EP4380965A2 - Activateur pharmacologique et/ou genetique pour son utilisation pour preserver et regenerer la structure et la fonction musculaire en bloquant la senescence - Google Patents

Activateur pharmacologique et/ou genetique pour son utilisation pour preserver et regenerer la structure et la fonction musculaire en bloquant la senescence

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EP4380965A2
EP4380965A2 EP22765409.2A EP22765409A EP4380965A2 EP 4380965 A2 EP4380965 A2 EP 4380965A2 EP 22765409 A EP22765409 A EP 22765409A EP 4380965 A2 EP4380965 A2 EP 4380965A2
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EP
European Patent Office
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activator
tshr
seq
sequence
dmddel52
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP22765409.2A
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English (en)
Inventor
Valentina TAGLIETTI
Frédéric RELAIX
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Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
French Muscular Dystrophy Association
Université Paris-Est Créteil Val de Marne
Original Assignee
Institut National de la Santé et de la Recherche Médicale
French Muscular Dystrophy Association
Université Paris-Est Créteil Val de Marne
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Publication date
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    • C12N2750/14143—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector

Definitions

  • the invention relates to a new pharmacological and/or genetic activator for its use to preserve and regenerate muscle structure and function by blocking senescence, in particular to prevent and/or treat myopathies, preferentially Duchenne muscular dystrophy (DMD) , as well as sarcopenia.
  • the invention also relates to a novel adenoviral vector for its use as a medicament.
  • Muscular dystrophy is a hereditary neuromuscular disorder of a progressive nature, resulting from the mutation of one or more genes intended to ensure muscular functions and structures.
  • Duchenne muscular dystrophy is the most common myopathy in children. It is due to abnormalities of a protein essential to the muscles, dystrophin. It is characterized by a decline in muscle regeneration contributing to the loss of muscle mass.
  • Duchenne muscular dystrophy is caused by a recessive genetic defect in the DMD gene on the X chromosome, resulting in the absence of dystrophin.
  • Dystrophin is a large protein that provides the link between the contractile cytoskeleton and the extracellular matrix, through a protein complex called the dystrophin membrane complex, and plays a major role in maintaining the integrity of muscle fibers during contraction.
  • Dystrophin is a protein made up of 3685 amino acids for a molecular weight of 427 kDa. It is encoded by the DMD gene which allows the synthesis of 7 main isoforms, of different sizes, thanks to the presence of 7 tissue-specific promoters.
  • M, B and P promoters indicating expression in the tissues "Muscle (Muscle), “Brain (Brain)” and “Purkinje neurons of the cerebellar cortex (Purkinje cerebellar neurons)" are located upstream of the first exon and allow the synthesis of functionally equivalent full-length dystrophins.
  • the other four promoters are intra-genic and allow the synthesis of isoforms of reduced size.
  • Dystrophin is part of the family of filamentous proteins of the "spectrin” type which are present in skeletal and cardiac muscle tissues, the brain, the retina, glial and Purkinje cells and in very reduced quantities in the lymphocytes.
  • Dystrophin is composed of four main domains which interact with several partners of the muscle cell and play an essential role during the muscle contraction-relaxation cycle: the N-terminal domain or actin binding domain (Actin Binding Domain or ABD1 ), comprising the first 246 amino acids; the central domain (or rod domain) ranging from amino acid 247 to 3045.
  • ABD1 actin binding domain
  • spectrin consists of 24 homologous spectrin repeats (or spectrin like, RI to R24) and 4 proline-rich hinges (or hinges, HI to H4) dividing the central domain into 3 sub-domains; the domain rich in cysteine (cysteine rich repeats or CR) ranging from amino acid 3080 to 3360; and the C-terminal domain formed from the last 325 residues.
  • Gene therapies aim to obtain functional dystrophin production in the muscle.
  • a first clinical trial started recently in France. It is evaluating a gene therapy product combining a shortened version of the DMD gene and an adeno-associated viral vector AAV.
  • Pharmacological therapies act on certain manifestations of the disease to slow its progression.
  • Several drugs are being studied to improve and/or protect muscle and/or heart function, fight against inflammation and the effects of the absence of dystrophin on muscle cells: tamoxifen, nebivolol, givinostat, rimeporide, etc.
  • Patent document WO2018155913 relates to a composition comprising chemical compounds selected from pan-histone deacetylase inhibitors, ALK5 inhibitors (activin A receptor-like kinase 5 inhibitor) and activin signaling activators.
  • cAMP for inducing the differentiation of somatic cells, mesenchymal stem cells or adult stem cells (excluding muscle stem cells) into skeletal muscle cells for the treatment of skeletal muscle diseases. It uses a method in which cells are cultured in a culture medium containing the composition inducing differentiation into skeletal muscle cells.
  • the skeletal muscle cells thus obtained present no risk of oncogenesis after implantation due to differentiation from somatic cells, and have the advantage of being genetically stable due to the use of a mixture of compounds of low molecular weight alone, without the introduction of genetics.
  • a problem which the present invention proposes to solve consists in developing a new therapy for preserving and regenerating the structure and the muscular function and in particular treating Duchenne muscular dystrophy.
  • the solution to this problem has as its first object a pharmacological and/or genetic activator of the thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) signaling pathway in muscle stem cells (satellite cells) for its use in preserving and regenerating the structure and the muscle function by blocking senescence.
  • TSHR thyroid-stimulating hormone receptor
  • TSHR signaling pharmacologically and/or genetically preserves the proliferation and differentiation capacities of muscle stem cells by blocking senescence.
  • the activation of TSHR signaling in muscle stem cells increases the regenerative properties of muscles affected in particular by Duchenne muscular dystrophy and preserves muscle structure and function, by preventing the rapid muscle wasting that occurs with the progression of the disease. pathology.
  • a subject of the invention is also an adenoviral vector characterized in that it comprises a protein sequence of the thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) of SEQ ID NO: 1 or a functional variant having a protein sequence which is at least 60% identical to the sequence SEQ ID NO:1, or a nucleotide sequence of the TSHR of SEQ ID NO:2 or a functional variant having a nucleotide sequence that is at least 60% identical to the sequence SEQ ID NO:2 for its use as a medicament.
  • TSHR thyroid stimulating hormone receptor
  • the Applicant has in particular been able to develop a pharmacological and/or genetic activator of the thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) signaling pathway in muscle stem cells, making it possible to increase muscle regeneration by preventing the loss of muscle mass and substitution by fatty and fibrous tissues. This approach will help maintain muscle functionality and slow the progression of Duchenne muscular dystrophy.
  • TSHR thyroid-stimulating hormone receptor
  • FIG. 1 illustrates the generation of R-DMDdel52 rats as detailed in example 1 in which: IA) is an observation of Dystrophin and
  • 3-Dystroglycan (in gray) by immunofluorescence in the anterior tibia of WT rats and R-DMDdel52 rats at 3 weeks and 12 months of age. (Scale bar at 20
  • 1B is an analysis of the level of dystrophin expression in the anterior tibia of a WT rat and two R-DMDdel52 rats (DMD #1, DMD#2) at 16 weeks of age by Western Blot . (3-Tubulin is used as a housekeeping gene.
  • I C represents a survival curve of WT rats and DMD rats by the Kaplan Meier estimator.
  • 1 G corresponds to the percentage distribution of the sizes of the muscle fibers of the transverse section at the level of the anterior tibia in WT and R-DMDdel52 rats of the age of 12 months.
  • Mean ⁇ standard deviation (n 3), ANOVA test.
  • the p values are calculated by Sidak's post test.
  • 1 J corresponds to the percentage of central nucleus myofibrils in the extraocular muscles of WT and R-DMDdel52 rats at the age of 12 months.
  • Mean ⁇ standard deviation (n 3), Mann-Whitney test.
  • FIG. 2 illustrates the continuous muscular regeneration of progressive extraocular muscles in the rat DMD model as detailed in example 2 in which:
  • 2A is an observation of the embryonic myosin light chain (eMHC - gray cluster in the lower left panel) and laminin (as a network) in the anterior tibia of WT and R-D rats Ddel52 aged 3 weeks,
  • 2D corresponds to the quantifications of the number of eMHC per mm2 in the extraocular muscles of WT and R-DMDdel52 rats aged 3 weeks, 6 months and 12 months.
  • Mean ⁇ standard deviation (n 3), Mann-Whitney test.
  • 2G represents the quantification of the percentage of quiescent (Pax7+/Ki67-) MSCs (muscle stem cells) and proliferative MSCs (Pax7+/Ki67+) on AT isolated from WT and R-DMDdel52 rats aged 3 weeks, 6 months and 12 month.
  • Mean ⁇ standard deviation (n 3), Mann-Whitney test.
  • FIG. 3 illustrates the myogenic potential of MSCs from AT R-DMDdel52 rats in vitro in which:
  • 3A-B correspond to representative co-immunofluorescence staining of Ki67 (round), MyoD (square) and nuclei (Hoechst, star) of myoblasts isolated from the anterior tibia (A) and extraocular muscles (B ) 3-week-old WT and R-DMDdel52 rats. Arrows indicate proliferating myoblasts co-labeled with Ki67 and MyoD. Scale bar 20 ⁇ m.
  • 3C corresponds to the quantifications of MyoD+/KI67+ and MyoD+/KI67- myoblasts from the anterior tibia and extraocular muscles of 3-week-old WT and R-DMDdel52 rats.
  • Mean ⁇ standard deviation (n 3), Mann-Whitney test.
  • 3D-E represent the immunofluorescence labeling of sarcomeric myosins (MF20 in the form of filaments) and nuclei (Hoechst,) of differentiated myotubes at the level of the anterior tibia (D) and extraocular muscles (E) of WT rats and R-DMDdel52 aged 3 weeks.
  • H-1) correspond to co-immunofluorescence staining of KI67, MyoD and nuclei (Hoechst) of myoblasts isolated from TA (H) and MEO (I) of 6-month-old WT and R-DMDdel52 rats. Arrows indicate proliferating myoblasts co-labeled with Ki67 and MyoD, while stars highlight MyoD+/KI67- myoblasts, 20 ⁇ m scale bar.
  • 3K-L correspond to immunofluorescence staining of sarcomeric myosins (MF20, green) and nuclei (Hoechst, blue) of differentiated myotubes from TA (K) and MEO (L) of 6-year-old WT and R-DMDdel52 rats month. 20m scale bar.
  • 3P is the percentage of cell type (Pax7+/MyoD+ and Pax7+/MyoD-) to assess cell purity after FACS sorting.
  • 3R is an immunofluorescence staining of sarcomeric myosins (MF20, as a broad band (WT) and a thick line (DMD)) and nuclei (Hoechst, in circles) on myotubes differentiated from FACS-sorted myoblasts of 6 month old WT and R-DMDdel52 rats. Scale bar 50 m.
  • 3S corresponds to the quantification of the fusion index per field for the experiment carried out in (R).
  • FIG. 4 illustrates the expression of the senescence markers in the satellite cells of the Tibialis anterior (TA) muscle R-DMDdel52 as detailed in Example 4, in which:. 4A) is a plot plotted by the t-SNE algorithm on the clustering of muscle-resident cell populations revealed by scRNA-seq analysis on the AT of 12-month-old WT and R-DMDdel52 rats.
  • 4B is a t-SNE plot split between WT and R-DMDdel52.
  • 4C is a t-SNE plot showing expression of Cdkn1a and Cdkn2a in muscle stem cells (MSCs) of WT and R-DMDdel52 samples.
  • 4D depicts violin diagrams showing the gene expression distribution of Pax7 and Myf5 as CSM-specific genes and Cdkn 1a and Cdkn2a as senescence markers.
  • 4E-F-G correspond to staining of TA by co-immunofluorescence, using antibodies against Pax7, Cdkn2a (also called p16; star, E) or Cdknl a (also called p21; star, F) or yH2AX (star, G), laminin (in the form of a network) and Hoechst for the nuclei.
  • Triangles highlight PAX7+ CSMs. Scale bar 10pm.
  • 4J corresponds to the quantification of G showing the percentage of MSC (Pax7+) co-expressing yH2AX at the age of 3 weeks, 6 months and 12 months at the level of the AT of the WT and R-DMDdel52 rats.
  • Means ⁇ standard deviation (n 3), Mann-Whitney test.
  • FIG. 5 illustrates the expression of senescence markers in the MSCs of human patients with DMD as detailed in example 5, in which:
  • 5A depicts immunofluorescence for embryonic myosin heavy chain (eMHC, large filled gray circle) and laminin (as a lattice) on human control and DMD biopsies at ages 1-2, 3-4, 5-6, 7-8 years old. Scale bar 20pm.
  • 5C is co-immunofluorescence staining of DMD and control muscle biopsies, using antibodies against Pax7, Cdkn2a (red) and Hoechst. Yellow triangles highlight PAX7+ CSMs. Scale bar 10 m.
  • 5F is a representative co-immunofluorescence staining of DMD and control muscle biopsies, using antibodies against Pax7, yH2AX (star), and Hoechst. Triangles highlight PAX7+ CSMs. lOpm scale bar.
  • FIG. 6 illustrates the expression of a specific signature of MSCs at the MEC level distinct from that at the TA level as detailed in Example 6, in which:
  • 6A is a graph plotted by the t-SNE algorithm of clustering of muscle-resident cell populations revealed by scRNA-seq at the TA (left panels) and MEOs (right panels) of WT rats and 12-month-old R-DMDdel52 showing expression of Pax7, Pitx2, Cdkn la, Cdkn2a and Tshr. The squares indicate the CSM group.
  • 6B-C depict Violin plots showing the gene expression distribution of Fax/, Cdkn la, Cdkn2a in B and Myf5, Pitx2 and Tshr in C from scRNAseq analysis performed at TA and MEO 12-month-old WT and R-DMDdel52 rats.
  • 6E-G correspond to co-immunofluorescence staining of MEOs, using antibodies against Pax7, Cdkn2a (E) or Cdknl a (F) or yH2AX (, G), laminin (as array) and Hoechst.
  • Triangles highlight CSMs (PAX7+) .
  • FIG. 7 illustrates the regulation of senescence in myoblasts isolated from MEOs in R-DMDdel2 rats, in which:
  • 7A is immunofluorescence for TSHR (stars) and Pax7/MyoD on myoblasts from 3 month old rats isolated from MEO (left) and limb muscle (right). Nuclei were stained with Hoechst. 20m scale bar.
  • 7B is co-immunofluorescence staining of Edll (middle panels), Pax7/MyoD (left panels) and nuclei (Hoechst, right panels) of vehicle-treated (DMSO) OME-derived myoblasts ) or ML224. 20m scale bar.
  • 7D is an immunofluorescence staining of sarcomeric myosins (MF20, as a band) and nuclei (Hoechst) of differentiated myotubes from MEO cells treated with vehicle (DMSO) or ML224. 20pm scale bar.
  • FIG. 7G depicts representative co-immunofluorescence staining of Pax7/MyoD (left panels), EdU (middle panels), and nuclei (Hoechst, right panels) on myoblasts isolated from WT and R limb muscles -DMDdel52 treated with vehicle (DMSO) or with the adenylate cyclase activator Forskolin. 20m scale bar.
  • 7K shows immunofluorescence staining of sarcomeric myosins (MF20, as bands) and nuclei (Hoechst, round) of differentiated myotubes from WT and R-DMDdel52 limb cells treated with vehicle (DMSO) or Forskolin. 20m scale bar.
  • the invention relates to an activator of the thyroid stimulating hormone receptor (TSH R) signaling pathway in muscle stem cells (satellite cells) for its use in preserving and regenerating muscle structure and function by blocking senescence, preferentially in ' Man and animal, even more preferentially in Man.
  • TSH R thyroid stimulating hormone receptor
  • the invention relates to a pharmacological and/or genetic activator of the thyroid-stimulating hormone receptor (TSH R) signaling pathway in muscle stem cells (satellite cells) for its use in preserving and regenerating muscle structure and function by blocking senescence, preferentially in humans and animals, even more preferentially in humans.
  • TSH R thyroid-stimulating hormone receptor
  • the Applicant has thus been able to identify new pharmacological and/or genetic activators of the thyroid-stimulating hormone receptor (TSHR) signaling pathway, taken alone or in combination, for their use specifically at the level of muscle stem cells (cells satellites) to block their senescence.
  • TSHR thyroid-stimulating hormone receptor
  • TSHR belongs to the family of glycoprotein rhodopsin receptors which, when activated, stimulate adenylate cyclase, activating the cyclic adenosine monophosphate (cAMP)/protein kinase A (PKA) pathway (Morshed et al. , “Characterization of thyrotropin receptor antibody-induced signaling cascades.” Endocrinology vol. 150.1 (2009): 51-29: Rowe et al., "Tezacaftor-lvacaftor in Residual-Function Heterozygotes with Cystic Fibrosis.” The New England journal of medicine vol 377.21 (2017): 2024-2035).
  • cAMP cyclic adenosine monophosphate
  • PKA protein kinase A pathway
  • DMD Duchenne muscular dystrophy
  • preserving and regenerating muscle structure and function by blocking the senescence of muscle stem cells makes it possible to prevent and/or treat myopathies, more preferably DMD.
  • the pharmacological and/or genetic activators of the TSHR signaling pathway in muscle stem cells (satellite cells) used according to the invention make it possible to prevent and/or treat sarcopenia.
  • sarcopenia we mean a geriatric syndrome characterized initially by a decrease in muscle capacity due to age and which, as it gets worse, will be the cause of a deterioration in muscle strength and physical performance.
  • the sarcopenia observed in the elderly is attributable to the aging process but can be accelerated by pathological and behavioral factors such as malnutrition and a sedentary lifestyle. From the age of 30, muscle degeneration of 3 to 8% per decade is observed. Muscle tissue is replaced by fat mass and this loss accelerates from the age of 50. Indeed, muscle mass declines approximately 1 to 2% per year after the age of 50, while strength declines on average by 1.5% per year between 50 and 60 years (-15%), then at the rate 3% per year, i.e.
  • the activator of the TSHR signaling pathway in muscle stem cells (satellite cells) used according to the invention is an activator chosen from a TSHR receptor agonist or an activator of the adenylate cyclase, taken alone or in combination.
  • agonist of the TSHR receptor used according to the invention is meant a compound capable of activating the TSHR receptor directly by binding at the level of the TSHR receptor or indirectly via other compound(s).
  • TSHR receptor agonist By way of example of a TSHR receptor agonist, mention may be made of recombinant human TSH (rhTSH) Thyrogen®, an antibody stimulating the TSHR (such as M22), NCGC00161870 known as C2 and consisting of the El and E2 enantiomers, NCGC00379308, and MSql.
  • rhTSH recombinant human TSH
  • Thyrogen® an antibody stimulating the TSHR (such as M22)
  • NCGC00161870 known as C2 and consisting of the El and E2 enantiomers
  • NCGC00379308 NCGC00379308
  • MSql MSql
  • the pharmacological activator used according to the invention is preferably an adenylate cyclase activator chosen from NKH 477 (6-[3-(dimethylamino)propionyl]forskolin), cw008, DMAPD (6-[3-(dimethylamino)propionyl] -14,15-dihydro-forskolin), PACAP-27, PACAP-38, Glucagon, Isoproterenol, Octopamine, PACAP 27 Amine, Prostaglandin D2/E1/E2/I2, Vasopressina, Forskolin and its analogues like 6-Acetyl-7- deacetyl-Forskolin, 7-Deacetyl-7-O- 4hemisuccinyl-Forskolin, 7-Deacetyl-7-(O-N- methylpiperazino)-y-butryl-Dihydrochlonde- Forskolin, 7-deacetyl-
  • the activator of the TSHR signaling pathway in muscle stem cells (satellite cells) used according to the invention is a genetic activator.
  • the genetic activator used according to the invention consists of a vector chosen from a liposome comprising a protein sequence of the thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) of SEQ ID NO: 1 or a functional variant having a protein sequence identical to at least 60 % to the sequence SEQ ID NO: 1, an adenoviral vector comprising the protein sequence of SEQ ID NO: 1 or a functional variant having a protein sequence identical to at least 60% to the sequence SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence of the TSHR of SEQ ID NO: 2 or a functional variant having a nucleotide sequence that is at least 60% identical to the sequence SEQ ID NO: 2, and an adenoviral vector comprising a CRISPR-Cas9 sequence fused with a transactivator domain preferentially chosen from VP16 , VP64, p65, NCO1A1, FOXO1A to activate TSHR expression.
  • TSHR thyroid stimulating hormone receptor
  • nucleotide any polyribonucleotide or polydeoxyribonucleotide, which may be an unmodified RNA or DNA or a modified RNA or DNA.
  • Polynucleotides include, without limitation, single and double stranded DNA, DNA that is a mixture of single and double stranded regions or single and triple stranded regions, single and double stranded RNA, and RNA which is a mixture of single and double stranded regions, hybrid molecules comprising DNA and RNA which may be single stranded or, more typically, double stranded, or regions triple stranded, or a mixture of single and double stranded regions.
  • polynucleotide(s) also includes DNAs or RNAs described above which contain one or more modified bases.
  • DNAs or RNAs whose backbones are modified for reasons of stability or for other reasons are “polynucleotides” in the sense that this term is understood here.
  • polynucleotide(s) as used herein encompasses such chemically, enzymatically or metabolically modified forms of polynucleotides, as well as chemical forms of DNA and RNA characteristic of viruses and cells, including, for example, simple and complex cells.
  • polynucleotide(s) also encompasses short polynucleotides often referred to as oligonucleotides.
  • polypeptide(s) designates both short chains, commonly called peptides, oligopeptides and oligomers, and longer chains generally called proteins. Polypeptides may contain amino acids other than the 20 amino acids encoded by the gene. "Polypeptides” include those that are modified by natural processes, such as processing and other post-translational modifications, but also by chemical modification techniques. Such modifications are well described in the scientific literature and are well known to those skilled in the art. It will be appreciated that the same type of modification may be present to the same degree or to different degrees at several sites in a given polypeptide.
  • a given polypeptide may contain many types of modification. Modification can occur anywhere in a polypeptide, including the peptide backbone, amino acid side chains, and amino or carboxyl termini. Modifications include, for example, acetylation, acylation, ADP-ribosylation, amidation, covalent attachment of flavin, covalent attachment of a heme fragment, covalent attachment of a nucleotide, or of a nucleotide derivative, covalent attachment of a lipid or lipid derivative, covalent attachment of phosphotidylinositol, cross-linking, cyclization, disulfide bond formation, demethylation, covalent cross-link formation, cysteine formation, pyroglutamate formation , formylation, gamma-carboxylation, GPI anchor formation, hydroxylation, iodination, methylation, myristoylation, oxidation, proteolytic processing, phosphorylation, prenylation, racemization, glycos
  • the protein acid sequence of TSH R is at least 60% identical to the sequence SEQ ID NO: 1, for example at 65%, 70%, 75%, 80%, 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, more preferably identical at least 95% to the sequence SEQ ID NO: 1, for example 96%, 97%, 98%, 99%, even more preferably is identical to the sequence SEQ ID NO: 1.
  • the nucleic acid sequence of TSH R is at least 60% identical to the sequence SEQ ID NO: 2, for example at 65%, 70%, 75%, 80%, 86%, 87%, 88% , 89%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, more preferably identical at least 95% to the sequence SEQ ID NO: 2, for example 96%, 97%, 98%, 99%, even more preferably is identical to the sequence SEQ ID NO: 2.
  • identity is meant a relationship between two or more polypeptide sequences or two or more polynucleotide sequences, as determined by comparison of the sequences.
  • identity also means the degree of sequence relatedness between the polypeptide or polynucleotide sequences, as the case may be, as determined by the correspondence between the chains of these sequences.
  • Identity and similarity can be readily calculated by known methods, including but not limited to those described in the following references (Computational Molecular Biology, Lesk A.M., ed travers Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and genome Projects, Smith D.W., ed therapeutic Academic Press, New York.
  • variant is meant a polynucleotide or a polypeptide which differs from a reference polynucleotide or polypeptide, respectively, but which retains essential properties.
  • a typical variant of a polynucleotide differs in its nucleotide sequence from another reference polynucleotide. Alterations to the nucleotide sequence of the variant may or may not alter the amino acid sequence of a polypeptide encoded by the reference polynucleotide. Nucleotide changes can lead to substitutions, additions, deletions, fusions and/or truncations of amino acids in the polypeptide encoded by the reference sequence, as discussed below.
  • a typical variant of a polypeptide differs in amino acid sequence from another reference polypeptide.
  • a variant polypeptide and a reference polypeptide may differ in amino acid sequence by one or more substitutions, additions, and/or deletions in any combination.
  • a substituted or inserted amino acid residue may or may not be a residue encoded by the genetic code.
  • the present invention also includes variants of each of the polypeptides of the invention, i.e. polypeptides which vary from the references by conservative amino acid substitutions, whereby one residue is replaced by another having characteristics similar.
  • Typical conservative amino acid substitutions are among Ala, Val, Leu and Ile; among Ser and Thr; among the acid residues, Asp and Glu; among Asn and Gin; and from the basic residues Lys and Arg; or aromatic residues Phe and Tyr.
  • conservative mutations include mutations that swap one amino acid for another in one of the following groups:
  • Aromatic residues Phe, Tyr and Trp.
  • variants in which several, for example 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 or 1 amino acid are substituted, deleted or added in any combination.
  • a variant of a polynucleotide or polypeptide may be naturally occurring, such as an allelic variant, or it may be a variant that is not known to be naturally occurring.
  • Unnatural polynucleotide and polypeptide variants can be obtained by mutagenesis techniques, by direct synthesis and by other recombinant methods known to those skilled in the art.
  • sequence optimization may also include decreasing the number of CpG islands in the sequence and/or decreasing the number of splice donor and acceptor sites.
  • sequence optimization is a balance between all these parameters, which means that a sequence can be considered optimized if at least one of the above parameters is enhanced while one or more of the other parameters are not, so long as the optimized sequence leads to an enhancement of the transgene, such as enhanced expression and/or decreased immune response to the transgene in vivo .
  • the transgene of interest codes for a human TSHR
  • the nucleic acid sequence coding for the human TSHR protein comprises an optimized sequence identical to the sequence SEQ ID NO: 2.
  • liposome an artificial vesicle formed by concentric lipid bilayers, trapping aqueous compartments between them. It is obtained from a wide variety of amphiphilic lipids, most often phospholipids. When such compounds are placed in the presence of an excess of aqueous solution, they organize themselves in such a way as to minimize the interactions between their hydrocarbon chains and water.
  • the genetic activator preferentially used according to the invention is an adenoviral vector, more preferentially an adeno-associated virus (AAV), even more preferentially an AAV8 or an AAV9.
  • AAV adeno-associated virus
  • Another subject of the invention relates to a combination of a pharmacological activator of the TSHR signaling pathway in muscle stem cells (satellite cells) and a genetic activator of the TSHR signaling pathway in muscle stem cells ( satellite cells) for its use in preserving and regenerating the muscle structure and function by blocking senescence, preferentially to prevent and/or treat myopathies, more preferentially DMD or even to prevent and/or treat sarcopenia.
  • the pharmacological activator is Forskolin and the genetic activator is an adeno-associated virus (AAV) comprising a protein sequence of the receptor of thyroid stimulating hormone (TSH R) of SEQ ID NO: 1 or a functional variant having a protein sequence that is at least 60% identical to the sequence SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence of the TSHR of SEQ ID NO: 2 or a functional variant having a nucleotide sequence that is at least 60% identical to the sequence SEQ ID NO: 2, more preferably an AAV8 or an AAV9.
  • AAV adeno-associated virus
  • Another object of the invention relates to an adenoviral vector comprising a protein sequence of the thyroid stimulating hormone receptor (TSHR) of SEQ ID NO: 1 or a functional variant having a protein sequence identical to at least 60% to the sequence SEQ ID NO: 1, or a nucleotide sequence of the TSHR of SEQ ID NO:2 or a functional variant having a nucleotide sequence that is at least 60% identical to the sequence SEQ ID NO:2 for its use as a medicament.
  • TSHR thyroid stimulating hormone receptor
  • the adenoviral vector preferentially used according to the invention is an adeno-associated virus (AAV), preferentially an AAV8 or an AAV9.
  • AAV adeno-associated virus
  • the adenoviral vector is preferentially used according to the invention to preserve and regenerate the structure and the muscular function by blocking senescence, more preferentially to prevent and/or treat myopathies, even more preferentially DMD.
  • the adenoviral vector is preferably used according to the invention to prevent and/or treat sarcopenia.
  • the R-DMDdel52 rat model is generated by deletion of 188 bp (base pairs) and generation of a premature stop codon at exon 52 of the Dystrophin (DMD) gene to produce a loss of function of the allele responsible for the production of dystrophin.
  • DMD Dystrophin
  • ENSRNQE00000518152 The sequence of rat exon 52 (ENSRNQE00000518152) and surrounding intronic sequences were selected to identify guide RNA sequences (sgRNAs) by the BWA algorithm for genome editing by the CRISPR method.
  • F0 animals were screened by junction PCR genotyping. Genotyping is performed on DNA extracted from tail or ear biopsies.
  • the PCR mix was prepared with 10X Dream Taq buffer (ThermoFisher Scientific, Cat#B65), 0.25mM dNTP (10mM), 0.3M forward primer ((5'- CTAACGCATTTAAAATATGCTGTCA-3'), 0.3 M of the antisense primer (5'-GTTGGCTTAGCTCAACAACCAAGAT-3', 100 pM), 0.03U/ ⁇ l DreamTaq and approximately 150ng of DNA.
  • the PCR was carried out using the Thermal Cycler 2720 with the following thermal program: initial denaturation at 95°C for 5 minutes, 40 cycles of denaturation at 95°C for 10 seconds, annealing of the primers at 60°C for 30 seconds and elongation at 72°C for 45 seconds, and final elongation at 72°C for 5 minutes.
  • exon 52 was detected on a 2% agarose gel.
  • Rats were housed in a pathogen-free facility with 12-hour light and 12-hour dark cycles in accordance with European Directive 2010/63/EU.
  • dystrophin was then evaluated by immunofluorescence (FIG. 1 A) and western blot [FIG. 1 B) in the muscle of WT and R-DMDdel52 rats.
  • Western blot was performed by cryosections of frozen muscles which were homogenized using a dounce homogenizer in lysis buffer containing 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 100 mM NaCl, 0.5% NP40 and Halt protease inhibitor cocktail (Pierce).
  • a survival curve was established in order to compare the probability of survival between WT and R-DMDdel52 rats as a function of the number of days. This made it possible to show that the R-DMDdel52 rats die after 14 months of life, unlike the WT rats.
  • R-DMDdel52 rats show significantly lower body mass than WT controls from 3 months of age, with a large decrease in body mass index and body length at age 12 months (Table 1). Consistent with the progressive loss of muscle mass, a reduction in Tibialis anterior (TA) and soleus weight was observed in 12-month-old R-DMDdel52 rats compared to WT rats.
  • TA Tibialis anterior
  • TA muscles are isolated from 12-month-old WT and R-DMDdel52 rats. After isolation, the muscles are immediately frozen in isopentane cooled in liquid nitrogen and sectioned at 7 m.
  • the slides are immersed in Mayer's hematoxylin (Sigma-Aldrich) for 3 minutes and after rinsing in deionized water, they are immersed in a solution of lithium carbonate for 3 seconds, then incubated in eosin for 30 seconds. After washing with distilled water, the slides are immersed in 50% and 70% ethanol, then equilibrated in 95% and 100% ethanol.
  • Mayer's hematoxylin Sigma-Aldrich
  • a severe fibrotic deposit is confirmed by Sirius red staining.
  • Figl D lower panels.
  • the extent of fibrosis is quantified by measuring the percentage of the area occupied by connective tissue, showing statistically significant differences between WT and R-DMDdel52 rats at the anterior tibia (Fig. 1E). In fact, R-DMDdel52 rats show approximately 2.5 times more fibrosis than WT rats.
  • central nuclei is also evaluated, as a pathological marker of a muscle undergoing a degeneration/regeneration event.
  • the R-DMDdel52 muscle showed a considerable number of central core fibers compared to the controls. (Fig.l F)
  • EOM extraocular muscles
  • R-DMDdel52 MEOs exhibited a high number of central nucleus myofibers compared to WT muscles (Fig. 1J), but to a lesser extent compared to TAs (Fig. 1F). Furthermore, fiber size analysis did not show any significant variation between the MEOs of 12-month-old WT and R-DMDdel52 rats (Fig. 1K).
  • R-DMDdel52 exhibit progressive and severe muscular dystrophy characterized by well-described features of DMD pathophysiology, including the fact that the extraocular muscles are specifically unaffected by the disease.
  • Example 2 The extraocular muscles do not show progressive muscle regeneration defects in the rat DMD model
  • the temporal course of muscle regeneration in the anterior tibia of R-DMDdel52 rats was assessed, using immunofluorescence for embryonic myosin heavy chain (eMHC), a specific marker of developing and regenerating myofibers on histological sections. of skeletal muscles.
  • eMHC embryonic myosin heavy chain
  • the following primary antibodies were used: Pax7 (Santa Cruz Biotechnology, sc-81648), ki67 (Abeam, sp6 abl 6667), Cdkn2a (Abeam Anti-CDKN2A/pl 6INK4a, Abl 08349), Cdknl a (Thermofisher, bs-10129R ) and yH2AX (Abeam, abl 1174). After repeated washings, the slides were incubated with Alexa fluorine secondary antibodies for 45 minutes at room temperature. Laminin staining was performed after incubation of the secondary antibodies, for 1 h at 37°C using a conjugated antibody (NB300-144AF647).
  • FIG. 2A-B A sharp decrease in the number of regenerating fibers was observed over time (Fig. 2A-B), indicating a progressive reduction in muscle regeneration during the progression of muscular dystrophy.
  • a co-immunolabeling is carried out for Pax7 and Ki67, a proliferation and activation marker, on histological sections of skeletal muscles isolated from the TA and MEO of WT and R-DMDdel52 rats.
  • MSCs The cell cycle status of MSCs is then assessed in WT and R-DMDdel52 rats. It can be said that in the TA muscle of WT and R-DMDdel52 rats, MSCs only divide at early stages (3 weeks), while remaining arrested in their cell cycle at later stages of pathology, including in the pathological context of DMD.
  • MEO MSCs are highly active in a WT context and retain their regenerative capacity in R-DMDdel52 animals.
  • Example 3 The R-DMDdel52 TA MSCs exhibit an altered myogenic potential in vitro:
  • the cells were fixed with 4% PFA for 10 minutes at 4° C. and permeabilized with 0.5% Triton in 1 X PBS for 6 minutes. After blocking with 10% BSA for 30 minutes at room temperature, the cells were incubated O/N at 4°C with the following primary antibodies: Pax7 (Santa Cruz Biotechnology, sc-81648), MyoD (Dako, clone 5.8A, M3512), ki67 (Abeam, sp6 abl 6667), sarcomeric myosin heavy chain (MF20, DSHB, AB_2147781).
  • TA-derived MSCs of 6-month-old R-DMDdel52 rats show a decrease in the percentage of MyoD-positive myoblasts co-expressing Ki67 compared to WT control cells (Fig. 31-J).
  • MSCs are purified from limb muscles by FACS sorting with CD45, CD31 , Terl 19 as exclusion markers and a7-integrin as a positive selection surface marker (Fig.S2A), allowing the culture of pure CSM-derived myoblasts (Figure 3O-P).
  • the FACS sorting is done by the following method: After dissociation of the cells, the cells isolated from the hind limb were incubated with CD45-PE-Cy7 (BD Pharmingen, 552848), Terl 19-PE-Cy7 (BD Pharmingen, 557853), CD31-PE-Cy7 (BD Pharmingen, 561410), ⁇ 7-integrin-FITC (CliniSciences, Cl 79570-100) for 45 minutes at 4°C. After washes with HBSS supplemented with DNase (Sigma-Aldrich, DN25), the cells are incubated with the vital dye 7-AAD (BD Pharmingen, 559925) and sorted with the BD FacsAria device. The MSC population was identified as CD45:Ter119:CD31-negative and ⁇ 7-integrin-positive.
  • a decrease in proliferative potential is observed in sorted R-DMDdel52 cells, as shown by the lower number of myoblasts (Pax7 ⁇ :MyoD ⁇ ) labeled with EdU (Fig. 3Q) in cultured cells from dystrophic limb muscles .
  • R-DMDdel52 sorted muscle satellite cells also show strong deficiencies in myogenic differentiation with the formation of small myotubes with fewer nuclei compared to WT cells (Fig. 3R-S).
  • Example 4 The satellite cells of the Tibialis anterior R-DMDdel52 muscle express markers of senescence
  • a scRNA-seq is performed from TA muscles of 12-month-old R-DMDdel52 and WT rats.
  • AT and extra-ocular muscle cells are extracted from 12-month-old WT and R-DMDdel52 rats and immediately digested with 3U/ml of Dispose II (Roche, 4942078001) and 0.5u/ml of Collagenase A (Roche, 10103586001) for 20 minutes in HBSS at 37° C. with slight agitation.
  • the cell suspension is passed through cell filters and centrifuged at 600g/minute for 5 minutes, at 4°C. The supernatant was discarded and the cell pellet was resuspended in 20% fetal bovine serum (Cat#S1810-500 Kevin Dutscher) in DMEM (Cat#41966-029 Gibco) supplemented with 25ng/ml bFGF ( RP4037, Sigma-Aldrich) with penicillin/streptomycin 100 mg/mL. (354234, Life Sciences) coated with matrigel (Sarstedt, #94.6140.802). Cells were grown for 48 hours to assess proliferation. After 48 h of proliferation, the cells were cultured for 5 days in 5% fetal bovine serum to induce differentiation.
  • cells were filtered through 100 and 70 ⁇ m cell strainers and sorted by FACS after incubation in DAPI (D9542, Sigma-Aldrich) to obtain a clean cell suspension removing dead cells and debris.
  • DAPI D9542, Sigma-Aldrich
  • the snRNA-seq is carried out using the Chromium Next GEM Single Cell 3'Gene Expression V3 kit (10X Genomics) following the manufacturing protocol. Sequencing was performed on the Illumina NexSeq 550 System with the High Output Kit v2.5 (75 cycles, Illumina 20024906).
  • WT and R-DMDdel52 cells are labeled on the t-SNE map, highlighting disease-related changes at the transcriptomic level (Fig. 4B). These changes were evident for MSCs that exhibited distinct gene expression signatures between WT and R-DMDdel52 samples (Fig. 4C).
  • Cdkn1a and Cdkn2a are observed in the MSCs at the protein level by co-immunolabeling with Pax7 on muscle sections isolated from 6-month-old R-DMDdel52 and WT rats.
  • RNA-Seq histone H2A gamma X
  • Example 5 MSCs from human patients with DMP express markers of senescence
  • DMD muscle biopsies divided by age groups (1 -2, 3-4, 5-6, 7-8 years), and control biopsies are stained for embryonic myosin heavy chain (eMHC) to mark the regenerating myofibers (Fig. 5A).
  • eMHC embryonic myosin heavy chain
  • Pax7 co-immunostaining with Cdkn2a and yH2AX are performed on histological sections from DMD biopsies and control biopsies to assess the senescence status of human muscle satellite cells.
  • Muscle sections from DMD patients showed substantial numbers of Pax7-positive MSCs that co-expressed Cdkn2a (Fig.5C-E) and yH2AX (Fig.5F-H) compared to control biopsies that barely expressed Cdkn2a and exhibited low levels of yH2AX (Fig.5C-H).
  • human DMD MSCs express an early and progressive senescent signature, associated with a gradual decline in muscle regeneration potential.
  • the same protocol as for the TA samples is used to characterize the MEO samples, identifying an average of 2505 cells.
  • the transcriptomic profile of MSCs from TA and MEO from WT and R-DMDdel52 animals is compared and the specific expression of the Pitx2 gene is detected (Evano, Brendan et al. "Dynamics of Asymmetric and Symmetric Divisions of Muscle Stem Cells In Vivo and on Artificial Niches.” Cell reports vol. 30,10 (2020): 3195-3206. e7. doi:10.1016/j.celrep.2020.01.097; Noden, Drew M, and Philippa Francis-West. "The differentiation and morphogenesis of craniofacial muscles.” Developmental dynamics: an official publication of the American Association of Anatomists vol. 235.5 (2006): 1 194-218. doi:10.1002/dvdy.20697) in MEO WT and R- DMDdel52, confirming the specific identity of these cells (Fig. 6A-C).
  • MSCs isolated from MEOs did not show a signature of senescence, with Cdkn1a and Cdkn2a being selectively expressed only in MSCs from R-DMDdel52 TA (Fig. 6B).
  • RNA is extracted using the kit RNAqueous-Micro total RNA isolation (Invitrogen) and reverse transcribed using SuperscriptTM III reverse transcriptase (Invitrogen, 18080093) according to the manufacturer's instructions.
  • qPCR is performed using the StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) and SYBR Green detection tools (Applied Biosystems).
  • Results are reported as relative gene expression (2-DDCT) using vehicle-treated cells or extraocular-derived myoblasts as reference. Gene expression is normalized to
  • Co-immunostaining for Pax7 and senescence markers are also performed: Cdkn2a, Cdknl a and yH2AX (Hernandez-Segura et al. 2018; Wang et al, 2009; Bernadotte et al, 2016; Dungan et al, 2020) (Fig .6E-G), showing the absence of their expression in Pax7-positive satellite cells of MEOs.
  • Example 7 TSHR signaling regulates senescence in myoblasts isolated from MEOs of R-DMDdel52 rats.
  • TSHR the thyroid-stimulating hormone receptor
  • MSCs of MEOs Fig. 6A-C
  • Specific protein expression of TSHR in MEO MSCs is validated by immunofluorescence of TSHR on freshly isolated myogenic cells from extraocular muscles and limbs.
  • TSHR staining cells were permeabilized for 5 minutes with 0.1% Triton in 1 X PBS, then incubated O/N with TSHR antibody (CliniSciences, BS-0003R). The following day, the cells were washed in IX PBS and incubated with Alexa fluorine secondary antibodies for 45 minutes at room temperature. Finally, the nuclei were counterstained with Hoechst (Sigma-Aldrich, B2261). Fluorescence was analyzed with an LSM800 confocal device.
  • TSHR is highly expressed in MEO-derived myoblasts at the cell membrane, whereas myoblasts isolated from limb muscles express low or undetectable levels of TSHR.
  • myoblasts were isolated from WT MEOs and treated with a selective TSH receptor antagonist, ML224 (Neumann et al., 2014).
  • the myoblasts derived from CSM were treated with 10 ⁇ M of ML224 (HY12381-S, CliniSciences) for 2 days (proliferation) or 7 days (differentiation) or 20 M of Forskolin (F3917, Sigma-Amdrich) (experiment following) only for 48 hours.
  • Control cells were treated with DMSO (D8418, Sigma Aldrich) as vehicle for ML224 and Forskolin.
  • the proliferation was measured after 24 h of culture by adding to the culture medium a pulse of 10 mM of 5-ethynyl-20-deoxyuridine (EdU) for 24 h (EdU Click-IT PLUS Kit C10640, Life Technologies).
  • EdU 5-ethynyl-20-deoxyuridine
  • myoblasts from ML224-treated MEOs exhibited differentiation defects and compromised myotube formation associated with a significant reduction in fusion index compared to vehicle-only-treated control cells (Fig. 7D- E).
  • WT and R-DMDdel52 MSCs isolated from limb muscles were treated with Forskolin, a well-known activator of adenylate cyclase [Alasbahi & Melzing, 2012) and TSHR signaling.
  • R-DMDdel52 myoblasts exposed to forskolin abolished aberrant expression of Cdkn1a (p21) and Cdkn2a (p16), while R-DMDdel52 myoblasts treated with vehicle maintained expression. of these markers of senescence (Fig. 51-J).
  • myoblasts from forskolin-treated R-DMDdel52 limbs exhibited enhanced differentiation potential compared to control R-DMDdel52 cells, forming significantly larger myotubes with a higher fusion index (Fig. 7K-L).
  • Muscles from the hind limbs of adult rats were dissected and digested with 3U/ml of Dispose II (Roche, 4942078001) and 0.5u/ml of Collagenase A (Roche, 10103586001) for 1 hour in HBSS at 37°C with a slight agitation.
  • the cell suspension was passed through cell filters and centrifuged at 600g/min for 5 minutes, at 4°C.
  • Cells were fixed with 4% PFA for 10 minutes at 4°C and permeabilized with 0.5% Triton in 1X PBS for 6 minutes. After blocking with 10% BSA for 30min at RT, the cells were incubated O/N at 4°C with the following primary antibodies: MyoD (Dako, clone 5.8A, M3512), and pl 6 (Abeam Anti-CDKN2A/ pl 6INK4a, Ab 108349). The following day, the cells were washed in 1X PBS and incubated with Alexa fluorine secondary antibodies for 45 min at room temperature. Finally, the nuclei were counterstained with Hoechst (Sigma-Aldrich, B2261).
  • qPCR was performed using the StepOnePlus real-time PCR system (Applied Biosystems) and SYBR Green detection tools (Applied Biosystems). Results are reported as relative gene expression (2-DDCT) using vehicle-treated cells or extraocular-derived myoblasts as reference.
  • the gene expression of the rat transcript was normalized to the expression levels of (Sactin.
  • a lentiviral vector carrying the coding sequence of TSHR and the Tomato reporter gene under the control of the CMV promoter (TSHR Tomato, Fig.8A) have been generated.
  • Wild-type (WT) myoblasts and DMD myoblasts were isolated from 6-month-old rats and cultured.
  • Transduction with the TSHR Tomato coding sequence or with a control lentivirus carrying only the Tomato gene was carried out 24 hours after culturing.
  • Cells were analyzed 72 hours after transduction and the efficiency of transduction of WT and DMD myoblasts with TSHR Tomato or a control lentivirus (Fig. 8B) was verified.
  • TSHR overexpression was validated by qPCR, showing greater transgene expression in cells transduced with TSHR Tomato compared to control cells (Fig.SC).
  • DMD cells overexpressing TSH R have lower expression of the senescence marker p! 6 (Fig.SD) thus demonstrating that TSHR prevents the entry into senescence of DMD myoblasts.

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Abstract

L'invention concerne un activateur pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire. L'invention se caractérise en ce que ledit activateur est un activateur de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence. L'invention concerne également une combinaison d'un activateur pharmacologique pour son utilisation selon l'invention et d'un activateur génétique pour son utilisation selon l'invention, ainsi qu'un vecteur adénoviral comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 pour son utilisation à titre de médicament.

Description

ACTIVATEUR PHARMACOLOGIQU E ET/OU GENETIQUE POUR SON UTILISATION POUR PRESERVER ET REGENERER LA STRUCTURE ET LA FONCTION MUSCULAIRE EN BLOQUANT LA SENESCENCE
DOMAINE TECHNIQUE
L'invention concerne un nouvel activateur pharmacologique et/ou génétique pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, en particulier pour prévenir et/ou traiter les myopathies, préférentiellement la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD), ainsi que la sarcopénie. L'invention concerne également un nouveau vecteur adénoviral pour son utilisation à titre de médicament.
TECH NIQU E ANTERIEU RE
La dystrophie musculaire est une atteinte neuromusculaire héréditaire de nature progressive, résultant de la mutation d'un ou de plusieurs gènes destinés à assurer les fonctions et structures musculaires.
La dystrophie musculaire de Duchenne est la plus répandue des myopathies de l'enfant. Elle est due à des anomalies d'une protéine indispensable aux muscles, la dystrophine. Elle se caractérise par un déclin de la régénération musculaire contribuant à la perte de masse musculaire.
Chez les patients atteints de myopathie de Duchenne, en l'absence de dystrophine, les fibres qui constituent les muscles squelettiques, les muscles lisses et le muscle cardiaque s'abîment à chaque contraction et finissent par se détruire.
La dystrophie musculaire de Duchenne est due à une anomalie génétique récessive dans le gène DMD, sur le chromosome X, entraînant l'absence de dystrophine.
La dystrophine est une grande protéine qui assure le lien entre le cytosquelette contractile et la matrice extracellulaire, par l'intermédiaire d'un complexe protéique appelé complexe membranaire de la dystrophine, et joue un rôle majeur dans le maintien de l'intégrité des fibres musculaires lors de la contraction.
La dystrophine est une protéine constituée de 3685 acides aminés pour un poids moléculaire de 427 kDa. Elle est encodée par le gène DMD qui permet la synthèse de 7 isoformes principales, de tailles différentes, grâce à la présence de 7 promoteurs tissus-spécifiques.
Trois de ces promoteurs (appelés promoteurs M, B et P indiquant une expression dans les tissus « Muscle (Muscle) », « Cerveau (Brain) » et « Neurones de Purkinje du cortex cérébelleux (Purkinje cerebellar neurons) ») sont situés en amont du premier exon et permettent la synthèse des dystrophines de pleine longueur fonctionnellement équivalentes.
Les quatre autres promoteurs sont intra-géniques et permettent la synthèse d'isoformes de taille réduite.
La dystrophine fait partie de la famille des protéines filamenteuses de type « spectrine » qui sont présentes dans les tissus musculaires squelettique et cardiaque, le cerveau, la rétine, les cellules gliales et de Purkinje et en quantité très réduite dans les lymphocytes. La dystrophine est composée de quatre grands domaines qui interagissent avec plusieurs partenaires de la cellule musculaire et jouent un rôle essentiel durant le cycle de contraction- relaxation musculaire : le domaine N-terminal ou domaine de liaison à l'actine (Actin Binding Domain ou ABD1 ), comprenant les premiers 246 acides aminés ; le domaine central (ou rod domain) allant de l'acide aminé 247 au 3045. Il est constitué de 24 répétitions homologues à la spectrine (ou spectrine like, RI à R24) et de 4 charnières riches en proline (ou hinges, HI à H4) divisant le domaine central en 3 sous-domaines ; le domaine riche en cystéine (cysteine rich repeats ou CR) allant de l'acide aminé 3080 à 3360 ; et le domaine C-terminal formé des 325 derniers résidus.
De nombreux essais cliniques sont en cours pour le traitement de la dystrophie musculaire de Duchenne en thérapie génique ou pharmacologique.
Les thérapies géniques visent à obtenir une production de dystrophine fonctionnelle dans le muscle.
Un premier essai clinique a démarré récemment en France. Il évalue un produit de thérapie génique associant une version raccourcie du gène DMD et un vecteur viral adéno-associé AAV.
Les thérapies pharmacologiques agissent sur certaines manifestations de la maladie pour ralentir son évolution. Plusieurs médicaments sont à l'étude pour améliorer et/ou protéger la fonction musculaire et/ou cardiaque, lutter contre l'inflammation et les effets de l'absence de dystrophine sur les cellules musculaires : le tamoxifène, le nébivolol, le givinostat, le riméporide, etc.
Le document brevet WO2018155913 concerne une composition comprenant des composés chimiques choisis parmi les inhibiteurs de la pan-histone désacétylase, les inhibiteurs de l'ALK5 (inhibiteur de la kinase 5 semblable au récepteur de l'activine A) et les activateurs de signalisation de l'AMPc permettant d'induire la différenciation de cellules somatiques, de cellules souches mésenchymateuses ou de cellules souches adultes (à l'exception des cellules souches musculaires) en cellules de muscle squelettique pour le traitement de maladies du muscle squelettique. Il met en œuvre un procédé dans lequel des cellules sont cultivées dans un milieu de culture contenant la composition induisant la différenciation en cellules de muscle squelettique. Les cellules de muscle squelettique ainsi obtenues ne présentent aucun risque d'oncogenèse après implantation du fait de la différenciation à partir de cellules somatiques, et présentent l'avantage d'être génétiquement stables en raison de l'utilisation d'un mélange de composés de faible poids moléculaire seuls, sans introduction de génétique.
PROBLEME TECHNIQU E
Considérant ce qui précède, un problème que se propose de résoudre la présente invention consiste à développer une nouvelle thérapie pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire et traiter notamment la dystrophie musculaire de Duchenne.
Or, à ce jour, aucune thérapie connue ne vise à cibler la sénescence cellulaire des cellules souches musculaires pour traiter la dystrophie musculaire de Duchenne. La sénescence des cellules souches musculaires est un des effets causés par la dystrophie musculaire de Duchenne (Sugihara, Hidetoshi et al. “Cellular senescence-mediated exacerbation of Duchenne muscular dystrophy." Scientific reports vol. 10,1 16385. 12 Oct. 2020, doi:10.1038/s41598-020-73315-6). Ceci contribue à la forte réduction de la régénération musculaire et provoque ainsi l'aggravation de la pathologie.
SOLUTION TECHNIQUE
La solution à ce problème posé a pour premier objet un activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence.
De manière surprenante, cibler la signalisation du TSHR de manière pharmacologique et/ou génétique permet de préserver les capacités de prolifération et de différenciation des cellules souches musculaires en bloquant la sénescence. L'activation de la signalisation TSHR dans les cellules souches musculaires augmente les propriétés de régénération des muscles atteints notamment de la dystrophie musculaire de Duchenne et préserve la structure et la fonction musculaires, en empêchant la fonte musculaire rapide qui se produit avec la progression de la pathologie.
Elle a également pour objet une combinaison d'un activateur pharmacologique et d'un activateur génétique pour leurs utilisations selon l'invention.
L'invention a également pour objet un vecteur adénoviral caractérisé en ce qu'il comprend une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2pour son utilisation à titre de médicament.
AVANTAGES APPORTES
Le Demandeur a notamment pu développer un activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans les cellules souches musculaires permettant d'augmenter la régénération musculaire en prévenant la perte de masse musculaire et la substitution par des tissus adipeux et fibreux. Cette approche permettra de maintenir la fonctionnalité des muscles et de ralentir la progression de la dystrophie musculaire de Duchenne.
BREVE DESCRIPTION DES DESSINS
L'invention et les avantages qui en découlent seront mieux compris à la lecture de la description et des modes de réalisation non limitatifs qui suivent, illustrés au regard des dessins annexés dans lesquels :
[fig. 1] illustre la génération des rats R-DMDdel52 telle que détaillée dans l'exemple 1 dans laquelle : IA) est une observation de la Dystrophine et de la |3-Dystroglycane (en gris) par immunofluorescence au niveau du tibia antérieur des rats WT et des rats R-DMDdel52 à l'âge de 3 semaines et de 12 mois. (Barre d'échelle = à 20|_im).
1 B) est une analyse du taux d'expression de la Dystrophine au niveau du tibia antérieur d'un rat WT et de deux rats R-DMDdel52 (DMD #1, DMD#2) à l'âge de 16 semaines par Western Blot. La (3-Tubuline est utilisé comme gène de ménage.
I C) représente une courbe de survie des rats WT et des rats DMD par l'estimateur de Kaplan Meier.
I D) détaille la coloration du tissu musculaire du tibia antérieur, à l'Hématoxyline et l' Eosine (panel du dessus) et au rouge Sirius (panel du dessous), provenant de rats WT et R-DMDdel52 à l'âge de 12 mois. (Barre d'échelle = 20 m).
1 E) représente la quantification de dépôt de tissu fibreux grâce au pourcentage de surface teinté au rouge Sirius au niveau du tibia antérieur chez des rats WT et R-DMDdel52 de l'âge de 12mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
1 F) correspond au pourcentage de myofibrilles à noyau central au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 à l'âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
1 G) correspond au pourcentage de distribution des tailles des fibres musculaires de la section transversal au niveau du tibia antérieur chez des rats WT et R-DMDdel52 de l'âge de 12mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test ANOVA. Les p values sont calculés par le Sidak's post test.
1 H) détaille la coloration des muscles extra -oculaires, à l' Hématoxyline et l' Eosine (panel du dessus, en blanc) et au rouge Sirius (panel du dessous, en noir), provenant de rats WT et R- DMDdel52 à l'âge de 12 mois. (Barre d'échelle = 20 m).
11) représente la quantification de dépôt de tissu fibreux grâce au pourcentage de surface teinté au rouge Sirius au niveau des muscles extra-oculaires chez des rats WT et R-DMDdel52 de l'âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
1 J) correspond au pourcentage de myofibrilles à noyau central au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 à l'âge de 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
1 K) correspond au pourcentage de distribution de la section transversal au niveau des muscles extra-oculaires chez des rats WT et R-DMDdel52 de l’âge de 12 mois. Moyenne ± écart- type (n=3), test ANOVA. Les p values sont calculés par le Sidak's post test.
[fig. 2] illustre la régénération continue musculaire des muscles extra-oculaires progressive dans le modèle DMD du rat telle que détaillée dans l'exemple 2 dans laquelle :
2A) est une observation de la chaîne légère de myosine embryonnaire (eMHC - embryonic myosin heavy chain, amas gris dans le panel du dessous à gauche) et de la laminine (sous forme de réseau) au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-D Ddel52 âgés de 3 semaines,
FEUILLE RECTIFIÉE (RÈGLE 91) ISA/EP 6 mois et 12 mois, par immunofluorescence, le noyau est marqué grâce au colorant bleu Hoechst. (Barre d'échelle = 20 pm) .
2B) correspond aux quantifications du nombre d'eMHC par mm2 au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3) , test de Mann-Whitney.
2C) est une observation de la chaîne légère d'eMHC (amas gris) et de la laminine (sous forme de réseau condensé) au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois, par immunofluorescence, le noyau est marqué grâce au colorant bleu Hoechst. (Barre d'échelle = 20 pm).
2D) correspond aux quantifications du nombre d'eMHC par mm2 au niveau des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart- type (n=3), test de Mann-Whitney.
2E) correspond à une coloration représentative par co-immunofluorescence au niveau du tibia antérieur, utilisant des anticorps Ki67 (en triangle blanc), Pax7 (encadré 0), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst (les ronds dans les cellules) . Les encadrés jaunes indiquent une coexpression de Pax7 et Ki67 et les rectangles gris indiquent PAX7+/KI67- des cellules souches musculaires. (Barre d'échelle = 10 pm) .
2F) représente la quantification de E montrant le nombre de cellules musculaires (PAX7+) par fibre au niveau du tibia antérieur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
2G) représente la quantification du pourcentage de CSM (Cellules souches musculaires) quiescentes (Pax7+/Ki67-) et de CSM prolifératives (Pax7+/Ki67+) sur les TA isolés des rats WT et R- DMDdel52 âgés de 3 semaines, 6 mois et 12 mois. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann- Whitney.
[fig. 3] illustre le potentiel myogénique des CSM des rats R-DMDdel52 du TA in vitro dans laquelle :
3A-B) correspondent à une coloration représentative par co-immunofluorescence de Ki67 (rond), MyoD (carré) et des noyaux (Hoechst, étoile) de myoblastes isolés à partir du tibia antérieur (A) et des muscles extra-oculaires (B) des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs co-marqués par Ki67 et MyoD. Barre d'échelle 20 pm.
3C) correspond aux quantifications des myoblastes MyoD+/KI67+ et MyoD+/KI67- à partir du tibia antérieur et des muscles extra-oculaires des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Moyenne ± écart-type (n=3), test de Mann-Whitney.
3D-E) représentent le marquage par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20 sous formes de filaments) et des noyaux (Hoechst,) des myotubes différentiés au niveau du tibia antérieur (D) et des muscles extra-oculaires (E) des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines. Barre d'échelle 20 pm. 3F) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés du et des MEO (Muscles Extra-Oculaires) à l'âge de 3 semaines. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
3G) représente le nombre de noyaux par myotube par champ (mm2) pour les myotubes WT et R-DMDdel52 isolés de TA et MEO à l'âge de 3 semaines. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
H-l) correspondent à une coloration par co-immunofluorescence de KI67, MyoD et noyaux (Hoechst) de myoblastes isolés du TA (H) et des MEO (I) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs co-marqués par Ki67 et MyoD, tandis que les étoiles mettent en évidence les myoblastes MyoD+/KI67-, Barre d'échelle de 20 m.
3J) représente les quantifications des myoblastes MyoD+/KI67+ et MyoD+/Ki67- provenant du TA et des MEO WT et R-DMDdel52 à 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann- Whitney.
3K-L) correspondent à une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, vert) et des noyaux (Hoechst, bleu) des myotubes différenciés du TA (K) et des MEO (L) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Barre d'échelle de 20 m.
3M) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés du TA et des MEO des rats âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
3N) représente le nombre de noyaux par myotube par champ (mm2) pour les myotubes WT et R-DMDdel52 isolés du TA et MEO des rats âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
30) correspond à une coloration par co-immunofluorescence de l'Edll, de Pax7/MyoD et des noyaux (Hoechst) de myoblastes triés par FACS provenant de muscles de membres isolés de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Les flèches indiquent les myoblastes prolifératifs comarqués par KI67 et MyoD, tandis que les étoiles mettent en évidence les myoblastes MyoD-positifs négatifs pour ki67. Barre d'échelle de 20 m.
3P) correspond au pourcentage de type cellulaire (Pax7+/MyoD+ et Pax7+/MyoD-) pour évaluer la pureté des cellules après le tri FACS.
3Q) correspond à la quantification des myoblastes prolifératifs (EdU+) (Pax7:MyoD+) à partir de cellules triées par FACS et isolées des muscles des membres de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
3R) est une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de large bande (WT) et un trait épais (DMD)) et des noyaux (Hoechst, en rond) sur des myotubes différenciés à partir de myoblastes triés par FACS de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 6 mois. Barre d'échelle 50 m.
3S) correspond à la quantification de l'indice de fusion par champ pour l'expérience réalisée en (R) .
[fig. 4] illustre l'expression des marqueurs de sénescence au niveau des cellules satellites du muscle Tibialis anterior (TA) R-DMDdel52 telle que détaillée dans l'exemple 4, dans laquelle :. 4A) correspond à un graphique tracé par l'algorithme t-SNE sur le regroupement des populations de cellules résidant dans les muscles, révélé par l'analyse scRNA-seq sur le TA de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois.
4B) correspond à un graphique t-SNE divisé entre WT et R-DMDdel52.
4C) correspond à un graphique t-SNE montrant l'expression de Cdkn la et Cdkn2a au niveau des cellules souches musculaires (CSM) des échantillons WT et R-DMDdel52.
4D) représente des diagrammes de violon montrant la distribution de l'expression génique de Pax7 et Myf5 comme gènes spécifiques de CSM et de Cdkn 1 a et Cdkn2a comme marqueurs de sénescence.
4E-F-G) correspondent à une coloration du TA par co-immunofluorescence, en utilisant des anticorps contre Pax7 , Cdkn2a (aussi appelé pl 6 ; étoile, E) ou Cdknl a (aussi appelé p21 ; étoile, F) ou yH2AX (étoile, G), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst pour les noyaux. Les triangles mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle 10pm.
4H) correspond à la quantification de E montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant Cdkn2a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA des rats WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
41) correspond à la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant Cdknl a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA chez les rats WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
4J) correspond à la quantification de G montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant yH2AX à l'âge de 3 semaines, 6 mois et 12 mois au niveau du TA des rats WT et R- DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
[fig. 5] illustre l'expression des marqueurs de sénescence au niveau des CSM de patients humains atteints de DMD telle que détaillée à l'exemple 5, dans laquelle :
5A) représente une immunofluorescence pour la chaîne lourde de la myosine embryonnaire (eMHC, gros cercle gris rempli) et la laminine (sous forme de réseau) sur des biopsies humaines témoins et DMD à l'âge de 1 -2, 3-4, 5-6, 7-8 ans. Barre d'échelle 20pm.
5B) correspond à la quantification du nombre de myofibres eMHC+ par mm2 par rapport à A. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=20), test de Mann-Whitney.
5C) est une coloration par co-immunofluorescence de biopsies musculaires de DMD et de contrôle, en utilisant des anticorps contre Pax7, Cdkn2a (rouge) et Hoechst. Les triangles jaunes mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle 10 m.
5D) représente la quantification de C montrant le pourcentage de CSM Pax7 co-exprimant Cdkn2a dans les biopsies musculaires DMD et contrôle. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=20), test de Mann-Whitney.
5E) représente un test de corrélation de Pearson montrant la corrélation entre les CSM DMD exprimant Cdkn2a et l'âge (Contrôle n=12 ; DMD n=20) . 5F) est une coloration représentative par co-immunofluorescence de biopsies musculaires de DMD et de contrôle, en utilisant des anticorps contre Pax7, yH2AX (étoile) et Hoechst. Les triangles mettent en évidence les CSM PAX7+. Barre d'échelle lOpm.
5G) représente la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant yH2AX dans les biopsies musculaires DMD et contrôle. Moyennes ± écart-type (Contrôle n=12 ; DMD n=l 5), test de Mann-Whitney.
5H) représente un test de corrélation de Pearson entre les CSM DMD exprimant yH2AX et l'âge (Contrôle n=12 ; DMD n= 15) .
[fig. 6] illustre l'expression d'une signature spécifique des CSM au niveau des MEC distincte de celle au niveau du TA telle que détaillée à l'exemple 6, dans laquelle :
6A) est un graphique tracé par l'algorithme t-SNE du regroupement des populations de cellules résidant dans les muscles, révélé par scRNA-seq au niveau du TA (panneaux de gauche) et des MEO (panneaux de droite) de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois, montrant l'expression de Pax7, Pitx2, Cdkn la, Cdkn2a et Tshr. Les carrés indiquent le groupe de CSM.
6B-C) représentent des diagrammes de Violon montrant la distribution de l'expression génique de Fax/, Cdkn la, Cdkn2a en B et Myf5, Pitx2 et Tshr en C à partir de l'analyse scRNAseq effectuée au niveau du TA et des MEO de rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois.
6D) est une analyse qPCR des myoblastes dérivés des MEO et des membres en tant que pli d'expression relatif aux myoblastes dérivés des MEO pour Cdknl a, Cdkn2a et Tshr. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
6E-G) correspondent à une coloration par co-immunofluorescence des MEO, en utilisant des anticorps contre Pax7, Cdkn2a (E) ou Cdknl a (F) ou yH2AX (, G), laminine (sous forme de réseau) et Hoechst. Les triangles mettent en évidence les CSM (PAX7+) . Barre d'échelle l Opm.
6H) correspond à la quantification de E montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant Cdkn2a à l’âge de 3 semaines, 6 mois et 12 mois des rats au niveau du TA WT et R- DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
61) correspond à la quantification de F montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant Cdknl a à 3 semaines, 6 mois et 12 mois chez les TA WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
6J) correspond à la quantification de G montrant le pourcentage de CSM (Pax7+) co- exprimant yH2AX à 3 semaines, 6 mois et 12 mois chez les TA WT et R-DMDdel52. Moyennes ± écart- type (n = 3), test de Mann-Whitney.
[fig. 7] illustre la régulation de la sénescence au niveaux des myoblastes isolés des MEO chez les rats R-DMDdel2, dans laquelle :
7A) correspond à une immunofluorescence pour TSHR (étoiles) et Pax7/MyoD sur des myoblastes des rats âgés de 3 mois isolés des MEO (à gauche) et des muscles des membres (à droite) . Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst. Barre d'échelle de 20 m. 7B) est une coloration par co-immunofluorescence de l'Edll (panels du milieu), de Pax7/MyoD (panels à gauche) et des noyaux (Hoechst, panels de droite) des myoblastes dérivés de l'OME traités par véhicule (DMSO) ou ML224. Barre d'échelle de 20 m.
7C) correspond aux quantifications des myoblastes prolifératifs (EdU+) (Pax7/MyoD+) provenant de myoblastes dérivés des MEO traités avec le véhicule (DMSO) ou l'inhibiteur du TSHR ML224. Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
7D) est une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de bande) et des noyaux (Hoechst) de myotubes différenciés issus de cellules MEO traitées avec véhicule (DMSO) ou ML224. Barre d'échelle de 20pm.
7E) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur les myotubes différenciés des MEO, traités avec le véhicule (DMSO) ou ML224. Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann- Whitney.
7F) correspond à une analyse qPCR sur les myoblastes dérivés des MEO traités avec véhicule ou ML224, évaluant l'expression génétique de Cdknla et Cdkn2a. Moyennes ± écart- type (n = 4-5), test de Mann-Whitney.
7G) représente une coloration représentative par co-immunofluorescence de Pax7/MyoD (panels de gauche), de l'EdU (panels du milieu) et des noyaux (Hoechst, panels de droite) sur des myoblastes isolés de muscles de membres WT et R-DMDdel52 traités par véhicule (DMSO) ou par l’activateur de l'adénylate cyclase Forskoline. Barre d'échelle de 20 m.
7H) correspond aux quantifications des myoblastes Pax7:MyoD+/EdU+ et Pax7:MyoD+/EdU- provenant de myoblastes WT et R-DMDdel52 isolés à partir de muscles des membres après traitement par la Forskoline ou par le véhicule (DMSO). Moyennes ± écart-type (n = 3), test de Mann-Whitney.
71-J) correspondent à l’analyse qPCR sur des myoblastes dérivés de membres traités par véhicule ou par Forskoline provenant de rats WT et R-DMDdel52, évaluant l'expression génétique de Cdknla (I) et Cdkn2a (J) . Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann-Whitney.
7K) représente une coloration par immunofluorescence des myosines sarcomériques (MF20, sous forme de bandes) et des noyaux (Hoechst, ronds) de myotubes différenciés provenant de cellules de membres WT et R-DMDdel52 traitées par véhicule (DMSO) ou par Forskoline. Barre d'échelle de 20 m.
7L) est une évaluation de l'indice de fusion par champ sur des myotubes différenciés provenant de muscles de membres WT et R-DMDdel52, traités avec le véhicule (DMSO) ou la Forskoline. Moyennes ± écart-type (n = 4), test de Mann-Whitney.
8A) correspond au Schéma du lentivirus TSHR Tomato
8B) montre l'expression de Tomato dans des myoblastes WT et DMD transduits avec un lentivirus contrôle (Tomato) ou avec le lentivirus TSHR Tomato.
8C) représente une analyse par qPCR des niveaux de transcription du gène TSHR.
8D) correspond au pourcentage de myoblastes MyoD-positifs exprimant le marqueur de sénescence pl 6. DESCRIPTION DES MODES DE REALISATION
L'invention concerne un activateur de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSH R) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, préférentiellement chez l' Homme et l'animal, encore plus préférentiellement chez l' Homme.
Préférentiellement, l'invention concerne un activateur pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSH R) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, préférentiellement chez l' Homme et l'animal, encore plus préférentiellement chez l' Homme.
De manière surprenante, le Demandeur a ainsi pu identifier de nouveaux activateurs pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR), pris seul ou en combinaison, pour leur utilisation spécifiquement au niveau des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour bloquer leur sénescence.
Le TSHR appartient à la famille des récepteurs glycoprotéiques de la rhodopsine qui, lorsqu'il est activé, stimule l'adénylate cyclase, activant la voie de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc)/protéine kinase A (PKA) (Morshed et al., “Characterization of thyrotropin receptor antibody-induced signaling cascades." Endocrinology vol. 150,1 (2009) : 51 -29 : Rowe et al., "Tezacaftor-lvacaftor in Residual-Function Heterozygotes with Cystic Fibrosis." The New England journal of medicine vol. 377,21 (2017) : 2024-2035) .
La sénescence des cellules souches musculaires est un des effets causés par la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD). Ceci contribue à la forte réduction de la régénération musculaire et provoque ainsi l'aggravation de la pathologie.
Préférentiellement, préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence des cellules souches musculaires (cellules satellites) permet de prévenir et/ou traiter les myopathies, plus préférentiellement la DMD.
Selon un autre mode de réalisation, les activateurs pharmacologique et/ou génétique de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) utilisés selon l'invention permettent de prévenir et/ou traiter la sarcopénie.
Par sarcopénie, on entend un syndrome gériatrique se caractérisant dans un premier temps par une diminution des capacités musculaires due à l'âge et qui en s'aggravant sera à l’origine d'une détérioration de la force musculaire et des performances physiques. La sarcopénie observée chez la personne âgée est imputable au processus de vieillissement mais peut être accélérée par des facteurs pathologiques et comportementaux tels que la dénutrition et la sédentarité. Dès 30 ans, on observe une dégénérescence musculaire de 3 à 8 % par décennie. Le tissu musculaire est remplacé par la masse grasse et cette perte s'accélère à partir de 50 ans. En effet, la masse musculaire décline approximativement de 1 à 2 % par an passé l'âge de 50 ans tandis que la force décline en moyenne de 1 ,5 % par an entre 50 et 60 ans (-15 %), puis au rythme de 3 % par an, soit une perte de 30 % par décennie après 60 ans. Selon un mode de réalisation préféré de l'invention, l'activateur de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) utilisé selon l'invention est un activateur choisi parmi un agoniste du récepteur TSHR ou un activateur de l'adénylate cyclase, pris seul ou en combinaison.
Par agoniste du récepteur TSHR utilisé selon l'invention, on entend un composé capable d’activer directement par fixation au niveau du récepteur TSHR ou indirectement par l’intermédiaire d’autre(s) composé(s) le récepteur TSHR.
A titre d'exemple d'agoniste du récepteur TSHR, on peut citer le TSH humain recombinant (rhTSH) Thyrogen®, un anticorps stimulant le TSHR (comme M22), NCGC00161870 connu comme C2 et constitué par les énantiomères El et E2, NCGC00379308, et MSql .
L'activateur pharmacologique utilisé selon l'invention est préférentiellement un activateur de l'adénylate cyclase choisi parmi NKH 477 (6-[3-(dimethylamino) propionyl] forskolin) , cw008, DMAPD (6-[3-(dimethylamino)propionyl]-14,15-dihydro-forskolin), PACAP-27, PACAP-38, Glucagone, Isoproterenol, Octopamine, PACAP 27 Amine, Prostaglandine D2/E1/E2/I2, Vasopressina, Forskoline et ses analogues comme 6-Acetyl-7-deacetyl-Forskoline, 7-Deacetyl-7-O- 4hemisuccinyl-Forskoline, 7-Deacetyl-7-(O-N- methylpiperazino)-y-butryl-Dihydrochlonde- Forskoline, 7-deacetyl-forskoline (D3533), 6-[3-(dimethylamino)propionyl]forskoline, 6-[N-(2- isothiocyanatoethyl)aminocarbonyl]forskoline, 5,6-dehydroxy-7-deacetyl-7-nicotinoylforskoline, 6- acetyl-7-deacetyl-forskoline, 7-deacetyl-7-O-hemisuccinyl-forskoline, 1 ,9-dideoxy-forskolin (D3658), préférentiellement la Forskoline.
Selon un autre mode de réalisation préféré de l'invention, l'activateur de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) utilisé selon l’invention est un activateur génétique.
Préférentiellement, l'activateur génétique utilisé selon l'invention consiste en un vecteur choisi parmi un liposome comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, un vecteur adénoviral comprenant la séquence protéique de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2, et un vecteur adénoviral comprenant une séquence CRISPR-Cas9 fusionnée avec un domaine transactivateur préférentiellement choisi parmi VP16, VP64, p65, NCO1A1, FOXO1A pour activer l'expression du TSHR.
Par nucléotide, on entend tout polyribonucléotide ou polydésoxyribonucléotide, qui peut être un ARN ou un ADN non modifié ou un ARN ou un ADN modifié. Les polynucléotides comprennent, sans limitation, de l'ADN simple et double brin, de l'ADN qui est un mélange de régions simple et double brin ou de régions simple et triple brin, de l'ARN simple et double brin, et de l'ARN qui est un mélange de régions simple et double brin, des molécules hybrides comprenant de l'ADN et de l'ARN qui peuvent être simple brin ou, plus typiquement, double brin, ou des régions triple brin, ou un mélange de régions simple et double brin. Tel qu'il est utilisé ici, le terme « polynucléotide(s) » comprend également les ADN ou ARN décrits ci-dessus qui contiennent une ou plusieurs bases modifiées. Ainsi, les ADN ou ARN dont les squelettes sont modifiés pour des raisons de stabilité ou pour d'autres raisons sont des « polynucléotides » au sens où ce terme est entendu ici. De plus, les ADN ou ARN comprenant des bases inhabituelles, telles que l'inosine, ou des bases modifiées, telles que des bases tritylées, pour ne citer que deux exemples, sont des polynucléotides au sens où ce terme est utilisé ici. On comprendra qu'une grande variété de modifications ont été apportées à l'ADN et à l'ARN, qui servent à de nombreuses fins utiles connues des personnes compétentes dans ce domaine. Le terme « polynucléotide(s) » tel qu'il est utilisé ici englobe de telles formes de polynucléotides modifiées chimiquement, enzymatiquement ou métaboliquement, ainsi que les formes chimiques d'ADN et d'ARN caractéristiques des virus et des cellules, y compris, par exemple, les cellules simples et complexes. Le terme « polynucléotide(s) » englobe également les polynucléotides courts souvent appelés oligonucléotides.
Par séquence protéique, on entend tout peptide ou protéine comprenant deux ou plusieurs acides aminés reliés entre eux par des liaisons peptidiques ou des liaisons peptidiques modifiées. Le terme « polypeptide(s) » désigne à la fois des chaînes courtes, communément appelées peptides, oligopeptides et oligomères, et des chaînes plus longues généralement appelées protéines. Les polypeptides peuvent contenir des acides aminés autres que les 20 acides aminés codés par le gène. Les « polypeptides » comprennent ceux qui sont modifiés par des processus naturels, tels que la transformation et d'autres modifications post-traductionnelles, mais aussi par des techniques de modification chimique. De telles modifications sont bien décrites dans la littérature scientifique et sont bien connues des personnes compétentes dans ce domaine. Il sera apprécié que le même type de modification peut être présent au même degré ou à des degrés différents sur plusieurs sites dans un polypeptide donné. De même, un polypeptide donné peut contenir de nombreux types de modification. La modification peut se produire n'importe où dans un polypeptide, y compris le squelette peptidique, les chaînes latérales d'acides aminés et les extrémités aminées ou carboxyliques. Les modifications comprennent, par exemple, l'acétylation, l'acylation, l'ADP-ribosylation, l'amidation, la fixation covalente de flavine, la fixation covalente d'un fragment d'hème, la fixation covalente d'un nucléotide ou d'un dérivé de nucléotide, fixation covalente d'un lipide ou d'un dérivé de lipide, fixation covalente du phosphotidylinositol, réticulation, cyclisation, formation de liaison disulfure, déméthylation, formation de liaisons transversales covalentes, formation de cystéine, formation de pyroglutamate, formylation, gamma-carboxylation, formation d'ancrage GPI, hydroxylation, iodation, méthylation, myristoylation, oxydation, traitement protéolytique, phosphorylation, prénylation, racémisation, glycosylation, la fixation aux lipides, la sulfatation, la gamma- carboxylation des résidus d'acide glutamique, l'hydroxylation et l'ADP-ribosylation, la sélénoylation, la sulfatation, l'addition d'acides aminés aux protéines par l'intermédiaire de l'ARN de transfert, comme l'arginylation, et l'ubiquitination. Les polypeptides peuvent être ramifiés ou cycliques, avec ou sans ramification. Les polypeptides cycliques, ramifiés et non ramifiés peuvent résulter de processus naturels post-traductionnels et peuvent également être fabriqués par des méthodes entièrement synthétiques.
Préférentiellement, la séquence d'acide protéique de TSH R est identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , par exemple à 65%, 70%, 75%, 80%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, plus préférentiellement identique à au moins 95% à la séquence SEQ ID NO :1 , par exemple 96%, 97%, 98%, 99%, encore plus préférentiellement est identique à la séquence SEQ ID NO :1.
Préférentiellement, la séquence d'acide nucléique de TSH R est identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2, par exemple à 65%, 70%, 75%, 80%, 86%, 87%, 88%, 89%, 90%, 91 %, 92%, 93%, 94%, plus préférentiellement identique à au moins 95% à la séquence SEQ ID NO :2, par exemple 96%, 97%, 98%, 99%, encore plus préférentiellement est identique à la séquence SEQ ID NO :2.
Par identité, on entend une relation entre deux ou plusieurs séquences polypeptidiques ou deux ou plusieurs séquences polynucléotidiques, telle que déterminée par la comparaison des séquences. Dans l'art, « identité » signifie également le degré de parenté de séquence entre les séquences polypeptidiques ou polynucléotidiques, selon le cas, tel que déterminé par la correspondance entre les chaînes de ces séquences. L'« identité » et la « similarité » peuvent être facilement calculées par des méthodes connues, y compris, mais sans s'y limiter, celles décrites dans les références suivantes (Computational Molecular Biology, Lesk A.M., ed„ Oxford University Press, New York, 1988 ; Biocomputing : Informatics and genome Projects, Smith D.W., ed„ Academic Press, New York. 1993 ; Computer Analysis of sequence Data, Part I, Griffin A.M., et Griffin H.G., eds., Humana Press. New jersey, 30 1994 ; sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje G„ Academic Press, 1987 ; et sequence Analysis Primer, Gribskov M. et Devereux J., eds., M Stockton Press, New York, 1991 ; et Carillo H., et Lipman D„ SIAM J. Applied Math., 48:1073 ( 1998)) . Les méthodes de détermination de l'identité sont conçues pour donner la plus grande correspondance entre les séquences testées. En outre, les méthodes de détermination de l'identité sont codifiées dans des programmes informatiques accessibles au public. Les méthodes de programmes informatiques permettant de déterminer l'identité entre deux séquences comprennent, sans s'y limiter, le progiciel GCG (Devereux J. et al., Nucleic Acids Research 12(1 ) : 387 (1984)), BLASTP, BLASTN, et FASTA (Altschul S. F. et al., J. Molec. Biol. 215 : 403-410 (1990)) . Le programme BLAST X est 12 publiquement disponible auprès du NCBI et d'autres sources (BLAST Manual, Altschul S. et al., NCBI NLM NUH Bethesda, MD 20894 ; Altschul S. et al., J. Mol Biol. 215 : 403-410 (1990)).
Par variant, on entend un polynucléotide ou un polypeptide qui diffère d'un polynucléotide ou d'un polypeptide de référence, respectivement, mais qui conserve des propriétés essentielles. Un variant typique d'un polynucléotide diffère par sa séquence nucléotidique d'un autre polynucléotide de référence. Les modifications de la séquence nucléotidique du variant peuvent ou non modifier la séquence d'acides aminés d'un polypeptide codé par le polynucléotide de référence. Les changements de nucléotides peuvent entraîner des substitutions, des ajouts, des suppressions, des fusions et/ou des troncations d'acides aminés dans le polypeptide codé par la séquence de référence, comme discuté ci-dessous. Une variante typique d'un polypeptide diffère en séquence d'acides aminés d'un autre polypeptide de référence.
En général, les différences sont limitées de sorte que les séquences du polypeptide de référence et du variant sont globalement très similaires et, dans de nombreuses régions, identiques. Un polypeptide variant et un polypeptide de référence peuvent différer dans la séquence d'acides aminés par une ou plusieurs substitutions, additions, et/ou délétions dans n'importe quelle combinaison. Un résidu d'acide aminé substitué ou inséré peut être ou ne pas être un résidu codé par le code génétique.
La présente invention comprend également des variantes de chacun des polypeptides de l'invention, c'est-à-dire des polypeptides qui varient des références par des substitutions conservatrices d'acides aminés, par lesquelles un résidu est remplacé par un autre ayant des caractéristiques similaires. Les substitutions d'acides aminés conservatrices typiques sont parmi Ala, Val, Leu et Ile ; parmi Ser et Thr ; parmi les résidus acides, Asp et Glu ; parmi Asn et Gin ; et parmi les résidus basiques Lys et Arg ; ou les résidus aromatiques Phe et Tyr. Ces mutations conservatrices comprennent les mutations qui échangent un acide aminé contre un autre dans l'un des groupes suivants :
1 . Petits résidus aliphatiques, non polaires ou légèrement polaires : Ala, Ser, Thr, Pro et Gly ;
2. Résidus polaires, chargés négativement et leurs amides : Asp, Asn, Glu et Gin ;
3. Résidus polaires, chargés positivement : His, Arg et Lys ;
4. De grands résidus aliphatiques, non polaires : Met, Leu, Ile, Val et Cys ; et
5. Résidus aromatiques : Phe, Tyr et Trp.
Ces variations conservatrices peuvent en outre inclure les éléments suivants :
Préférentiellement, les variantes dans lesquelles plusieurs, par exemple 5-10, 1-5, 1-3, 1-2 ou 1 acide aminé sont substitués, supprimés ou ajoutés dans n'importe quelle combinaison. Un variant d'un polynucléotide ou d'un polypeptide peut être d'origine naturelle, comme un variant allélique, ou il peut s'agir d'un variant qui n'est pas connu pour être d'origine naturelle. Les variants non naturels de polynucléotides et de polypeptides peuvent être obtenus par des techniques de mutagenèse, par synthèse directe et par d'autres méthodes de recombinaison connues de l'homme de l'art.
Comme mentionné ci-dessus, en plus de la teneur en GC et/ou du nombre d'ARF, l'optimisation de la séquence peut également comprendre une diminution du nombre d'îlots CpG dans la séquence et/ou une diminution du nombre de sites donneurs et accepteurs d'épissage.
Bien entendu, comme cela est bien connu de l'homme du métier, l'optimisation de la séquence est un équilibre entre tous ces paramètres, ce qui signifie qu'une séquence peut être considérée comme optimisée si au moins un des paramètres ci-dessus est amélioré alors qu'un ou plusieurs des autres paramètres ne le sont pas, tant que la séquence optimisée conduit à une amélioration du transgène, telle qu'une amélioration de l'expression et/ou une diminution de la réponse immunitaire au transgène in vivo.
Préférentiellement, le transgène d'intérêt code pour un TSHR humain, et la séquence d'acide nucléique codant pour la protéine TSHR humaine comprend une séquence optimisée identique à la séquence SEQ ID NO : 2.
Par liposome, on entend une vésicule artificielle formée par des bicouches lipidiques concentriques, emprisonnant entre elles des compartiments aqueux. On en obtient à partir d'une grande variété de lipides amphiphiles, dont les plus souvent des phospholipides. Lorsque de tels composés sont mis en présence d'un excès de solution aqueuse, ils s'organisent de manière à minimiser les interactions entre leurs chaînes hydrocarbonées et l'eau.
L'activateur génétique préférentiellement utilisé selon l'invention est un vecteur adénoviral, plus préférentiellement un virus adéno-associé (AAV), encore plus préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.
Un autre objet de l'invention concerne une combinaison d' un activateur pharmacologique de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) et d' un activateur génétique de la voie de signalisation du TSHR dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, préférentiellement pour prévenir et/ou traiter les myopathies, plus préférentiellement la DMD ou encore pour prévenir et/ou traiter la sarcopénie.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de l'invention, dans la combinaison utilisée selon l'invention, l'activateur pharmacologique est la Forskoline et l'activateur génétique est un virus adéno-associé (AAV) comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSH R) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2, plus préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.
Un autre objet de l'invention concerne un vecteur adénoviral comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2 pour son utilisation à titre de médicament.
Le vecteur adénoviral préférentiellement utilisé selon l'invention est un virus adéno-associé (AAV), préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.
Le vecteur adénoviral est préférentiellement utilisé selon l'invention pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence, plus préférentiellement pour prévenir et/ou traiter les myopathies, encore plus préférentiellement la DMD.
Selon un autre mode de réalisation de l’invention, le vecteur adénoviral est préférentiellement utilisé selon l'invention pour prévenir et/ou traiter la sarcopénie.
Exemples :
L'analyse des données a été réalisée à l'aide du logiciel GraphPad Prism, version 6.0. Les données sont exprimées en moyenne ± écart-type.
Exemple 1 : Génération des rats R-DMDdel52 :
Le modèle de rat R-DMDdel52 est généré par la délétion de 188 pb (paires de bases) et la génération d'un codon stop prématuré au niveau de l'exon 52 du gène de la Dystrophine (DMD) pour produire une perte de fonction de l'allèle responsable de la production de dystrophine.
La séquence de l'exon 52 du rat (ENSRNQE00000518152) et les séquences introniques autour ont été sélectionnées afin d'identifier les séquences d'ARN guides (sgRNAs) par l’algorithme BWA pour l'édition génomique par la méthode CRISPR.
Après une validation in vitro, deux sgRNAs 3' et 5’ ont été sélectionnés et microinjéctés dans les ovocytes des rats Sprague Dawley.
Les animaux F0 ont été dépistés par génotypage par PCR de jonction. Le génotypage est réalisé sur de l'ADN extrait de biopsies de la queue ou de l'oreille.
Le mélange PCR a été préparé avec le tampon Dream Taq 10X (ThermoFisher Scientific, Cat#B65), 0.25mM de dNTP (lOmM), 0.3 M de l'amorce sens ((5'- CTAACGCATTTAAAATATGCTGTCA-3'), 0.3 M de l'amorce anti-sens (5'- GTTGGCTTAGCTCAACAACCAAGAT-3', lOOpM), 0.03U/|jl DreamTaq et environ 150ng d'ADN. La PCR a été réalisée à l'aide du Thermal Cycler 2720 avec le programme thermique suivant : dénaturation initiale à 95°C pendant 5 minutes, 40 cycles de dénaturation à 95°C pendant 10 secondes, hybridation des amorces à 60°C pendant 30 secondes et élongation à 72°C pendant 45 secodes, et l'élongation finale à 72°C pendant 5 minutes.
La délétion de l'exon 52 a été détectée sur un gel d'agarose à 2%.
Les rats ont été hébergés dans une installation exempte d'agents pathogènes avec des cycles de 12 heures de lumière et de 12 heures d'obscurité, conformément à la directive européenne 2010/63/UE.
Seuls des rats mâles ont été utilisés pour les expériences car la mutation est portée sur le chromosome X.
Les animaux ont été manipulés conformément aux directives nationales et européennes, et les protocoles ont été approuvés par le comité d'éthique du ministère français (APAFIS#25606- 20200531 1746599) .
L'expression de la dystrophine a ensuite été évaluée par immunofluorescence (figure 1 A) et western blot [figure 1 B) au niveau du muscle des rats WT et R-DMDdel52.
Le western blot a été réalisé par cryosections de muscles congelés qui ont été homogénéisées à l'aide d'un homogénéisateur dounce dans un tampon de lyse contenant 50 mM Tris-HCI, pH 7,4, 100 mM NaCI, 0,5% NP40 et un cocktail d'inhibiteurs de protéase Halt (Pierce) .
Les échantillons ont ensuite été centrifugés pendant 5 minutes à 1500g et dénaturés à température ambiante pendant 30 minutes avec du tampon Laemmli. La concentration en protéines a été déterminée par le test de Bradford (Pierce). Les protéines ont été séparées par électrophorèse (Nu-PAGE 4-12% gel Bis-Tris ; Life Technologies) puis transférées sur des membranes de nitrocellulose (GE Healthcare) et marquées avec des anticorps primaires et des anticorps secondaires couplés à la peroxydase de raifort. L'anticorps primaire utilisé est la Dystrophin (DYS2, Leica) et l'alpha-tubulin (Sigma, T5168) . Les signaux ont été visualisés avec le substrat chimiluminescent SuperSignal West Pico (Pierce) . Les images ont été acquises avec Chemidoc MP (Biorad).
Cela a permis de déterminer que la dystrophine n'est pas exprimée chez les rats R- DMDdel52 comparé aux rats WT. (Figi A-B) .
Une courbe de survie a été établie afin de comparer la probabilité de survie entre les rats WT et R-DMDdel52 en fonction du nombre de jour. Cela a permis de montrer que les rats R- DMDdel52 meurent au bout de 14 mois de vie, contrairement aux rats WT.
De plus, les rats R-DMDdel52 présentent une masse corporelle nettement inférieure à celle des témoins WT à partir de l'âge de 3 mois, avec une forte diminution de l'indice de masse corporelle et de la longueur du corps à l'âge de 12 mois (Tableau 1 ) . En accord avec la perte progressive de la masse musculaire, une réduction du poids du Tibialis anterior (TA) et du soleus a été observée chez les rats R-DMDdel52 âgés de 12 mois comparés aux rats WT.
Un examen histologique a été réalisé par hématoxyline et éosine (H&E) et coloration au rouge Sirius au niveau du tibia antérieur chez les rats R-DMDdel52 en comparaison avec les rats WT. (Figl D-G)
Pour la coloration à l'hématoxyline et à l'éosine, les muscles du TA sont isolés chez des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois. Après isolement, les muscles sont immédiatement congelés dans de l'isopentane refroidi dans l'azote liquide et sectionnés à 7 m.
Les lames sont plongées dans l'hématoxyline de Mayer (Sigma-Aldrich) pendant 3 minutes et après rinçage dans de l'eau désionisée, elles sont plongées dans une solution de carbonate de lithium pendant 3 secondes, puis incubées dans de l'éosine pendant 30 secondes. Après un lavage à l'eau distillée, les lames sont plongées dans de l'éthanol à 50 % et 70 %, puis équilibrées dans de l'éthanol à 95 % et 100 %.
Les lames ont été montées avec Eurokit après avoir été trempées dans du xylène.
Pour la coloration au rouge Sirius, des lames sont décongelées pendant 20 minutes à température ambiante (RT) et plongées dans de l'EtOH à 90% pendant 2 minutes avant de commencer la coloration, en incubant les échantillons pendant 25 minutes dans une solution de rouge picro-sirius (Sigma-Aldrich). Les lames sont ensuite lavées abondamment à l'eau et déshydratées dans de l'éthanol à 100%.
Après la clarification au xylène, les lames ont été montées en Eurokit.
Cela a permis de mettre en évidence que les muscles des rats R-DMDdel52 présentent des signes de pathologie DMD sévère avec présence de fibrose endomysiale, une morphologie des fibres altérée et l'envahissement de cellules inflammatoires. (Figl D, panneaux supérieurs) .
En effet, un dépôt fibrotique sévère est confirmé par la coloration au rouge Sirius. (Figl D, panneaux inférieurs). L'étendue de la fibrose est quantifiée en mesurant le pourcentage de la zone occupée par le tissu conjonctif, montrant des différences statistiquement significatives entre les rats WT et R-DMDdel52 au niveau du tibia antérieur (fig. 1 E). En effet les rats R-DMDdel52 présentent environ 2.5 fois plus de fibrose que les rats WT.
La présence de noyaux centraux est également évaluée, en tant que marqueur pathologique d'un muscle subissant un événement de dégénération/régénération. Le muscle R- DMDdel52 présentait un nombre considérable de fibres à noyau central par rapport aux contrôles. (Fig.l F)
Enfin, la présence de fibres atrophiques est confirmée, avec une surface de section transversale des fibres musculaires réduite, qui contribuent à la fonte musculaire (Shin, Jonghyun ét al. "Wasting mechanisms in muscular dystrophy." The international journal of biochemistry & cell biology vol. 45,10 (2013): 2266-79. doi:10.1016/j.biocel.2013.05.001 ) . (Figl G)
Les muscles extra-oculaires (MEO) ont également été analysés, car ils sont sélectivement épargnés dans la dystrophie musculaire de Duchenne (Kaminski, H J et al. “Extraocular muscles are spared in advanced Duchenne dystrophy." Annals of neurology vol. 32,4 (1992) : 586-8. doi:10.1002/ana.4103204181992). Les MEO sont des muscles striés complexes qui présentent des propriétés biochimiques, mécaniques et physiologiques distinctes par rapport à leurs homologues des membres (Bondi, A Y, and D J Chiarandini. "Morphologie and electrophysiologic identification of multiply innervated fibers in rat extraocular muscles." Investigative ophthalmology & visual science vol. 24,4 ( 1983) : 516-9., Jacoby et al., 1990, Kono et al., 2005, Fraterman et al., 2007) . Les colorations à l'hématoxyline/éosine et au rouge Sirius ont confirmé la préservation des MEO isolées d'animaux R-DMDdel52 âgés de 12 mois (Fig. H-K), sans signe d'inflammation ou de fibrose significative par rapport aux témoins (Fig. 1 H-l) .
Il est intéressant de noter que les MEO R-DMDdel52 présentaient un nombre élevé de myofibres à noyau central par rapport aux muscles WT (Fig. I J), mais dans une moindre mesure par rapport aux TA (Fig. 1 F). En outre, l'analyse de la taille des fibres n'a pas montré de variation significative entre les MEO des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois (Fig. 1 K) .
Ces résultats montrent que les R-DMDdel52 présentent une dystrophie musculaire progressive et sévère caractérisée par des caractéristiques bien décrites de la physiopathologie de la DMD, y compris le fait que les muscles extra-oculaires ne sont spécifiquement pas atteints par la maladie.
Tableau 1 :
Exemple 2 : Les muscles extra-oculaires ne présentent pas de défauts de régénération musculaire progressive dans le modèle DMD du rat
Les lésions du tissu musculaire entraînent la nécrose des fibres musculaires qui déclenchent la régénération musculaire en activant le pool de cellules satellites musculaires quiescentes situées à proximité des fibres musculaires.
Le déroulement temporel de la régénération musculaire dans le tibia antérieur des rats R- DMDdel52 a été évalué, en utilisant l'immunofluorescence pour la chaîne lourde de myosine embryonnaire (eMHC), un marqueur spécifique des myofibres en développement et en régénération sur des coupes histologiques de muscles squelettiques.
Une immunohistochimie est ainsi réalisée sur cryosections : Les muscles frais congelés ont été sectionnés avec le cryostat Leica CM3050S (Leica Biosystems) à 7 pim d'épaisseur sur des lames Super Frost Plus (Thermo scientific, 10149870) et conservés à -80°C. Les lames ont été décongelées pendant environ 20 minutes à température ambiante, réhydratées pendant 5 minutes dans du PBS 1 X et ensuite fixées avec du PFA à 4% dans du PBS 1 X pendant 10 minutes à 4°C. Après des lavages dans du PBS I X, les lames ont été placées dans une solution froide d'acétone et de méthanol (1 :1 ) pendant 6 minutes à -20°C, puis incubées avec de la BSA à 10% pendant 1 heure de blocage. Les anticorps primaires ont été ajoutés à 1% de BSA et incubés pendant la nuit (O/N) à 4°C.
Les anticorps primaires suivants ont été utilisés : Pax7 (Santa Cruz Biotechnology, sc-81648), ki67 (Abeam, sp6 abl 6667), Cdkn2a (Abeam Anti-CDKN2A/pl 6INK4a, Abl 08349), Cdknl a (Thermofisher, bs-10129R) et yH2AX (Abeam, abl 1 174) . Après des lavages répétés, les lames ont été incubées avec des anticorps secondaires de type Alexa fluor pendant 45minutes à température ambiante. La coloration de la laminine a été réalisée après l'incubation des anticorps secondaires, pendant I h à 37°C en utilisant un anticorps conjugué (NB300-144AF647) .
Les noyaux ont été colorés avec du Hoechst (Sigma-Aldrich, B2261 ). La fluorescence a été analysée avec un appareil confocal LSM800. Les immunomarquages de la chaîne lourde de la myosine embryonnaire (eMHC), de la dystrophine et du |3-dystroglycane ont été réalisés sans fixation et avec une perméabilisation dans du Triton à 0,5 % dans du PBS I X pendant 5 minutes. L'eMHC (sc-53091 ), la dystrophine (Leica, DYS2-CE), le |3-dystroglycane (Leica, B-DG-CE) et la laminine (Sigma-Aldrich, L9393) ont été incubés à l'air libre.
L'incubation des anticorps secondaires et la coloration des noyaux ont été effectuées comme décrit ci-dessus. La fluorescence a été analysée avec un appareil confocal LSM800.
Un grand nombre de myofibres positives à l'eMHC dans les TA des rats R-DMDdel52 âgés de 3 semaines est observé, alors qu'elles étaient complètement absentes dans les muscles WT (Fig. 2A) .
Une forte diminution du nombre de fibres en régénération a été observé au fil du temps (Fig. 2A-B), indiquant une réduction progressive de la régénération musculaire au cours de la progression de la dystrophie musculaire.
En revanche, bien qu'il soit légèrement augmenté chez les rats R-DMDdel52 par rapport aux rats WT, le processus de régénération est stable et limité au cours de la progression pathologique dans les muscles extra-oculaires.
Ces données suggèrent que les MEO présentent des performances de régénération accrues par rapport aux autres muscles.
La capacité de régénération des muscles squelettiques étant liée aux cellules satellites, nous avons décidé d'évaluer le nombre et le statut myogénique des CSM in vivo.
Un co-immunomarquage est réalisé pour Pax7 et Ki67, un marqueur de prolifération et d'activation, sur des coupes histologiques de muscles squelettiques isolées du TA et MEO de rats WT et R-DMDdel52.
Comme le montrent les figures 2E et 2H, aucune différence n'est observée dans le nombre de CSM par fibre entre les muscles TA ou MEO WT et R-DMDdel52 (quantifiés dans les figures 2F et 21), ce qui indique que les CSM ne sont pas perdues au cours de la progression pathologique de la DMD.
Le statut du cycle cellulaire des CSM est ensuite évalué chez les rats WT et R-DMDdel52. On peut dire que dans le muscle TA des rats WT et R-DMDdel52, les CSM ne se divisent qu'à des stades précoces (3 semaines), tout en restant arrêtées dans leur cycle cellulaire à des stades ultérieurs de la pathologie, y compris dans le contexte pathologique de la DMD.
En revanche, une grande partie des CSM analysées sur des coupes histologiques de MEC exprimaient le marqueur de prolifération, Ki67, à la fois dans les échantillons WT et R-DMDdel52 et à tous les stades examinés, y compris chez les rats WT et dystrophiques âgés de 12 mois (Fig.2H-J) .
Ce qui suggère que les CSM des MEO sont très actives dans un contexte WT et conservent leur capacité de régénération chez les animaux R-DMDdel52.
Exemple 3 : Les CSM R-DMDdel52 TA présentent un potentiel myoqénique altéré in vitro :
Pour approfondir les propriétés des CSM WT et R-DMDdel52, les cellules satellites des muscles du Tibialis Anterior et des muscles extra-oculaires ont été isolées et évalué leur capacité proliférative en culture.
Pour cela, les cellules ont été fixées avec du PFA à 4% pendant 10 minutes à 4°C et perméabilisées avec du Triton à 0,5% dans du PBS I X pendant 6 minutes. Après blocage avec 10% de BSA pendant 30minutes à température ambiante, les cellules ont été incubées O/N à 4°C avec les anticorps primaires suivants : Pax7 (Santa Cruz Biotechnology, sc-81648), MyoD (Dako, clone 5.8A, M3512), ki67 (Abeam, sp6 abl 6667), chaîne lourde des myosines sarcomériques (MF20, DSHB, AB_2147781 ) .
Des différences significatives n'ont pas été observées dans les propriétés prolifératives des CSM isolées à partir du TA ou des MEO des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 3 semaines (Fig.3A-C) .
En outre, les cultures de myoblastes dérivés de CSM WT et R-DMDdel52 isolés à partir de contrôles des muscles TA et MEO n'ont pas présenté de différences significatives dans la différenciation myogénique (Fig.3D-G).
On peut constater que les CSM dérivées du TA de rats R-DMDdel52 âgés de 6 mois présentent une diminution du pourcentage de myoblastes MyoD-positifs co-exprimant Ki67 par rapport aux cellules témoins WT (Fig. 31-J) .
Cependant, il n'y a pas de différence de prolifération significative dans les myoblastes isolés à partir de MEO R-DMDdel52 de 6 mois par rapport aux MEO WT, ce qui suggère que les CSM des muscles extra-oculaires R-DMDdel52 conservent leur capacité de prolifération ex vivo (Fig.3l- J).
Ensuite, la différenciation myogénique a été évaluée sur des cellules cultivées isolées à partir de muscles TA des rats WT et R-DMDdel52 à l'âge de 6 mois.
Alors que la différenciation des cultures de cellules myogéniques isolées à partir des MEO de R-DMDdel52 âgés de 6 mois était pratiquement indifférenciable de celle des témoins, un fort déficit de différenciation est observé dans les cultures de cellules R-DMDdel52 isolées à partir des TA des mêmes rats. (Fig.3 K-L) La quantification a montré une réduction importante de l'indice de fusion ainsi que du nombre de noyaux par myotube par mm2 dans les cellules cultivées de R-DMDdel52 TA par rapport aux contrôles WT. (Fig. 3M-N)
À l'inverse, aucun défaut de différenciation significatif n'a été constaté dans les myoblastes isolés des MEO de rats dystrophiques et de rats WT âgés de 6 mois. (Fig. 3M-N)
Afin d'évaluer si les défauts de prolifération et de différenciation observés lors de la culture de cellules isolées à partir de muscles R-DMDdel52 TA sont cellulaires-autonomes, les CSM sont purifiées à partir de muscles de membres par tri FACS avec CD45, CD31 , Terl 19 comme marqueurs d'exclusion et a7-integrin comme marqueur de surface à sélection positive (Fig.S2A), permettant la culture de myoblastes purs dérivés de CSM (Figure 3 O-P) .
Le tri FACS est fait par la méthode suivante : Après dissociation des cellules, les cellules isolées du membre postérieur ont été incubées avec CD45-PE-Cy7 (BD Pharmingen, 552848), Terl 19-PE-Cy7 (BD Pharmingen, 557853), CD31 -PE-Cy7 (BD Pharmingen, 561410), a7-intégrine-FITC (CliniSciences, Cl 79570-100) pendant 45minutes à 4°C. Après des lavages avec du HBSS supplémenté en DNase (Sigma-Aldrich, DN25), les cellules sont incubées avec le colorant vital 7- AAD (BD Pharmingen, 559925) et triées avec le dispositif BD FacsAria. La population de CSM a été identifiée comme CD45:Terl 19:CD31-négative et a7-intégrine-positive.
Une diminution du potentiel prolifératif est observée dans les cellules R-DMDdel52 triées, comme le montre le nombre inférieur de myoblastes (Pax7±:MyoD±) marqués à I'EdU (Fig. 3Q) dans les cellules cultivées provenant de muscles de membres dystrophiques.
Les cellules satellites musculaires triées R-DMDdel52 présentent également de fortes déficiences dans la différenciation myogénique avec la formation de petits myotubes avec moins de noyaux par rapport aux cellules WT (Fig. 3R-S) .
Dans l'ensemble, ces données démontrent que la prolifération et la différenciation sont altérées dans les CSM isolées des muscles des membres R-DMDdel52, alors que les CSM des MEO dystrophiques conservent leur potentiel.
Exemple 4 : Les cellules satellites du muscle Tibialis anterior R-DMDdel52 expriment des marqueurs de sénescence
Afin d'étudier les changements moléculaires et cellulaires survenant dans les muscles de rats dystrophiques, une scRNA-seq est réalisée à partir de muscles TA de rats R-DMDdel52 et WT âgés de 12 mois.
En effet, les cellules des muscles du TA et extra-oculaires sont extraites chez des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois et immédiatement digérés avec 3U/ml de Dispose II (Roche, 4942078001 ) et 0,5u/ml de Collagenase A (Roche, 10103586001 ) pendant 20minutes dans du HBSS à 37°C avec une légère agitation.
La suspension cellulaire est passée à travers des filtres à cellules et centrifugée à 600g/minutes pendant 5 minutes, à 4°C. Le surnageant a été éliminé et le culot cellulaire a été remis en suspension dans du sérum bovin fœtal à 20 % (Cat#S1810-500 Dominique Dutscher) dans du DMEM (Cat#41966-029 Gibco) complété par 25ng/ml de bFGF (RP4037, Sigma- Aldrich) avec de la pénicilline/streptomycine à 100 mg/mL. (354234, Life Sciences) recouvertes de matrigel (Sarstedt, #94.6140.802). Les cellules ont crû pendant 48 heures pour évaluer la prolifération. Après 48h de prolifération, les cellules ont été cultivées pendant 5 jours dans du sérum bovin fœtal à 5% pour induire la différenciation.
Après dissociation, les cellules ont été filtrées dans des crépines cellulaires de 100 et 70 m et triées par FACS après incubation dans du DAPI (D9542, Sigma-Aldrich) pour obtenir une suspension cellulaire propre éliminant les cellules mortes et les débris.
Le snRNA-seq est réalisé en utilisant le kit Chromium Next GEM Single Cell 3'Gene Expression V3 ( 10X Genomics) en suivant le protocole de fabrication. Le séquençage a été effectué sur le système NexSeq 550 d'Illumina avec le High Output Kit v2.5 (75 cycles, Illumina 20024906).
Les cellules ont été filtrées en fonction des lectures par échantillon, de la teneur en ARN mitochondrial et ribosomal et des doublets prédits pour obtenir une moyenne de 6247 cellules par échantillon (tableau 2) . L'identité des cellules a été évaluée sur la base de l'expression de marqueurs bien établis et les données ont été visualisées par intégration de voisinage stochastique distribué en T (Jamieson, Andrew R et al. "Exploring nonlinear feature space dimension reduction and data representation in breast Cadx with Laplacian eigenmaps and t-SNE." Medical physics vol. 37,1 (2010): 339-51. doi:10.1 1 18/1.3267037) (t-SNE ; Fig. 4A) . Un total de 9 groupes majeurs de cellules résidant dans les muscles est identifié. (Fig.S2A).
Les cellules WT et R-DMDdel52 sont marquées sur la carte t-SNE, mettant en évidence les changements liés à la maladie au niveau transcriptomique (Fig. 4B). Ces changements étaient évidents pour les CSM qui présentaient des signatures d'expression génique distinctes entre les échantillons WT et R-DMDdel52 (Fig. 4C) .
L'identification des gènes différentiellement exprimés dans le groupe des CSM est ainsi étudiée.
L'induction spécifique de deux marqueurs d'arrêt de croissance et de sénescence dans les CSM R-DMDdel52 par rapport aux témoins est identifiée : les inhibiteurs de la kinase dépendante de la cycline Cdkn l a (p21 ) et Cdkn2a (pl 6lnk4a,Cdkn2a ) (Hernandez-Segura, Alejandra et al. "Hallmarks of Cellular Senescence." Trends in cell biology vol. 28,6 (2018): 436-453. doi:10.1016/j.tcb.2018.02.001 ) (Fig. 4C-D) .
L'expression de Cdknl a et Cdkn2a est observée dans les CSM au niveau protéique par co- immunomarquage avec Pax7 sur des sections musculaires isolées des rats R-DMDdel52 et WT âgés de 6 mois.
La présence de la forme phosphorylée de l'histone H2A gamma X (yH2AX), un marqueur des dommages à l'ADN induits dans les cellules sénescentes (Wang, Zhong et al. “RNA-Seq: a revolutionary tool for transcrip tomics." Nature reviews. Genetics vol. 10,1 (2009) : 57-63. doi:10.1038/nrg2484; Bernadotte, Alexandra et al. “Markers of cellular senescence. Telomere shortening as a marker of cellular senescence." Aging vol. 8,1 (2016) : 3-1 1 . doi:10.18632/aging.100871 ; Dungan, Cory M et al. “In vivo analysis of yH2AX+ cells in skeletal muscle from aged and obese humans." FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology vol. 34,5 (2020) : 7018-7035. doi:10.1096/fj.2020001 1 1 RR) dans les CSM de rats dystrophiques par rapport aux WT (Fig. 4F-H) est également observée.
De manière frappante, la signature de sénescence des CSM in vivo (Cdkn2a, Cdknl a, yH2AX) était associée à la progression de la maladie chez les R-DMDdel52 (Fig. 4H-J) .
Ces données suggèrent que les CSM du TA R-DMDdel52 acquièrent progressivement une signature de sénescence au cours de l'évolution de la maladie, ce qui est cohérent avec la réduction progressive du potentiel régénérateur et les phénotypes observés dans les cultures ex vivo de CSM.
Tableau 2 :
Exemple 5 : Les CSM de patients humains atteints de DMP expriment des marqueurs de sénescence
Afin d'évaluer si la sénescence des cellules souches musculaires chez les rats dystrophiques reproduit la pathologie humaine de la DMD, le potentiel de régénération et la présence d'une signature de sénescence des CSM sur des biopsies deltoïdes humaines provenant de patients atteints de DMD et de patients témoins sont évalués.
Les biopsies musculaires DMD, divisées par classes d'âge (1 -2, 3-4, 5-6, 7-8 ans), et les biopsies de contrôle sont colorées pour la chaîne lourde de la myosine embryonnaire (eMHC) afin de marquer les myofibres en régénération (Fig. 5A) .
La quantification des myofibres positives à l'eMHC a montré une réduction progressive des capacités de régénération des muscles DMD, avec des différences marquées entre les échantillons de stade précoce ( 1 -2 ans) et ceux de 7-8 ans (Fig. 5B).
Des co-immunomarquages de Pax7 avec Cdkn2a et yH2AX sont réalisés sur des coupes histologiques provenant de biopsies DMD et de biopsies témoins afin d'évaluer le statut de sénescence des cellules satellites musculaires humaines.
Les coupes musculaires de patients atteints de DMD présentaient un nombre substantiel de CSM Pax7-positives qui co-exprimaient Cdkn2a (Fig.5C-E) et yH2AX (Fig.5F-H) par rapport aux biopsies de contrôle qui exprimaient à peine Cdkn2a et présentaient de faibles niveaux de yH2AX (Fig.5C-H).
De plus, le nombre de CSM DMD exprimant Cdkn2a augmente avec l'âge (r=0.84, corrélation de Pearson, Fig.7E), sans révélation d' une forte corrélation positive entre les CSM DMD exprimant yH2AX et la progression de la maladie (r=-0.34, corrélation de Pearson, Fig.7H).
Pour conclure, les CSM humaines DMD expriment une signature sénescente précoce et progressive, associée à un déclin graduel du potentiel de régénération musculaire.
Exemple 6 : Les CSM de rat expriment une signature spécifique aux MEOs distincte de celle des TA Les MEO sont prélevés sur des rats WT et R-DMDdel52 âgés de 12 mois et les cellules sont isolées et analysées par scRNAseq avec la plateforme lOx Genomics afin d'identifier les caractéristiques spécifiques des MEO associées à un potentiel régénératif efficace dans la DMD.
Le même protocole que pour les échantillons TA est utilisé pour caractériser les échantillons MEO, identifiant une moyenne de 2505 cellules.
Le profil transcriptomique des CSM du TA et des MEO provenant d'animaux WT et R- DMDdel52 est comparé et l'expression spécifique du gène Pitx2 est détecté (Evano, Brendan et al. "Dynamics of Asymmetric and Symmetric Divisions of Muscle Stem Cells In Vivo and on Artificial Niches." Cell reports vol. 30,10 (2020) : 3195-3206. e7. doi:10.1016/j.celrep.2020.01 .097; Noden, Drew M, and Philippa Francis-West. "The differentiation and morphogenesis of craniofacial muscles." Developmental dynamics : an official publication of the American Association of Anatomists vol. 235,5 (2006) : 1 194-218. doi:10.1002/dvdy .20697) dans les CSM des MEO WT et R-DMDdel52, confirmant l'identité spécifique de ces cellules (Fig. 6A-C) .
Comme prévu, les CSM isolées des MEO ne présentaient pas de signature de sénescence, Cdknl a et Cdkn2a étant exprimées de manière sélective uniquement dans les CSM du TA de R- DMDdel52 (Fig. 6B).
L'absence de transcrits Cdknl a et Cdkn2a est également validé ainsi que l'expression spécifique de TSHR sur les cellules satellites musculaires fraîchement isolées des MEO par qRT-PCR (Fig. 6D) : L'ARN est extrait à l'aide du kit d'isolation d'ARN total RNAqueous-Micro (Invitrogen) et rétrotranscrit à l'aide de la transcriptase inverse Superscript™ III (Invitrogen, 18080093) selon les instructions du fabricant.
La qPCR est réalisée à l'aide du système PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems) et des outils de détection SYBR Green (Applied Biosystems) .
Les résultats sont rapportés en tant qu'expression génique relative (2-DDCT) en utilisant les cellules traitées par le véhicule ou les myoblastes dérivés de l'extra-oculaire comme référence. L'expression génique est normalisée sur les niveaux d'expression de la |3-actine.
Des co-immunomarquages pour Pax7 et les marqueurs de sénescence sont également réalisés :Cdkn2a , Cdknl a et yH2AX (Hernandez-Segura et al. 2018 ; Wang et al, 2009 ; Bernadotte et al, 2016 ; Dungan et al, 2020) (Fig.6E-G), montrant l'absence de leur expression dans les cellules satellites Pax7-positives des MEO.
En effet, les quantifications du pourcentage de Pax7±/ Cdkn2a ±/ Cdknl a ±/ yH2AX± dans les MEOs à 3 semaines, 6 et 12 mois démontrent qu'il n'y a pas de différences entre les échantillons WT et R-DMDdel52.
Ces données confirment que les CSM des MEOs sont protégées de la sénescence et conservent leur potentiel myogénique chez les rats dystrophiques.
Exemple 7 : La signalisation TSHR régule la sénescence dans les myoblastes isolés des MEO des rats R-DMDdel52.
Le TSHR, le récepteur de l'hormone stimulant la thyroïde, est spécifiquement exprimé dans les CSM des MEO (Fig.6A-C). L'expression protéique spécifique du TSHR dans les CSM des MEO est validé par immunofluorescence du TSHR sur des cellules myogéniques fraîchement isolées des muscles extra-oculaires et des membres.
Pour la coloration du TSHR, les cellules ont été perméabilisées pendant 5 minutes avec 0, 1 % de Triton dans du PBS I X, puis incubées O/N avec l'anticorps TSHR (CliniSciences, BS-0003R) . Le jour suivant, les cellules ont été lavées dans du PBS I X et incubées avec des anticorps secondaires de type Alexa fluor pendant 45 minutes à température ambiante. Enfin, les noyaux ont été contre- colorés avec du Hoechst (Sigma-Aldrich, B2261 ). La fluorescence a été analysée avec un appareil confocal LSM800.
Comme le montre la figure 7A, le TSHR est fortement exprimé dans les myoblastes dérivés des MEO au niveau de la membrane cellulaire, tandis que les myoblastes isolés des muscles des membres expriment un niveau faible ou indétectable de TSHR.
Pour évaluer l'importance fonctionnelle de l'expression du TSHR dans les CSM des MEO, les myoblastes ont été isolés des MEO WT et traités avec un antagoniste sélectif du récepteur de la TSH, le ML224 (Neumann et al., 2014) .
Pour cela, les myoblastes dérivés de CSM ont été traités avec 10|JM de ML224 (HY12381 -S, CliniSciences) pendant 2 jours (prolifération) ou 7 jours (différenciation) ou 20 M de Forskoline (F3917, Sigma-Amdrich) (expérience suivante) uniquement pendant 48h. Les cellules témoins ont été traitées avec du DMSO (D8418, Sigma Aldrich) comme véhicule pour le ML224 et la Forskoline.
La prolifération a été mesurée après 24 h de culture en ajoutant au milieu de culture une impulsion de 10 mM de 5-éthynyl-20-désoxyuridine (EdU) pendant 24 h (EdU Click-IT PLUS Kit C10640, Life Technologies) .
L'inhibition de la signalisation du TSHR a compromis la prolifération des myoblastes avec une diminution significative des cellules Pax7±/MyoD±/EdU± par rapport aux cellules traitées avec le véhicule (Fig. 7B-C).
Cette expérience est menée dans des conditions sans sérum afin d'éviter toute stimulation de TSHR par la présence de TSH dans le sérum, ce qui explique la plus faible capacité proliférative des myoblastes des MEO traités avec le véhicule, par rapport aux données présentées précédemment (Fig.3l) .
En outre, les myoblastes des MEO traités par le ML224 ont présenté des défauts de différenciation et ont compromis la formation de myotubes associée à une réduction significative de l'indice de fusion par rapport aux cellules témoins traitées uniquement par le véhicule (Fig. 7D- E).
De plus, les cellules satellites des MEO en culture traitées par l'inhibiteur du TSHR ont induit l'expression de Cdknl a (p21 ) et de Cdkn2a (pl 6) (Fig.7F), suggérant l'acquisition d'une signature de sénescence. Il est frappant de constater que les myoblastes des MEO traités par le ML224 ont présenté un phénotype remarquablement similaire à celui des myoblastes de membres R- DMDdel52 en culture, rappelant les cellules sénescentes (Moustogiannis, Athanasios et al. "The Effects of Muscle Cell Aging on Myogenesis." International journal of molecular sciences vol. 22,7 3721. 2 Apr. 2021 , doi:10.3390/ijms22073721 ) . Ces données démontrent que la signalisation TSH R est nécessaire pour empêcher l'entrée en sénescence et maintenir le potentiel myogénique des CSM dérivées de l'OME dystrophique.
Ensuite, l'hypothèse que la signalisation TSHR pouvait également protéger les myoblastes dérivés des CSM DMD de l'entrée en sénescence a été émise.
Pour valider cette hypothèse, des CSM WT et R-DMDdel52 isolées des muscles des membres ont été traitées avec de la Forskoline, un activateur bien connu de l'adénylate cyclase [Alasbahi & Melzing, 2012) et de la signalisation TSHR.
Il est frappant de constater que les myoblastes R-DMDdel52 traités à la forskoline ont présenté une prolifération restaurée par rapport aux cellules R-DMDdel52 témoins, atteignant la capacité proliférative des cellules WT (Fig.7G-H) .
Il est important de noter que les myoblastes R-DMDdel52 exposés à la forskoline ont aboli l'expression aberrante de Cdknl a (p21 ) et Cdkn2a (pl 6), tandis que les myoblastes R-DMDdel52 traités avec le véhicule ont maintenu l'expression de ces marqueurs de sénescence (Fig. 51-J) .
Enfin, les myoblastes des membres R-DMDdel52 traités par forskoline ont présenté un potentiel de différenciation amélioré par rapport aux cellules R-DMDdel52 témoins, formant des myotubes significativement plus grands avec un indice de fusion plus élevé (Fig. 7K-L) .
Ces données suggèrent que l'activation de la signalisation AMP/PKA peut corriger les défauts de prolifération et de différenciation observés dans les myoblastes R-DMDdel52.
Exemple 8 : Matériel et méthodes
Culture cellulaire
Les muscles des membres postérieurs de rats adultes ont été disséqués et digérés avec 3U/ml de Dispose II (Roche, 4942078001 ) et 0,5u/ml de Collagénase A (Roche, 10103586001 ) pendant 1 h dans du HBSS à 37°C avec une légère agitation. La suspension cellulaire a été passée à travers des filtres cellulaires et centrifugée à 600g/min pendant 5 minutes, à 4°C. Le surnageant a été jeté et le culot cellulaire a été remis en suspension dans du sérum bovin fœtal à 20 % (Cat#S 1810-500 Dominique Dutscher) dans du DMEM (Cat#41966-029 Gibco) complété par 25ng/ml de bFGF (RP4037, Sigma- Aldrich) avec de la pénicilline/streptomycine à 100 mg/mL, et placé sur des lames à 8 chambres recouvertes de Matrigel (354234, Life Sciences) (Sarstedt, #94.6140.802). Les cellules ont été transduites 24h après la mise en place et analysées 72 heures après la transduction.
Immunofluorescence des cellules cultivées
Les cellules ont été fixées avec du PFA à 4% pendant 10 minutes à 4°C et perméabilisées avec du Triton à 0,5% dans du PBS 1 X pendant 6 minutes. Après blocage avec 10% de BSA pendant 30min à RT, les cellules ont été incubées O/N à 4°C avec les anticorps primaires suivants : MyoD (Dako, clone 5.8A, M3512), et pl 6 (Abeam Anti-CDKN2A/pl 6INK4a, Ab 108349). Le jour suivant, les cellules ont été lavées dans du PBS I X et incubées avec des anticorps secondaires de type Alexa fluor pendant 45min à température ambiante. Enfin, les noyaux ont été contre-colorés avec du Hoechst (Sigma-Aldrich, B2261 ) . La fluorescence a été analysée avec un appareil confocal LSM800. La fluorescence des tomates a été évaluée avec le microscope EVOS M5000. Le vecteur lentiviral utilisé pour surexprimer TSHR dans notre étude, pLV[Exp]-Tom-CMV>rTshr[NM_012888.2], a été construit et conditionné par VectorBuilder.
Isolation de l'ARN et RT-qPCR
L'ARN a été extrait à l'aide du kit d'isolation d'ARN total RNAqueous-Micro (Invitrogen) et rétrotranscrit à l'aide de la transcriptase inverse Superscript™ III (Invitrogen, 18080093) selon les instructions du fabricant. La qPCR a été réalisée à l'aide du système PCR en temps réel StepOnePlus (Applied Biosystems) et des outils de détection SYBR Green (Applied Biosystems) . Les résultats sont rapportés en tant qu'expression génique relative (2-DDCT) en utilisant les cellules traitées par le véhicule ou les myoblastes dérivés de l'extra-oculaire comme référence. L'expression génique du transcrit du rat a été normalisée sur les niveaux d'expression de la (Sactine. Les séquences des amorces sont les suivantes : Tshr de rat (Pour CTTTGTCCTGTTCGTCCTGC, Rev AGTGAAGGGACTAGCATTGTC) ; |3actine (Pour : TGTCACCAACTGGGACGATA, Rev : GGGGTGTTGAAGGTCTCAAA) .
Résultats
Afin de comprendre si la surexpression du TSHR pourrait avoir un impact sur l'entrée en sénescence des myoblastes DMD, un vecteur lentiviral portant la séquence codante du TSHR et le gène rapporteur Tomato sous le contrôle du promoteur CMV (TSHR Tomato, Fig.8A) ont été générés. Des myoblastes de type sauvage (WT) et des myoblastes DMD ont été isolés à partir de rats âgés de 6 mois et mis en culture. La transduction avec la séquence codante TSHR Tomato ou avec un lentivirus de contrôle portant uniquement le gène Tomato a été réalisée 24 heures après la mise en culture. Les cellules ont été analysées 72 heures après la transduction et l'efficacité de la transduction des myoblastes WT et DMD avec TSHR Tomato ou un lentivirus contrôle (Fig. 8B) a été vérifiée.
La surexpression de TSHR a été validée par qPCR, montrant une plus grande expression du transgène dans les cellules transduites avec TSHR Tomato par rapport aux cellules de contrôle (Fig.SC) . De manière intéressante, les cellules DMD surexprimant TSH R ont une plus faible expression du marqueur de sénescence p! 6 (Fig.SD) démontrant ainsi que TSHR prévient l'entrée en sénescence des myoblastes DMD.
En d'autres termes, une surexpression du récepteur TSHR permettrait de prévenir et traiter la DMD.

Claims

29 REVENDICATIONS
1. Activateur de la voie de signalisation du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) dans des cellules souches musculaires (cellules satellites) pour son utilisation pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence.
2. Activateur selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit activateur est un activateur pharmacologique et/ou génétique.
3. Activateur pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour prévenir et/ou traiter les myopathies, préférentiellement la dystrophie musculaire de Duchenne (DMD).
4. Activateur pour son utilisation selon la revendication 1 ou 2, pour prévenir et/ou traiter la sarcopénie.
5. Activateur pour son utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'activateur pharmacologique est choisi parmi un agoniste du récepteur TSHR ou un activateur de l'adénylate cyclase.
6. Activateur pour son utilisation selon la revendication 5, caractérisé en ce qu'il est un activateur de l'adénylate cyclase, préférentiellement la Forskoline.
7. Activateur pour son utilisation selon la revendication 2, caractérisé en ce que l'activateur génétique consiste en un vecteur choisi parmi un liposome comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , un vecteur adénoviral comprenant la séquence protéique de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2, et un vecteur adénoviral comprenant une séquence CRISPR-Cas9 fusionnée avec un domaine transactivateur préférentiellement choisi parmi VP16, VP64, p65, NCO1A1, FOXO1A pour activer l'expression du TSHR.
8. Activateur pour son utilisation selon la revendication 7, caractérisé en ce que ledit vecteur adénoviral est un virus adéno-associé (AAV), préférentiellement un AAV8 ou un AAV9. 30
9. Combinaison d'un activateur pharmacologique pour son utilisation selon la revendication 5ou 6 et d'un activateur génétique pour son utilisation selon la revendication 7 ou 8.
10. Combinaison pour son utilisation selon la revendication 9, caractérisée en ce que l'activateur pharmacologique est la Forskoline et l'activateur génétique est un virus adéno- associé (AAV) comprenant une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSH R) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1, ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2.
11. Vecteur adénoviral caractérisé en ce qu'il comprend une séquence protéique du récepteur de la thyréostimuline (TSHR) de SEQ ID NO :1 ou un variant fonctionnel ayant une séquence protéique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :1 , ou une séquence nucléotidique du TSHR de SEQ ID NO :2 ou un variant fonctionnel ayant une séquence nucléotidique identique à au moins 60% à la séquence SEQ ID NO :2 pour son utilisation à titre de médicament.
12. Vecteur adénoviral pour son utilisation selon la revendication 1 1, pour préserver et régénérer la structure et la fonction musculaire en bloquant la sénescence.
13. Vecteur adénoviral pour son utilisation selon la revendication 12, pour prévenir et/ou traiter les myopathies, préférentiellement la DMD.
14. Vecteur adénoviral pour son utilisation selon la revendication 12, pour prévenir et/ou traiter la sarcopénie.
15. Vecteur adénoviral pour son utilisation selon l'une des revendications 1 1 à 14, caractérisé en ce que ledit vecteur est un virus adéno-associé (AAV), préférentiellement un AAV8 ou un AAV9.
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