EP4322755A1 - Nouveau procédé de préparation d'un isolat de protéines cationiques de lactosérum et le produit ainsi obtenu - Google Patents

Nouveau procédé de préparation d'un isolat de protéines cationiques de lactosérum et le produit ainsi obtenu

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EP4322755A1
EP4322755A1 EP21840054.7A EP21840054A EP4322755A1 EP 4322755 A1 EP4322755 A1 EP 4322755A1 EP 21840054 A EP21840054 A EP 21840054A EP 4322755 A1 EP4322755 A1 EP 4322755A1
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EP
European Patent Office
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milk
proteins
lactoferrin
cationic
protein
Prior art date
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Pending
Application number
EP21840054.7A
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German (de)
English (en)
Inventor
Takashi Mikogami
Carine LECHEVIN
Michel Bourtourault
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Savencia SA
Original Assignee
Savencia SA
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Publication date
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    • A23C2210/208—Removal of bacteria by membrane filtration; Sterile filtration of milk products

Definitions

  • the present invention relates to a new process for the preparation of a cationic whey protein isolate of high lactoferrin purity.
  • the Applicant has developed a process for obtaining a whey protein isolate whose lactoferrin protein purity is greater than 90%; this process also allows the control of the vitamin B12 (cobalamin) content in the lactoferrin isolate.
  • This process is characterized on the one hand by the use of previously concentrated dairy material (such as concentrated skimmed milk or concentrated whey) by a membrane technology (such as reverse osmosis, nanofiltration, or ultrafiltration) and on the other hand by selective extraction using strong cation exchange resins of the sulfopropyl (SP) type packed in a radial chromatography column.
  • the eluted pure lactoferrin fraction is concentrated and demineralized by ultrafiltration in order to obtain a cationic whey protein isolate whose lactoferrin purity is greater than at least 90% and preferably 95%.
  • This liquid isolate obtained is debacterized or sterilized by microfiltration and optionally dried by atomization (spray-dry) or freeze-drying (freeze-dry) to obtain the powdered isolate.
  • the method for preparing a cationic whey protein isolate of high lactoferrin purity comprises the following steps a) to f): a)
  • the starting raw material may be mammalian milk previously skimmed and concentrated by membrane technology; it may also be a mixture of mammalian milk previously skimmed and concentrated by membrane technology and skimmed milk (not concentrated); mammalian milk is for example cow's milk or goat's milk; the starting raw material can also be whey obtained from mammalian milk and concentrated beforehand; i.
  • the starting raw material when the starting raw material is prepared with a mammalian milk such as cow's milk or goat's milk, it is skimmed and optionally pasteurized, for example by a heat treatment between 60 and 78°C for a short time (a heat treatment minimum equivalent level of 72°C for 15 seconds; skimming can be performed either before or after pasteurization) or debacterized by microfiltration with a membrane porosity between 0.8 and 1.4 ⁇ m, then concentrated by reverse osmosis (OI) or nanofiltration (NF) or ultrafiltration (UF); for the implementation of the process, it is also possible to use a mixture of skimmed milk (not concentrated) and skimmed milk previously concentrated by a membrane technology as described above; the product to be treated in step b) preferably has a concentration of protein matter (MP) between 40 and 72 g/L, preferably between 43 and 57 g/L; when an RO membrane is used, the dry matter (DM) concentration of pasteurized skimmed milk is between 110 and 200 g/
  • the starting raw material when the starting raw material is prepared with whey, it can be concentrated after separation of the caseins, by acidification or the action of rennet, or by microfiltration (whose membrane has a porosity of approximately 0.1 ⁇ m), concentrated by osmosis reverse (OI) or nano filtration (NF) or ultrafiltration (UF); for the implementation of the method, it is also possible to use a mixture of whey (not concentrated) and whey previously concentrated by a membrane technology as described above; the product to be treated in step b) preferably has a protein concentration between 20 and 100 g/L, preferably between 30 and 80 g/L;
  • b) selective extraction of cationic proteins comprising the following steps: i. passage of the starting raw material (for example, pasteurized, pre-concentrated skimmed milk) through a radial flow chromatography column, containing strong cation exchange resins of the sulfopropyl SP type, preferably greater than 100 ⁇ m in diameter (e.g. SP Sepharose Big Beads from Cytiva Sweden):
  • the volume of starting raw material (expressed in volume equivalent to that of the non-concentrated raw material; that is to say that the volume indicated is that which the raw material had before being concentrated) is between 40 and 500 times, in particular between 80 and 500 times, the volume of the resins (BV, Bed Volume), preferably between 80 and 300 BV;
  • the linear flow rate of starting raw material is between 1.0 and 4.0 m/h, preferably between 2.0 and 3.0 m/h; ii. rinsing with demineralised water, preferably treated with an RO membrane (osmosis water):
  • the volume of demineralised water is between 2 and 6 BV, preferably between 3 and 5 BV;
  • the demineralized water passage speed is between 3.0 and 5.0 m/h, preferably between 3.5 and 4.5 m/h; iii. elution of fixed cationic proteins with a saline solution (NaCl in demineralised water, preferably osmosis water) with an electrical conductivity between 30 and 50 mS/cm:
  • the volume of the saline solution is between 4 and 8 BV, preferably between 5 and 7 BV;
  • the speed of passage of the saline solution is between 0.3 and 2.0 m/h, preferably between 0.5 and 1.0 m/h; iv. elution of fixed cationic proteins with a saline solution (NaCl in demineralised water, preferably osmosis water) with electrical conductivity between 80 and 140 mS/cm, preferably between 90 and 110 mS/cm:
  • the volume of the saline solution is between 3 and 6 BV, preferably between 4 and 5 BV;
  • the passage speed of the saline solution is between 0.5 and 2.5 m/h, preferably between 1.0 and 2.0 m/h;
  • the step of passing over cation exchange resins is used to fix cationic proteins present in the starting raw material while letting through major constituents of skimmed milk such as lactose, minerals, acid proteins such as caseins, ⁇ -lactoglobulin, ⁇ -lactoglobulin, serum albumin and most immunoglobulins.
  • the first elution step serves for a selective extraction of specific cationic proteins by keeping the majority of lactoferrin, the major cationic protein of milk, fixed on the resins. The pure fraction of bovine lactoferrin is therefore eluted in the second eluate.
  • a dairy material from mammals for example, pasteurized skimmed cow's milk, cheese whey from pasteurized goat's milk
  • UF/NF/OI membrane makes it possible to reduce the rate of passage of flux for the equivalent amount of protein present for one pass through an extraction column. Thanks to this extension of contact time with strong cation exchange resins of the SP type, the efficiency of extraction of cationic proteins is significantly improved.
  • This combination of concentrated dairy material and a radial flow column is essential to run industrial production in a stable and regular manner.
  • Another advantage of the process according to the invention is that it can be carried out effectively over a wide temperature range; in particular, while resin manufacturers recommend implementation at temperatures between 30 and 50°C, the Applicant has succeeded in developing an effective cold process, that is to say at temperatures below at 15°C, preferably below 10°C.
  • the present invention thus relates to an isolate of cationic whey proteins enriched in lactoferrin obtained or capable of being obtained by the process according to the invention, such that the proportion of proteins on dry matter is greater than or equal to 90% by weight and in which the proportion of lactoferrin to the total proteins is greater than 90% by weight, preferably greater than 95% by weight, even more preferably greater than 98% by weight.
  • the present invention also relates to a lactoferrin-enriched cationic whey protein isolate from milk or whey from cow's milk or goat's milk. obtained or capable of being obtained by the process according to the invention, the proportion of proteins on dry matter of which is greater than or equal to 90% by weight, the proportion of lactoferrin on the total proteins is greater than 95% by weight (p / p), preferably greater than 98% by weight, and containing cobalamin in complex form with transcobalamin at a concentration less than or equal to 5 pg / g of protein, in particular, the concentration of cobalamin in complex form with transcobalamin is included between 1 to 5 pg/g protein.
  • the present invention also relates to an isolate of cationic whey proteins enriched in lactoferrin derived from milk or whey derived from cow's milk or goat's milk obtained or capable of being obtained by the process according to the invention whose proportion protein on dry matter is greater than or equal to 90% by weight, the proportion of lactoferrin to total protein is greater than 90% (w/w), preferably greater than 95% by weight, containing cobalamin in complex form with transcobalamin at a concentration greater than or equal to 5 ⁇ g/g, preferably greater than or equal to 8 ⁇ g/g, even more preferably greater than or equal to 10 ⁇ g/g of proteins.
  • the isolates according to the invention can be in liquid form (step f not implemented) or in powder form (implementation of step f).
  • it In the case where it is in liquid form, it has the same characteristics as the powder in terms of composition relative to the dry matter and generally comprises between 5 and 25%, preferably between 10 and 20%, by weight of water. .
  • the present invention relates to a food product for human or animal consumption, to a human or animal medicine or to a food supplement containing a cationic protein isolate according to the invention.
  • the isolates according to the invention have a microbial load such that the count of the aerobic mesophilic flora is less than 1000, preferably less than 100 or 10 and even more preferably less than 1 cfu/g of isolate powder according to the invention or less than 100, preferably less than 10, even more preferably less than 1 cfu/ml of liquid isolate.
  • the combination of the use of a concentrated dairy material and a radial flow column makes it possible to produce, in a stable and efficient manner, two kinds of isolates of high purity in lactoferrin by cation exchange chromatography by choosing the appropriate conditions:
  • Such isolates according to the invention are of particular interest for the preparation of infant milks (milks for infants or follow-on milks) based on cow's or goat's milk.
  • This isolate may have a nutritional advantage for a food supplement intended for vegetarians or for a nutritional preparation intended for people deficient in the absorption of vitamin B12 such as people who have undergone a gastrectomy or people chronically treated with PPIs (inhibitors of proton pump).
  • this isolate can provide, in addition to the benefits of lactoferrin, an important source of vitamin B 12 of high bioavailability even in a situation of absence of the intrinsic factor secreted by the stomach.
  • the present invention thus also relates to food supplements comprising the isolate according to the invention enriched with vitamin B 12, that is to say an isolate whose lactoferrin protein purity is > 90% or 95% and whose vitamin B 12 content is >5 pg/g protein, preferably >8 pg/g protein, even more preferably greater than or equal to 10 pg/g protein.
  • the content of isolate according to the invention in the food supplement will be chosen according to the profile of the population to be supplemented, therefore the dose of vitamin B 12 to be administered, and the vitamin B 12 content of the isolate.
  • a daily dose of 150 to 1000 mg in protein of the isolate according to the invention enriched with vitamin B 12 at 6 pg/g of protein can provide 0.9 to 6.0 pg of vitamin B 12 in complex form. with transcobalamin.
  • 100 to 600 mg of protein from the isolate according to the invention enriched with vitamin B12 at 10 pg/g of protein can provide 1.0 to 6.0 pg of vitamin B 12 in complex form with transcobalamin.
  • a food supplement can cover the needs of each population group shown in the table below even if the intestinal absorption of vitamin B 12 is disturbed.
  • the present invention also relates to an isolate whose lactoferrin protein purity is >90% or 95% and whose vitamin B12 content is > 5 pg/g of protein, preferably > 8 pg/g of protein, more preferably at >10 pg/g of protein to prevent and/or treat deficient absorption of vitamin B 12, for example in patients having undergone a gastrectomy or chronically treated with PPIs (proton pump inhibitors).
  • Cobalamin vitamin B 12
  • the invention therefore relates to food products for human or animal consumption comprising an isolate according to the invention; in the context of infant formulas, either infant formulas/milks or/and follow-on formulas/milks, an isolate whose lactoferrin protein purity is >95% and whose vitamin B 12 content is preferably used is ⁇ 5 pg/g protein.
  • the degree of incorporation of the isolate according to the invention is from 50 to 1000 mg of protein in one liter of a ready-to-eat formula.
  • the present invention also relates to non-food products, such as hygiene products and cosmetic products comprising an isolate according to the invention.
  • Also included in the present invention are products for the hygiene of the oral cavity, such as toothpastes in gel or paste form, mouthwashes, chewing gums, comprising an isolate according to the invention.
  • the incorporation rate of the isolate according to the invention is from 1 to 100 mg of protein in one gram of a product.
  • Figure 1 Schematic representation of the process for obtaining the cationic whey protein isolate of high lactoferrin purity.
  • Figure 2 Pressure drop generated by the radial flow column and different parameters of the passage of pasteurized skimmed milk (concentrations in DM and in MP, flow rates in DM and in MP) (example 4)
  • Figure 4 PI HPLC profile (reverse phase high performance liquid chromatography; C18 300 ⁇ column, 0.1% TFA in H2O/CH3CN in gradient, detection at 280 nm) of ingredient 1 of example 5.
  • Figure 5 SEC HPLC profile (size exclusion high performance liquid chromatography; TSK G3000PWxl column, CH3CN/H20/TFA, detection at 210 nm) of ingredient 1 of example 5. Indications of molecular weights top according to the retention times of the control proteins.
  • Figure 7 PI HPLC profile of ingredient 3 of example 6.
  • Example 1 Benchtop test with pasteurized skimmed cow's milk (control)
  • Pasteurized skimmed cow's milk was passed through an axial flow column (1.6 cm in diameter) containing 20 mL (BV) of SP Sepharose Big Beads at a linear speed of 400 cm/h at variable volume of pasteurized skimmed milk;
  • Example 2 Benchtop test with concentrated pasteurized skimmed cow's milk
  • Cow's milk was skimmed, then pasteurized at 73°C for 20 seconds, then cooled to 6°C.
  • This pasteurized skimmed cow's milk with a DM of 92 g/L was concentrated by reverse osmosis to 130 g/L of DM at 6°C.
  • the concentration of bovine lactoferrin in this concentrated pasteurized skimmed milk was measured by HPLC SCX (Propac SCX column, 20 mM phosphate buffer in NaCl gradient, detection at 280 nm);
  • Example 3 Benchtop test with concentrated pasteurized skimmed cow's milk
  • Cow's milk was skimmed, then pasteurized at 73°C for 20 seconds, then cooled to 6°C.
  • This pasteurized skimmed cow's milk with a DM of 92 g/L was concentrated by reverse osmosis to 130 g/L of DM at 6°C.
  • the concentration of bovine lactoferrin in this concentrated pasteurized skimmed milk was measured by HPLC SCX (Propac SCX column, 20 mM phosphate buffer in NaCl gradient, detection at 280 nm);
  • the cobalamin content (vitamin B 12) in this 2nd eluate was also measured by the AO AC method. Thus, its content by total protein was obtained.
  • Example 4 Industrial scale test with pasteurized skimmed cow's milk (control) Although pasteurized skimmed milk concentrated at -130 g/L can pass through a bench-scale axial column, it is difficult to consider a stable production over time on an industrial scale with the passage of a complex matrix such as a dairy material, in particularly concentrated, both because of a high pressure drop and clogging of the filtering surface.
  • compositions of these non-concentrated and concentrated pasteurized skimmed milks are as follows:
  • DM dry matter
  • MAT total nitrogenous matter
  • MP protein materials
  • Table 4 Composition of the starting skimmed milks 3) After having prepared the concentration level of pasteurized skimmed milk by mixing in line, it is passed at different flow rates through the radial flow column previously prepared at a temperature of 10°C .
  • Example 5 industrial trial for the manufacture of pure whey isolate in bovine lactoferrin with concentrated pasteurized skimmed milk
  • Cow's milk was skimmed, then pasteurized at 73°C for 20 seconds, then cooled to 6°C, then concentrated by reverse osmosis to 128 g/L DM at 6°C;
  • Steps 2-4 were repeated 10 times;
  • Example 6 industrial test for the manufacture of pure whey isolate in bovine lactoferrin with concentrated pasteurized skimmed milk
  • Cow's milk was skimmed, then pasteurized at 73°C for 20 seconds, then cooled to 6°C, then concentrated by reverse osmosis to 120 g/L DM at 6°C;
  • Steps 2-4 were repeated 15 times;
  • the whey protein isolate enriched with bovine lactoferrin obtained in the form of the microfiltrate has undergone the following additional treatments in order to guarantee the stability of this protein fraction: i. Part of the microfiltrate was microfiltered on a 0.2 ⁇ m PES membrane (Supor® Pali), then placed in sterilized 1 L bottles (Ingredient 3) ii. The rest of the microfiltrate underwent spray drying and 60 kg of powder were obtained (Ingredient 2).
  • the concentration of caprine ⁇ -lactoglobulin and caprine ⁇ -lactalbumin in this concentrated whey was measured by SEC HPLC (column TSK G3000PWxl, CH3CN/H20/TFA, detection at 210 nm).
  • the caprine lactoferrin concentration in this concentrated whey was measured by HPLC SCX (Propac SCX column, 20 mM phosphate buffer in NaCl gradient, detection at 280 nm).
  • Example 8 bench test with concentrated cheese whey from pasteurized skimmed goat's milk 1) 240 L of cheese whey from pasteurized goat's milk (at 74 ° C for 30 seconds) was concentrated on an ultrafiltration (membrane organic spiral with MWCO of 10 kDa).
  • the compositions of the retentate obtained (60 L) were in the table below:
  • the concentration of caprine ⁇ -lactoglobulin and caprine ⁇ -lactalbumin in this concentrated whey was measured by SEC HPLC (column TSK G3000PWxl, CH3CN/H20/TFA, detection at 210 nm).
  • the caprine lactoferrin concentration in this concentrated whey was measured by HPLC SCX (Propac SCX column, 20 mM NaPB/NaCl gradient, detection at 280 nm).
  • Example 9 test for the preparation of powdered infant milk supplemented with bovine lactoferrin (low Vitamin B 12 content)
  • a cow's milk powdered infant formula was prepared by a standard manufacturing process by formulating with skimmed cow's milk, lactose, maltodextrins, oleic sunflower oil, anhydrous milk fat, demineralized whey, protein solubles, galacto-oligosaccharides, sunflower oil, rapeseed oil, soya lecithin, sunflower lecithin, calcium phosphate, fish oil, potassium phosphate, Mortierella alpina oil, choline bitartrate, calcium chloride, potassium citrate , magnesium citrate, sodium chloride, fructo-oligosaccharides, vitamin C, ferric pyrophosphate, calcium carbonate, taurine, potassium hydroxide, potassium chloride, inositol, nucleotides, L-phenylalanine, extract rich in tocopherols, L-palmitate ascorbyl, zinc sulphate, L-tryptophan, vitamin E, potassium iodide, L-carnitine
  • Table 11 The composition of a powdered infant milk incorporated in ingredient 1
  • Example 10 trial of nutritional formulation in powder supplemented with bovine lactoferrin (high Vitamin B 12 content)
  • a milk for infants (foodstuffs intended for special medical purposes, or DADFMS) in powder form made from cow's milk was prepared by a standard manufacturing process by formulating with skimmed milk, vegetable oils (palm, rapeseed, copra , sunflower), demineralized soluble protein, lactose, starch, carob seed flour, lecithin, calcium citrate, fish oil, Mortierella alpina oil, calcium carbonate, vitamin C, calcium phosphate, potassium citrate, potassium citrate, sodium, calcium hydroxide, choline chloride, taurine, vitamin E, inositol, ferrous sulfate, L-tryptophan, potassium chloride, calcium chloride, high tocopherol extract, L-ascorbyl palmitate, L-carnitine, magnesium sulfate , nucleotides, zinc sulfate, vitamin A, nicotinamide, vitamin K, vitamin D, calcium pantothenate, copper sulfate, thia
  • DADFMS infant milk powder was mixed with ingredient 2 at an incorporation rate of 400 mg/100 g.
  • An intake of 3.1 pg of vitamin B 12 in complex form with transcobalamin per 100 g of the powder formulation was obtained by this incorporation of ingredient 2.
  • Example 11 test of nutritional powder formulation supplemented with bovine lactoferrin (high Vitamin B 12 content)
  • a milk for infants (dietary foods for special medical purposes, DADFMS) in liquid from cow's milk was prepared by a manufacturing process standard by formulating with Skimmed milk, soluble demineralized proteins, vegetable oils (palm, palm kernel, rapeseed, sunflower), lactose, soy lecithin, sunflower lecithin, sodium citrate, calcium phosphate, potassium citrate, calcium chloride, carbonate calcium, vitamin C, Mortierella alpina oil, fish oil, calcium hydroxide, potassium chloride, vitamin E, choline chloride, taurine, ferrous sulphate, extract rich in tocopherols, L-ascorbyl palmitate, inositol, sulphate of zinc, nucleotides, L-carnitine, nicotinamide, vitamin A, magnesium sulphate, vitamin K, vitamin D, calcium pantothenate, copper sulphate, thiamin, vitamin B6, riboflavin, manganese sulphate, folic acid
  • DADFMS infant milk in liquid form was sterilized by ultra-high temperature (UHT) heat treatment, then mixed with ingredient 3 with an incorporation rate of 410 mg/100 g (on dry matter).
  • UHT ultra-high temperature
  • An intake of 0.43 pg of vitamin B 12 in complex form with transcobalamin per 100 mL of the liquid formulation was obtained by this incorporation of ingredient 3.
  • Example 12 preparation of a food supplement in capsule form using bovine lactoferrin (high Vitamin B 12 content)
  • a food supplement in capsule form was prepared from the mixture of ingredient 2 of Example 5 (99.5% of the mixture) and colloidal silica (0.5% of the mixture). Each capsule contains 200 mg of protein.
  • the content of vitamin B 12 in complex form with transcobalamin is 1.6 pg/capsule.
  • the recommended daily dose for each population group is as follows:

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Abstract

La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de préparation d'un isolat de protéines cationiques de lactosérum de pureté élevée en lactoferrine.

Description

Nouveau procédé de préparation d’un isolat de protéines cationiques de lactosérum et le produit ainsi obtenu
La présente invention se rapporte à un nouveau procédé de préparation d’un isolat de protéines cationiques de lactosérum de pureté élevée en lactoferrine.
La Demanderesse a mis au point un procédé d’obtention d’un isolat de protéines de lactosérum dont la pureté protéique en lactoferrine est supérieure à 90% ; ce procédé permet en outre le contrôle de la teneur en vitamine B12 (cobalamine) dans l’isolat de lactoferrine.
Ce procédé est caractérisé d’une part par une utilisation de matière laitière préalablement concentrée (telle que le lait écrémé concentré ou le lactosérum concentré) par une technologie membranaire (telle que l’osmose inverse, la nanofiltration, ou l’ultrafiltration) et d’autre part par une extraction sélective en utilisant les résines échangeuses de cations fortes de type sulfopropyl (SP) packées dans une colonne de chromatographie radiale. La fraction pure en lactoferrine éluée est concentrée et déminéralisée par ultrafiltration afin d’obtenir un isolat de protéines cationiques de lactosérum dont la pureté en lactoferrine est supérieure à au moins 90% et de préférence à 95%. Cet isolat liquide obtenu est débactérisé ou stérilisé par une microfiltration et optionnellement séché par atomisation (spray-dry) ou lyophilisation ( freeze - dry) pour obtenir l’isolat en poudre.
Le procédé de préparation d’un isolat de protéines cationiques de lactosérum de pureté élevée en lactoferrine comprend les étapes a) à f) suivantes : a) La matière première de départ peut être un lait de mammifère préalablement écrémé et concentré par une technologie membranaire ; il peut aussi s’agir d’un mélange de lait de mammifère préalablement écrémé et concentré par une technologie membranaire et de lait écrémé (non concentré) ; le lait de mammifère est par exemple du lait de vache ou du lait de chèvre ; la matière première de départ peut aussi être du lactosérum issu de lait de mammifère et préalablement concentré ; i. lorsque la matière première de départ est préparée avec un lait mammifère tel que du lait de vache ou du lait de chèvre, il est écrémé et optionnellement pasteurisé, par exemple par un traitement thermique entre 60 et 78 °C de courte durée (un traitement thermique minimum de niveau équivalent de 72°C pendant 15 secondes ; l’écrémage peut être exécuté soit avant ou après la pasteurisation) ou débactérisé par une microfiltration avec une membrane de porosité entre 0,8 et 1,4 pm, puis concentré par osmose inverse (OI) ou nano filtration (NF) ou ultrafiltration (UF) ; pour la mise en œuvre du procédé, on peut aussi utiliser un mélange de lait écrémé (non concentré) et de lait écrémé préalablement concentré par une technologie membranaire telle que décrite ci- avant ; le produit à traiter à l’étape b) a de préférence une concentration en matière protéique (MP) entre 40 et 72 g/L, de préférence entre 43 et 57 g/L ; quand une membrane d’OI est utilisée, la concentration de matière sèche (MS) de lait écrémé pasteurisé est entre 110 et 200 g/L, de préférence entre 120 et 160 g/L ; ii. lorsque la matière première de départ est préparée avec du lactosérum, il peut être concentré après séparation des caséines, par acidification ou action de présure, soit par microfiltration (dont la membrane a une porosité d’environ 0,1 pm), concentré par osmose inverse (OI) ou nano filtration (NF) ou ultrafiltration (UF) ; pour la mise en œuvre du procédé, on peut aussi utiliser un mélange de lactosérum (non concentré) et de lactosérum préalablement concentré par une technologie membranaire telle que décrite ci-avant ; le produit à traiter à l’étape b) a de préférence une concentration en protéines entre 20 et 100 g/L, de préférence entre 30 et 80 g/L ;
Il convient de noter que les traitements de pasteurisation et de microfiltration ne sont pas indispensables pour la conduite du procédé. b) extraction sélective de protéines cationiques comprenant les étapes suivantes : i. passage de la matière première de départ (par exemple, un lait écrémé pasteurisé, préconcentré) au travers d’une colonne de chromatographie en flux radial (« radial flow chromatography »), contenant les résines échangeuses de cations fortes de type sulfopropyl SP, de préférence supérieur à 100 pm de diamètre (par exemple, SP Sepharose Big Beads de Cytiva Sweden) :
- Le volume de matière première de départ (exprimé en volume équivalent à celui de la matière première non concentrée ; c’est-à-dire que le volume indiqué est celui qu’avait la matière première avant d’être concentrée) est compris entre 40 et 500 fois, en particulier entre 80 et 500 fois de volume des résines (BV, Bed Volume), de préférence entre 80 et 300 BV ;
- La vitesse linéaire de passage de matière première de départ est comprise entre 1,0 et 4,0 m/h, de préférence entre 2,0 et 3,0 m/h ; ii. rinçage avec de l’eau déminéralisée, de préférence traitée par une membrane d’OI (eau osmosée) :
- Le volume d’eau déminéralisée est compris entre 2 et 6 BV, de préférence entre 3 et 5 BV ;
- La vitesse de passage d’eau déminéralisée est comprise entre 3,0 et 5,0 m/h, de préférence entre 3,5 et 4,5 m/h ; iii. élution des protéines cationiques fixées avec une solution saline (NaCl dans de l’eau déminéralisée, de préférence de l’eau osmosée) à conductivité électrique entre 30 et 50 mS/cm :
- Le volume de la solution saline est compris entre 4 et 8 BV, de préférence entre 5 et 7 BV ;
- La vitesse de passage de la solution saline est comprise entre 0,3 et 2,0 m/h, de préférence entre 0,5 et 1,0 m/h ; iv. élution des protéines cationiques fixées avec une solution saline (NaCl dans de l’eau déminéralisée, de préférence de l’eau osmosée) à conductivité électrique entre 80 et 140 mS/cm, de préférence entre 90 et 110 mS/cm :
- Le volume de la solution saline est compris entre 3 et 6 BV, de préférence entre 4 et 5 BV ;
- La vitesse de passage de la solution saline est comprise entre 0,5 et 2,5 m/h, de préférence entre 1,0 et 2,0 m/h ;
L’étape de passage sur des résines échangeuses de cations sert à la fixation de protéines cationiques présentes dans la matière première de départ tout en laissant passer des constituants majeurs du lait écrémé tels que le lactose, les minéraux, les protéines acides comme les caséines, la P-lactoglobuline, l’a-lactoglobuline, l’albumine sérique et la plupart des immunoglobulines. La première étape d’élution sert à une extraction sélective de protéines cationiques spécifiques en gardant la majorité de la lactoferrine, la protéine majeure de protéines cationiques de lait, fixée sur les résines. La fraction pure de lactoferrine bovine est donc éluée dans le deuxième éluat. c) concentration des protéines cationiques de pureté élevée en lactoferrine éluées dans la solution saline en utilisant une membrane d’ultrafiltration ayant un seuil de coupure (MWCO) compris entre 10 et 20 kDa ; d) déminéralisation des protéines cationiques de pureté élevée en lactoferrine par une diafiltration avec de l’eau déminéralisée, de préférence l’eau osmosée, en utilisant une membrane d’ultrafiltration de MWCO compris entre 10 et 20 kDa pour atteindre un ratio cendre s/protéine s compris entre 0,001 et 0,03, de préférence entre 0,003 et 0,01 ; e) microfiltration avec une membrane ayant un seuil de coupure compris entre 0,2 et 1,4 pm, de préférence 0,8 et 1,4 pm en double couche, de la solution concentrée de protéines cationiques spécifiques afin d’en réduire la charge microbienne ; f) optionnellement, séchage par atomisation ou par lyophilisation de la solution concentrée de protéines cationiques spécifiques préalablement microfiltrée afin d’obtenir un isolat de lactoferrine en poudre.
Avantageusement, l’utilisation d’une matière laitière de mammifères (par exemple, le lait de vache écrémé pasteurisé, le lactosérum de fromagerie issu de lait de chèvre pasteurisé) concentrée par membrane UF/NF/OI permet de réduire la vitesse de passage de flux pour la quantité équivalente de protéines présente pour un passage à travers d’une colonne d’extraction. Grâce à cette prolongation de temps de contact avec les résines échangeuses de cations fortes de type SP, l’efficacité d’extraction des protéines cationiques est nettement améliorée.
En outre, étonnamment, l’utilisation d’une colonne flux radial (ex. celle de Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH), en raison de la géométrie trapézoïdale de cette colonne, permet de supporter durablement la pression générée par passage d’une matière laitière de mammifères concentrée à travers de résines packées (packed resins).
Cette combinaison d’une matière laitière concentrée et une colonne de flux radial est essentielle pour exécuter une production industrielle de façon stable et régulière.
Un autre avantage du procédé selon l’invention est qu’il peut être conduit efficacement dans une large gamme de température ; en particulier, alors que les fabricants de résine recommandent une mise en œuvre à des températures comprises entre 30 et 50°C, la Demanderesse est parvenue à mettre au point un procédé efficace à froid, c’est-à-dire à des températures inférieures à 15°C, de préférence, inférieures à 10°C.
La présente invention se rapporte ainsi à un isolat de protéines cationiques de lactosérum enrichi en lactoferrine obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention, tel que la proportion de protéines sur matière sèche est supérieure ou égale à 90% en poids et dont la proportion de la lactoferrine sur les protéines totales est supérieure à 90% en poids, de préférence supérieure à 95% en poids, encore préférentiellement supérieur à 98% en poids.
La présente invention se rapporte également à un isolat de protéines cationiques de lactosérum enrichi en lactoferrine issu de lait ou de lactosérum issu de lait de vache ou de lait de chèvre obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention dont la proportion de protéines sur matière sèche est supérieure ou égale à 90% en poids, la proportion de la lactoferrine sur les protéines totales est supérieure à 95% en poids (p/p), de préférence supérieure à 98% en poids, et contenant la cobalamine sous forme complexe avec transcobalamine à une concentration inférieure ou égale 5 pg/g de protéines, en particulier, la concentration de cobalamine sous forme complexe avec la transcobalamine est comprise entre 1 à 5 pg/g de protéines.
La présente invention se rapporte encore à un isolat de protéines cationiques de lactosérum enrichi en lactoferrine issu de lait ou de lactosérum issu de lait de vache ou de lait de chèvre obtenu ou susceptible d’être obtenu par le procédé selon l’invention dont la proportion de protéines sur matière sèche est supérieure ou égale à 90% en poids, la proportion de la lactoferrine sur les protéines totales est supérieure à 90% (p/p), de préférence supérieure à 95% en poids, contenant la cobalamine sous forme complexe avec transcobalamine à une concentration supérieure ou égale à 5 pg/g, de préférence supérieure ou égale à 8 pg/g, encore préférentiellement supérieure ou égale à 10 pg/g de protéines.
Les isolats selon l’invention peuvent se présenter sous forme liquide (étape f non mise en œuvre) ou sous forme de poudre (mise en œuvre de l’étape f). Dans le cas où elle est sous forme liquide, elle présente les mêmes caractéristiques que la poudre en termes de composition par rapport à la matière sèche et comprend généralement entre 5 et 25%, de préférence entre 10 et 20%, en poids d’eau.
Selon un autre de ses objets, la présente invention se rapporte à un produit alimentaire pour l’alimentation humaine ou animale, à un médicament humain ou animal ou à un complément alimentaire contenant un isolat de protéines cationiques selon l’invention.
De préférence, les isolats selon l’invention ont une charge microbienne telle que le dénombrement de la flore mésophile aérobie est inférieur à 1000, préférentiellement inférieur à 100 ou 10 et encore préférentiellement inférieure à 1 ufc/g de poudre d’isolat selon l’invention ou inférieur à 100, préférentiellement inférieur à 10, encore préférentiellement inférieur à 1 ufc/ml d’isolat liquide. La combinaison d’utilisation d’une matière laitière concentrée et d’une colonne flux radial permet de produire de façon stable et efficace, deux sortes d’isolats de pureté élevée en lactoferrine par la chromatographie par échange de cations en choisissant les conditions appropriées :
- un isolat dont la pureté protéique de lactoferrine est > 95% ou à 98% et dont la teneur en vitamine B 12 est < 5 pg/g de protéines ou comprise entre 1 et 5 pg/g de protéines ; De tels isolats selon l’invention trouvent un intérêt particulier pour la préparation de laits infantiles (laits pour nourrisson ou laits de suite) à base de lait de vache ou de chèvre. et
- un isolat dont la pureté protéique de lactoferrine est > 90% ou 95% et dont la teneur en vitamine B 12 est > 5 pg/g de protéines, de préférence > 8 pg/g de protéines, encore de préférence > 10 pg/g de protéines ;
Cet isolat peut présenter un avantage nutritionnel pour un complément alimentaire destiné aux végétariens ou pour une préparation nutritionnelle destinée aux personnes déficientes pour l’absorption de vitamine B12 telles que les personnes ayant subi une gastrectomie ou des personnes traitées chroniquement avec des IPP (inhibiteurs de la pompe à protons). En effet, cet isolat peut apporter, en plus de bénéfices de la lactoferrine, une source importante de vitamine B 12 de biodisponibilité élevée même en situation d’absence du facteur intrinsèque sécrété par l’estomac.
La présente invention se rapporte ainsi également à des compléments alimentaires comprenant l’isolat selon l’invention enrichi en vitamine B 12, c’est-à-dire un isolat dont la pureté protéique de lactoferrine est > 90% ou 95% et dont la teneur en vitamine B 12 est > à 5 pg/g de protéines, de préférence à > 8 pg/g de protéines, encore préférentiellement supérieure ou égale à 10 pg/g de protéines.
La teneur en isolat selon l’invention dans le complément alimentaire sera choisie en fonction du profil de la population à supplémenter, donc de la dose de vitamine B 12 à administrer, et de la teneur en vitamine B 12 de l’isolat. Par exemple, une dose journalière de 150 à 1000 mg en protéines de l’isolat selon l’invention enrichi en vitamine B 12 à 6 pg/g de protéines peut apporter 0,9 à 6,0 pg de vitamine B 12 sous forme complexe avec transcobalamine. Aussi, 100 à 600 mg en protéines de l’isolat selon l’invention enrichi en vitamine B12 à 10 pg/g de protéines peut apporter 1,0 à 6,0 pg de vitamine B 12 sous forme complexe avec transcobalamine. Ainsi, un tel complément alimentaire peut couvrir les besoins de chaque groupe de population montrés dans le tableau ci-dessous même si l’absorption intestinale de vitamine B 12 est perturbée.
Références nutritionnelles pour la vitamine B 12 (pg/j) selon ANSES 2016 |
La présente invention se rapporte encore à un isolat dont la pureté protéique de lactoferrine est >90% ou 95% et dont la teneur en vitamine B12 est > à 5 pg/g de protéines, de préférence à > 8 pg/g de protéines, encore de préférence à > 10 pg/g de protéines pour prévenir et/ou traiter une absorption déficiente en vitamine B 12, par exemple chez des patients ayant subi une gastrectomie ou traités chroniquement avec des IPP (inhibiteurs de la pompe à protons). La cobalamine (vitamine B 12) est présente dans le lait sous forme de complexe avec une protéine fixatrice. Dans le lait de vache, elle est présente sous forme complexe avec la transcobalamine qui est une protéine cationique de 43 kDa (S. N. Fedosov, T.E. Petersen, E. Nexp, Transcobalamin fromcow milk: isolation and physico-chemical properties, Biochimica et Biophysica Acta - Protein Structure and Molecular Enzymology. 1292 (1996) 113-119). L’intérêt nutritionnel de ce complexe cobalamine -transcobalamine est important, puisqu’il semblerait qu’il soit responsable de la biodisponibilité de vitamine B 12 (S.N. Fedosov, Ebba Nexo, Christian W. Heegaard, Vitamin B 12 and its binding proteins in milk from cow and buffalo in relation to bioavailability of B 12, Journal of Dairy Science. American Dairy Science Association. 102 (2019) 4891-4905).
Bien que le comportement de ce complexe lors du traitement par chromatographie par échange de cations soit proche de celui de la lactoferrine, il est possible de faire varier la teneur en vitamine B 12 dans l’éluat obtenu par le procédé selon l’invention en fonction des conditions utilisées.
En outre, malgré son intérêt nutritionnel, pour certaines applications (ex. formules infantiles, soit préparations/laits pour nourrissons ou/et préparations/laits de suite) dans certains cas spécifiques (dose d’incorporation élevée), il peut y avoir un intérêt de limiter cette teneur en vitamine B 12 dans un ingrédient de fraction pure en lactoferrine. Dans ce contexte, le procédé selon l’invention, qui permet d’ajuster la teneur finale en vitamine B 12, présente un grand intérêt.
L’invention se rapporte donc à des produits alimentaires pour l’alimentation humaine ou animale comprenant un isolat selon l’invention ; dans le cadre de formules infantiles, soit préparations/laits pour nourrissons ou/et préparations/laits de suite, on utilisera de préférence un isolat dont la pureté protéique de lactoferrine est >95% et dont la teneur en vitamine B 12 est < 5 pg/g de protéines. Le taux d’incorporation de l’isolat selon invention est de 50 à 1000 mg en protéines dans un litre d’une formule prêt à consommer.
La présente invention se rapporte également à des produits non alimentaires, tels que des produits d’hygiène et des produits cosmétiques comprenant un isolat selon l’invention.
Sont également inclus dans la présente invention, les produits d'hygiène de la cavité buccale, tels que les dentifrices sous forme de gel ou de pâte, les bains de bouche, les gommes à mâcher, comprenant un isolat selon l'invention. Le taux d’incorporation de l’isolat selon invention est de 1 à 100 mg en protéines dans un gramme d’un produit.
FIGURES
Figure 1 : Représentation schématique du procédé d’obtention de l’isolat de protéines cationiques de lactosérum de pureté élevée en lactoferrine.
Figure 2 : Perte de charge générée par la colonne à flux radial et différents paramètres du passage de lait écrémé pasteurisé (concentrations en MS et en MP, débits en MS et en MP) (exemple 4)
Figure 3 : Corrélation entre la perte de charge générée par la colonne à flux radial et différents paramètres du passage de lait écrémé pasteurisé (débits en MS et en MP) (exemple 4)
Figure 4 : Profil CLHP PI (Chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse ; colonne C18 300 Â, 0.1% TFA dans H2O/CH3CN en gradient, détection à 280 nm) de l’ingrédient 1 de l’exemple 5.
Figure 5 : Profil CLHP SEC (Chromatographie en phase liquide à haute performance d’exclusion stérique ; colonne TSK G3000PWxl, CH3CN/H20/TFA, détection à 210 nm) de l’ingrédient 1 de l’exemple 5. Les indications de poids moléculaires en haut selon les temps de rétention des protéines témoins.
Figure 6 : Profil CLHP PI de l’ingrédient 2 de l’exemple 6.
Figure 7 : Profil CLHP PI de l’ingrédient 3 de l’exemple 6.
Exemple 1 : essai en paillasse avec le lait de vache écrémé pasteurisé (témoin)
1) Le lait de vache écrémé dont la MS est 92 g/L a été pasteurisé à 73 °C pendant 20 secondes, puis refroidi à 6°C. La concentration de lactoferrine bovine dans ce lait écrémé pasteurisé a été mesurée par CLHP SCX (Chromatographie en phase liquide à haute performance par échange de cations fortes ; colonne Propac SCX, 20 mM tampon phosphate en gradient de NaCl, détection à 280 nm) ;
2) Le lait de vache écrémé pasteurisé a été passé sur une colonne de flux axial (1,6 cm de diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads à une vitesse linéaire de 400 cm/h à volume variable de lait écrémé pasteurisé ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l’eau osmosée, les protéines fixées sont éluées avec 6 BV d’une solution de NaCl à 10% (p/v) à 20°C ;
4) La teneur en lactoferrine bovine de chaque éluat a été mesurée par CLHP PI (Chromatographie en phase liquide à haute performance en phase inverse ; colonne C18 300 Â, 0.1% TFA/CH3CN gradient, détection à 280 nm). Ainsi, la quantité de lactoferrine bovine dans chaque éluat a été obtenue.
Les conditions et les résultats des essais sont montrés dans le Tableau 1 :
Tableau 1 - Lactoferrine bovine obtenue avec le passage de lait écrémé à 92 g/L
Exemple 2 : essai en paillasse avec le lait de vache écrémé pasteurisé concentré
1) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 °C pendant 20 secondes, puis refroidi à 6°C. Ce lait de vache écrémé pasteurisé dont la MS est 92 g/L a été concentré par une osmose inverse jusqu’à 130 g/L de MS à 6°C. La concentration de lactoferrine bovine dans ce lait écrémé pasteurisé concentré a été mesurée par CLHP SCX (colonne Propac SCX, 20 mM tampon phosphate en gradient de NaCl, détection à 280 nm) ;
2) Le lait de vache écrémé pasteurisé concentré (130 g/L de MS) est passé sur une colonne de flux axial (1,6 cm de diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads à une vitesse linéaire variable à volume variable de lait écrémé pasteurisé ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l’eau osmosée, des protéines fixées sont éluées avec 5 BV d’une solution de NaCl à 10% (p/v) à 20°C ;
4) La teneur en lactoferrine bovine de chaque éluat a été mesurée par CLHP PI (colonne C18 300 Â, 0.1% TFA/CH3CN gradient, détection à 280 nm). Ainsi, la quantité de lactoferrine bovine dans chaque éluat a été obtenue.
Les conditions et les résultats des essais sont présentés dans le Tableau 2 :
Tableau 2 - Lactoferrine bovine obtenue avec le passage de lait écrémé concentré à 130 g/L *Les valeurs équivalentes avec le lait écrémé pasteurisé non concentré (dont la MS est de 92 g/L).
La comparaison des tableaux 1 et 2 montre que le rendement en lactoferrine bovine obtenue est bien supérieur (>20%) avec le lait écrémé pasteurisé préalablement concentré en utilisant les conditions de fixation comparables (ex. le passage de -300 BV équivalent de lait écrémé pasteurisé avec le débit de MS 37-39 g/cm2/h).
Exemple 3 : essai en paillasse avec le lait de vache écrémé pasteurisé concentré
1) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 °C pendant 20 secondes, puis refroidi à 6°C. Ce lait de vache écrémé pasteurisé dont la MS est 92 g/L a été concentré par une osmose inverse jusqu’à 130 g/L de MS à 6°C. La concentration de lactoferrine bovine dans ce lait écrémé pasteurisé concentré a été mesurée par CLHP SCX (colonne Propac SCX, 20 mM tampon phosphate en gradient de NaCl, détection à 280 nm) ;
2) Le lait de vache écrémé pasteurisé concentré (130 g/L de MS) est passé sur une colonne de flux axial (1,6 cm de diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads à une vitesse linéaire variable à volume variable de lait écrémé pasteurisé ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l’eau osmosée, des protéines fixées sont partiellement éluées avec 6 BV d’une solution de NaCl à 2,6% (p/v) soit 38 mS/cm à 20°C. La lactoperoxydase, les ribonucléases et d’autres protéines basiques ont été récupérées dans cet éluat ;
4) Des protéines encore fixées sont éluées avec 5 BV d’une solution de NaCl à 10% (p/v) à 20°C. La lactoferrine bovine a été récupérée dans cet éluat ;
5) La proportion de lactoferrine dans les protéines totales dans ce 2e éluat a été déterminée par CLHP PI (colonne C18 300 Â, 0.1% TFA dans H2O/CH3CN en gradient, détection à 280 nm) comme l’aire relatif du pic du lactoferrine bovine.
La teneur en cobalamine (vitamine B 12) dans ce 2e éluat a été également mesurée par la méthode AO AC. Ainsi, sa teneur par protéines totales a été obtenue.
Les conditions et les résultats de 2 séries d’essais sont montrés dans le Tableau 3 :
Tableau 3 - Lactoferrine bovine obtenue dans le 2e éluat avec le passage de lait écrémé concentré à 130 g/L
Ces résultats montrent qu’en utilisant des conditions appropriées, deux sortes de fraction de la pureté élevée en lactoferrine (ex. >95% sur protéines totales) peuvent être obtenues par la chromatographie par échange de cations avec le passage de lait écrémé pasteurisé concentré :
- une fraction dont la pureté protéique de lactoferrine est >95% et dont la teneur en vitamine B 12 est < 5 pg/g de protéines ;
- une fraction dont la pureté protéique de lactoferrine est >90% et dont la teneur en vitamine B 12 est > 10 pg/g de protéines.
Exemple 4 : essai à l’échelle industrielle avec le lait de vache écrémé pasteurisé (témoin) Bien que le lait écrémé pasteurisé concentré à -130 g/L puisse passer à travers une colonne axial à l’échelle paillasse, il est difficile d’envisager une production stable dans la durée à l’échelle industrielle avec un passage d’une matrice complexe comme une matière laitière, en particulier concentrée, à la fois à cause d’une perte de charge élevée et un colmatage de surface filtrante.
Nous avons vérifié le comportement de perte de charge à travers d’une colonne industrielle à flux radial en faisant passer le lait écrémé de différent MS et à différents débits. 1) Une colonne industrielle à flux radial de 260 L (Albert Handtmann Armaturenfabrick
GmbH) a été préparée avec 280 L de résines SP Sepharose Big Beads Food Grade. Elle a été régénérée avec 10% de NaCl, puis satinée avec 1 N NaOH, enfin rincée avec de l’eau osmosée ;
2) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 °C pendant 20 secondes, puis refroidi à 6°C. Une partie de lait de vache écrémé pasteurisé a été concentré par une osmose inverse à
6°C. Les compositions de ces laits écrémés pasteurisés non concentrés et concentrés sont les suivantes :
MS : matière sèche ; MAT : matières azotés totales ; MP : matières protéiques
Tableau 4 - Composition des laits écrémés de départ 3) Après avoir préparé le niveau de concentration de lait écrémé pasteurisé en mélangeant en ligne, il est passé à différents débits à travers de la colonne à flux radial préalablement préparée à une température à 10°C.
Les compositions de lait écrémé, les débits et les pressions observés sont dans le Tableau 5.
La perte de charge (soit la pression) générée par la colonne à flux radial a augmenté en fonction des débits et des concentrations en matières en phase mobile (Figure 2) et elle a une bonne corrélation entre le débit en MS ou en MP (Figure 3). Ces résultats montrent bien que cette colonne à flux radial à l’échelle industrielle permet un passage de lait écrémé pasteurisé concentré (par osmose inverse) jusqu’à 200 g/L en MS ou 72 g MP (ou 75 g/L en MAT) avec une perte de charge acceptable en utilisant un débit de passage approprié dans les conditions industrielles de production en routine. Débit
Pression de colonne
Tableau 5 - Les compositions de lait écrémé, les débits et les pressions observés avec la colonne industrielle à flux radiale
Exemple 5 : essai industriel pour la fabrication de l’isolat de lactosérum pure en lactoferrine bovine avec le lait écrémé pasteurisé concentré
1) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 °C pendant 20 secondes, puis refroidi à 6°C, puis concentré par une osmose inverse jusqu’à 128 g/L de MS à 6°C ;
2) 80 m3 de ce lait écrémé pasteurisé concentré ont été passés sur une colonne industrielle à flux radial de 260 L (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) garnie avec 280 L de résines SP Sepharose Big Beads Food Grade au débit de 2,6 m/h ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l’eau osmosée, des protéines fixées sont partiellement éluées par 6 BV d’une solution de NaCl à 38 mS/cm à 20°C. La lactoperoxydase, les ribonucléases et d’autres protéines basiques ont été récupérées dans cet éluat ;
4) Des protéines encore fixées sont éluées avec 4 BV d’une solution de NaCl à 10% (p/v) à 20°C. Cet éluat contenant la lactoferrine bovine a été refroidi et stocké à 6°C ;
5) Les étapes 2-4 ont été répétées 10 fois ;
6) 11,2 m3 de 2e éluat regroupé ont été concentrés sur une ultrafiltration (membrane organique spirale avec MWCO de 20 kDa), puis diafiltré sur UF (MWCO 20 kDa) avec l’eau osmosée jusqu’à 1 mS/cm, enfin microfiltré sur une membrane céramique à 1,4 pm en double couche (Membrarox®, Pali Corporation) ;
7) L’isolat de protéines de lactosérum enrichie en lactoferrine bovine obtenu sous forme du microfiltrat a subi un séchage par atomisation et 40 kg de poudre ont été obtenus (Ingrédient 1) ;
8) L’Ingrédient 1 a été analysé ; notamment la proportion de lactoferrine dans les protéines totales a été déterminée par CLHP PI (colonne C18 300 Â, 0.1% TFA dans H2O/CH3CN en gradient, détection à 280 nm) comme Faire relatif du pic du lactoferrine bovine (Figure 5). La teneur en cobalamine (vitamine B 12) dans ce 2e éluat a été également mesurée par la méthode AO AC. Les résultats d’analyses sont présentés dans Tableau 6.
Exemple 6 : essai industriel pour la fabrication de l’isolat de lactosérum pure en lactoferrine bovine avec le lait écrémé pasteurisé concentré
1) Le lait de vache a été écrémé, puis pasteurisé à 73 °C pendant 20 secondes, puis refroidi à 6°C, puis concentré par une osmose inverse jusqu’à 120 g/L de MS à 6°C ;
2) 60 m3 de ce lait écrémé pasteurisé concentré ont été passés sur une colonne industrielle à flux radial de 260 L (Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH) guarnie avec 280 L de résines SP Sepharose Big Beads Food Grade au débit de 2,6 m/h ;
3) Après un rinçage avec 5 BV de l’eau osmosée, des protéines fixées sont partiellement éluées par 6 BV d’une solution de NaCl à 36 mS/cm à 20°C. La lactoperoxydase, les ribonucléases et d’autres protéines basiques ont été récupérées dans cet éluat ;
4) Des protéines encore fixées sont éluées avec 4 BV d’une solution de NaCl à 10% (p/v) à 20°C. Cet éluat contenant la lactoferrine bovine a été refroidi et stocké à 6°C ;
5) Les étapes 2-4 ont été répétées 15 fois ;
6) 116.8m3 de 2e éluat regroupé ont été concentrés sur une ultrafiltration (membrane organique spirale avec seuil de coupure (MWCO) de 20 kDa), puis diafiltré sur UF (MWCO 20 kDa) avec l’eau osmosée jusqu’à 1 mS/cm, enfin microfiltré sur une membrane céramique à 0,8 pm en double couche (Membrarox®, Pali Corporation) ;
7) L’isolat de protéines de lactosérum enrichi en lactoferrine bovine obtenu sous forme du microfiltrat a subi les traitements supplémentaires afin de garantir la stabilité de cette fraction protéique suivants : i. Une partie du microfiltrat a été microfiltré sur membrane PES à 0,2 pm (Supor® Pali), puis mis dans les flacons stérilisés de 1 L (Ingrédient 3) ii. Le reste du micro filtrat subi un séchage par atomisation et 60 kg de poudre ont été obtenus (Ingrédient 2).
8) Les Ingrédients 2 et 3 ont été analysés ; notamment la proportion de lactoferrine dans les protéines totales dans ce 2e éluat ont été déterminée par CLHP PI (colonne C18 300 Â, 0.1% TFA dans H2O/CH3CN en gradient, détection à 280 nm) comme l’aire relatif du pic du lactoferrine bovine (Figure 6 & Figure 7). La teneur en cobalamine (vitamine B 12) dans ce 2e éluat a été également mesurée par la méthode AO AC. Les résultats d’analyses sont présentés dans le tableau 6.
Tableau 6 - Les caractéristiques physico-chimiques et microbiologiques de l’ingrédient 1, l ’Ingrédient 2 et l ’Ingrédient 3
Exemple 7 : essai en paillasse avec le lactosérum concentré issu de lait de chèvre écrémé pasteurisé 1) Le lait de chèvre a été écrémé, puis pasteurisé à 74°C pendant 30 secondes, puis refroidi à
6°C ;
2) 3000 L de lait de chèvre écrémé pasteurisé, après avoir maintenu à 50°C pendant 30 minutes, ont été passés sur une microfiltration céramique à 0,1 pm (Membrarox®, Pali Corporation) pour obtenir un lactosérum comme microfiltrat de lait de chèvre dépourvu de matière grasse et les micelles de caséines ;
3) 2000 L de lactosérum issu du lait de chèvre ont été concentrés sur une ultrafiltration (membrane organique spirale avec seuil de coupure (MWCO) de 10 kDa). Les compositions du rétentat obtenu (450 L) étaient dans le tableau 7 ci-dessous :
Tableau 7 - Composition de lactosérum concentré issu du lait de chèvre
La concentration de P-Lactoglobuline caprine et a-Lactalbumine caprine dans ce lactosérum concentré a été mesurée par CLHP SEC (colonne TSK G3000PWxl, CH3CN/H20/TFA, détection à 210 nm). La concentration de lactoferrine caprine dans ce lactosérum concentré a été mesurée par CLHP SCX (colonne Propac SCX, 20 mM tampon phosphate en gradient de NaCl, détection à 280 nm).
4) 3 L de lactosérum concentré de chèvre est passé sur une colonne de flux axial (1,6 cm de diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads à une vitesse linéaire de 200 et 300 cm/h ;
5) Après un rinçage avec 5 BV de l’eau osmosée, des protéines fixées sont partiellement éluées avec 6 BV d’une solution de NaCl à 2,2% (p/v) à 20°C. Des protéines cationiques autres que la lactoferrine telles que la lactoperoxydase ont été récupérées dans cet éluat ;
6) Des protéines encore fixées sont éluées avec 5 BV d’une solution de NaCl à 10% (p/v) à 20°C. La lactoferrine caprine a été récupérée dans cet éluat. La teneur en lactoferrine caprine dans l’éluat a été mesurée par CLHP PI (colonne C18 300 Â, 0.1% TFA dans H2O/CH3CN en gradient, détection à 280 nm).
Comme montré dans le tableau 8, une fraction de lactoferrine caprine dont la pureté protéique très élevée a été extraite très efficacement à partir du lactosérum concentré issu du lait de chèvre.
Tableau 8 - Lactoferrine caprine obtenue dans le 2e éluat avec le passage de lactosérum concentré issu du lait de chèvre
Exemple 8 : essai en paillasse avec le lactosérum de fromagerie concentré issu de lait de chèvre écrémé pasteurisé 1) 240 L du lactosérum de fromagerie issu du lait de chèvre pasteurisé (à 74°C pendant 30 secondes) a été concentré sur une ultrafiltration (membrane organique spirale avec MWCO de 10 kDa). Les compositions du rétentat obtenu (60 L) étaient dans le tableau ci-dessous :
Tableau 9 - Composition des lactosérum fromagerie concentré issu du lait de chèvre
La concentration de P-Lactoglobuline caprine et a-Lactalbumine caprine dans ce lactosérum concentré a été mesurée par CLHP SEC (colonne TSK G3000PWxl, CH3CN/H20/TFA, détection à 210 nm). La concentration de lactoferrine caprine dans ce lactosérum concentré a été mesurée par CLHP SCX (colonne Propac SCX, 20 mM NaPB/NaCl gradient, détection à 280 nm).
2) 3 L de lactosérum concentré de chèvre sont passés sur une colonne de flux axial (1,6 cm de diamètre) contenant 20 mL (BV) de SP Sepharose Big Beads à une vitesse linéaire de 200 et
300 cm/h ;
3) Après un rinçage avec 6 BV de l’eau osmosée, des protéines fixées sont partiellement éluées avec 6 BV d’une solution de NaCl à 2,2% (p/v) à 20°C. Des protéines cationiques autres que la lactoferrine telles que la lactoperoxydase ont été récupérées dans cet éluat ; 4) Des protéines encore fixées sont éluées avec 5 BV d’une solution de NaCl à 10% (p/v) à 20 °C. La lactoferrine caprine a été récupérée dans cet éluat. La teneur en lactoferrine caprine dans l’éluat a été mesurée par CLHP PI (colonne C18 300 Â, 0.1% TFA dans H2O/CH3CN en gradient, détection à 280 nm).
Comme montré dans le tableau 10, une fraction de lactoferrine caprine dont la pureté protéique élevée a été extraite très efficacement à partir du lactosérum de fromagerie concentré issu du lait de chèvre.
Tableau 10 - Lactoferrine bovine obtenue dans le 2e éluat avec le passage de lactosérum de fromagerie concentré issu du lait de chèvre
Exemple 9 : essai de préparation d’un lait infantile en poudre supplémenté en lactoferrine bovine (teneur en Vitamine B 12 faible)
1) Un lait pour nourrissons en poudre à base de lait de vache a été préparé par un procédé de fabrication standard en formulant avec lait de vache écrémé, lactose, maltodextrines, huile de tournesol oléique, matière grasse de lait anhydre, lactosérum déminéralisé, protéines solubles, galacto-oligosaccharides, huile de tournesol, huile de colza, lécithine de soja, lécithine de tournesol, phosphate de calcium, huile de poisson, phosphate de potassium, huile de Mortierella alpina, bitartrate de choline, chlorure de calcium, citrate de potassium, citrate de magnésium, chlorure de sodium, fructo-oligosaccharides, vitamine C, pyrophosphate ferrique, carbonate de calcium, taurine, hydroxyde de potassium, chlorure de potassium, inositol, nucléotides, L-phénylalanine, extrait riche en tocophérols, palmitate de L-ascorbyle, sulfate de zinc, L-tryptophane, vitamine E, iodure de potassium, L-carnitine, nicotinamide, sélénite de sodium, pantothénate de calcium, sulfate de cuivre, thiamine, vitamine A, vitamine B6, sulfate de manganèse, acide folique, vitamine K, biotine, vitamine D, riboflavine, vitamine B12.
2) Le lait pour nourrissons en poudre a été mélangé avec l’ingrédient 1 à un taux d’incorporation de 82 mg/100 g.
Tableau 11 - La composition d’un lait infantile en poudre incorporé en l’ingrédient 1 Exemple 10 : essai de formulation nutritionnelle en poudre supplémentée en lactoferrine bovine (teneur en Vitamine B 12 élevée)
1) Un lait pour nourrissons (denrées alimentaires destinés à des fins médicales spéciales, soit DADFMS) en poudre à base de lait de vache a été préparé par un procédé de fabrication standard en formulant avec lait écrémé, huiles végétales (palme, colza, coprah, tournesol), protéines solubles déminéralisées, lactose, amidon, farine de graines de caroube, lécithine, citrate de calcium, huile de poisson, huile de Mortierella alpina, carbonate de calcium, vitamine C, phosphate de calcium, citrate de potassium, citrate de sodium, hydroxyde de calcium, chlorure de choline, taurine, vitamine E, inositol, sulfate ferreux, L-tryptophane, chlorure de potassium, chlorure de calcium, extrait riche en tocophérols, palmitate de L- ascorbyle, L-carnitine, sulfate de magnésium, nucléotides, sulfate de zinc, vitamine A, nicotinamide, vitamine K, vitamine D, pantothénate de calcium, sulfate de cuivre, thiamine, vitamine B6, riboflavine, sulfate de manganèse, acide folique, iodure de potassium, sélénite de sodium, biotine.
2) Le lait DADFMS pour nourrissons en poudre a été mélangé avec l’ingrédient 2 à un taux d’incorporation de 400 mg/100 g. Un apport de 3,1 pg de vitamine B 12 sous forme complexe avec transcobalamine par 100 g de la formulation en poudre a été obtenu par cette incorporation de l’ingrédient 2.
Tableau 12 - La composition de DADFMS en poudre incorporé en l’ingrédient 2
Exemple 11 : essai de formulation nutritionnelle en poudre supplémentée en lactoferrine bovine (teneur en Vitamine B 12 élevée)
1) Un lait pour nourrissons (aliments diététique destinés à des fins médicales spéciales, DADFMS) en liquide à base de lait de vache a été préparé par un procédé de fabrication standard en formulant avec Lait écrémé, protéines solubles déminéralisées, huiles végétales (palme, palmiste, colza, tournesol), lactose, lécithine de soja, lécithine de tournesol, citrate de sodium, phosphate de calcium, citrate de potassium, chlorure de calcium, carbonate de calcium, vitamine C, huile de Mortierella alpina, huile de poisson, hydroxyde de calcium, chlorure de potassium, vitamine E, chlorure de choline, taurine, sulfate ferreux, extrait riche en tocophérols, palmitate de L-ascorbyle, inositol, sulfate de zinc, nucléotides, L-carnitine, nicotinamide, vitamine A, sulfate de magnésium, vitamine K, vitamine D, pantothénate de calcium, sulfate de cuivre, thiamine, vitamine B6, riboflavine, sulfate de manganèse, acide folique, iodure de potassium, sélénite de sodium, biotine. 2) Le lait DADFMS pour nourrissons en liquide a été stérilisé par un traitement thermique ultra-haute température (UHT), puis mélangé avec l’ingrédient 3 avec un taux d’incorporation de 410 mg/100 g (sur la matière sèche). Un apport de 0,43 pg de vitamine B 12 sous forme complexe avec transcobalamine par 100 mL de la formulation en liquide a été obtenu par cette incorporation de l’ingrédient 3.
MS totale g 13,2
Tableau 13 - La composition de DADFMS en liquide incorporé en l’ingrédient 3
Exemple 12 : préparation d’un complément alimentaire en gélule en utilisant la lactoferrine bovine (teneur en Vitamine B 12 élevée)
Un complément alimentaire en gélule a été préparé à partir du mélange d’ingrédient 2 de l’Exemple 5 (99,5% du mélange) et silice colloïdale (0,5% du mélange). Chaque gélule contient 200 mg de protéines.
La teneur en vitamine B 12 sous forme complexe avec transcobalamine est de 1,6 pg/gélule.
La dose journalière recommandée pour chaque groupe de population est comme suite :
Tableau 14

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de préparation d’un isolat de protéines cationiques de lactosérum comprenant les étapes a) à f) suivantes : a) la matière première de départ est un lait écrémé de mammifère ou un lactosérum issu de lait de mammifère préalablement concentré par une technologie membranaire de telle sorte que, lorsque la matière première de départ est préparée avec un lait écrémé de mammifère, la concentration en matière protéique MP est comprise entre 40 et 72 g/L et, lorsque la matière première de départ est préparée avec du lactosérum, la concentration en matière protéique est comprise entre 20 et 100 g/L ; b) extraction sélective de protéines cationiques comprenant les étapes suivantes : i. passage de la matière première de départ au travers d’une colonne de chromatographie en flux radial, contenant des résines échangeuses de cations fortes de type sulfopropyle SP, de préférence de diamètre supérieur à 100 pm:
- Le volume de matière première de départ, équivalent à celui non concentré, est compris entre 40 et 500 fois de volume des résines BV ;
- La vitesse linéaire de passage de matière première de départ est comprise entre 1,0 et 4,0 m/h ; ii. rinçage avec de l’eau déminéralisée :
- Le volume d’eau déminéralisée est compris entre 2 et 6 BV ;
- La vitesse de passage d’eau déminéralisée est comprise entre 3,0 et 5,0 m/h ; iii. élution des protéines cationiques fixées avec une solution saline à conductivité électrique entre 30 et 50 mS/cm :
- Le volume de la solution saline est compris entre 4 et 8 BV ;
- La vitesse de passage de la solution saline est comprise entre 0,3 et 2,0 m/h ; iv. élution des protéines cationiques fixées avec une solution saline à conductivité électrique entre 80 et 140 mS/cm :
- Le volume de la solution saline est compris entre 3 et 6 BV ;
- La vitesse de passage de la solution saline est comprise entre 0,5 et 2,5 m/h ; c) concentration des protéines cationiques de pureté élevée en lactoferrine éluées dans la solution saline en utilisant une membrane d’ultrafiltration ayant un seuil de coupure compris entre 10 et 20 kDa ; d) déminéralisation des protéines cationiques de pureté élevée en lactoferrine par une diafiltration avec de l’eau déminéralisée en utilisant une membrane d’ultrafiltration ayant un seuil de coupure compris entre 10 et 20 kDa pour atteindre un ratio cendres/protéines compris entre 0,001 et 0,03 ; e) microfiltration avec une membrane ayant un seuil de coupure compris entre 0,2 et 1,4 pm, de la solution concentrée de protéines cationiques spécifiques afin réduire la charge microbienne ; f) optionnellement, séchage par atomisation ou par lyophilisation de la solution concentrée de protéines cationiques spécifiques préalablement microfiltrée afin d’obtenir un isolat de lactoferrine en poudre.
2. Isolat de protéines cationiques de lactosérum obtenu par le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la proportion de protéines sur matière sèche est supérieure ou égale à 90% en poids et en ce que la proportion de la lactoferrine sur les protéines totales est supérieure à 90% en poids.
3. Isolat de protéines cationiques de lactosérum issu de lait de vache ou de lait de chèvre obtenu par le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la proportion de la lactoferrine sur les protéines totales est supérieure à 95% en poids et contenant une cobalamine sous forme complexe avec transcobalamine à une concentration inférieure ou égale à 5 pg/g de protéines.
4. Isolat de protéines cationiques de lactosérum issu de lait de vache ou de lait de chèvre susceptible d’être obtenu par le procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la proportion de la lactoferrine sur les protéines totales est supérieure à 90% en poids et contenant une cobalamine sous forme complexe avec transcobalamine à une concentration supérieure ou égale à 5 pg/g de protéines.
5. Isolat de protéines cationiques de lactosérum selon la revendication 4, pour son utilisation dans la prévention et/ou le traitement d’une absorption déficiente en vitamine B 12 chez des patients ayant subi une gastrectomie ou traités chroniquement avec des inhibiteurs de la pompe à protons IPP.
6. Produit alimentaire pour l’alimentation humaine ou animale comprenant un isolat selon l’une quelconque des revendications 2 à 4.
7. Produit non alimentaire comprenant un isolat selon l’une quelconque des revendications 2 à 4.
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