CN116600781A - 用于制备阳离子乳清蛋白分离物的新方法及由其获得的产品 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于制备含有高纯度乳铁蛋白的阳离子乳清蛋白分离物的新方法。

Description

用于制备阳离子乳清蛋白分离物的新方法及由其获得的产品
技术领域
本发明涉及一种用于制备高纯度乳铁蛋白阳离子乳清蛋白分离物的新方法。
发明内容
申请人开发了一种用于获得乳铁蛋白纯度高于90％的乳清蛋白分离物的方法；该方法允许控制乳铁蛋白分离物中的维生素B12(钴胺素)含量。
该方法的特征一方面在于通过膜技术(如反渗透、纳滤或超滤)使用先前浓缩的乳材料(如浓缩脱脂乳或浓缩乳清)，另一方面在于使用填充在径向色谱柱中的磺丙基(SP)型强阳离子交换树脂进行选择性提取。通过超滤对洗脱的乳铁蛋白纯级分进行浓缩和脱盐，以获得阳离子乳清蛋白分离物，其乳铁蛋白纯度高于至少90％，优选95％。通过微滤对获得的该液体分离物进行去细菌化或灭菌，并任选地通过喷雾干燥或冷冻干燥进行干燥以获得粉末分离物。
用于制备高纯度乳铁蛋白阳离子乳清蛋白分离物的方法包括以下步骤a)至f)：
a)起始原料可以是通过膜技术预脱脂并浓缩的哺乳动物乳；它也可以是通过膜技术预脱脂并浓缩的哺乳动物乳和脱脂(未浓缩)乳的混合物；所述哺乳动物乳是例如牛乳或山羊乳；起始原料也可以是来自哺乳动物乳并预浓缩的乳清；
i.当用哺乳动物乳(如牛乳或山羊乳)制备起始原料时，对其进行脱脂并任选进行巴氏消毒，例如通过在60和78℃之间的短期热处理(最低热处理等效水平为72℃，15秒；可以在巴氏消毒之前或之后进行脱脂)进行，或通过用孔隙率在0.8和1.4μm之间的膜进行微滤来进行去细菌化，然后通过反渗透(OI)或纳滤(NF)或超滤(UF)进行浓缩；为了实施所述方法，还可以使用脱脂乳(未浓缩)和先前通过如上所述的膜技术浓缩的脱脂乳的混合物；步骤b)中待处理的产品的蛋白质物质(MP)浓度优选在40和72g/L之间，优选在43和57g/L之间；当使用OI膜时，巴氏消毒脱脂乳的干物质(MS)浓度在110和200g/L之间，优选在120和160g/L之间；
ii.当用乳清制备起始原料时，可以在通过酸化或凝乳酶作用分离酪蛋白之后浓缩乳清，通过微滤(其膜的孔隙率大约为0.1μm)、通过反渗透(OI)或纳滤(NF)或超滤(UF)进行浓缩；为了实施所述方法，还可以使用乳清(未浓缩)和先前通过如上所述的膜技术浓缩的乳清的混合物；步骤b)中待处理的产品的蛋白质浓度优选在20和100g/L之间，优选在30和80g/L之间；
应当注意的是，巴氏消毒和微滤处理对于所述方法不是必需的。
b)选择性提取阳离子蛋白包括以下步骤：
i.使起始原料(例如预浓缩巴氏消毒脱脂乳)通过含有磺丙基SP型强阳离子交换树脂的径流色谱柱，所述树脂优选直径大于100μm(例如来自瑞典Cytiva的SP SepharoseBig Beads)：
-起始原料的体积(表示为相当于未浓缩原料的体积；即标明的体积是原料在浓缩前具有的体积)在树脂体积(BV，柱床体积)的40和500倍之间，特别是在80和500倍之间，优选在80和300BV之间；
-起始原料通过的线速度在1.0和4.0m/h之间，优选在2.0和3.0m/h之间；
ii.用软化水冲洗，所述软化水优选用OI膜处理(渗透水)：
-软化水的体积在2和6BV之间，优选在3和5BV之间；
-软化水通过速度在3.0和5.0m/h之间，优选在3.5和4.5m/h之间；
iii.用电导率在30和50mS/cm之间的盐溶液(NaCl的软化水溶液，所述软化水优选渗透水)洗脱结合的阳离子蛋白：
-盐溶液的体积在4和8BV之间，优选在5和7BV之间；
-盐溶液的通过速度在0.3和2.0m/h之间，优选在0.5和1.0m/h之间；
iv.用电导率在80和140mS/cm之间，优选在90和110mS/cm之间的盐溶液(NaCl的软化水溶液，所述软化水优选渗透水)洗脱结合的阳离子蛋白：
-盐溶液的体积在3和6BV之间，优选在4和5BV之间；
-盐溶液的通过速度在0.5和2.5m/h之间，优选在1.0和2.0m/h之间；
通过阳离子交换树脂的步骤用于结合起始原料中存在的阳离子蛋白，同时允许脱脂乳的主要成分(如乳糖)、矿物质、酸性蛋白质(如酪蛋白、β-乳球蛋白、α-乳球蛋白、血清白蛋白和大多数免疫球蛋白)通过。第一洗脱步骤用于通过保留与树脂结合的大部分乳铁蛋白(乳阳离子蛋白的主要蛋白质)来选择性地提取特定的阳离子蛋白。因此，纯牛乳铁蛋白级分在第二洗脱液中洗脱。
c)使用截止阈值(MWCO)在10和20kDa之间的超滤膜浓缩在盐溶液中洗脱的高纯度乳铁蛋白阳离子蛋白；
d)使用MWCO在10和20kDa之间的超滤膜，通过用软化水(优选渗透水)渗滤，对高纯度乳铁蛋白阳离子蛋白进行脱盐，以达到灰分/蛋白质比在0.001和0.03之间，优选在0.003和0.01之间；
e)用截止阈值在0.2和1.4μm之间，优选在0.8和1.4μm之间的双层膜对特定阳离子蛋白的浓缩溶液进行微滤，以减少微生物负荷；
f)任选地，喷雾干燥或冷冻干燥先前微滤的特定阳离子蛋白的浓缩溶液，以获得粉末状乳铁蛋白分离物。
有利地，使用通过UF/NF/OI膜浓缩的哺乳动物乳材料(例如巴氏消毒脱脂乳、来自巴氏消毒山羊乳的乳酪乳清)允许降低存在的等量蛋白质通过提取柱时的通过流速。由于与SP型强阳离子交换树脂的接触时间延长，阳离子蛋白的提取效率显著提高。
此外，由于其梯形几何形状，使用径流柱(例如Albert HandtmannArmaturenfabrick GmbH)允许可持续地承受浓缩哺乳动物乳材料通过填充树脂所产生的压力。
浓缩乳材料和径流柱的这种组合对于执行稳定且恒定的工业生产至关重要。
根据本发明的方法的另一个优点是它可以在宽温度范围内有效地进行；特别是，虽然树脂制造商建议在30和50℃之间的温度实施，但申请人已经成功开发出一种在低温(即在低于15℃的温度，优选低于10℃)有效的方法。
因此，本发明涉及一种通过本发明的方法获得或可获得的富含乳铁蛋白的阳离子乳清蛋白分离物，使得干物质的蛋白质比例大于或等于90重量％，并且所述分离物的乳铁蛋白占总蛋白质的比例大于90重量％，优选大于95重量％，更优选大于98重量％。
本发明还涉及一种来自乳或乳清(来自牛乳或山羊乳)的通过本发明的方法获得或可获得的富含乳铁蛋白的阳离子乳清蛋白分离物，其干物质的蛋白质比例大于或等于90重量％，乳铁蛋白占总蛋白质的比例大于95重量％(w/w)，优选大于98重量％，并且含有与转钴胺素蛋白复合形式的钴胺素，其浓度小于或等于5μg/g蛋白质，特别是，与转钴胺素蛋白复合形式的钴胺素的浓度在1和5μg/g蛋白质之间。
本发明还涉及一种来自乳或乳清(来自牛乳或山羊乳)的通过本发明的方法获得或可获得的富含乳铁蛋白的阳离子乳清蛋白分离物，其干物质的蛋白质比例大于或等于90重量％，乳铁蛋白占总蛋白质的比例大于90％(w/w)，优选大于95重量％，其含有与转钴胺素蛋白复合形式的钴胺素，其浓度大于或等于5μg/g，优选大于或等于8μg/g，仍更优选大于或等于10μg/g蛋白质。
根据本发明的分离物可以是液体形式(未实施步骤f)或粉末形式(实施了步骤f)。如果它是液体形式，则它在相对于干物质的组成方面具有与粉末相同的特征，并且通常包含在5和25重量％之间，优选在10和20重量％之间的水。
根据另一个目的，本发明涉及含有根据本发明的阳离子蛋白分离物的供人或动物食用的食品产品、人或动物药物或食品补充剂。
优选地，根据本发明的分离物具有的微生物负荷使得根据本发明的分离物粉末的好氧嗜中温菌群计数小于1000，优选小于100或10，甚至更优选小于1ufc/g，或使得液体分离物的该计数小于100，优选小于10，甚至更优选小于1ufc/ml。浓缩乳材料和径流柱的组合使用允许在适当条件下通过阳离子交换色谱法来稳定且有效地生产两种高纯度乳铁蛋白分离物：
-乳铁蛋白纯度>95％或98％，且维生素B12含量≤5μg/g蛋白质或在1和5μg/g蛋白质之间的分离物；
根据本发明的此类分离物对于制备基于牛乳或山羊乳的婴儿配方奶粉(婴儿乳或二段乳)特别有意义。
以及
-乳铁蛋白纯度>90％或95％，且维生素B12含量≥5μg/g蛋白质，优选≥8μg/g蛋白质，更优选≥10μg/g蛋白质的分离物；
该分离物可以对素食者的食品补充剂或对缺乏维生素B12吸收的人(如接受过胃切除术的人或长期接受IPP(质子泵抑制剂)治疗的人)的营养制剂具有营养益处。事实上，除了乳铁蛋白的益处之外，该分离物还可以提供维生素B12的重要来源，即使没有由胃分泌的内源因子也具有高生物利用度。
因此，本发明还涉及膳食补充剂，其包含根据本发明的富含维生素B12的分离物，即分离物的乳铁蛋白纯度>90％或95％，且其维生素B12含量≥5μg/g蛋白质，优选≥8μg/g蛋白质，更优选大于或等于10μg/g蛋白质。
将根据待补充的人群的概况来选择根据本发明的分离物在食品补充剂中的含量，从而选择待施用的维生素B12的剂量，以及分离物的维生素B12含量。例如，根据本发明的富含维生素B12(6μg/g蛋白质)的分离物的日剂量为150至1000mg蛋白质时，可以提供0.9至6.0μg的与转钴胺素蛋白复合形式的维生素B12。同样，根据本发明的富含维生素B12(10μg/g蛋白质)的分离物为100至600mg蛋白质时，可以提供1.0至6.0μg的与转钴胺素蛋白复合形式的维生素B12。因此，即使维生素B12的肠道吸收受到干扰，这种食品补充剂也可以满足下表所示的每个人群的需求。
根据ANSES 2016的维生素B12的营养参考(μg/d)
人群 充足摄入量(μg/天)
6个月以下的婴儿 0.4
6个月及以上的婴儿 1.5
1至3岁的儿童 1.5
4至10岁的儿童 1.5
11至17岁的青少年 2.5
18岁及以上的男性和女性 4
孕妇 4.5
哺乳期妇女 5
本发明进一步涉及一种分离物，其乳铁蛋白纯度>90％或95％，且维生素B12含量≥5μg/g蛋白质，优选≥8μg/g蛋白质，更优选≥10μg/g蛋白质，其用于例如在接受过胃切除术或长期接受IPP(质子泵抑制剂)治疗的患者中预防和/或治疗维生素B12缺乏吸收。
钴胺素(维生素B12)以与结合蛋白复合的形式存在于乳中。在牛乳中，它以与转钴胺素蛋白复合的形式存在，转钴胺素蛋白是一种43kDa的阳离子蛋白(S.N.Fedosov,T.E.Petersen,E.Transcobalamin from cow milk:isolation and physico-chemical properties,Biochimica et Biophysica Acta-Protein Structure andMolecular Enzymology.1292(1996)113-119)。该钴胺素-转钴胺素蛋白复合物具有重要的营养意义，因为它被认为是负责维生素B12的生物利用度(S.N.Fedosov,Ebba Nexo,Christian W.Heegaard,Vitamin B12 and its binding proteins in milk from cowand buffalo in relation to bioavailability of B12,Journal of DairyScience.American Dairy Science Association.102(2019)4891-4905)。
尽管该复合物在阳离子交换色谱法处理期间的表现接近乳铁蛋白的表现，但可以根据使用的条件来改变通过本发明的方法获得的洗脱液中的维生素B12含量。
此外，尽管具有营养意义，但对于某些应用(例如婴儿配方奶粉，即婴儿配方奶粉/乳和/或二段配方奶粉/乳)，在某些特定情况下(高掺入剂量)，限制纯乳铁蛋白级分成分中的该维生素B12含量可能有意义。在该情况下，根据本发明的方法允许调节最终的维生素B12含量，具有极大的意义。
因此，本发明涉及包含根据本发明的分离物的供人或动物食用的食品产品；在婴儿配方奶粉(即婴儿配方奶粉/乳和/或二段配方奶粉/乳)的情况下，优选使用乳铁蛋白纯度>95％且维生素B12含量≤5μg/g蛋白质的分离物。根据本发明的分离物的掺入率为在一升即食配方中有50至1000mg蛋白质。
本发明还涉及非食品产品，如包含根据本发明的分离物的卫生产品和化妆品。
本发明还包括包含根据本发明的分离物的用于口腔卫生的产品，如凝胶或糊状形式的牙膏、漱口水、口香糖。根据本发明的分离物的掺入率为在一克产品中有1至100mg蛋白质。
附图说明
图1：用于获得高纯度乳铁蛋白阳离子乳清蛋白分离物的方法的示意图。
图2：径流柱产生的压力损失和巴氏消毒脱脂乳通过的不同参数(MS和MP浓度、MS和MP流速)(实施例4)
图3：径流柱产生的压力损失和巴氏消毒脱脂乳通过的不同参数(MS和MP流速)之间的相关性(实施例4)
图4：实施例5的成分1的CLHP PI图谱(反相高效液相色谱法；C18柱0.1％TFA的H2O/CH3CN溶液梯度，在280nm处检测)。
图5：实施例5的成分1的CLHP SEC图谱(尺寸排阻高效液相色谱法；TSK G3000PWxl柱，CH3CN/H2O/TFA，在210nm处检测)。顶部的分子量指示根据对照蛋白的保留时间。
图6：实施例6的成分2的CLHP PI图谱。
图7：实施例6的成分3的CLHP PI图谱。
具体实施方式
实施例1：用巴氏消毒脱脂牛乳进行小型测定(对照)
1)MS为92g/L的脱脂牛乳在73℃巴氏消毒20秒，然后冷却至6℃。通过CLHP SCX(强阳离子交换的高效液相色谱法；Propac SCX柱，20mM磷酸盐缓冲液NaCl梯度，在280nm处检测)测量该巴氏消毒脱脂乳中的牛乳铁蛋白浓度；
2)使巴氏消毒脱脂乳以400cm/h的线速度通过含有20mL(BV)SP Sepharose BigBeads的轴流柱(直径1.6cm)，巴氏消毒脱脂乳的体积可变；
3)用5BV的渗透水冲洗后，在20℃用6BV的10％(w/v)NaCl溶液洗脱结合蛋白；
4)通过CLHP PI(反相高效液相色谱法；C18柱0.1％TFA/CH3CN梯度，在280nm处检测)测量每个洗脱液中的牛乳铁蛋白含量。因此，获得了每个洗脱液中牛乳铁蛋白的量。
测定的条件和结果示于表1中：
表1-使92g/L的脱脂乳通过而获得的牛乳铁蛋白
实施例2：用浓缩巴氏消毒脱脂牛乳进行小型测定
1)对牛乳进行脱脂，然后在73℃巴氏消毒20秒，然后冷却至6℃。在6℃通过反渗透法将MS为92g/L的该巴氏消毒脱脂牛乳浓缩至MS为130g/L。通过CLHP SCX(Propac SCX柱，20mM磷酸盐缓冲液NaCl梯度，在280nm处检测)测量该浓缩巴氏消毒脱脂乳中的牛乳铁蛋白的浓度；
2)使浓缩巴氏消毒脱脂乳(MS为130g/L)以可变的线速度通过含有20mL(BV)SPSepharose Big Beads的轴流柱(直径1.6cm)，巴氏消毒脱脂乳的体积可变；
3)用5BV的渗透水冲洗后，在20℃用5BV的10％(w/v)NaCl溶液洗脱结合蛋白；
4)通过CLHP PI(C18柱0.1％ TFA/CH3CN梯度，在280nm处检测)测量每个洗脱液的牛乳铁蛋白含量。因此，获得了每个洗脱液中牛乳铁蛋白的量。
测定的条件和结果示于表2中：
表2-使130g/L的浓缩脱脂乳通过而获得的牛乳铁蛋白
*相当于巴氏消毒非浓缩脱脂乳(其MS为92g/L)的值。
表1和表2的比较显示，使用相当的结合条件(例如使相当于约300BV的巴氏消毒脱脂乳通过，MS流速为37-39g/cm2/h)，用先前浓缩的巴氏消毒脱脂乳获得的牛乳铁蛋白的产率要高得多(>20％)。
实施例3：用浓缩巴氏消毒脱脂牛乳进行小型测定
1)对牛乳进行脱脂，然后在73℃巴氏消毒20秒，然后冷却至6℃。在6℃通过反渗透法将MS为92g/L的该巴氏消毒脱脂牛乳浓缩至MS为130g/L。通过CLHP SCX(Propac SCX柱，20mM磷酸盐缓冲液NaCl梯度，在280nm处检测)测量该浓缩巴氏消毒脱脂乳中的牛乳铁蛋白的浓度；
2)使浓缩巴氏消毒脱脂乳(MS为130g/L)以可变的线速度通过含有20mL(BV)SPSepharose Big Beads的轴流柱(直径1.6cm)，巴氏消毒脱脂乳的体积可变；
3)用5BV的渗透水冲洗后，在20℃用6BV的38mS/cm的2.6％(w/v)NaCl溶液部分洗脱结合蛋白。从该洗脱液中回收乳过氧化物酶、核糖核酸酶和其他碱性蛋白质；
4)在20℃用5BV的10％(w/v)NaCl溶液洗脱仍然结合的蛋白质。从该洗脱液中回收牛乳铁蛋白；
5)通过CLHP PI(C18柱0.1％ TFA的H2O/CH3CN溶液梯度，在280nm处检测)测定乳铁蛋白在该第二洗脱液中的总蛋白中的比例，即牛乳铁蛋白的峰的相对面积。
还通过AOAC方法测定该第二洗脱液中的钴胺素(维生素B12)含量。因此，获得了它的总蛋白含量。
2个系列测定的条件和结果示于表3中：
表3-使130g/L的浓缩脱脂乳通过，在第二洗脱液中获得的牛乳铁蛋白
这些结果显示，使用适当条件，通过阳离子交换色谱法并使浓缩巴氏消毒脱脂乳通过，可以获得两种高乳铁蛋白纯度(例如占总蛋白>95％)的级分：
-乳铁蛋白纯度>95％，且维生素B12含量≤5μg/g蛋白质的级分；
-乳铁蛋白纯度>90％，且维生素B12含量≥10μg/g蛋白质的级分。
实施例4：用巴氏消毒脱脂牛乳进行工业规模测定(对照)
尽管可以在小型规模使浓缩至约130g/L的巴氏消毒脱脂乳通过轴流柱，但由于压力损失大和过滤器表面堵塞两个原因，难以设想使复杂的基质(如乳材料，尤其是浓缩乳材料)通过能够在工业规模上长期稳定生产。
我们通过使不同MS的脱脂乳在不同流速下通过工业径流柱来检查压力损失的表现。
1)用280L的SP Sepharose Big Beads食品级树脂制备了260L的工业径流柱(Albert Handtmann Armaturenfabrick GmbH)。用10％ NaCl使其再生，然后用1N NaOH使其饱和，最后用渗透水冲洗；
2)对牛乳进行脱脂，然后在73℃巴氏消毒20秒，然后冷却至6℃。在6℃通过反渗透法浓缩一部分巴氏消毒脱脂牛乳。这些未浓缩的和浓缩的巴氏脱脂乳的组成如下：
表4-脱脂乳起始物的组成
MS：干物质；MAT：总含氮物质；MP：蛋白质物质
3)在通过在管线中混合来准备好巴氏消毒脱脂乳的浓度水平后，在10℃的温度使其以不同的流速通过先前制备的径流柱。
观察到的脱脂乳的组成、流速和压力示于表5中。径流柱产生的压力损失(即压力)随着流速和流动相材料浓度的增加而增加(图2)，并与MS或MP的流速有很好的相关性(图3)。这些结果显示，在常规工业生产条件下，使用适当的通过流速，该工业规模的径流柱允许高达200g/L MS或72g MP(或75g/L MAT)的浓缩巴氏消毒脱脂乳通过(通过反渗透)，压力损失可以接受。
表5-用工业径流柱观察到的脱脂乳组成、流速和压力
实施例5：用浓缩巴氏消毒脱脂乳制造纯牛乳铁蛋白乳清分离物的工业测定
1)对牛乳进行脱脂，然后在73℃巴氏消毒20秒，然后冷却至6℃，然后在6℃通过反渗透浓缩至MS为128g/L；
2)使80m3的该浓缩巴氏消毒脱脂乳通过260L的工业径流柱(Albert HandtmannArmaturenfabrick GmbH)，其中填充有280L SP Sepharose Big Beads食品级树脂，流速为2.6m/h；
3)用5BV的渗透水冲洗后，在20℃用6BV的38mS/cm NaCl溶液部分洗脱结合蛋白。从该洗脱液中回收乳过氧化物酶、核糖核酸酶和其他碱性蛋白质；
4)在20℃用4BV的10％(w/v)NaCl溶液洗脱仍然结合的蛋白质。使含有牛乳铁蛋白的该洗脱液冷却并在6℃储存；
5)重复10次步骤2-4；
6)在超滤器(MWCO为20kDa的有机螺旋膜)上浓缩11.2m3的第二混合洗脱液，然后在UF(MWCO为20kDa)上用低至1mS/cm的渗透水进行渗滤，最后在1.4μm的双层陶瓷膜上进行微滤(Pall Corporation)；
7)以微滤液形式获得的富含牛乳铁蛋白的乳清蛋白分离物经过喷雾干燥，获得40kg的粉末(成分1)；
8)对成分1进行分析；特别是通过CLHP PI(C18柱0.1％TFA的H2O/CH3CN溶液梯度，在280nm处检测)测定乳铁蛋白在总蛋白质中的比例，即牛乳铁蛋白的相对峰面积(图5)。还通过AOAC方法测定该第二洗脱液中的钴胺素(维生素B12)含量。分析结果示于表6中。
实施例6：用浓缩巴氏消毒脱脂乳制造纯牛乳铁蛋白乳清分离物的工业测定
1)对牛乳进行脱脂，然后在73℃巴氏消毒20秒，然后冷却至6℃，然后在6℃通过反渗透浓缩至MS为120g/L；
2)使60m3的该浓缩巴氏消毒脱脂乳通过260L径流工业柱(Albert HandtmannArmaturenfabrick GmbH)，其中填充有280L SP Sepharose Big Beads食品级树脂，流速为2.6m/h；
3)用5BV的渗透水冲洗后，在20℃用6BV的36mS/cm NaCl溶液部分洗脱结合蛋白。从该洗脱液中回收乳过氧化物酶、核糖核酸酶和其他碱性蛋白质；
4)在20℃用4BV的10％(w/v)NaCl溶液洗脱仍然结合的蛋白质。使含有牛乳铁蛋白的该洗脱液冷却并在6℃储存；
5)重复15次步骤2-4；
6)在超滤器(截止阈值(MWCO)为20kDa的有机螺旋膜)上浓缩116.8m3的第二混合洗脱液，然后在UF(MWCO为20kDa)上用低至1mS/cm的渗透水进行渗滤，最后在0.8μm的双层陶瓷膜上进行微滤(Pall Corporation)；
7)以微滤液形式获得的富含牛乳铁蛋白的乳清蛋白分离物经过以下额外处理，以确保以下这种蛋白级分的稳定性：
i.一部分微滤液在0.2μm PES膜(Pall)上进行微过滤，然后放入灭菌的1L瓶中(成分3)
ii.剩余的微滤液经过喷雾干燥，获得60kg的粉末(成分2)。
8)对成分2和成分3进行分析；特别是通过CLHP PI(C18柱 0.1％ TFA的H2O/CH3CN溶液梯度，在280nm处检测)测定该第二洗脱液中乳铁蛋白在总蛋白质中的比例，即牛乳铁蛋白的相对峰面积(图6和图7)。还通过AOAC方法测定该第二洗脱液中的钴胺素(维生素B12)含量。分析结果示于表6中。
表6-成分1、成分2和成分3的物理化学和微生物学特征
实施例7：用来自巴氏消毒脱脂山羊乳的浓缩乳清进行小型测定
1)对山羊乳进行脱脂，然后在74℃巴氏消毒30秒，然后冷却至6℃；
2)3000L巴氏消毒脱脂山羊乳在50℃保持30分钟后，使其通过0.1μm陶瓷微滤器(Pall公司)，以获得不含脂肪和酪蛋白微团的作为山羊乳微滤液的乳清；
3)在超滤器(截止阈值(MWCO)为10kDa的有机螺旋膜)上浓缩2000L来自山羊乳的乳清。所得的保留物(450L)的组成在下表7中：
表7-来自山羊乳的浓缩乳清的组成
通过CLHP SEC(TSK G3000PWxl柱，CH3CN/H2O/TFA，在210nm处检测)测量该浓缩乳清中的山羊β-乳球蛋白和山羊α-乳白蛋白的浓度。通过CLHP SCX(Propac SCX柱，20mM磷酸盐缓冲液NaCl梯度，在280nm处检测)测量该浓缩乳清中的山羊乳铁蛋白的浓度。
4)使3L浓缩山羊乳清以200和300cm/h的线速度通过含有20mL(BV)SP SepharoseBig Beads的轴流柱(直径1.6cm)；
5)用5BV的渗透水冲洗后，在20℃用6BV的2.2％(w/v)NaCl溶液部分洗脱结合蛋白。从该洗脱液中回收除了乳铁蛋白之外的阳离子蛋白，如乳过氧化物酶；
6)在20℃用5BV的10％(w/v)NaCl溶液洗脱仍然结合的蛋白质。从该洗脱液中回收山羊乳铁蛋白。通过CLHP PI(C18柱0.1％ TFA的H2O/CH3CN溶液梯度，在280nm处检测)测量洗脱液中的山羊乳铁蛋白含量。
如表8所示，从来自山羊乳的浓缩乳清中非常有效地提取了蛋白质纯度非常高的山羊乳铁蛋白级分。
表8-使来自山羊乳的浓缩乳清通过而在第二洗脱液中获得的山羊乳铁蛋白
实施例8：用来自巴氏消毒脱脂山羊乳的浓缩乳酪乳清进行小型测定
1)在超滤器(MWCO为10kDa的有机螺旋膜)上浓缩240L来自巴氏消毒山羊乳的乳酪乳清(在74℃进行30秒)。获得的保留物(60L)的组成在下表中：
表9-来自山羊乳的浓缩乳酪乳清的组成
通过CLHP SEC(TSK G3000PWxl柱，CH3CN/H2O/TFA，在210nm处检测)测量该浓缩乳清中的山羊β-乳球蛋白和山羊α-乳白蛋白的浓度。通过CLHP SCX(Propac SCX柱，20mMNaPB/NaCl梯度，在280nm处检测)测量该浓缩乳清中的山羊乳铁蛋白的浓度。
2)使3L浓缩山羊乳清以200和300cm/h的线速度通过含有20mL(BV)SP SepharoseBig Beads的轴流柱(直径1.6cm)；
3)用6BV的渗透水冲洗后，在20℃用6BV的2.2％(w/v)NaCl溶液部分洗脱结合蛋白。从该洗脱液中回收除了乳铁蛋白之外的阳离子蛋白，如乳过氧化物酶；
4)在20℃用5BV的10％(w/v)NaCl溶液洗脱仍然结合的蛋白质。从该洗脱液中回收山羊乳铁蛋白。通过CLHP PI(C18柱0.1％ TFA的H2O/CH3CN溶液梯度，在280nm处检测)测量洗脱液中的山羊乳铁蛋白含量。
如表10所示，从来自山羊乳的浓缩乳酪乳清中非常有效地提取了高蛋白质纯度的山羊乳铁蛋白级分。
表10-使来自山羊乳的浓缩乳酪乳清通过而在第二洗脱液中获得的牛乳铁蛋白
实施例9：补充有牛乳铁蛋白(低维生素B12含量)的婴儿奶粉的制备测定
1)通过标准制造方法制备了一种基于牛乳的婴儿奶粉，用以下配制：脱脂牛乳、乳糖、麦芽糊精、油酸葵花籽油、无水乳脂肪、脱盐乳清、可溶性蛋白质、低聚半乳糖、葵花籽油、菜籽油、大豆卵磷脂、向日葵卵磷脂、磷酸钙、鱼油、磷酸钾、高山被孢霉(Mortierellaalpina)油、重酒石酸胆碱、氯化钙、柠檬酸钾、柠檬酸镁、氯化钠、低聚果糖、维生素C、焦磷酸铁、碳酸钙、牛磺酸、氢氧化钾、氯化钾、肌醇、核苷酸、L-苯丙氨酸、富含生育酚的提取物、L-抗坏血酸棕榈酸酯、硫酸锌、L-色氨酸、维生素E、碘化钾、L-肉毒碱、烟酰胺、亚硒酸钠、泛酸钙、硫酸铜、硫胺素、维生素A、维生素B6、硫酸锰、叶酸、维生素K、生物素、维生素D、核黄素、维生素B12。
2)以82mg/100g的掺入率将婴儿奶粉与成分1混合。
表11-掺入成分1的婴儿奶粉的组成
实施例10：补充有牛乳铁蛋白(高维生素B12含量)的粉末状营养配方奶粉的测定
1)通过标准制造方法制备了基于牛乳的婴儿奶粉(特殊医疗用途食品，即DADFMS)，用以下配制：脱脂乳、植物油(棕榈油、菜籽油、椰子油、葵花籽油)、脱盐可溶性蛋白质、乳糖、淀粉、刺槐豆粉、卵磷脂、柠檬酸钙、鱼油、高山被孢霉油、碳酸钙、维生素C、磷酸钙、柠檬酸钾、柠檬酸钠、氢氧化钙、氯化胆碱、牛磺酸、维生素E、肌醇、硫酸亚铁、L-色氨酸、氯化钾、氯化钙、富含生育酚的提取物、L-抗坏血酸棕榈酸酯、L-肉毒碱、硫酸镁、核苷酸、硫酸锌、维生素A、烟酰胺、维生素K、维生素D、泛酸钙、硫酸铜、硫胺素、维生素B6、核黄素、硫酸锰、叶酸、碘化钾、亚硒酸钠、生物素。
2)以400mg/100g的掺入率将DADFMS婴儿奶粉与成分2混合。通过掺入成分2，实现了每100g粉末状配方奶粉中摄入3.1μg与转钴胺素蛋白复合形式的维生素B12。
表12-掺入成分2的DADFMS粉末的组成
实施例11：补充有牛乳铁蛋白(高维生素B12含量)的粉末状营养配方奶粉的测定
1)通过标准制造方法制备了基于牛乳的液体婴儿乳(特殊医疗用途食品，DADFMS)，用以下配制：脱脂乳、脱盐可溶性蛋白质、植物油(棕榈油、棕榈仁油、菜籽油、葵花籽油)、乳糖、大豆卵磷脂、向日葵卵磷脂、柠檬酸钠、磷酸钙、柠檬酸钾、氯化钙、碳酸钙、维生素C、高山被孢霉油、鱼油、氢氧化钙、氯化钾、维生素E、氯化胆碱、牛磺酸、硫酸亚铁、富含生育酚的提取物、L-抗坏血酸棕榈酸酯、肌醇、硫酸锌、核苷酸、L-肉毒碱、烟酰胺、维生素A、硫酸镁、维生素K、维生素D、泛酸钙、硫酸铜、硫胺素、维生素B6、核黄素、硫酸锰、叶酸、碘化钾、亚硒酸钠、生物素。
2)液体形式的DADFMS婴儿乳通过超高温(UHT)热处理进行灭菌，然后以410mg/100g(干物质)的掺入率与成分3混合。通过掺入成分3，实现了每100mL液体制剂摄入0.43μg与转钴胺素蛋白复合形式的维生素B12。
表13-掺入成分3的液体DADFMS的组成
实施例12：使用牛乳铁蛋白(高维生素B12含量)制备胶囊食品补充剂
由实施例5的成分2(混合物的99.5％)和胶体二氧化硅(混合物的0.5％)的混合物制备了胶囊食品补充剂。每粒胶囊含有200mg蛋白质。
与转钴胺素蛋白复合形式的维生素B12的含量为1.6μg/胶囊。每个人群的推荐每日剂量如下：
表14
人群 每日剂量 复合形式的维生素B12 牛乳铁蛋白
4至10岁的儿童 1粒胶囊 1.6μg 189mg
11至17岁的青少年 2粒胶囊 3.2 μg 379mg
成人 3粒胶囊 4.8 μg 568mg
孕妇/哺乳期妇女 4粒胶囊 5.6 μg 757mg

Claims (7)

1.一种用于制备阳离子乳清蛋白分离物的方法，其包括以下步骤a)至f)：
a)起始原料是哺乳动物脱脂乳或来自哺乳动物乳的乳清，其先前通过膜技术浓缩，使得当用哺乳动物脱脂乳制备所述起始原料时，蛋白质物质MP的浓度在40和72g/L之间，并且当用乳清制备所述起始原料时，蛋白质物质的浓度在20和100g/L之间；
b)选择性提取阳离子蛋白包括以下步骤：
i.使起始原料通过径流色谱柱，所述柱含有磺丙基SP型强阳离子交换树脂，优选所述树脂直径大于100μm：
-相当于未浓缩体积的起始原料的体积在树脂体积BV的40和500倍之间；
-起始原料通过的线速度在1.0和4.0m/h之间；
ii.用软化水冲洗：
-软化水的体积在2和6BV之间；
-软化水通过速度在3.0和5.0m/h之间；
iii.用电导率在30和50mS/cm之间的盐溶液洗脱结合的阳离子蛋白：
-盐溶液的体积在4和8BV之间；
-盐溶液的通过速度在0.3和2.0m/h之间；
iv.用电导率为80至140mS/cm的盐溶液洗脱结合的阳离子蛋白：
-盐溶液的体积在3至6BV之间；
-盐溶液的通过速度在0.5和2.5m/h之间；
c)使用截止阈值在10和20kDa之间的超滤膜浓缩在盐溶液中洗脱的高纯度乳铁蛋白阳离子蛋白；
d)使用截止阈值在10和20kDa之间的超滤膜，通过用软化水渗滤，对高纯度乳铁蛋白阳离子蛋白进行脱盐，以达到灰分/蛋白质比在0.001和0.03之间；
e)用截止阈值在0.2和1.4μm之间的膜对特定阳离子蛋白的浓缩溶液进行微滤，以减少微生物负荷；
f)任选地，喷雾干燥或冷冻干燥先前微滤的特定阳离子蛋白的浓缩溶液，以获得粉末状乳铁蛋白分离物。
2.根据权利要求1所述的方法获得的阳离子乳清蛋白分离物，其特征在于，蛋白质占干物质的比例大于或等于90重量％，并且乳铁蛋白占总蛋白质的比例大于90重量％。
3.根据权利要求1所述的方法由牛乳或山羊乳获得的阳离子乳清蛋白分离物，其特征在于，乳铁蛋白占总蛋白质的比例大于95重量％，并且含有与转钴胺素蛋白复合形式的钴胺素，其浓度小于或等于5μg/g蛋白质。
4.根据权利要求1所述的方法由牛乳或山羊乳获得的阳离子乳清蛋白分离物，其特征在于，乳铁蛋白占总蛋白质的比例大于90重量％，并且含有与转钴胺素蛋白复合形式的钴胺素，其浓度大于或等于5μg/g蛋白质。
5.根据权利要求4所述的阳离子乳清蛋白分离物，其用于预防和/或治疗接受过胃切除术或长期接受质子泵抑制剂IPP治疗的患者的维生素B12缺乏吸收。
6.一种供人或动物食用的食品产品，其包含根据权利要求2至4中任一项所述的分离物。
7.一种非食品产品，其包含根据权利要求2至4中任一项所述的分离物。
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