute Plastikmaterialien eingesetzt, die bei kommerziell verfügbaren Extraktionsautomaten normalerweise für die Separation von magnetischen Beads Verwendung finden. Bei diesen Automaten handelt es sich um sog. Walk-Away-Plattformen, welche Plastikkämme für die Separation von magnetischen Beads nutzen. Ein weltweit bekanntes diesbezügliches System ist der sog. Magnetic Particle Processor „KingFisher“ der Firma Thermo. Es existieren weltweit eine Vielzahl ähnlicher Automaten, welche alle dasselbe Prinzip nutzen. Für das erfindungsgemäße Verfahren benötigt man keine magnetischen Beads. Die Plastikkämme werden leicht angeraut. Dies ermöglicht dann die direkte Adsorption der DNA-Fragmente an die Plastikkämme unter Nutzung des erfindungsgemäßen Verfahrens.
[0012] Für die manuelle Aufreinigung der Bibliotheken wird der Reaktionsmix in einem Reaktionsgefäß mit Polyethylenglycol und einem monovalenten oder divalenten Salz versetzt und in Kontakt mit einem Material mit rauer oder strukturierter Oberfläche gebracht, welches vorzugsweise magnetisch bzw. paramagnetisch ist. Das Gefäß wird mehrmals vorsichtig invertiert, damit die langkettigen DNA-Fragmente nicht geschert werden. Die DNA- Fragmente adsorbieren an die Oberfläche. Das Gefäß wird in ein Magnetrack gestellt. Das raue Material wird fixiert und der Überstand wird abgegossen. Danach erfolgt die Zugabe eines Waschpuffers ohne Ethanol oder Isopropanol, vorzugsweise wird ein Tris-Puffer verwendet, das Gefäß wird im Magnetrack gelassen und einige Male vorsichtig invertiert. Der Überstand wird abgegossen. Der Waschschritt wird ein weiteres Mal wiederholt. Nach dem letzten Waschschritt erfolgt die Zugabe von ddEEO (doppelt-destilliertes Wasser). Nachfolgend wird das Gefäß mit den rauen Materialien einige Zeit bei leichtem Schütteln inkubiert, damit die gebundenen DNA-Fragmente in Lösung gehen können. Nach dieser Inkubation kann die DNA - Bibliothek gelagert oder auch sofort für die Nanoporensequenzierung verwendet werden.
[0013] Der gesamte Prozess benötigt somit weniger als eine Stunde und ist damit viel schneller als die bisher Verwendung findenden Methoden. Bei der automatisierten Methode unter Verwendung von Walk-Away-Plattformen, welche wie schon beschriebenen Plastikkämme nutzen, wird die Aufreinigung ebenfalls unter der Verwendung der beschriebenen Reagenzien durchgeführt. Die Adsorption der DNA-Fragmente an die Plastikkämme erfolgt durch eine langsame Vertikalbewegung des Kammes in die Reaktionskavität, in welcher sich der Reaktionsansatz befindet. Nach erfolgtem Adsorptionsschritt bewegt sich der Kamm in die Kavität mit dem Waschpuffer. Gewaschen wird durch ein kurzes Eintauchen des Kammes in den Puffer. Der Waschschritt wird wiederholt. Im letzten Schritt wird dann wieder die DNA in Wasser gelöst. Dies erfolgt durch eine langsame Ein- und Auftauchbewegung des Kammes. Danach kann die gelöste DNA sofort für die Nanoporensequenzierung eingesetzt werden oder wird für einen späteren Einsatz im Kühlschrank gelagert. Auch die automatisierte Aufreinigung ist in weniger als einer Stunde beendet. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren und Mittel steht damit eine sehr einfache, effiziente und schnelle Möglichkeit zur Verfügung, welche es erlaubt, DNA- Fragmente einer erzeugten DNA-Bibliothek für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung aufzureinigen. Dabei kann das Verfahren automatisiert oder manuell durchgeführt werden. Überaschenderweise offenbarte sich noch ein weiterer Vorteil, wenn man für die Adsorption von DNA an raue Oberflächen eine Mischung aus Polyethylenglycol und monovalent oder multivalenten Salzen einsetzt.
[0014] Das Verfahren eignet sich nicht nur für die Aufreinigung der DNA-Bibliothek, sondern auch für die Extraktion hochmolekularer DNA, welche man für die Herstellung der DNA-Bibliothek benötigt. Für die Extraktion hochmolekularer DNA gibt es kommerziell verfügbare Produkte der Firmen NEB und Circulomics. Allerdings ist in der Regel die Aufreinigung hochmolekularer DNA arbeits- und zeitaufwendig. Automatisierte Anwendungen sind kommerziell kaum zu finden. Ein weiterer wesentlicher Nachteil besteht auch darin, dass sich die verfügbaren Methoden und verwendeten Reagenzien bzw. Kits für die Extraktion der hochmolekularen DNA und der notwendigen Aufreinigung von für die Sequenzierung vorbereiteter Bibliotheken unterscheiden. Es gibt keinen Kit, welcher es erlaubt, beide Verfahren umzusetzen.
[0015] Auf Basis der vorliegenden Erfindung ist es möglich, mit einem Kit sowohl hochmolekulare DNA aus einer biologischen Probe zu isolieren, als auch die Aufreinigung der Bibliothek zu ermöglichen. Ein solches Produkt bzw. Verfahren gibt es weltweit nicht. Dem Fachmann wäre der Vorteil der Verfügbarkeit einer solchen Lösung bekannt. Ein solcher Kit benötigt lediglich zusätzliche Reagenzien zur Probenlyse (Lysepuffer und proteolytisches Enzym) und ggf. einen Waschpuffer, der auch eine ethanolhaltige Komponente enthalten kann. Erfindungsgemäß würde ein solcher Kit für eine manuell durchführbare Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe sowie die spätere Aufreinigung der Bibliothek folgende Komponenten enthalten:
1. Lysepuffer und Proteinase K
2. Polyethylenglycol - Lösung
3. Magnesiumchlorid - Lösung (als multivalentes Salz)
4. optional ein Waschpuffer auf Ethanol -Basis
5. Tris-Lösung als ein Waschpuffer ohne alkoholische Komponenten
6. Material mit rauer Oberfläche aus Plastik, die magnetisch ist (Granulat oder Kugeln)
7. ddH2O Der Ablauf der Extraktion ist nachfolgend kurz skizziert:
Extraktion hochmolekularer DNA
1. Lyse der Ausgangsprobe (Zellen, Gewebe, Bakterien etc.) mittels Zugabe eines Lysepuffers und Proteinase K.
2. Nach erfolgter Lyse der Ausgangsprobe erfolgt die Zugabe einer definierten Menge an Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid sowie Zugabe des rauen Materials.
3. Mehrmaliges vorsichtiges Invertieren des Reaktionsgefäßes.
4. Platzieren des Gefäßes in ein Magnetrack. Fixierung des rauen Materials mit der adsorbieren DNA und Abgießen des Überstandes.
5. Zugabe eines ethanolhaltigen Waschpuffers und dreimaliges Invertieren des Gefäßes und Abgießen des Überstandes. Wiederholung des Schrittes.
6. Zugabe einer Tris-Lösung und dreimaliges Invertieren des Gefäßes und Abgießen des Überstandes.
7. Zugabe von Wasser und lösen der DNA durch Inkubation in einem Thermoshaker bei 300 rpm und 37°C für ca. 30 min.
[0016] Nach dieser Zeit kann die hochmolekulare DNA direkt für die Herstellung einer DNA - Bibliothek für die Nanoporensequenzierung eingesetzt werden. Es ist natürlich auch möglich, die DNA nachfolgend sachgemäß aufzubewahren und zu einem späteren Zeitpunkt zu nutzen.
[0017] Für die Nanoporensequenzierung mittels der des Kits Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) wird eine definierte Menge an DNA für die Herstellung der DNA- Bibliothek eingesetzt. Nachdem dieser Schritt abgeschlossen ist, erfolgt mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens und Kits die Aufreinigung der Bibliothek wie folgt:
1. Zugabe einer definierten Menge an Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid sowie Zugabe des rauen Materials zum Reaktionsansatz mit der erzeugten Bibliothek.
2. Mehrmaliges vorsichtiges Invertieren des Reaktionsgefäßes. 3. Platzieren des Gefäßes in ein Magnetrack. Fixierung des rauen Materials mit der adsorbieren DNA und Abgießen des Überstandes.
4. Zugabe einer Tris-Lösung zum Waschen der adsorbierten DNA und dreimaliges Invertieren des Gefäßes und Abgießen des Überstandes.
5. Zugabe von Wasser und lösen der DNA durch Inkubation in einem Thermoshaker bei 300 rpm und 37°C für ca. 30 min.
[0018] Die DNA kann jetzt direkt für die Sequenzierung auf die Flow Cell aufgetragen werden, kann aber auch gelagert und zu einem späteren Zeitpunkt eingesetzt werden.
[0019] In analoger Weise kann die kombinierte Extraktion hochmolekularer DNA und die nachfolgende Aufreinigung der Bibliothek automatisiert umgesetzt werden. Dies erfolgt mittels der schon beschriebenen Nutzung von Walk-Away -Plattformen unter Verwendung von rauen Plastikkämmen. Das Verfahren ist einfach in der Durchführung und sehr schnell. Darüber hinaus können mit der Nanoporensequenzierung sehr lange Fragmente sequenziert werden. Dies ist ein sehr wichtiges Qualitätsmerkmal.
[0020] Die Erfindung ist nachfolgend anhand von Ausführungsbeispielen beschrieben.
Ausführungsbeispiele
Ausführungsbeispiel 1:
Manuelle Extraktion hochmolekularer DNA aus Blut für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) einschließlich der Aufreinigung der erzeugten DNA- Bibliothek
[0021] Eingesetzt wurden 3 ml einer Vollblutprobe. Nach Lyse der Erythrozyten wurde das resultierende Zellpellet der kernhaltigen Blutzellen mit 130 pl 1 x PBS-Puffer resuspendiert und in ein 2.0 ml Reaktionsgefäß überführt. Danach erfolgte die Zugabe von 200 pl eines Lysepuffers (Lysis Solution CBV; IST Innuscreen GmbH) sowie 30 pl Proteinase K. Die Zelllyse erfolgte bei 55°C in einem Thermomixer für 15 min. Nach erfolgter Lyse wurde der Ansatz mit 3 paramagnetischen Plastik-Kugeln mit angerauter Oberfläche (Durchmesser 3 mm; Polypropylen) versetzt. Danach erfolgte die Zugabe von 200 pl einer 40%igen Polyethylenglycol-Lösung (PEG-Lösung) und von 40 pl Magnesiumchlorid (400 mM). Das Gefäß wurde dann 30-mal vorsichtig um 180° invertiert. Bei diesem Schritt adsorbiert die hochmolekulare DNA and die raue Oberfläche der paramagnetischen Kügelchen. Das Gefäß wurde anschließend zur Fixierung der Kügelchen in ein Magnet-Rack gestellt und der Lyseansatz wurde ausgegossen. Danach erfolgte die Zugabe eines Waschpuffers (Washing Solution MS; IST Innuscreen GmbH). Dass Gefäß wurde am Magnet-Rack belassen und 3 mal invertiert und der Waschpuffer abgegossen. Der Waschschritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Danach erfolgte die Zugabe von 800 pl einer Tris-Lösung (100 mM Tris-HCl; pH 8). Das Gefäß wurde zweimal invertiert und die Tris-Lösung wurde abgegossen. Durch diesen letzten Waschschritt mit einer nicht ethanolhaltigen Lösung ist ein finaler Trocknungsschritt zur vollständigen Ethanolentfernung nicht mehr notwendig. Die an den Kügelchen befindliche DNA wurde nach Zugabe von 200 pl ddH2O gelöst, wobei dazu das Gefäß für ca. 30 min bei 300 rpm und einer Temperatur von 37°C inkubiert wurde. Die hochmolekulare DNA wurde mittels einer Wide-Bore-Pipettenspitze in ein neues Gefäß überführt und dabei mehrmals vorsichtig auf- und abpipettiert. Die DNA wurde spektrophotometrisch vermessen und eine Menge von 45 pg DNA in einem Volumen von 400 pl für die weitere Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) eingesetzt. Nach erfolgter DNA-Bibliothek Herstellung ist es notwendig, überschüssigen Adaptoren zu entfernen. Dies erfolgte mittels des erfindungsgemäßen Verfahrens nachfolgend. Dazu wurde der Ansatz wiederum mit einer PEG Lösung (40%) und Magnesiumchlorid-Lösung (400 mM) sowie mit angerauten paramagnetischen Plastik-Kügelchen versetzt. Das Gefäß wurde dann 30-mal vorsichtig um 180° zur Adsorption der hochmolekularen DNA an die raue Oberfläche der paramagnetischen Kügelchen invertiert. Das Gefäß wurde anschließend zur Fixierung der Kügelchen in ein Magnet-Rack gestellt und der Reaktionsansatz wurde ausgegossen. Danach erfolgte die Zugabe von 800 pl einer Tris-Lösung (100 mM Tris-HCl; pH 8). Das Gefäß wurde zweimal invertiert und die Tris-Lösung abgegossen. Der Waschschritt wurde ein weiteres Mal wiederholt. Wichtig war bei der Aufreinigung der DNA-Library, dass keine alkoholischen Komponenten als Waschpuffer oder Bindungspuffer eingesetzt werden, da dies zur Zerstörung der Bibliothek führen würde. Die an den Kügelchen befindliche DNA wurde nach Zugabe von 225 pl ddH2O gelöst, wobei dazu das Gefäß für ca. 45 min bei 300 rpm und einer Temperatur von 37°C inkubiert. Nach erfolgter DNA-Extraktion, Herstellung der DNA- Bibliothek und Aufreinigung der DNA-Bibliothek erfolgt die Überführung der Probe in das Gerät Minion (Oxford Nanopore Technologies) zur Durchführung einer Long-Read- Sequenzierung. Mittels dieser Technologie konnte gezeigt werden, dass unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens mit der Kombination von Extraktion hochmolekularer DNA und Aufreinigung der DNA-Bibliothek sehr hohe Leseweiten erzielbar sind (Leseweiten bis > 300.000 Basenpaare). Das gesamte Verfahren ist in ca. 2 Stunden abgeschlossen, was es erlaubt, noch am selben Arbeitstag die Sequenzierung zu starten. Darüber hinaus ist das Verfahren sehr einfach in der Durchführung.
Ausführungsbeispiel 2: Automatisierte Extraktion hochmolekularer DNA aus Blut für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) einschließlich der Aufreinigung der erzeugten DNA-Bibliothek unter Verwendung einer Walk-Away-Plattform (KingFisher Flex; Thermo)
[0022] Eingesetzt wurden 3 ml einer Vollblutprobe. Nach Lyse der Erythrozyten wurde das resultierende Zellpellet der kernhaltigen Blutzellen mit 130 pl 1 x PBS-Puffer resuspendiert und in eine Kavität einer 96-Well Deep Well Platte zur Abarbeitung des automatisierten Protokolls auf dem KingFisher Flex-Geräte überführt. Bei der automatisierten Methode unter Verwendung von Walk-Away-Plattformen (wie hier unter Verwendung des Gerätes KingFisher Flex) erfolgt die Adsorption der hochmolekularen DNA an die schon beschriebenen Plastikkämme, welche diese Gerätesysteme verwenden. Die Extraktion wurde ebenfalls unter der Verwendung der für den manuellen Prozess beschriebenen Reagenzien durchgeführt. Nach erfolgter automatisierter Probenlyse auf dem Gerät erfolgte die Adsorption der DNA-Fragmente an die Plastikkämme durch eine langsame Vertikalbewegung des Kammes in der Reaktionskavität, in welcher sich der Reaktionsansatz befindet. Nach erfolgtem Adsorptionsschritt der hochmolekularen DNA bewegt sich der Kamm sukzessive in die Deep Well-Platten-Kavitäten mit den Waschpuffern, wobei bei der Extraktion der hochmolekularen DNA mit einem ethanolhaltigen Waschpuffer gewaschen wird. Der letzte Waschschritt erfolgt dann wieder mit einer Tris-Lösung. Die hochmolekulare DNA wurde mittels einer Wide-Bore-Pipettenspitze aus der Kavität der Deep-Well-Platte in ein neues Gefäß überführt und dabei mehrmals vorsichtig auf- und abpipettiert. Die DNA wurde spektrophotometrisch vermessen und eine Menge von 45 pg DNA in einem Volumen von 400 pl für die weitere Nanoporensequenzierung mittels des Ultra-Long DNA Sequencing Kit SQK-ULK001 (Oxford Nanopore Technologies) eingesetzt. Nach erfolgter DNA- Bibliothek Herstellung erfolgte dann unter Nutzung der schon im Ausführungsbeispiel 1 aufgeführten Reagenzien die die automatisierte Aufreinigung der DNA-Bibliothek, um die überschüssigen Adaptoren zu entfernen. Bei der automatisierten Aufreinigung der DNA Library wird nur mit der Tris-Lösung gewaschen. Gewaschen wird durch ein kurzes Eintauchen des Kammes in den jeweiligen Puffer. Im letzten Schritt wird dann wieder die DNA in Wasser gelöst. Dies erfolgt durch eine langsame Ein- und Auftauchbewegung des Kammes. Nach der automatisierten Extraktion hochmolekularer DNA, der Herstellung der DNA-Bibliothek und automatisierten Aufreinigung der DNA-Bibliothek erfolgt die Überführung der Probe in das Gerät Minion (Oxford Nanopore Technologies) zur Durchführung einer Long-Read-Sequenzierung. Mittels dieser Technologie konnte gezeigt werden, dass mittels des erfmdungsgemäßen Verfahrens der Kombination von automatisierter Extraktion hochmolekularer DNA und Aufreinigung der DNA-Bibliothek sehr hohe Leseweiten erzielbar sind (Leseweiten bis > 300.000 Basenpaare). Das gesamte Verfahren ist in ca. 2 Stunden abgeschlossen, was es erlaubt, noch am selben Arbeitstag die Sequenzierung zu starten. Darüber hinaus ist das Verfahren sehr einfach in der Durchführung.
Definitionen:
Einwertiger Alkohol:
Alkohole mit nur einer OH-Gruppe wie Ethanol oder Isopropanol
Polyether:
Langkettige Verbindungen der Art heißen Polyether (auch Polyalkylenglycole,
Polyetherpolyole, Polyalkylenoxide). Beispiele für diese Gruppe polymerer Ether sind Polyethylenglycol und Polypropylenglycol. PEG 6000 oder PEG 8000 bedeutet, dass n= 6000 bzw. 8000 ist.
TRIS: Tris(hydroxymethyl)aminomethan (Kurzbezeichnung TRIS oder THAM), auch Tromethamin, Trometamol (INN) sowie TRIS-Puffer genannt. Chemisch handelt es sich um ein primäres Amin mit drei alkoholischen Hydroxygruppen. Vorzugsweise wird dessen Salz (Hydrochlorid) verwendet mit einem pH-Wert von 7-9, vorzugsweise pH = 8.
Hochmolekulare DNA:
DNA mit größer gleich 100.000 bp.

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe und / oder Aufreinigung einer DNA-Library, dadurch gekennzeichnet, dass nach ggf. Lyse der biologischen Probe und / oder nach Herstellung der DNA-Library der Ansatz mit einer Kombination aus einem Polyether und mindestens einem Salz sowie in Abwesenheit einwertiger Alkohole in Kontakt gebracht wird, wobei anschließend die DNA an eine feste Phase gebunden und anschließend die DNA ohne Verwendung einwertiger Alkohole gereinigt wird.
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass als Polyether Polyethylenglycol (PEG), vorzugsweise PEG 6000 oder PEG 8000 eingesetzt wird.
3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass als Salz MgCh verwendet wird, vorzugsweise in einer Konzentration zwischen 1 bis 100 mM, insbesondere zwischen 5 und 50 mM.
4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass Polyether und Salz sich in entsprechenden Konzentrationen zusammen in einem Puffer befinden.
5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass als feste Phase ein Material mit rauer oder strukturierter Oberfläche verwendet wird.
6. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass ein Waschpuffer ohne einwertigen Alkohol für die Reinigung der gebundenen DNA ein Aminoalkohol verwendet wird, vorzugsweise TRIS.
7. Verfahren zur Extraktion hochmolekularer DNA aus einer biologischen Probe, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Lyse der biologischen Probe b) Zugabe von Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid sowie Zugabe des rauen Materials c) Fixierung des rauen Materials mit der adsorbieren DNA und Abgießen des Überstandes d) Zugabe eines Waschpuffers e) Zugabe von Wasser und lösen der DNA Verfahren zur Aufreinigung einer DNA-Library, gekennzeichnet durch folgende Schritte: a) Zugabe von Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid sowie Zugabe des rauen
Materials zum Reaktionsansatz mit der erzeugten Bibliothek b) Fixierung des rauen Materials mit der adsorbieren DNA und Abgießen des Überstandes c) Zugabe eines Waschpuffers ohne einwertigen Alkohol d) Zugabe von Wasser und lösen der DNA Automatisiertes Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8, wobei sich der Lyseansatz bzw. der Reaktionsansatz mit der erzeugten Bibliothek in einem Walk-Away- Extraktionsgerät befindet, welches Plastikstäbe verwendet, welche eine raue oder strukturierte Oberfläche aufweisen, an denen die DNA unter Zugabe von Polyethylenglycol und Magnesiumchlorid durch vertikale Bewegung der Plastikkämme innerhalb der Probe adsorbiert und sich diese Plastikkämme nach dem walk-away- Prinzip in Gefäße mit dem Waschpuffer und final in die wässrige Lösung bewegen. Kit für eine manuell durchführbare Durchführung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, umfassend: a) Lysepuffer b) Polyethylenglycol - Lösung c) Magnesiumchlorid - Lösung d) Tris-Lösung als ein Waschpuffer e) Material mit rauer Oberfläche aus Plastik, die magnetisch ist (Granulat oder Kugeln) f) ddH2O Verwendung des Verfahrens gemäß einem der Ansprüche 1 bis 9 für eine nachfolgende Nanoporensequenzierung
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