EP4457361A1 - Oligonucléotide linéaire et utilisation dans la détection d'analytes d'intérêt - Google Patents

Oligonucléotide linéaire et utilisation dans la détection d'analytes d'intérêt

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Publication number
EP4457361A1
EP4457361A1 EP22844109.3A EP22844109A EP4457361A1 EP 4457361 A1 EP4457361 A1 EP 4457361A1 EP 22844109 A EP22844109 A EP 22844109A EP 4457361 A1 EP4457361 A1 EP 4457361A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
analyte
oligonucleotide
binding
blc
entity
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP22844109.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Mathilde AUBRET
Anne-Gaëlle BOURDAT
Arnaud BUHOT
Myriam-Laure Cubizolles
Yoann Roupioz
Maud SAVONNET
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Commissariat a lEnergie Atomique CEA
Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Commissariat a lEnergie Atomique CEA, Commissariat a lEnergie Atomique et aux Energies Alternatives CEA filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP4457361A1 publication Critical patent/EP4457361A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6876—Nucleic acid products used in the analysis of nucleic acids, e.g. primers or probes
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions

Definitions

  • the present invention relates to the field of tools and methods for detecting molecules of interest.
  • the present invention proposes a particular linear oligonucleotide structure, useful in particular for detecting and optionally quantifying at least one analyte of interest in a liquid sample implementing LAMP amplification (for “Loop-mediated isothermal AMPlification”) with two primers .
  • LAMP amplification for “Loop-mediated isothermal AMPlification”
  • the present invention also relates to such a method of detection and possible quantification.
  • a first immuno-enzymatic detection technique called the ELISA method was developed in the early 1970s.
  • ELISA method for "Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay"
  • the first antibody is used to capture the target, for example, at the bottom of a well, then that the second antibody is used for enzymatic amplification, directly or via a secondary antibody coupled to an enzyme such as HRP (for "Horse Radish Peroxidase”).
  • HRP for "Horse Radish Peroxidase”
  • the ELISA method uses an antibody and allows quantification of the target by means of a calibration range carried out beforehand or simultaneously. This method is still widely used today and many variations exist.
  • an aptamer which is an oligonucleotide sequence selected specifically for its interaction with an analyte or any other oligonucleotide sequence having a specific affinity towards an analyte can be used instead of an antibody and applied as a probe in an ELISA method.
  • Aptamers are a good alternative to antibodies since, having similar affinity to antibodies, they can detect small molecules and they are very target specific, much easier to produce and handle, more stable and less expensive.
  • the ELISA technique with antibodies or aptamers proves to be ineffective and does not allow low detection limits to be reached.
  • amplification of a DNA probe is usually necessary.
  • Aptamero-PCR for its part, makes it possible to replace the secondary antibody with an oligonucleotide containing an aptamer sequence specific to the target to be detected. Detection is obtained by the direct amplification of this probe by PCR. This method makes it possible to reach a detection limit of a few picomolar.
  • immuno-PCR and aptamero-PCR both have the disadvantages of PCR, namely the need for relatively long temperature cycles comprising different temperatures.
  • LAMP and patented [1] has the major advantage of being isothermal, the amplification being carried out at a constant temperature typically between 60°C and 65°C, and allowing rapid detection.
  • micro-RNAs a method for detecting micro-RNAs (mi-RNAs) using a LAMP method with two primers has been developed [3, 4].
  • This method has the advantage of being quantitative. However, it can only detect RNA from which a fragment of complementary DNA (cDNA) is formed by means of a reverse transcription reaction.
  • Two hairpin DNA probes designated H1 and H2 in Du et al, 2016 [4] are designed, the H1 probe presenting at its 3' end an extension complementary to half of the cDNA fragment and the H2 probe presenting at its 5' end an extension complementary to the other half of the cDNA fragment.
  • the H1 and H2 probes hybridize to the latter and, if no mismatch exists between the extensions of the H1 and H2 probes and the cDNA fragment, a covalent bond between the two probes d H1 and H2 DNA can be formed thanks to a high-fidelity ligase such as Taq DNA ligase.
  • a high-fidelity ligase such as Taq DNA ligase.
  • the inventors have already developed an innovative method for performing LAMP amplification with only two primers [5, 6].
  • This method makes it possible to detect analytes of interest of varied nature in a sample and does not have the drawbacks of the methods of the state of the art.
  • It implements a sequence in the form of an oligonucleotide with a double stem-loop structure, also referred to by the term “dumbbell”, serving as a matrix for LAMP amplification and making it possible to eliminate the first stages of this amplification. It allows to combine the recognition of analytes by oligonucleotide strands and the LAMP amplification with two primers, and gives a high sensitivity detection.
  • the oligonucleotide with double stem-loop structure implemented incorporates, within its structure [5] or at one of its ends [6], an entity for recognizing the analyte of interest.
  • the inventors have therefore set themselves the aim of proposing a useful tool in a method making it possible to detect molecules of interest of varied nature in a sample, said method not having the disadvantages of the methods of the state of the art and making it possible to further improve the double stem-loop oligonucleotide described in [5, 6], DISCLOSURE OF THE INVENTION
  • the present invention makes it possible to solve the technical problems and drawbacks listed above. Indeed, the inventors have proposed a new oligonucleotide tool which is particularly useful in a method for detecting and possibly quantifying an analyte, which makes it possible to take advantage of the advantages of LAMP amplification with two primers, namely an isothermal method, quantifiable and not requiring only two primers.
  • the oligonucleotide tool that is the subject of the present invention is a linear oligonucleotide which clearly differs from the oligonucleotides with a double stem-loop structure described in [5, 6]. Indeed, the sequence of the oligonucleotide according to the invention implemented is modified to become shorter, ideally less than 100 bases. This makes it possible in particular to envisage a simpler, more efficient chemical synthesis with a high yield and an easier and more economical purification.
  • Fie and B1 portions as defined in the oligonucleotides with double stem-loop structure described in [5, 6] have been deleted in the oligonucleotide according to the invention, thus preventing any hybridization and therefore the formation of stem-loop structures. loop.
  • This oligonucleotide comprising the portions F2, Fl, Blc and B2c can then be modified by adding an entity specific for the analyte to be detected or usable for this detection at various locations in the sequence, in particular at 5' or 3' but also between F2 and Fl, between Fl and Blc or between Blc and B2c.
  • the linear oligonucleotide according to the invention comprises neither a portion (Fie) whose nucleotide sequence is complementary to the nucleotide sequence of the portion F1, nor a portion (Bl) whose nucleotide sequence is complementary to the nucleotide sequence of the Blc portion, said Fl and Blc portions being present in this oligonucleotide.
  • the melting temperatures (Tm) of Fl-Flc and Bl-Blc are as defined later herein.
  • the oligonucleotide object of the invention comprises an F2 portion also present in the FIP primer, a Fl portion whose nucleotide sequence is complementary to the nucleotide sequence of the Fie portion present in the FIP primer, a Blc portion also present in the BIP primer and a B2c portion whose nucleotide sequence is complementary to the nucleotide sequence of the B2 present in the BIP primer.
  • nucleotide sequences are complementary to each other, when a sufficient number of nucleotides of the first nucleotide sequence can bind, by means of hydrogen bonds, with the corresponding nucleotides of the second nucleotide sequence such that pairing between the two nucleotide sequences can occur.
  • “Complementarity”, as used herein, refers to the matchability between the nucleotides of a first nucleotide sequence and a second nucleotide sequence. Non-complementary nucleotides between two nucleotide sequences can be tolerated provided that the two nucleotide sequences remain capable of specifically hybridizing to each other.
  • a first nucleotide sequence can hybridize to one or more segments of a second nucleotide sequence such that intermediate or adjacent segments are not involved in hybridization.
  • a first nucleotide sequence or specific portion thereof is at least 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90 %, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% or 100% complementary to a second nucleotide sequence or a specified part thereof.
  • linear oligonucleotide, object of the present invention corresponds to the following formula (I):
  • Sa represents the 5' end of the F2 portion or a structure comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest, the F2 portion comprises from 8 to 30 nucleotides,
  • Sb separating the F2 portion and the Fl portion is either a covalent bond, or a portion comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest, the Fl portion comprises from 10 to 35 nucleotides,
  • the Blc portion comprises from 10 to 35 nucleotides
  • Sc separating the Blc portion and the B2c portion is either a covalent bond, or a portion comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest, the B2c portion comprises from 8 to 35 nucleotides, And
  • Sd represents the 3' end of the B2c portion or a structure comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest, provided that at least one of Sa, Sb, Int, Sc and Sd comprise a structure or portion comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest.
  • the linear oligonucleotide according to the invention may comprise two, three, four or five structures or portions comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest.
  • the linear oligonucleotide according to the invention comprises a single structure or portion comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest.
  • linear oligonucleotide according to the invention corresponds to any one of the following formulas (II), (III), (IV), (V) and (VI):
  • Int' separating the Fl portion and the Blc portion is either a covalent bond or a portion comprising at least one nucleotide
  • Sa', Sb', Int'', Sc' and Sd' represent a structure or portion comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest.
  • linear oligonucleotide according to the invention corresponds to the following formula (II) or (VI):
  • Int' separating the Fl portion and the Blc portion is either a covalent bond or a portion comprising at least one nucleotide
  • Sa' and Sd' represent a structure comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest.
  • the F2 portion can comprise from 10 to 27 nucleotides and, by way of specific example, 21 or 24 nucleotides.
  • the F1 portion can comprise from 15 to 25 nucleotides and, by way of specific examples, 19, 20, 21 or 22 nucleotides. Moreover, the F1 portion has a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the Fie portion present in the FIP primer used during the two-primer LAMP amplification.
  • the melting temperature (Tm) of Fl-Flc is typically higher than the temperature used during amplification (typically between 55°C and 65°C).
  • the Tm of Fl-Flc is higher than the temperature used during the amplification, advantageously by at least 5°C, in particular by at least 7°C and, in particular, by at least 10°C.
  • the Blc portion can comprise from 17 to 27 nucleotides and, by way of specific examples, 18 or 25 nucleotides. Moreover, the Blc portion has a nucleotide sequence complementary to the nucleotide sequence of the B1 portion present in the BIP primer used during the two-primer LAMP amplification.
  • the melting temperature (Tm) of Bl-Blc is in particular higher than the temperature used during the amplification.
  • the Tm of Bl-Blc is higher than the temperature used during the amplification, advantageously by at least 5°C, in particular by at least 7°C and, in particular, by at least 10°C.
  • the B2c portion can comprise from 15 to 30 nucleotides and, by way of specific examples, 18 or 22 nucleotides.
  • the linear oligonucleotide according to the present invention when Int or Int' represents a portion comprising at least one nucleotide, the latter can comprise up to 3 nucleotides, 10 nucleotides, 30 nucleotides, 50 nucleotides and even 70 nucleotides and does not comprise any structure comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest.
  • the linear oligonucleotide according to the invention comprises less than 180 nucleotides, in particular less than 160 nucleotides, in particular less than 150 nucleotides, more particularly less than 140 nucleotides and very particularly less than 130 nucleotides.
  • the linear oligonucleotide according to the invention may comprise less than 130 nucleotides, in particular less than 120 nucleotides, in particular less than 110 nucleotides, more particularly less than 100 nucleotides and most particularly less than 90 nucleotides, in particular when the structure(s) or portions comprising at least one entity E capable of binding, directly or indirectly, to an analyte of interest does not present(s) any nucleotide.
  • the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' or Sd' in the oligonucleotide according to the invention may comprise only one entity E as defined above.
  • the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' or Sd' consists of an entity E.
  • this entity E is related:
  • the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' or Sd' in the oligonucleotide according to the invention may comprise, in addition to a entity E as previously defined, at least one other element making it possible to link the entity E to the 5' end of the portion F2, to the 3' end of the portion F2, to the 3' end of the Fl portion, at the 5' end of the Fl portion, at the 5' end of the Blc portion, at the 3' end of the Blc portion, at the 5' end of the B2c portion and/or at the 3' end of the B2c portion.
  • linking arm is used to improve the accessibility of the entity E.
  • linking arm is used to improve the accessibility of the entity E.
  • Those skilled in the art know various examples of such elements that can be used in the context of the present invention [5, 6 ], By way of examples, mention may be made of a nucleotide molecule as defined above and in particular a sequence comprising several thymine bases and in particular 10 thymine bases, a polymer such as, for example, a poly-ethylene glycol (PEG) or a structure molecular streptavidin-biotin. These last two examples (polymer and molecular structure) are in particular more suited to the Sa, Sd, Sa' and Sd' structures in the oligonucleotide according to the invention.
  • the bonds implemented in this variant are non-covalent and low-energy bonds such as hydrogen bonds or Van der Waals bonds and/or high-energy bonds of the covalent bond type.
  • the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' or Sd' in the oligonucleotide according to the invention can comprise several entities E as previously defined, identical or different.
  • two successive entities E can optionally be separated by a connecting arm.
  • these entities may optionally be linked to the 5' or 3' end of the adjacent portion via a link arm.
  • the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' or Sd' has several connecting arms, the latter may be identical or different.
  • the entity or entities E present at the level of the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' or Sd' in the oligonucleotide according to the invention are able to bind directly to at least one analyte of interest.
  • An entity E according to this embodiment may also be referred to herein as a “recognition entity”.
  • This entity can be any molecule capable of forming with the analyte to be detected a pair of elements forming a bond, also designated by the expression “binding pair” or, in English, “binding pair”.
  • the entity E and the corresponding analyte both partners of this binding pair.
  • the bonds implemented in the analyte-entity bond are advantageously non-covalent and low-energy bonds such as hydrogen bonds or Van der Waals bonds and/or high-energy bonds of the covalent bond type.
  • Non-covalent and low-energy bonds will be implemented in particular when the entity E is located in any of the aforementioned portions or structures and, in particular, in the portion Sb, Sb', Int, Int'', Sc or Sc'.
  • High-energy bonds can be implemented in the Sa, Sa', Sd and Sd' structures. Indeed, in these structures, high energy bonds will not affect LAMP amplification.
  • a recognition entity may be selected, for example, from the group consisting of carbohydrate; a peptide such as an antimicrobial peptide or an MIP for “MHC class I peptide” i.e.
  • a peptide associated with MHC-1 for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • an antigen for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • an epitope for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • an antigen for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • an epitope for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • a protein for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • an antigen an epitope
  • a protein for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • an enzyme for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • an enzyme substrate for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • a membrane or nuclear receptor for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • an agonist or antagonist of a membrane or nuclear receptor for “Major Histocompatibility Complex-1”
  • a toxin a polyclonal or monoclonal antibody
  • an antibody fragment such as an Fab
  • an entity forming a pair of bonds with an analyte of interest is advantageously in the form of a nucleotide sequence, when this entity is included in the portion Sb, Sb', Int, Int'', Sc or Sc '.
  • nucleotide molecule used herein is equivalent to the following terms and expressions: “nucleic acid”, “polynucleotide”, “nucleotide sequence”, “polynucleotide sequence” and “oligonucleotide sequence”.
  • nucleotide molecule is meant, in the context of the present invention, a chromosome; a gene ; a regulatory polynucleotide; DNA, single-stranded or double-stranded, genomic, chromosomal, chloroplast, plasmid, mitochondrial, recombinant or complementary; total RNA; a messenger RNA; a ribosomal RNA (or ribozyme); a transfer RNA; a microRNA; a small RNA interfere; a sequence acting as an aptamer; a peptide nucleic acid; a locked nucleic acid (or LNA for "Locked Nucleic Acid”); a morpholino; a portion or fragment thereof.
  • the entity or entities E present at the level of the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int”, Sc' or Sd′ are capable of binding indirectly to one or more analytes of interest.
  • This second embodiment applies in particular to the case where the entity or entities E are present at the level of the structure Sa, Sd, Sa' or Sd'.
  • this or these E entities are independent of the analyte(s) of interest to be detected and this detection requires the use of a binding intermediate capable of binding, on the one hand, to the oligonucleotide according to this second embodiment of the invention and, on the other hand, to the analyte(s) of interest.
  • This binding partner corresponds to a molecule comprising a first PI portion capable of binding to an entity E present in the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int”, Sc' or Sd 'of the oligonucleotide and in particular in the structure Sa, Sd, Sa' or Sd' and a second portion P2 capable of binding to at least one analyte of interest.
  • the P2 portion of this molecule corresponds to a recognition entity as defined above or comprises several recognition entities as defined above, which are identical or different. Thus, everything that has been described above for the recognition entity or entities applies mutatis mutandis to the P2 portion.
  • the P1 portion and the P2 portion are coupled to each other by means of a covalent bond.
  • the portion PI and the portion P2 can be coupled to each other by means of a connecting arm as previously defined.
  • An entity E of this second embodiment can be any molecule capable of forming a binding pair with the PI portion of the binding partner, the entity E and the PI portion corresponding to the two partners of this binding pair.
  • the bonds implemented in the entity-PI portion bond are non-covalent and low energy bonds such as hydrogen bonds or Van der Waals bonds.
  • the present invention relates to a non-covalent complex, formed by an oligonucleotide according to the second embodiment and a molecule comprising a first portion PI capable of binding to said at least one entity E of said oligonucleotide and a second portion P2 capable of binding at least one analyte of interest.
  • this non-covalent complex is formed by a linear oligonucleotide whose structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' or Sd' and in particular the structure Sa, Sd, Sa' or Sd' comprises at least one entity E capable of binding indirectly to at least one analyte of interest as previously defined and a molecule comprising a first portion PI capable of binding to this at least one entity E present in the structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' or Sd' and in particular the structure Sa, Sd, Sa' or Sd' and a second portion P2 able to bind to at least one analyte of interest.
  • Such a complex can be designated by the expression “binding complex”.
  • the present invention also relates to the use of a linear oligonucleotide as defined above or a binding complex as defined above for detecting and optionally quantifying at least one analyte optionally present in a liquid sample.
  • FIP primer of formula 5′-Flc-F2-3′
  • BIP primer of formula 5'-Blc-B2-3'
  • the present invention relates to a method for detecting and possibly quantifying at least one analyte possibly present in a liquid sample, comprising the following steps: i) bringing said liquid sample into contact with the surface of a solid support comprising at least one active zone on which at least one probe capable of binding said at least one analyte is immobilized; ii) bringing said surface into contact with a solution containing either at least one linear oligonucleotide whose structure or portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int”, Sc' or Sd' comprises an entity E capable of binding directly to at least one analyte of interest as defined above, or a binding complex as defined above, said oligonucleotide and said complex having been prepared prior to said contacting; iii) eliminating the excess of oligonucleotides or the excess of binding complexes which have not reacted during the bringing into contact of step ii); iv)
  • the present invention relates to a method for detecting and possibly quantifying at least one analyte possibly present in a liquid sample, comprising the following steps: i′) bringing said liquid sample into contact with the surface of a solid support comprising at least one active zone on which at least one probe capable of binding said at least one analyte is immobilized; iii') bringing said surface into contact with a solution containing at least one molecule comprising a first portion PI capable of binding to the entity E present in the structure of the oligonucleotide according to the present invention and a second portion P2 capable of binding binding to said at least one analyte of interest;
  • the liquid sample used in the context of the present invention is a liquid capable of containing one or more analytes to be detected and optionally to be quantified. It can be of very varied nature and origin.
  • This liquid sample is advantageously chosen from the group consisting of a biological fluid; a plant fluid such as sap, nectar and root exudate; a sample in a culture medium or in a biological culture reactor such as a cell culture of higher eukaryotes, yeasts, fungi, algae or bacteria; a liquid obtained from one (or more) animal or plant cell(s); a liquid obtained from animal or plant tissue; a sample taken from a food matrix; a sample taken from a chemical reactor; city, river, sea, swimming pool, air-cooled tower or underground water; a sample taken from a liquid industrial effluent; waste water originating in particular from intensive farming or industries in the chemical, pharmaceutical or cosmetics field; a sample from air filtration or coating; a sample taken from an object such as a piece of fabric, a piece of clothing, a sole, a shoe, a tool or a weapon; a pharmaceutical product; a cosmetic product; a perfume ; a soil sample or one of their mixtures.
  • a biological fluid such
  • the biological fluid is advantageously chosen from the group consisting of blood such as whole blood or anti-coagulated whole blood, blood serum, blood plasma, lymph, saliva, sputum, tears, sweat, semen, urine, faeces, milk, cerebrospinal fluid, interstitial fluid, isolated bone marrow fluid, mucus or fluid from the respiratory, intestinal or genito-urinary tract, cell extracts, extracts of tissues and organ extracts.
  • the biological fluid can be any fluid naturally secreted or excreted from a human or animal body or any fluid recovered, from a human or animal body, by any technique known to those skilled in the art such as extraction , sampling or washing. The steps for recovering and isolating these different fluids from the human or animal body are carried out prior to the implementation of the method according to the invention.
  • the method of the invention further comprises a prior step of preparing the liquid sample with optional dissolving of the sample by techniques known to those skilled in the art such as filtration, precipitation, dilution , distillation, mixing, concentration, lysis, etc.
  • An analyte to be detected and optionally to be quantified in the liquid sample can be chosen from the group consisting of a molecule of environmental interest such as a pesticide; a molecule of biological interest; a molecule of pharmacological interest; a toxin; a carbohydrate such as glucose; a lipid such as cholesterol; a peptide; an antigen; an epitope; a protein; a glycoprotein; an enzyme; an enzyme substrate; a nuclear or membrane receptor; an agonist or antagonist of a nuclear or membrane receptor; a hormone; a polyclonal or monoclonal antibody; an antibody fragment such as an Fab, F(ab′)2, Fv fragment or a hypervariable domain (or CDR for “Complementarity Determining Region”); a nucleotide molecule as previously defined; ions such as mercury ions or lead ions; a eukaryotic cell; a prokaryotic cell and a virus.
  • a molecule of environmental interest such as
  • an analyte to be detected and possibly to be quantified in the liquid sample can be defined as a small molecule, i.e. a molecule whose molecular weight is less than or equal to 10,000 daltons and in particular less than or equal to 8000 daltons. This small molecule can belong to any of the analyte lists above.
  • Step i) or i′) of the method according to the present invention uses a probe capable of binding said at least one analyte immobilized on the surface of a solid support.
  • the probe used to functionalize an active zone of the surface of the solid support is any molecule capable of forming with an analyte to be detected a pair of bonds, the probe and the analyte corresponding to the two partners of this pair of bonds.
  • the bonds implemented in the analyte-probe bond are advantageously either non-covalent and low-energy bonds such as hydrogen bonds or Van der Waals bonds, or high-energy bonds of the covalent bond type.
  • the probe used is therefore dependent on an analyte to be detected.
  • the person skilled in the art will be able, without any inventive effort, to choose the most suitable probe. It can be selected, for example, from the group consisting of a carbohydrate; a peptide such as an antimicrobial peptide or a MIP, ie a peptide associated with MHC-1 (for “Major Histocompatibility Complex-1”); an antigen; an epitope; a protein; a glycoprotein; an enzyme; an enzyme substrate; a membrane or nuclear receptor; an agonist or antagonist of a membrane receptor or nuclear; a toxin; a polyclonal or monoclonal antibody; an antibody fragment such as a Fab, Ffab', Fv fragment or a hypervariable domain; a nucleotide molecule as previously defined; and an aptamer.
  • the probe and the recognition entity can recognize distinct zones or elements at the level of the analyte to be detected.
  • the probe and the recognition entity can target the same element at the level of the analyte to be detected. This variant corresponds in particular to the case where the analyte to be detected is a bacterium or a virus and the element to be targeted is a surface element present at several bacterial or viral surface zones.
  • Any solid support making it possible to implement the present invention can be used. It may be, for example, a biochip support such as those conventionally used in silicon, glass, metal, polymer or plastic. This solid support can also consist of particles and in particular silica particles, polymer particles and/or magnetizable particles.
  • the functionalization of the active zone of the surface of the solid support by a probe as defined above can be carried out by any suitable technique allowing the fixing of a compound on a solid support. It is possible in particular to envisage simple adsorption, ionic bonds, hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, Van der Waals bonds or covalent grafting.
  • the surface of the solid support has functional groups thanks to which the probe(s) are capable of immobilizing themselves.
  • these functional groups are chosen from carboxylic groups, radical entities, alcohol, amine, amide, epoxy or thiol functions. These groups are carried, intrinsically or by functionalization, by the active zone of the surface of the solid support.
  • the probe(s) may also have such functional groups, intrinsically or by functionalization.
  • the probe(s) can be immobilized directly at the level of the functionalized or non-functionalized surface.
  • a solid support "coated" with a protein such as streptavidin is an example of direct immobilization, in which the probe must be functionalized with a biotin.
  • the probe(s) can be immobilized indirectly at the level of the functionalized or non-functionalized surface.
  • This indirect immobilization involves a spacer arm (or joining agent) linked, on the one hand, to the surface and, on the other hand, to a probe.
  • a spacer arm is used in particular to improve accessibility to the probe.
  • silane reagents used for the grafting of probes onto glass
  • complexation of thiolated products on gold surfaces and the immobilization of probes in polymer matrices.
  • such a spacer arm may be in the form of a sequence comprising several thymine bases and in particular 10 thymine bases.
  • bonds implemented during direct or indirect immobilization can be any bonds known to those skilled in the art and in particular covalent bonds, ionic bonds, hydrogen bonds, electrostatic interactions, hydrophobic interactions, bonds of Van der Waals or adsorption.
  • a surface blocking step can be implemented prior to the attachment of the probe and/or following this attachment.
  • the blocking solution used during this blocking step may comprise one or more of the following components: albumin such as BSA (for "Bovine Serum Albumin"), genomic DNA such as single-stranded DNA and in particular Single-stranded salmon sperm DNA, gelatin, casein, milk proteins, serum, polyethylene glycol and polyvinylpyrrolidone type polymers.
  • a particular example of a blocking solution is a solution containing 1% to 5% BSA and optionally 20 ⁇ g/mL of salmon sperm single-stranded DNA.
  • Step i) or i') of the method according to the invention consists in bringing the liquid sample as defined above into contact with the surface of a solid support functionalized by one or more probes capable of binding the analyte to be detected. whereby, if the liquid sample contains this analyte, the latter is captured at the probe(s).
  • step i) or i′) of bringing into contact can last between 1 min and 24 h, between 2 min and 12 h, between 5 min and 6 h, between 10 min and 3 h, between 15 min and 2 h, between 20 min and 1 h and, in particular, of the order of 30 min (i.e. 30 min ⁇ 5 min).
  • step i) of bringing into contact can be carried out at a temperature of between 4° C. and 70° C., in particular between 10° C. and 60° C., in particular between 15 and 45° C. and, more particularly , at room temperature (i.e. 23°C ⁇ 5°C) or at physiological temperature (i.e. 37°C ⁇ 5°C).
  • step i) or i′) and prior to step ii) or iii′) of the method according to the present invention it is possible to eliminate the elements present in the liquid sample and which have not been captured by the probe(s). Any technique allowing such elimination can be used in the context of the present invention. By way of example, mention may be made of the washing of the surface of the solid support or the separation of the liquid sample and the solid support such as a physical or magnetic separation. However, this elimination step is optional since these elements can be eliminated subsequently and in particular during any one of steps iii), Ü2′) or iii′).
  • the surface of the solid support can be subjected to at least one rinsing so as to eliminate all traces of the liquid sample.
  • This rinsing is typically carried out with an aqueous rinsing solution preserving the probe/analyte interaction or irreversibly binding the analyte and the probe. This solution can also make it possible to eliminate non-specific interactions.
  • a buffer such as a Tris, phosphate, acetate or borate buffer
  • salts such as KCI, NaCI, (NF hSC , MgC or CaC
  • detergents or surfactants such as Tween®, Triton® or sodium dodecyl sulphate (or SDS)
  • denaturing agents such as formamide or dimethyl sulphoxide
  • organic solvent such as ethanol, methanol or acetonitrile
  • bridging agents such as formaldehyde or glutaraldehyde.
  • rinsing is repeated three times with a solution comprising (i) phosphate buffered saline (or PBS) and 0.1% Tween® such as Tween®20, (ii) PBS, 0.3% Tween® such as Tween®20 and 1 M NaCl or (iii) a saline solution containing 0.02 M PBS, 1.074 M NaCl and 0.3% Tween® such as Tween®20.
  • a solution comprising (i) phosphate buffered saline (or PBS) and 0.1% Tween® such as Tween®20, (ii) PBS, 0.3% Tween® such as Tween®20 and 1 M NaCl or (iii) a saline solution containing 0.02 M PBS, 1.074 M NaCl and 0.3% Tween® such as Tween®20.
  • this optional elimination step is carried out at a temperature between 4°C and 100°C, in particular between 10°C and 60°C, in particular between 15°C and 45°C. C and, more particularly, at room temperature or at physiological temperature.
  • Step ii) of the method according to the present invention consists in bringing the surface of the solid support on which an analyte to be detected is optionally retained via the probe or probes functionalizing this surface into contact with a solution containing at least one linear oligonucleotide, capable of to bind to said analyte or at least one binding complex as previously defined, whereby, if this analyte is present at the surface of the solid support, the oligonucleotide or the binding complex binds to the latter respectively via its recognition entity or its portion P2.
  • the linear oligonucleotide or the binding complex is capable of forming with the analyte to be detected a binding pair, the oligonucleotide or the binding complex and the analyte corresponding to the two partners of this pair of connection.
  • the bonds implemented in the oligonucleotide-analyte bond or in the complex-analyte bond are advantageously non-covalent and low-energy bonds such as hydrogen bonds or Van der Waals bonds and/or high-energy bonds of the covalent bonds.
  • oligonucleotide according to the invention was synthesized prior to the contacting of step ii) or iis′). In other words, this synthesis is carried out neither in the presence of the surface of the solid support functionalized by the probe(s) as defined previously, nor in the presence of the analyte to be detected.
  • this synthesis is a chemical synthesis conventionally used to prepare oligonucleotides.
  • step ii) of the method according to the present invention the surface of the solid support on which at least one analyte is optionally maintained by means of a probe is brought into contact with a solution containing at least one linear oligonucleotide as previously defined or a binding complex as previously defined.
  • This solution is advantageously an aqueous solution allowing dumbbell or complex/analyte interaction.
  • a buffer such as a Tris, phosphate, acetate or borate buffer
  • salts such as KCI, NaCI, (NF hSC , MgC or CaC
  • detergents or surfactants such as Tween®, Triton® or sodium dodecyl sulphate (or SDS)
  • denaturing agents such as formamide or dimethyl sulphoxide
  • organic solvent such as ethanol, methanol or acetonitrile
  • bridging agents such as formaldehyde or glutaraldehyde.
  • the solution used when the oligonucleotide comprises an aptamer sequence for the recognition of the analyte, the solution used will be composed of the elements in whole or in part constituting the selection buffer of the aptamer
  • the solution used during step ii) may, in addition, comprise one or more elements chosen from genomic DNA such as single-stranded DNA and in particular single-stranded salmon sperm DNA, serum, albumin, a synthetic polymer, a blocking agent such as Denhardt blocking agent and any other element making it possible to limit non-specific adsorption.
  • a particular example of a solution used during step ii) is a saline solution containing 0.02 M PBS, 1.074 M NaCl, 0.3% Tween20 detergent, 20 pg/mL of sperm DNA from salmon as well as 4% Denhardt blocking agent.
  • the linear oligonucleotide or the binding complex is present in this solution in an amount of between 1 ⁇ M and 1 mM, and in particular between 100 ⁇ M and 1 ⁇ M.
  • concentrations that can be used, mention may be made of a concentration of 10 pM, 100 pM, 1 nM or 10 nM.
  • the linear oligonucleotide or the binding complex is present in the solution used during step ii) at a concentration of 100 pM.
  • step ii) of bringing into contact can last between 1 min and 24 h, in particular between 2 min and 12 h and, in particular, between 5 min and 6 h.
  • this contacting can last between 10 min and 3 h, between 15 min and 2 h, between 20 min and 1 h and, in particular, of the order of 30 min (ie 30 min ⁇ 5 mins). In another form of implementation, this implementation can last between 30 min and 6 h, between 1 h and 5 h, between 2 h and 4 h and, in particular, of the order of 3 h (ie 3 h ⁇ 15 mins).
  • step (ii) of bringing into contact can be carried out at a temperature of between 4° C. and 100° C., in particular between 10° C. and 60° C., in particular between 15 and 30° C. and, more particularly, at room temperature (ie 23°C ⁇ 5°C) or at physiological temperature (ie 37°C ⁇ 5°C).
  • step ii) nature of the solution, duration and temperature
  • steps iii') and iis' the molecule comprising a first portion P1 and a second portion P2 as previously defined and the linear oligonucleotide is present in the solution during contacting respectively in step iii′) and in step iis′) in an amount comprised between 1 aM and 1 mM, and in particular between 100 aM and 1 pM.
  • concentrations that can be used, mention may be made of a concentration of 10 pM, 100 pM, 1 nM or 10 nM.
  • stage iiz′ iii) or iii′ of the process according to the present invention.
  • any technique allowing such elimination can be used in the context of the present invention. Examples include washing the surface of the solid support or separating the solution containing linear oligonucleotides or molecules with P1 and P2 moieties or binding complexes, from the solid support such as a physical or magnetic separation .
  • the surface of the solid support can be subjected to at least one rinsing which is typically carried out with a rinsing solution consisting of an aqueous solution: preserving the analyte/oligonucleotide interaction or binding irreversibly the analyte and the oligonucleotide (case of step iii));
  • step iii - retaining the analyte/binding complex interaction or irreversibly binding the analyte and the binding complex (case of step iii) and of step iii')) or
  • This rinsing solution can also eliminate non-specific interactions. It may comprise one or more of the following components: a buffer such as a Tris, phosphate, acetate or borate buffer; salts such as KCl, NaCl, (NFUhSC , MgC or CaC; detergents or surfactants such as Tween®, Triton® or sodium dodecyl sulphate (or SDS); denaturing agents such as formamide or dimethyl sulphoxide; an organic solvent such as ethanol, methanol or acetonitrile; and bridging agents such as formaldehyde or glutaraldehyde and one or more element(s) chosen from genomic DNA such as single-stranded DNA and in particular single-stranded DNA from salmon sperm, serum, albumin and a synthetic polymer.
  • a buffer such as a Tris, phosphate, acetate or borate buffer
  • salts such as KCl, NaCl, (NFUhSC , M
  • This rinsing can be repeated twice, three times, five times, 10 times and even 50 times using, for each rinse, an identical or different rinsing solution.
  • the rinsing is repeated three times with a solution comprising PBS and 0.1% Tween®
  • the rinse is repeated three times with a saline solution containing 0.02 M PBS, 1.074 M NaCl and 0.3% Tween®20 detergent.
  • step Hz′), iü) or iii′) is carried out at a temperature between 4° C. and 100° C., in particular between 15° C. and 80° C., in particular between 30° C. and 60° C. C and, more particularly, at a temperature of the order of 40° C. (i.e. 40° C. ⁇ 5° C.) or at physiological temperature.
  • Step iv) or iv′) of the method according to the invention is the two-primer LAMP amplification strictly speaking.
  • the only two primers used are the FIP and BIP primers as previously defined, namely the primers with respective sequences 5'-Flc-F2-3' and 5'-Blc-B2-3'.
  • the melting temperature (Tm) of B2-B2c is in particular higher than the temperature used during the amplification.
  • the Tm of B2-B2c is higher than the temperature used during the amplification, advantageously by at least 5°C, in particular by at least 7°C and, in particular, by at least 10°C.
  • the melting temperature (Tm) of F2-F2c is in particular higher than the temperature used during the amplification.
  • the Tm of B2-B2c is higher than the temperature used during the amplification, advantageously by at least 5°C, in particular by at least 7°C and, in particular, by at least 10°C.
  • step iv) or iv') of the method according to the present invention the analyte is not used as a primer for the LAMP amplification.
  • step iv) or iv′) of the method according to the present invention consists in bringing into contact the surface on which is/are immobilized one or more probe(s) specific for the analytes to be detected with a reaction mixture comprising the FIP and BIP primers and any element necessary for the production of an amplification product if the linear oligonucleotide is present.
  • step iv) or iv′) after having resuspended the linear oligonucleotide or the binding complex as previously defined.
  • the solid support to which the linear oligonucleotide is indirectly bound via the analyte of interest and optionally a molecule with P1 and P2 portions should be subjected to a treatment such as a thermal or chemical treatment and this , so as to separate the binding partners which are (i) the linear oligonucleotide and the analyte of interest, (ii) the linear oligonucleotide and the molecule with P1 and P2 portions, and/or (iii) the molecule at P1 and P2 portions and the analyte of interest.
  • the reaction mixture used during step iv) or iv′) comprises an appropriate buffer, such as, for example, a phosphate buffer or a Tris buffer; deoxyribonucleosides (dNTPs), such as an equimolar mixture of dATP, dCTP, dGTP and dTTP and an enzyme catalyzing LAMP amplification.
  • an appropriate buffer such as, for example, a phosphate buffer or a Tris buffer
  • dNTPs deoxyribonucleosides
  • One such enzyme is a polymerase exhibiting high strand displacement activity in addition to replication activity.
  • the reaction medium may also comprise salts such as magnesium salts, manganese salts and/or ammonium salts; detergents, betaine and/or elements useful for the detection and quantification of the amplification product of the linear oligonucleotide such as, for example, calcein, an intercalating dye such as, for example, propidium iodide, SYTO 9, SYBR Green and EvaGreen.
  • salts such as magnesium salts, manganese salts and/or ammonium salts
  • detergents such as, for example, calcein
  • an intercalating dye such as, for example, propidium iodide, SYTO 9, SYBR Green and EvaGreen.
  • Step iv) or iv′) of the method according to the present invention is carried out for a period of time and at a temperature sufficient for the production of an amplification product if the linear oligonucleotide is present.
  • this step is carried out under isothermal conditions and in particular at a temperature of between 15° C. and 90° C., in particular, between 50° C. and 80° C. and, more particularly of the order of 65° C. ( i.e. 65°C ⁇ 5°C).
  • the duration of step iv) or iv′) of the process according to the present invention is between 1 min and 120 min, in particular between 5 min and 90 min and, in particular, between 10 min and 60 min.
  • Step v) or v′) consists in detecting and optionally quantifying the amplification product of the linear oligonucleotide and therefore in detecting and optionally quantifying the analyte to which the linear oligonucleotide is or has been bound since the Accumulation of the amplification product is an indicator of the presence of this immobilized analyte on the surface of the solid support.
  • Step v) or v′) can be carried out simultaneously with step iv) or iv′) or after the latter.
  • a person skilled in the art knows various techniques for carrying out this detection. The latter can in particular be any of the techniques described in Becherer et al, 2020 [7],
  • the amplification product can be detected, during step v) or v′), by measuring the turbidity caused by the magnesium pyrophosphate precipitated in solution as a byproduct of amplification. This measurement can be performed with the naked eye or via a turbidimeter or by lensless imaging [8].
  • the amplification product can be detected, during step v) or v′), by a pH probe making it possible to monitor the acidification of the reaction mixture during LAMP amplification.
  • the amplification product can be detected, during step v) or v′), via gel electrophoresis.
  • the amplification product can be detected, during step v) or v′), by detection of crystals in plane by lensless imaging as described in [8].
  • the amplification product can also be detected, during step v) or v′), by a colorimetric test or by fluorescence measurement, in particular when calcein or a fluorescent intercalating dye is present in the reaction mixture.
  • this quantification is carried out by a comparison with a standard range of analyte at known concentrations. .
  • This quantification is a standard step of the ELISA method.
  • This quantification can also implement known quantities of analyte to be detected, added to the liquid sample as previously envisaged (doped liquid sample).
  • FIG. 1 presents the LAMP calibration range of linear oligonucleotides according to the invention (M1 and M2) and compared with that of a minimal dumbbell (M3).
  • FIG. 2 presents the principle of direct detection of a single strand of DNA complementary to the recognition entity of a linear oligonucleotide according to the invention, M2.
  • FIG. 3 presents the amplification curves of a linear oligonucleotide according to the invention, M2, during its hybridization on the complementary DNA strand immobilized on the magnetic beads (experimental duplicates).
  • Figure 5 presents the principle of detection of a protein (antibody 1) fixed on magnetic beads by immunoLAMP: grafting of antibodies on the linear oligonucleotide according to the invention using a PI portion, here "Zip6c" which recognizes the "Zip6" recognition entity of the oligonucleotide, the antibody corresponding to the P2 portion (left), by covalent bond (center) and by biotin-streptavidin bond (right).
  • a PI portion here "Zip6c” which recognizes the "Zip6" recognition entity of the oligonucleotide
  • FIG. 6 presents the implementation of the immunoLAMP protocols including an antibody functionalized with the linear oligonucleotide according to the invention and various negative controls.
  • Figure 7 shows the amplification curve (fluorescence as a function of time) of the detection of proteins immobilized on beads by an antibody functionalized with a "Zip6c" oligonucleotide strand then linked to the oligonucleotide according to the invention by LAMP with 2 primers .
  • the legend corresponds to the diagrams in Figure 6.
  • a linear oligonucleotide according to the invention designated Ml with an El recognition entity of 40 bases consisting of an anti-thrombin aptamer called "Thrl" [9]
  • dumbbell with a double rod-loop structure as presented in [5, 6] and used here as a reference. This dumbbell is said to be "minimal” because it does not contain any recognition entity. 0
  • an intercalating dye such as EvaGreen
  • the calibration range comparing the 3 sequences is presented in Figure 1. This represents the threshold cycle values called “Ct” as a function of the logarithm of the concentration of the DNA matrix.
  • the Ct value is defined by the time from which the fluorescence value is greater than a threshold fluorescence value.
  • Figure 1 validates the two-primer LAMP amplification of oligonucleotides M1 and M2. Their amplification is slower than the “dumbbell” double loop version i.e. M3, but they have the advantage of having a much shorter strand length, allowing easy synthesis.
  • oligonucleotides are then subsequently used in various configurations including a recognition entity for detection applications. II. Use of an oligonucleotide according to the present invention in detection.
  • the M2 oligonucleotide is used in detection, since it includes a “Zip6” recognition entity part allowing it to hybridize to the complementary “Zip6c” sequence.
  • the sequence of "Zip6" and that of "Zip6c” are respectively 5'-GACCGGTATGCGACCTGGTATGCG-3' (SEQ ID NO: 6 in the attached sequence listing) and 5'-CGCATACCAGGTCGCATACCGGTC-3' (SEQ ID NO: 7 in the attached sequence listing).
  • the M2 oligonucleotide Compared to the dumbbells used in detection in [5, 6], the M2 oligonucleotide has the advantage of being short and generic since it can hybridize with any type of probe.
  • the detection of DNA strands immobilized on magnetic beads was carried out and made it possible to show that the oligonucleotide according to the invention makes it possible to detect a single strand of DNA when the latter is complementary to the sequence placed at the end 5'.
  • the detection protocol is then the following:
  • This protocol makes it possible to obtain a range of amplification of the oligonucleotide when its 5' end hybridizes with the complementary strand placed on the beads.
  • the amplification curves obtained and the associated calibration range are shown in Figure 3 and Figure 4.
  • linear oligonucleotide Another example of the use of a linear oligonucleotide according to the invention consists in using it with antibodies. This makes it possible to combine the recognition specificity of the antibodies with the sensitivity given by the LAMP amplification of this oligonucleotide, in order to detect molecules present in very small quantities in the fluids.
  • This technique is equivalent to immunoPCR techniques known and used for twenty years, but uses LAMP amplification which has the advantage of being isothermal [2],
  • this protocol is further simplified because the linear oligonucleotide used for LAMP is shortened and uses only 2 primers.
  • an antibody can be grafted to the oligonucleotide by biotin-streptavidin bond, by covalent bond at the 5' end or else via a PI portion, here "Zip6c" which recognizes the recognition entity "Zip6" of the oligonucleotide, the antibody corresponding to the P2 portion, as shown in Figure 5.
  • This type of configuration makes it possible to make a sandwich with two antibodies followed by LAMP amplification, combining specificity and sensitivity of recognition.
  • This protein detection was set up by way of example with an anti-mouse antibody 1 and an anti-CD63 antibody 2 produced in mice.
  • antibody 2 is functionalized with a "Zip6c" oligonucleotide strand, complementary to the "Zip6" part present in the linear oligonucleotide according to invention).
  • a covalent bond is then established between the antibody 2 and the oligonucleotide strand thanks to a reaction between a thiol molecule attached to the oligonucleotide and the SM(PEG)i2 molecule attached to the antibody 2.
  • This complex is then brought into contact with the oligonucleotide according to the invention, amplifiable by 2-primer LAMP, which binds thereto by DNA hybridization, forming a protein recognition complex and amplifiable by 2-primer LAMP.
  • the detection protocol is then the following:
  • Negative control 1 Antibody 1 specific for antibody 2 and addition of the oligonucleotide according to the invention, not functionalized with the antibody,
  • Patent application CN 106148549 published on November 23, 2016.
  • Patent application EP 3878971 published on September 15, 2021.

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Abstract

La présente invention concerne un oligonucléotide linéaire présentant, dans sa séquence, à son extrémité 5' ou à son extrémité 3', une structure comprenant une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à au moins un analyte d'intérêt. La présente invention concerne également l'utilisation d'un tel oligonucléotide linéaire pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, via une amplification isotherme médiée par des boucles à deux amorces.

Description

OLIGONUCLÉOTIDE LINÉAIRE ET UTILISATION DANS LA DÉTECTION D'ANALYTES D'INTÉRÊT
DESCRIPTION
DOMAINE TECHNIQUE
La présente invention concerne le domaine des outils et procédés de détection de molécules d'intérêt.
Plus particulièrement, la présente invention propose une structure oligonucléotidique linéaire particulière, utile notamment pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte d'intérêt dans un échantillon liquide mettant en œuvre une amplification LAMP (pour « Loop-mediated isothermal AMPlification ») à deux amorces. La présente invention concerne également un tel procédé de détection et d'éventuelle quantification.
ÉTAT DE LA TECHNIQUE ANTÉRIEURE
De nombreux travaux et études dans des domaines englobant notamment la recherche académique ; la recherche et les analyses, cliniques et diagnostiques, avec des essais réalisés sur des prélèvements de sang ou des biopsies cellulaires ou tissulaires ; la surveillance environnementale ; la surveillance civile ; la sécurité alimentaire et notamment le contrôle qualité ; les analyses criminelles sur traces... impliquent la détection de biomarqueurs, de molécules d'intérêt ou de contaminants dans un échantillon et notamment dans un échantillon liquide.
Plusieurs techniques ont été mises au point à cet effet.
Une première technique immuno-enzymatique de détection intitulée méthode ELISA (pour « Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay ») a été développée au début des années 1970. Parmi les différentes mises en œuvre employées dans cette technique, un sandwich entre deux anticorps spécifiques et la cible peut être réalisé. Le premier anticorps est utilisé pour capturer la cible, par exemple, au fond d'un puits, alors que le deuxième anticorps sert à l'amplification enzymatique, directement ou via un anticorps secondaire couplé à une enzyme comme la HRP (pour « Horse Radish Peroxidase »). La méthode ELISA met en œuvre un anticorps et permet une quantification de la cible au moyen d'une gamme de calibration réalisée au préalable ou simultanément. Cette méthode est encore actuellement largement utilisée et de nombreuses variantes existent. En effet, un aptamère qui est une séquence oligonucléotidique sélectionnée spécifiquement pour son interaction avec un analyte ou toute autre séquence oligonucléotidique ayant une affinité spécifique envers un analyte peut être utilisé à la place d'un anticorps et appliqué comme sonde dans une méthode ELISA. Les aptamères constituent une bonne alternative aux anticorps dans la mesure où, présentant une affinité similaire à celle des anticorps, ils peuvent détecter de petites molécules et où ils sont très spécifiques d'une cible, beaucoup plus faciles à produire et à manipuler, plus stables et moins coûteux.
Cependant, lorsque la cible à détecter est présente en très faibles concentrations dans l'échantillon, la technique ELISA avec anticorps ou aptamères s'avère inefficace et ne permet pas d'atteindre des faibles limites de détection. Pour résoudre ce problème, l'amplification d'une sonde ADN est généralement nécessaire.
C'est pourquoi, d'autres méthodes de détection ont été développées mettant en œuvre une amplification en chaîne par polymérase (ou PCR pour « Polymerase Chain Reaction »). A titre d'exemples particuliers de telles méthodes, on peut citer l'immuno-PCR et l'aptaméro-PCR.
Dans l'immuno-PCR, l'amplification enzymatique de la technique ELISA est remplacée par une amplification d'ADN. Le second anticorps est alors couplé à une séquence ADN qui est exponentiellement amplifiée par PCR. Cette méthode est très spécifique et quantitative mais elle nécessite toujours la présence de deux anticorps spécifiques de la cible et notamment le développement d'un anticorps couplé à un ADN, ce qui rend cette méthode compliquée et coûteuse.
L'aptaméro-PCR, quant à elle, permet de remplacer l'anticorps secondaire par un oligonucléotide contenant une séquence d'aptamère spécifique de la cible à détecter. La détection est obtenue par l'amplification directe de cette sonde par PCR. Cette méthode permet d'atteindre une limite de détection de quelques picomolaires. Cependant, l'immuno-PCR et l'aptaméro-PCR présentent, toutes deux, les inconvénients de la PCR à savoir la nécessité de cycles de températures relativement longs et comportant différentes températures.
Enfin, une autre méthode d'amplification a été développée pour remplacer la PCR dans le cadre de l'amplification de doubles brins d'ADN. Cette méthode appelée LAMP et brevetée [1] présente l'avantage majeur d'être isotherme, l'amplification étant réalisée à une température constante typiquement comprise entre 60°C et 65°C, et permettant une détection rapide.
Ainsi, une méthode de détection de protéines avec amplification LAMP a été décrite par Pourhassan-Moghaddam et al, 2013 [2], Elle met en œuvre, d'une part, un anticorps ou un aptamère fixé à une surface pour capturer la cible et, d'autre part, un oligonucléotide contenant une séquence aptamère qui reconnaît la cible. Cet oligonucléotide est, par la suite, amplifié par la méthode LAMP classique avec quatre amorces.
Cependant, le design complexe des quatre amorces indispensables à la méthode d'amplification LAMP rend ce procédé complexe et relativement long à mettre en œuvre, malgré le développement de nombreux logiciels de design des amorces LAMP comme, par exemple, LAMP designer (OPtigene) ou primer Explorer.
Enfin, une méthode de détection de micro-ARNs (mi-ARNs) par une méthode LAMP avec deux amorces a été développée [3, 4], Cette méthode présente l'avantage d'être quantitative. Toutefois, elle ne permet de détecter que de l'ARN à partir duquel est formé un fragment d'ADN complémentaire (ADNc) au moyen d'une réaction de transcription inverse. Deux sondes d'ADN en épingle à cheveux désignées H1 et H2 dans Du et al, 2016 [4] sont conçues, la sonde H1 présentant à son extrémité 3' une extension complémentaire à la moitié du fragment d'ADNc et la sonde H2 présentant à son extrémité 5' une extension complémentaire à l'autre moitié du fragment d'ADNc. En présence du fragment d'ADNc, les sondes H1 et H2 s'hybrident sur ce dernier et, si aucun mésappariement n'existe entre les extensions des sondes H1 et H2 et le fragment d'ADNc, une liaison covalente entre les deux sondes d'ADN H1 et H2 peut être formée grâce à une ligase haute-fidélité comme la Taq DNA ligase. Il est donc clair que cette méthode de détection de mi-ARNs n'est pas générique puisqu'elle nécessite la préparation de deux sondes spécifiques de chaque mi-ARN à détecter. Par ailleurs, cette méthode implique plusieurs étapes avant la mise en œuvre de la technique LAMP avec une étape de transcription inverse et une étape de ligation, cette dernière pouvant être complexe avec un rendement possiblement faible et la nécessité d'utiliser une enzyme supplémentaire. Malgré cela, dans leur publication Du et al, 2016 [4], les auteurs insistent sur le fait que cette étape est primordiale notamment pour une meilleure discrimination des mutations dans les mi-ARNs (phrase pontant les colonnes de la page 12722).
Les inventeurs ont déjà mis au point une méthode innovante permettant de réaliser une amplification LAMP avec seulement deux amorces [5, 6]. Cette méthode permet de détecter des analytes d'intérêt de nature variée dans un échantillon et ne présente pas les inconvénients des méthodes de l'état de la technique. Elle met en œuvre une séquence se présentant sous forme d'un oligonucléotide à double structure tige-boucle, également désigné sous le terme « haltère », servant de matrice à l'amplification LAMP et permettant d'éliminer les premières étapes de cette amplification. Elle permet de combiner la reconnaissance d'analytes par des brins oligonucléotidiques et l'amplification LAMP à deux amorces, et donne une détection à haute sensibilité. En effet, l'oligonucléotide à double structure tige-boucle mis en œuvre intègre, au sein de sa structure [5] ou à l'une de ses extrémités [6], une entité de reconnaissance de l'analyte d'intérêt.
Les inventeurs se sont donc fixé pour but de proposer un outil utile dans un procédé permettant de détecter des molécules d'intérêt de nature variée dans un échantillon, ledit procédé ne présentant pas les inconvénients des méthodes de l'état de la technique et permettant d'améliorer encore l'oligonucléotide à double structure tige- boucle décrit dans [5, 6], EXPOSÉ DE L'INVENTION
La présente invention permet de résoudre des problèmes techniques et inconvénients précédemment listés. En effet, les inventeurs ont proposé un nouvel outil oligonucléotidique notamment utile dans un procédé de détection et éventuellement de quantification d'un analyte, qui permet de profiter des avantages de l'amplification LAMP à deux amorces, à savoir méthode isotherme, quantifiable et ne nécessitant que deux amorces.
L'outil oligonucléotidique objet de la présente invention est un oligonucléotide linéaire qui se distingue clairement des oligonucléotides à double structure tige-boucle décrits dans [5, 6]. En effet, la séquence de l'oligonucléotide selon l'invention mise en œuvre est modifiée pour devenir plus courte, idéalement inférieure à 100 bases. Cela permet notamment d'envisager une synthèse chimique plus simple, plus efficace avec un rendement important et une purification plus facile et plus économe.
Plus particulièrement, les portions Fie et B1 telles que définies dans les oligonucléotides à double structure tige-boucle décrits dans [5, 6] ont été supprimées dans l'oligonucléotide selon l'invention empêchant ainsi toute hybridation et donc la formation de structures tige-boucle. Cet oligonucléotide comprenant les portions F2, Fl, Blc et B2c peut alors être modifié en ajoutant une entité spécifique de l'analyte à détecter ou utilisable pour cette détection à divers endroits de la séquence, notamment en 5' ou 3' mais aussi entre F2 et Fl, entre Fl et Blc ou entre Blc et B2c.
En d'autres termes, l'oligonucléotide linéaire selon l'invention ne comprend ni une portion (Fie) dont la séquence nucléotidique est complémentaire à la séquence nucléotidique de la portion Fl, ni une portion (Bl) dont la séquence nucléotidique est complémentaire à la séquence nucléotidique de la portion Blc, lesdites portions Fl et Blc étant présentes dans cet oligonucléotide. Les températures de fusion (Tm) de Fl-Flc et Bl-Blc sont telles que définies plus tard dans la présente.
Ainsi, il est facile de préparer l'oligonucléotide selon l'invention à partir de la séquence de toutes amorces FIP (pour « Forward Inner Primer ») et BIP (pour « Backward Inner Primer ») décrites dans l'art antérieur. En effet, l'oligonucléotide objet de l'invention comprend une portion F2 également présente dans l'amorce FIP, une portion Fl dont la séquence nucléotidique est complémentaire à la séquence nucléotidique de la portion Fie présente dans l'amorce FIP, une portion Blc également présente dans l'amorce BIP et une portion B2c dont la séquence nucléotidique est complémentaire à la séquence nucléotidique de la portion B2 présente dans l'amorce BIP.
Dans le cadre de la présente invention, deux séquences nucléotidiques sont complémentaires l'une de l'autre, lorsqu'un nombre suffisant de nucléotides de la première séquence nucléotidique peut se lier, au moyen de liaisons hydrogène, avec les nucléotides correspondants de la deuxième séquence nucléotidique de telle sorte que l'appariement entre les deux séquences nucléotidiques peut se produire. La « complémentarité », telle qu'utilisée ici, se réfère à la capacité d'appariement entre les nucléotides d'une première séquence nucléotidique et d'une seconde séquence nucléotidique. Des nucléotides non complémentaires entre deux séquences nucléotidiques peuvent être tolérés à condition que les deux séquences nucléotidiques restent capables de s'hybrider spécifiquement l'une à l'autre. De plus, une première séquence nucléotidique peut s'hybrider sur un ou plusieurs segments d'une seconde séquence nucléotidique de telle sorte que les segments intermédiaires ou adjacents ne sont pas impliqués dans l'hybridation. Dans certaines formes de mise en œuvre de l'invention, une première séquence nucléotidique ou une partie spécifique de celle-ci, est au moins 70%, 80%, 85%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% ou 100% complémentaire à une deuxième séquence nucléotidique ou une partie spécifiée de celle-ci.
De manière surprenante et contrairement à ce que l'homme du métier pourrait penser, la mise en contact de l'oligonucléotide linéaire selon l'invention avec les deux amorces FIP de séquence 5'-Flc-F2-3' et BIP de séquence 5'-Blc-B2-3', classiquement utilisées dans les amplifications LAMP à deux amorces donne bien lieu à une amplification exponentielle, comme décrit dans la partie expérimentale ci-après.
L'oligonucléotide linéaire, objet de la présente invention répond à la formule (I) suivante :
Sa-F2-Sb-Fl-lnt-Blc-Sc-B2c-Sd (I) dans laquelle
Sa représente l'extrémité 5' de la portion F2 ou une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, la portion F2 comprend de 8 à 30 nucléotides,
Sb séparant la portion F2 et la portion Fl est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, la portion Fl comprend de 10 à 35 nucléotides,
Int séparant la portion Fl et la portion Blc est choisi dans le groupe constitué par une liaison covalente, une portion comprenant au moins un nucléotide et une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, la portion Blc comprend de 10 à 35 nucléotides,
Sc séparant la portion Blc et la portion B2c est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, la portion B2c comprend de 8 à 35 nucléotides, et
Sd représente l'extrémité 3' de la portion B2c ou une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, à condition qu'au moins un parmi Sa, Sb, Int, Sc et Sd comprenne une structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt.
L'oligonucléotide linéaire selon l'invention peut comprendre deux, trois, quatre ou cinq structures ou portions comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt. Avantageusement, l'oligonucléotide linéaire selon l'invention comprend une seule structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt.
En d'autres termes, l'oligonucléotide linéaire selon l'invention répond à l'une quelconque des formules (II), (III), (IV), (V) et (VI) suivantes :
Sa'-F2-Fl-lnt'-Blc-B2c (II)
F2-Sb'-Fl-lnt'-Blc-B2c (III)
F2-Fl-lnt"-Blc-B2c (IV)
F2-Fl-lnt'-Blc-Sc'-B2c (V) et
F2-Fl-lnt'-Blc-B2c-Sd' (VI) dans lesquelles les portions F2, Fl, Blc et B2c sont telles que précédemment définies,
Int' séparant la portion Fl et la portion Blc est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins un nucléotide, et
Sa', Sb', Int'', Sc' et Sd' représentent une structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt.
Dans un mode de réalisation plus particulier, l'oligonucléotide linéaire selon l'invention répond à la formule (II) ou (VI) suivante :
Sa'-F2-Fl-lnt'-Blc-B2c (II)
F2-Fl-lnt'-Blc-B2c-Sd' (VI) dans lesquelles les portions F2, Fl, Blc et B2c sont telles que précédemment définies,
Int' séparant la portion Fl et la portion Blc est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins un nucléotide, et
Sa' et Sd' représentent une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt. Dans l'oligonucléotide linéaire selon l'invention, la portion F2 peut comprendre de 10 à 27 nucléotides et, à titre d'exemple particulier, 21 ou 24 nucléotides.
Dans l'oligonucléotide linéaire selon l'invention, la portion Fl peut comprendre de 15 à 25 nucléotides et, à titre d'exemples particuliers, 19, 20, 21 ou 22 nucléotides. Par ailleurs, la portion Fl présente une séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique de la portion Fie présente dans l'amorce FIP utilisée lors de l'amplification LAMP à deux amorces. La température de fusion (Tm) de Fl-Flc est typiquement supérieure à la température utilisée lors de l'amplification (typiquement entre 55°C et 65°C). La Tm de Fl-Flc est supérieure à la température utilisée lors de l'amplification avantageusement d'au moins 5°C, notamment d'au moins 7°C et, en particulier, d'au moins 10°C. L'homme du métier pourra trouver des informations additionnelles quant à ces portions dans [1],
Dans l'oligonucléotide linéaire selon l'invention, la portion Blc peut comprendre de 17 à 27 nucléotides et, à titre d'exemples particuliers, 18 ou 25 nucléotides. Par ailleurs, la portion Blc présente une séquence nucléotidique complémentaire à la séquence nucléotidique de la portion B1 présente dans l'amorce BIP utilisée lors de l'amplification LAMP à deux amorces. La température de fusion (Tm) de Bl-Blc est notamment supérieure à la température utilisée lors de l'amplification. La Tm de Bl-Blc est supérieure à la température utilisée lors de l'amplification avantageusement d'au moins 5°C, notamment d'au moins 7°C et, en particulier, d'au moins 10°C. L'homme du métier pourra trouver des informations additionnelles quant à ces portions dans [1],
Dans l'oligonucléotide linéaire selon l'invention, la portion B2c peut comprendre de 15 à 30 nucléotides et, à titre d'exemples particuliers, 18 ou 22 nucléotides.
Dans l'oligonucléotide linéaire selon la présente invention, lorsque Int ou Int' représente une portion comprenant au moins un nucléotide, cette dernière peut comprendre jusqu'à 3 nucléotides, 10 nucléotides, 30 nucléotides, 50 nucléotides et voire 70 nucléotides et ne comprend aucune structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt. Avantageusement, l'oligonucléotide linéaire selon l'invention comprend moins de 180 nucléotides, notamment moins de 160 nucléotides, en particulier moins de 150 nucléotides, plus particulièrement moins de 140 nucléotides et tout particulièrement moins de 130 nucléotides.
Dans certains modes de réalisation, l'oligonucléotide linéaire selon l'invention peut comprendre moins de 130 nucléotides, notamment moins de 120 nucléotides, en particulier moins de 110 nucléotides, plus particulièrement moins de 100 nucléotides et tout particulièrement moins de 90 nucléotides, notamment lorsque la ou les structures ou portions comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt ne présente(nt) aucun nucléotide.
Avec une telle taille, la synthèse chimique de cet oligonucléotide est facilitée et le coût de cette synthèse et, par conséquent, le coût du procédé selon l'invention sont moindres.
La structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' dans l'oligonucléotide selon l'invention peut ne comprendre qu'une entité E telle que précédemment définie. Dans cette première variante, la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' consiste en une entité E. En d'autres termes, cette entité E est liée :
- via une liaison covalente, à l'extrémité 5' de la portion F2, ou
- via une liaison covalente, à l'extrémité 3' de la portion B2c, ou
- soit via une première liaison covalente à l'extrémité 3' de F2 et via une seconde liaison covalente à l'extrémité 5' de Fl, ou
- soit via une première liaison covalente à l'extrémité 3' de Fl et via une seconde liaison covalente à l'extrémité 5' de Blc, ou
- soit via une première liaison covalente à l'extrémité 3' de Blc et via une seconde liaison covalente à l'extrémité 5' de B2c.
Dans une deuxième variante, la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' dans l'oligonucléotide selon l'invention peut comprendre, en plus d'une entité E telle que précédemment définie, au moins un autre élément permettant de lier l'entité E à l'extrémité 5' de la portion F2, à l'extrémité 3' de la portion F2, à l'extrémité 3' de la portion Fl, à l'extrémité 5' de la portion Fl, à l'extrémité 5' de la portion Blc, à l'extrémité 3' de la portion Blc, à l'extrémité 5' de la portion B2c et/ou à l'extrémité 3' de la portion B2c. Cet élément additionnel est connu sous l'expression « bras de liaison » et sert à améliorer l'accessibilité de l'entité E. L'homme du métier connaît différents exemples de tels éléments utilisables dans le cadre de la présente invention [5, 6], A titre d'exemples, on peut citer une molécule nucléotidique telle que précédemment définie et notamment une séquence comprenant plusieurs bases thymine et notamment 10 bases thymine, un polymère comme, par exemple, un poly-éthylène glycol (PEG) ou une structure moléculaire streptavidine-biotine. Ces deux derniers exemples (polymère et structure moléculaire) sont notamment plus adaptés aux structures Sa, Sd, Sa' et Sd' dans l'oligonucléotide selon l'invention. Les liaisons mises en œuvre dans cette variante sont des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals et/ou des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes.
Dans une troisième variante, la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' dans l'oligonucléotide selon l'invention peut comprendre plusieurs entités E telles que précédemment définies, identiques ou différentes. Dans cette variante, deux entités E successives peuvent éventuellement être séparées par un bras de liaison. De même, ces entités peuvent éventuellement être liées à l'extrémité 5' ou 3' de la portion adjacente via un bras de liaison. Enfin, lorsque la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' présente plusieurs bras de liaison, ces derniers peuvent être identiques ou différents.
Dans un premier mode de réalisation, la ou les entités E présente(s) au niveau de la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' dans l'oligonucléotide selon l'invention sont aptes à se lier directement à au moins un analyte d'intérêt. Une entité E selon ce mode de réalisation peut également être désignée, dans la présente, par l'expression « entité de reconnaissance ».
Cette entité peut être toute molécule capable de former avec l'analyte à détecter une paire d'éléments formant une liaison, également désignée par l'expression « paire de liaison » ou, en anglais, « binding pair ». L'entité E et l'analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison analyte-entité sont avantageusement des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals et/ou des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes. Des liaisons non covalentes et de faible énergie seront notamment mises en œuvre lorsque l'entité E se trouve dans l'une quelconque des portions ou structures précitées et, en particulier, dans la portion Sb, Sb', Int, Int'', Sc ou Sc'. Des liaisons de forte énergie pourront être mises en œuvre dans les structures Sa, Sa', Sd et Sd'. En effet, dans ces structures, des liaisons de forte énergie n'affecteront pas l'amplification LAMP.
La ou les entités de reconnaissance utilisées sont donc dépendantes du ou des analytes à détecter. En fonction de ce ou des derniers, l'homme du métier saura, sans effort inventif, choisir la ou les entités les plus adaptées. Une entité de reconnaissance peut être choisie, par exemple, dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide tel qu'un peptide antimicrobien ou un MIP pour « MHC class I peptide » i.e. un peptide associé au CMH-1 (pour « Complexe Majeur d'Histocompatibilité-1 ») ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Region ») ; une molécule nucléotidique ; et un aptamère.
A noter qu'une entité formant une paire de liaisons avec un analyte d'intérêt se présente avantageusement sous forme d'une séquence nucléotidique, lorsque cette entité est comprise dans la portion Sb, Sb', Int, Int'', Sc ou Sc'.
L'expression « molécule nucléotidique » utilisée dans la présente est équivalente aux termes et expressions suivants : « acide nucléique », « polynucléotide », « séquence nucléotidique », « séquence polynucléotidique » et « séquence oligonucléotidique ». Par « molécule nucléotidique », on entend, dans le cadre de la présente invention, un chromosome ; un gène ; un polynucléotide régulateur ; un ADN, simple-brin ou double-brin, génomique, chromosomique, chloroplastique, plasmidique, mitochondrial, recombinant ou complémentaire ; un ARN total ; un ARN messager ; un ARN ribosomal (ou ribozyme) ; un ARN de transfert ; un micro-ARN ; un petit ARN interfèrent ; une séquence faisant office d'aptamère ; un acide nucléique peptidique ; un acide nucléique verrouillé (ou LNA pour « Locked Nucleic Acid ») ; un morpholino ; une portion ou un fragment de ceux-ci.
Dans un second mode de réalisation notamment illustré dans la partie expérimentale ci-après, la ou les entités E présentes au niveau de la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int”, Sc' ou Sd' sont aptes à se lier indirectement à un ou des analytes d'intérêt. Ce second mode de réalisation s'applique en particulier au cas où la ou les entités E sont présentes au niveau de la structure Sa, Sd, Sa' ou Sd'. En d'autres termes, cette ou ces entités E sont indépendantes du ou des analytes d'intérêt à détecter et cette détection nécessite l'utilisation d'un intermédiaire de liaison apte à se lier, d'une part, à l'oligonucléotide selon ce second mode de réalisation de l'invention et, d'autre part, à ou aux analytes d'intérêt. Ce partenaire de liaison correspond à une molécule comprenant une première portion PI apte à se lier à une entité E présente dans la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int”, Sc' ou Sd' de l'oligonucléotide et notamment dans la structure Sa, Sd, Sa' ou Sd' et une seconde portion P2 apte à se lier à au moins un analyte d'intérêt. La portion P2 de cette molécule correspond à une entité de reconnaissance telle que définie précédemment ou comprend plusieurs entités de reconnaissance telles que définies précédemment, identiques ou différentes. Ainsi, tout ce qui a été décrit ci-dessus pour l'entité ou les entités de reconnaissance s'applique mutatis mutandis à la portion P2. Dans ce partenaire de liaison, la portion PI et la portion P2 sont couplées l'une à l'autre au moyen d'une liaison covalente. En variante, la portion PI et la portion P2 peuvent être couplées l'une à l'autre au moyen d'un bras de liaison tel que précédemment défini.
Une entité E de ce second mode de réalisation peut être toute molécule capable de former une paire de liaison avec la portion PI du partenaire de liaison, l'entité E et la portion PI correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison entité-portion PI sont des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals. La présente invention concerne un complexe non-covalent, formé par un oligonucléotide selon le second mode de réalisation et une molécule comprenant une première portion PI apte à se lier à ladite au moins une entité E dudit oligonucléotide et une seconde portion P2 apte à se lier à au moins un analyte d'intérêt. En d'autres termes, ce complexe non-covalent est formé par un oligonucléotide linéaire dont la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' et notamment la structure Sa, Sd, Sa' ou Sd' comprend au moins une entité E apte à se lier indirectement à au moins un analyte d'intérêt tel que précédemment défini et une molécule comprenant une première portion PI apte à se lier à cette au moins une entité E présente dans la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' et notamment la structure Sa, Sd, Sa' ou Sd' et une seconde portion P2 apte à se lier à au moins un analyte d'intérêt. Un tel complexe peut être désigné par l'expression « complexe de liaison ».
La présente invention concerne également l'utilisation d'un oligonucléotide linéaire tel que précédemment défini ou un complexe de liaison tel que précédemment défini pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide.
Cette utilisation met plus particulièrement en œuvre une amplification LAMP à deux amorces, l'une, généralement désignée « amorce FIP », de formule 5'-Flc- F2-3' et l'autre, généralement désignée « amorce BIP », de formule 5'-Blc-B2-3'.
Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes : i) mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ; ii) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant soit au moins un oligonucléotide linéaire dont la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int”, Sc' ou Sd' comprend une entité E apte à se lier directement à au moins un analyte d'intérêt tel que précédemment défini, soit un complexe de liaison tel que précédemment défini, ledit oligonucléotide et ledit complexe ayant été préparés préalablement à ladite mise en contact ; iii) éliminer l'excès d'oligonucléotides ou l'excès de complexes de liaison n'ayant pas réagi lors de la mise en contact de l'étape ii) ; iv) mettre en contact, avec deux amorces d'amplification isotherme médiée par des boucles dans des conditions permettant l'amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l'oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison tel que précédemment défini, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ; v) détecter et éventuellement quantifier le produit de l'amplification dudit oligonucléotide (moyennant quoi ledit au moins un analyte est détecté et éventuellement quantifié).
Dans un autre mode de réalisation particulier, la présente invention concerne un procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes : i') mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ; iii') mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins une molécule comprenant une première portion PI apte à se lier à l'entité E présente dans la structure de l'oligonucléotide selon la présente invention et une seconde portion P2 apte à se lier audit au moins un analyte d'intérêt ;
Ü2') éliminer l'excès de molécules n'ayant pas réagi lors de la mise en contact de l'étape iii') ;
Ü3') mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire dont la structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int”, Sc' ou Sd' comprend une entité E apte à se lier indirectement audit analyte d'intérêt tel que précédemment défini, ledit oligonucléotide ayant été synthétisé préalablement à ladite mise en contact ; iii') éliminer l'excès d'oligonucléotides n'ayant pas réagi lors de la mise en contact de l'étape iis') ; iv') mettre en contact, avec deux amorces d'amplification isotherme médiée par des boucles dans des conditions permettant l'amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l'oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison tel que précédemment défini, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ; v') détecter et éventuellement quantifier le produit de l'amplification dudit oligonucléotide (moyennant quoi ledit au moins un analyte est détecté et éventuellement quantifié).
L'échantillon liquide mis en œuvre dans le cadre de la présente invention est un liquide susceptible de contenir un ou des analytes à détecter et éventuellement à quantifier. Il peut être de nature et d'origine très variées.
Cet échantillon liquide est avantageusement choisi dans le groupe constitué par un fluide biologique ; un fluide végétal tel que sève, nectar et exsudât racinaire ; un prélèvement dans un milieu de culture ou dans un réacteur de culture biologique comme une culture cellulaire d'eucaryotes supérieurs, de levures, de champignons, d'algues ou de bactéries ; un liquide obtenu à partir d'une (ou plusieurs) cellule(s) animale(s) ou végétale(s) ; un liquide obtenu à partir d'un tissu animal ou végétal ; un prélèvement dans une matrice alimentaire ; un prélèvement dans un réacteur chimique ; de l'eau de ville, de rivière, de mer, de piscines, de tours aéro-réfrigérées ou d'origine souterraine; un prélèvement à partir d'un effluent industriel liquide ; de l'eau usée provenant notamment d'élevages intensifs ou d'industries du domaine chimique, pharmaceutique ou cosmétique ; un prélèvement provenant d'une filtration d'air ou d'un revêtement ; un prélèvement sur un objet tel qu'un fragment de tissu, un habit, une semelle, une chaussure, un outil ou une arme ; un produit pharmaceutique ; un produit cosmétique ; un parfum ; un échantillon de terre ou un de leurs mélanges. Dans le cadre de la présente invention, on entend par « prélèvement » tout type de collecte d'échantillons, par exemple, par contact, raclage, forage, découpage, poinçonnage, broyage, lavage, rinçage, aspiration ou pompage.
Le fluide biologique est avantageusement choisi dans le groupe constitué par le sang tel que du sang entier ou du sang entier anti-coagulé, le sérum sanguin, le plasma sanguin, la lymphe, la salive, le crachat, les larmes, la sueur, le sperme, l'urine, les selles, le lait, le liquide céphalo-rachidien, le liquide interstitiel, un fluide isolé de moelle osseuse, un mucus ou fluide du tractus respiratoire, intestinal ou génito- urinaire, des extraits cellulaires, des extraits de tissus et des extraits d'organes. Ainsi, le fluide biologique peut être tout fluide naturellement sécrété ou excrété d'un corps humain ou animal ou tout fluide récupéré, à partir d'un corps humain ou animal, par toute technique connue de l'homme du métier telle qu'une extraction, un prélèvement ou un lavage. Les étapes de récupération et d'isolement de ces différents fluides à partir du corps humain ou animal sont réalisées préalablement à la mise en œuvre du procédé selon l'invention.
De même, si un des prélèvements envisagés ne permet pas de mettre en œuvre le procédé de l'invention, par exemple du fait de sa nature gazeuse ou solide, de sa concentration ou des éléments qu'il contient tels que résidus solides, déchets, suspension ou molécules interfé rentes, le procédé de l'invention comprend en outre une étape préalable de préparation de l'échantillon liquide avec éventuellement une mise en solution du prélèvement par les techniques connues de l'homme du métier telles que filtration, précipitation, dilution, distillation, mélange, concentration, lyse, etc.
Par ailleurs, il est possible d'ajouter, à l'échantillon liquide, des quantités connues d'au moins un analyte à détecter. On parle alors d'échantillon liquide dopé par au moins un analyte, ce dopage permettant d'avoir un contrôle positif notamment lorsque l'échantillon liquide est complexe et éventuellement d'obtenir une quantification du ou des analytes à détecter initialement contenus dans l'échantillon liquide.
Un analyte à détecter et éventuellement à quantifier dans l'échantillon liquide peut être choisi dans le groupe constitué par une molécule d'intérêt environnemental tel qu'un pesticide ; une molécule d'intérêt biologique ; une molécule d'intérêt pharmacologique ; une toxine ; un glucide tel que du glucose ; un lipide tel que du cholestérol ; un peptide ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur nucléaire ou membranaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur nucléaire ou membranaire ; une hormone ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Region ») ; une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; des ions tels que des ions mercure ou des ions plomb ; une cellule eucaryote ; une cellule procaryote et un virus.
A noter que, dans certaines formes de mise en œuvre, un analyte à détecter et éventuellement à quantifier dans l'échantillon liquide peut être défini comme une petite molécule i.e. une molécule dont le poids moléculaire est inférieur ou égal à 10000 daltons et notamment inférieur ou égal à 8000 daltons. Cette petite molécule peut appartenir à l'un quelconque des éléments des listes d'analytes ci-dessus.
L'étape i) ou i') du procédé selon la présente invention met en œuvre une sonde apte à lier ledit au moins un analyte immobilisée sur la surface d'un support solide. La sonde utilisée pour fonctionnaliser une zone active de la surface du support solide est toute molécule capable de former avec un analyte à détecter une paire de liaisons, la sonde et l'analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaisons. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison analyte-sonde sont avantageusement soit des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals, soit des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes.
La sonde utilisée est donc dépendante d'un analyte à détecter. En fonction de cet analyte, l'homme du métier saura, sans effort inventif, choisir la sonde la plus adaptée. Elle peut être choisie, par exemple, dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide tel qu'un peptide antimicrobien ou un MIP i.e. un peptide associé au CMH-1 (pour « Complexe Majeur d'Histocompatibilté-1 ») ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, Ffab' , Fv ou un domaine hypervariable ; une molécule nucléotidique telle que précédemment définie ; et un aptamère.
Il est évident que, lors du choix de la sonde la mieux adaptée, il convient de tenir compte de l'entité de reconnaissance mise en œuvre ultérieurement. La sonde et l'entité de reconnaissance peuvent reconnaître des zones ou éléments distincts au niveau de l'analyte à détecter. En variante, la sonde et l'entité de reconnaissance peuvent cibler le même élément au niveau de l'analyte à détecter. Cette variante correspond notamment au cas où l'analyte à détecter est une bactérie ou un virus et l'élément à cibler un élément de surface présent au niveau de plusieurs zones de surface bactérienne ou virale.
Tout support solide permettant de mettre en œuvre la présente invention est utilisable. Il peut s'agir, par exemple, d'un support de biopuce tel que ceux classiquement utilisés en silicium, en verre, en métal, en polymère ou en plastique. Ce support solide peut également consister en des particules et notamment des particules de silice, des particules polymériques et/ou des particules magnétisables.
La fonctionnalisation de la zone active de la surface du support solide par une sonde telle que précédemment définie peut être effectuée par toute technique adaptée permettant la fixation d'un composé sur un support solide. On peut en particulier envisager une simple adsorption, des liaisons ioniques, des liaisons hydrogène, des interactions électrostatiques, des interactions hydrophobes, des liaisons de Van der Waals ou un greffage covalent.
Dans une forme de mise en œuvre particulière de la présente invention, la surface du support solide présente des groupements fonctionnels grâce auxquels la ou les sondes sont capables de s'immobiliser. De façon avantageuse, ces groupements fonctionnels sont choisis parmi les groupements carboxyliques, des entités radicalaires, les fonctions alcools, amines, amides, époxy ou thiols. Ces groupements sont portés, de façon intrinsèque ou par fonctionnalisation, par la zone active de la surface du support solide. La (ou les) sonde(s) peuvent également présenter de tels groupements fonctionnels, de façon intrinsèque ou par fonctionnalisation. Dans une première variante de la présente invention, la ou les sondes peuvent être immobilisées de façon directe au niveau de la surface fonctionnalisée ou non. Un support solide « coaté » avec une protéine telle que la streptavidine est un exemple d'immobilisation directe, dans lequel la sonde doit être fonctionnalisée par une biotine.
Dans une seconde variante de la présente invention, la ou les sondes peuvent être immobilisées de façon indirecte au niveau de la surface fonctionnalisée ou non. Cette immobilisation indirecte fait intervenir un bras espaceur (ou agent de jonction) lié, d'une part, à la surface et, d'autre part, à une sonde. Un tel bras espaceur est notamment utilisé pour améliorer l'accessibilité à la sonde. A titre d'exemples illustratifs, on peut citer les réactifs silanes mis en œuvre pour le greffage de sondes sur du verre, la complexation de produits thiolés sur des surfaces d'or et l'immobilisation de sondes dans des matrices polymères. De plus, lorsque la ou les sondes sont une ou des molécules nucléotidiques telles que précédemment définies, un tel bras espaceur peut se présenter sous forme d'une séquence comprenant plusieurs bases thymine et notamment 10 bases thymine.
Les liaisons mises en œuvre au cours d'une immobilisation directe ou indirecte peuvent être toutes liaisons connues de l'homme du métier et notamment des liaisons covalentes, des liaisons ioniques, des liaisons hydrogène, des interactions électrostatiques, des interactions hydrophobes, des liaisons de Van der Waals ou une adsorption.
Avantageusement, une étape de blocage de la surface peut être mise en œuvre préalablement à la fixation de la sonde et/ou suite à cette fixation. La solution de blocage mise en œuvre lors de cette étape de blocage peut comporter un ou plusieurs des composants suivants : albumine comme de la BSA (pour « Bovine Serum Albumin »), ADN génomique comme de l'ADN simple brin et notamment de l'ADN simple brin de sperme de saumon, gélatine, caséine, protéines de lait, sérum, polyéthylène glycol et polymères du type polyvinylpyrrolidone. Un exemple particulier de solution de blocage est une solution contenant de 1% à 5% de BSA et éventuellement 20 pg/mL d'ADN simple brin de sperme de saumon. L'étape i) ou i') du procédé selon l'invention consiste à mettre en contact l'échantillon liquide tel que précédemment défini avec la surface d'un support solide fonctionnalisée par une ou plusieurs sondes aptes à lier l'analyte à détecter moyennant quoi, si l'échantillon liquide contient cet analyte, ce dernier est capturé au niveau de la ou des sondes.
Typiquement, l'étape i) ou i') de mise en contact peut durer entre 1 min et 24 h, entre 2 min et 12 h, entre 5 min et 6 h, entre 10 min et 3 h, entre 15 min et 2 h, entre 20 min et 1 h et, notamment, de l'ordre de 30 min (i.e. 30 min ± 5 min). Par ailleurs, l'étape i) de mise en contact peut être réalisée à une température comprise entre 4°C et 70°C, notamment entre 10°C et 60°C, en particulier entre 15 et 45°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) ou à température physiologique (i.e. 37°C ± 5°C).
Suite à l'étape i) ou i') et préalablement à l'étape ii) ou iii') du procédé selon la présente invention, il est possible d'éliminer les éléments présents dans l'échantillon liquide et qui n'ont pas été capturés par la ou les sondes. Toute technique permettant une telle élimination est utilisable dans le cadre de la présente invention. A titre d'exemple, on peut citer le lavage de la surface du support solide ou la séparation de l'échantillon liquide et du support solide comme une séparation physique ou magnétique. Toutefois, cette étape d'élimination est optionnelle puisque ces éléments pourront être éliminés par la suite et notamment lors de l'une quelconque des étapes iii), Ü2') ou iii').
Lorsque cette étape d'élimination est mise en œuvre, la surface du support solide peut être soumise à au moins un rinçage de façon à éliminer toute trace de l'échantillon liquide. Ce rinçage est typiquement effectué avec une solution aqueuse de rinçage conservant l'interaction sonde/analyte ou liant irréversiblement l'analyte et la sonde. Cette solution peut également permettre d'éliminer les interactions non spécifiques. Elle peut comporter un ou plusieurs des composants suivants : un tampon comme un tampon Tris, phosphate, acétate ou borate ; des sels comme KCI, NaCI, (NF hSC , MgC ou CaC ; des détergents ou agents tensioactifs comme Tween®, Triton® ou dodécylsulfate de sodium (ou SDS) ; des agents dénaturants comme formamide ou diméthylsulfoxyde ; un solvant organique comme éthanol, méthanol ou acétonitrile ; et des agents pontants comme formaldéhyde ou glutaraldéhyde. Ce rinçage peut être répété deux fois, trois fois, cinq fois, 10 fois et voire 50 fois en utilisant, à chaque rinçage, une solution de rinçage identique ou différente. Typiquement, le rinçage est répété trois fois avec une solution comprenant (i) du tampon phosphate salin (ou PBS) et 0,1% de Tween® comme du Tween®20, (ii) du PBS, 0,3% de Tween® comme du Tween®20 et 1 M de NaCI ou (iii) une solution saline contenant 0,02 M de PBS, 1,074 M de NaCI et 0,3% de Tween® comme du Tween®20.
De plus, lorsque cette étape optionnelle d'élimination est mise en œuvre, elle est réalisée à une température comprise entre 4°C et 100°C, notamment entre 10°C et 60°C, en particulier entre 15°C et 45°C et, plus particulièrement, à température ambiante ou à température physiologique.
L'étape ii) du procédé selon la présente invention consiste à mettre en contact la surface du support solide sur laquelle un analyte à détecter est éventuellement retenu via la ou les sondes fonctionnalisant cette surface avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire, capable de se lier audit analyte ou au moins un complexe de liaison tel que précédemment défini, moyennant quoi, si cet analyte est présent à la surface du support solide, l'oligonucléotide ou le complexe de liaison se lie à ce dernier respectivement via son entité de reconnaissance ou sa portion P2. En d'autres termes, l'oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison est capable de former avec l'analyte à détecter une paire de liaison, l'oligonucléotide ou le complexe de liaison et l'analyte correspondant aux deux partenaires de cette paire de liaison. Les liaisons mises en œuvre dans la liaison oligonucléotide-analyte ou dans la liaison complexe-analyte sont avantageusement des liaisons non covalentes et de faible énergie telles que des liaisons hydrogène ou des liaisons de Van der Waals et/ou des liaisons de forte énergie de type liaisons covalentes.
L'oligonucléotide selon l'invention a été synthétisé préalablement à la mise en contact de l'étape ii) ou iis'). En d'autres termes, cette synthèse n'est effectuée ni en présence de la surface du support solide fonctionnalisée par la ou les sondes telles que précédemment définies, ni en présence de l'analyte à détecter. Avantageusement, cette synthèse est une synthèse chimique classiquement utilisée pour préparer des oligonucléotides.
Lors de l'étape ii) du procédé selon la présente invention, la surface du support solide sur laquelle est éventuellement maintenu au moins un analyte au moyen d'une sonde est mise en contact avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire tel que précédemment défini ou un complexe de liaison tel que précédemment défini. Cette solution est avantageusement une solution aqueuse permettant l'interaction haltère ou complexe/analyte. Elle peut comporter un ou plusieurs des composants suivants : un tampon comme un tampon Tris, phosphate, acétate ou borate ; des sels comme KCI, NaCI, (NF hSC , MgC ou CaC ; des détergents ou agents tensioactifs comme Tween®, Triton® ou dodécylsulfate de sodium (ou SDS) ; des agents dénaturants comme formamide ou diméthylsulfoxyde ; un solvant organique comme éthanol, méthanol ou acétonitrile ; et des agents pontants comme formaldéhyde ou glutaraldéhyde. Avantageusement, lorsque l'oligonucléotide comprend une séquence aptamère pour la reconnaissance de l'analyte, la solution utilisée sera composée des éléments en totalité ou en partie constituant le tampon de sélection de l'aptamère. La solution utilisée lors de l'étape ii) peut, en outre, comprendre un ou plusieurs éléments choisis parmi un ADN génomique comme de l'ADN simple brin et notamment de l'ADN simple brin de sperme de saumon, du sérum, de l'albumine, un polymère de synthèse, un agent bloquant comme l'agent bloquant Denhardt et tout autre élément permettant de limiter l'adsorption non spécifique. Un exemple particulier de solution mise en œuvre lors de l'étape ii) est une solution saline contenant 0,02 M de PBS, 1,074 M de NaCI, 0,3% de détergent Tween20, 20 pg/mL d'ADN de sperme de saumon ainsi que 4% d'agent bloquant Denhardt.
Par ailleurs, l'oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison est présent dans cette solution en une quantité comprise entre 1 aM et 1 mM, et notamment entre 100 aM et 1 pM. A titre d'exemples particuliers de concentrations utilisables, on peut citer une concentration de 10 pM, de 100 pM, de 1 nM, ou de 10 nM. Avantageusement, l'oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison est présent dans la solution mise en œuvre lors de l'étape ii) à une concentration de 100 pM. Typiquement, l'étape ii) de mise en contact peut durer entre 1 min et 24 h, notamment entre 2 min et 12 h et, en particulier, entre 5 min et 6 h. Dans une forme de mise en œuvre particulière, cette mise en contact peut durer entre 10 min et 3 h, entre 15 min et 2 h, entre 20 min et 1 h et, notamment, de l'ordre de 30 min (i.e. 30 min ± 5 min). Dans une autre forme de mise en œuvre, cette mise en œuvre peut durer entre 30 min et 6 h, entre 1 h et 5 h, entre 2 h et 4 h et, notamment, de l'ordre de 3 h (i.e. 3 h ± 15 min). De même, l'étape (ii) de mise en contact peut être réalisée à une température comprise entre 4°C et 100°C, notamment entre 10°C et 60°C, en particulier entre 15 et 30°C et, plus particulièrement, à température ambiante (i.e. 23°C ± 5°C) ou à température physiologique (i.e. 37°C ± 5°C).
Préalablement à cette mise en contact, il est possible de chauffer l'oligonucléotide selon l'invention à une température supérieure à 80°C et notamment de l'ordre de 90°C (i.e. 90°C ± 5°C) pendant 5 min puis de le refroidir jusqu'à la température ambiante en environ 35 min (35 min ± 10 min). Cette étape préalable permet, notamment lorsque l'entité de reconnaissance est un aptamère, de donner à ce dernier une conformation optimale pour la détection de l'analyte.
Tout ce qui a été décrit ci-dessus pour l'étape ii) (nature de la solution, durée et température) s'applique aux étapes iii') et iis'). De plus, la molécule comprenant une première portion PI et une seconde portion P2 telle que précédemment définie et l'oligonucléotide linéaire est présent(e) dans la solution lors de la mise en contact respectivement à l'étape iii') et à l'étape iis') en une quantité comprise entre 1 aM et 1 mM, et notamment entre 100 aM et 1 pM. A titre d'exemples particuliers de concentrations utilisables, on peut citer une concentration de 10 pM, de 100 pM, de 1 nM, ou de 10 nM.
Suite à l'étape ii) ou iis') et préalablement à l'amplification LAMP ou suite à l'étape iii') et préalablement à l'étape iis'), il est nécessaire d'éliminer tous les éléments susceptibles de donner de faux positifs, comme, par exemple, des oligonucléotides linéaires ou des molécules à portions PI et P2 ou des complexes de liaison non spécifiquement liés à l'analyte à détecter ou liés à des éléments non liés aux sondes fonctionnalisant la surface du support solide. Il s'agit là de l'étape iiz'), iii) ou iii') du procédé selon la présente invention.
Toute technique permettant une telle élimination est utilisable dans le cadre de la présente invention. A titre d'exemple, on peut citer le lavage de la surface du support solide ou la séparation de la solution contenant des oligonucléotides linéaires ou des molécules à portions PI et P2 ou des complexes de liaison, du support solide comme une séparation physique ou magnétique.
Lorsque cette étape d'élimination est mise en œuvre, la surface du support solide peut être soumise à au moins un rinçage qui est typiquement effectué avec une solution de rinçage constituée d'une solution aqueuse : conservant l'interaction analyte/oligonucléotide ou liant irréversiblement l'analyte et l'oligonucléotide (cas de l'étape iii)) ;
- conservant l'interaction analyte/complexe de liaison ou liant irréversiblement l'analyte et le complexe de liaison (cas de l'étape iii) et de l'étape iii')) ou
- conservant l'interaction analyte/molécule à portions PI et P2 ou liant irréversiblement l'analyte et la molécule à portions PI et P2 (cas de l'étape Hz'))-
Cette solution de rinçage peut également permettre d'éliminer les interactions non spécifiques. Elle peut comporter un ou plusieurs des composants suivants : un tampon comme un tampon Tris, phosphate, acétate ou borate ; des sels comme KCI, NaCI, (NFUhSC , MgC ou CaC ; des détergents ou agents tensioactifs comme Tween®, Triton® ou dodécylsulfate de sodium (ou SDS) ; des agents dénaturants comme formamide ou diméthylsulfoxyde ; un solvant organique comme éthanol, méthanol ou acétonitrile ; et des agents pontants comme formaldéhyde ou glutaraldéhyde et un ou plusieurs élément(s) choisi(s) parmi un ADN génomique comme de l'ADN simple brin et notamment de l'ADN simple brin de sperme de saumon, du sérum, de l'albumine et un polymère de synthèse. Ce rinçage peut être répété deux fois, trois fois, cinq fois, 10 fois et voire 50 fois en utilisant, à chaque rinçage, une solution de rinçage identique ou différente. Typiquement, le rinçage est répété trois fois avec une solution comprenant du PBS et 0,1% de Tween®. En variante, le rinçage est répété trois fois avec une solution saline contenant 0,02 M de PBS, 1,074 M de NaCI et 0,3% de détergent Tween®20.
De plus, l'étape Hz'), iü) ou iii') est réalisée à une température comprise entre 4°C et 100°C, notamment entre 15°C et 80°C, en particulier entre 30°C et 60°C et, plus particulièrement, à température de l'ordre de 40°C (i.e. 40°C ± 5°C) ou à température physiologique.
L'étape iv) ou iv') du procédé selon l'invention est l'amplification LAMP à deux amorces à proprement parler. Les deux seules amorces mises en œuvre sont les amorces FIP et BIP telles que précédemment définies à savoir les amorces de séquences respectives 5'-Flc-F2-3' et 5'-Blc-B2-3'.
La température de fusion (Tm) de B2-B2c est notamment supérieure à la température utilisée lors de l'amplification. La Tm de B2-B2c est supérieure à la température utilisée lors de l'amplification avantageusement d'au moins 5°C, notamment d'au moins 7°C et, en particulier, d'au moins 10°C. L'homme du métier pourra trouver des informations additionnelles quant à ces portions dans [1],
La température de fusion (Tm) de F2-F2c est notamment supérieure à la température utilisée lors de l'amplification. La Tm de B2-B2c est supérieure à la température utilisée lors de l'amplification avantageusement d'au moins 5°C, notamment d'au moins 7°C et, en particulier, d'au moins 10°C. L'homme du métier pourra trouver des informations additionnelles quant à ces portions dans [1],
Il convient de noter que, dans l'étape iv) ou iv') du procédé selon la présente invention, l'analyte n'est pas utilisé comme une amorce de l'amplification LAMP.
Dans un mode de réalisation, l'étape iv) ou iv') du procédé selon la présente invention consiste à mettre en contact la surface sur laquelle est/sont immobilisée(s) une ou des sonde(s) spécifique(s) du ou des analytes à détecter avec un mélange réactionnel comprenant les amorces FIP et BIP et tout élément nécessaire à la production d'un produit d'amplification si l'oligonucléotide linéaire est présent.
Dans un autre mode de réalisation particulier, il est possible de mettre en œuvre l'étape iv) ou iv') après avoir remis en suspension l'oligonucléotide linéaire ou le complexe de liaison tel que précédemment défini. Dans ce mode de réalisation, il convient de soumettre, le support solide auquel l'oligonucléotide linéaire est indirectement lié via l'analyte d'intérêt et éventuellement une molécule à portions PI et P2, à un traitement comme un traitement thermique ou chimique et ce, de façon à séparer les partenaires de liaison que sont (i) l'oligonucléotide linéaire et l'analyte d'intérêt, (ii) l'oligonucléotide linéaire et la molécule à portions PI et P2, et/ou (iii) la molécule à portions PI et P2 et l'analyte d'intérêt. Sans effort inventif, l'homme du métier saura déterminer le traitement le mieux adapté en fonction des partenaires de liaison mis en œuvre. Ce mode de réalisation particulier permet, une fois l'oligonucléotide ou le complexe de liaison remis en suspension, d'éliminer la surface sur laquelle l'analyte a été fixé avant de réaliser la LAMP avec le seul surnageant.
Typiquement, le mélange réactionnel mis en œuvre lors de l'étape iv) ou iv') comprend un tampon approprié, comme, par exemple, un tampon phosphate ou un tampon Tris ; des désoxyribonucléosides (dNTP), comme, un mélange équimolaire de dATP, dCTP, dGTP et dTTP et une enzyme catalysant l'amplification LAMP. Une telle enzyme est une polymérase présentant une activité de déplacement de brin élevée en plus d'une activité de réplication. A titre d'exemples particuliers de telles enzymes, on peut utiliser l'une des enzymes listées ci-dessous :
- Bst DNA polymerase et ses variantes telles que, par exemple, Bst2.0 DNA polymerase et Bst3.0 DNA polymerase,
- Bsm DNA polymerase,
- Bca (exo-) DNA polymerase,
- Klenow fragment of DNA polymerase I,
- Vent DNA polymerase,
- Vent(Exo-) DNA polymerase (exonuclease activity-free Vent DNA polymerase),
- DeepVent DNA polymerase,
- DeepVent(Exo-) DNA polymerase (DeepVent DNA polymerase sans activité exonucléase),
- 29 phage DNA polymerase, - MS-2 phage DNA polymerase,
- Z-Taq DNA polymerase (Takara Shuzo), et
- KOD DNA polymerase (TOYOBO).
Le milieu réactionnel peut comprendre, en outre, des sels comme des sels de magnésium, des sels de manganèse et/ou sels d'ammonium ; des détergents, de la bétaïne et/ou des éléments utiles pour la détection et la quantification du produit d'amplification de l'oligonucléotide linéaire comme, par exemple, de la calcéine, un colorant intercalant comme, par exemple, iodure de propidium, SYTO 9, le vert SYBR et l'EvaGreen.
L'étape iv) ou iv') du procédé selon la présente invention est mise en œuvre pendant une période de temps et à une température suffisantes pour la production d'un produit d'amplification si l'oligonucléotide linéaire est présent. Avantageusement, cette étape est effectuée dans des conditions isothermes et notamment à une température comprise entre 15°C et 90°C, en particulier, comprise entre 50°C et 80°C et, plus particulièrement de l'ordre de 65°C (i.e. 65°C ± 5°C). La durée de l'étape iv) ou iv') du procédé selon la présente invention est comprise entre 1 min et 120 min, notamment entre 5 min et 90 min et, en particulier, entre 10 min et 60 min.
L'étape v) ou v') consiste à détecter et éventuellement à quantifier le produit d'amplification de l'oligonucléotide linéaire et donc à détecter et éventuellement à quantifier l'analyte auquel l'oligonucléotide linéaire est ou a été lié puisque l'accumulation du produit d'amplification est un indicateur de la présence de cet analyte immobilisé à la surface du support solide.
L'étape v) ou v') peut être réalisée simultanément à l'étape iv) ou iv') ou après cette dernière. L'homme du métier connaît différentes techniques pour réaliser cette détection. Cette dernière peut notamment être l'une quelconque des techniques décrites dans Becherer et al, 2020 [7],
Le produit d'amplification peut être détecté, lors de l'étape v) ou v') par mesure de la turbidité causée par le pyrophosphate de magnésium précipité en solution comme sous-produit de l'amplification. Cette mesure peut être réalisée à l'œil nu ou via un turbidimètre ou par imagerie sans lentille [8].
Le produit d'amplification peut être détecté, lors de l'étape v) ou v'), par une sonde pH permettant de suivre l'acidification du mélange réactionnel lors de l'amplification LAMP.
Le produit d'amplification peut être détecté, lors de l'étape v) ou v'), via une électrophorèse sur gel.
Le produit d'amplification peut être détecté, lors de l'étape v) ou v'), par détection de cristaux en plan par imagerie sans lentille comme décrit dans [8].
Le produit d'amplification peut également être détecté, lors de l'étape v) ou v'), par un test colorimétrique ou par mesure de fluorescence notamment lorsque la calcéine ou un colorant intercalant fluorescent est présent dans le mélange réactionnel.
Lorsque l'on souhaite réaliser une quantification d'au moins un analyte lors de l'étape v) ou v') du procédé selon la présente invention, cette quantification est réalisée par une comparaison avec une gamme étalon d'analyte à des concentrations connues. Cette quantification est une étape classique de la méthode ELISA. Cette quantification peut également mettre en œuvre des quantités connues d'analyte à détecter, ajoutées à l'échantillon liquide comme précédemment envisagé (échantillon liquide dopé).
D'autres caractéristiques et avantages de la présente invention apparaîtront encore à l'homme du métier à la lecture des exemples ci-dessous donnés à titre illustratif et non limitatif, en référence aux figures annexées.
BRÈVE DESCRIPTION DES DESSINS
La Figure 1 présente la gamme de calibration LAMP d'oligonucléotides linéaires selon l'invention (Ml et M2) et comparée à celle d'un haltère minimal (M3). La Figure 2 présente le principe de détection directe d'un simple brin d'ADN complémentaire à l'entité de reconnaissance d'un oligonucléotide linéaire selon l'invention, M2.
La Figure 3 présente les courbes d'amplification d'un oligonucléotide linéaire selon l'invention, M2, lors de son hybridation sur le brin d'ADN complémentaire immobilisé sur les billes magnétiques (duplicats expérimentaux).
La Figure 4 présente la gamme de calibration d'un oligonucléotide linéaire, M2, lors de son hybridation sur le brin d'ADN complémentaire immobilisé sur billes magnétiques (N=4).
La Figure 5 présente le principe de détection d'une protéine (anticorps 1) fixée sur billes magnétiques par immunoLAMP : greffage d'anticorps sur l'oligonucléotide linéaire selon l'invention à l'aide d'une portion PI, ici « Zip6c » qui reconnaît l'entité de reconnaissance « Zip6 » de l'oligonucléotide, l'anticorps correspondant à la portion P2 (gauche), par liaison covalente (centre) et par liaison biotine-streptavidine (droite).
La Figure 6 présente la mise en place des protocoles d'immunoLAMP incluant un anticorps fonctionnalisé avec l'oligonucléotide linéaire selon l'invention et différents contrôles négatifs.
La Figure 7 présente la courbe d'amplification (fluorescence en fonction du temps) de la détection de protéines immobilisées sur billes par un anticorps fonctionnalisé avec un brin oligonucléotidique « Zip6c » puis lié à l'oligonucléotide selon l'invention par LAMP à 2 amorces. La légende correspond aux schémas de la Figure 6.
EXPOSÉ DÉTAILLÉ DE MODES DE RÉALISATION PARTICULIERS
I. Amplification de l'oligonucléotide selon l'invention par LAMP à deux amorces.
Pour prouver la fonctionnalité de la LAMP à deux amorces, plusieurs séquences sont utilisées : - un oligonucléotide linéaire selon l'invention désigné Ml avec une entité de reconnaissance El de 40 bases constituée d'un aptamère anti-thrombine appelé « Thrl » [9],
- un oligonucléotide linéaire selon l'invention désigné M2 avec une
5 entité de reconnaissance E2 de 24 bases constituée d'une séquence oligonucléotidique « Zip6 », et
- un haltère à double structure tige-boucle comme présenté dans [5, 6] et utilisé ici comme référence. Cet haltère est dit « minimal » car il ne contient aucune entité de reconnaissance. 0
Les séquences des deux oligonucléotides Ml et M2, de l'haltère minimal M3 et des amorces FIP et BIP mis en œuvre durant l'amplification LAMP sont données dans le Tableau 1 ci-après.
Tableau 1
Plusieurs solutions des oligonucléotides Ml et M2 et de l'haltère M3 à des concentrations différentes ont été amplifiées selon le protocole d'amplification LAMP à deux amorces.
Ce protocole consiste à ajouter 2 pL de solution d'oligonucléotide ou d'haltère diluée dans un tampon contenant du PBS et du MgC (pH = 7,3) avec 18 pL de mix réactionnel comprenant :
- une enzyme catalysant l'amplification, Bst DNA Polymerase par exemple, avec son tampon d'amplification associé, comme « isothermal amplification buffer (NEB) » par exemple,
- des désoxyribonucléosides triphosphates (d NTP),
- des sels de magnésium tels que MgC ,
- un colorant intercalant tel que l'EvaGreen,
- de la bétaïne et
- les amorces FIP et BIP telles que définies ci-après.
La gamme de calibration comparant les 3 séquences est présentée Figure 1. Celle-ci représente les valeurs de cycles seuils dits « Ct » en fonction du logarithme de la concentration de la matrice d'ADN. La valeur de Ct est définie par le temps à partir duquel la valeur de fluorescence est supérieure à une valeur de fluorescence seuil.
La Figure 1 valide l'amplification par LAMP à deux amorces des oligonucléotides Ml et M2. Leur amplification est plus lente que la version en double boucle « haltère » i.e. M3, mais ils présentent l'avantage d'avoir une longueur de brin beaucoup plus courte, permettant une synthèse facile.
Ces oligonucléotides sont alors utilisés par la suite dans diverses configurations incluant une entité de reconnaissance pour des applications de détection. II. Utilisation d'un oligonucléotide selon la présente invention en détection.
L'oligonucléotide M2 est utilisé en détection, car il inclut une partie entité de reconnaissance « Zip6 » permettant de s'hybrider sur la séquence complémentaire « Zip6c ». La séquence de « Zip6 » et celle de « Zip6c » sont respectivement 5'-GACCGGTATGCGACCTGGTATGCG-3' (SEQ ID NO: 6 dans le listage de séquences en annexe) et 5'-CGCATACCAGGTCGCATACCGGTC-3' (SEQ ID NO: 7 dans le listage de séquences en annexe).
Par rapport aux haltères utilisés en détection dans [5, 6], l'oligonucléotide M2 a l'avantage d'être court et générique car pouvant s'hybrider sur tout type de sondes.
11.1. Gamme de quantification d'oligonucléotides sur billes (direct) .
La détection de brins d'ADN immobilisés sur billes magnétiques a été réalisée et a permis de montrer que l'oligonucléotide selon l'invention permet de détecter un simple brin d'ADN lorsque celui-ci est complémentaire de la séquence placée à l'extrémité 5'.
Une gamme de différentes concentrations d'oligonucléotide M2 mélangées avec des billes sur lesquelles sont greffées le brin d'ADN complémentaire à l'entité de reconnaissance « Zip6 » via un bras de liaison de 10 bases thymine « 10T- Zip6c », est réalisée. La solution contenant les billes et la matrice est amplifiée, après avoir effectué 3 lavages permettant d'éliminer les oligonucléotides ne s'étant pas accrochés à la cible. Le principe du protocole de détection est représenté Figure 2.
Le protocole de détection est alors le suivant :
- incubation du brin d'ADN biotinylé « 10T-Zip6c » avec les billes magnétiques streptavidine à 25°C pendant 10 min puis 3 rinçages à l'aide d'un aimant et d'un tampon de rinçage
- blocage des billes magnétiques pendant 30 min à l'aide d'une solution de 1% de BSA - incubation de différentes concentrations d'oligonucléotide M2 (1 nM -
100 pM) à 37°C pendant 30 min, puis 3 rinçages avec le tampon de rinçage,
- ajout de la solution LAMP contenant les 2 amorces et l'enzyme nécessaire à l'amplification
Ce protocole permet d'obtenir une gamme d'amplification de l'oligonucléotide lorsque son extrémité 5' s'hybride avec le brin complémentaire placé sur les billes. Les courbes d'amplification obtenues et la gamme de calibration associée sont exposées Figure 3 et Figure 4.
11.2. Détection de protéines : ImmunoLAMP.
Un autre exemple d'utilisation d'un oligonucléotide linéaire selon l'invention consiste à l'utiliser avec des anticorps. Cela permet de combiner la spécificité de reconnaissance des anticorps avec la sensibilité donnée par l'amplification LAMP de cet oligonucléotide, afin d'aller détecter des molécules présentes en très petites quantités dans les fluides. Cette technique est équivalente aux techniques d'immunoPCR connues et utilisées depuis une vingtaine d'années, mais utilise l'amplification LAMP qui a l'avantage d'être isotherme [2],
Grâce à la présente invention, ce protocole est encore simplifié car l'oligonucléotide linéaire, utilisé pour la LAMP est raccourci et n'utilise que 2 amorces. Pour cela, un anticorps peut être greffé à l'oligonucléotide par liaison biotine- streptavidine, par liaison covalente à l'extrémité 5' ou bien par l'intermédiaire d'une portion PI, ici « Zip6c » qui reconnaît l'entité de reconnaissance « Zip6 » de l'oligonucléotide, l'anticorps correspondant à la portion P2, comme exposé Figure 5. Ce type de configuration permet de faire un sandwich avec deux anticorps suivi d'une amplification LAMP, combinant spécificité et sensibilité de la reconnaissance.
Cette détection de protéine a été mise en place à titre d'exemple avec un anticorps 1 anti-souris et un anticorps 2 anti-CD63 produit chez la souris. Dans un premier temps, l'anticorps 2 est fonctionnalisé avec un brin oligonucléotidique « Zip6c », complémentaire à la partie « Zip6 » présente dans l'oligonucléotide linéaire selon l'invention). Une liaison covalente est alors établie entre l'anticorps 2 et le brin oligonucléotidique grâce à une réaction entre une molécule thiol fixée sur l'oligonucléotide et la molécule SM(PEG)i2 fixée sur l'anticorps 2. Ce complexe est alors mis en contact avec l'oligonucléotide selon l'invention, amplifîable par LAMP à 2 amorces, qui s'y lie par hybridation d'ADN, formant un complexe de reconnaissance de protéine et amplifîable par LAMP à 2 amorces.
Le protocole de détection est alors le suivant:
- incubation de l'anticorps 1 biotinylé et spécifique de l'anticorps 2 sur les billes magnétiques pendant 30 min sous agitation à 25°C, puis 3 rinçages à l'aide d'un aimant et d'une solution de PBS, 1% BSA et 0,3% de Tween 20,
- blocage des billes magnétiques pendant 30 min à l'aide d'une solution de 1% BSA,
- incubation de l'anticorps 2 spécifique de l'anticorps 1 et fonctionnalisé avec l'oligonucléotide selon l'invention, pendant 30 min, sous agitation à 25°C, puis 3 rinçages à l'aide d'un aimant et d'une solution de PBS, 1% BSA et 0,3% de Tween 20,
- ajout de la solution LAMP contenant les 2 amorces et l'enzyme nécessaire à l'amplification
En parallèle de ce protocole de détection, des contrôles négatifs (Figure 6) sont effectués avec des anticorps 1 non spécifiques de l'anticorps 2, de la manière suivante :
- Contrôle négatif 1 : Anticorps 1 spécifique de l'anticorps 2 et ajout de l'oligonucléotide selon l'invention, non fonctionnalisé avec l'anticorps,
- Contrôle négatif 2 : Anticorps Ibis non spécifique de l'anticorps 2,
- Contrôle négatif 3 : Pas d'anticorps 1 ajouté.
Ce protocole permet d'observer la détection de protéine par cette méthode d'ImmunoLAMP. Les résultats obtenus sont présentés Figure 7.
Cette dernière montre la spécificité de la reconnaissance de protéine suivie d'une amplification LAMP. En effet, le signal de fluorescence correspondant à la détection apparaît plus tôt (quelques minutes) par rapport aux contrôles négatifs. Les résultats présentés ici mettent en avant la possibilité d'implémenter des protocoles de détection par ImmunoLAMP à 2 amorces avec l'oligonucléotide linéaire selon l'invention.
Références bibliographiques
[1] Brevet US 6,410,278 publié le 25 juin 2002.
[2] Pourhassan-Moghaddam et al, 2013, « Protein detection through different platforms of immuno-loop-mediated isothermal amplification », Nanoscale Research Letters, vol. 8:485, pages 1-11.
[3] Du et al, 2016, « A ligation-based loop-mediated isothermal amplification (ligation-LAMP) strategy for highly selective microRNA detection », Chem. Commun., vol. 52, pages 12721-12724.
[4] Demande de brevet CN 106148549 publiée le 23 novembre 2016.
[5] Demande de brevet EP 3878971 publiée le 15 septembre 2021.
[6] Demande de brevet FR 2109667 déposée le 15 septembre 2021.
[7] Becherer et al, 2020, « Loop-mediated isothermal amplification (LAMP) - review and classification of methods for sequence-specific detection », vol. 12, pages 717-746.
[8] Demande de brevet EP 3363913 publiée le 22 août 2018.
[9] Daniel et al, 2013, « Real-time monitoring of thrombin interactions with its aptamers: Insights into the sandwich complex formation », Biosens. Bioelectron., vol. 40, pages 186-192.

Claims

37
REVENDICATIONS
1) Utilisation d'un oligonucléotide linéaire répondant à la formule (I) suivante :
Sa-F2-Sb-Fl-lnt-Blc-Sc-B2c-Sd (I) dans laquelle
Sa représente l'extrémité 5' de la portion F2 ou une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, la portion F2 comprend de 8 à 30 nucléotides,
Sb séparant la portion F2 et la portion Fl est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, la portion Fl comprend de 10 à 35 nucléotides,
Int séparant la portion Fl et la portion Blc est choisi dans le groupe constitué par une liaison covalente, une portion comprenant au moins un nucléotide et une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, la portion Blc comprend de 10 à 35 nucléotides,
Sc séparant la portion Blc et la portion B2c est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, la portion B2c comprend de 8 à 35 nucléotides, et
Sd représente l'extrémité 3' de la portion B2c ou une structure comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, à condition qu'au moins un parmi Sa, Sb, Int, Sc et Sd comprenne une structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt, 38 pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, ladite détection et éventuelle quantification mettant en œuvre une amplification isotherme médiée par des boucles à deux amorces, l'une de formule 5'-Flc- F2-3' et l'autre de formule 5'-Blc-B2-3'.
2) Utilisation selon la revendication 1, caractérisée en ce que ledit oligonucléotide répond à l'une quelconque des formules (II), (III), (IV), (V) et (VI) suivantes :
Sa'-F2-Fl-lnt'-Blc-B2c (II)
F2-Sb'-Fl-lnt'-Blc-B2c (III)
F2-Fl-lnt"-Blc-B2c (IV)
F2-Fl-lnt'-Blc-Sc'-B2c (V) et
F2-Fl-lnt'-Blc-B2c-Sd' (VI) dans lesquelles les portions F2, Fl, Blc et B2c sont telles que définies à la revendication 1,
Int' séparant la portion Fl et la portion Blc est soit une liaison covalente, soit une portion comprenant au moins un nucléotide, et
Sa', Sb', Int'', Sc' et Sd' représentent une structure ou portion comprenant au moins une entité E apte à se lier, directement ou indirectement, à un analyte d'intérêt.
3) Utilisation selon la revendication 1 ou 2, caractérisée en ce que
- ladite portion F2 comprend de 10 à 27 nucléotides,
- ladite portion Fl comprend de 15 à 25 nucléotides,
- ladite portion Blc comprend de 17 à 27 nucléotides, et/ou
- ladite portion B2c comprend de 15 à 30 nucléotides. 4) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que ladite structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' comprend, en plus d'une entité, au moins un autre élément permettant de lier l'entité E à l'extrémité 5' de la portion F2, à l'extrémité 3' de la portion F2, à l'extrémité 3' de la portion Fl, à l'extrémité 5' de la portion Fl, à l'extrémité 5' de la portion Blc, à l'extrémité 3' de la portion Blc, à l'extrémité 5' de la portion B2c et/ou à l'extrémité 3' de la portion B2c.
5) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite au moins une entité E présente au niveau de ladite structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' est apte à se lier directement à au moins un analyte d'intérêt.
6) Utilisation selon la revendication 5, caractérisée en ce que ladite au moins une entité E est choisie dans le groupe constitué par un glucide ; un peptide tel qu'un peptide antimicrobien ou un MIP i.e. un peptide associé au CMH-1 (pour « Complexe Majeur d'Histocompatibilté-1 ») ; un antigène ; un épitope ; une protéine ; une glycoprotéine ; une enzyme ; un substrat enzymatique ; un récepteur membranaire ou nucléaire ; un agoniste ou un antagoniste d'un récepteur membranaire ou nucléaire ; une toxine ; un anticorps polyclonal ou monoclonal ; un fragment d'anticorps tel qu'un fragment Fab, F(ab')2, Fv ou un domaine hypervariable (ou CDR pour « Complementarity Determining Region ») ; une molécule nucléotidique ; et un aptamère.
7) Utilisation selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que ladite au moins une entité E présente au niveau de ladite structure ou portion Sa, Sb, Int, Sc, Sd, Sa', Sb', Int'', Sc' ou Sd' est apte à se lier indirectement à au moins un analyte d'intérêt.
8) Utilisation d'un complexe non-covalent, formé par un oligonucléotide linéaire tel que défini à la revendication 7 et une molécule comprenant une première portion Pl apte à se lier à ladite au moins une entité E dudit oligonucléotide et une seconde portion P2 apte à se lier à au moins un analyte d'intérêt, pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, ladite détection et éventuelle quantification mettant en œuvre une amplification isotherme médiée par des boucles à deux amorces, l'une de formule 5'-Flc- F2-3' et l'autre de formule 5'-Blc-B2-3'.
9) Procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes : i) mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ; ii) mettre en contact ladite surface avec une solution contenant soit au moins un oligonucléotide linéaire tel que défini à la revendication 5 ou 6, soit un complexe tel que défini à la revendication 8, ledit oligonucléotide et ledit complexe ayant été préparés préalablement à ladite mise en contact ; iii) éliminer l'excès d'oligonucléotides ou l'excès de complexes de liaison n'ayant pas réagi lors de la mise en contact de l'étape ii) ; iv) mettre en contact, avec deux amorces d'amplification isotherme médiée par des boucles, l'une de formule 5'-Flc-F2-3' et l'autre de formule 5'-Blc-B2-3', dans des conditions permettant l'amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l'oligonucléotide linéaire tel que défini à la revendication 5 ou 6 ou le complexe de liaison selon la revendication 8, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ; v) détecter et éventuellement quantifier le produit de l'amplification dudit oligonucléotide. 10) Procédé pour détecter et éventuellement quantifier au moins un analyte éventuellement présent dans un échantillon liquide, comprenant les étapes suivantes : i') mettre en contact ledit échantillon liquide avec la surface d'un support solide comprenant au moins une zone active sur laquelle au moins une sonde apte à lier ledit au moins un analyte est immobilisée ; iii') mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins une molécule comprenant une première portion PI apte à se lier à l'entité E présente dans la structure de l'oligonucléotide selon la revendication 7 et une seconde portion P2 apte à se lier audit au moins un analyte d'intérêt ;
Ü2') éliminer l'excès de molécules n'ayant pas réagi lors de la mise en contact de l'étape iii') ;
Ü3') mettre en contact ladite surface avec une solution contenant au moins un oligonucléotide linéaire selon la revendication 7, ledit oligonucléotide ayant été synthétisé préalablement à ladite mise en contact ; iii') éliminer l'excès d'oligonucléotides n'ayant pas réagi lors de la mise en contact de l'étape iis') ; iv') mettre en contact avec deux amorces d'amplification isotherme médiée par des boucles, l'une de formule 5'-Flc-F2-3' et l'autre de formule 5'-Blc-B2-3', dans des conditions permettant l'amplification dudit oligonucléotide, soit ladite surface, soit l'oligonucléotide linéaire selon la revendication 7 ou le complexe de liaison selon la revendication 8, après avoir remis ledit oligonucléotide ou ledit complexe en suspension ; v') détecter et éventuellement quantifier le produit de l'amplification dudit oligonucléotide.
11) Procédé selon la revendication 9 ou 10, caractérisé en ce que ledit produit d'amplification est détecté, lors de ladite étape v) ou v'), par mesure de la turbidité, par imagerie sans lentille, par une sonde pH, via une électrophorèse sur gel, par un test colorimétrique ou par mesure de fluorescence.
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