EP4511508A1 - Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischen modularen reporterkomplexes und elektrochemischer detektion - Google Patents

Nukleinsäurenachweis in einer pcr mittels eines zielsequenz-unspezifischen modularen reporterkomplexes und elektrochemischer detektion

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Publication number
EP4511508A1
EP4511508A1 EP23717587.2A EP23717587A EP4511508A1 EP 4511508 A1 EP4511508 A1 EP 4511508A1 EP 23717587 A EP23717587 A EP 23717587A EP 4511508 A1 EP4511508 A1 EP 4511508A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
signal
sequence
mediator
oligo
probe
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP23717587.2A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Felix Von Stetten
Tamara Pfaff
Michael Lehnert
Martin Trotter
Nadine Borst
Lisa BECHERER
Helena Gmoser
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Hann Schickard Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV
Original Assignee
Hann Schickard Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV
Albert Ludwigs Universitaet Freiburg
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hann Schickard Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV, Albert Ludwigs Universitaet Freiburg filed Critical Hann Schickard Gesellschaft fuer Angewandte Forschung eV
Publication of EP4511508A1 publication Critical patent/EP4511508A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6823—Release of bound markers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6816—Hybridisation assays characterised by the detection means
    • C12Q1/6818—Hybridisation assays characterised by the detection means involving interaction of two or more labels, e.g. resonant energy transfer

Definitions

  • target sequences are primarily detected either by dyes that intercalate into the DNA, but which bind non-specifically to all existing DNA double strands, or by DNA probes that only bind a specific DNA target sequence.
  • DNA probes produce an optical signal change directly (e.g. Taqman probes) or indirectly (mediator probes in combination with universal reporter molecules) through their cleavage.
  • Optical detectors detect the light emissions generated during the reaction outside the reaction vessel. These detection systems mostly rely on light-absorbing and emitting fluorescence molecules. After being stimulated by light energy of a certain wavelength, these molecules release energy in the form of higher wavelengths, which can be detected using detectors.
  • fluorescence donor or fluorophore molecules whose light energy is to be detected in a specific wavelength range
  • fluorescence acceptor or quencher molecules that lead to a decrease in the fluorescence intensity of a fluorophore when in close proximity
  • fluorescence acceptor or quencher molecules that lead to a decrease in the fluorescence intensity of a fluorophore when in close proximity
  • DNA probes or detection molecules which carry different fluorophore-quencher combinations, each of which emits a fluorescence signal in a specific wavelength range in the presence of a specific DNA sequence.
  • Further developments of this multiplexing detection also enable the detection of multiple target sequences within a wavelength range by considering the fluorescence values quantitatively or combining them with other parameters (e.g. the readout temperature).
  • Two known one-part target sequence-specific DNA probes for optical detection are Taqman probes and molecular beacons (Tan et al. 2004; Li et al. 2008; Holland et al. 1991; Rodriguez et al. 2005), which bind target sequences. specific and are cleaved during PCR, generating a signal.
  • the disadvantage of these probes is their dependence on the target gene sequence, which means that only special regions of a DNA target sequence that must meet certain requirements can be used. For example, attention must be paid to probe length, melting temperature, binding enthalpy, GC content, guanine quenching and complementary sequence fragments. In addition, their synthesis can be very demanding.
  • Molecular beacons consist of an oligonucleotide (oligo) with five to seven complementary bases at the two ends and a terminal fluorophore or quencher (Tyagi and Kramer 1996). Instead of a fluorophore in a molecular beacon, an electroactive label is used and instead of the quencher, a molecule that complexes the electroactive molecule and thus prevents effective electron transfer.
  • the complex-forming molecule can be dispensed with if the secondary structure of the molecular beacon forms a reversible binding region (in the form of an aptamer) for the electroactive molecule. In this case, hybridization of the target sequence with the molecular beacon causes the release of the electroactive molecule.
  • the specific electrochemical detection of target DNA is carried out using the solid phase, often via specifically functionalized electrodes to which the amplification product or a probe hybridizes.
  • single-stranded DNA molecules are usually generated from double-stranded amplification products, for example by enzymatic digestion.
  • To generate signals either intercalating electroactive molecules or a further hybridization probe that is modified with an electroactive molecule are then added.
  • DNA detection reactions can be found in the literature for which electrode surfaces were functionalized with universally usable DNA probes.
  • the target DNA is usually not amplified, so the sensitivity of the methods is low.
  • Some methods require that the target sequence be present as a single strand, so either an initial single-strand generation step is required or the application remains limited to single-stranded RNA.
  • the reaction times are also often significantly longer than would be expected for a DNA amplification reaction.
  • only one form of hybridization chain reaction is comparable to, for example, a PCR, for which, according to the publication, detection limits of 50 aM are achieved within 120 min (Liu et al. 2017).
  • the first probe can unfold into a second universal probe (initially also present as a hairpin structure).
  • This second probe is modified with an electroactive molecule.
  • this second probe can hybridize to another surface-bound probe, so that electroactive molecules are enriched on the electrode surface.
  • the patent WQ2013079307A1 Bifunctional oligonucleotide probe for universal real-time multi-analyte detection claims the system of mediator probe technology.
  • a mediator probe is activated by extending a primer (auxiliary molecule 1) to the target sequence (target molecule) using a polymerase (auxiliary molecule 2). Due to the exonuclease activity of the polymerase, the mediator probe is cleaved and can then bind to the UR (mediator hybridization sequence). Here it acts as a primer after its cleavage. As a result, it is extended by the polymerase and thus separates the fluorophore and quencher on the universal reporter, which leads to signal generation.
  • different wavelengths are generally used in optical detection reactions in order to be able to distinguish individual target sequences in certain light ranges, the so-called detection channels, in a reaction. This limits multiplexing because only one target sequence can be detected per channel. Thus, the degree of multiplexing in most commercial devices is limited to five or six channels.
  • a so-called signal oligo which has a hairpin structure, is used.
  • the loop area contains a target DNA-specific sequence.
  • the hairpin stem contains a universal sequence that can hybridize to the complementary universal solid-phase probe and is modified for detection with an electroactive molecule. When folded, hybridization is not effective.
  • the signal initiation oligo hybridizes with the target sequence, it folds up and the sequences of the Trunks form flaps.
  • the exonuclease domain of the polymerase cuts the flap sequence so that it can hybridize more effectively with the solid-phase probe.
  • a disadvantage of this method is that the signaling oligo is modified with a relatively expensive electroactive molecule. Since the signal oligo also contains a target sequence-specific region, assay optimization can therefore be expensive.
  • the design of the signal oligo and solid-phase probe is not trivial. By optimizing the melting temperatures, it must be prevented that the solid-phase probe already interacts with the signal oligo that is still folded. At the same time, it must be prevented that the complementary parts of the strain hybridize with each other again even after cleavage by the exonuclease activity.
  • the patent therefore describes that the solid phase probe should contain individual bases that are not complementary to the stem of the signal oligonucleotide in order to optimize the melting temperatures.
  • PCR is the gold standard method for amplifying individual DNA sequences and making them detectable.
  • DNA or cDNA in the case of RNA either intercalating dyes or DNA probes are used.
  • intercalating dyes bind non-specifically to all existing double-stranded DNA molecules, which means that direct sequence-specific detection in PCR is not possible.
  • DNA probes are signal-generating DNA sequences that are complementary to the respective sequence section of a PCR product and can therefore specifically detect and quantify them. This method is used in particular in real-time PCR and digital PCR.
  • DNA probes either have a biochemical modification themselves in order to generate a signal in the presence of a DNA target sequence during PCR (e.g. Taqman probes) or activate a second detection molecule, which generates a signal independently of the target sequence (e.g. Mediator probes in combination with target sequence-unspecific universal reporters).
  • the method according to the invention preferably uses electrochemical methods for detecting DNA sequences in a PCR. These differ greatly in their methodology from the optical methods described so far, since a signal change is generated by a change in the electrical charge transfer at an electrode. This means that the signal change must be detected at the electrode solid phase. This brings with it many advantages.
  • the signal detection is very sensitive and direct, which makes expensive optical detection systems unnecessary. This is an advantage because corresponding electrochemical detectors are significantly cheaper, more robust and easy to miniaturize. So far, the non-direct transferability between optical and electrochemical detection has been a problem, as it is not sufficient to simply add a biosensor (e.g. a DNA sequence) to an electrode. Rather, all detection components must be adapted and other detection mechanisms must be used.
  • the core of such a process would be a new type of modular detection molecule complex, which is target sequence-unspecific, flexible in design and easy to optimize and has the same performance characteristics as the current state of the art describes for single-part detection molecules. For this purpose, it should have similar sequence patterns in order to be able to more easily transfer detection processes between optical and electrochemical detection. So far, such a modular composition has failed in particular because it does not contain covalent chemical bonds, which, according to current state-of-the-art assumptions, makes it appear unsuitable for PCR applications.
  • the reaction of the signal-causing or -initiating oligonucleotides has been optimized, in particular the hybridization reaction on the solid phase surface, it should also be easy and reproducible to transfer to other target sequences.
  • the universal character of surface modification should allow the sequences involved in the surface reactions to be left unchanged, even if these surfaces are to be used to detect other target sequences.
  • the target sequence-specific reactions should therefore all take place in the liquid phase, so that in order to develop a new nucleic acid detection system, only the reagents and oligonucleotides of the liquid phase need to be adapted, redeveloped and optimized.
  • the surfaces and their modification e.g. the immobilization of oligonucleotides on electrode surfaces
  • the invention relates to a method for detecting at least one target nucleic acid sequence, comprising the steps: a. Providing at least one target sequence-unspecific modular reporter complex, comprising at least one label and at least two oligonucleotides, namely i. comprising a base strand
  • At least one signal initiation oligo binding site ii. at least one signal initiation oligo wherein optionally the signal initiation oligo binding site of the base strand and the at least one signal initiation oligo hybridize with one another, but are not covalently linked and together form a signal complex.
  • the mediator probe comprising an oligonucleotide with at least one probe sequence and at least one mediator sequence, the at least one probe sequence having an affinity for at least one target nucleic acid sequence, and the at least one mediator sequence having an affinity for at least one mediator -Binding site on the base strand which has at least one target sequence-unspecific modular reporter complex, c.
  • PCR amplification of at least one nucleic acid sequence i.e. Binding a probe sequence of at least one mediator probe to at least one target nucleic acid sequence, e. Cleavage of the probe sequence of the at least one mediator probe bound to the at least one target nucleic acid sequence by a PCR polymerase, whereby the mediator sequence is released, f. Binding at least one released mediator sequence to a mediator binding site of the at least one target sequence-unspecific modular reporter - complex, g.
  • the method for detecting at least one target nucleic acid sequence comprises the following steps: a. Providing at least one target sequence-unspecific modular reporter complex, comprising at least one label and at least two oligonucleotides, namely i. comprising a base strand
  • At least one signal initiation oligo binding site ii. at least one signal initiation oligo, wherein optionally the signal initiation oligo binding site of the base strand and the at least one signal initiation oligo hybridize with one another, but are not covalently linked and together form a signal complex
  • b. Providing at least one mediator probe, the mediator probe comprising an oligonucleotide with at least one probe sequence and at least one mediator sequence, the at least one probe sequence having an affinity for at least one target nucleic acid sequence, and the at least one mediator sequence having an affinity for at least one mediator -Binding site on the base strand which has at least one target sequence-unspecific modular reporter complex, c.
  • PCR amplification of at least one nucleic acid sequence i.e. Binding a probe sequence of at least one mediator probe to at least one target nucleic acid sequence, e. Cleavage of the probe sequence of the at least one mediator probe bound to the at least one target nucleic acid sequence by a PCR polymerase, whereby the mediator sequence is released, f. Binding at least one released mediator sequence to a mediator binding site of the at least one target sequence-unspecific modular reporter -Complex, g.
  • the method for detecting at least one target nucleic acid sequence comprises the following steps: a. Providing at least one target sequence-unspecific modular reporter complex, comprising at least one label and at least two oligonucleotides, namely i. comprising a base strand
  • At least one signal initiation oligo binding site ii. at least one signal initiation oligo, wherein optionally the signal initiation oligo binding site of the base strand and the at least one signal initiation oligo hybridize with one another, but are not covalently linked and together form a signal complex
  • b. Providing at least one mediator probe, the mediator probe comprising an oligonucleotide with at least one probe sequence and at least one mediator sequence, the at least one probe sequence having an affinity for at least one target nucleic acid sequence, and the at least one mediator sequence having an affinity for at least one mediator -Binding site on the base strand which has at least one target sequence-unspecific modular reporter complex, c.
  • PCR amplification of at least one nucleic acid sequence i.e. Binding a probe sequence of at least one mediator probe to at least one target nucleic acid sequence, e. Cleavage of the probe sequence of the at least one mediator probe bound to the at least one target nucleic acid sequence by a PCR polymerase, whereby the mediator sequence is released, f. Binding at least one released mediator sequence to a mediator binding site of the at least one target sequence-unspecific modular reporter -Complex, g.
  • the signal oligo and the base strand are not hybridized with one another from the outset and form in step a. no signal complex yet.
  • the extension of the mediator on the base strand can take place, for example in a separate chamber/cavity/well, so that the hybridization, for example in a (later) end point detection, only takes place at a later point in time/in a later step, virtually retrospectively .
  • the signal change is in step g. therefore not a “signal change” but rather an altered signal compared to a control response with an intact mediator probe.
  • the signal change is therefore in step g. a modified signal, preferably a modified signal compared to a control reaction with an uncleaved mediator probe, which is initiated or is present.
  • step g includes. the extension of the sequence of at least one Mediator sequence bound to a Mediator binding site by a PCR polymerase, wherein the binding (and/or hybridization) of the at least one signal initiation oligo binding site and the at least one signal initiation oligo is either i) broken and/or prevented, or ii) initiated or enabled/produced, thereby causing an altered signal compared to a control reaction with uncleaved mediator probe.
  • step g includes. the extension of the sequence of at least one mediator sequence bound to a mediator binding site by a PCR polymerase, wherein the binding (hybridization) of the at least one signal initiation oligo binding site and the at least one signal initiation oligo is either i) broken and/or prevented or ii) initiated or is made possible/established, whereby a signal change is initiated.
  • a signal change is a changed signal, preferably a changed signal compared to a control reaction with an uncleaved mediator probe.
  • a signal change is generated by hybridizing a signal initiation oligo with an oligonucleotide, preferably one of the two molecules comprising at least one label; in other embodiments, a signal change is generated by preventing or cleavage/breaking hybridization.
  • a signal change is achieved by changing the distance of at least one electroactive molecule to a surface as a result of the severing of the bond between the signal initiation oligo and the base strand.
  • An extension of the mediator causes the distance to the surface to either increase ( Figure 6iv) or decrease ( Figure 6v), which in both cases leads to a signal change.
  • step g includes. the extension of the sequence of at least one mediator sequence bound to a mediator binding site by a PCR polymerase, the binding of the, optionally hybridized with one another, at least one signal initiation oligo binding site and the at least one signal initiation oligo being broken and/or prevented, thereby causing a signal change and/or a changed signal (e.g. compared to a control reaction) is initiated.
  • step a) the signal initiation oligo binding site of the base strand and the at least one signal initiation oligo are hybridized with one another, but not covalently linked, and together form a signal complex.
  • step g. initiates a signal change by the separated at least one signal initiation oligo comprising at least one label and binding to at least one auxiliary oligo (preferably comprising a signal oligonucleotide binding site) which is immobilized on a solid phase.
  • auxiliary oligo preferably comprising a signal oligonucleotide binding site
  • step g. a signal change is initiated by one of the two oligonucleotides or both oligonucleotides of the at least one target sequence-unspecific modular reporter complex, namely i. the base strand, and/or ii. the at least one signal initiation oligo is/are immobilized on a solid phase via a linker.
  • the modular reporter system for target sequence-unspecific detection is a new invention that distinguishes itself from the previously known detection systems through the flexible use of different oligonucleotides with different labels.
  • the modular structure offers various advantages such as the flexibly adaptable design to specific device conditions, the uniformity of the signal generation reaction between different detection methods or the inexpensive, simple production as well as completely new multiplex detection methods.
  • the system and its functionality have not yet been described in a patent or in the literature for nucleic acid detection in a PCR.
  • the core of the invention is the modular target sequence-independent modular reporter complex (e.g. in Figure 1) made of non-covalently linked oligonucleotides.
  • This system has all the advantages of the various target sequence-specific detection systems as well as target sequence-unspecific detection molecules and combines them with increased flexibility in the design of such detection molecules, which lead to completely new detection methods.
  • the system can be used without any problems in a PCR with cyclical temperature changes and the associated melting of the DNA strands in each cycle. Investigations by the inventors have shown that the modular system according to the invention even surpasses the prior art systems in terms of their functionality. Here, significantly cheaper production can be achieved with at least as good performance parameters.
  • a further advantage of the system according to the invention is the possibility of flexible adaptation of the universal probe according to the invention.
  • the basic structure of the modular system of the target sequence-independent modular reporter complex consists of a basic strand. This has at least one binding site for a mediator (receptor complex) and at least one binding site for a signal initiation oligonucleotide (signal complex).
  • the base strand and at least one signal initiation oligo together form a complex (eg Figure 1). At least one of these strands has a mark that can detect a structural change in this complex.
  • the modular structure results from several possible signal initiation oligonucleotides (or “signal initiation oligos”), which in different embodiments can be combined with a base strand in different ways (see, for example, Figures 5-7).
  • the modular structure means that a much higher number of labels can be applied per complex than is possible with current one-part detection molecules. Due to this novelty of the modular detection complex, new possibilities for detection reactions arise which are based on a basic reaction which is described below as an example.
  • a mediator probe binds to the amplified DNA target sequence ( Figure 1).
  • a mediator probe is an oligonucleotide and has a sequence-specific probe section which binds to the target sequence and in some preferred embodiments is protected at the 3' end, and a target sequence-unspecific section, called mediator, which except for one nucleotide which mediator and probe are common is, does not bind to the target sequence.
  • the mediator is cleaved from the probe, with the common base remaining on the mediator (FIG. 1). The mediator is now no longer blocked by the probe section and can now bind to the target sequence-nonspecific reporter complex and be extended here.
  • the mediator binds to the receptor complex of the base strand of the target sequence-independent modular reporter complex.
  • the mediator is then extended along the base strand by the polymerase, whereby the signaling complex is broken up in such a way that individual components and/or molecules of this complex are split off, thereby initiating a signal change compared to the original state ( Figures 5-7).
  • the present invention achieves the advantageous effect that once the reaction of the signal-causing or -initiating oligonucleotides, in particular the hybridization reaction on the solid phase surface, has been optimized, it can be easily and reproducibly transferred to other target sequences.
  • a further advantage of the invention is that the universal character of the surface modification allows the sequences involved in the surface reactions to be left unchanged, even if these surfaces are to be used for the detection of further target sequences.
  • a target sequence-specific reaction preferably takes place in the liquid phase, so that for the development of a new nucleic acid detection, only the reagents and oligonucleotides of the liquid phase need to be adapted, redeveloped and optimized.
  • the surfaces and their modification e.g. the immobilization of oligonucleotides on electrode surfaces
  • the invention enables development effort (time and costs) to be saved.
  • either the base strand or the at least one signal initiation oligo comprises the at least one label.
  • cleavage of the mediator probe and subsequent extension of the mediator on the target sequence-unspecific modular reporter can lead to the binding of an electroactively labeled signal initiation oligo to the base strand being broken. This can then bind to a makeshift oligo that has been immobilized on a solid phase (electrode) and thus bring about a signal change ( Figure 6iii).
  • the target sequence-independent modular reporter complex can be coupled to a solid phase via a linker on the base strand ( Figure 6i).
  • the signal in initiation sol igo itself can be immobilized on a surface and the entire target sequence-unspecific modular reporter complex can be coupled to the electrode via the base strand, which in this case has an electroactive modification (Figure 6ii).
  • the mediator By extending the mediator, the binding of the base strand to the signal initiation oligo is broken or prevented, resulting in a signal change.
  • the probability of hybridization to a solid phase probe can be influenced by the effective free energy of the hybridization reaction and/or by different diffusion speeds of molecules of different sizes (length and secondary structure of the DNA (complexes)). In general, it can be extended to other detection principles, in which the signal is detected by enrichment/depletion of signaling markings on the solid phase.
  • fluorophores could be used for optical detection or magnetic particles for magnetoresistive detection.
  • the signal change in step g is based on the fact that the extension of the mediator sequence leads to an increased or reduced hybridization probability of the labeled oligonucleotide to the immobilized oligonucleotide and thus the labeling on the functionalized surface is enriched or reduced.
  • Non-mimicking embodiments of the embodiments with an increased hybridization probability are illustrated in Figure 6 iii).
  • Non-mimicking embodiments of the embodiments with a reduced hybridization probability are illustrated in Figures 6 i)-ii).
  • the detection methods are selected from the group comprising electrochemical, optical, magnetoresistive, piezoelectric (e.g. quartz oscillator, surface acoustic waves), and/or surface plasmon resonance detection.
  • electrochemical, optical, magnetoresistive, piezoelectric e.g. quartz oscillator, surface acoustic waves
  • piezoelectric e.g. quartz oscillator, surface acoustic waves
  • the at least one marking is or comprises at least one electroactive marking and the solid phase is an electrode.
  • step g. a signal change is initiated by in step g. the distance between the at least one marking and the solid phase increases or decreases.
  • a signal change is initiated by in step g. the distance between the at least one marking and the solid phase increases or decreases.
  • Another option is to immobilize the electroactive label on the solid phase (electrode), either via the base strand ( Figure 6iv) or the signal initiation oligo ( Figure 6v).
  • a signal change is achieved by changing the distance from the electroactive molecule to the surface as a result of the severing of the bond between the signal initiation oligo and the base strand.
  • An extension of the mediator causes the distance to the surface to either increase ( Figure 6iv) or decrease ( Figure 6v), which in both cases leads to a signal change.
  • These embodiments are also not limited to electrochemical detection. Changing the distance of a fluorescent marking can lead to a detectable signal change, for example through surface quenching effects.
  • Another variant is the detection comparable to the optical exemplary embodiment according to FIG. 7.
  • the marking After hydrolysis of the marked signal initiation oligonucleotide, the marking has a detectably higher diffusion speed and can therefore be detected without enrichment by an oligonucleotide immobilized on the electrode.
  • the effect was discussed, for example, in Pearce, D.M., Shenton, D.P., Holden, J., Gaydos, C.A., 2011. IEEE Trans. Biomed. Closely. 58 (3), 755-758.
  • the addition of an electroactively labeled hydrolysis probe is necessary after the PCR, which is then digested by an exonuclease that must also be added.
  • the advantage of the invention is, on the one hand, the possibility of being able to analyze suitable embodiments for signal generation more flexibly and quickly using the target sequence-unspecific reporter complex and thereby generate stronger and/or more precisely distinguishable signals and provide a uniform mechanism for electrochemical detection, than is possible with the state of the art.
  • the invention also allows universally fu nationalized electrode arrays to be generated. This means that it is no longer necessary to adapt the electrode modification to new target sequences and the electrode arrays can be produced in large batches and therefore more cost-effectively.
  • the invention includes various detection methods, such as electrochemical, optical (e.g. through fluorescence, dyes, etc.), magnetoresistive, piezoelectric (e.g. Schwinquarz, surface acoustic waves) or surface plasmon resonance.
  • an optically detectable marker such as colloidal gold, colloidal silver, colloidal carbon, latex particles is coupled to the marking.
  • the signal change is based on step g. that changing the number of bound labels results in a change in charge transfer.
  • the signal change is based on step g. that the number of bound labels results in a change in the electrode potential or charge transfer.
  • the change described is determined as a changed current or charge or potential or charge transfer resistance using, for example, voltammetric, amperometric, coulometric, potentiometric or impedimetric measurement methods.
  • the invention includes, in embodiments, electrochemical detection methods.
  • the at least one label comprises at least one fluorophore.
  • the at least one label of an oligonucleotide comprises at least one fluorophore, where the oligonucleotide is bound to the solid phase.
  • quenchers can preferably be dispensed with.
  • the signal change is based on the fact that the number of bound labels results in a change in the fluorescence intensity.
  • the signal change is based on the fact that the change in the distance between the marking and the solid phase causes a signal change.
  • the solid phase is a (preferably metallic) surface that causes fluorescence quenching of proximal fluorophores.
  • the at least one label is a molecule for coupling further labels.
  • Molecules that can be used for coupling are known to those skilled in the art. Non-imitating examples are biotin - streptavidin, fluorescein - anti-fluorescein, etc.
  • the signal change is an optically perceptible change (for example by eye or camera) in the color intensity at the location of the immobilized oligonucleotides.
  • the invention includes optical detection methods.
  • the person skilled in the art is aware of the basic possibilities and principles of optical detection.
  • a nanoparticle (preferably a metal nanoparticle) is coupled to the marking and the solid phase is a piezoelectric material that is excited to oscillate by an alternating electric field.
  • the signal change is in step g. a change in the frequency and/or the phase and/or attenuation of the oscillation depending on the number of bound markings.
  • the invention includes piezoelectric detection methods.
  • the person skilled in the art is aware of the basic possibilities and principles of piezoelectric detection.
  • a metallic nanoparticle is/is coupled to the marking and the solid phase is a metallic surface.
  • the signal change is based on a change in the refractive index at the surface due to the increase/decrease in bound labels, which can be determined using surface plasmon resonance spectroscopy.
  • the invention includes surface plasmon resonance detection methods.
  • the person skilled in the art is aware of the basic possibilities and principles of surface plasmon resonance detection.
  • magnetic nanoparticles are/are coupled to the marking and the signal change is based on a change in the resistance of a magnetoresistive sensor.
  • the invention includes magnetoresistive detection methods.
  • the person skilled in the art is aware of the basic possibilities and principles of magnetoresistive detection.
  • the immobilized oligonucleotides can be immobilized at several defined positions of the solid phase.
  • the immobilized oligonucleotides can differ in their sequence.
  • the solid phase is or comprises an electrode array and/or solid phase array.
  • the target sequence can be clearly identified via the characteristics of the marking and/or the position of the signal change. If the detection takes place in embodiments using a solid phase array, the position of the detected signal can also enable identification of the target sequence.
  • the separated at least one signal initiation oligo comprises at least one electroactive label and wherein in step g. the at least one electroactive label is released, whereby it has a detectably higher diffusion speed and thus initiates a signal change by increasing the electron transfer rate.
  • the at least one label is specific for the at least one target nucleic acid sequence and wherein the step g. initiated signal change for which at least one target nucleic acid sequence is characteristic.
  • the detection of the signal change includes an analysis of the signal change as a function of the detection temperature and/or the electric field and/or the frequency of the excitation signal.
  • a mediator probe comprises an oligonucleotide and a sequence-specific probe portion that binds to the target sequence and is protected at the 3' end.
  • This protection at the 3' end may be a block group (protecting group), e.g. a chemical block or protecting group, which in some embodiments comprises a chain of three carbon atoms.
  • Protecting the mediator probe at the 3' end preferably prevents the (unspecific) extension of the sequence strand by a polymerase during an amplification reaction.
  • the mediator probe can comprise any protecting or blocking group which is suitable for preventing (non-specific) extension of the mediator probe sequence strand by a polymerase during an amplification reaction.
  • the mediator probe is protected against (non-specific) polymerase extension by means other than a block group (protecting group) at the 3' end.
  • a mediator probe does not include a block group (protecting group) at the 3' end and is not protected against (non-specific) polymerase extension.
  • a 3'-end protected mediator probe may include a “C3 spacer”.
  • Such a C3 spacer may be a chemical block group, which in some embodiments includes a chain of three carbon atoms. This “C3 spacer” thus preferably prevents (unspecific) polymerase extension of the mediator probe sequence strand.
  • Typical block groups (protecting groups) that are suitable depending on the embodiments are known to those skilled in the art. Also, based on the present disclosure of the invention, one skilled in the art will know how to select appropriate block groups (protecting groups) as routine adaptations of the invention described herein.
  • the process according to the invention for detecting DNA sequences by means of PCR in combination with an electrochemical readout accordingly comprises a novel system of individual DNA oligonucleotides. These form such a target sequence-independent modular reporter complex without covalent bonds.
  • This target sequence-independent modular reporter complex surprisingly has all the advantages and performance indicators of one-part target sequence-dependent DNA probes or one-part target sequence-independent detection molecules.
  • the target sequence-independent modular reporter complex consists of at least two DNA sequences that specifically bind to each other and carry modifications that initiate signal generation during PCR. This means that the target sequence-independent reporter molecules are flexible in design.
  • a further inventive feature here is that optical and electrochemical readout is possible with the reporter complexes according to the invention, with only the types of modifications differing, but not the basic concept of the detection process.
  • This target sequence-independent modular reporter complex created in this way has a very high stability in the initial state under PCR conditions.
  • the initial signal is comparable to that generated by a one-part DNA probe or a one-part target sequence-independent reporter.
  • the entire resulting PCR detection system according to the invention has performance indicators comparable to current PCR detection methods based on one-part detection molecules, although this complex of a target sequence-independent modular reporter has to be separated with each cycle of a PCR and formed again before the signal is read out.
  • the system according to the invention thus increases the efficiency of signal generation and is also suitable for the simultaneous detection of several DNA target genes in a PCR reaction (multiplex PCR).
  • the complex is flexible in design and the individual components are inexpensive to develop and produce.
  • the system enables the production of universal microarrays, for example for electrochemical detection. This means that the functionalization of the solid phase can take place in a very standardized manner and in large batches.
  • the hybridization reaction on the solid phase itself is also reproducible after initial optimization, since the same oligonucleotide combinations are always involved, so that only the partial reactions in the liquid phase need to be optimized for new target sequences.
  • the process according to the invention does not require any additional step for generating a single strand from the (amplified) target sequence, as is often the case in the prior art. Overall, this represents a significant improvement over the state of the art.
  • the different possible applications described here are possible because the target sequence-independent modular reporter complex according to the invention is at the same time flexible in design and, on the other hand, the individual components are cheap to develop and produce.
  • the system according to the invention enables the production of universal microarrays. Overall, this represents a significant improvement over the state of the art.
  • the invention relates to a kit for carrying out the method according to one of the preceding claims, comprising: at least one oligonucleotide primer at least one mediator probe at least one signal initiation oligo at least one base strand at least one buffer
  • the oligonucleotide primers preferably at least one pair of oligonucleotide primers, the at least one signal oligo, the at least one mediator and/or the at least one base strand can be configured or suitable for the specific detection of one or more different target sequences.
  • kit according to the invention can be used to carry out the method according to the invention.
  • the kit can thus be used for the specific amplification and/or detection of target sequences within the scope of the method according to the invention.
  • the specific amplification and/or detection reaction is a PCR, qPCR, real-time PCR, droplet PCR and/or digital PCR.
  • inventions described for one aspect of the invention may also be embodiments of any of the other aspects of the present invention. Accordingly, embodiments described for the method according to the invention can also be embodiments of the kit according to the invention. Additionally, any embodiment described herein may also include features of any other embodiment of the invention.
  • the various aspects of the invention are united, benefit from, are based on and/or are, through the common and surprising discovery of the unexpected advantageous effects of the present method, namely the optimized PCR detection of target sequences by reporter complexes, which themselves are non-specific to the target sequence associated with it.
  • target sequence-unspecific reporter complex describes a complex of target sequence-unspecific DNA oligonucleotides for signal generation during PCR in the presence of the DNA target sequences.
  • the term “basic strand” describes a DNA oligonucleotide and part of the target sequence-unspecific reporter complex.
  • a basic strand serves as the basis for the connection of signal initiation oligos and mediators, which form a signaling complex and receptor complex.
  • the term “base strand” describes a nucleic acid oligonucleotide (e.g. a DNA oligonucleotide) and part of the target sequence-unspecific reporter complex.
  • a basic strand serves as the basis for the connection of signal initiation oligos and mediators, which form a signaling complex and receptor complex.
  • a base strand preferably comprises at least one mediator binding site and at least one signal oligo binding site.
  • a base strand includes one or more mediator binding sites and/or signal oligo binding sites.
  • a base strand can have at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40 or even include 50 Mediator binding sites.
  • a basic strand can also have at least 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40 or even include 50 signal oligo binding sites.
  • a base strand comprises between 1 and 10 mediator binding sites and between 1 and 10 signal oligo binding sites.
  • a Mediator binding site can correspond to one or more signal oligo binding sites, in other words, an (activated) Mediator bound to a Mediator binding site can, when extended, be activated or broken down by a (PCR) polymerase , (Ab)cleavage or release of one or more signal oligos from one or more signal oligo binding sites, preferably located upstream (towards the 5 'end).
  • a basic strand may comprise one or more signaling complexes and one or more receptor complexes, where a signal oligo complex may comprise at least one signal oligo binding site and (in the non-activated state) at least one signal oligo, and a receptor complex may comprise at least one mediator Binding site may include.
  • a signal initiation oligo is a DNA oligonucleotide and part of the signal complex, which initiates a signal change in the presence of a target sequence by itself and or parts thereof being cleaved or broken up by the signal complex.
  • a “signal initiation oligonucleotide”, “signal initiation oligo” or “signal oligo” for short is a nucleic acid oligonucleotide (preferably a DNA oligonucleotide) and part of the signal complex, which initiates a signal change in the presence of a target sequence by itself and or Parts of this are split off or broken up by the signal complex.
  • the terms signal initiation oligonucleotide, signal initiation oligo and signal oligo are to be considered equivalent and interchangeable.
  • a label may preferably be one or more electroactive labels or one or more fluorophores and/or a molecule for coupling further labeling.
  • a base strand and/or a signal initiation molecule or signal initiation oligo in embodiments may carry or comprise one or more electroactive labels and/or fluorophores and/or molecules for coupling further labels.
  • a “mediator” refers to an oligonucleotide and part of the receptor complex, which can be extended along the “basic strand” by the polymerase.
  • a “mediator probe” describes a DNA oligonucleotide that creates the connection between the target sequence and the target sequence-independent (modular) receptor by binding to it during PCR in the presence of a DNA target sequence, cleaved by the exonuclease activity of the polymerase and releases a mediator sequence, which together with the base strand forms a receptor complex.
  • nucleic acid refers to nucleic acid molecules including, without limitation, DNA, ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA, tRNA, lncRNA, ncRNA, microRNA, siRNA, rRNA, sgRNA, piRNA, rmRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, gRNA or viral RNA.
  • Nucleic acid sequences herein refer to a sequential arrangement of nucleotides, the nucleotides being represented by their nucleobases in guanine (G), adenine (A), cytosine (C) and thymine (T) in DNA and uracil (U) in RNA.
  • a nucleic acid sequence here can also refer to the sequence of consecutive letters or nucleobases (consisting of G, A, C and T or U), which represent the actual sequence of consecutive nucleic acids in a DNA or RNA strand.
  • This nucleic acid sequence can be identified and characterized biochemically and bioinformatically using DNA or RNA sequencing or can be specifically detected by complementary nucleic acid probes (e.g. in embodiments herein by mediator probes), e.g. as part of a PCR, real-time PCR or detection reaction digital PCR.
  • the sequence analysis can also include the comparison of the nucleic acid sequence obtained or a detection signal specific therefor with one or more reference nucleic acid sequences and/or with the detection signals of housekeeping genes.
  • nucleotide can be abbreviated as “nt”.
  • base pair two nucleobases bound together via hydrogen bonds
  • a “target sequence” describes any nucleic acid sequence of interest that is to be detected by the method according to the invention.
  • a target sequence can preferably be a DNA or RNA sequence.
  • a target sequence can represent part or all of the nucleic acid sequence of a target DNA.
  • a mediator probe preferably comprises a sequence which is wholly or partially complementary to the nucleic acid sequence of the target sequence or a part thereof. In some embodiments, this mediator probe sequence is 100%, 99%, 95%, 90%, or 80% complementary to the target sequence.
  • a mediator probe may, in some embodiments, tolerate one or more mismatches to the target sequence and still bind to it. In other embodiments, the mediator probe only binds to a target sequence if it matches the target sequence 100%.
  • nucleic acid amplification reaction refers to any method that involves an enzymatic reaction that enables the amplification of nucleic acids.
  • a preferred embodiment of the invention relates to a polymerase chain reaction (PCR).
  • PCR Polymerase chain reaction
  • PCR is the gold standard method for quickly producing millions to billions of copies (full copies or partial copies) of a given DNA sample, allowing the amplification of a very small DNA sample to a sufficiently large amount becomes.
  • PCR amplifies a specific region of a DNA strand (the target DNA sequence) depending on where the primers used bind to start the amplification reaction.
  • Almost all PCR applications use a heat-stable DNA polymerase enzyme, such as. B. Taq polymerase.
  • Quantitative PCR or “real-time PCR”, represents a specific form of PCR and is a standard method for detecting and quantifying a specific target sequence or for quantifying the level of gene expression in a sample Real time.
  • fluorescently or electroactively labeled probes or nucleic acids e.g. mediator probes
  • a complementary sequence e.g. a target sequence
  • This may also include monitoring hybridization and/or extension reactions on a solid phase at a specific time during a PCR cycle.
  • a real-time PCR makes it possible to monitor the progress of an ongoing amplification reaction as it occurs (i.e. in real time). Data is therefore collected over the entire duration of the PCR reaction and not at the end point as with conventional PCR. Measuring reaction kinetics in the early phases of PCR offers significant advantages over conventional PCR detection.
  • reactions are characterized by the point in time during the cycle at which amplification of a target is first detected, rather than by the amount of target accumulated after a fixed number of cycles, as in classical PCR.
  • PCR enables analysis using optical signals that are used to detect a specific PCR product (the target sequence), using specific fluorochromes or fluorophores. An increase in DNA product during a PCR therefore results in an increase in the fluorescence intensity measured at each cycle.
  • fluorescent probes can be used in multiplex assays to monitor multiple target sequences. For embodiments in which oligonucleotides are immobilized on the solid phase and an interaction of amplification products with them takes place, in addition to the characteristics of the label (e.g. wavelength of the fluorophore, redox potential of the electroactive molecule), the position at which the signal change occurs can also be used to distinguish between several Target sequences are used.
  • qPCR While real-time qPCR depends on the relative amount of target nucleic acid being determined in each amplification cycle, "digital PCR", on the other hand, enables the absolute amount of target nucleic acid to be determined based on Poisson statistics, which is determined following an endpoint analysis.
  • PCR amplification is used to calculate the target nucleic acid amount. The steps before amplification are usually comparable or similar between digital PCR and qPCR. However, in qPCR all nucleic acid molecules are preferably pooled and then amplified and analyzed, while in digital PCR the nucleic acid molecules are preferably divided as best as possible into individual partitions (e.g.
  • emulsion drops cavities or gel beads
  • this reaction is also often called droplet PCR or digital droplet PCR
  • digital PCR the random division of the nucleic acid molecules into individual partitions occurs according to the Poisson distribution.
  • Digital PCR analysis then applies Poisson statistics to determine the average number of nucleic acid molecules per partition (none, one, or more). Statistical Poisson analysis of the number of positive and negative reactions provides precise absolute quantification of the target sequence.
  • the invention relates to a method, wherein the amplification is a multiplex PCR with more than one pair of primers.
  • Multiplex PCR is a variant of standard PCR in which two or more target sequences can be amplified and/or detected simultaneously in the same reaction by using at least one pair of primers in the reaction.
  • a “signal change” preferably describes a significant, differentiable and/or characteristic change in the signal, which is clearly demarcated or different from potential basic or background signals or background or background noise.
  • a signal change preferably describes a significant, differentiable and/or characteristic change in the signal, and not a base or background signal or background or background noise.
  • this signal change can mean an increase in the current intensity (eg peak currents) and/or the potential and/or the impedance, in other words an increase in the signal.
  • a signal change is the decrease in signal.
  • the increase in a signal is preferably due to the fact that the number of target sequence amplicons increases as a result of an amplification reaction and thereby the activation of associated signal complexes. The more target sequences are present and are bound by mediator probes in a PCR reaction, the more or sooner (in the case of real-time PCR) the signal increases.
  • the signal is proportional or approximately proportional to the amount of the corresponding target sequence for which the fluorophore signal (eg its color) is specific/characteristic.
  • the signal increases increasingly with the number of target sequence amplicons per reaction space.
  • the intensity/strength of a respective one, preferably specific for a target sequence Labeling and the maximum achievable signal strength/intensity depend on the number of labels per signal oligo and signal complex and/or the type of labeling (e.g. type of fluorophores and/or quenchers).
  • Fluorophore (or fluorochrome, similar to a chromophore) is a fluorescent chemical compound that can re-emit light when excited by light.
  • Quenching refers to any process that reduces the fluorescence intensity of a given substance. Quenching (“quenching”) is the basis for Förster resonance energy transfer (FRET) assays or static or contact quenching assays or a combination of both
  • FRET Förster resonance energy transfer
  • surface quenching means the emission-free transfer of energy between fluorophores and preferably metallic surfaces.
  • a “makeshift oligo” refers to an oligonucleotide which, in addition to the signal oligo and the base strand, is required as a third oligonucleotide in order to amplify the signal change by enriching the signal oligo in the solid phase.
  • electroactive molecule preferably refers to a redox molecule which, in the case of electrochemical detection, is reduced or oxidized at defined potentials, with electrons being transferred.
  • electroactively labeled preferably means that the electroactive molecule is coupled to an oligonucleotide.
  • electroactive molecules for labeling oligonucleotides include methylene blue, ferrocene, anthraquinone, etc.
  • cleavage of the mediator probe and subsequent extension of the mediator on the target sequence-unspecific modular reporter can lead to the binding of an electroactively labeled signal initiation oligo to the base strand being broken. This can then bind to a makeshift oligo that has been immobilized on a solid phase (electrode) and thus bring about a signal change ( Figure 6 iii).
  • the target sequence-independent modular reporter complex can be coupled to a solid phase via a linker on the base strand ( Figure 6 i).
  • the binding of the signal initiation strand with the electroactive label or the binding of the electroactive label itself with the base strand is broken, which brings about a signal change.
  • the signal initiation system can ligo itself can be immobilized on a surface and the entire target sequence-unspecific modular reporter complex can be coupled to the electrode via the base strand, which in this case has an electroactive modification ( Figure 6 ii).
  • the mediator By extending the mediator, the binding of the base strand to the signal initiation oligo is broken, resulting in a signal change.
  • the probability of hybridization to a solid phase probe can be influenced by the effective free energy of the hybridization reaction and/or by different diffusion speeds of molecules of different sizes (length and secondary structure of the DNA (complexes)).
  • fluorophores could be used for optical detection or magnetic particles for magnetoresistive detection (detecting the movement of ferromagnetic materials via the change in magnetic flux).
  • Another option is to immobilize the electroactive label on the solid phase (electrode), either via the base strand ( Figure 6 iv) or the signal initiation oligo ( Figure 6 v).
  • a signal change is achieved by changing the distance from the electroactive molecule to the surface as a result of the severing of the bond between the signal initiation oligo and the base strand.
  • An extension of the mediator causes the distance to the surface to either increase (iv) or decrease (v), which in both cases leads to a signal change.
  • a further embodiment includes an electrochemical detection comparable to an optical detection, such as in Figure? shown.
  • the label After hydrolysis of the labeled signal initiation oligonucleotide, the label has a detectably higher diffusion rate and can therefore be detected even without enrichment by an oligonucleotide immobilized on the electrode (the effect was described, for example, in Pearce, D.M., Shenton, D.P., Holden, J., Gaydos, C.A., 2011. IEEE Trans. Biomed. Eng. 58 (3), 755-758. However, in the version described there).
  • a mediator extension reaction was carried out in the presence of the electrode surface functionalized with the base strand.
  • the reaction mix included a PCR mix (including polymerase, co-factors, etc.) as well as 300 nM of the electroactively labeled molecule (signal oligo) and also 200 nM of either the mediator or the intact mediator probe.
  • the sequences of the oligonucleotides are listed in Table 1. The reaction mix was initially incubated for 5 min at 95 °C to activate the polymerase.
  • reaction mix was then transferred into reaction chambers of a functionalized electrode array.
  • the closed reaction chambers were first incubated in a water bath at 40 °C and then heated up to 62 °C. During the heating phase and the subsequent cooling process, the electrodes were analyzed electrochemically using square-wave voltammetry. When the electroactive molecule accumulates on the electrode surface through hybridization, the current signal has a characteristic peak (Aip ea k).
  • Table 1 Sequences for the mediator extension reaction according to Figure 6 i). Sequence sections that belong to the receptor complex are shown in italics. Sequence sections that belong to the signaling complex are underlined.
  • Figures 2 and 3 initially shows electrochemical signals that are easily detectable at temperatures below 45 °C, but which do not differ between the different reaction mixes. This suggests hybridization of the signal oligo to the solid phase probe, but no significant displacement reaction of an extended mediator. As temperature increases and therefore polymerase activity increases, the signal for reactions containing mediators begins to decrease and differ from mediator probe reactions. This suggests that the mediator on the solid phase oligo is extended by polymerase activity and thereby displaces the electroactively labeled oligonucleotide from it. Even after or during the cooling process, the signals from reaction approaches with active mediator remain distinguishable from reaction approaches with mediator probes ( Figure 3).
  • the active mediator For a real PCR (real-time PCR), the active mediator must be generated by cleavage of the mediator probe.
  • target sequence-specific primers > 200 nM
  • PTC positive controls
  • NTC No Template Control
  • the base strand is on the surface of the Working electrode immobilized.
  • the signal oligo can initially be pre-hybridized with the base strand or be part of the PCR mix.
  • the PCR takes place in real-time detection in a chamber that contains the functionalized electrode.
  • the amplification reaction can also take place in an upstream chamber.
  • the PCR is carried out according to the recommended temperature protocol for the polymerase used, ie after activation of the hotstart polymerase by cyclical temperature changes between 95 °C and approx. 60 °C.
  • the signal is detected during the approximately 60 °C temperature step (typical temperature for the attachment of primers and probes to target sequences).
  • Tm melting temperature
  • endpoint detection possibly in comparison to NTC reactions that have uncleaved mediator probes.
  • the prerequisite for real-time detection is that the melting temperature (Tm) of the mediator and signal oligo at their respective binding sites is above the evaluation temperature.
  • Tm melting temperature
  • There is greater freedom in melting temperature for endpoint detection because mediator extension and signal oligohybridization can occur below the primer annealing temperature.
  • the results so far indicate that there is sufficient polymerase activity for the mediator extension and signal oligodisplacement reaction up to a temperature of 45 °C, i.e. an extended temperature window between 45 °C and approx. 60 °C (with appropriate design of the Tm of Mediator and Signaloligo (also above) is possible.
  • a mediator extension reaction was carried out under PCR conditions in a standard PCR cycler.
  • the electroactively labeled molecule (base strand) and also the mediator or the intact mediator probe as a control were added to the PCR reagents. After 10 cycles, the reaction result was transferred to an electrode array functionalized with the signal oligo.
  • the hybridization reaction that took place there at room temperature was analyzed electrochemically using square-wave voltammetry. The sequences used are listed in Table 2.
  • FIG 4 shows an increasing electrochemical signal for reactions that contained an intact mediator probe (dark gray (upper) curve). Surprisingly, no electrochemical signals can be detected for reactions that contained mediators (light gray (lower) curve). This suggests an effective extension reaction of the mediator on the electroactively labeled strand, which subsequently leads to an effective prevention of the hybridization reaction on the functionalized electrode surface. An elevated temperature or polymerase activity is no longer absolutely necessary for the detection step, with the hybridization rate increasing from a higher hybridization temperature and the signal plateau being reached more quickly.
  • Table 2 Sequences for the mediator extension reaction according to Figure 6 i). Sequence sections that belong to the receptor complex are shown in italics. Sequence sections that belong to the signaling complex are underlined.
  • target sequence-specific primers to the reaction components already mentioned (polymerase, buffer, electroactively labeled base strand), as well as target DNA for the PTC.
  • PTC and NTC reactions are set up and PCR cycles (between 95 °C and approx. 60 °C) are carried out.
  • the electrode functionalized with signal oligo is in the reaction chamber. This is not absolutely necessary for endpoint detection.
  • mediator probes are cleaved during the primer extension reaction in the course of the PCR.
  • the activated mediator hybridizes to the basic strand and is extended there, so that the basic strand is separated from the immobilized signaling oligo and/or its rehybridization to the signaling oligo is prevented.
  • the signal detection in real-time PCR takes place at the end of each primer-ZMediator extension step at approx. 60 °C. A decrease in signal is observed with PTC.
  • the melting temperatures of the signal complex must be close to or above the evaluation temperature. In the case of endpoint detection, the signal from the PTC is lower than that from the NTC reactions.
  • the evaluation temperature can be chosen from room temperature to the melting temperature of the signal complex, with a higher temperature being preferred due to the faster hybridization speed and the avoidance of non-specific hybridization processes.
  • Figure 1 The figure shows the Mediator probe cleavage during a PCR with activation of the Mediator in an embodiment of the invention.
  • the “activated” mediator here corresponds to a mediator sequence that is released after digestion of the mediator probe.
  • FIG 2 Electrochemical signal as a function of the time for carrying out a mediator extension reaction according to the exemplary embodiment according to Figure 6 i) in the presence of the mediator (active) or the mediator probe.
  • the temperature shown refers to the temperature of the water bath.
  • Reactions with mediator probe (compare Figure 2) depending on the temperature of the water bath.
  • the display distinguishes between signals recorded during the heating phase (squares) and during the cooling phase (crosses).
  • the target sequence-independent modular reporter complex can be coupled to a solid phase via a linker on the base strand ( Figure 6i).
  • the mediator By extending the mediator, the binding of the signal initiation strand with the electroactive label or the binding of the electroactive label itself with the base strand is broken, which brings about a signal change.
  • the signal initiation oligo itself can be immobilized on a surface and the entire target sequence-unspecific modular reporter complex can be coupled to the electrode via the base strand, which in this case has an electroactive modification (Figure 6ii).
  • a signal initiation oligo can bind to a makeshift oligo that has been immobilized on a solid phase (electrode) so that a signal change is brought about (Figure 6iii).
  • Two further embodiments are the immobilization of the electroactive label on the solid phase (electrode), either via the base strand ( Figure 6iv) or the signal initiation oligo ( Figure 6v).
  • a signal change is achieved by changing the distance from the electroactive molecule to the surface as a result of the severing of the bond between the signal initiation oligo and the base strand.
  • An extension of the mediator causes the distance to the surface to either increase ( Figure 6iv) or decrease ( Figure 6v), which in both cases leads to a signal change.
  • FIG. 7 The figure shows a further embodiment, with detection without immobilization
  • Oligonucleotide is needed. After hydrolysis of the labeled signal initiation oligonucleotide, the label has a detectably higher diffusion rate and can therefore be detected even without enrichment by an oligonucleotide immobilized on the electrode
  • Mediator probe PCR a novel approach for detection of real-time PCR based on label-free primary probes and standardized secondary universal fluorogenic reporters.
  • Clinical Chemistry 58 11
  • DOI 10.1373/clinchem.2O12.186734.

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Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis mindestens einer Ziel-Nukleinsäuresequenz mittels Verfahren zum Nachweis mindestens einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, umfassend die Schritte: i. Bereitstellen mindestens eines Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter-Komplexes, umfassend mindestens eine Markierung, sowie mindestens zwei Oligonukleotide, nämlich, i. einen Basisstrang, umfassend, 1. mindestens eine Mediator-Bindestelle, 2. mindestens eine Signalinitiationsoligo-Bindestelle, ii. mindestens ein Signalinitiationsoligo, wobei optional die Signalinitiationsoligo-Bindestelle des Basisstrangs und das mindestens eine Signalinitiationsoligo miteinander hybridisiert, jedoch nicht kovalent verbunden sind und zusammen einen Signal-Komplex bilden, j. Bereitstellen mindestens einer Mediatorsonde, wobei die Mediatorsonde ein Oligonukleotid mit mindestens einer Sondensequenz und mindestens einer Mediatorsequenz umfasst, wobei die mindestens eine Sondensequenz eine Affinität zu mindestens einer Ziel-Nukleinsäuresequenz aufweist, und die mindestens eine Mediatorsequenz eine Affinität zu mindestens einer Mediator-Bindestelle an dem Basisstrang des mindestens einen Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter-Komplex aufweist, k. PCR Amplifikation mindestens einer Nukleinsäuresequenz, l. Binden einer Sondensequenz mindestens einer Mediatorsonde an mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, m. Spaltung der Sondensequenz der an die mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz gebundenen mindestens einen Mediatorsonde durch eine PCR Polymerase, wobei die Mediatorsequenz freigesetzt wird, n. Binden mindestens einer freigesetzten Mediatorsequenz an eine Mediator-Bindestelle des mindestens einen Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter-Komplexes, o. Verlängerung der Sequenz mindestens einer an eine Mediator-Bindestelle gebundenen Mediatorsequenz durch eine PCR Polymerase, wobei die Bindung durch Hybridisierung der mindestens einen Signalinitiationsoligo-Bindestelle und des mindestens einen Signalinitiationsoligos aufgebrochen oder verhindert wird, wodurch eine Signaländerung initiiert wird, p. Detektion mindestens einer Signaländerung als Nachweis der mindestens einen Ziel-Nukleinsäuresequenz.

Description

NUKLEINSÄURENACHWEIS IN EINER PCR MITTELS EINES ZIELSEQUENZ-UNSPEZIFISCHEN MODULAREN REPORTERKOMPLEXES UND ELEKTROCHEMISCHER DE¬
TEKTION
Technischer Hintergrund
Bei quantitativen Nachweisreaktionen von PCR-Produkten wie der Real-Time PCR (qPCR) oder der digitalen PCR (dPCR) werden Zielsequenzen vorwiegend entweder durch in die DNA interka- lierende Farbstoffe, welche jedoch unspezifisch an alle vorhandene DNA-Doppelstränge binden, nachgewiesen oder durch DNA-Sonden, welche lediglich eine spezifische DNA-Zielsequenz binden. Diese DNA-Sonden erzeugen direkt (z.B. Taqman-Sonden) oder indirekt (Mediatorsonden in Kombination mit universellen Reportermolekülen) durch ihre Spaltung eine optische Signaländerung. Optische Detektoren detektieren dabei die während der Reaktion generierten Lichtemissionen außerhalb des Reaktionsgefäßes. Diese Nachweissysteme greifen dabei zumeist auf lichtabsorbierende- und emittierende Fluoreszenzmoleküle zurück. Diese Moleküle geben nach Anregung durch Lichtenergie einer bestimmten Wellenlänge Energie in Form von höheren Wellenlängen ab, welche über Detektoren detektiert werden können. Dabei wird zwischen Molekülen unterschieden, deren Lichtenergie in einem bestimmten Wellenlängenbereich detektiert werden soll (Fluoreszenzdonor oder Fluorophor) und Molekülen, die zur Abnahme der Fluoreszenzintensität eines Fluorophors bei räumlicher Nähe führt (Fluoreszenzakzeptor oder Quencher). Ändert sich die die räumliche Nähe zwischen Fluorophor und Quencher, kommt es entsprechend zu einer Änderung des Fluoreszenzsignales, wobei ein geringerer Abstand stets ein höheres Quenching bewirkt (FRET- Quenching oder Kontakt-Quenching). Der Einsatz von Zielsequenz-spezifischen DNA-Sonden in Kombination mit unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierungen ermöglicht weiterhin den sensitiven Nachweis von mehreren DNA-Sequenzen in einer Reaktion (Multiplex-Nachweis). Hierbei werden zumeist mehrere DNA-Sonden oder Nachweismoleküle eingesetzt, welche unterschiedliche Flu- orophor-Quencher-Kombinationen tragen, welche in Gegenwart einer bestimmten DNA-Sequenz jeweils Fluoreszenzsignal in einem bestimmten Wellenlängenbereich emittieren. Weiterentwicklungen dieses Multiplexing-Nachweises ermöglichen zudem ebenfalls den Nachweis mehrerer Zielsequenzen innerhalb eines Wellenlängenbereichs, indem die Fluoreszenzwerte quantitativ betrachtet werden oder mit weiteren Parametern (z.B. der Auslesetemperatur) kombiniert werden.
Zwei bekannte einteiligen Zielsequenz-spezifischen DNA-Sonden zur optischen Detektion sind Taqman-Sonden und Molecular Beacons (Tan et al. 2004; Li et al. 2008; Holland et al. 1991 ; Ro- driguez et al. 2005) diese binden Zielsequenz-spezifisch und werden während der PCR gespalten, wodurch ein Signal generiert wird. Nachteil dieser Sonden ist die Abhängigkeit von der Zielgensequenz, womit einhergeht, dass nur spezielle Regionen einer DNA-Zielsequenz, welche bestimmten Anforderungen entsprechen müssen, verwendet werden können. Es muss beispielsweise auf Sondenlänge, Schmelztemperatur, Bindungsenthalpie, GC-Gehalt, Guanin-quenching und komplementäre Sequenzfragmente geachtet werden. Zudem kann ihre Synthese sehr anspruchsvoll sein. Es existieren einzelne Beispiele für (spezifische) elektrochemische Detektion von Zielsequenzen in der Flüssigphase. Häufiger ist die Detektion von Zielsequenzen durch Hybridisierungsreaktionen an funktionalisierten Elektroden beschrieben.
Beispiele für eine Detektion in der Flüssigphase funktionieren nach der Methode der Molecular Beacons. Molecular Beacons bestehen aus einem Oligonukleotid (Oligo) mit fünf bis sieben zueinander komplementäre Basen an den beiden Enden sowie einem endständigen Fluorophor bzw. Quencher (Tyagi und Kramer 1996). Anstelle eins Fluorophors bei einem Molecular Beacon wird eine elektroaktive Markierung verwendet und anstelle des Quenchers ein Molekül, das das elektroaktive Molekül komplexiert und so einen effektiven Elektronentransfer verhindert. Auf das komplexbildende Molekül kann verzichtet werden, wenn die Sekundärstruktur des Molecular Beacons eine reversible Binderegion (in Form eines Aptamers) für das elektroaktive Molekül ausbildet. In diesem Fall bewirkt die Hybridisierung der Zielsequenz mit dem Molecular Beacon die Freisetzung des elektroaktiven Moleküls.
Die spezifische elektrochemische Detektion von Ziel-DNA erfolgt mittels Festphase häufig über spezifisch funktionalisierte Elektroden, an die das Amplifikationsprodukt oder eine Sonde hybridisiert. Vor der Hybridisierungsreaktion werden üblicherweise aus doppelsträngigen Amplifikationsprodukten einzelsträngige DNA-Moleküle generiert, beispielsweise durch enzymatischen Verdau. Zur Signalgenerierung werden dann entweder interkalierende elektroaktive Moleküle zugegeben oder eine weitere Hybridisierungssonde, die mit einem elektroaktiven Molekül modifiziert ist.
In der Literatur sind DNA-Nachweisreaktionen zu finden, für die Elektrodenoberflächen mit universell nutzbaren DNA-Sonden funktionalisiert wurden. Üblicherweise wird dabei jedoch die Ziel-DNA nicht amplifiziert, sodass die Sensitivität der Methoden gering ist. Einige Methoden erfordern, dass die Zielsequenz als Einzelstrang vorliegt, sodass entweder ein initialer Schritt zur Einzelstranggenerierung benötigt wird oder die Anwendung auf einzelsträngige RNA eingeschränkt bleibt. Auch die Reaktionszeiten sind häufig deutlich länger, als sie für eine DNA-Amplifikationsreaktion zu erwarten ist. Nach unserem Wissensstand ist lediglich eine Form der Hybridisierungskettenreaktion mit beispielsweise einer PCR vergleichbar, für die laut Publikation Detektionslimits von 50 aM innerhalb 120 min erreicht werden (Liu et al. 2017). Auch hierfür wird zunächst eine einzelsträngige Zielsequenz benötigt, die eine erste DNA-Sonde (gefaltet in Haarnadel Struktur) auffaltet. Aufgefaltet kann die erste Sonde, eine zweite universelle Sonde (initial ebenfalls als Haarnadelstruktur vorliegend) auffalten. Diese zweite Sonde ist mit einem elektroaktiven Molekül modifiziert. In aufgefaltetem Zustand kann diese zweite Sonde an eine oberflächengebundene weitere Sonde hybridisieren, sodass an der Elektrodenoberfläche elektroaktive Moleküle angereichert werden.
Das Patent WQ2013079307A1 Bifunktionale Oligonukleotidsonde zur universellen Echtzeit Multi- analytdetektion beansprucht das System der Mediator-Sonden-Technologie. In diesem System wird eine Mediatorsonde aktiviert, indem ein Primer (auxiliary molecule 1) mittels einer Polymerase (auxiliary molecule 2) an der Zielsequenz (target molecule) verlängert wird. Aufgrund der Exonuk- leaseaktivität der Polymerase wird die Mediatorsonde gespalten und kann anschließend an den UR binden (mediator hybridsation sequence). Hier fungiert er nach seiner Spaltung als Primer. Hierdurch wird er durch die Polymerase verlängert und trennt somit Fluorophor und Quencher am Universal Reporter voneinander, wodurch es zu einer Signalgenerierung kommt. Ein Beispiel für zweigeteilte Reportersysteme findet sich im Patent WO2018114674A1 zur schleifenvermittelten isothermalen Amplifikationsmethode mit Mediator-displacement Sonden (MD LAMP) wird ein universeller Reporter mit mindestens einem Oligonukleotid und mindestens einem Fluorophor und Quencher für eine LAMP-Reaktion beansprucht. Bisher wurde davon ausgegangen, dass dies nur funktioniert, da eine LAMP im Gegensatz zu einer PCR kontinuierlich eine einheitliche Temperatur besitzt, wodurch sich schnell ein Gleichgewicht einstellt und beibehalten wird, was es einzelnen Molekülen ermöglicht dauerhaft aneinanderzu binden und so im initialen Zustand kein Signal zu erzeugen.
Auch in Bezug auf den Nachweis an einer Festphase wurden bislang lediglich einteilige universelle Reporter beschrieben, die auf Elektrodenoberflächen angebunden sind. Die Signaländerung wird bislang durch Hybridisierung eines verdrängten Mediators bewirkt.
In Multiplexvariationen werden allgemein in optischen Nachweisreaktionen verschiedene Wellenlängen verwendet, um einzelne Zielsequenzen in bestimmten Lichtbereichen, den sogenannten Detektionskanälen, in einer Reaktion unterscheiden zu können. Dies schränkt das Multiplexen ein, da je Kanal nur eine Zielsequenz nachgewiesen werden kann. Somit ist der Multiplexgrad in den meisten kommerziellen Geräten auf fünf oder sechs Kanäle beschränkt.
Ein alternativer Ansatz zum Multiplexen stellen Patente mit Detektionssystemen dar, welche ebenfalls auf einer Trennung von Signalgenerierung und Detektion beruhen, wie die Patentschrift US20200087718A1 von Seegene zur Signalmolekül-basierten Detektion mittels Schmelzkurvenanalyse. Dieses Patent beansprucht die Möglichkeit zur Erhöhung des Multiplexgrades durch die Nutzung verschiedener Längen des Zielsequenz-unspezifischen Signalmoleküls, um unterschiedliche Schmelztemperaturen zu generieren. Eine weitere Teilanmeldung (EP2708608) nutzt gegenüber dem ursprünglichen Patent nur noch die Signalauslese bei vorab definierten Temperaturen, da die entsprechenden einteiligen Signalmoleküle unterschiedlicher Sequenzlängen ebenfalls unterschiedliches Fluoreszenzverhalten bei definierten Auslesetemperaturen zeigen.
Ein weiteres Patent ist das nur in den USA erteilte Patent der Firma Biorad (US9921154B2). Dieses beansprucht ebenfalls den Nachweis mehrerer Zielsequenzen in identischen Detektionskanälen in einer digitalen PCR, lässt sich aber nach aktuellem Verständnis nur dann anwenden, wenn je Reaktionsraum einer digitalen PCR eine signifikante Mehrfachbelegung mit DNA-Zielsequenzen auftritt, welche so zu unterscheidbaren Signalclustern im Datenraum führen. Die hier beschriebene erfindungsgemäße Methode besitzt diesem Patent gegenüber den Vorteil, dass es sich ebenfalls bei nicht Mehrfachbelegung anwenden lässt.
Ein Beispiel für einen universellen elektrochemischer Nachweis findet sich in der Patentschrift DE102011056606B3 der FRIZ Biochem GmbH, welche eine universelle Nachweismethode für die elektrochemische Detektion beschreibt. Dabei wird ein sogenanntes Signal-Oligo verwendet, das in Haarnadelstruktur vorliegt. Der Loop Bereich enthält eine Ziel-DNA spezifische Sequenz. Der Stamm (engl.: „stern“) der Haarnadel enthält eine universelle Sequenz, die an die komplementäre universelle Festphasensonde hybridisieren kann, und für die Detektion mit einem elektroaktiven Molekül modifiziert ist. Im gefalteten Zustand ist die Hybridisierung nicht effektiv. Wenn das Sig- nalinitiations-Oligo mit der Zielsequenz hybridisiert, faltet sie sich auf und die Sequenzen des Stamms bilden Flaps. Während einer DNA-Amplifikationsreaktion schneidet die Exonuklease Domäne der Polymerase die Flapsequenz, sodass diese effektiver mit der Festphasensonde hybridisieren kann.
Ein Nachteil dieser Methode ist, dass das Signal-Oligo mit einem verhältnismäßig teuren elektroaktiven Molekül modifiziert ist. Da das Signal-Oligo auch einen Zielsequenz-spezifischen Bereich enthält, kann daher die Assayoptimierung teuer werden. Das Design von Signal-Oligo und Festphasensonde ist nicht trivial. Durch Optimierung der Schmelztemperaturen muss verhindert werden, dass die Festphasensonde bereits mit dem noch gefalteten Signal-Oligo interagiert. Gleichzeitig muss verhindert werden, dass die komplementären Teile des Stamms auch nach Spaltung durch die Exonukleaseaktivität wieder miteinander hybridisieren. In der Patentschrift wird daher beschrieben, dass die Festphasensonde einzelne Basen enthalten sollte, die nicht komplementär zum Stamm des Signal-Oligonukleotids sind, um so die Schmelztemperaturen zu optimieren.
Aufgabe der Erfindung
PCR ist die Goldstandard Methode, um einzelne DNA-Sequenzen zu amplifizieren und so nachweisbar zu machen. Um PCR-Produkte (DNA oder cDNA im Fall von RNA) nachzuweisen und zu quantifizieren werden entweder interkalierende Farbstoffe oder DNA-Sonden genutzt. Interkalie- rende Farbstoffe binden jedoch unspezifisch an alle vorhandenen doppelsträngigen DNA-Mole- küle, wodurch kein direkter sequenzspezifischer Nachweis in der PCR möglich wird. Bei DNA- Sonden handelt es sich um signalerzeugende DNA-Sequenzen, welche komplementär zum jeweiligen Sequenzabschnitt eines PCR-Produktes sind und diese so spezifisch nachweisen und quantifizieren können. Insbesondere wird diese Methode in der real-time PCR und digitalen PCR genutzt. Aktuell verfügen DNA-Sonden entweder selbst über eine biochemische Modifikation, um in Gegenwart einer DNA-Zielsequenz während der PCR ein Signal zu erzeugen (z.B. Taqman-Son- den) oder aktivieren ein zweites Nachweismolekül, welches, Zielsequenz unabhängig, ein Signal generiert (z.B. Mediatorsonden in Kombination mit Zielsequenz-unspezifischen universellen Reportern).
Für die Detektion verwendet das erfindungsgemäße Verfahren vorzugsweise elektrochemische Methoden zum Nachweis von DNA-Sequenzen in einer PCR. Diese unterscheiden sich in ihrer Methodik stark von den bisher beschriebenen optischen Methoden, da eine Signaländerung über eine Änderung des elektrischen Ladungstransfers an einer Elektrode generiert wird. Dies bedeutet, dass die Signaländerung an der Elektrodenfestphase detektiert werden muss. Dabei bringt dies viele Vorteile mit sich. So ist die Signalerfassung sehr sensitiv und direkt, was entsprechende teure optische Detektionssysteme überflüssig macht. Dies ist von Vorteil, da entsprechende elektrochemische Detektoren signifikant günstiger, robuster und leicht zu miniaturisieren sind. Bisher stellt die nicht direkte Übertragbarkeit zwischen optischer und elektrochemischer Detektion ein Problem dar, da es nicht ausreicht lediglich einen Biosensor (z.B. eine DNA-Sequenz) an einer Elektrode zu ergänzen. Vielmehr müssen sämtliche Nachweiskomponenten angepasst werden und andere Nachweismechanismen genutzt werden. Diese Hürde verhindert die schnelle Übertragung von Nachweissystemen zwischen optischer und elektrochemischer Detektion. Dies zeigt den dringenden Bedarf an einem neuen Typus von Nachweisprozessen und Signalmolekülen auf, welche diese Probleme überwinden. Zudem sollte dieser Nachweisprozess auf einem allgemeinen Grundprozess beruhen, sodass ähnliche DNA-Sequenzlayouts für eine optische oder elektrochemische Detektion genutzt werden können, um eine schnelle Übertragung zwischen unterschiedlichen Detektionsmethoden zu gewährleisten.
Den Kern eines solchen Prozesses wäre eine neue Art eines modularen Nachweismolekülkomplexes, welcher Zielsequenz-unspezifisch ist, flexibel im Design und leicht zu optimieren und hierbei dieselben Leistungsmerkmale besitzt, wie der aktuelle Stand der Technik sie für einteilige Nachweismoleküle beschreibt. Hierzu sollte dieser ähnliche Sequenzmuster besitzen, um Nachweisprozesse leichter zwischen optischer wie elektrochemischer Detektion übertragen zu können. Bisher scheiterte eine solche modulare Zusammensetzung insbesondere daran, dass diese auf kovalente chemische Bindungen verzichten, was sie nach aktuellen Annahmen des Stands der Technik ungeeignet für PCR-Anwendungen erscheinen lässt.
Die einmal optimierte Reaktion der signalbewirkenden bzw. -initiierenden Oligonukleotide, insbesondere die Hybridisierungsreaktion an der Festphasenoberfläche, sollte zudem leicht und reproduzierbar auf weitere Zielsequenzen übertragbar sein. Der universelle Charakter der Oberflächenmodifizierung soll es erlauben, die Sequenzen unverändert zu lassen, die an den Oberflächen re- aktionen beteiligt sind, auch wenn diese Oberflächen zur Detektion von weiteren Zielsequenzen genutzt werden sollen. Die zielsequenzspezifischen Reaktionen sollen daher alle in der Flüssigphase stattfinden, sodass für die Entwicklung eines neuen Nukleinsäurenachweises lediglich die Reagenzien und Oligonukleotide der Flüssigphase angepasst, neu entwickelt und optimiert werden müssen. Die Oberflächen und deren Modifikation (z.B. die Immobilisierung von Oligonukleotiden auf Elektrodenoberflächen) sollen dagegen in großen Batches und dadurch kostengünstig herstellbar sein. Durch diese Maßnahmen soll Entwicklungsaufwand (Zeit und Kosten) gespart werden.
Zusammenfassung der Erfindung
Die erfindungsgemäße Aufgabe wird gelöst durch die Merkmale der unabhängigen Ansprüche. Vorteilhafte Ausgestaltungen der Erfindung sind in den abhängigen Ansprüchen beschrieben.
Daher bezieht sich die Erfindung in einem Aspekt auf ein Verfahren zum Nachweis mindestens einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, umfassend die Schritte: a. Bereitstellen mindestens eines Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter- Komplexes, umfassend mindestens eine Markierung, sowie mindestens zwei Oligonukleotide, nämlich i. einen Basisstrang, umfassend
1. mindestens eine Mediator-Bindestelle
2. mindestens eine Signalinitiationsoligo-Bindestelle ii. mindestens ein Signalinitiationsoligo wobei optional die Signalinitiationsoligo-Bindestelle des Basisstrangs und das mindestens eine Signalinitiationsoligo miteinander hybridisiert, jedoch nicht kovalent verbunden sind und zusammen einen Signal-Komplex bilden. b. Bereitstellen mindestens einer Mediatorsonde, wobei die Mediatorsonde ein Oligo- nukleotid mit mindestens einer Sondensequenz und mindestens einer Mediatorsequenz umfasst, wobei die mindestens eine Sondensequenz eine Affinität zu mindestens einer Ziel-Nukleinsäu- resequenz aufweist, und die mindestens eine Mediatorsequenz eine Affinität zu mindestens einer Mediator-Bindestelle an dem Basisstrang des mindestens einen Zielsequenz-unspe- zifischen modularen Reporter-Komplex aufweist, c. PCR Amplifikation mindestens einer Nukleinsäuresequenz, d. Binden einerSondensequenz mindestens einer Mediatorsonde an mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, e. Spaltung der Sondensequenz der an die mindestens eine Ziel-Nukleinsäurese- quenz gebundenen mindestens einen Mediatorsonde durch eine PCR Polymerase, wobei die Mediatorsequenz freigesetzt wird, f. Binden mindestens einer freigesetzten Mediatorsequenz an eine Mediator-Binde- stelle des mindestens einen Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter- Komplexes, g. Verlängerung der Sequenz mindestens einer an eine Mediator-Bindestelle gebundenen Mediatorsequenz durch eine PCR Polymerase, wobei die Bindung der miteinander hybridisierten mindestens einen Signalinitiationsoligo-Bindestelle und des mindestens einen Signalinitiationsoligos aufgebrochen wird, wodurch eine Signaländerung initiiert wird, h. Detektion mindestens einer Signaländerung als Nachweis der mindestens einen Ziel-Nukleinsäuresequenz.
In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Nachweis mindestens einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, die folgenden Schritte: a. Bereitstellen mindestens eines Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter- Komplexes, umfassend mindestens eine Markierung, sowie mindestens zwei Oligonukleotide, nämlich i. einen Basisstrang, umfassend
1. mindestens eine Mediator-Bindestelle
2. mindestens eine Signalinitiationsoligo-Bindestelle ii. mindestens ein Signalinitiationsoligo wobei optional die Signalinitiationsoligo-Bindestelle des Basisstrangs und das mindestens eine Signalinitiationsoligo miteinander hybridisiert, jedoch nicht kovalent verbunden sind und zusammen einen Signal-Komplex bilden, b. Bereitstellen mindestens einer Mediatorsonde, wobei die Mediatorsonde ein Oligo- nukleotid mit mindestens einer Sondensequenz und mindestens einer Mediatorsequenz umfasst, wobei die mindestens eine Sondensequenz eine Affinität zu mindestens einer Ziel-Nukleinsäu- resequenz aufweist, und die mindestens eine Mediatorsequenz eine Affinität zu mindestens einer Mediator-Bindestelle an dem Basisstrang des mindestens einen Zielsequenz-unspe- zifischen modularen Reporter-Komplex aufweist, c. PCR Amplifikation mindestens einer Nukleinsäuresequenz, d. Binden einer Sondensequenz mindestens einer Mediatorsonde an mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, e. Spaltung der Sondensequenz der an die mindestens eine Ziel-Nukleinsäurese- quenz gebundenen mindestens einen Mediatorsonde durch eine PCR Polymerase, wobei die Mediatorsequenz freigesetzt wird, f. Binden mindestens einer freigesetzten Mediatorsequenz an eine Mediator-Binde- stelle des mindestens einen Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter-Komplexes, g. Verlängerung der Sequenz mindestens einer an eine Mediator-Bindestelle gebundenen Mediatorsequenz durch eine PCR Polymerase, wobei die Bindung der mindestens einen Signalinitiationsoligo-Bindestelle und des mindestens einen Signali- nitiationsoligos, vorzugsweise über Hybridisierung, aufgebrochen wird und/oder verhindert wird, wodurch eine Signaländerung initiiert wird, h. Detektion mindestens einer Signaländerung als Nachweis der mindestens einen Ziel-Nukleinsäuresequenz.
In einerweiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst das Verfahren zum Nachweis mindestens einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, die folgenden Schritte: a. Bereitstellen mindestens eines Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter- Komplexes, umfassend mindestens eine Markierung, sowie mindestens zwei Oligonukleotide, nämlich i. einen Basisstrang, umfassend
1. mindestens eine Mediator-Bindestelle
2. mindestens eine Signalinitiationsoligo-Bindestelle ii. mindestens ein Signalinitiationsoligo wobei optional die Signalinitiationsoligo-Bindestelle des Basisstrangs und das mindestens eine Signalinitiationsoligo miteinander hybridisiert, jedoch nicht kovalent verbunden sind und zusammen einen Signal-Komplex bilden, b. Bereitstellen mindestens einer Mediatorsonde, wobei die Mediatorsonde ein Oligo- nukleotid mit mindestens einer Sondensequenz und mindestens einer Mediatorsequenz umfasst, wobei die mindestens eine Sondensequenz eine Affinität zu mindestens einer Ziel-Nukleinsäu- resequenz aufweist, und die mindestens eine Mediatorsequenz eine Affinität zu mindestens einer Mediator-Bindestelle an dem Basisstrang des mindestens einen Zielsequenz-unspe- zifischen modularen Reporter-Komplex aufweist, c. PCR Amplifikation mindestens einer Nukleinsäuresequenz, d. Binden einer Sondensequenz mindestens einer Mediatorsonde an mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, e. Spaltung der Sondensequenz der an die mindestens eine Ziel-Nukleinsäurese- quenz gebundenen mindestens einen Mediatorsonde durch eine PCR Polymerase, wobei die Mediatorsequenz freigesetzt wird, f. Binden mindestens einer freigesetzten Mediatorsequenz an eine Mediator-Binde- stelle des mindestens einen Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter-Komplexes, g. Verlängerung der Sequenz mindestens einer an eine Mediator-Bindestelle gebundenen Mediatorsequenz durch eine PCR Polymerase, wobei die Bindung oder Hybridisierung, der mindestens einen Signalinitiationsoligo-Bindestelle und des mindestens einen Signalinitiationsoligos entweder i) aufgebrochen und/oder verhindert wird oder ii) initiiert und/oder hergestellt wird, wodurch ein Signaländerung initiiert wird, h. Detektion mindestens einer Signaländerung als Nachweis der mindestens einen Ziel-Nukleinsäuresequenz.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens (z.B. ähnlich der in Figur 6 ii) dargestellten) sind das Signaloligo und der Basisstrang nicht von vornherein miteinander hybridisiert und bilden in Schritt a. noch keinen Signal-Komplex. Die Verlängerung des Mediators am Basisstrang kann in mancher solcher Ausführungsformen, z.B. in einer separaten Kammer/Kavität/Well stattfinden, sodass die Hybridisierung beispielsweise in einer (späteren) Endpunkt-Detektion erst zu einem späteren Zeitpunkt/in einem späteren Schritt, quasi nachträglich, stattfindet. In manchen dieser Ausführungsformen ist die Signaländerung in Schritt g. daher keine „Signaländerung“ sondern vielmehr ein verändertes Signal im Vergleich zu einer Kontrollreaktionen mit intakter Mediatorsonde. In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist daher die Signaländerung in Schritt g. ein verändertes Signal, vorzugsweise ein im Vergleich zu einer Kontrollreaktion mit ungespaltener Mediatorsonde, verändertes Signal das initiiert wird oder vorliegt.
In Ausführungsformen umfasst Schritt g. die Verlängerung der Sequenz mindestens einer an eine Mediator-Bindestelle gebundenen Mediatorsequenz durch eine PCR Polymerase, wobei die Bindung (und/oder Hybridisierung) der mindestens einen Signalinitiationsoligo-Bindestelle und des mindestens einen Signalinitiationsoligos entweder i) aufgebrochen wird und/oder verhindert wird, oder ii) initiiert oder ermöglicht/hergestellt wird, wodurch/sodass ein verändertes Signal im Vergleich zu einer Kontrollreaktion mit ungespaltener Mediatorsonde hervorgerufen wird.
In Ausführungsformen umfasst Schritt g. die Verlängerung der Sequenz mindestens einer an eine Mediator-Bindestelle gebundenen Mediatorsequenz durch eine PCR Polymerase, wobei die Bindung (Hybridisierung) der mindestens einen Signalinitiationsoligo-Bindestelle und des mindestens einen Signalinitiationsoligos entweder i) aufgebrochen wird und/oder verhindert wird oder ii) initiiert oder ermöglicht/hergestellt wird, wodurch eine Signaländerung initiiert wird. In Ausführungsformen ist eine Signaländerung ein verändertes Signal, vorzugsweise ein im Vergleich zu einer Kontrollreaktion mit ungespaltener Mediatorsonde, verändertes Signal.
Beispielhafte Ausführungsformen sind in den Figuren 6i-6v dargestellt. In manchen Ausführungsformen wird eine Signaländerung durch die Hybridisierung eines Signalinitiationsoligos mit einem Oligonukleotid, wobei bevorzugt eines der beiden Moleküle mindestens eine Markierung umfasst, erzeugt, in anderen Ausführungsformen wird eine Signaländerung durch die Verhinderung oder Spaltung/Aufbrechen einer Hybridisierung generiert. In bestimmten Ausführungsformen wird eine Signaländerung durch die Veränderung des Abstands von mindestens einem elektroaktivem Molekül zu einer Oberfläche als Folge der Auftrennung der Bindung zwischen Signalinitiationsoligo und Basisstrang erzielt. Hierbei bewirkt eine Verlängerung des Mediators entweder, dass der Abstand zur Oberfläche zunimmt (Figur 6iv) oder abnimmt (Figur 6v), was in beiden Fällen zu einer Signaländerung führt.
In Ausführungsformen umfasst Schritt g. die Verlängerung der Sequenz mindestens einer an eine Mediator-Bindestelle gebundenen Mediatorsequenz durch eine PCR Polymerase, wobei die Bindung der, optional miteinander hybridisierten, mindestens einen Signalinitiationsoligo-Bindestelle und des mindestens einen Signalinitiationsoligos aufgebrochen und/oder verhindert wird, wodurch eine Signaländerung und/oder ein (z.B. im Vergleich zu einer Kontroll-reaktion) geändertes Signal initiiert wird.
In Ausführungsformen sind in Schritt a) die Signalinitiationsoligo-Bindestelle des Basisstrangs und das mindestens eine Signalinitiationsoligo miteinander hybridisiert, jedoch nicht kovalent verbunden, und bilden zusammen einen Signal-Komplex.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt g. eine Signaländerung initiiert indem das separierte mindestens eine Signalinitiationsoligo mindestens eine Markierung umfasst und an mindestens ein Behelfsoligo (bevorzugt umfassend eine Signaloligonukleotidbin- destelle) bindet, welches an einer Festphase immobilisiert ist. Nicht-Iimitierende Ausführungsbeispiele der Ausführungsformen sind in der Figur 6 iii) dargestellt. In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt g. eine Signaländerung initiiert indem eines der zwei Oligonukleotide oder beide Oligonukleotide des mindestens einen Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter-Komplexes nämlich i. der Basisstrang, und/oder ii. das mindestens eine Signalinitiationsoligo, über je einen Linker an einer Festphase immobilisiert ist/sind.
Das modulare Reporter-System der Zielsequenz-unspezifischen Detektion ist eine neue Erfindung, die sich durch den flexiblen Einsatz verschiedener Oligonukleotide mit unterschiedlichen Markierungen von den bisher bekannten Detektionssystemen abgrenzt. Vor allem der modulare Aufbau erbringt diverse Vorteile wie das flexibel anpassbare Design an bestimmte Gerätebedingungen, die Einheitlichkeit der Signalgenerierungsreaktion zwischen verschiedenen Detektions-Methoden oder die günstige, einfache Herstellung sowie gänzlich neue multiplex Nachweismethoden. Das System und seine Funktionalität wurde bisher weder in einem Patent noch in der Literatur zur Nukleinsäuredetektion in einer PCR beschrieben.
Den Kern der Erfindung bildet der modular aufgebaute Zielsequenz-unabhängige modulare Reporterkomplex (z.B. in Figur 1) aus nicht kovalent miteinander verbundenen Oligonukleotiden. Dieses System besitzt alle Vorteile der verschiedenen Zielsequenz-spezifischen Detektionssysteme sowie Zielsequenz-unspezifischer Nachweismoleküle und kombiniert sie mit einer erhöhten Flexibilität im Design solcher Nachweismoleküle, welche zu gänzlich neuen Nachweismethoden führen. Überraschenderweise kann das System in einer PCR mit zyklischer Temperaturveränderung, und der damit einhergehenden Aufschmelzung der DNA-Stränge in jedem Zyklus, ohne Probleme eingesetzt werden. Untersuchungen der Erfinder haben gezeigt, dass das erfindungsgemäße modulare System die Systeme des Standes der Technik sogar in deren Funktionalität übertrifft. Hierbei kann die deutlich günstigere Herstellung bei mindestens genauso guten Leistungsparameters erzielt werden. Ein weiterer Vorteil des erfindungsgemäßen Systems ist die Möglichkeit zur flexiblen Anpassung der erfindungsgemäßen universellen Sonde.
Das modulare System des erfindungsgemäßen Zielsequenz-unabhängigen modularen Reporterkomplex besteht im Grundgerüst aus einem Basisstrang. Dieser besitzt mindestens eine Bindestelle für einen Mediator (Rezeptor-Komplex) und mindestens eine Bindestelle für ein Signalinitia- tionsoligonukleotid (Signal-Komplex). Der Basisstrang und mindestens ein Signalinitiationsoligo bilden gemeinsam einen Komplex aus (z.B. Figur 1). Mindestens einer dieser Stränge besitzt hierbei eine Markierung, welche eine strukturelle Änderung dieses Komplexes nachweisen kann. Der modulare Aufbau ergibt sich aus mehreren möglichen Signalinitiationsoligonukleotiden (oder „Sig- nalinitiationsoligos“) welche in unterschiedlichen Ausführungsformen mit einem Basisstrang auf unterschiedliche Art kombiniert werden können (siehe z.B. Figur 5-7). Durch verschiedene Möglichkeiten zur Anbringung von Signalinitiationsoligonukleotiden und Basissträngen an einer Festphase (z.B. einer Elektrode) können die Vorteile von Zielgen-abhängigen Systemen des Stands der Technik aufgegriffen werden. Durch den modularen Aufbau kann eine weitaus höhere Anzahl an Markierungen je Komplex angebracht werden als es bei aktuellen einteiligen Nachweismolekülen möglich ist. Aufgrund dieser Neuartigkeit des modularen Nachweiskomplexes ergeben sich neue Möglichkeiten für Nachweisreaktionen, welche auf einer Basisreaktion beruhen welche im Folgenden beispielhaft beschrieben ist.
Während einer PCR-Nachweisreaktion bindet eine Mediatorsonde an die amplifizierte DNA-Zielse- quenz (Figur 1). Eine Mediatorsonde ist ein Oligonukleotid und besitzt einen sequenzspezifischen Sondenabschnitt, welcher an die Zielsequenz bindet und in manchen bevorzugten Ausführungsformen am 3'-Ende geschützt ist, und einen Zielsequenz-unspezifischen Abschnitt, Mediator genannt, welcher bis auf ein Nukleotid, welches Mediator und Sonde gemeinsam ist, nicht an die Zielsequenz bindet. Während der Primerverlängerung durch eine Polymerase mit Exonukleaseak- tivität wird der Mediator von der Sonde abgespalten, wobei die gemeinsame Base am Mediator verbleibt (Figur 1 ). Der Mediator ist nun nicht mehr durch den Sondenabschnitt blockiert und kann nun an den Zielsequenz-unspezifischen-Reporter-Komplex binden und hier verlängert werden. Hierbei bindet der Mediator an den Rezeptorkomplex des Basisstrangs des Zielsequenz-unabhängigen modularen Reporterkomplexes. Anschließend wird der Mediator durch die Polymerase entlang des Basisstranges verlängert, wobei der Signalkomplex in einer Weise aufgebrochen wird, dass einzelne Bestandteile und/oder Moleküle dieses Komplexes abgespalten werden und hierdurch eine Signaländerung gegenüber dem Urzustand initiiert wird (Figuren 5-7).
Die vorliegende Erfindung erzielt die vorteilhafte Wirkung, dass eine einmal optimierte Reaktion der signalbewirkenden bzw. -initiierenden Oligonukleotide, insbesondere die Hybridisierungsreaktion an der Festphasenoberfläche, leicht und reproduzierbar auf weitere Zielsequenzen übertragbar ist. Ein weiterer Vorzug der Erfindung ist, dass der universelle Charakter der Oberflächenmodifizierung es erlaubt, die Sequenzen unverändert zu lassen, die an den Oberflächenreaktionen beteiligt sind, auch wenn diese Oberflächen zur Detektion von weiteren Zielsequenzen genutzt werden sollen. In Ausführungsformen findet eine zielsequenzspezifischen Reaktionen bevorzugt in der Flüssigphase statt, sodass für die Entwicklung eines neuen Nukleinsäurenachweises lediglich die Reagenzien und Oligonukleotide der Flüssigphase angepasst, neu entwickelt und optimiert werden müssen. Außerdem ist es vorteilhaft, dass bevorzugt die Oberflächen und deren Modifikation (z.B. die Immobilisierung von Oligonukleotiden auf Elektrodenoberflächen) in großen Batches und dadurch kostengünstig herstellbar sind. Zusammenfassend ermöglicht die Erfindung, dass Entwicklungsaufwand (Zeit und Kosten) eingespart werden kann.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst entweder der Basisstrang oder das mindestens eine Signalinitiationsoligo die mindestens eine Markierung.
Um eine elektrochemische Signaländerung während einer Amplifikationsreaktion zu detektieren, kann die Spaltung der Mediatorsonde und anschließende Verlängerung des Mediators am Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter dazu führen, dass die Bindung eines elektroaktiv markierten Signalinitiationsoligos zum Basisstrang aufgebrochen wird. Dieses kann dann an ein Behelfsoligo binden, welches an einer Festphase (Elektrode) immobilisiert wurde, und so eine Signaländerung herbeiführen (Figur 6iii). Als alternativer Ansatz kann der Zielsequenz-unabhängige modulare Reporterkomplex übereinen Linker am Basisstrang an eine Festphase gekoppelt werden (Figur 6i). Durch Verlängerung des Mediators wird die Bindung des Signalinitiationsstranges mit elektroaktiver Markierung bzw. die Bindung der elektroaktiven Markierung selbst mit dem Basisstrang aufgebrochen, was eine Signaländerung herbeiführt. Als weitere Alternative kann das Signal i n itiation sol igo selbst an eine Oberfläche immobilisiert werden und hierüber der gesamte Zielsequenz-unspezifische modulare Reporterkomplex überden Basisstrang, welcher in diesem Fall eine elektroaktive Modifikation besitzt, an der Elektrode gekoppelt werden (Figur 6ii). Durch Verlängerung des Mediators wird die Bindung des Basisstrangs zum Signalinitiationsoligo aufgebrochen bzw. verhindert, wodurch sich eine Signaländerung ergibt.
Die Wahrscheinlichkeit der Hybridisierung an eine Festphasensonde kann durch die effektive freie Enthalpie der Hybridisierungsreaktion beeinflusst sein und/oder durch unterschiedliche Diffusionsgeschwindigkeiten unterschiedlich großer Moleküle (Länge und Sekundärstruktur der DNA(kom- plexe)). Generell ist die Erweiterbarkeit auf andere Nachweisprinzipien möglich, bei der das Signal durch Anreicherung/Abreicherung von signalgebenden Markierungen an der Festphase detektiert wird. Unter anderem könnten Fluorophore für die optische Detektion oder magnetische Partikel für die magnetoresistive Detektion verwendet werden.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht die Signaländerung in Schritt g darauf, dass die Verlängerung der Mediatorsequenz zu einer erhöhten oder verringerten Hybridisierungswahrscheinlichkeit des markierten Oligonukleotids am immobilisierten Oligonukleotid führt und damit die Markierung an der funktionalisierten Oberfläche angereichert oder verringert wird.
Nicht-Iimitierende Ausführungsbeispiele der Ausführungsformen mit einer erhöhten Hybridisierungswahrscheinlichkeit sind in der Figur 6 iii) illustriert. Nicht-Iimitierende Ausführungsbeispiele der Ausführungsformen mit einer verringerten Hybridisierungswahrscheinlichkeit sind in den Figuren 6 i)-ii) illustriert.
In Ausführungsformen ist die Detektionsmethoden ausgewählt aus der Gruppe umfassend elektrochemische, optische, magnetoresistive, piezoelektrische (z.B. Schwingquarz, Surface Acoustic Waves), und/oder Oberflächenplasmonenresonanz-Detektion.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist oder umfasst die mindestens eine Markierung mindestens eine elektroaktive Markierung und die Festphase eine Elektrode.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird in Schritt g. eine Signaländerung initiiert, indem in Schritt g. der Abstand zwischen der mindestens einen Markierung und der Festphase zunimmt oder abnimmt. Nicht-Iimitierende Beispiele für diese Ausführungsformen sind in den Figuren 6iv) und v) illustriert.
Eine weitere Option ist die Immobilisierung der elektroaktiven Markierung an der Festphase (Elektrode), entweder über den Basisstrang (Figur 6iv) oder dem Signalinitiationsoligo (Figur 6v). In diesem Fall wird eine Signaländerung durch die Veränderung des Abstands von elektroaktivem Molekül zur Oberfläche als Folge der Auftrennung der Bindung zwischen Signalinitiationsoligo und Basisstrang erzielt. Hierbei bewirkt eine Verlängerung des Mediators entweder, dass der Abstand zur Oberfläche zunimmt (Figur 6iv) oder abnimmt (Figur 6v), was in beiden Fällen zu einer Signaländerung führt. Auch diese Ausführungsformen sind nicht auf die elektrochemische Detektion beschränkt. Die Änderung des Abstands einer fluoreszierenden Markierung kann beispielsweise durch Oberflächen- quenching-Effekte zu einer detektierbaren Signaländerung führen.
Eine weitere Variante ist die Detektion vergleichbar mit dem optischen Ausführungsbeispiel nach Figur 7. Nach Hydrolyse des markierten Signalinitiationsoligonukleotids, weist die Markierung eine detektierbar höhere Diffusionsgeschwindigkeit auf und kann so auch ohne Anreicherung durch ein auf der Elektrode immobilisiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden. Der Effekt wurde beispielsweise in Pearce, D.M., Shenton, D.P., Holden, J., Gaydos, C.A., 2011. IEEE Trans. Biomed. Eng. 58 (3), 755-758 beschrieben. Allerdings ist in der dort beschriebenen Ausführung die Zugabe einer elektroaktiv markierten Hydrolysesonde nach der PCR notwendig, die dann durch eine ebenfalls zuzugebende Exonuklease verdaut wird.
Vorteil der Erfindung ist zum einen die Möglichkeit, durch den Zielsequenz-unspezifischen-Repor- ter-Komplex geeignete Ausführungsformen für eine Signalgenerierung flexibler und schneller analysieren zu können und hierdurch stärkere und oder präziser unterscheidbarere Signale zu generieren und einen einheitlichen Mechanismus für elektrochemische Detektion bereitzustellen, als es mit dem Stand der Technik möglich ist. In Bezug auf eine elektrochemische Festphasendetektion erlaubt die Erfindung zudem, universell fu nationalisierte Elektrodenarrays zu generieren. Damit ist die Anpassung der Elektrodenmodifikation auf neue Zielsequenzen nicht mehr notwendig und die Elektrodenarrays können in großen Batches und somit kostengünstiger hergestellt werden.
Daher umfasst die Erfindung in Ausführungsformen verschiedene Detektionsmethoden, wie beispielsweise elektrochemische, optische (z.B. durch Fluoreszenz, Farbstoffe, etc.), magnetoresistive, piezoelektrische (z.B. Schwinquarz, Surface Acoustic Waves) oder Oberflächenplasmo- nenresonanz.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird an die Markierung ein optisch de- tektierbarer Marker wie kolloidales Gold, kolloidales Silber, kolloidales Carbon, Latexpartikel gekoppelt.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht die Signaländerung in Schritt g. darauf, dass die Änderung der Anzahl gebundener Markierungen eine Änderung des Ladungstransfers zur Folge hat.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht die Signaländerung in Schritt g. darauf, dass die Anzahl gebundener Markierungen eine Änderung des Elektrodenpotentials oder des Ladungstransfers zur Folge hat.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die beschriebene Änderung als veränderter Strom oder Ladung oder Potential oder Ladungstransferwiderstand mittels beispielsweise voltammetrischen, amperometrischen, coulometrischen, potentiometrischen oder impedi- metrischen Messmethoden bestimmet.
Somit umfasst die Erfindung in Ausführungsformen elektrochemischen Detektionsmethoden. Dem Fachmann sind grundsätzliche Möglichkeiten und Prinzipien der elektrochemischen Detektion bekannt. In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst die mindestens eine Markierung mindestens ein Fluorophor. In Ausführungsformen umfasst die mindestens eine Markierung eines Oligonukleotids mindestens ein Fluorophor wobei das Oligonukleotid an der Festphase gebunden ist. In solchen Ausführungsformen kann vorzugsweise auf Quencher verzichtet werden.
In manchen Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht die Signaländerung darauf, dass die Anzahl gebundener Markierungen, eine Änderung der Fluoreszenzintensität zur Folge hat.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht die Signaländerung darauf, dass die Änderung des Abstands der Markierung zur Festphase eine Signaländerung bewirkt. Die Festphase ist dabei eine (bevorzugt metallische) Oberfläche, die eine Fluoreszenzlöschung (Quenching) proximaler Fluorophore bewirkt.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die mindestens eine Markierung ein Molekül zur Kopplung weiterer Markierungen. Moleküle, die für eine Kopplung verwendet werden können, sind dem Fachmann bekannt. Nicht-Iimitierende Beispiele sind Biotin - Streptavidin, Fluorescein- anti-Fluorescein, etc.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Signaländerung eine optisch wahrnehmbare Änderung (beispielsweise mittels Auge oder Kamera) der Farbintensität am Ort der immobilisierten Oligonukleotide.
Somit umfasst die Erfindung in Ausführungsformen optische Detektionsmethoden. Dem Fachmann sind grundsätzliche Möglichkeiten und Prinzipien der optischen Detektion bekannt.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird an die Markierung ein Nanopartikel (bevorzugt ein Metallnanopartikel) gekoppelt und die Festphase ist ein piezoelektrisches Material, das durch ein elektrisches Wechselfeld zum Schwingen angeregt wird.
In manchen dieser Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Signaländerung in Schritt g. eine Änderung der Frequenz und/oder der Phase und/oder Dämpfung der Schwingung in Abhängigkeit der Anzahl gebundener Markierungen.
Somit umfasst die Erfindung in Ausführungsformen piezoelektrische Detektionsmethoden. Dem Fachmann sind grundsätzliche Möglichkeiten und Prinzipien der piezoelektrische Detektion bekannt.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens wird/ist an die Markierung ein metallischer Nanopartikel gekoppelt und ist die Festphase eine metallische Oberfläche.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens beruht die Signaländerung auf einer Änderung des Brechungsindex an der Oberfläche aufgrund der Zunahme/Abnahme gebundener Markierungen, die sich mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmen lässt.
Somit umfasst die Erfindung in Ausführungsformen Oberflächenplasmonenresonanz-Detektions- methoden. Dem Fachmann sind grundsätzliche Möglichkeiten und Prinzipien derOberflächenplas- monenresonanz-Detektion bekannt. In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens werden/sind an die Markierung magnetische Nanopartikel gekoppelt und die Signaländerung beruht auf einer Änderung des Widerstands eines magnetoresistiven Sensors.
Somit umfasst die Erfindung in Ausführungsformen magnetoresistive Detektionsmethoden. Dem Fachmann sind grundsätzliche Möglichkeiten und Prinzipien der magnetoresistiven Detektion bekannt.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens können die immobilisierten Oligonuk- leotide an mehreren definierten Positionen der Festphase immobilisiert sein. Die immobilisierten Oligonukleotide können sich in ihrer Sequenz unterscheiden. In Ausführungsformen ist oder umfasst die Festphase ein Elektrodenarray und/oder Festphasen-Array.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Zielsequenz über die Charakteristika der Markierung und/oder die Position der Signaländerung eindeutig identifizierbar ist. Findet die Detektion in Ausführungsformen mittels eines Festphasen-Arrays statt, kann auch die Position des detektierten Signals eine Identifikation der Zielsequenz ermöglichen.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens umfasst das separierte mindestens eine Signalinitiationsoligo mindestens eine elektroaktive Markierung und wobei in Schritt g. die mindestens eine elektroaktive Markierung freigesetzt wird, wodurch diese eine detektierbar höhere Diffusionsgeschwindigkeit aufweist und somit eine Signaländerung initiiert, indem die Elektronentransferrate zunimmt.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die mindestens eine Markierung spezifisch für die mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz und wobei die unter Schritt g. initiierte Signaländerung für die mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz charakteristisch ist.
In Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Verfahrens ist die Detektion der Signaländerung eine Analyse der Signaländerung in Abhängigkeit der Detektions-Temperatur und/oder des elektrischen Feldes und/oder der Frequenz des Anregungssignals umfasst.
In manchen bevorzugten Ausführungsformen umfasst eine Mediatorsonde ein Oligonukleotid und einen sequenzspezifischen Sondenabschnitt, welcher an die Zielsequenz bindet und am 3'-Ende geschützt ist. Dieser Schutz am 3‘-Ende kann eine Blockgruppe (Schutzgruppe), z.B. eine chemische Block- oder Schutzgruppe, sein, welche in manchen Ausführungsformen eine Kette aus drei Kohlenstoffatomen umfasst. Ein Schutz der Mediatorsonde am 3‘ Ende verhindert vorzugsweise die (unspezifische) Verlängerung des Sequenzstranges durch eine Polymerase während einer Amplifikationsreaktion. Erfindungsgemäß kann die Mediatorsonde in Ausführungsformen jede Schutz- oder Blockgruppe umfassen, welche geeignet ist, eine (unspezifische) Verlängerung des Mediatorsonden-Sequenzstranges durch eine Polymerase während einer Amplifikationsreaktion zu verhindern. In manchen Ausführungsformen ist die Mediatorsonde durch andere Mittel, als eine Blockgruppe (Schutzgruppe) am 3‘ Ende, gegen eine (unspezifische) Polymeraseverlängerung geschützt.
In anderen Ausführungsformen umfasst eine Mediatorsonde keine Blockgruppe (Schutzgruppe) am 3‘ Ende und ist nicht geschützt gegen eine (unspezifische) Polymeraseverlängerung. In Ausführungsformen kann eine am 3‘-Ende geschützte Mediatorsonde einen „C3-Spacer“ umfassen. Ein solcher C3-Spacer kann eine chemische Blockgruppe sein, welche in manchen Ausführungsformen eine Kette aus drei Kohlenstoffatomen umfasst. Dieser „C3-Spacer“ verhindert somit vorzugsweise eine (unspezifische) Polymerase-Verlängerung des Mediatorsonden-Sequenzstran- ges. Dem Fachmann sind typische und je nach Ausführungsformen geeignete Blockgruppen (Schutzgruppen) bekannt. Auch weiß der Fachmann, ausgehend von der vorliegenden Offenbarung der Erfindung, wie er passende Blockgruppen (Schutzgruppen) als routinemäßige Anpassungen der hierin beschriebenen Erfindung auswählen muss.
Der erfindungsgemäße Prozess zum Nachweis von DNA-Sequenzen mittels PCR in Kombination mit einer elektrochemischen Auslese umfasst entsprechend ein neuartiges System aus einzelnen DNA-Oligonukleotiden. Diese bilden einen solchen Zielsequenz-unabhängigen modularen Reporterkomplex ohne kovalente Bindungen aus. Dieser Zielsequenz-unabhängige modulare Reporterkomplex besitzt dabei überraschenderweise alle Vorteile und Leistungskennzahlen einteiliger Zielsequenz-abhängiger DNA-Sonden oder einteiligen Zielsequenz-unabhängigen Nachweismoleküle. Der Zielsequenz-unabhängige modulare Reporterkomplex besteht aus mindestens zwei DNA-Sequenzen, welche spezifisch aneinanderbinden und Modifikationen tragen, welche die Signalgenerierung während einer PCR initiieren. Hierdurch sind die Zielsequenz-unabhängigen Reportermoleküle flexibel im Design. Eine weitere erfinderische Besonderheit ist hierbei, dass mit den erfindungsgemäßen Reporterkomplexen eine optischen und elektrochemische Auslese möglich ist, wobei sich lediglich die Arten von Modifikationen unterscheiden, nicht aber das Grundkonzept des Nachweisprozesses. Dieser so entstandene Zielsequenz-unabhängige modulare Reporterkomplex besitzt unter PCR-Bedingungen im initialen Zustand eine sehr hohe Stabilität. Das initiale Signal ist entsprechend mit dem vergleichbar, welches durch eine einteilige DNA-Sonde bzw. einem einteiligen Zielsequenz-unabhängigen Reporter generiert wird. Hierdurch besitzt das gesamte resultierende erfindungsgemäße PCR-Nachweis-System vergleichbare Leistungskennzahlen wie aktuelle PCR-Nachweismethoden basierend auf einteiligen Nachweismolekülen, obwohl sich dieser Komplex eines Zielsequenz-unabhängigen modularen Reporters mit jedem Zyklus einer PCR aufgetrennt und vor der Signalauslesung erneut gebildet werden muss. Das erfindungsgemäße System steigert so die Effizienz der Signalgenerierung und ist auch für den gleichzeitigen Nachweis von mehreren DNA-Zielgenen in einer PCR-Reaktion (Multiplex-PCR) geeignet. Darüber hinaus ist der Komplex zugleich flexibel im Design und die Einzelkomponenten günstig in ihrer Entwicklung und Produktion. Darüber hinaus ermöglicht das System die Herstellung universeller Mikroarrays, beispielsweise für den elektrochemischen Nachweis. Damit kann die Funktionalisierung der Festphase sehr standardisiert und in großen Batches stattfinden. Die Hybridisierungsreaktion an der Festphase selbst ist nach initialer Optimierung ebenfalls reproduzierbar, da stets dieselben Oligo- nukleotidkombinationen beteiligt sind, sodass für neue Zielsequenzen lediglich die Teilreaktionen in der Flüssigphase optimiert werden müssen. Dies verringert das Problem, dass sonst üblicherweise Teile der (amplifizierten) Zielsequenz an eine Festphasensonde hybridisieren, deren Eigenschaften (Länge, Sekundärstruktur, etc.) Einfluss auf die Hybridisierungseffizienz und somit auf das Signal haben kann. Dabei benötigt der erfindungsmäße Prozess auch keinen zusätzlichen Schritt zur Generierung eines Einzelstranges aus der (amplifizierten) Zielsequenz, wie es im Stand der Technik häufig üblich ist. Dies stellt insgesamt eine signifikante Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar. Die hierin beschriebenen unterschiedlichen Anwendungsmöglichkeiten sind möglich, da der erfindungsgemäße Zielsequenz-unabhängige modulare Reporterkomplex zugleich flexibel im Design ist und zum anderen die Einzelkomponenten günstig in ihrer Entwicklung und Produktion sind. Darüber hinaus ermöglicht das erfindungsgemäße System die Herstellung universeller Mikroarrays. Dies stellt insgesamt eine signifikante Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar.
In einem weiteren Aspekt bezieht sich die Erfindung auf ein Kit für die Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorangehenden Ansprüche umfassend: mindestens ein Oligonukleotid-Primer mindestens eine Mediatorsonde mindestens ein Signalinitiationsoligo mindestens ein Basisstrang mindestens ein Puffer
PCR-Polymerase.
Im Kontext des erfindungsgemäßen Kits können die Oligonukleotid-Primer, vorzugsweise mindestens ein Oligonukleotid-Primer Paar, das mindestens eine Signaloligo, der mindestens eine Mediator und/oder der mindestens eine Basisstrang für die spezifische Detektion eines oder mehrerer unterschiedlicher Zielsequenzen konfiguriert bzw. geeignet sein.
In Ausführungsformen kann das erfindungsgemäße Kit für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden.
In manchen Ausführungsformen kann das Kit somit für die spezifische Amplifikation und/oder Detektion von Zielsequenzen im Rahmen des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden. In bevorzugten Ausführungsformen der Verwendung des erfindungsgemäßen Kits ist die spezifische Amplifikations- und/oder Detektionsreaktion eine PCR, qPCR, real-time PCR, droplet PCR und/oder digitale PCR.
Die für einen Aspekt der Erfindung beschriebenen Ausführungsformen können auch Ausführungsformen von jedem der anderen Aspekte der vorliegenden Erfindung sein. Dementsprechend können für das erfindungsgemäße Verfahren beschriebene Ausführungsformen auch Ausführungsformen des erfindungsgemäßen Kits sein. Außerdem kann jede hierin beschriebene Ausführungsform auch Merkmale jeder anderen Ausführungsform der Erfindung umfassen. Die verschiedenen Aspekte der Erfindung werden durch die gemeinsame und überraschende Entdeckung der unerwarteten vorteilhaften Wirkungen des vorliegenden Verfahrens, nämlich der optimierten PCR-Detek- tion von Zielsequenzen durch Reporterkomplexe, welche selbst Zielsequenz unspezifisch sind, vereint, profitieren davon, basieren darauf und/oder sind damit verbunden.
Detaillierte Beschreibung Der Begriff „Zielsequenz-unspezifischer Reporterkomplex“ beschreibt einen Komplex aus Zielsequenz-unspezifischen DNA-Oligonukleotiden zur Signalgenerierung während einer PCR in Gegenwart der DNA-Zielsequenzen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung beschriebt der Begriff „Basisstrang“ ein DNA-Oligonukleotid und Teil des Zielsequenz-unspezifischen Reporterkomplexes. Ein Basisstrang dient als Basis für die Anbindung von Signalinitiationsoligos und Mediatoren, welche so einen Signalkomplex und Rezeptorkomplex ausbilden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung beschreibt der Begriff „Basisstrang“ ein Nukleinsäure-Oligonukleotid (z.B. ein DNA-Oligonukleotid) und Teil des Zielsequenzunspezifischen Reporterkomplexes. Ein Basisstrang dient als Basis für die Anbindung von Signalinitiationsoligos und Mediatoren, welche so einen Signalkomplex und Rezeptorkomplex ausbilden. Daher umfasst ein Basisstrang vorzugsweise mindestens eine Mediator-Bindestelle und mindestens eine Signaloligo-Bindestelle. In Ausführungsformen umfasst ein Basisstrang ein oder mehrere Mediator-Bindestellen und/oder Signaloligo-Bindestellen. Somit kann ein Basisstrang mindestens 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40 oder sogar 50 Mediator- Bindestellen umfassen. Ein Basisstrang kann zudem mindestens 1 , 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 25, 30, 40 oder sogar 50 Signaloligo-Bindestellen umfassen. In bevorzugten Ausführungsformen umfasst ein Basisstrang zwischen 1 und 10 Mediator-Bindestellen und zwischen 1 und 10 Signaloligo-Bindestellen. Eine Mediator-Bindestelle kann dabei mit einer oder mehreren Signaloligo-Bindestellen korrespondieren, mit anderen Worten, ein an eine Me- diator-Bindestelle gebundener (aktivierter) Mediator kann bei seiner Verlängerung durch eine (PCR) Polymerase zur Aktivierung bzw. dem Abbau, Verdau, (Ab)Spaltung oder Freisetzung eines oder mehrerer Signaloligos von einer oder mehrerer, vorzugsweise stromaufwärts (gen 5‘ Ende) gelegenen, Signaloligo-Bindestellen führen. Ein Basisstrang kann eine oder mehrere Signal-Komplexe und ein oder mehrere Rezeptor-Komplexe umfassen, wobei ein Signaloligo-Komplex mindestens eine Signaloligo-Bindestelle und (im nicht aktivierten Zustand) mindestens ein Signaloligo umfassen kann, und ein Rezeptor-Komplex mindestens eine Mediator-Bindestelle umfassen kann.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein Signalinitiationsoligo ein DNA-Oligonukleotid und Teil des Signalkomplexes, welches in Gegenwart einer Zielsequenz eine Signaländerung initiiert indem es selbst und oder Teile hiervon vom Signalkomplex abgespalten oder aufgebrochen werden.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung ist ein „Signalinitiationsoligonukleotid“, „Signalinitiationsoligo“ oder kurz „Signaloligo“ ein Nukleinsäure-Oligonukleotid (vorzugsweise ein DNA Oligonukleo- tid) und Teil des Signalkomplexes, welches in Gegenwart einer Zielsequenz eine Signaländerung initiiert, indem es selbst und oder Teile hiervon vom Signalkomplex abgespalten oder aufgebrochen werden. Im Kontext der vorliegenden Erfindung sind die Begriffe Signalinitiationsoligonukleotid, Signalinitiationsoligo und Signaloligo als äquivalent und austauschbar anzusehen.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung kann eine Markierung bevorzugt ein oder mehrere elektroaktive Markierungen oder ein oder mehrere Fluorophore und/oder eines Moleküls zur Kopplung weiterer Markierung sein. Dementsprechend können im Kontext der Erfindung ein Basisstrang und/oder ein Signalinitiationsmolekül oder Signalinitiationsoligo in Ausführungsformen ein oder mehrere elektroaktive Markierungen und/oder Fluorophore und/oder Moleküle zur Kopplung weiterer Markierungen tragen bzw. umfassen. Hierin bezieht sich ein „Mediator“ auf ein Oligonukleotid und Teil des Rezeptorkomplexes, welcher durch die Polymerase entlang des „Basisstrangs“ verlängert werden kann. Eine „Mediatorsonde“ beschriebt ein DNA-Oligonukleotid, welches die Verbindung zwischen der Zielsequenz und dem Zielsequenz-unabhängigen (modularen) Rezeptor herstellt, indem es während einer PCR in Gegenwart einer DNA-Zielsequenz an diese bindet, durch die Exonuklease-Aktivität der Polymerase gespalten wird und eine Mediatorsequenz freisetzt, welche gemeinsam mit dem Basisstrang einen Rezeptorkomplex ausbildet.
Der Begriff "Nukleinsäure" bezieht sich auf Nukleinsäuremoleküle, einschließlich, ohne Einschränkung, DNA, ssDNA, dsDNA, RNA, mRNA, tRNA, IncRNA, ncRNA, microRNA, siRNA, rRNA, sgRNA, piRNA, rmRNA, snRNA, snoRNA, scaRNA, gRNA oder virale RNA. Nukleinsäuresequenzen beziehen sich hierin auf eine aufeinanderfolgende Anordnung von Nukleotiden, wobei die Nukleotide durch ihre Nukleobasen in Guanin (G), Adenin (A), Cytosin (C) und Thymin (T) in DNA und Uracil (U) in RNA dargestellt werden. Eine Nukleinsäuresequenz kann sich hier auch auf die Sequenz aufeinanderfolgender Buchstaben bzw. Nukleobasen (bestehend aus G, A, C und T oder U) beziehen, die die tatsächliche Sequenz aufeinanderfolgender Nukleinsäuren in einem DNA- oder RNA-Strang darstellen. Diese Nukleinsäuresequenz kann unter Verwendung von DNA- oder RNA-Sequenzierung biochemisch und bioinformatisch identifiziert und charakterisiert werden oder durch komplementäre Nukleinsäure-Sonden (z.B. in Ausführungsformen hierin durch Mediatorsonden) spezifisch detektiert werden, z.B. im Rahmen einer PCR, real-time PCR oder Detektionsreaktion einer digitalen PCR. Die Sequenzanalyse kann auch den Vergleich der erhaltenen Nukleinsäuresequenz oder eines dafür spezifischen Detektionssignals mit einer oder mehrerer Referenznukleinsäuresequenzen und/oder mit den Detektionssignalen von Haushaltsgenen umfassen. Der Begriff Nukleotid kann mit „nt“ abgekürzt werden. Der Begriff Basenpaar (zwei über Wasserstoffbrücken aneinander gebundene Nukleobasen) kann mit „bp“ abgekürzt werden.
Eine „Zielsequenz“ beschreibt im Kontext der Erfindung jede Nukleinsäuresequenz von Interesse, welche durch das erfindungsgemäße Verfahren nachgewiesen werden soll. Eine Zielsequenz kann vorzugsweise eine DNA oder RNA-Sequenz sein. Eine Zielsequenz kann ein Teil oder die gesamte Nukleinsäuresequenz einer Ziel-DNA darstellen. Eine Mediatorsonde umfasst vorzugsweise eine Sequenz, welche ganz oder teilweise komplementär zu der Nukleinsäuresequenz der Zielsequenz oder einem Teil davon ist. In manchen Ausführungsformen ist diese Sequenz der Mediatorsonde zu 100%, zu 99 %, 95%, 90% oder zu 80% komplementär zu der Zielsequenz. Eine Mediatorsonde kann in manchen Ausführungsformen eine oder mehrere Fehlpaarungen zu der Zielsequenz tolerieren und trotzdem an diese binden. In andere Ausführungsformen bindet die Mediatorsonde nur an eine Zielsequenz, wenn sie zu 100% mit der Zielsequenz übereinstimmt.
Der Begriff "Nukleinsäure-Amplifikationsreaktion" bezieht sich auf jedes Verfahren, das eine enzymatische Reaktion umfasst, die die Amplifikation von Nukleinsäuren ermöglicht. Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR). Die „Polymerase-Kettenreaktion“ („PCR“) ist die Goldstandard Methode, um schnell Millionen bis Milliarden Kopien (vollständige Kopien oder Teilkopien) einer bestimmten DNA-Probe herzustellen, wodurch die Amplifikation einer sehr kleinen DNA-Probe auf eine ausreichend große Menge ermöglicht wird. PCR amplifiziert eine bestimmte Region eines DNA-Strangs (die DNA-Zielsequenz), je nachdem, wo die verwendeten Primer binden, um die Amplifikationsreaktion zu starten. Fast alle PCR-Anwendungen verwenden ein hitzestabiles DNA-Polymerase-Enzym, wie z. B. Taq-Poly- merase. Quantitative PCR („qPCR“) oder „real-time PCR“ („Echtzeit-PCR“), stellt eine spezifische Form der PCR dar und ist eine Standardmethode zum Nachweis und zur Quantifizierung einer spezifischen Zielsequenz oder zur Quantifizierung des Genexpressionsniveaus in einer Probe in Echtzeit. Bei der qPCR werden fluoreszenz- oder elektroaktiv-markierte Sonden oder Nukleinsäuren (z.B. Mediatorsonden) in der PCR-Reaktion hybridisiert und in Ausführungsformen während der Primerverlängerung von der PCR Polymerase gespalten bzw. verdaut sobald sie an eine komplementäre Sequenz binden (z.B. eine Zielsequenz), wobei in Ausführungsformen das Vorhandensein und die Amplifikation von Zielsequenzen nach oder während eines jeden PCR-Zyk- lus in Echtzeit überwacht wird. Dies kann auch die Überwachung von Hybridisierungs- und/oder Verlängerungsreaktionen an einer Festphase zu einem bestimmten Zeitpunkt während eines PCR-Zyklus einschließen. Eine real-time PCR ermöglicht es, den Fortschritt einer laufenden Amplifikationsreaktion während ihres Auftretens (d. h. in Echtzeit) zu überwachen. Daten werden daher über die gesamte Dauer der PCR-Reaktion gesammelt und nicht am Endpunkt wie bei der herkömmlichen PCR. Die Messung der Reaktionskinetik in den frühen Phasen der PCR bietet deutliche Vorteile gegenüber dem herkömmlichen PCR-Nachweis. In Ausführungsformen der real-time PCR werden Reaktionen durch den Zeitpunkt während des Zyklus charakterisiert, an dem die Amplifikation eines Ziels erstmals nachgewiesen wird, und nicht durch die Menge des Ziels, die sich nach einer festgelegten Anzahl von Zyklen angesammelt hat, wie bei einer klassischen PCR. Je höher die Startkopienzahl des Nukleinsäure-Targets ist, desto eher wird eine signifikante Signaländerung (z.B. Fluoreszenz, elektrochemisches Signal) beobachtet. Die real-time PCR ermöglicht eine Analyse mittels optischer Signale, die zum Nachweis eines spezifischen PCR-Produkts (der Zielsequenz), wobei spezifische Fluorochrome bzw. Fluorophore verwendet werden. Eine Zunahme des DNA-Produkts während einer PCR führt daher zu einer Zunahme der bei jedem Zyklus gemessenen Fluoreszenzintensität. Unter Verwendung verschiedenfarbiger Markierungen können fluoreszierende Sonden in Multiplex-Assays zum Überwachen mehrerer Zielsequenzen verwendet werden. Für Ausführungsformen, bei denen Oligonukleotide an der Festphase immobilisiert sind und eine Interaktion von Amplifikationsprodukten mit diesen stattfindet, kann neben den Charakteristika der Markierung (z.B. Wellenlänge des Fluorophors, Redoxpotential des elektroaktiven Moleküls) auch die Position, an der die Signaländerung auftritt, zur Unterscheidung mehrerer Zielsequenzen verwendet werden.
Während die Real-time qPCR davon abhängig ist, dass in jedem Amplifikationszyklus die relative Menge der Zielnukleinsäure bestimmt wird, ermöglicht die „digitale PCR“ hingegen eine Bestimmung der absoluten Menge der Zielnukleinsäure auf Basis der Poisson-Statistik, welche im Anschluss an eine Endpunkt-PCR-Amplifikation für die Berechnung der Zielnukleinsäure-Menge angewandt wird. Die Schritte vor der Amplifikation sind üblicherweise vergleichbar oder ähnlich zwischen digitaler PCR und qPCR. Jedoch werden in der qPCR vorzugsweise alle Nukleinsäuremoleküle gepoolt und anschließend amplifiziert und analysiert, während in der digitalen PCR die Nukleinsäuremoleküle vorzugsweise bestmöglich auf Einzelpartitionen (z.B. Emulsions-Tropfen, Kavitäten oder Gel-Beads) aufgeteilt werden, wodurch die PCR in jeder Partition als Einzelreaktion abläuft (im Fall von Emulsions-Tropfen, wird diese Reaktion auch oft als droplet PCR oder digital droplet PCR bezeichnet) und eine separate Analyse jeder Partition ermöglicht. Die zufällige Aufteilung der Nukleinsäuremoleküle in einzelne Partitionen erfolgt bei der digitalen PCR gemäß der Poisson-Verteilung. Bei der Analyse der digitalen PCR wird dann die Poisson-Statistik angewandt, um die durchschnittliche Anzahl an Nukleinsäuremolekülen pro Partition (keines, eines oder mehrere) zu bestimmen. Die statistische Poisson-Analyse der Anzahl positiver und negativer Reaktionen liefert eine präzise absolute Quantifizierung der Target-Sequenz.
Die Spezifität der Mediatorsonden verhindert auch eine Störung der Messungen durch Primer- Dimere, die unerwünschte potenzielle Nebenprodukte bei der PCR sind. In einer Ausführungsform betrifft die Erfindung ein Verfahren, wobei die Amplifikation eine Multiplex-PCR mit mehr als einem Primerpaar ist. Die Multiplex-PCR ist eine Variante der Standard-PCR, bei der zwei oder mehr Zielsequenzen gleichzeitig in derselben Reaktion amplifiziert und/oder nachgewiesen werden können, indem mindestens ein Primerpaar in der Reaktion verwendet wird.
Im Kontext der Erfindung beschreibt eine „Signaländerung“ vorzugsweise eine signifikante, differenzierbare und/oder charakteristische Änderung des Signals, welche sich deutlich von potentiellen Basis- oder Hintergrundsignalen bzw. Grund- oder Hintergrundrauschen abgrenzt bzw. unterscheidet. Dem Fachmann ist bewusst, dass unter manchen Versuchsbedingungen im Rahmen von elektrochemischer Detektionen unspezifische Basissignale bzw. Grund- oder Hintergrundrauschen durch unspezifische Prozesse an den Elektroden beispielsweise unspezifische Adsorption oder Alterungseffekte auftreten können. Daher beschreibt eine Signaländerung im Kontext der Erfindung vorzugsweise eine signifikante, differenzierbare und/oder charakteristische Änderung des Signals, und kein Basis- oder Hintergrundsignal bzw. Grund- oder Hintergrundrauschen. Diese Signaländerung kann in bevorzugten Ausführungsformen eine Zunahme der Stromstärke (z.B. Peakströme) und/oder des Potentials und/oder der Impedanz, in anderen Worten eine Zunahme des Signals bedeuten. In manchen Ausführungsformen ist eine Signaländerung die Abnahme des Signals. Die Zunahme eines Signals ist vorzugsweise dadurch bedingt, dass durch eine Amplifikationsreaktion die Anzahl der Zielsequenz-Amplifikate steigt und dadurch die Aktivierung zugehöriger Signalkomplexe. Je mehr Zielsequenzen somit vorhanden sind und durch Mediatorsonden in einer PCR Reaktion gebunden werden, umso mehr oder früher (im Falle einer realtime PCR) steigt das Signal. Vorzugsweise ist das Signal proportional oder annährend proportional zu der Menge der korrespondierenden Zielsequenz, für welche das Fluorophor-Signal (z.B. seine Farbe) spezifisch/charakteristisch ist. Da im Rahmen einer digitalen PCR bevorzugt nur eine Zielsequenz je Reaktionsraum (z.B. Partition, Emulsions-Tropfen) vorhanden ist, steigt das Signal zunehmend mit der Anzahl der Zielsequenz-Amplifikate je Reaktionsraum. In bevorzugten Ausführungsformen liegt idealerweise eine gleichmäßige Verteilung von max. 1 Zielsequenz je Reaktionsraum (z.B. Partition, Emulsions-Tropfen) vor, sodass bei beginnender Amplifikation und einer ähnlichen Amplifikationseffizienz in allen Reaktionsräumen (die eine Zielsequenz enthalten) das spezifische Signal für den Nachweis einer identischen Zielsequenz in unterschiedlichen Reaktionsräumen mit vergleichbarer Höhe/Stärke/Intensität bei der Auslese mittels digitaler oder „droplet“ PCR entsteht, welches vorzugsweise indikativ für das Vorhandensein und/oder die Anzahl der vorhandenen Zielsequenz-Amplifikate in jedem Reaktionsraum ist. In Ausführungsformen kann die, vorzugsweise für eine Zielsequenz spezifische, Intensität/Stärke einer jeweiligen Markierung sowie die maximal erreichbare Signalstärke/Intensität von der Anzahl der Markierungen je Signaloligo und Signalkomplex und/oder der Art der Markierung (z.B. Art der Fluorophore und/oder Quencher) abhängen.
„Fluorophor“ (oder Fluorochrom, ähnlich einem Chromophor) ist eine fluoreszierende chemische Verbindung, die bei Lichtanregung Licht wieder emittieren kann.
"Quenching" bezieht sich auf jeden Prozess, der die Fluoreszenzintensität einer gegebenen Substanz verringert. Quenchen („Löschen“) ist die Grundlage für Förster-Resonanzenergietransfer (FRET)-Assays oder Statische- bzw. Kontaktquenching-Assays oder einer Kombination aus beiden
Grundsätzlich versteht man unter „Oberflächenquenching“ den emissionslosen Energietransfer zwischen Fluorophoren und vorzugsweise metallischen Oberflächen.
Im Kontext der Erfindung bezeichnet ein „Behelfsoligo“ ein Oligonukleotid, das neben Signaloligo und Basisstrang als drittes Oligonukleotid benötigt wird um die Signaländerung durch Anreicherung des Signaloligos an der Festphase zu verstärken.
Im Kontext der Erfindung bezeichnet „elektroaktives Molekül“ bevorzugt ein Redox-Molekül, das im Fall der elektrochemischen Detektion, bei definierten Potentialen reduziert oder oxidiert wird wobei Elektronen transferiert werden. In diesem Zusammenhang bedeutet „elektroaktiv markiert“ bevorzugt, dass das elektroaktive Molekül an ein Oligonukleotid gekoppelt ist. Als Beispiele für elektroaktive Moleküle zur Markierung von Oligonukleotiden seien Methylenblau, Ferrocen, Anth- rachinon etc. erwähnt.
Ausführungs beispiele
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele weiter beschrieben. Diese sollen den Umfang der Erfindung nicht einschränken, sondern stellen bevorzugte Ausführungsformen verschiedener Aspekte der Erfindung dar, welche zur Veranschaulichung der hierin beschriebenen Erfindung bereitgestellt werden.
Elektrochemische Detektion
Nicht-markierte
Um eine elektrische Signaländerung während einer Amplifikationsreaktion zu detektieren, kann die Spaltung der Mediatorsonde und anschließende Verlängerung des Mediators am Zielsequenz-un- spezifischen modularen Reporter dazu führen, dass die Bindung eines elektroaktiv markierten Sig- nalinitiationsoligos zum Basisstrang aufgebrochen wird. Dieses kann dann an ein Behelfsoligo binden, welches an einer Festphase (Elektrode) immobilisiert wurde und so eine Signaländerung herbeiführen (Figur 6 iii). Als alternativer Ansatz kann der Zielsequenz-unabhängige modulare Reporterkomplex über einen Linker am Basisstrang an eine Festphase gekoppelt werden (Figur 6 i). Durch Verlängerung des Mediators wird die Bindung des Signalinitiationsstranges mit elektroaktiver Markierung bzw. die Bindung der elektroaktiven Markierung selbst mit dem Basisstrang aufgebrochen, was eine Signaländerung herbeiführt. Als weitere Alternative kann das Signalinitiationso- ligo selbst an eine Oberfläche immobilisiert werden und hierüber der gesamte Zielsequenz-unspe- zifische modulare Reporterkomplex über den Basisstrang, welcher in diesem Fall eine elektroaktive Modifikation besitzt, an der Elektrode gekoppelt werden (Figur 6 ii). Durch Verlängerung des Mediators wird die Bindung des Basisstrangs zum Signalinitiationsoligo aufgebrochen, wodurch sich eine Signaländerung ergibt.
Die Wahrscheinlichkeit der Hybridisierung an eine Festphasensonde kann durch die effektive freie Enthalpie der Hybridisierungsreaktion beeinflusst sein und/oder durch unterschiedliche Diffusionsgeschwindigkeiten unterschiedlich großer Moleküle (Länge und Sekundärstruktur der DNA-(kom- plexe)).
Generell ist die Erweiterbarkeit auf andere Nachweisprinzipien denkbar, bei der das Signal durch Anreicherung/Abreicherung von signalgebenden Markierungen an der Festphase detektiert wird. Unter anderem könnten Fluorophore für die optische Detektion oder magnetische Partikel für die magnetoresistive Detektion (detektieren der Bewegung von ferromagnetischen Materialien über die Veränderung des magnetischen Flusses) verwendet werden.
Elektroaktive Markierung an Festphase
Eine weitere Option ist die Immobilisierung der elektroaktiven Markierung an der Festphase (Elektrode), entweder über den Basisstrang (Figur 6 iv) oder dem Signalinitiationsoligo (Figur 6 v). In diesem Fall wird eine Signaländerung durch die Veränderung des Abstands von elektroaktivem Molekül zur Oberfläche als Folge der Auftrennung der Bindung zwischen Signalinitiationsoligo und Basisstrang erzielt. Hierbei bewirkt eine Verlängerung des Mediators entweder, dass der Abstand zur Oberfläche zunimmt (iv) oder abnimmt (v), was in beiden Fällen zu einer Signaländerung führt.
Auch diese Beispiele sind nicht auf die elektrochemische Detektion beschränkt. Die Änderung des Abstands einer fluoreszierenden Markierung kann beispielsweise durch Oberflächenquenching- Effekte zu einer detektierbaren Signaländerung führen.
Detektion ohne Oligo-modifizierte Festphase
Eine weitere Ausführungsform umfasst eine elektrochemische Detektion vergleichbar mit einer optischen Detektion, wie z.B. in Figur ? gezeigt. Nach Hydrolyse des markierten Signalinitiationsoli- gonukleotids, weist die Markierung eine detektierbar höhere Diffusionsgeschwindigkeit auf und kann so auch ohne Anreicherung durch ein auf der Elektrode immobilisiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden (Der Effekt wurde beispielsweise in Pearce, D.M., Shenton, D.P., Holden, J., Gaydos, C.A., 2011 . IEEE Trans. Biomed. Eng. 58 (3), 755-758 beschrieben. Allerdings ist in der dort beschriebenen Ausführung).
Ergebnisse
Zur Demonstration einer Nachweisreaktion nach dem Reporterkomplexaufbau gemäß Figur 6 i) wurde eine Mediatorverlängerungsreaktion in Gegenwart der mit dem Basisstrang fun ktionalisier- ten Elektrodenoberfläche durchgeführt. Der Reaktionsmix umfasste einen PCR-Mix (inkl. Polymerase, Co-Faktoren, etc.) sowie 300 nM des elektroaktiv markierten Moleküls (Signaloligo) und zudem 200 nM entweder des Mediators oder der intakten Mediatorsonde. Die Sequenzen der Oli- gonukleotide sind in Tabelle 1 gelistet. Der Reaktionsmix wurde initial für 5 min bei 95 °C inkubiert, um die Polymerase zu aktivieren.
Anschließend wurde der Reaktionsmix in Reaktionskammern eines funktionalisierten Elektrodenarrays überführt. Die geschlossenen Reaktionskammern wurden in einem Wasserbad zunächst bei 40 °C inkubiert und anschließend auf bis zu 62 °C erhitzt. Während der Heizphase und des anschließenden Abkühlvorgangs wurden die Elektroden elektrochemisch mittels Square-Wave Voltammetrie analysiert. Bei Anreicherung des elektroaktiven Moleküls an der Elektrodenoberfläche durch Hybridisierung, weist das Stromsignal einen charakteristischen Peak (Aipeak) auf.
Tabelle 1 : Sequenzen für die Mediatorverlängerungsreaktion gemäß Figur 6 i). Sequenzabschnitte, die zum Rezeptorkomplex gehören, sind kursiv dargestellt. Sequenzabschnitte, die zum Signalkomplex gehören, sind unterstrichen.
Das Ergebnis (Figur 2 und 3) zeigt zunächst bei Temperaturen unter 45 °C gut detektierbare elektrochemische Signale, die sich jedoch nicht zwischen den unterschiedlichen Reaktionsmixen unterscheiden. Dies spricht für die Hybridisierung des Signaloligos an die Festphasensonde, jedoch für keine signifikante Verdrängungsreaktion eines verlängerten Mediators. Mit zunehmender Temperatur und damit zunehmender Aktivität der Polymerase beginnt das Signal für Reaktionen, die Mediatoren enthalten, zu sinken und sich von Reaktionen mit Mediatorsonde zu unterscheiden. Dies deutet darauf hin, dass der Mediator am Festphasenoligo durch Polymeraseaktivität verlängert wird und dabei das elektroaktiv markierte Oligonukleotid von diesem verdrängt. Auch nach bzw. während des Abkühlvorgangs bleiben die Signale von Reaktionsansätzen mit aktivem Mediator von den Reaktionsansätzen mit Mediatorsonden unterscheidbar (Figur 3).
Für eine reale PCR (real-time PCR), muss der aktive Mediator durch Spaltung der Mediatorsonde erzeugt werden. In diesem Fall werden dem PCR-Mix neben Polymerase, PCR-Puffer und 200 nM Mediatorsonde auch zielsequenzspezifische Primer (> 200 nM) zugefügt sowie für Positivkontrollen (PTC) eine Ziel-DNA, die die zu amplifizierende Zielsequenz aufweist, während die mitzuführende „No-Template Control“ (NTC) keine Ziel-DNA enthält. Der Basisstrang ist auf der Oberfläche der Arbeitselektrode immobilisiert. Das Signaloligo kann initial mit dem Basisstrang vorhybridisiert vorliegen oder Teil des PCR-Mix sein. Die PCR findet bei einer real-time Detektion in einer Kammer statt, die die fun ktionalisierte Elektrode enthält. Bei Endpunkt-PCR Detektion kann die Amplifikationsreaktion auch in einer vorgeschalteten Kammer erfolgen. Die PCR erfolgt nach dem empfohlenen Temperaturprotokoll für die verwendete Polymerase, d.h. nach Aktivierung der Hotstart-Poly- merase durch zyklische Temperaturänderungen zwischen 95 °C und ca. 60 °C. Die Detektion des Signals erfolgt während des ca. 60 °C Temperaturschritts (typische Temperatur für die Anlagerung von Primern und Sonden an Zielsequenzen). Durch Spaltung der Mediatorsonde im Verlauf der PCR, werden zunehmend aktivierte Mediatoren generiert, die an den Basisstrang hybridisieren und durch Verlängerung zu einer detektierbaren Verdrängung des elektroaktiv markierten Signaloligos führen bzw. im nächsten Temperaturschritt dessen Rehybridisierung am Basisstrang verhindern. Dies bewirkt eine Signalabnahme; bei Endpunktdetektion ggf. im Vergleich zu NTC-Reaktionen, die ungespaltene Mediatorsonden aufweisen. Voraussetzung für die real-time Detektion ist, dass Schmelztemperatur (Tm) von Mediator und Signaloligo an ihren jeweiligen Bindestellen oberhalb der Auswertetemperatur liegen. Bei einer Endpunktdetektion besteht bezüglich der Schmelztemperatureine größere Freiheit, da die Mediatorverlängerung und Signaloligohybridisierung unterhalb der Primerannealing-Temperatur stattfinden kann. Die bisherigen Ergebnisse deuten für diesen Fall darauf hin, dass bis zu einer Temperatur von 45 °C eine ausreichende Polymeraseaktivitität für die Mediatorverlängerungs- und Signaloligoverdrängungsreaktion gegeben ist, d.h. ein erweitertes Temperaturfensterzwischen 45 °C bis ca. 60 °C (bei entsprechender Auslegung der Tm von Mediator und Signaloligo auch darüber) möglich ist.
Für eine Nachweisreaktion nach dem Reporterkomplexaufbau gemäß Figur 6 ii) wurde eine Mediatorverlängerungsreaktion unter PCR-Bedingungen in einem Standard PCR-Cycler durchgeführt. Zu den PCR-Reagenzien wurde das elektroaktiv markierte Molekül (Basisstrang) und zudem der Mediator bzw. die intakte Mediatorsonde als Kontrolle zugegeben. Das Reaktionsergebnis wurde nach 10 Zyklen auf ein mit dem Signaloligo funktionalisiertes Elektrodenarray überführt. Die dort bei Raumtemperatur stattfindende Hybridisierungsreaktion wurde elektrochemisch mittels Square- Wave Voltammetrie analysiert. Die verwendeten Sequenzen sind in Tabelle 2 aufgeführt.
Das Ergebnis (Figur 4) zeigt ein ansteigendes elektrochemisches Signal für Reaktionen, die eine intakte Mediatorsonde enthielten (dunkelgraue (obere) Kurve). Überraschenderweise sind für Reaktionen, die Mediatoren enthielten, kein elektrochemischen Signale detektierbar (hellgraue (untere) Kurve). Dies spricht für eine effektive Verlängerungsreaktion des Mediators am elektroaktiv markierten Strang, was im Anschluss zu einer effektiven Verhinderung der Hybridisierungsreaktion an derfunktionalisierten Elektrodenoberfläche führt. Eine erhöhte Temperatur oder eine Polymeraseaktivität ist für den Detektionsschritt nicht mehr zwingend erforderlich, wobei die Hybridisierungsgeschwindigkeit von einer höheren Hybridisierungstemperatur zunehmen und das Signalplateau schneller erreicht werden würde. Tabelle 2: Sequenzen für die Mediatorverlängerungsreaktion gemäß Figur 6 i). Sequenzabschnitte, die zum Rezeptorkomplex gehören, sind kursiv dargestellt. Sequenzabschnitte, die zum Signalkomplex gehören, sind unterstrichen.
Für eine reale PCR ist auch in diesem Fall die Zugabe von zielsequenzspezifischen Primern zu den bereits genannten Reaktionsbestandteilen (Polymerase, Puffer, elektroaktiv markierter Basisstrang) notwendig, sowie Ziel DNA für die PTC. Bei der Durchführung werden PTC- und NTC- Reaktionen angesetzt und PCR Zyklen (zwischen 95 °C und ca. 60 °C) durchgeführt. Bei real-time Detektion ist die mit Signaloligo funktionalisierte Elektrode in der Reaktionskammer. Bei Endpunkt- Detektion ist dies nicht zwingend erforderlich. In der PTC werden im Verlauf der PCR Mediatorsonden während der Primerverlängerungsreaktion gespalten. Der aktivierte Mediator hybridisiert an den Basisstrang und wird dort verlängert, sodass der Basisstrang vom imobilisierten Signaloligo getrennt wird und/oder dessen Rehybridisierung and das Signaloligo verhindert wird. Die Signaldetektion der bei der real-time PCR erfolgt jeweils am Ende jedes Primer- ZMediatorverlängerungsschritts bei ca. 60 °C. Bei PTC wird eine Signalabnahme beobachtet. Wie bereits zuvor erwähnt müssen die Schmelztemperaturen des Signalkomplexes nahe bzw. oberhalb der Auwertetemperatur liegen. Im Fall einer Endpunktdetektion ist das Signal der PTC geringer als das der NTC Reaktionen. Die Auswertetemperatur kann dabei von Raumtempertur bis Schmelztemperatur des Signalkomplexes gewählt werden, wobei eine höhere Temperatur aufgrund der schnelleren Hybridisierungsgeschwindigkeit und der Vermeidung von unspezifischen Hybridisierungsvorgängen zu bevorzugen ist.
Figuren
Figur 1 : Die Figur zeigt die Mediator-Sonden Spaltung während einer PCR mit Aktivierung des Mediators in einer Ausführungsform der Erfindung. Der „aktivierte“ Mediator entspricht hier einer Mediatorsequenz, welche nach Verdau der Mediatorsonde freigesetzt wird.
Figur 2: Elektrochemisches Signal in Abhängigkeit der Zeit für die Durchführung einer Mediatorverlängerungsreaktion gemäß Ausführungsbeispiel nach Figur 6 i) in Anwesenheit des Mediators (aktiv) oder der Mediatorsonde. Die Peakströme (A/peak) wurden zum Zeitpunkt t = 5 min normalisiert. Die dargestellte Temperatur bezieht sich auf die Temperatur des Wasserbades.
Figur 3 Quotient aus normalisiertem elektrochemischem Signal der Reaktionen mit Mediator zu
Reaktionen mit Mediatorsonde (vergleiche Figur 2) in Abhängigkeit der Temperatur des Wasserbades. Die Darstellung unterscheidet zwischen Signalen die während der Heizphase (Quadrate) und während der Abkühlphase (Kreuze) aufgenommen wurden.
Vergleich des elektrochemischen Signals einer Hybridisierungsreaktion nach durchgeführtem Thermocycling in Anwesenheit von elektroaktiv markierten Oligonukleotiden und Mediatoren (hellgrauen) oder intakten Mediatorsonden (dunkelgrauen) nach Figur 6 ii).
Die Figur zeigt ein Ausführungsbeispiel für die elektrochemische Signalgenerierung nach
Mediatoraktivierung unter Verwendung eines Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporterkomplexes.
Die Figur zeigt ein Ausführungsbeispiel für die elektrochemische Signalgenerierung nach
Mediatoraktivierung unter Verwendung eines Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporterkomplexes. Als eine Ausführungsform kann derZielsequenz-unabhängige modulare Reporterkomplex über einen Linker am Basisstrang an eine Festphase gekoppelt werden (Figur 6i). Durch Verlängerung des Mediators wird die Bindung des Signalinitiationsstranges mit elektroaktiver Markierung bzw. die Bindung der elektroaktiven Markierung selbst mit dem Basisstrang aufgebrochen, was eine Signaländerung herbeiführt. Als weitere Ausführungsform kann das Signalinitiationsoligo selbst an eine Oberfläche immobilisiert werden und hierüber der gesamte Zielsequenz-unspezifi- sche modulare Reporterkomplex über den Basisstrang, welcher in diesem Fall eine elektroaktive Modifikation besitzt, an der Elektrode gekoppelt werden (Figur 6ii). Als weitere Ausführungsform kann ein Signalinitiationsoligo an ein Behelfsoligo binden, welches an einer Festphase (Elektrode) immobilisiert wurde sodass eine Signaländerung herbeigeführt wird (Figur 6iii). Zwei weitere Ausführungsformen sind die Immobilisierung der elektroaktiven Markierung an der Festphase (Elektrode), entweder über den Basisstrang (Figur 6iv) oder dem Signalinitiationsoligo (Figur 6v). In diesem Fall wird eine Signaländerung durch die Veränderung des Abstands von elektroaktivem Molekül zur Oberfläche als Folge der Auftrennung der Bindung zwischen Signalinitiationsoligo und Basisstrang erzielt. Hierbei bewirkt eine Verlängerung des Mediators entweder, dass der Abstand zur Oberfläche zunimmt (Figur 6iv) oder abnimmt (Figur 6v), was in beiden Fällen zu einer Signaländerung führt.
Figur 7 Die Figur zeigt eine weitere Ausführungsform, wobei die Detektion ohne immobilisiertes
Oligonukleotid auskommt. Nach Hydrolyse des markierten Signalinitiationsoligonukleotids, weist die Markierung eine detektierbar höhere Diffusionsgeschwindigkeit auf und kann so auch ohne Anreicherung durch ein auf der Elektrode immobilisiertes Oligonukleotid nachgewiesen werden
Referenzen Becherer, Lisa; Bakheit, Mohammed; Frischmann, Sieghard; Stinco, Silvina; Borst, Nadine; Zengerle, Roland; Stetten, Felix von (2018): Simplified Real-Time Multiplex Detection of Loop-Mediated Isothermal Amplification Using Novel Mediator Displacement Probes with Universal Reporters. In: Anal. Chem. 90 (7), S. 4741-4748. DOI: 10.1021/acs.analchem.7b05371 .
Faltin, Bernd; Wadle, Simon; Roth, Günter; Zengerle, Roland; Stetten, Felix von (2012): Mediator probe PCR: a novel approach for detection of real-time PCR based on label-free primary probes and standardized secondary universal fluorogenic reporters. In: Clinical Chemistry 58 (11), S. 1546-1556. DOI: 10.1373/clinchem.2O12.186734.
Faltin, Bernd; Zengerle, Roland; Stetten, Felix von (2013): Current Methods for Fluorescence- Based Universal Sequence-Dependent Detection of Nucleic Acids in Homogenous Assays and Clinical Applications. In: Clinical Chemistry 59 (11), S. 1567-1582. DOI:
10.1373/clinchem.2O13.205211.
Heid, C. A.; Stevens, J.; Livak, K. J.; Williams, P. M. (1996): Real time quantitative PCR. In: Genome Research 6 (10), S. 986-994. DOI: 10.1101/gr.6.10.986.
Holland, P. M.; Abramson, R. D.; Watson, R.; Gelfand, D. H. (1991): Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5' — 3' exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America 88 (16), S. 7276-7280. DOI: 10.1073/pnas.88.16.7276.
Lehnert, Michael; Kipf, Elena; Schlenker, Franziska; Borst, Nadine; Zengerle, Roland; Stetten, Felix von (2018): Fluorescence signal-to-noise optimisation for real-time PCR using universal reporter oligonucleotides. In: Anal. Methods 10 (28), S. 3444-3454. DOI: 10.1039/C8AY00812D.
Li, Yongsheng; Zhou, Xiaoyan; Ye, Duyun (2008): Molecular beacons: an optimal multifunctional biological probe. In: Biochemical and biophysical research communications 373 (4), S. 457-461. DOI: 10.1016/j.bbrc.2008.05.038.
Liu, Shufeng; Fang, Li; Wang, Yanqun; Wang, Li (2017): Universal Dynamic DNA Assembly-Programmed Surface Hybridization Effect for Single-Step, Reusable, and Amplified Electrochemical Nucleic Acid Biosensing. In: Anal. Chem. 89 (5), S. 3108-3115. DOI: 10.1021/acs.anal- chem.6b04871.
Lyamichev, V.; Brow, M. A.; Dahlberg, J. E. (1993): Structure-specific endonucleolytic cleavage of nucleic acids by eubacterial DNA polymerases. In: Science (New York, N.Y.) 260 (5109), S. 778- 783. DOI: 10.1126/science.7683443.
Rodriguez, Miguel A.; Garcia, Teresa; Gonzalez, Isabel; Hernandez, Pablo E.; Martin, Rosario (2005): TaqMan real-time PCR for the detection and quantitation of pork in meat mixtures. In: Meat science 70 (1), S. 113-120. DOI: 10.1016/j.meatsci.2004.12.005.
Tan, Weihong; Wang, Kemim; Drake, Timothy J. (2004): Molecular beacons. In: Current opinion in chemical biology 8 (5), S. 547-553. DOI: 10.1016/j.cbpa.2004.08.010. Tyagi, S.; Kramer, F. R. (1996): Molecular beacons: probes that fluoresce upon hybridization. In: Nat Biotechnol 14 (3), S. 303-308. DOI: 10.1038/nbt0396-303.
Wadle, Simon; Lehnert, Michael; Schuler, Friedrich; Koppel, Rene; Serr, Annerose; Zengerle, Roland; Stetten, Felix von (2016): Simplified development of multiplex real-time PCR through master mix augmented by universal fluorogenic reporters. In: BioTechniques 61 (3), S. 123-128. DOI: 10.2144/000114443.
Whale, Alexandra S.; Huggett, Jim F.; Tzonev, Svilen (2016): Fundamentals of multiplexing with digital PCR. In: Biomolecular Detection and Quantification 10, S. 15-23. DOI: 10.1016/j.bdq.2016.05.002.

Claims

Patentansprüche
1 . Verfahren zum Nachweis mindestens einer Ziel-Nukleinsäuresequenz, umfassend die Schritte: a. Bereitstellen mindestens eines Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter- Komplexes, umfassend mindestens eine Markierung, sowie mindestens zwei Oligonukleotide, nämlich i. einen Basisstrang, umfassend
1. mindestens eine Mediator-Bindestelle
2. mindestens eine Signalinitiationsoligo-Bindestelle ii. mindestens ein Signalinitiationsoligo, b. Bereitstellen mindestens einer Mediatorsonde, wobei die Mediatorsonde ein Oli- gonukleotid mit mindestens einer Sondensequenz und mindestens einer Mediatorsequenz umfasst, wobei die mindestens eine Sondensequenz eine Affinität zu mindestens einer Ziel-Nukle- insäuresequenz aufweist, und die mindestens eine Mediatorsequenz eine Affinität zu mindestens einer Mediator-Bindestelle an dem Basisstrang des mindestens einen Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter-Komplex aufweist, c. PCR Amplifikation mindestens einer Nukleinsäuresequenz, d. Binden einer Sondensequenz mindestens einer Mediatorsonde an mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz, e. Spaltung der Sondensequenz der an die mindestens eine Ziel-Nukleinsäurese- quenz gebundenen mindestens einen Mediatorsonde durch eine PCR Polymerase, wobei die Mediatorsequenz freigesetzt wird, f. Binden mindestens einer freigesetzten Mediatorsequenz an eine Mediator-Binde- stelle des mindestens einen Zielsequenz-unspezifischen modularen Reporter- Komplexes, g. Verlängerung der Sequenz mindestens einer an eine Mediator-Bindestelle gebundenen Mediatorsequenz durch eine PCR Polymerase, wobei die Bindung (Hybridisierung), der mindestens einen Signalinitiationsoligo-Bindestelle und des mindestens einen Signalinitiationsoligos entweder i) aufgebrochen und/oder verhindert wird oder ii) initiiert und/oder hergestellt wird, wodurch ein Signaländerung initiiert wird, h. Detektion mindestens einer Signaländerung als Nachweis der mindestens einen Ziel-Nukleinsäuresequenz.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei in Schritt g. eine Signaländerung initiiert wird indem das separierte mindestens eine Signalinitiationsoligo mindestens eine Markierung umfasst und an mindestens ein Behelfsoligo bindet, welches an einer Festphase immobilisiert ist. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei in Schritt g. eine Signaländerung initiiert wird indem eines der zwei Oligonukleotide oder beide Oligonukleotide des mindestens einen Zielsequenzunspezifischen modularen Reporter-Komplexes nämlich i. der Basisstrang, und/oder ii. das mindestens eine Signalinitiationsoligo, über je einen Linker an einer Festphase immobilisiert ist/sind. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei entweder der Basisstrang oder das mindestens eine Signalinitiationsoligo die mindestens eine Markierung umfasst. Verfahren gemäß Anspruch 4, wobei die Signaländerung in Schritt g darauf beruht, dass die Verlängerung der Mediatorsequenz zu einer erhöhten oder verringerten Hybridisierungswahrscheinlichkeit des markierten Oligonukleotids am immobilisierten Oligonukleotid führt und damit die Markierung an der funktionalisierten Oberfläche angereichert oder verringert wird. Verfahren gemäß einem der vorigen Ansprüche, wobei die mindestens eine Markierung mindestens eine elektroaktive Markierung umfasst und die Festphase eine Elektrode ist. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei in Schritt g. eine Signaländerung initiiert wird, indem in Schritt g. der Abstand zwischen der mindestens einen Markierung und der Festphase zunimmt oder abnimmt. Verfahren gemäß Anspruch 6, wobei die Signaländerung in Schritt g darauf beruht, dass die Anzahl gebundener Markierungen eine Änderung des Elektrodenpotentials oder des Ladungstransfers zur Folge hat. Verfahren gemäß Ansprüchen 7 und 8, wobei die beschriebene Änderung als veränderter Strom oder Ladung oder Potential oder Ladungstransferwiderstand mittels beispielsweise voltammetrischen, amperometrischen, coulometrischen, potentiometrischen oder impedimet- rischen Messmethoden bestimmt wird. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, wobei die mindestens eine Markierung mindestens ein Fluorophor umfasst. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Signaländerung darauf beruht, dass die Anzahl gebundener Markierungen, eine Änderung der Fluoreszenzintensität zur Folge hat. Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei die Signaländerung darauf beruht, dass die Änderung des Abstands der Markierung zur Festphase eine Signaländerung bewirkt. Die Festphase ist dabei eine (bevorzugt metallische) Oberfläche, die eine Fluoreszenzlöschung (Quenching) proximaler Fluorophore bewirkt. Verfahren gemäß Anspruch 1 bis 5, in dem die mindestens eine Markierung ein Molekül zur Kopplung weiterer Markierungen ist. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei an die Markierung ein optisch detektierbarer Marker wie kolloidales Gold, kolloidales Silber, kolloidales Carbon, Latexpartikel gekoppelt wird. Verfahren gemäß Anspruch 14, wobei die Signaländerung eine optisch wahrnehmbare Änderung (beispielsweise mittels Auge oder Kamera) der Farbintensität am Ort der immobilisierten Oligonukleotide ist. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei an die Markierung ein Nanopartikel (bevorzugt ein Metallnanopartikel) gekoppelt wird und die Festphase ein piezoelektrisches Material ist, das durch ein elektrisches Wechselfeld zum Schwingen angeregt wird. Verfahren gemäß Anspruch 16, wobei die Signaländerung in Schritt g eine Änderung der Frequenz und/oder der Phase und/oder Dämpfung der Schwingung in Abhängigkeit der Anzahl gebundener Markierungen ist. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei an die Markierung ein metallischer Nanopartikel gekoppelt wird und die Festphase eine metallische Oberfläche ist. Verfahren gemäß Anspruch 18, wobei die Signaländerung auf einer Änderung des Brechungsindex an der Oberfläche aufgrund der Zunahme/Abnahme gebundener Markierungen beruht, die sich mittels Oberflächenplasmonenresonanzspektroskopie bestimmen lässt. Verfahren gemäß Anspruch 13, wobei an die Markierung magnetische Nanopartikel gekoppelt werden und die Signaländerung auf einer Änderung des Widerstands eines magnetore- sistiven Sensors beruht. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die immobilisierten Oligonukleotide an mehreren definierten Positionen der Festphase immobilisiert sein können. Die immobilisierten Oligonukleotide können sich in ihrer Sequenz unterscheiden. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Zielsequenz über die Charakteristika des Markierung und/oder die Position der Signaländerung eindeutig identifizierbar ist. Verfahren gemäß Anspruch 1 , wobei das separierte mindestens eine Signalinitiationsoligo mindestens eine elektroaktive Markierung umfasst und wobei in Schritt g. die mindestens eine elektroaktive Markierung freigesetzt wird, wodurch diese eine detektierbar höhere Diffusionsgeschwindigkeit aufweist und somit eine Signaländerung initiiert, vorzugsweise indem die Elektronentransferrate zunimmt. Verfahren gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die mindestens eine Markierung spezifisch für die mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz ist und wobei die unter Schritt g. initiierte Signaländerung für die mindestens eine Ziel-Nukleinsäuresequenz charakteristisch ist. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei die Detektion der Signaländerung eine Analyse der Signaländerung in Abhängigkeit der Detektions-Temperatur und/oder des elektrischen Feldes und/oder der Frequenz des Anregungssignals umfasst. Verfahren gemäß einem der vorherigen Ansprüche, wobei in Schritt a) die Signalinitiationso- ligo-Bindestelle des Basisstrangs und das mindestens eine Signalinitiationsoligo miteinander hybridisiert, jedoch nicht kovalent verbunden, sind und zusammen einen Signal-Komplex bilden. Kit für die Durchführung des Verfahrens gemäß einem der vorangehenden Ansprüche umfassend: mindestens ein Oligonukleotid-Primer mindestens eine Mediatorsonde mindestens ein Signalinitiationsoligo mindestens ein Basisstrang mindestens ein Puffer
PCR-Polymerase.
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Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2608151A1 (en) * 2005-05-11 2006-11-16 Stratagene California Snapback oligonucleotide probe
US9921154B2 (en) 2011-03-18 2018-03-20 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multiplexed digital assays
MX352460B (es) 2011-01-11 2017-11-24 Seegene Inc Detección de secuencias de ácido nucleico objetivo mediante ensayo de escisión y extensión del pto.
DE102011055247A1 (de) * 2011-11-10 2013-05-16 Albert-Ludwigs-Universität Freiburg Multianalyt-Reportersystem
DE102011056606B3 (de) 2011-12-19 2013-01-03 Friz Biochem Gesellschaft Für Bioanalytik Mbh Verfahren zur elektrochemischen Detektion von Nukleinsäureoligomer-Hybridisierungsereignissen
EP2943586B1 (de) * 2012-12-27 2017-09-20 Seegene, Inc. Erkennung von zielnukleinsäuresequenzen durch pto-spaltung und erweiterungsabhängiges nicht-hybridisierungs-assay
KR101750464B1 (ko) * 2014-11-28 2017-06-28 케이맥바이오센터주식회사 바이오물질의 실시간 정량 및 정성 분석을 위한 프로브 시스템, 상기 프로브 시스템을 구비한 반응용기 및 이를 이용한 분석 방법
CA3049833A1 (en) * 2016-12-23 2018-06-28 Albert-Ludwigs-Universitat Freiburg Two-piece mediator probe

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