EP4337262A1 - Compositions de conjugues poly-lysine et de micelles et/ou de copolymeres de poly-lysine - Google Patents

Compositions de conjugues poly-lysine et de micelles et/ou de copolymeres de poly-lysine

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Publication number
EP4337262A1
EP4337262A1 EP22729063.2A EP22729063A EP4337262A1 EP 4337262 A1 EP4337262 A1 EP 4337262A1 EP 22729063 A EP22729063 A EP 22729063A EP 4337262 A1 EP4337262 A1 EP 4337262A1
Authority
EP
European Patent Office
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poly
lysine
acid
molecule
composition
Prior art date
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Pending
Application number
EP22729063.2A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Jean-Pascal Zambaux
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PLL Therapeutics SAS
Original Assignee
PLL Therapeutics SAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Definitions

  • the invention relates to compositions of molecules, some being conjugated to specific polymers and others, which cannot be conjugated directly to these polymers, are in the form of copolymers or encapsulated in micelles.
  • Poly-lysine is a homopolypeptide, which can be linear, belonging to the group of cationic polymers. At neutral pH, poly-lysine contains a positively charged hydrophilic amino group. The precursor amino acid, lysine, contains two amino groups, one on the a-carbon and the other on the e-carbon.
  • PTS produced iPr-PLys.HBr, where the terminal ammonium counterion is a bromide ion.
  • Poly-lysine enhances the electrostatic interaction between the negatively charged ions of the cell membrane and the positively charged ions of the attachment factors on the surface of the culture. When adsorbed to the culture surface, it increases the number of positively charged sites available for cell attachment. Poly-lysine exhibits a high positive charge density which allows it to form soluble complexes with negatively charged macromolecules (Park, Tae Gwan; Jeong, Ji Hoon; Kim, Sung Wan (2006-07-07). "Current status of polymeric gene delivery Systems". Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4): 467-486. doi:10.1016/j. addr.2006.03.007. ISSN 0169-409X. PMID 16781003).
  • Poly-lysine homopolymers or block copolymers have been widely used for DNA delivery (Kadlecova, Zuzana; Rajendra, Yashas; Matasci, Mattia; Baldi, Lucia; Hacker, David L.; Wurm, Florian M.; Klok , Harm-Anton (2013-08-10) "DNA delivery with hyperbranched poly-lysine: a comparative study with linear and dendritic poly-lysine". Journal of Controlled Release. 169 (3): 276-288. doi:10.1016 /j.jconrel.2013.01.019. ISSN 1873-4995.
  • Poly-lysine as a highly cationic macromolecule, is efficiently transported into cells by parendocytosis (HuguesJ.-P. Ryser, lain Drummond, Wei-ChiangShen. The cellular uptake of horseradish peroxidase and its poly(lysine) conjugate by cultured fibroblasts is qualitatively similar despite a 900-fold difference in rate, 1982, https://doi.org/10.1002/jcp.1041130126). This Absorption is preceded by strong adsorption to the cell surface, which is due to a nonspecific interaction of the positive charges of the polymer with the negative charges present on the surface of most mammalian cells. Membrane transport of poly-lysine can therefore be described as nonspecific absorptive endocytosis, as opposed to liquid-phase endocytosis or receptor-mediated endocytosis.
  • poly-lysine is supposed to biodegrade physiologically under the hydrolytic action of several proteolytic enzymes, such as endopeptidase tripsin, chemotripsin or exopeptidases aminopeptidases (Hudecz F, Kutassi-Kovács S, Mezö G , Szekerke M. Biodegradability of synthetic branched polypeptide with poly(L-lysine) back-bone. Biol Chem Hoppe Seyler. 1989;370(9):1019-1026. doi:10.1515/bchm3.1989.370.2.1019; Quong D, Yeo JN, Neufeld RJ.
  • proteolytic enzymes such as endopeptidase tripsin, chemotripsin or exopeptidases aminopeptidases
  • the poly-lysine increases the half-life of the molecules with which it is associated.
  • a molecule can be conjugated to poly-lysine if appropriate functional groups are present in the structure of said molecule such that conjugation to poly-lysine can be achieved in an orthogonal manner.
  • the molecules should include functional groups suitable for conjugation to amino group residues within the poly-L-lysine (primary amine available in poly-lysine), such as for example an alcohol, acid or carboxylic, aldehyde, amine, etc., and that they do not contain incompatible functional groups for conjugation to the poly-lysine.
  • some molecules do not include appropriate functional groups to allow orthogonal conjugation to the poly-lysine backbone and/or have incompatible functional groups to effect covalent conjugation with the poly-lysine. This is the case in particular of certain very hydrophobic molecules, such as for example cholesterol, or this is also the case of amino acids. These molecules cannot be conjugated to poly-lysine, and when they are integrated into compositions with poly-lysine, said molecules remain free, are not transported by poly-lysine, so that their bioavailability is weak and identical to that which they present when they are administered alone.
  • the invention proposes:
  • NCA Ncarboxyanhydride
  • composition in liquid form comprising:
  • the invention thus makes it possible to benefit from the advantages of poly-lysine for all molecules, including those which cannot be chemically combined with poly-lysine by the methods known to those skilled in the art.
  • the effectiveness, solubility and bioavailability of all molecules are improved.
  • composition molecules to target the tissues or cells on which the composition molecules must act
  • composition effectiveness of the composition is therefore greater and it is possible to administer lower doses and to reduce the acute or chronic toxicity of the active molecules contained in the composition.
  • a subject of the invention is also a process for the manufacture of the compositions according to the invention.
  • compositions according to the invention can be used as medicament alone or combined with the use of at least one other composition, and the invention also relates to the compositions for their use as medicament.
  • compositions according to the invention can be used as a food supplement or cosmetic composition, alone or combined with the use of another composition, and the invention also relates to the use of these compositions as a food supplement or cosmetic composition.
  • FIG. 1b represents a deprotection scheme: the copolymer of figure la is deprotected for obtain a Poly-(L-Lysine-co-methionine) as a bromide salt.
  • FIG. 2a represents a polymerization scheme L-Cys NCA (trityl) and L-Lys NCA (trifluoroacetate) are mixed and polymerized to obtain the copolymer Poly-(L-lysine-co-L-cysteine).
  • FIG. la represents a deprotection scheme: the copolymer of FIG. la is deprotected to obtain a Poly-(L-lysine-co-L-cysteine) in the form of a bromide salt.
  • DMF dimethylformamide
  • animal within the meaning of the invention, is meant any animal with the exception of the human being.
  • amphiphilic conjugate within the meaning of the invention is meant a conjugate formed by a hydrophobic molecule X and a hydrophilic polymer Y, in particular a poly-lysine, the conjugate thus exhibiting an amphiphilic characteristic.
  • molecule X conjugated to a poly-lysine within the meaning of the invention, is meant a molecule X linked by a covalent bond to a poly-lysine, said bond possibly being preferentially an amide, urea or carbamate bond depending on the chemical nature of molecule X.
  • compositions according to the invention are provided.
  • composition in liquid form comprising:
  • composition according to the invention may comprise:
  • active molecules may be molecules as such (example ascorbic acid) and/or a salt of these molecules (example: ascorbate) and/or an ester of these molecules (example: ascorbic acid ester) and/or of an anhydride (example: ascorbic acid anhydride).
  • composition according to the invention therefore comprises one or more molecule(s) covalently conjugated to the poly-lysine.
  • This type of conjugate is known to those skilled in the art, the bonds between a molecule and the poly-lysine being in particular amide, urea or carbamate bonds depending on the nature and the chemical structure of the molecule concerned. Examples of the production of amide, urea and carbamate bonds are described for example in:
  • Nanoparticles Stabilized with MPEG-Poly-lysine Carbamate Synthesis and Characterization, (carbamate bonds),
  • the molecule(s) covalently conjugated to a poly-lysine are chosen from fatty acids, antioxidants, vitamins and mixtures thereof. They can be chosen in particular from myristic acid, linoleic acid, palmitic acid, palmitoleic acid, lauric acid, oleic acid, orotic acid, spermine, taurine, acid pathothenic acid, azelaic acid, GABA, biotin, thioctic acid, ascorbic acid, acetic acid, propionic acid, butyric acid, pyruvic acid, lactic acid, alpha-tocopherol, pantothenic acid, glutathione , retinoic acid and mixtures thereof.
  • composition according to the invention may comprise hydrophobic molecules that cannot be conjugated with poly-lysine encapsulated in micelles.
  • the poly-lysine non-conjugatable hydrophobic molecules are chemically unsuitable for covalent conjugation, either due to the absence of reactive functional groups or due to chemical incompatibilities.
  • These molecules are highly hydrophobic, preferably, according to the invention, they are molecules having LogP values greater than 1, in particular greater than 2 and preferably greater than 3. They may be, for example, cholesterol, farnesyl- cysteine, co-enzyme Q10 or curcumin.
  • the hydrophobic molecule(s) that cannot be covalently conjugated to a poly-lysine are chosen from cholesterol, co-enzyme Q10, farnesyl cysteine, curcumin and mixtures thereof.
  • the hydrophobic molecule or molecules which cannot be covalently conjugated to a poly-lysine are encapsulated in at least one micelle 10 formed by amphiphilic conjugates each consisting of at least one hydrophobic molecule 14 covalently conjugated to a poly-lysine 12, encapsulating the hydrophobic molecule(s) 16 and not conjugatable covalently to a poly-lysine.
  • conjugates act as polymeric micelles in aqueous medium, generating a hydrophobic pocket, capable of encapsulating hydrophobic molecules that cannot be conjugated to poly-lysine (such as cholesterol, farnesyl cysteine, etc. ), thus considerably improving their solubility and stability in aqueous solution.
  • poly-lysine such as cholesterol, farnesyl cysteine, etc.
  • the micelle(s) encapsulating the hydrophobic molecules which cannot be conjugated with poly-lysine are formed at least by one or more alpha-tocopherol conjugates covalently conjugated to a poly -lysine and/or by one or more retinoic acid conjugates covalently conjugated to a poly-lysine.
  • the micelle(s) encapsulating the hydrophobic molecules that cannot be conjugated with poly-lysine are formed at least by one or more conjugates of conjugated fatty acid(s). ) covalently to a poly-lysine.
  • the fatty acid(s) are preferably chosen from oleic acid, palmitic acid, lauric acid, linoleic acid, azelaic acid, palmitoleic acid, thioctic acid, myristic acid, orotic acid, acetic acid, butyric acid, lactic acid, propionic acid.
  • composition according to the invention in addition to these poly-lysine conjugates, and optionally in addition to hydrophobic molecules not conjugatable to poly-lysine encapsulated in micelles, may comprise at least one molecule conjugated to a poly-lysine by polymerization, that is to say copolymers of said molecule and of poly-lysine. It is in particular a molecule chosen from amino acids, such as for example cysteine or methionine. Indeed, amino acids, whether natural or not, cannot be conjugated to poly-lysine by a covalent bond.
  • these molecules can be integrated into the poly-L-lysine backbone via an appropriate copolymerization of the NCA (Ncarboxyanhydride) monomers to form a copolymer.
  • the molecules that cannot be conjugated with the poly-lysine, in particular the amino acids, are included in the polypeptide backbone of the polymer to form a copolymer.
  • the copolymers have between 5 and 20% of molecules that cannot be covalently conjugated with poly-lysine (in particular amino acids) and between 80 and 95% of poly-lysine.
  • the copolymers have 10% of molecules that cannot be covalently conjugated to poly-lysine (in particular amino acids) and 90% of poly-lysine (ratio of 1 to 10).
  • the copolymerization can be carried out in particular by implementing a polymerization step (for example L-Met NCA or L-Cys NCA and L-Lys NCA are mixed and polymerized to obtain a copolymer) then a step of deprotection of the copolymer obtained after polymerization.
  • a polymerization step for example L-Met NCA or L-Cys NCA and L-Lys NCA are mixed and polymerized to obtain a copolymer
  • a step of deprotection of the copolymer obtained after polymerization Illustrative examples are shown in Figures 1a, 1b (Poly-(L-Lysine-co-methionine), 2a and 2b (Poly-(L-lysine-co-L-cysteine):
  • Lys-TFA The preceding copolymer is deprotected to obtain L-Lys in the form of the bromide salt and L-Cys in its deprotected form.
  • the poly-lysine used in the compositions according to the invention is preferably a poly-L-lysine.
  • Poly-lysine is preferably linear.
  • the poly-lysine used may be an epsilon poly-L-lysine, preferably a poly-L-lysine with a molecular weight of between 12,000 and 20,000 Da.
  • the poly-lysine used in the compositions according to the invention may be a poly-lysine having a bromide or chlorine counterion or trifluoroacetic acid TFA.
  • compositions according to the invention can be in liquid form or in solid form.
  • the composition comprises at least water and the constituents mentioned above.
  • the solid form is preferably obtained from the liquid form, preferably by lyophilization.
  • the composition according to the invention in liquid form comprises micelles and when it is freeze-dried in solid form, the micelles reform when the composition in solid form is again placed in an aqueous solution.
  • a subject of the invention is also a composition in solid form, obtained by lyophilization or atomization or slow dehydration of a composition according to the invention in liquid form.
  • composition according to the invention may also comprise pharmaceutically or cosmetically acceptable excipients.
  • excipients can be chosen in particular to respond to the pH and osmolarity of solutions for injection in humans or animals. They may be, for example, acids or bases to adjust the pH or solutions to adjust the osmolarity, such as NaCl, PBS or a saline phosphate buffer.
  • composition according to the invention is intended in particular to be administered to humans, or to an animal and is therefore in a form suitable for such administration.
  • it is preferably suitable for administration by the subcutaneous route or by the intravenous route, in particular by the intravenous route by infusion, and it is packaged in suitable containers known to those skilled in the art for package this type of product.
  • the composition according to the invention can also be administered in liquid form via a pump, of the insulin pump type.
  • transcutaneously and it is preferably formulated and packaged in the form of a patch, or
  • transmucosal route by transmucosal route and it is preferably formulated and packaged in the form of a mucoadhesive tablet.
  • composition C1 comprising at least:
  • conjugates each conjugate consisting of a molecule covalently bonded to a poly-lysine:
  • composition C1 the amount of butyric acid in composition C1 is greater than that of each of the other molecules taken individually, and/or
  • composition C1 the amount of thioctic acid in composition C1 is greater than that of each of the other molecules taken individually, except butyric acid, and/or
  • the amount of lauric acid in composition C1 is greater than that of each of the following molecules taken individually:, palmitic acid, linoleic acid, azelaic acid, farnesyl cysteine, palmitoleic acid, cholesterol , myristic acid, orotic acid,
  • the amount of oleic acid on the one hand and lactic acid on the other in composition C1 is greater than that of each of the following molecules taken individually: palmitic acid, lauric acid, linoleic acid , azelaic acid, farnesyl cysteine, palmitoleic acid, cholesterol, myristic acid, orotic acid, acetic acid.
  • each of the active molecules in composition C1 represents between 0.5 E-05 M and 10 E-05 M.
  • composition C2 comprising at least:
  • conjugates each conjugate consisting of a molecule covalently bonded to a poly-lysine:
  • methionine-Poly-L-Lysine copolymers and cysteine-Poly-L-Lysine copolymers the methionine and/or the cysteine possibly being replaced by an ester or a salt or an anhydride of these molecules.
  • composition C2 the amount of retinoic acid in composition C2 is greater than that of each of the other molecules taken individually, and/or
  • composition C2 the amount of taurine, the amount of methionine and the amount of GABA are equivalent in composition C2 and are each greater than that of each of the other molecules taken individually, except for retinoic acid and coenzyme Q10.
  • each of the active molecules in composition C2 represents between 6 E-05 M and 18 E-05 M.
  • compositions according to the invention can be manufactured by any suitable process.
  • a particularly suitable manufacturing process comprises the following steps:
  • premix mix in an aqueous solution (preferably water) one or more conjugates of a molecule conjugable with poly-lysine,
  • amphiphilic premix adds to the amphiphilic premix at least one hydrophobic molecule that cannot be combined with polylysine (for example cholesterol, farnesyl-cysteine, co-enzyme Q10, etc.), and stir to form micelles formed by one or more conjugates of the amphiphile premix encapsulating this or these hydrophobic molecule(s) which cannot be conjugated to poly-lysine, and/or
  • polylysine for example cholesterol, farnesyl-cysteine, co-enzyme Q10, etc.
  • a process for manufacturing a composition according to the invention comprises at least one hydrophobic molecule which cannot be covalently conjugated to a poly-lysine, encapsulated in a micelle formed by amphiphilic conjugates each consisting of at least one hydrophobic molecule conjugated with covalently to a poly-lysine, characterized in that it comprises the following steps:
  • a variant of the invention consists in taking advantage of the amphiphilic nature of certain poly-lysine conjugates (in particular poly-lysine fatty acid conjugates), to create an amphiphilic premix which allows the controlled solubilization of highly hydrophobic molecules not conjugatable with poly-lysine.
  • the solubilization process according to a preferred embodiment consists of a controlled addition of the hydrophobic molecules to the amphiphilic premix and allowing the time necessary for their dissolution under stirring.
  • the stirring in step b. is carried out for at least 5 minutes, even more preferably between 5 and 20 minutes, and preferably at a stirring speed of less than or equal to 900 revolutions per minute, in particular at a stirring speed of between 50 and 800 revolutions per minute.
  • the poly-lysine conjugates and other molecules should be dissolved and formulated in water. It is possible to add appropriate salts such as PBS/NaCl afterwards, but these should not be used beforehand. Indeed, the use of salts such as PBS or NaCl in steps a. and/or b. prevents the formation of micelles does not allow to obtain a clear solution and the solubilization is not optimized. If PBS or Nacl is used, it should preferably be used after formation of the micelles and once the solution is clear.
  • the manufacturing method according to the invention also comprises a step d. separation of the soluble and insoluble phases, to recover the soluble phase.
  • the insoluble phase is eliminated and the soluble phase constitutes the composition according to the invention.
  • a physical separation process filtration, ultrafiltration is preferably carried out to ensure the isolation of the soluble fraction, containing both the amphiphilic premix, the copolymers and/or the solubilized encapsulated hydrophobic molecules.
  • the premix of step a. also comprises one or more copolymer(s) of a molecule conjugated to a poly-lysine by polymerization and/or in a step c. which is implemented after step b. or after step d., one or more poly-lysine conjugated molecule copolymer(s) are added to the mixture.
  • the premix from step a. may also comprise one or more other molecules covalently conjugated to a poly-lysine and/or only after step b. or d., one or more other molecules covalently conjugated to a poly-lysine are added to the mixture.
  • the process for manufacturing a composition according to the invention comprises at least one molecule conjugated with a poly-lysine by polymerization, said at least one molecule and the poly-lysine forming a copolymer, characterized in that it comprises the mixture of said at least one copolymer with at least one molecule covalently conjugated to a poly-lysine.
  • the composition in liquid form can then be lyophilized or dehydrated to be in the form solid.
  • the method according to the invention may in fact comprise a step of freeze-drying or of atomization or of slow dehydration of the liquid composition obtained beforehand to obtain a solid composition, then a step of solubilization of this solid composition.
  • the drying step is carried out by slow lyophilization, for example between 12 and 36 hours.
  • poly-lysine conjugates and/or co-polymers of the composition are not integrated into the premix of step a or c, these can be added to the mixture after step b. that is to say after the formation of the micelles and the encapsulation of the co-enzyme Q10.
  • the active molecule-polymer conjugates can be manufactured by any means known to those skilled in the art for conjugating a molecule covalently to a polymer depending on their chemical nature. For example:
  • pantothenic acid aminobutyric acid, biotin, alpha tocopherol, GABA, lauric acid, myristic acid, palmitic acid, oleic acid, linoleic acid, orotic acid, azelaic acid, thioctic acid, acetic acid, palmitoleic acid, butyric acid, lactic acid, propionic acid, retinoic acid and oleic acid are conjugated to poly-lysine by an amide bond.
  • the copolymers can be made by any means known to those skilled in the art.
  • the molecules, in particular the molecules of amino acids, are incorporated into the structure of the polymer preferentially in the presence of an anhydrous solvent and according to one embodiment in a ratio of 1 molecule of cysteine or methionine for 10 monomers of the polymer.
  • compositions according to the invention can be used in particular as a medicament, to prevent and/or treat pathologies, in particular in humans or animals, that is to say for a human or animal subject, depending on the molecules that 'they contain.
  • compositions according to the invention can be used as a food supplement or else as a cosmetic composition.
  • Example of composition C1 is a generic formulation particularly suitable for preventing and/or treating multifactorial diseases, in particular chronic multifactorial diseases, and in particular diseases involving intestinal permeability.
  • the different molecules present act in synergy and in particular make it possible to restore the function of intestinal permeability.
  • composition C1 can be used to restore the function of the intestinal membrane and/or to maintain intestinal permeability and/or to prevent or combat hyperpermeability of the intestinal mucosa.
  • composition C1 can be used as a food supplement in a healthy person or a healthy animal, in particular to reduce the intestinal permeability of the person or animal for whom it is intended.
  • composition C1 can in particular be administered to humans or animals to prevent or combat diseases in which the intestine plays an important role, in particular chronic diseases, and in particular chronic degenerative diseases, such as neurodegenerative diseases such as for example Charcot's disease.
  • Composition C1 can also be used as an activator of the immune system for preventing or combating autoimmune and infectious diseases.
  • the composition can be used in particular to reduce the chronicity of chronic diseases.
  • composition C1 is used in prevention or treatment from the first symptoms of intestinal hyperpermeability or of a chronic disease, so as to prevent the development of the chronicity of said disease and thus avoid the inflammatory storm which results prolonged intestinal hyperpermeability.
  • composition C1 is particularly useful for at least:
  • a subject of the invention is therefore also a composition C1 according to the invention for its use as a medicament, in particular in humans or animals, that is to say for a human or animal subject.
  • composition C1 can be used in the prevention and/or treatment of a multifactorial pathology, in particular a chronic multifactorial pathology, in particular a pathology chosen from inflammatory diseases, neurodegenerative diseases, bacterial diseases, viral diseases, autoimmune diseases, food allergies and intolerances.
  • composition C1 can be used in the prevention and/or treatment of a pathology chosen from eczema, psoriasis, chronic inflammatory bowel diseases (in particular Crohn's and Celiac disease), Alzheimer's disease, Parkinson's, multiple sclerosis, Charcot's disease.
  • Composition C2 is a formulation particularly suitable for preventing and/or treating multifactorial diseases, in particular chronic multifactorial diseases.
  • Composition C2 is particularly useful for the prevention and treatment of neurodegenerative, autoimmune, infectious diseases or cancers. In particular, it is highly effective in the prevention and treatment of Charcot's disease.
  • the C2 composition intervenes on the classic and known processes to reduce the chronicity of the diseases. Its action is particularly suitable for neurodegenerative, autoimmune, cancer and infectious diseases.
  • antioxidant in particular thanks to the presence of taurine, cysteine, methionine, spermine, pantothenic acid, alpha-tocopherol, co-enzyme Q10, glutathione, ascorbic acid,
  • the different molecules present act in synergy and make it possible in particular to prevent or fight against the factors at the origin of chronic diseases and in particular Charcot's disease.
  • composition C2 can be used to prevent and/or combat chronic diseases, in particular to act on the specific metabolisms of the pathology.
  • Composition C2 can be used in particular to reduce the chronicity of chronic diseases.
  • composition C2 is used in prevention or in treatment from the first symptoms of a chronic disease, in particular a neurodegenerative disease and specifically Charcot's disease.
  • Composition C2 according to the invention can be used as a medicament, in particular in humans or animals, that is to say for a human or animal subject.
  • composition C2 can be used in the prevention and/or treatment of a multifactorial pathology, in particular a chronic multifactorial pathology, in particular a pathology chosen from inflammatory diseases, neurodegenerative diseases, bacterial diseases, viral diseases, autoimmune diseases, food allergies and intolerances, and in particular Charcot's disease.
  • a multifactorial pathology in particular a chronic multifactorial pathology, in particular a pathology chosen from inflammatory diseases, neurodegenerative diseases, bacterial diseases, viral diseases, autoimmune diseases, food allergies and intolerances, and in particular Charcot's disease.
  • composition C2 can be used with composition C1, simultaneously or sequenced over time.
  • Example 1 Composition C1 An example of composition C1 suitable for tests on mice is presented below.
  • Each conjugate was weighed into a sterile 50 ml centrifuge tube, and dissolved in 30 ml water, using a vortex. Each conjugate was stirred for between 10 and 20 minutes depending on the solubility of the conjugate.
  • composition C2 suitable for tests on mice is presented below.
  • the solid was stored in a sterile centrifuge tube at -20°C until use.
  • the 50 ml centrifuge tubes previously prepared with the conjugates and copolymers were taken out and allowed to warm to room temperature. After this time, 30 ml of water was added to each centrifuge tube.
  • the conjugates and copolymers were dissolved using a vortex, stirring for a time between 10 and 20 minutes, depending on the solubility of the conjugates and copolymers.
  • the centrifuge tube containing coenzyme Q10 was also removed from the freezer and allowed to warm to room temperature.
  • a sterile 500 ml bottle was taken and fitted with a magnetic bar. 27.3 ml of each previously prepared conjugate solution were added to the flask with magnetic stirring (700 revolutions per minute).
  • Coenzyme Q10 was added and the mixture was stirred for 2 hours (700 rpm).
  • the 166 vials were placed in the steel freeze-drying pan and a one-day freeze-drying cycle was initiated.
  • composition C1 suitable for tests on rats is presented below.
  • the process for manufacturing the composition is similar to that presented in Example 1.
  • the concentrations of each of the constituents are different and presented in Table 5.
  • the sum of the concentrations of PLL+cholesterol+farnesylcysteine conjugates for C1 10X is 13.2 mg/mL.
  • the sum of the concentrations of the PLL+cholesterol+farnesylcysteine conjugates for C1 1X is 1.32 mg/ml.
  • composition C1 suitable for humans is presented below.
  • the process for manufacturing the composition is similar to that presented in Example 1.
  • the concentrations of each of the constituents are different and presented in Table 6.
  • composition C2 suitable for humans is presented below.
  • composition C1 for restoring intestinal permeability
  • the aim of this study is to evaluate the efficacy of an injectable formulation according to the invention on the restoration of intestinal permeability following the induction of intestinal inflammation induced by sodium dextran sulphate (DSS) in the rat.
  • DSS sodium dextran sulphate
  • the intestinal epithelium is a dynamic barrier which limits the access of bacteria, parasites, viruses but also of certain chemical molecules to the tissues of the host. It is composed of different types of cells, each with a well-defined role, such as enterocytes responsible for the function of absorbing nutrients, goblet cells secreting mucus whose thickness keeps bacteria and other microorganisms away from enterocytes, Paneth cells, located at the bottom of the crypts of the small intestine, participating in the maintenance of homeostasis and the role of defense of the intestinal mucosa via the secretion of defensin-type antimicrobial agents and microfold cells called M cells, specialized in the endocytosis of antigens, molecules or even microorganisms present in the intestinal lumen.
  • enterocytes responsible for the function of absorbing nutrients
  • goblet cells secreting mucus whose thickness keeps bacteria and other microorganisms away from enterocytes
  • Paneth cells located at the bottom of the crypts of the small intestine
  • the epithelial physical barrier provided by the enterocytes is reinforced by a layer of glycocalyx and thick mucus (thinner layer at the level of the M cells to more easily access the microbiome of the intestinal lumen) and IgA secretion by enterocyte transcytosis produced by the plasma cells under -lyings.
  • Epithelial cells form a monolayer of polarized cells resting on the lamina intestinal via their basolateral pole and tightly bound together by tight junctions. In this lamina intestinal, the Peyer's patches are located, made up of follicles rich in lymphocytes, the initiating site of pro or anti-inflammatory responses.
  • composition tested in this study is composition C1 of example 3.
  • the intestinal epithelium is a dynamic barrier which limits the access of bacteria, parasites, viruses but also of certain chemical molecules to the tissues of the host. It is composed of different types of cells, each with a well-defined role, such as enterocytes responsible for the absorption function of the intestine, goblet cells secreting mucus, M cells responsible for the passage of macromolecules and Antigens from the intestinal lumen ( Lamina Propria) to underlying immune cells as well as neuroendocrine cells.
  • enterocytes responsible for the absorption function of the intestine
  • goblet cells secreting mucus M cells responsible for the passage of macromolecules
  • Antigens from the intestinal lumen Lamina Propria
  • the epithelial physical barrier provided by enterocytes is reinforced by a layer of glycocalyx and thick mucus. Epithelial cells form a monolayer of polarized cells resting on the laminalitis via their basolateral pole and tightly bound together by tight junctions.
  • the main objective of the study is to demonstrate the effectiveness of the invention on the remediation of intestinal permeability following the induction of chronic intestinal inflammation.
  • composition C1 of Example 3 administered by subcutaneous injection after induction of intestinal inflammation.
  • DSS Dextran Sodium Sulfate
  • the accommodation conditions were as follows: temperature 20-24°C, humidity 60 plus or minus 10%, cycle 12h/12h.
  • composition C1 The administrations of composition C1 were carried out once a day. If signs of pain were observed, the animal concerned was isolated and paracetamol (200 mg/kg) was administered to it by gavage twice a day. These animals were removed from the experimental scheme. If a significant weight loss was observed, the animals were sacrificed when they reached 80% of their initial weight. Finally, the animals were sacrificed if they presented an unusual attitude indicating discomfort.
  • the accommodation conditions were as follows: temperature 20-24°C, humidity 60 plus or minus 10%, cycle 12h/12h.
  • the results make it possible to determine an inflammation severity index which represents the average of the scores obtained for stool consistency and rectal bleeding.
  • the weight loss represents the percentage difference in weight of the rats ((JX ⁇ J0)/J0)*100).
  • the animals were anesthetized (cf. organ sampling) and various samples were taken: blood, small intestine, cecum, colon, liver, spleen and several parameters evaluated: size of the cecum, weight of the liver , spleen, and caecum.
  • a permeability study was carried out on an isolated organ (jejunum or colon) to determine the effectiveness of the dose of composition C1 on the restoration of intestinal permeability.
  • This ex vivo approach uses a jejunum or colon fragment from the rat digestive tract. Rats were anesthetized by isoflurane inhalation (1000mg/g) with an induction of 3% and an intraoperative maintenance of 1.5%. After laparotomy and ligation of the celiac artery attached to the esophagus, a 10 cm fragment of jejunum or colon was removed. The sample was weighed. The rats were then sacrificed by injection of sodium pentobarbital (12 mg/100g).
  • the serous and mucous compartments of the organ were quickly flushed with serum physiological (37°C) and the organ was everted.
  • a ligature was performed at one end. The second end allows the introduction of 1 mL of Krebs-Henseleit medium. This extremity was then ligated, the organ was weighed and then placed in a tank containing 10 mL of Krebs-Henseleit survival medium supplemented with 250 mg of FITC-dextran of 4 Kda (mucous compartment).
  • the everted organs were maintained at 37° C. and oxygenated with an O2/CO2 mixture (95%/5%).
  • the medium of the mucous compartment was agitated by carrying out 3 cycles of aspiration-discharge using a 1 mL micropipette. After 2 hours of incubation, a sample of 1 mL was taken from the mucosal side.
  • the organs were removed from the glass tank and one end was cut off.
  • the serous medium was collected in a previously weighed tube. After sampling, the tube was weighed again in order to evaluate the transfer of survival medium during the experiment. After weighing, the FITC-Dextran was assayed by fluorometry in duplicate (excitation, 490 nm; emission, 530 nm).
  • the dosage of FITC Dextran 4KDa in the plasma makes it possible to clearly discriminate the impact of composition C1 according to the invention on the rats having received 2% of DSS, the fluorescence found in the blood is identical to that of the control.
  • Concerning the analysis of the permeability of the intestinal membrane the results of the ex vivo tests 10 days after the injection of composition C1 into the 2% DSS rats, on isolated organs (the permeability on isolated organs was carried out on a fragment of distal jejunum (5 cm) and on the ileum (5 cm) by measurement of FITC-dextran, are presented in Table 17.

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Abstract

La présente invention concerne une composition comprenant : - au moins une molécule conjuguée de façon covalente à une poly-lysine, et - au moins une molécule hydrophobe et non conjugable de façon covalente à une poly-lysine, ladite molécule étant encapsulée dans une micelle, et/ou au moins une molécule conjuguée à une poly- lysine par polymérisation, ladite molécule et la poly-lysine formant un copolymère. L'invention a également pour objet son procédé de fabrication et ses utilisations.

Description

COMPOSITIONS DE CONJUGUES POLY-LYSINE ET DE MICELLES ET/OU DE COPOLYMERES DE POLY-LYSINE
Domaine technique
L'invention concerne des compositions de molécules, certains étant conjuguées à des polymères spécifiques et d'autres, non conjugables directement à ces polymères, sont sous forme de copolymères ou encapsulées dans des micelles. Etat de l'art
Pour augmenter l'efficacité et la biodisponibilité de certaines molécules dans des compositions thérapeutiques, nutritionnelles ou cosmétiques, il est connu de conjuguer lesdites molécules à des polymères spécifiques, comme la poly-lysine, et en particulier la poly-L-lysine.
La poly-lysine est un homopolypeptide, qui peut être linéaire, appartenant au groupe des polymères cationiques. À pH neutre, la poly-lysine contient un groupe amino hydrophile chargé positivement. L'acide aminé précurseur, la lysine, contient deux groupes amino, l'un sur le carbone a et l'autre sur le carbone e. Au cours du développement du projet PNOS, PTS a produit iPr-PLys.HBr, où le contre- ion de l'ammonium terminal est un ion bromure.
La poly-lysine renforce l'interaction électrostatique entre les ions à charge négative de la membrane cellulaire et les ions à charge positive des facteurs de fixation à la surface de la culture. Lorsqu'elle est adsorbée à la surface de la culture, elle augmente le nombre de sites à charge positive disponibles pour la fixation des cellules. La poly-lysine présente une densité de charge positive élevée qui lui permet de former des complexes solubles avec des macromolécules chargées négativement (Park, Tae Gwan; Jeong, Ji Hoon; Kim, Sung Wan (2006-07-07). "Current status of polymeric gene delivery Systems". Advanced Drug Delivery Reviews. 58 (4): 467-486. doi :10.1016/j. addr.2006.03.007. ISSN 0169-409X. PMID 16781003). Les homopolymères ou les copolymères séquencés de poly-lysine ont été largement utilisés pour la délivrance d'ADN (Kadlecova, Zuzana; Rajendra, Yashas; Matasci, Mattia; Baldi, Lucia; Hacker, David L.; Wurm, Florian M.; Klok, Harm-Anton (2013-08-10). "DNA delivery with hyperbranched poly-lysine: a comparative study with linear and dendritic poly-lysine". Journal of Controlled Release. 169 (3): 276-288. doi:10.1016/j.jconrel.2013.01.019. ISSN 1873-4995. PMID 23379996) et de protéines (Jiang, Yuhang; Arounleut, Phonepasong; Rheiner, Steven; Bae, Younsoo; Kabanov, Alexander V.; Milligan, Carol; Manickam, Devika S. (2016-06-10). "SOD1 nanozyme with reduced toxicity and MPS accumulation". Journal of Controlled Release. 231: 38 -49. doi:10.1016/j.jconrel.2016.02.038. ISSN 1873-4995. PMID 26928528).
La poly-lysine, en tant que macromolécule fortement cationique, est efficacement transportée dans les cellules parendocytose (HuguesJ.-P. Ryser, lain Drummond, Wei-ChiangShen. The cellular uptake of horseradish peroxidase and its poly(lysine) conjugate by cultured fibroblasts is qualitatively similar despite a 900-fold différence in rate, 1982, https://doi.org/10.1002/jcp.1041130126). Cette absorption est précédée d'une forte adsorption à la surface des cellules, qui est due à une interaction non spécifique des charges positives du polymère avec les charges négatives présentes à la surface de la plupart des cellules mammaliennes. Le transport membranaire de la poly-lysine peut donc être décrit comme une endocytose absorptive non spécifique, par opposition à l'endocytose en phase liquide ou à l'endocytose médiée par les récepteurs.
Étant donné sa nature polypeptidique, la poly-lysine est censée se biodégrader physiologi-quement sous l'action hydrolytique de plusieurs enzymes protéolytiques, comme l'endopeptidase tripsin, la chimotripsine ou les exopeptidases aminopeptidases (Hudecz F, Kutassi-Kovács S, Mezö G, Szekerke M. Biodegradability of synthetic branched polypeptide with poly(L-lysine) back-bone. Biol Chem Hoppe Seyler. 1989;370(9):1019-1026. doi:10.1515/bchm3.1989.370.2.1019 ; Quong D, Yeo JN, Neufeld RJ. Stability of chitosan and poly-L-lysine membranes coating DNA-alginate beads when exposed to hydrolytic enzymes. J Microencapsul. 1999;16(l):73-82. doi:10.1080/026520499289329 ; The Action of Trypsin on Poly-lysine BY S. G. WALEY Aim J. WAT-SON, 1953.
Avantageusement, la poly-lysine augmentation la demi-vie des molécules auxquelles elle est associée. De plus, du fait de son caractères amphiphile elle permet le passage de la Barrière Hémato Encéphalique.
Une molécule peut être conjuguée à la poly-lysine si des groupes fonctionnels appropriés sont présents dans la structure de ladite molécule de telle sorte que la conjugaison à la poly--lysine puisse être réalisée d'une manière orthogonale. En particulier il convient que les molécules comportent des groupes fonctionnels appropriés pour la conjugaison à des résidus de groupe amino au sein de la poly-L-lysine (amine primaire disponible dans les poly-lysine), tels que par exemple un groupe alcool, acide carboxylique, aldéhyde, amine, etc, et qu'elles ne comportent pas de groupes fonctionnels incompatibles pour une conjugaison à la poly-lysine.
Toutefois, certaines molécules n'incluent pas de groupes fonctionnels appropriés pour permettre la conjugaison orthogonale au squelette poly-lysine et/ou comportent des groupes fonctionnels incompatibles pour effectuer une conjugaison de façon covalente avec la poly-lysine. C'est le cas notamment de certaines molécules très hydrophobes, comme par exemple le cholestérol, ou c'est le cas également des acides aminés. Ces molécules ne peuvent pas être conjuguées à la poly-lysine, et lorsqu'elles sont intégrées dans des compositions avec de la poly-lysine, lesdites molécules restent libres, ne sont pas transportées par la poly-lysine, si bien que leur biodisponibilité est faible et identique à celle qu'elles présentent lorsqu'elles sont administrées seules.
Résumé de l'invention
Pour répondre à cette problématique, l'invention propose :
- d'encapsuler dans des micelles les molécules hydrophobes non conjugables à la poly-lysine, en particulier de les encapsuler, de les piéger, dans des structures micellaires préférentiellement formées par des conjugués poly-lysine, et
- d'intégrer au squelette poly-lysine les autres molécules non conjugables de façon covalente comme les acides aminés, via une copolymérisation des monomères Ncarboxyanhydrides (NCA).
Ainsi l'invention a pour objet une composition sous forme liquide comprenant :
- au moins une molécule (i) conjuguée de façon covalente à une poly-lysine, et
- au moins une molécule (ii) hydrophobe et non conjugable de façon covalente à une poly-lysine, ladite molécule (ii) étant encapsulée dans une micelle, et/ou au moins une molécule (iii) conjuguée à une poly-lysine par polymérisation, ladite molécule (iii) et la poly-lysine formant un copolymère.
Avantageusement, l'invention permet ainsi que bénéficier des avantages de la poly-lysine pour toutes les molécules, y compris celles qui ne sont chimiquement pas conjugables à la poly-lysine par les méthodes connues de l'homme du métier. Ainsi l'efficacité, la solubilité et la biodisponibilité de toutes les molécules sont améliorée.
Cette configuration permet en particulier :
- d'augmenter la demi-vie des molécules actives de la composition dans l'organisme,
- de cibler les tissus ou les cellules sur lesquelles les molécules de composition doivent agir,
- de permettre aux molécules actives de la composition de passer la Barrière Hémato Encéphalique et de pénétrer dans les cellules, notamment dans les neurones et les motoneurones,
- d'augmenter la stabilité et la biodisponibilité de l'actif.
L'efficacité de la composition est donc plus importante et il est possible d'administrer des doses plus faibles et de réduire la toxicité aigüe ou chronique des molécules actives contenues dans la composition.
L'invention a également pour objet un procédé de fabrication des compositions selon l'invention.
Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées comme médicament seules ou combinées à l'utilisation d'au moins une autre composition, et l'invention vise aussi les compositions pour leur utilisation comme médicament.
Enfin, les compositions selon l'invention peuvent être utilisées comme complément alimentaire ou composition cosmétique, seules ou combinées à l'utilisation d'une autre composition, et l'invention vise aussi l'utilisation de ces compositions comme complément alimentaire ou composition cosmétique.
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront de la description détaillée de l'invention, des exemples et des figures qui vont suivre.
Brève description des Figures
[Fig. 1a] représente un schéma de polymérisation : Le L-Met NCA et le L-Lys NCA (trifluoroacétate) sont mélangés et polymérisés pour obtenir le copolymère (Poly-(L-Lysine-co-methionine). (DMF = dimethylformamide).
[Fig. 1b] représente un schéma de déprotection : le copolymère de la figure la est déprotégé pour obtenir un Poly-(L-Lysine-co-methionine) sous forme de sel de bromure.
[Fig. 2a] représente un schéma de polymérisation Le L-Cys NCA (trityle) et le L-Lys NCA (trifluoroacétate) sont mélangés et polymérisés pour obtenir le copolymère Poly-(L-lysine-co-L- cystéine).
[Fig2 b] représente un schéma de déprotection : le copolymère de la figure la est déprotégé pour obtenir un Poly-(L-lysine-co-L-cystéine) sous forme de sel de bromure. (DMF = dimethylformamide).
[Fig3] représente un schéma de formations de micelles selon un mode de réalisation de l'invention : 10 = micelles ; 12= poly-lysine ; 14 = molécules conjuguées de façon covalente (notamment acides gras) ; 16 = molécules hautement hydrophobes non conjugables à la poly-lysine (par exemple cholestérol, farnésyl-cystéine, co-enzyme Q10, curcumine).
Description détaillée de l'invention
Définitions
Par « animal » au sens de l'invention, on entend tout animal à l'exception de l'être humain.
Par « conjugué amphiphile » au sens de l'invention on entend un conjugué formé par une molécule X hydrophobe et un polymère Y hydrophile, en particulier une poly-lysine, le conjugué présentant ainsi une caractéristique amphiphile.
Par « molécule X conjuguée à une poly-lysine » au sens de l'invention, on entend une molécule X lié par une liaison covalente à une poly-lysine, ladite liaison pouvant être préférentiellement une liaison amide, urée ou carbamate en fonction de la nature chimique de la molécule X.
Compositions selon l'invention
La présente invention a donc pour objet une composition sous forme liquide comprenant :
- au moins une molécule (i) conjuguée de façon covalente à une poly-lysine, et
- au moins une molécule (ii) hydrophobe et non conjugable de façon covalente à une poly-lysine, ladite molécule (ii) étant encapsulée dans une micelle, et/ou au moins une molécule (iii) conjuguée à une poly-lysine par polymérisation, ladite molécule (iii) et la poly-lysine formant un copolymère.
Ainsi la composition selon l'invention peut comprendre :
- au moins une molécule (i) conjuguée de façon covalente à une poly-lysine, et au moins une molécule (ii) hydrophobe et non conjugable de façon covalente à une poly-lysine, ladite molécule (ii) étant encapsulée dans une micelle, ou
- au moins une molécule (i) conjuguée de façon covalente à une poly-lysine, et au moins une molécule (iii) conjuguée à une poly-lysine par polymérisation, ladite molécule (iii) et la poly-lysine formant un copolymère, ou
- au moins une molécule (i) conjuguée de façon covalente à une poly-lysine, et au moins une molécule (ii) hydrophobe et non conjugable de façon covalente à une poly-lysine, ladite molécule (ii) étant encapsulée dans une micelle et au moins une molécule (iii) conjuguée à une poly-lysine par polymérisation, ladite molécule (iii) et la poly-lysine formant un copolymère.
Pour toutes les molécules actives présentes dans les compositions selon l'invention, il peut s'agir des molécules en tant que telles (exemple acide ascorbique) et/ou d'un sel de ces molécules (exemple : ascorbate) et/ou d'un ester de ces molécules (exemple : ester d'acide ascorbique) et/ou d'un anhydride (exemple : anhydride d'acide ascorbique).
La composition selon l'invention comprend donc une ou plusieurs molécule(s) conjuguées de façon covalente à la poly -lysine. Ce type de conjugués est connu de l'homme du métier, les liaisons entre une molécule et la poly-lysine étant notamment des liaisons amide, urée ou carbamate en fonction de la nature et de la structure chimique de la molécule concernée. Des exemples de réalisation de liaisons amides, urée et carbamates sont décrits par exemple dans :
- Ryser HJ, Shen WC. Conjugation of methotrexate to poly (L-lysine) as a potential way to overcome drug résistance. Cancer. 1980 Mar 15;45(5 Suppl):1207-ll (liaisons amide),
- Zhuxian Z, Jianbin T, Qihang S, William J. A multifunctional PEG-PLL drug conjugate forming redox- responsive nanoparticles for intracellular drug delivery Issue 38, 2015. Journal of Materials Chemistry B (liaisons amide),
- Scheper V, Wolf M, Scholl M, Kadlecova Z, Perrier T, Klok HA, Saulnier P, Lenarz T, Stöver T. Potential novel drug carriers for inner ear treatment: hyperbranched poly-lysine and lipid nanocapsules. Nanomedicine (Lond). 2009 Aug;4(6):623-35 (liaisons urée),
- Stéphanie Gac-Breton, Jean Coudane, Mahfoud Boustta & Michel Vert (2004) Norfloxacin-Poly(l- Lysine Citramide Imide) Conjugates and Structure-dependence of the Drug Release, Journal of Drug Targeting, 12:5, 297-307, (liaisons carbamate),
- Elmore, W. M. (2013). Nanoparticles Stabilized with MPEG-Poly-lysine Carbamate: Synthesis and Characterization, (liaisons carbamate),
- Ning-Ping Huang, Janos Vörös, Susan M. De Paul, Marcus Textor, and Nicholas D. Spencer. Biotin- Derivatized Poly(l-lysine)-g-poly(éthylene glycol): A Novel Polymeric Interface for Bioaffinity Sensing. Langmuir 2002 18 (1), 220-230 (liaisons carbamate).
Préférentiellement, la ou les molécule(s) conjuguée(s) de façon covalente à une poly-lysine sont choisies parmi les acides gras, les antioxydants, les vitamines et leurs mélanges. Elles peuvent être choisies notamment parmi l'acide myristique, l'acide linoléique, l'acide palmitique, l'acide palmitoléique, l'acide laurique, l'acide oléique, l'acide orotique, la spermine, la taurine, l'acide patothénique, l'acide azélaïque, GABA, la biotine, l'acide thioctique, l'acide ascorbique, acide acétique, acide propionique, acide butyrique, acide pyruvique, acide lactique, l'alpha-tocophérol, l'acide pantothénique, le glutathion, l'acide rétinoïque et leurs mélanges.
La composition selon l'invention, en plus de ces conjugués poly-lysine, peut comprendre des molécules hydrophobes non conjugables à la poly-lysine encapsulées dans des micelles. Les molécules hydrophobes non conjugables à la poly-lysine sont chimiquement non appropriées pour une conjugaison covalente, soit en raison de l'absence de groupes fonctionnels réactifs, soit en raison d'incompatibilités chimiques. Ces molécules sont hautement hydrophobes, préférentiellement, selon l'invention il s'agit de molécules présentant des valeurs LogP supérieures à 1, en particulier supérieures à 2 et préférentiellement supérieures à 3. Il peut s'agir par exemple le cholestérol, le farnésyl-cystéine, le co-enzyme Q10 ou la curcumine. Préférentiellement, la ou les molécule(s) hydrophobe(s) et non conjugable(s) de façon covalente à une poly-lysine sont choisies parmi le cholestérol, le co-enzyme Q10, le farnésyl cystéine, la curcumine et leurs mélanges.
Selon un mode de réalisation préféré et particulièrement adapté, tel que représenté sur la figure 3, la ou les molécules hydrophobes et non conjugables de façon covalente à une poly-lysine sont encapsulée(s) dans au moins une micelle 10 formée par des conjugués amphiphiles constitués chacun par au moins une molécule hydrophobe 14 conjuguée de façon covalente à une poly-lysine 12, encapsulant la ou les molécule(s) 16 hydrophobe(s) et non conjugable(s) de façon covalente à une poly-lysine.
En effet, considérant à la fois le caractère hydrophile de la poly-lysine et le caractère hydrophobe de la plupart de certaines molécules convenant à la conjugaison covalente (notamment l'alpha- tocophérol ou l'acide rétinoïque ou des acides gras comme l'acide oléique, l'acide palmitique, l'acide laurique, l'acide linoléique, l'acide azélaïque, l'acide palmitoléïque, l'acide thioctique, l'acide myristique, l'acide orotique, l'acide acétique, l'acide butyrique, l'acide lactique, l'acide propionique), selon l'invention ces conjugués particuliers se comportent comme des surfactants en solution aqueuse. De cette manière, certains de ces conjugués (amphiphiles) agissent comme des micelles polymères en milieu aqueux, générant une poche hydrophobe, capable d’encapsuler des molécules hydrophobes non conjugables à la poly-lysine (comme le cholestérol, le farnésyl cystéine, etc.), améliorant ainsi considérablement leur solubilité et leur stabilité en solution aqueuse.
Selon un mode de réalisation particulierde l'invention, la ou les micelle(s) encapsulant les molécules hydrophobes non conjugables à la poly-lysine, sont formées au moins par un ou plusieurs conjugués d'alpha-tocophérol conjugué de façon covalente à une poly-lysine et/ou par un ou plusieurs conjugués d'acide rétinoïque conjugué de façon covalente à une poly-lysine.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l'invention, la ou les micelle(s) encapsulant les molécules hydrophobes non conjugables à la poly-lysine, sont formées au moins par un ou plusieurs conjugués d'acide(s) gras conjugué(s) de façon covalente à une poly-lysine. Le ou les acides gras sont préférentiellement choisis parmi l'acide oléique, l'acide palmitique, l'acide laurique, l'acide linoléique, l'acide azélaïque, l'acide palmitoléïque, l'acide thioctique, l'acide myristique, l'acide orotique, l'acide acétique, l'acide butyrique, l'acide lactique, l'acide propionique.
La composition selon l'invention, en plus de ces conjugués poly-lysine, et éventuellement en plus des molécules hydrophobes non conjugables à la poly-lysine encapsulées dans des micelles, peut comprendre au moins une molécule conjuguée à une poly-lysine par polymérisation, c'est-à-dire des copolymères de ladite molécule et de poly-lysine. Il s'agit en particulier d'une molécule choisie parmi les acides aminés, telle que par exemple la cystéine ou la méthionine. En effet, les acides aminés, qu'ils soient naturels ou non, ne sont pas conjugables à la poly-lysine par une liaison covalent. Selon l'invention, ces molécules peuvent être intégrées au squelette poly-L-lysine via une copolymérisation appropriée des monomères NCA (Ncarboxyanhydrides) pour former un copolymère. Préférentiellement, les molécules non conjugables à la poly-lysine, en particulier les acides aminés, sont incluses dans l'épine dorsale polypeptidique du polymère pour former un copolymère.
Préférentiellement, les copolymères ont entre 5 et 20% de molécules non conjugables de façon covalent à la poly-lysine (en particulier des acides aminés) et entre 80 et 95% de poly-lysine. Selon une variante préférée, les copolymères ont 10 % de molécules non conjugables de façon covalent à la poly-lysine (en particulier des acides aminés) et 90% de poly-lysine (rapport de 1 pour 10).
La copolymérisation peut être réalisée notamment par la mise en œuvre d'une étape de polymérisation (par exemple L-Met NCA ou L-Cys NCA et L-Lys NCA sont mélangés et polymérisés pour obtenir un copolymère) puis une étape de déprotection du copolymère obtenu après polymérisation. Des exemples illustratifs sont présentés sur les figures la, lb (Poly-(L-Lysi ne-co- méthionine), 2a et 2b (Poly-(L-lysine-co-L-cystéine) :
- 1a : Polymérisation : Le L-Met NCA et le L-Lys NCA (trifluoroacétate) sont mélangés et polymérisés dans le rapport approprié pour obtenir le copolymère aléatoire approprié,
- 1b : Déprotection du PLys-TFA : Le copolymère précédent est déprotégé pour obtenir du PLys sous forme de sel de bromure.
- 2a : Polymérisation : Le L-Cys NCA (trityle) et le L-Lys NCA (trifluoroacétate) sont mélangés dans le rapport approprié pour obtenir le copolymère aléatoire approprié.
2b : Déprotection de Lys-TFA : Le copolymère précédent est déprotégé pour obtenir L-Lys sous forme de sel de bromure et L-Cys sous sa forme déprotégée.
La poly-lysine utilisée dans les compositions selon l'invention est préférentiellement une poly-L- lysine. La poly-lysine est préférentiellement linéaire. En particulier la poly-lysine utilisée peut-être une epsilon poly-L-lysine, préférentiellement un poly-L-lysine de poids moléculaire compris entre 12000 et 20000 Da. La poly-lysine utilisée dans les compositions selon l'invention peut être une poly-lysine présentant un contre ion bromure, ou chlore ou TFA acide trifluoroacétique.
Les compositions selon l'invention peuvent se présenter sous forme liquide ou sous forme solide.
Lorsqu'elle est sous forme liquide la composition comprend au moins de l'eau et les constituants ci- avant mentionnés.
La forme solide est préférentiellement obtenue à partir de la forme liquide, de façon préférée par lyophilisation. Ainsi, lorsque la composition selon l'invention sous forme liquide comprend des micelles et qu'elle est lyophilisée sous forme solide, les micelles se reforment lorsque la composition sous forme solide est de nouveau mise dans une solution aqueuse. Ainsi l'invention a également pour objet une composition sous forme solide, obtenue par lyophilisation ou atomisation ou une déshydratation lente d'une composition selon l'invention sous forme liquide.
La composition selon l'invention peut également comprendre des excipients pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptables. Ces excipients peuvent être choisis en particulier pour répondre aux pH et osmolarité de solution injectables chez l'homme ou l'animal. Il peut s'agir par exemple d'acides ou de bases pour ajuster le pH ou des solutions pour ajuster l'osmolarité, tels que NaCI, le PBS ou un tampon phosphate salin.
La composition selon l'invention est destinée notamment à être administrée à l'être humain, ou à un animal et se présente par conséquent sous une forme adaptée à une telle administration. Lorsqu'elle se présente sous forme liquide, elle est préférentiellement adaptée à une administration par voie sous-cutanée ou par voie intraveineuse, notamment par voie intraveineuse en perfusion, et elle est conditionnée dans des contenants adaptés et connus de l'homme du métier pour conditionner ce type de produits. La composition selon l'invention peut être aussi administrée sous forme liquide via une pompe, du type des pompes à insuline.
Lorsqu'elle se présente sous forme solide, elle est préférentiellement adaptée à une administration :
- par voie transcutanée et elle est préférentiellement formulée et conditionnée sous forme d'un patch, ou
- par voie nasale sous forme de poudre, ou
- par voie sublinguale sous forme de poudre ou de comprimé, ou
- par voie transmucosale et elle est préférentiellement formulée et conditionnée sous forme d'un comprimé muco-adhésif.
Un exemple non limitatif de composition selon l'invention est une composition C1 comprenant au moins :
- A. les conjugués suivants, chaque conjugué étant constitué par une molécule liée de façon covalente à une poly-lysine :
- un ou plusieurs conjugués Oléyl-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Palmitic-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Lauryl-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Azélayl-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Palmitoléyl-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Thioctyl-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Myristyl-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Orotyl-Poly-L-Lysine - un ou plusieurs conjugués Acétate-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Butyrate-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Lactate-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Propionate-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Linoléyl-Poly-L-Lysine, et
- B. du farnésyl cystéine et du cholestérol, et/ou un ester de ces molécules, encapsulées dans des micelles, préférentiellement dans des micelles formées par un ou plusieurs des conjugués listés au point A.
Préférentiellement :
- la quantité d'acide butyrique dans la composition C1 est supérieure à celle de chacune des autres molécules prises individuellement, et/ou
- la quantité d'acide thioctique dans la composition C1 est supérieure à celle de chacune des autres molécules prises individuellement, sauf de l'acide butyrique, et/ou
- la quantité d'acide laurique dans la composition C1 est supérieure à celle de de chacune des molécules suivantes prises individuellement :, l'acide palmitique, l'acide linoléique, l'acide azélaïque, farnésyl cystéine, l'acide palmitoléïque, le cholestérol, l'acide myristique, l'acide orotique,
- la quantité d'acide oléique d'une part et d'acide lactique d'autre part dans la composition C1 est supérieure à celle de chacune des molécules suivantes prises individuellement : l'acide palmitique, l'acide laurique, l'acide linoléique, l'acide azélaïque, farnésyl cystéine, l'acide palmitoléïque, le cholestérol, l'acide myristique, l'acide orotique, l'acide acétique.
Préférentiellement, chacune des molécules actives dans la composition C1 représente entre 0,5 E- 05 M et 10 E-05 M.
Un autre exemple non limitatif de composition selon l'invention est la composition C2 comprenant au moins :
- A. les conjugués suivants, chaque conjugué étant constitué par une molécule liée de façon covalente à une poly-lysine :
- un ou plusieurs conjugués Taurine-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Spermine-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Pantothényl-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Alpha tocophérol-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Biotinyl-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Glutathion-Poly-L-Lysine
- un ou plusieurs conjugués Ascorbyl-Poly-L-Lysine - un ou plusieurs conjugués GABA-Poly-L-Lysine,
- un ou plusieurs conjugués Rétinoyl-Poly-L-Lysine, et
B. Co-enzyme Q10, et/ou un ester et/ou un sel de Co-enzyme Q10, encapsulées dans des micelles, préférentiellement dans des micelles formées par un ou plusieurs des conjugués listés au point A, et
C. des copolymères méthionine-Poly-L-Lysine et des copolymères cystéine-Poly-L-Lysine, la méthionine et/ou la cystéine pouvant être remplacé par un ester ou un sel ou un anhydride de ces molécules.
Préférentiellement :
- la quantité d'acide rétinoïque dans la composition C2 est supérieure à celle de chacune des autres molécules prises individuellement, et/ou
- la quantité de taurine, la quantité de méthionine et la quantité de GABA sont équivalentes dans la composition C2 et sont chacune supérieures à celle de chacune des autres molécules prises individuellement, sauf de l'acide rétinoïque et du coenzyme Q10.
Préférentiellement, chacune des molécules actives dans la composition C2 représente entre 6 E-05 M et 18 E-05 M.
Procédé de fabrication de compositions selon l'invention Les compositions selon l'invention peuvent être fabriquées par tout procédé adapté.
Un procédé de fabrication particulièrement adapté comprend les étapes suivantes :
- a. créer un premix (pré-mélange) amphiphile : mélanger dans une solution aqueuse (préférentiellement de l'eau) un ou plusieurs conjugués de molécule conjugable à la poly-lysine,
- b. ajouter dans le premix amphiphile au moins une molécule hydrophobe non conjugable à la poly- lysine (par exemple cholestérol, farnésyl-cystéine, co-enzyme Q10, etc.), et mettre sous agitation de façon à former des micelles formées par un ou plusieurs des conjugués du premix amphiphile encapsulant cette ou ces molécule(s) hydrophobe(s) non conjugable(s) à la poly-lysine, et/ou
- c. ajouter dans le mélange des co-polymères de poly-lysine et de molécules non conjugables de façon covalente à la poly-lysine, en particulier des copolymères acide aminé-Poly-L-Lysine.
Ainsi un procédé de fabrication d'une composition selon l'invention comprend au moins une molécule hydrophobe et non conjugable de façon covalente à une poly-lysine, encapsulée dans une micelle formée par des conjugués amphiphiles constitués chacun par au moins une molécule hydrophobe conjuguée de façon covalente à une poly-lysine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- a. créer un premix ampliphile : mélanger des conjugués de molécules hydrophobes conjuguées de façon covalente à une poly-lysine dans une solution aqueuse,
- b. ajouterdans le premixamphiphile, une ou plusieurs molécule(s) hydrophobe(s) non conjugable(s) à une poly-lysine, et mettre sous agitation de façon à former une micelle de molécules hydrophobes conjuguées de façon covalente à une poly-lysine encapsulant le ou les molécules hydrophobe(s).
En effet, une variante de l'invention consiste à tirer parti de la nature amphiphile de certains conjugués poly-lysine (en particulier les conjugués acides-gras poly-lysine), pour créer un prémélange amphiphile qui permet la solubilisation contrôlée de molécules hautement hydrophobes non conjugables à la poly-lysine. Le processus de solubilisation selon un mode de réalisation préféré consiste en une addition contrôlée des molécules hydrophobes au prémélange amphiphile et à laisser le temps nécessaire à leur dissolution sous agitation.
Préférentiellement, l'agitation à l'étape b. est réalisée pendant au moins 5 minutes, encore plus préférentiellement entre 5 et 20 minutes, et de façon préférée à une vitesse d'agitation inférieure ou égale à 900 tours par minute, en particulier à une vitesse d'agitation comprise entre 50 et 800 tours par minute.
Préférentiellement, les conjugués poly-lysine et autres molécules doivent être dissous et formulés dans l'eau. Il est possible en suite d'ajouter des sels appropriés comme le PBS/NaCI, mais ceux-ci ne doivent pas être utilisés avant. En effet, l'utilisation de sels comme le PBS ou le NaCI au niveau des étapes a. et/ou b. empêche la formation de micelles ne permet pas d'obtenir une solution claire et la solubilisation n'est pas optimisée. Si du PBS ou Nacl est utilisé il doit préférentiellement l'être après formation des micelles et une fois que la solution est limpide.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé de fabrication selon l'invention comprend également une étape d. de séparation des phases soluble et insoluble, pour récupérer la phase soluble. Dans ce cas la phase insoluble est éliminée et la phase soluble constitue la composition selon l'invention. En effet, un processus de séparation physique (filtration, ultrafiltration) est préférentiellement réalisé pour assurer l'isolement de la fraction soluble, contenant à la fois le prémélange amphiphile, les copolymères et/ou les molécules hydrophobes encapsulées solubilisées.
Selon un mode de réalisation, le premix de l'étape a. comprend également un ou plusieurs copolymère(s) de molécule conjuguée à une poly-lysine par polymérisation et/ou à une étape c. qui est mise en œuvre après l'étape b. ou après l'étape d., un ou plusieurs copolymère(s) de molécule conjuguée à une poly-lysine sont ajouté(s) dans le mélange.
De même, le premix de l'étape a. peut comprendre également une ou plusieurs autres molécules conjuguées de façon covalente à une poly-lysine et/ou qu'après l'étape b. ou d., une ou plusieurs autres molécules conjuguées de façon covalente à une poly-lysine sont ajoutée(s) dans le mélange.
Selon une variante, si la composition ne comprend pas de micelles, le procédé de fabrication d'une composition selon l'invention comprend au moins une molécule conjuguée à une poly-lysine par polymérisation, ladite au moins une molécule et la poly-lysine formant un copolymère, caractérisé en ce qu'il comprend le mélange dudit au moins un copolymère avec au moins une molécule conjuguée de façon covalente à une poly-lysine.
La composition sous forme liquide peut ensuite être lyophilisée ou déshydratée pour être sous forme solide. Le procédé selon l'invention peut en effet comprendre une étape de lyophilisation ou d'atomisation ou de déshydratation lente de la composition liquide obtenue préalablement pour obtenir une composition solide, puis une étape de solubilisation de cette composition solide. Préférentiellement l'étape de séchage est réalisée par lyophilisation lente par exemple entre 12 et 36 heures.
Par ailleurs si des conjugués de poly-lysine et/ou des co-polymères de la composition ne sont pas intégrés dans le premix de l'étape a ou c, ceux-ci peuvent être ajoutés dans le mélange après l'étape b. c'est-à-dire après la formation des micelles et l'encapsulation du co-enzyme Q10.
Les conjugués molécule active-polymère peuvent être fabriqués par tout moyen connu de l'homme du métier pour conjuguer une molécule de façon covalente à un polymère en fonction de leur nature chimique. A titre d'exemple:
- l'acide ascorbique est conjugué à la poly-lysine par une liaison carbamate,
- la spermine et la taurine sont conjugués à la poly-lysine par une liaison urée.
- le glutathion, l'acide pantothénique, l'acide aminobutyrique, la biotine, l'alpha tocophérol, le GABA, l'acide laurique, l'acide myristique, l'acide palmitique, l'acide oléique, l'acide linoléique, l'acide orotique, l'acide azélaïque, l'acide thioctique, l'acide acétique, l'acide palmitoléique, l'acide butyrique, l'acide lactique, l'acide propionique, l'acide rétinoïque et l'acide oléique sont conjugués à la poly-lysine par une liaison amide.
Les copolymères peuvent être fabriqués partout moyen connu de l'homme du métier. Les molécules, en particulier les molécules d'acides aminés, sont incorporées dans la structure du polymère préférentiellement en présence d'un solvant anhydre et selon un mode de réalisation dans un rapport de 1 molécule de cystéine ou méthionine pour 10 monomères du polymère.
Utilisations
Les compositions selon l'invention peuvent être utilisées en particulier comme médicament, pour prévenir et/ou traiter des pathologies notamment chez l'Homme ou l'animal c'est-à-dire pour un sujet Humain ou animal, en fonction des molécules qu'elles contiennent.
De même les compositions selon l'invention peuvent être utilisées comme complément alimentaire ou encore comme composition cosmétique.
L'exemple de composition C1 est une formulation générique particulièrement adaptée pour prévenir et/ou traiter les maladies multifactorielles, notamment les maladies chroniques multifactorielles, et en particulier les maladies impliquant une perméabilité intestinale.
Elle est capable d'agir de façon combinée :
- comme immuno-modulateur et régulateur de l'auto-immunité, en particulier grâce à la présence d'acide oléique, de l'acide palmitique, de l'acide palmitoléique,
- comme anti-inflammatoire, en particulier grâce à la présence de l'acide palmitique, de l'acide azélaïque, du farnésyl cystéine, de l'acide palmitoléique, de l'acide myristique,
- comme antibactérien, en particulier grâce à la présence de l'acide laurique, de l'acide azélaïque,
- comme antifongique, en particulier grâce à la présence de l'acide laurique,
- comme anti-radicalaire, en particulier grâce à la présence du farnésyl cystéine,
- comme antagoniste des protéines isoprénylées, en particulier grâce à la présence du farnésyl cystéine,
- sur la stabilisation des membranes cellulaires, en particulier grâce à la présence de cholestérol,
- comme piégeur de radicaux libres et de métaux, en particulier grâce à la présence d'acide thioctique.
- comme anti-viral, en particulier grâce à la présence d'acide myristique,
- comme substrat synergique cellulaire, en particulier grâce à la présence de butyrate,
- pour favoriser le développement de la flore intestinale, en particulier grâce à la présence d'acide orotique,
- pour réguler les muqueuses et la flore intestinale, en particulier grâce à la présence d'acétate, de lactate, de propionate et de Butyrate.
Les différentes molécules présentes agissent en synergie et permettent notamment de rétablir la fonction de la perméabilité intestinale.
Ainsi, la composition C1 peut être utilisée pour rétablir la fonction de la membrane intestinale et/ou pour maintenir la perméabilité intestinale et/ou prévenir ou lutter contre une hyperperméabilité de la muqueuse intestinale.
Selon une variante, la composition C1 peut être utilisée comme complément alimentaire chez une personne saine ou un animal sain, en particulier pour diminuer la perméabilité intestinale de la personne ou de l'animal à qui elle est destinée.
L'intestin joue un rôle clef d'initiateur, de régulateur sur la chronicité des maladies. Ainsi, la composition C1 peut notamment être administrée à l'Homme ou l'animal pour prévenir ou lutter contre des maladies dans lesquelles l’intestin joue un rôle important, notamment des maladies chroniques, et en particulier des maladies chroniques dégénératives, telles que des maladies neurodégénératives telles que par exemple la maladie de Charcot. La composition C1 peut aussi être utilisée comme activateur du système immunitaire pour prévenir ou lutter contre des maladies auto immunes et infectieuses.
La composition peut être utilisée en particulier pourdiminuer la chronicité des maladies chroniques.
Préférentiellement, la composition C1 est utilisée en prévention ou en traitement dès les premiers symptômes d'une hyperperméabilité intestinale ou d'une maladie chronique, de façon à empêcher le développement de la chronicité de ladite maladie et ainsi éviter l'orage inflammatoire qui découle d'une hyperperméabilité intestinale prolongée.
De façon spécifique, la composition C1 est particulièrement utile pour au moins :
- réduire le processus inflammatoire, et/ou
- réduire le processus auto-immun, et/ou
- diminuer la perméabilité intestinale, et/ou
- un effet anti-oxydant, et/ou
- un effet anti-radicalaire, et/ou
- un effet antibactérien et/ou antiviral/ou et antifongique.
L'invention a donc également pour objet une composition C1 selon l'invention pour son utilisation comme médicament, notamment chez l'Homme ou l'animal c'est-à-dire pour un sujet Humain ou animal.
En particulier la composition C1 peut être utilisée dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie multifactorielle, en particulier une pathologie multifactorielle chronique, notamment une pathologie choisie parmi les maladies inflammatoires, les maladies neurodégénératives, les maladies bactériennes, les maladies virales, les maladies auto-immunes, les allergies et intolérances alimentaires. Notamment la composition C1 peut être utilisée dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie choisie parmi l'eczéma, le psoriasis, les maladies inflammatoires chroniques intestinales (notamment maladie de Crohn et Coeliaque), la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson, la sclérose en plaque, la maladie de Charcot.
La composition C2 est une formulation particulièrement adaptée pour prévenir et/ou traiter les maladies multifactorielles, notamment les maladies chroniques multifactorielles. La composition C2 est particulièrement utile pour la prévention et le traitement des maladies neurodégénératives, auto-immunes, infectieuses ou des cancers. En particulier, elle présente une grande efficacité dans la prévention et le traitement de la maladie de Charcot. La composition C2 intervient sur les processus classiques et connus pour diminuer la chronicité des maladies. Son action est tout particulièrement adaptée aux maladies neurodégénératives, auto-immunes, cancer et infectieuse.
Elle est notamment capable d'agir de façon combinée :
- comme immuno-modulateur et régulateur de l'auto-immunité, en particulier grâce à la présence d'acide rétinoïque et de GABA,
- comme neuroprotecteur, en particulier grâce à la présence de taurine, co-enzyme Q10, GABA
- comme anti-inflammatoire, en particulier grâce à la présence de spermine,
- comme protecteur cellulaire, en particulier grâce à la présence d'acide pantothénique, co-enzyme Q10 (protection en particulier au niveau de la chaîne mitochondriale)
- comme protecteur des membranes cellulaires, en particulier grâce à la présence de l'alpha- tocophérol,
- comme anti-oxydant, en particulier grâce à la présence de taurine, de cystéine, de méthionine, spermine, acide pantothénique, alpha-tocophérol, co-enzyme Q10, glutathion, acide ascorbique,
- comme régulateur du métabolisme cellulaire piégeur des dérivés oxygénés, en particulier grâce à l'acide ascorbique,
- comme précurseur du glutathion, en particulier grâce à la présence de cystéine,
- sur la stabilisation des membranes cellulaires,
- comme piégeur de radicaux libres et de métaux, en particulier grâce à la présence de taurine, de cystéine, de méthionine , spermine, acide pantothénique, co-enzyme Q10, glutathion.
Les différentes molécules présentes agissent en synergie et permettent notamment de prévenir ou lutter contre les facteurs à l'origine des maladies chroniques et en particulier de la maladie de Charcot.
Ainsi, la composition C2 peut être utilisée pour prévenir et/ou lutter contre les maladies chroniques notamment pour agir sur les métabolismes spécifiques de la pathologie. La composition C2 peut être utilisée en particulier pour diminuer la chronicité des maladies chroniques.
Préférentiellement, la composition C2 est utilisée en prévention ou en traitement dès les premiers symptômes d'une maladie chronique, en particulier une maladie neurodégénérative et spécifiquement la maladie de Charcot.
La composition C2 selon l’invention peut être utilisée comme médicament, notamment chez l'Homme ou l'animal c'est-à-dire pour un sujet Humain ou animal.
En particulier la composition C2 peut être utilisée dans la prévention et/ou le traitement d'une pathologie multifactorielle, en particulier une pathologie multifactorielle chronique, notamment une pathologie choisie parmi les maladies inflammatoires, les maladies neurodégénératives, les maladies bactériennes, les maladies virales, les maladies auto-immunes, les allergies et intolérances alimentaires, et en particulier la maladie de Charcot.
La composition C2 peut être utilisée avec la composition C1, simultanée ou séquencée dans le temps. En particulier, il est préférable d'administrer la composition C1 d'abord, puis la composition C2, les deux administrations étant préférentiellement séparées d'au moins 1 heure, encore plus préférentiellement d'au moins 4 heures, idéalement une le matin et une le soir.
L'invention est à présent décrite par des exemples et des résultats d'essais.
Exemples
Exemple 1 : composition C1 Un exemple de composition C1 adaptée pour des tests sur des souris est présenté ci-après.
Les quantités suivantes de conjugués ont été pesées selon le tableau 1 pour préparer un stock de 300 ml de composition C1 10x. Tous les conjugués ont été pesés avec une balance analytique dans une hotte à flux laminaire.
[Tableau 1]
Chaque conjugué a été pesé dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml, et a été dissous dans 30 ml d'eau, à l'aide d'un vortex. Chaque conjugué a été agité pendant une durée comprise entre 10 et 20 minutes en fonction de la solubilité du conjugué.
En parallèle des molécules de cholestérol et de farnésylcystéine ont été dissous séparément à la concentration approximative de 50 mg/ml dans de l'éthanol absolu et filtrés sur un filtre filtrant de 0,22 μm. Le solvant a été évaporé par un rotavaporateur. Les quantités nécessaires de solides secs ont été pesées dans une hotte à flux laminaire, telles que présentées dans le tableau 2.
[Tableau 2]
Dans un flacon stérile de 500 ml et muni d'une barre magnétique, 23,8 ml de chaque solution conjuguée précédemment préparée ont été ajoutés sous agitation magnétique (700 tours par minute). Les quantités correspondantes de sels (préalablement lyophilisés) à 300 de PBS ont été ajoutées à la solution de conjugués sous agitation magnétique (700 tours par minute). Le cholestérol et la farnésylcystéine ont été ajoutés et le mélange et laissés sous agitation pendant 25 heures (700 tours par minute).
30 ml de formulation C1 10x ont été prélevés dans une hotte à flux laminaire et ajoutés à un nouveau flacon stérile de 500 ml. 270 ml de PBS stérile ont été ajoutés afin d'obtenir la formulation C1 1x. La formulation a été agitée pendant 30 minutes.
Les flacons ont été préparés selon le plan suivant en utilisant une pipette stérile et calibrée de 5 ml : C1 1X = 83 flacons, 2 ml chacun. C1 10X = 83 flacons de 2 ml chacun. Les 166 flacons ont été placés dans un bac de lyophilisation en acier et un cycle de lyophilisation d'une journée a été lancé.
Exemple 2 : composition C2
Un exemple de composition C2 adaptée pour des tests sur souris est présenté ci-après.
Les quantités suivantes de conjugués ont été pesées selon le tableau 3 pour préparer un stock de 300 ml de composition C2 10x. Tous les conjugués ont été pesés avec une balance analytique dans une hotte à flux laminaire.
[Tableau 3]
Chaque conjugué a été pesé dans un tube à centrifuger stérile de 50 ml, et a été conservé au congélateur à -20°C jusqu'à son utilisation. En parallèle le coenzymeQ10 a été dissous à la concentration approximative de 50 mg/ml dans de l'éthanol absolu et filtré à travers un filtre de 0,22 μm. Le solvant a été évaporé par un rotavaporateur. Les quantités nécessaires de solides secs ont été pesées dans une hotte à flux laminaire, telles que présentées dans le tableau 4.
[Tableau 4]
Le solide a été conservé dans un tube à centrifuger stérile à -20°C jusqu'à son utilisation.
Les tubes de centrifugation de 50 ml précédemment préparés avec les conjugués et copolymères ont été pris et laissés se réchauffer à température ambiante. Après ce temps, 30 ml d'eau ont été ajoutés à chaque tube de centrifugation.
Les conjugués et copolymères ont été dissous à l'aide d'un vortex, en agitant pendant un temps compris entre 10 et 20 minutes, selon la solubilité des conjugués et copolymères.
Le tube de centrifugation contenant la coenzyme Q10 a également été sorti du congélateur et laissé se réchauffer à température ambiante.
Un flacon stérile de 500 ml a été pris et muni d'une barre magnétique. 27,3 ml de chaque solution conjuguée précédemment préparée ont été ajoutés au flacon sous agitation magnétique (700 tours par minute).
Les quantités correspondantes de sels (préalablement lyophilisés) à 300 de PBS ont été ajoutées à la solution de conjugués sous agitation magnétique (700 tours par minute).
Le coenzyme Q10 a été ajouté et le mélange a été laissé sous agitation pendant 2 heures (700 tours par minute).
Après 2 heures, 30 ml de formulation C2 10 x ont été prélevés dans une hotte à flux laminaire et ajoutés à un nouveau flacon stérile de 500 ml.
270 ml de PBS stérile ont été ajoutés afin d'obtenir la formulation C2 x1. La formulation a été agitée pendant 30 minutes.
Les flacons ont été préparés selon le plan suivant en utilisant une pipette stérile et calibrée de 5 ml : C2 1X = 83 flacons, 2 ml chacun.
C2 10X = 83 flacons de 2 ml chacun.
Les 166 flacons ont été placés dans le bac de lyophilisation en acier et un cycle de lyophilisation d'une journée a été lancé.
Exemple 3 : composition C1
Un exemple de composition C1 adaptée pour des tests sur des rats est présenté ci-après. Le procédé de fabrication de la composition est similaire à celui présenté à l'exemple 1. Les concentrations de chacun des constituants sont différentes et présentés dans le tableau 5.
[Tableau 5]
La somme des concentrations en conjugués PLL + cholestérol + Farnésylcystéine pour C1 10X est de 13,2 mg/mL.
La somme des concentrations des conjugués PLL + cholestérol + Farnésylcystéine pour C1 1X est de 1,32 mg/ml.
Exemple 4 : composition C1
Un exemple de composition C1 adaptée pour l'Homme est présenté ci-après.
Le procédé de fabrication de la composition est similaire à celui présenté à l'exemple 1. Les concentrations de chacun des constituants sont différentes et présentés dans le tableau 6.
[Tableau 6]
Exemple 5 : composition C2
Un exemple de composition C2 adaptée pour l'Homme est présenté ci-après.
Le procédé de fabrication de la composition est similaire à celui présenté à l'exemple 2. Les concentrations de chacun des constituants sont différentes et présentés dans le tableau 7. [Tableau 7]
Résultats d'essais
Etude de l'effet de la composition C1 selon l'invention pour restaurer la perméabilité intestinale
Le but de cette étude est d'évaluer l'efficacité d'une formulation injectable selon l'invention sur la restauration de la perméabilité intestinale suite à l'induction d'une inflammation intestinale induite par du dextran sulfate de sodium (DSS) chez le rat.
L'épithélium intestinal est une barrière dynamique qui limite l'accès des bactéries, des parasites, des virus mais aussi de certaines molécules chimiques aux tissus de l'hôte. Il est composé de différents types de cellules ayant chacune un rôle bien défini, tels que les entérocytes responsables de la fonction d'absorption des nutriments, les cellules caliciformes sécrétant le mucus dont l'épaisseur maintient les bactéries et autres microorganismes à distance des entérocytes, des cellules de Paneth, situées au fond des cryptes de l'intestin grêle, participant au maintien de l'homéostasie et au rôle de défense de la muqueuse intestinale via la sécrétion d'agents antimicrobiens de type défensines et les cellules microfold dites cellules M, spécialisées dans l'endocytose d'antigènes, de molécules ou encore de microorganismes présents dans le lumen intestinale. Elles jouent le rôle de cellules présentatrices d'antigène puisqu'elles présentent au système immunitaire sous-jacent les antigènes endocytés. La barrière physique épithéliale assurée par les entérocytes est renforcée par une couche de glycocalyx et de mucus épaisse (couche plus fine au niveau des cellules M pour accéder plus facilement au microbiome du lumen intestinal) et la sécrétion IgA par transcytose entérocytaire produits par les plasmocytes sous-jacents. Les cellules épithéliales forment une monocouche de cellules polarisées reposant sur la lamina propria via leur pôle basolatéral et étroitement liées entre elles par des jonctions serrées. Dans cette lamina propria, se situe les plaques de Peyer, constituées de follicules riches en lymphocytes, site initiateur de des réponses pro ou anti-inflammatoires. De nombreuses pathologies sont associées à une altération de la perméabilité intestinale telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, l'obésité, la sclérose en plaques, la maladie de Charcot et Alzheimer. Cette altération conduit à une augmentation de la perméabilité intestinale aboutissant le plus souvent par une inflammation de la paroi de l'intestin.
La composition testée dans cette étude est la composition C1 de l'exemple 3.
L'épithélium intestinale est une barrière dynamique qui limite l'accès des bactéries, des parasites, des virus mais aussi de certaines molécules chimiques aux tissus de l'hôte. Il est composé de différents types de cellules ayant chacune un rôle bien défini, tels que les entérocytes responsables de la fonction d'absorption de l'intestin, les cellules caliciformes sécrétant le mucus, les cellules M responsables du passage de macromolécules et des Antigènes de la lumière intestinale (Lamina Propria) vers les cellules immunitaires sous-jacentes ainsi que des cellules neuroendocrines. La barrière physique épithéliale assurée par les entérocytes est renforcée par une couche de glycocalyx et de mucus épaisse. Les cellules épithéliales forment une monocouche de cellules polarisées reposant sur la lamina propria via leur pôle basolatéral et étroitement liées entre elles par des jonctions serrées. De nombreuses pathologies sont associées à une altération de la perméabilité intestinale telles que les maladies inflammatoires chroniques de l'intestin, l'obésité, la sclérose en plaques, la maladie de Charcot et Alzheimer. Cette altération conduit à une augmentation de la perméabilité intestinale aboutissant le plus souvent par une inflammation de la paroi de l'intestin.
. L'objectif principal de l'étude est de mettre en évidence l'efficacité de l'invention sur la remédiation de la perméabilité intestinale suite à l'induction d'une inflammation intestinale chronique.
Pour tester ces hypothèses, des rats ont reçu différentes doses de la composition C1 de l'exemple 3, administrées par injection sous cutanée après induction de l'inflammation intestinale.
Le protocole opératoire est décrit en suivant.
1- Mise en place du modèle d'inflammation chronique
Après leur arrivée, les animaux (rats Wistar, 280-300g) ont été élevés dans des cages de 900 cm2 (3 animaux par cages). Durant cette période d'acclimatation, les animaux ont eu libre accès à l'eau et la nourriture. Après cette période, les animaux (n = 9) ont reçu ad libitum la nourriture et une solution de 2% (m/v) de Dextran Sulfate de Sodium (DSS) dans l'eau de boisson. L'induction de l'inflammation intestinale a été suivie 3, 5 et 7 jours après le début de l'ajout de DSS. Un groupe témoin (n = 3) a reçu de la nourriture et de l'eau ad libitum. Si des signes de douleur sont observés, l'animal concerné a été isolé et du paracétamol (200 mg/kg) lui a été administré par gavage 2 fois par jours. Ces animaux ont été sortis du schéma expérimental. Si une perte de poids importante a été observée, les animaux ont été sacrifiés lorsqu'ils avaient atteint 80% de leur poids initial. Enfin, les animaux ont été sacrifiés s'ils présentaient une attitude inhabituelle traduisant un mal-être.
Les conditions d'hébergement ont été les suivantes : température 20-24°C, hygrométrie 60 plus ou moins 10%, cycle 12h/12h.
Les animaux ont été observés quotidiennement pour repérer des signes de stress ou de douleur. Des pesées journalières des animaux, de la nourriture et de l'eau ont été réalisées. L'apparition des signes cliniques de l'inflammation est basée sur la perte de poids corporel, la consistance des selles (normale-0, molle-2, diarrhée-4) et les saignements rectaux (0 - 4). Les résultats ont permis de déterminer un index de sévérité de l'inflammation qui représente la moyenne des scores obtenus pour la consistance des selles et des saignements rectaux. La perte de poids représente le pourcentage de différence de poids des rats à J1 (ajout DSS) à J7.
2- Détermination de la dose « efficace » Après leur arrivée, les animaux (rats Wistar, 280-300g) ont été élevés dans des cages de 900 cm2 (5 animaux par cages). Durant cette période d'acclimatation, les animaux ont eu libre accès à l'eau et la nourriture. Après cette période, les animaux (n = 30) ont été répartis en 4 groupes (Témoin - n = 5, DSS + composition C1 10X - n = 10). Le groupe « Témoin » a reçu de la nourriture et de l'eau ad libitum durant toute l'expérimentation. Les rats ont reçu de la nourriture et une solution de DSS de 2% dans l'eau de boisson ad libitum pendant 3, 5 ou 7 jours (durée déterminée lors de la première expérimentation). Après l'induction de l'inflammation intestinale chaque rat a reçu une injection intra-péritonéale de lmLde composition C1. Les administrations de composition C1 ont été réalisées en 1 fois par jour. Si des signes de douleur ont été observés, l'animal concerné a été isolé et du paracétamol (200 mg/kg) lui a été administré par gavage 2 fois par jours. Ces animaux ont été sortis du schéma expérimental. Si une perte de poids importante a été observée, les animaux ont été sacrifiés lorsqu'ils ont atteint 80% de leur poids initial. Enfin, les animaux ont été sacrifiés s'ils présentaient une attitude inhabituelle traduisant un mal-être.
Les conditions d'hébergement ont été les suivantes : température 20-24°C, hygrométrie 60 plus ou moins 10%, cycle 12h/12h.
Les animaux ont été observés quotidiennement pour repérer des signes de stress ou de douleur. Des pesées journalières des animaux, de la nourriture et de l'eau ont été réalisées.
L'apparition des signes cliniques de l'inflammation est basée sur la perte de poids corporel, la consistance des selles (normale-0, molle-2, diarrhée-4) et les saignements rectaux (0 - 4).
Les résultats permettent de déterminer un index de sévérité de l'inflammation qui représente la moyenne des scores obtenus pour la consistance des selles et des saignements rectaux. La perte de poids représente le pourcentage de différence de poids des rats ((JX x J0)/J0)*100). A la fin de l'expérimentation, les animaux ont été anesthésiés (cf. prélèvement organes) et différents prélèvements ont été réalisés : sang, intestin grêle, cæcum, côlon, foie, rate et plusieurs paramètres évalués : taille du cæcum, poids du foie, de la rate, et du cæcum.
Etude de perméabilité
Une étude de perméabilité a été réalisée sur organe isolé (jéjunum ou côlon) pour déterminer l'efficacité de la dose de composition C1 sur le rétablissement de la perméabilité intestinale.
Prélèvement des fragments digestifs
Cette approche ex vivo utilise un fragment de jéjunum ou de côlon issu du tractus digestif de rat. Les rats ont été anesthésiés par inhalation d'isoflurane (1000mg/g) avec une induction à 3% et un entretien au cours de l'opération de 1,5%. Après laparotomie et ligature de l'artère coeliaque accolée à l'œsophage, un fragment de 10 cm de jéjunum ou de côlon a été prélevé. Le prélèvement a été pesé. Les rats ont été ensuite sacrifiés par injection de pentobarbital sodique (12 mg/100g).
Préparation de l'organe éversé et prélèvement
Les compartiments séreux et muqueux de l'organe ont été rapidement rincés avec du sérum physiologique (37°C) et l'organe a été éversé. Une ligature a été réalisée à l'une des extrémités. La seconde extrémité permet l'introduction de 1 mL de milieu Krebs-Henseleit. Cette extrémité a ensuite été ligaturée, l'organe a été pesé puis placé dans une cuve contenant 10 mL de milieu de survie Krebs-Henseleit additionnés à 250 mg de FITC-dextran de 4 Kda (compartiment muqueux). Durant toute l'expérimentation, les organes éversés ont été maintenus à 37°C et oxygénés avec un mélange O2/CO2 (95%/5%). Toutes les 30 minutes, le milieu du compartiment muqueux a été agité en réalisant 3 cycles d'aspiration-refoulement à l'aide d'une micropipette de 1mL. Après 2 h d'incubation, un prélèvement de 1 mL a été réalisé côté muqueux.
Les organes ont été retirés de la cuve en verre et une des extrémités a été coupée. Le milieu séreux a été prélevé dans un tube préalablement pesé. Après prélèvement, le tube a été à nouveau pesé afin d'évaluer le transfert de milieu de survie au cours de l'expérimentation. Après la pesée, le FITC- Dextran a été dosé par fluorométrie en duplicat (excitation, 490 nm ; émission, 530 nm).
Après avoir pesé l'organe, une coupe longitudinale de ce dernier a été réalisée et ce dernier a été rapidement congelé dans de l'azote liquide. L'organe congelé a été ensuite introduit dans un sachet zip et a été congelé dans l'azote liquide puis conservé à -80°C.
Etude des paramètres de l'inflammation
L'étude a été faite par le comportement des animaux traités. En effet une inflammation provoque une agitation exacerbée chez les animaux.
Résultats Les résultats sur l'observation des symptômes de l'inflammation sont présentés dans les tableaux 8 à 10 (avant injection de la composition C1) et sur les tableaux 11 à 15 (après injection de la composition C1). Sur ces tableaux :
- la variation de poids en pourcent est calculé comme suit : ((JX x J0)/J0)*100)
- La consistance des selles est évaluée comme suit : 0 = normale ; 2 = molle ; 3 = diarrhée - Les saignements rectaux sont évalués comme suit : 0 = rien ; 1 = légers ; 2 = modérés ; 3= importants ; 4 = abondants.
[Tableau 8]
[Tableau 9]
[Tableau 10]
'Tableau 11] [Tableau 12]
Tableau 13] [Tableau 14]
Tableau 15]
On constate que la variation de poids a été stabilisée à J12 pour les rats avec DSS 2% et DSS4%.
Concernant la consistance des selles, elle redevient normale après 6 jours de traitement avec la composition selon l'invention pour les rats DSS 2% et après 8 jours de traitement avec la composition selon l'invention pour les rates DSS 4%. Concernant les saignements rectaux, ils sont absents des rats DSS 2% ce qui signifie qu'il y a eu un rétablissement de la fonction intestinale.
Concernant l'analyse de la perméabilité de la membrane intestinale, les résultats des tests in vivo 10 jours après l'injection de la composition C1 aux rats DSS 2%, par mesure du FITC-dextran, sont présentés dans le tableau 16.
[Tableau 16]
On constate que le dosage du FITC Dextran 4KDa dans le plasma permet de bien discriminer l'impact de la composition C1 selon l'invention sur les rats ayant reçu 2% de DSS, la fluorescence retrouvée dans le sang est identique à celle du témoin. Concernant l'analyse de la perméabilité de la membrane intestinale, les résultats des tests ex vivo 10 jours après l'injection de la composition C1 aux rats DSS 2%, sur organes isolés (la perméabilité sur organes isolés a été réalisée sur un fragment de jéjunum distal (5 cm) et sur l'iléon (5 cm) par mesure du FITC-dextran, sont présentés dans le tableau 17.
[Tableau 17] On constate que pour les rats traités avec la composition C1 selon l'invention ayant reçu 2% de DSS, les valeurs sont proches de celles observées chez le témoin.

Claims

Revendications
[Revendication 1] Composition sous forme liquide comprenant :
- au moins une molécule conjuguée de façon covalente à une poly-lysine, et
- au moins une molécule hydrophobe et non conjugable de façon covalente à une poly-lysine, ladite molécule étant encapsulée dans une micelle formée par des conjugués amphiphiles constitués chacun par au moins une molécule hydrophobe conjuguée de façon covalente à une poly-lysine.
[Revendication 2] Composition selon la revendication 1, caractérisée en ce qu'elle comprend également :
- au moins une molécule conjuguée à une poly-lysine par polymérisation, ladite molécule et la poly- lysine formant un copolymère.
[Revendication 3] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la ou les molécule(s) hydrophobe(s) et non conjugable(s) de façon covalente à une poly-lysine sont choisies parmi le cholestérol, le co-enzyme Q10, le farnésyl cystéine, la curcumine, et leurs mélanges.
[Revendication 4] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la ou les molécule(s) conjuguée(s) de façon covalente à une poly-lysine sont choisies parmi les acides gras, les antioxydants, les vitamines et leurs mélanges.
[Revendication 5] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la ou les molécule(s) conjuguée(s) de façon covalente à une poly-lysine sont choisies parmi l'acide myristique, l'acide linoléique, l'acide palmitique, l'acide palmitoléique, l'acide laurique, l'acide oléique, l'acide orotique, la spermine, la taurine, l'acide patothénique, l'acide azélaïque, GABA, la biotine, l'acide thioctique, l'acide ascorbique, acide acétique, acide propionique, acide butyrique, acide pyruvique, acide lactique, l'alpha-tocophérol, l'acide pantothénique, le glutathion et leurs mélanges.
[Revendication 6] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la ou les micelle(s) sont formées au moins par un ou plusieurs conjugués d'alpha-tocophérol conjugué de façon covalente à une poly-lysine et/ou par un ou plusieurs conjugués d'acide rétinoïque conjugué de façon covalente à une poly-lysine.
[Revendication 7] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la ou les micelle(s) sont formées au moins par un ou plusieurs conjugués d'acide(s) gras conjugué(s) de façon covalente à une poly-lysine.
[Revendication 8] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce qu'elle comprend au moins un acide aminé conjugué à une poly-lysine par polymérisation, ledit acide aminé et la poly-lysine formant un copolymère.
[Revendication 9] Composition selon la précédente revendication, caractérisée en ce l'acide aminé conjugué à une poly-lysine par polymérisation est choisie parmi la cystéine et la méthionine.
[Revendication 10] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la poly-lysine est la poly-L-lysine.
[Revendication 11] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la poly-lysine est linéaire et a un poids moléculaire compris entre 12000 à 20000 Da.
[Revendication 12] Composition selon l'une des précédentes revendications, caractérisée en ce que la poly-lysine a un contre ion bromure, ou chlore ou TFA acide trifluoroacétique.
[Revendication 13] Procédé de fabrication d'une composition selon l'une des précédentes revendications comprenant au moins une molécule hydrophobe et non conjugable de façon covalente à une poly-lysine, encapsulée dans une micelle formée par des conjugués amphiphiles constitués chacun par au moins une molécule hydrophobe conjuguée de façon covalente à une poly- lysine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes :
- a. créer un premix ampliphile : mélanger des conjugués de molécules hydrophobes conjuguées de façon covalente à une poly-lysine dans une solution aqueuse,
- b. ajouterdans le premixamphiphile, une ou plusieurs molécule(s) hydrophobe(s) non conjugable(s) à une poly-lysine, et mettre sous agitation de façon à former une micelle de molécules hydrophobes conjuguées de façon covalente à une poly-lysine encapsulant le ou les molécules hydrophobe(s).
[Revendication 14] Procédé de fabrication selon la précédente revendication, caractérisé en ce que l'agitation à l'étape b. est réalisée pendant entre 5 et 20 minutes à une vitesse d'agitation comprise entre 50 et 800 tours par minute.
[Revendication 15] Procédé de fabrication selon l'une des revendications 13 ou 14, caractérisé en ce qu'il comprend également une étape de d. de séparation des phases soluble et insoluble, pour récupérer la phase soluble.
[Revendication 16] Procédé de fabrication selon la revendication 13 à 15, caractérisé en ce que le premix de l'étape a. comprend également un ou plusieurs copolymère(s) de molécule conjuguée à une poly-lysine par polymérisation et/ou à une étape c. qui est mise en œuvre après l'étape b. ou après l'étape d., un ou plusieurs copolymère(s) de molécule conjuguée à une poly-lysine sont ajouté(s) dans le mélange.
[Revendication 17] Procédé de fabrication selon l'une des revendications 13 à 16, caractérisé en ce que le premix de l'étape a. comprend également une ou plusieurs autres molécules conjuguées de façon covalente à une poly-lysine et/ou qu'après l'étape b. ou c., une ou plusieurs autres molécules conjuguées de façon covalente à une poly-lysine sont ajoutée(s) dans le mélange.
[Revendication 18] Procédé de fabrication selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce qu'il comprend une étape de lyophilisation ou d'atomisation ou de déshydratation lente de la composition liquide obtenue préalablement pour obtenir une composition solide, puis une étape de solubilisation dans une solution aqueuse de cette composition solide. [Revendication 19] Composition sous forme solide, caractérisée en ce qu'elle est obtenue par lyophilisation ou atomisation ou une déshydratation lente d'une composition selon l'une des revendications 1 à 12.
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