EP4171588A1 - Verfahren zur gewinnung von stammzellen - Google Patents

Verfahren zur gewinnung von stammzellen

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Publication number
EP4171588A1
EP4171588A1 EP21739434.5A EP21739434A EP4171588A1 EP 4171588 A1 EP4171588 A1 EP 4171588A1 EP 21739434 A EP21739434 A EP 21739434A EP 4171588 A1 EP4171588 A1 EP 4171588A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
cannula
bone
stem cells
vacuum
bone marrow
Prior art date
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Pending
Application number
EP21739434.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Liudmila Petrovna NIKOLAEVA
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
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Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of EP4171588A1 publication Critical patent/EP4171588A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0652—Cells of skeletal and connective tissues; Mesenchyme
    • C12N5/0669—Bone marrow stromal cells; Whole bone marrow
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
    • A61K35/12—Materials from mammals; Compositions comprising non-specified tissues or cells; Compositions comprising non-embryonic stem cells; Genetically modified cells
    • A61K35/28—Bone marrow; Haematopoietic stem cells; Mesenchymal stem cells of any origin, e.g. adipose-derived stem cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor

Definitions

  • the invention relates to cell technologies, namely to methods for obtaining stem toes from the bone marrow of limbs, in particular human limbs amputated above the thigh.
  • the bone marrow is known to be a universal source of stem cells.
  • a bone marrow puncture is usually required to obtain stem cells from the bone marrow.
  • the iliac bones ie the pelvic bones, are punctured for this purpose. (Guide to Laboratory Hematology / B. Sisla; transl. From English, ed. By Al Vorobyov - M .: Practical Medicine, 2011. - 352 c.).
  • the stem cell content is low (no more than 0.001%).
  • a method for obtaining stem cells from bone marrow by extracting them from human tissue is known from the prior art. This method is discussed in the article by Machalinski B., et al. (Morphological analysis of the bone marrow biopsies derived from heparinized ca- daveric organ donors before and after disconnecting from the respirator, Morphsammlung, Ann Transplant. 2001; 6 (4 ⁇ : 48-52). The named article describes a method or study for the extraction of hematopoietic cells from Bone marrow obtained from the pelvic bone of human corpses by puncture.
  • the objects of the invention are therefore: 1. Shortening the time of the stem cell production method,
  • a method for obtaining adult stem cells comprising the steps of: a. Providing a portion of a subject's bone severed from the remainder of the body, the bone having an open medullary cavity; b. Removal of the bone marrow from the medullary cavity with a vacuum aspirator or a sharp spoon;
  • the cells are in particular non-embryonic stem cells, i.e. adult stem cells.
  • c Isolation of stem cells from the bone marrow. Any bone that is precipitated during surgery on a living or dead, particularly living subject, can be used.
  • Flat bones are understood here as the ilium, sternum, rib, etc. The advantage of using flat bones is that they contain hematopoietic stem cells in large numbers.
  • tubular bones can be used.
  • Tubular bones include the femur, tibia, fibula, and the like.
  • the use of tubular bones has the advantage that they contain large numbers of mesenchymal stem cells.
  • the method offers the advantage that bones or parts of bones that are present in limbs are also present. Such parts occur in particular with medically necessary amputations.
  • the method can also include: a. Providing an amputated part of a limb of a subject severed from the rest of the body, the part of the limb having an open marrow bone; b. Removal of the bone marrow from the medullary cavity with a vacuum aspirator or a sharp spoon; c. Isolation of the stem cells from the bone marrow.
  • the removal can take place by means of a (manual) vacuum suction device.
  • a vacuum aspirator is an aspirator that suitable for the suction of blood and other body fluids (e.g. MVA Plus other devices).
  • vacuum suction devices that are used for suctioning off material / tissue in the uterus are suitable. Since the bone of the limb was severed during the amputation, the medullary cavity was also severed, and the severed part of the limb is open, ie the lumen of the medullary cavity is accessible without the need for another puncture.
  • the use of a vacuum suction device has the advantage that it enables the bone marrow to be removed quickly, gently and as completely as possible.
  • the removal can take place through a cannula connected to the vacuum suction device.
  • the cannula can be 20-40 cm, in particular 24 cm, long, the cannula can have an inside diameter of 2-20 mm, in particular 4-8 mm.
  • the cannula can be made of a flexible or semi-rigid material such as plastic.
  • step b can include the following steps: insert the cannula into the medullary cavity, activate the vacuum aspirator so that it creates a vacuum, connect the vacuum aspirator to the cannula, and remove the bone marrow through the vacuum aspirator Transport the cannula into a receptacle.
  • the cannula can be rotated within the medullary cavity.
  • the insertion of the cannula can be facilitated and a complete suction of the tissue can be made possible.
  • the vacuum pressure can be increased gradually.
  • the pressure applied is at a time when the medullary cavity is still with a lot There is less bone marrow filling and less damage to the bone marrow.
  • the vacuum pressure is then increased in order to aspirate the remaining bone marrow as completely as possible.
  • the removal can alternatively take place with a sharp spoon, in particular a Volkmann spoon or a gynecological curette.
  • a sharp spoon is a spoon commonly used in surgery where the edge of the spoon is sharp-edged so that the bone marrow can be removed efficiently.
  • This method is particularly suitable when the length of the part of the bone or limb is rather small, e.g. one third of the total length of the entire limb or bone.
  • the alternative method with vacuum pressure is particularly suitable when the length of the part of the limb or bone is rather large, e.g. half or two-thirds of the total length of the entire limb.
  • the adult stem cells can be mesenchymal stem cells and / or hematopoietic stem cells.
  • the limb can be a thigh (containing the femur) or the bone can be the femur. Particularly large amounts of stem cells can be obtained from the femur.
  • the part of the limb can be obtained by amputation at the level of the lower third or amputated at the level of the middle or upper third.
  • the subject can be a human.
  • the subject can be ill with diseases which inevitably necessitate amputation of a limb, for example diabetes mellitus or atherosclerosis, in particular the subject can be ill with diabetic foot syndrome be ill.
  • the subject's limb containing the bone may have suffered trauma, such as an accident.
  • steps b. and c. can vary and depends e.g. on the size of the bone. Steps b and c can therefore last a maximum of 90 minutes or a maximum of 60 minutes. Step c can take a maximum of 60 minutes or a maximum of 45 minutes. These short processing times have the advantage that hypoxia of the removed cells is reduced.
  • a vacuum suction device which is set up to carry out the method described above with a vacuum suction device, comprising a vacuum suction device, a cannula and a receiving container.
  • the stem cell extraction method involves the extraction of bone marrow from human tissue with subsequent isolation of hematopoietic stem cells therefrom.
  • the bone marrow is immediately removed mechanically from an amputated limb of the patient with a Volkmann spoon or a vacuum aspirator.
  • a cannula is inserted through the femoral canal of the bone cavity and a vacuum suction device is attached to it, if this has not already been done.
  • press the buttons on the valve of the vacuum suction device To start suction through the cannula, press the buttons on the valve of the vacuum suction device. The cannula has to be moved and turned towards you.
  • the valve buttons When the vacuum suction device is filled and suction stops, the valve buttons must be pressed and the cannula removed from the suction device. The cannula is left in the medullary cavity. The suction cup is then replaced or emptied. Then a vacuum is generated again and the aspirator is connected to the suction hose. If the Extraction is completed, the suction cup is disconnected from the suction hose and the suction hose is pulled out of the thigh cavity. Now the contents of the vacuum suction device have to be emptied into a container. Immediately after the bone marrow collection, both hematopoietic and mesenchymal stem cells are isolated.
  • bone marrow After an emergency amputation (e.g. in patients with gangrene of the foot due to diabetes mellitus, after an accident, etc.) of a patient's lower extremity, the bone marrow must be immediately available in the operating room. The necessary sterility is ensured in the operating room.
  • bone marrow is extracted from the lumen of a finally (i.e. lifelong) amputated limb (e.g. thigh) immediately after the amputation, e.g. B. removed with a Volkmann spoon (when amputating a limb at the level of the lower thigh third) into a sterile container. This is immediately transported to the laboratory, where hematopoietic and mesenchymal stem cells are isolated from the bone marrow within a maximum of 1 hour.
  • a manual vacuum suction device (such as the ipas MVA Plus and similar models) is used to achieve as complete a bone marrow extraction as possible.
  • This aspirator is used in gynecology to aspirate the contents of the uterus.
  • its mechanism of action allows it to be used to harvest bone marrow from the femur in the following order: After the optional treatment of the edges of the thigh (amputation site), the cannula is gently inserted through the femoral canal without damaging the medullary tissue. Slightly pushing the cannula inwards together with the rotation of the cannula facilitates the insertion.
  • the cannula is then inserted slowly until it touches the bone of the epiphysis of the thigh. Then the cannula is carefully withdrawn.
  • the cannula must be held securely and immovable on the foot with one hand and (if necessary with an adapter) inserted into the prepared vacuum suction cup in which a vacuum has already been created. Make sure that the cannula is not depressed while the aspirator is being attached.
  • the suction cup must be held by the valve body with the other hand.
  • the cannula base is then carefully pushed into the vacuum suction device with a slight twist. Alternatively, the cannula can be attached to the
  • Vacuum suction cups must be attached before the cannula is inserted into the femoral cavity.
  • To start aspiration through the cannula press the buttons on the valve of the vacuum suction device. Blood, bone tissue, and bubbles should begin to flow through the cannula.
  • To evacuate the contents of the thigh turn the cannula by moving the piston of the vacuum suction device towards you. At the same time the vacuum pressure is increased. If the suction cup fills while suctioning the contents of the femoral cavity and suction stops, press the valve buttons and disconnect the cannula from the suction cup. The cannula is in to leave the medullary cavity. The suction cup is exchanged or emptied. A vacuum is then created again and the aspirator is connected to the cannula. After completing the operation, the vacuum suction device is separated from the cannula by turning it.
  • valve buttons are depressed, the spacer arms of the piston are pressed together and the piston is pushed into the cylinder as far as it will go.
  • the patient is not subjected to any additional operations, in particular no puncture.
  • the volume of the bone marrow depends on the level of the amputation, which can be at the level of the lower, middle, or upper third of the thigh. Accordingly, the greatest amount of bone marrow and thus of cellular material can be obtained during the amputation of limbs at the level of the upper third of the thigh (Machalinski B., et al .; “Morphological analysis of the bone marrow biopsies derived from heparinized cadaveric organ donors before and after disconnecting from the respirator “, Morphsammlung, Ann Transplant. 2001; 6 (4): 48-52), in patients with diabetes mellitus z. B. the therapy aims at the maintenance of the second extremity and the compensation of the diabetes mellitus. This requires substantial therapeutic doses of stem cells contained in the bone marrow. The percentage of HSCs and MSCs in the bone marrow is shown in Table 1 (based on the examination of 40 bone marrow samples from an amputated limb).
  • HSCs and MSCs for cell therapy is most promising at the current stage of clinical science as it allows one to avoid ethical and immunological problems associated with transplanting cells from the donor to the recipient.
  • Hematopoietic and mesenchymal stem cells have been used to treat patients with oncological, hematological and other diseases for three decades.
  • the approaches to SC transplantation in the treatment of diseases that until recently were considered incurable with traditional approaches are being actively developed.
  • the application of cell technologies in clinical practice is an urgent task for modern medicine.
  • transplants hematopoietic bone marrow cells
  • MSCs have been particularly important for cell therapy because they can be used in a variety of ways. They are practically not rejected and can be used for different patients.
  • Such transplants now run in the thousands and are proven to be effective.
  • new results from clinical studies appear every year. These studies prove the effectiveness of stem cells in treating various diseases.

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Abstract

Verfahren und Vorrichtung zum Gewinnen von adulten Stammzellen aus einem amputierten Teil einer Gliedmaße.

Description

Verfahren zur Gewinnung von Stammzellen
Die Erfindung bezieht sich auf Zelltechnologien, nämlich auf Verfahren zur Gewinnung von StammzeHen aus dem Knochenmark von Gliedmaßen, insbe- sondere menschlicher oberschenkeiamputierter Gliedmaßen.
Keine der derzeit verfügbaren Quellen für humane Stammzellen (SCs) oder Methoden zu deren Gewinnung kann die Bedürfnisse der Forscher und die Anforderungen der Kliniker vollständig erfüllen. Die Gewinnung von adulten Stammzellen ist mit dem Einsatz von invasiven, traumatischen, für den Spender schmerzhaften Verfahren verbunden (nicht ohne das Risiko von Komplikationen beim Patienten). Ferner handelt es sich dabei um kostspielige Verfahren. All dies schränkt die experimentelle Forschung an menschlichen Stammzellen zweifellos ein, und es verlangsamt die Einführung von Zelltechnologien in die klinische Praxis. Die amputierte Gliedmaße, die als Ergebnis einer erzwungenen Operation gewonnen wird, kann als eine der zugänglichsten Quellen für Stammzeilen angesehen werden, sowohl für hämatopoetische (HSCs) als auch für mesenchymale Stammzeilen (MSCs). Die Fähigkeit, sich in verschiedene Zelltypen zu differenzieren, macht MSCs vieiversprechend im Hinblick auf ihren möglichen Einsatz für die Zelltherapie einer Vielzahl von erworbenen und vererbten Krankheiten. Wenn MSCs in den systemischen Blutkreislauf injiziert werden, sind sie in der Lage, zielgerichtet in das betroffene Gebiet zu wandern. Das Knochenmark ist bekanntlich eine universelle Quelle für Stammzeilen. Zur Gewinnung von Stammzellen aus dem Knochenmark ist üblicherweise eine Knochenmarkpunktion erforderlich. In der Regel wird dazu eine Punktion der ili- akaien Knochen, d.h. der Beckenknochen durchgeführt. (Guide to Laboratory Haematology / B. Sisla; transl. from English, ed. by A.l. Vorobyov - M.: Practical Medicine, 2011. - 352 c.).
Die Knochenmarkpunktion bei Patienten ist jedoch mit gewissen Schwierigkeiten verbunden:
- Es wird nur eine kleine Menge an Material erhalten. - Der Stammzellgehait ist gering (nicht mehr als 0,001%).
- Der Patient ist abgeneigt, sich dem Eingriff zu unterziehen.
- Komplikationen durch die Punktion sind möglich.
Aus dem Stand der Technik ist eine Methode zur Gewinnung von Stammzellen aus Knochenmark durch deren Extraktion aus menschlichem Gewebe bekannt. Diese Methode wird in dem Artikel von Machalinski B., et al. beschrieben (Mor- phological analysis of the bone marrow biopsies derived from heparinized ca- daveric organ donors before and after disconnecting from the respirator, Morphologische, Ann Transplant. 2001 ;6(4}:48-52). Der genannte Artikel beschreibt eine Methode bzw. Studie zur Gewinnung von hämatopoetischen Zellen aus Knochenmark, das durch Punktion aus dem Beckenknochen menschlicher Leichen gewonnen wurde.
Die Nachteile des Standes der Technik sind die Folgenden: 1. Die Studie wurde an den iiiakalen (flachen) Knochen von menschlichen
Leichen durchgeführt. Die Verwendung von aus leichtem Knochenmark gewonnenen Stammzeilen zur Transplantation und/oder Gentherapie kann nur auf der Grundlage der immunologischen Verträglichkeit von Spender und Empfänger erfolgen. Wie die klinische Praxis zeigt, sind Empfänger nach einer solchen Transplantation gezwungen, lebenslang Medikamente einzunehmen, die Immunreaktionen unterdrücken. Ihr Entzug führt zur Entwicklung von Abstoßungsreaktionen auf fremde Organe oder Gewebe zu einem beliebigen Zeitpunkt nach der Operation. So ist Knochenmark, das aus den Organen von Leichen entnommen wird, aus den oben genannten Gründen in der Therapie solcher Patienten unerwünscht. Es kann zu irreversiblen Reaktionen und zum Tod des Patienten führen.
2. Die gewonnene Anzahl von Stammzelien für die Zeiltherapie ist gering. Um sie zu vermehren, wurde im Stand der Technik eine Zellkultivierung durchgeführt (Dauer bis zu 2 - 3 Wochen). Die Erlangung von SC ist in der
Regel mit der Notwendigkeit verbunden, die Zellmasse zu erhöhen. Die Kultivierung von Stammzelien führt oft zu einer Abnahme ihrer Qualität und in der Folge zu unerwünschten Nebenwirkungen. 3. Das Knochenmark befindet sich über einen langen Zeitraum von 3
Stunden und mehr in einem Zustand der Hypoxie. Dies führt zu einer Abnahme der Anzahl der Zellen, dem Beginn ihrer Zerstörung und einer Abnahme der Zellqualität. 4. Die Studie wurde nur mit hämatopoetischen Stammzellen durchgeführt.
Aufgaben der Erfindung sind daher: 1. Verkürzung der Zeit der Stammzeiienproduktionsmethode,
2. erhöhte Sicherheit für das Leben des Patienten,
3. Erreichen der maximalen Knochenmarkextraktion und Gewinnung einer ausreichenden Anzahl von hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen für die Zelitherapie daraus.
Die oben genannten Aufgaben werden durch die in den Ansprüchen definierten Gegenstände gelöst.
Die Erfindung wird durch den Gegenstand der beigefügten Ansprüche definiert. Offenbart wird ein Verfahren zur Gewinnung von adulten Stammzellen, umfassend die Schritte: a. Bereitstellen eines Teils eines vom übrigen Körper abgetrennten Knochens eines Subjekts, wobei der Knochen eine offene Markhöhle aufweist; b. Entnahme des Knochenmarks aus der Markhöhle durch einen Vakuum- Absauger oder einen scharfen Löffel;
Bei den Zellen handelt es sich insbesondere um nicht-embryonale Stammzellen, also adulte Stammzellen. c. Isolierung der Stammzellen aus dem Knochenmark. Jeder Knochen, der bei einer Operation an einem lebenden oder toten, insbesondere lebenden Subjekt anfäilt, kann verwendet werden. Dies schließt flache Knochen ein. Als flache Knochen werden hier llium, Sternum, Rippe, etc. verstanden. Die Verwendung flacher Knochen bietet den Vorteil, dass sie hämatopoetische Stammzellen in großer Zahl enthalten.
Alternativ können röhrenförmige Knochen verwendet werden. Röhrenförmige Knochen umfassen Femur, Tibia, Fibula und ähnliche. Die Verwendung röhrenförmige Knochen bietet den Vorteil, dass sie mesenchymale Stammzellen in großer Zahl enthalten.
Das Verfahren bietet den Vorteil, dass auch Knochen oder Teile von Knochen, die in Gliedmaßen vorlegen, vorliegen. Solche Teile fallen insbesondere bei medizinisch notwendigen Amputationen an.
Daher kann das Verfahren auch umfassen: a. Bereitsteüen einer amputierten vom übrigen Körper abgetrennten Teils einer Gliedmaße eines Subjekts, der Teil der Gliedmaße aufweisend einen Knochen mit offener Markhöhie; b. Entnahme des Knochenmarks aus der Markhöhle durch einen Vakuum- Absauger oder einen scharfen Löffel; c. Isolierung der Stammzeilen aus dem Knochenmark.
Insbesondere kann in Schritt b der Verfahren die Entnahme durch einen (manuellen) Vakuum-Absauger erfolgen. Als Vakuum-Absauger ist ein Aspirator, der für die Absaugung von Blut und andere Körperflüssigkeiten geeignet ist, geeignet (z.B. MVA Plus andere Geräte). Insbesondere sind Vakuum-Absauger geeignet, die zur Absaugung von Material/Gewebe im Uterus verwendet werden, geeignet. Da bei der Amputation der Knochen der Gliedmaße durchtrennt wurde, wurde auch die Markhöhle durchtrennt, und liegt abgetrennten Teil der Gliedmaße offen vor, d.h. das Lumen der Markhöhle ist zugänglich, ohne dass eine weitere Punktion erfolgen muss.
Die Verwendung eines Vakuum-Absaugers bietet den Vorteil, dass eine rasche, schonende und möglichst vollständige Entnahme des Knochenmarks ermöglicht wird.
In Schritt b kann die Entnahme durch eine an den Vakuum-Absauger angeschlossene Kanüle erfolgen. Die Kanüle kann 20-40 cm, insbesondere 24 cm, lang sein, die Kanüle kann einen Innendurchmesser von 2-20 mm, insbesondere 4-8 mm besitzen. Die Kanüle kann aus einem flexiblem oder semi-rigidem Material, z.B. Kunststoff, bestehen.
Insbesondere kann Schritt b die folgenden Schritte umfassen: die Kanüle in den Markhöhle einführen, den Vakuum-Absauger so aktivieren, dass er ein Vakuum erzeugt, den Vakuum-Absauger an die Kanüle anschließen, und das Knochen- markt durch den Vakuum-Absauger aus der Kanüle in einen Aufnahmebehälter transportieren.
Die Kanüle kann innerhalb der Markhöhle gedreht werden. Somit kann das Einführen der Kanüle erleichtert werden und eine vollständige Absaugung des Gewebes ermöglicht werden. Im Laufe des Schrittes b) kann der Vakuumdruck graduell erhöht werden. Somit ist der angelegte Druck zu einem Zeitpunkt zu dem die Markhöhle noch mit viel Knochenmark gefüiit ist geringer sein, und das Knochenmarkt wird weniger beschädigt. Zu einem späteren Zeitpunkt wird der Vakuumdruck dann erhöht, um auch verbliebenes Knochenmark möglichst vollständig abzusaugen.
In Schritt b kann alternative die Entnahme durch einen scharfen Löffel, insbe- sondere einen Löffel nach Volkmann oder eine gynäkologische Kürette erfolgen. Ein scharfer Löffel ist ein in der Chirurgie häufig verwendeter Löffel, bei der Rand des Löffels scharkantig ist, so dass ein effizientes Entfernen des Knochenmarks möglich wird. Diese Methode eignet sich insbesondere, wenn die Länge des Teiles des Knochens oder der Gliedmaße eher gering ist, z.B. ein Drittel der Gesamtlänge des gesamten Gliedmaßes oder Knochens. Das alternative Verfahren mit Vakuumdruck eignet sich insbesondere dann, wenn die Länge des Teiles der Gliedmaße oder des Knochens eher groß ist, z.B. die Hälfte oder Zweidrittel der Gesamtlänge des gesamten Gliedmaßes.
Die adulten Stammzellen können mesenchymale Stammzellen oder/und häma- topoetische Stammzeilen sein.
Die Gliedmaße kann ein Oberschenkel (enthaltend den Femur) sein bzw. der Knochen kann der Femur sein. Aus dem Femur lassen sich besonders große Mengen an Stammzellen gewinnen.
Das Teil der Gliedmaße kann durch Amputation auf Höhe des unteren Drittels gewonnen wurde oder durch Amputation auf Höhe des mittleren oder oberen Drittels gewonnen werden.
Das Subjekt kann ein Mensch sein.
Das Subjekt kann an Krankheiten, die zwingenderweise eine Amputation einer Gliedmaße bedingen erkrankt sein, z.B. an Diabetes mellitus oder Atherosklero- se erkrankt sein, insbesondere kann das Subjekt an diabetischem Fußsyndrom erkrankt sein. Die Gliedmaße des Subjektes enthaltend den Knochen kann einem Trauma ausgesetzt gewesen, z.B. ausgelöst durch einen Unfall.
Die Dauer der Schritte b. und c. kann variieren, und hängt z.B. von der Größe des Knochens ab. Schritt b und c kann daher maximal 90 Minuten oder maximal 60 Minuten dauern. Schritt c kann maximal 60 Minuten oder maximal 45 Minuten dauern. Dies kurzen Bearbeitungszeiten haben den Vorteil, dass eine Hypoxie der entnommenen Zellen reduziert wird.
Ferner ist ein Vakuum-Absauger Vorrichtung offenbart, die eingerichtet ist, das oben beschriebene Verfahren mit einem Vakuum-Absauger durchzuführen umfassend einen Vakuum-Absauger, eine Kanüle und einen Aufnahmebehälter.
Die technischen Probleme werden durch die Methode der Gewinnung von Stammzellen gelöst, die die Gewinnung von Knochenmark aus menschlichem Gewebe mit anschließender Isolierung von hämatopoetischen Stammzeilen daraus umfasst. Nach der Amputation wird das Knochenmark aus einer amputierten Extremität des Patienten sofort mechanisch mit einem Volkmann- Löffel oder einem Vakuum-Aspirator entnommen. Dazu wird nach der Bearbeitung der Ränder der Amputationsstelle mit einem Vakuumsauger eine Kanüle durch den femoralen Knochenhöhlenkanal eingeführt und ein Vakuumsauger daran angeschiossen, wenn dies nicht bereits vorher geschehen ist. Um die Absaugung durch die Kanüle zu starten, sind die Tasten am Ventil des Vakuumsaugers zu drücken. Dabei ist die Kanüle zu bewegen und auf sich zu zu drehen. Wenn der Vakuumsauger gefüllt ist und die Absaugung stoppt, sind die Ventiltasten zu drücken, und die Kanüle ist vom Sauger abzuziehen. Dabei wird die Kanüle in der Markhöhle belassen. Anschließend wird der Vakuumsauger ausgetauscht oder entleert. Dann wird wieder ein Vakuum erzeugt und der Aspirator an den Saugschlauch angeschlossen. Wenn die Extraktion abgeschlossen ist, wird der Vakuumsauger vom Saugschlauch getrennt und der Saugschlauch aus der Oberschenkelhöhle gezogen. Jetzt ist der Inhalt des Vakuumsaugers in einen Behälter zu entleeren. Unmittelbar nach der Knochenmarkentnahme werden daraus sowohl hämatopoetische als auch mesenchymale Stammzellen isoliert.
Beispiele
Nach einer notfallmäßigen Amputation (z. B. bei Patienten mit Gangrän des Fußes aufgrund von Diabetes mellitus, nach einem Unfall usw.) der unteren Extremität eines Patienten muss das Knochenmark sofort im Operationssaal zur Verfügung stehen. Im Operationssaal wird die notwendige Sterilität sichergestellt. Dazu wird Knochenmark aus dem Lumen einer final (d.h. lebenslang) amputierten Gliedmaße (z. B. Oberschenkel) unmittelbar nach der Amputation, z. B. mit einem Volkmann-Löffel (bei Amputation einer Gliedmaße in Höhe des unteren Oberschenkeldritteis) in einen sterilen Behälter entnommen. Diese wird sofort ins Labor transportiert, wo hämatopoetische und mesenchymale Stammzellen innerhalb von maximal 1 Stunde aus dem Knochenmark isoliert werden.
Bei einer Amputation auf Höhe des mittleren oder oberen Drittels des Oberschenkels ist es schwierig, das Mark vollständig zu extrahieren. Ein manueller Vakuumsauger (wie der ipas MVA Plus und ähnliche Modelle) wird verwendet, um eine möglichst vollständige Knochenmarkentnahme zu erreichen. Dieser Aspirator wird in der Gynäkologie verwendet, um den Inhalt des Uterus abzusaugen. Sein Wirkmechanismus erlaubt es jedoch, ihn zur Knochenmarkentnahme aus dem Oberschenkelknochen in der folgenden Reihenfolge zu verwenden: Nach der optionalen Behandlung der Ränder des Oberschenkels (Amputationsstelle) wird die Kanüle schonend durch den Femurhöhlenkanal eingeführt, ohne das Markgewebe zu beschädigen. Ein leichtes Drücken der Kanüle nach innen zusammen mit der Drehung der Kanüle erleichtert das Einführen. Die Kanüle wird dann langsam eingeführt, bis sie den Knochen der Epiphyse des Oberschenkels berührt. Dann wird die Kanüle vorsichtig herausgezogen. Die Kanüle ist mit einer Hand sicher und unbeweglich am Fuß festzuhal- ten und (ggf. mit Adapter) in den vorbereiteten Vakuumsauger zu stecken, in dem bereits ein Vakuum erzeugt wurde. Es ist darauf zu achten, dass die Kanüle nicht eingedrückt wird, während der Absauger angebracht wird. Der Vakuumsauger ist mit der anderen Hand am Ventilkörper festzuhalten. Die Kanülenbasis wird dann unter leichter Drehung vorsichtig in den Vakuumsauger geschoben. Alternativ kann die Kanüle am
Vakuumsauger befestigt werden, bevor die Kanüle in die Femurhöhle eingeführt wird. Um das Ansaugen durch die Kanüle zu starten, sind die Tasten am Ventil des Vakuumsaugers zu drücken. Blut, Knochengewebe und Blasen sollten beginnen, durch die Kanüle zu fließen. Um den Inhalt des Oberschenkels zu evakuieren, ist die Kanüle zu drehen, indem der Kolben des Vakuumsaugers zu sich hin bewegt wird. Gleichzeitig wird der Vakuumdruck erhöht. Wenn sich der Vakuumsauger während des Absaugens des Inhalts der Oberschenkelhöhle füllt und die Absaugung stoppt, sind die Ventiltasten zu drücken, und die Kanüle ist vom Sauger zu trennen. Die Kanüle ist in der Markraumhöhle zu belassen. Der Vakuumsauger wird ausgetauscht oder entleert. Danach wird erneut ein Vakuum erzeugt, und der Aspirator wird an die Kanüle angeschlossen. Nach Abschluss der Operation wird der Vakuumsauger durch Drehen von der Kanüle getrennt.
6. Nach der Operation zur Evakuierung des Femurinhalts, wenn der Hohlraum leer ist, sind die Tasten am Ventil zu drücken, und die Kanüle ist aus dem Femurhohlraum zu entfernen. Die Kanüle ist vom Vakuumsauger abgekoppeit. Die Kanüle kann auch ohne Betätigung der Ventiltasten herausgezogen werden.
7. Um den Inhalt des Vakuumsaugers in einen geeigneten Behälter zu entleeren, werden die Ventilknöpfe heruntergedrückt, die Abstandshalterarme des Kolbens zusammengedrückt und der Kolben bis zum Anschlag in den Zylinder geschoben.
Der Patient wird keinen zusätziichen Eingriffen, insbesondere keiner Punktion, unterzogen.
Das Volumen des Knochenmarks hängt von der Höhe der Amputation ab, die auf der Höhe des unteren, mittleren oder oberen Drittels des Oberschenkels liegen kann. Dementsprechend kann die größte Menge an Knochenmark und damit an zellulärem Material bei der Amputation von Gliedmaßen auf der Höhe des oberen Drittels des Oberschenkels gewonnen werden (Machalinski B., et al.; „Morphological anaiysis of the bone marrow biopsies derived from heparinized cadaveric organ donors before and after disconnecting from the respirator“, Morphologische, Ann Transplant. 2001;6(4):48-52), Bei Patienten mit Diabetes mellitus z. B. zielt die Therapie auf den Erhalt der zweiten Extremität und die Kompensation des Diabetes mellitus ab. Dies erfordert erhebliche therapeutische Dosen von Stammzelien, die im Knochenmark enthalten sind. Der prozentuale Gehalt an HSCs und MSCs im Knochenmark ist in Tabelle 1 dargestellt (basierend auf der Untersuchung von 40 Knochenmarkproben aus einer amputierten Gliedmaße).
Die Verwendung von HSCs und MSCs für die Zeiltherapie ist im derzeitigen Stadium der klinischen Wissenschaft am vielversprechendsten, da sie es erlaubt, ethische und immunologische Probleme zu vermeiden, die mit der Transplantation von Zeilen vom Spender zum Empfänger verbunden sind. Hämatopoetische und mesenchymale Stammzellen werden seit drei Jahrzehnten zur Behandlung von Patienten mit onkologischen, hämatoiogischen und anderen Erkrankungen eingesetzt. Die Ansätze zur SC-Transpiantation bei der Behandlung der Krankheiten, die bis vor kurzem mit traditionellen Ansätzen als unheilbar galten, werden aktiv weiterentwickelt. Die Anwendung von Zelltechnologien in der klinischen Praxis ist eine dringende Aufgabe der modernen Medizin.
Die ersten Transplantationen (hämatopoetische Knochenmarkzellen) wurden in der Mitte des letzten Jahrhunderts durchgeführt, und viele Patienten leben heute noch. In den letzten Jahren sind MSCs für die Zelltherapie besonders wichtig, da sie vielseitig einsetzbar sind. Sie werden praktisch nicht abgestoßen und können für verschiedene Patienten verwendet werden. Solche Transplantationen gehen mittlerweile in die Tausende pro Jahr, und ihre Wirksamkeit ist erwiesen. Unter anderem erscheinen jedes Jahr neue Ergebnisse aus klinischen Studien. Diese Studien belegen die Wirksamkeit von Stammzellen bei der Behandlung verschiedener Krankheiten.
Die technischen Ergebnisse des beanspruchten Verfahrens sind:
1. Gewinnung durch mechanische Extraktion von hämatopoetischen und mesenchymalen Stammzellen aus dem Knochenmark einer amputierten Gliedmaße in der Menge (im Vergleich zur Punktion), die für eine erfolgreiche Zeiltherapie eines Patienten mit einer unfreiwillig amputierten Gliedmaße ohne immunologischen Konflikt und die Notwendigkeit einer SC-Kultivierung ausreicht,
2. technische Einfachheit und Geschwindigkeit der Materialerfassung,
3. vollständigere Knochenmarkentnahme aus der amputierten Gliedmaße, 4. Vermeidung von unerwünschten Nebenwirkungen bei der Zelltherapie des
Patienten.
Nachstehend werden die Menge an prozentualem Gehalt an HSCs und MSCs im Knochenmark angegeben:
Tabelle 1

Claims

Patentansprüche
1. Verfahren zur Gewinnung von Stammzeiien, umfassend die Schritte: a. Bereitstelien eines Teils eines vom übrigen Körper abgetrennten Knochens eines Subjekts, wobei der Knochen eine offene Markhöhle aufweist; b. Entnahme des Knochenmarks aus der Markhöhle durch einen Vakuum- Absauger oder einen scharfen Löffel; c. Isolierung der Stammzeilen aus dem Knochenmark.
2. Verfahren gemäß Anspruch 1 , bei dem der Knochen ein röhrenförmiger Knochen ist, insbesondere Femur, Tibia oder Fibula.
3. Verfahren gemäß Anspruch 1, bei dem in Schritt b die Entnahme durch einen
Vakuum-Absauger erfolgt.
4. Verfahren gemäß Anspruch 4, bei dem in Schritt b die Entnahme durch eine an den Vakuum-Absauger angeschlossene Kanüle erfolgt.
5. Verfahren gemäß Anspruch 5, bei dem die Kanüle in den Markhöhle eingeführt, der Vakuum-Absauger so aktiviert wird, dass er ein Vakuum erzeugt, der Vakuum-Absauger an die Kanüle angeschlossen wird, und das Knochenmarkt durch den Vakuum-Absauger aus der Kanüle in einen Aufnahmebehälter transportiert wird.
6. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 5 oder 6, bei dem in Schritt b) die Kanüle innerhalb des Markhöhle gedreht wird.
7. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 4-7, bei dem im Laufe des Schrittes b) der Vakuumdruck graduell erhöht wird.
8. Verfahren gemäß Anspruch 1 , bei dem in Schritt b die Entnahme durch einen scharfen Löffel, insbesondere einem Löffel nach Volkmann oder eine gynäkologische Kürette erfolgt.
9. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem die Stammzellen mesenchymale Stammzellen oder/und hämatopoetische Stammzellen sind.
10. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2-10, bei dem der Knochen ein Femur ist.
11. Verfahren gemäß einem der Ansprüche 2-10, bei dem das Teil der Gliedmaße durch Amputation auf Höhe des unteren Drittels gewonnen wurde oder durch Amputation auf Höhe des mittleren oder oberen Drittels gewonnen wurde.
12. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Subjekt ein Mensch ist.
13. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Subjekt an Diabetes mellitus oder Atherosklerose erkrankt ist oder die Gliedmaße des Subjektes enthaltend den Knochen einem Trauma ausgesetzt war.
14. Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem das Subjekt an diabetischem Fußsyndrom erkrankt ist. 15, Verfahren gemäß einem der vorstehenden Ansprüche, bei dem Schritt b und c maximal 90 Minuten oder maximal 60 Minuten, und/oder Schritt c maximal 60 Minuten oder maximal 45 Minuten dauern. 16,Vakuum-Absauger Vorrichtung eingerichtet das Verfahren gemäß einem der Ansprüche 1-7 und 9-15 mit einem Vakuum-Absauger durchzuführen umfassend einen Vakuum-Absauger, eine Kanüle und einen Aufnahmebehälter.
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