EP4168532A1 - Biostimulant à base de bactéries pour une meilleure adaptation des plantes aux stress hydrique et osmotique - Google Patents

Biostimulant à base de bactéries pour une meilleure adaptation des plantes aux stress hydrique et osmotique

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Publication number
EP4168532A1
EP4168532A1 EP21740260.1A EP21740260A EP4168532A1 EP 4168532 A1 EP4168532 A1 EP 4168532A1 EP 21740260 A EP21740260 A EP 21740260A EP 4168532 A1 EP4168532 A1 EP 4168532A1
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EP
European Patent Office
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water
bacteria
plant
strains
soils
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Pending
Application number
EP21740260.1A
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German (de)
English (en)
Inventor
Mohamed Hafidi
Lamfeddal Kouisni
Ahmed NAFIS
Yedir Ouhdouch
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OCP SA
Original Assignee
OCP SA
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Filing date
Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N1/00—Microorganisms, e.g. protozoa; Compositions thereof; Processes of propagating, maintaining or preserving microorganisms or compositions thereof; Processes of preparing or isolating a composition containing a microorganism; Culture media therefor
    • C12N1/20—Bacteria; Culture media therefor
    • C12N1/205—Bacterial isolates
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01N—PRESERVATION OF BODIES OF HUMANS OR ANIMALS OR PLANTS OR PARTS THEREOF; BIOCIDES, e.g. AS DISINFECTANTS, AS PESTICIDES OR AS HERBICIDES; PEST REPELLANTS OR ATTRACTANTS; PLANT GROWTH REGULATORS
    • A01N63/00—Biocides, pest repellants or attractants, or plant growth regulators containing microorganisms, viruses, microbial fungi, animals or substances produced by, or obtained from, microorganisms, viruses, microbial fungi or animals, e.g. enzymes or fermentates
    • A01N63/20—Bacteria; Substances produced thereby or obtained therefrom
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
    • A01P—BIOCIDAL, PEST REPELLANT, PEST ATTRACTANT OR PLANT GROWTH REGULATORY ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR PREPARATIONS
    • A01P21/00—Plant growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12R—INDEXING SCHEME ASSOCIATED WITH SUBCLASSES C12C - C12Q, RELATING TO MICROORGANISMS
    • C12R2001/00—Microorganisms ; Processes using microorganisms
    • C12R2001/01—Bacteria or Actinomycetales ; using bacteria or Actinomycetales
    • C12R2001/465—Streptomyces
    • C12R2001/47—Streptomyces albus

Definitions

  • Bacteria-based biostimulant for better adaptation of plants to water and osmotic stress Bacteria-based biostimulant for better adaptation of plants to water and osmotic stress.
  • Figure 1 Diagram of the technique for evaluating the degree of hydrophobicity of a sandy soil (a) and determination of the volume of water retained (b)
  • FIG. 2 Elemental analysis of sand at low altitude a: BNT: untreated sand, b: BT: sand treated with butanone. (% CK in BNT is 29 against 14 in BT)
  • Figure 3a Macroscopic and microscopic aspects of isolates (NI, N3 & N4) degrading commercial waxes.
  • Figure 3b Phylogenetic tree of bacterial strains capable of degrading waxes (NI, N4 and N3) retained for this invention.
  • Figure 4 Examples of use of insoluble forms of K and P expressed by the extent of growth of strains (NI, N4 and N3) on screening media (Aleksandrov & NBRIP)
  • FIG. 5 Protocol followed for the evaluation of root colonization of alfalfa and Aradopsis seedlings by strains (NI, N4 and N 3).
  • Graph 1 PGP traits of NI, N4 and N4 strains: Germination index, TCP solubilization of Mica and auxin production
  • Potassium (K) is an essential element involved in water management at the plant level. Indeed, For plants, potassium (K) plays an important role in water and osmotic status: (i) by regulating the opening and closing of stomata, (ii) by the osmotic adjustment of the plant (turgor) , (iii) and by root growth. In addition to these 3 functions, the University of Halle has demonstrated a significant impact of potassium on the useful water reserve of the soil (Damm 2012).
  • This invention describes obtaining a plant biostimulant based on bacteria isolated from the root system of desert plants (rhizospheric soils).
  • the choice of this habitat is not trivial.
  • Our goal was to understand how the plants in this stressed habitat manage to resist and cope with the lack of water.
  • These bacteria which help desert plants are able to reduce water and osmotic stress thanks to their following essential properties:
  • BDC waxes
  • BDC + BSK bacterial inoculum based on the optimization of certain biological properties in these bacteria
  • BDC + BSK- Plant the role of the partnership (BDC + BSK- Plant) on the development of the host plant will be optimized by intimately combining the impact of these (BCD + BSK) on the plant directly (water, mineral, hormonal effect, etc. ) and indirectly (alteration of potassium and inorganic phosphate).
  • BCD + BSK Bacillus subtilis .
  • These bacteria are cultivated on liquid nutrient medium obtained from soybean flour juice after filtration (3g / L of water). After a period of culture depending on the physiological characteristics of (BCD + BSK), the propagules are recovered by filtration, washed with sterile water to remove all chemical traces from the nutrient medium used then ground in a Waring Blender and stored at room temperature and at 4 ° C.
  • Granules of potassium (Mica) (50 ⁇ m diameter) or commercial perlite are immersed in a sterile solution composed (i) of soybean flour juice (3 g / L), previously sterilized (ii) of propagules (1 g dry weight per liter of mixture).
  • mice and / or perlite granules impregnated with the bacteria are incubated at 28 ° C. for 2 days.
  • the perlite and Mica granules thus colonized by (BCD + BSK) forming propagules on the surface are then dried in air and placed in flasks to store them at room temperature and / or at 4 ° C.
  • Another advantage of this invention is the fact that the seeds or seeds can be inoculated directly with the propagules of (BCD + BSK) by the method of seed bacterization.
  • a new method of isolating bacteria, a new biotechnology and a new biostimulant isolating bacteria, a new biotechnology and a new biostimulant.
  • BDC Effect Optimization
  • Rhizospheric soils collected near the roots of desert plants have very low water repellency (with a time of less than 10 seconds).
  • bare sands far from the root system of plants show pronounced hydrophobicity with a time that is between 250-260 seconds.
  • Method 1 The rhizospheric or non-rhizospheric sand grains are washed with sterile distilled water and dried were seeded (deposited) directly in a minimum culture medium (MM) without any source of organic carbon.
  • the composition of MM consists of the following ingredients (for 1 liter): (KNO 3 2g, K 2 HPO 4 lg, MgS0 4 0.5 g, NaCl 0.5g, CaC0 3g, FeS0 4 0.01g and noble agar or agarose 14g
  • the only source of organic carbon is that which surrounds the grains of sand.
  • Method 2 From 200g of rhizospheric or non-rhizospheric rice, dried, treated with butanone to extract waxes and propagules from microorganisms. After evaporation of the butanone, the suspension of propagules was seeded on the MM + 5 g of commercial wax (for 1 liter MM + agar-agar not usable by bacteria). Three waxes were used.
  • the colonies developed were purified and tested for their ability to degrade a wide range of commercial waxes, namely, Carnauba wax, Candelilla wax and Mimosa wax.
  • the controls were used: MM + Agar-agar and wax + agar-agar
  • N3 isolate is identified as Voyl anyium bmchyspomm
  • N 4 isolate identified as Streptomyces mutabilis
  • NI is identified as Streptomyces acumycini.
  • PGP plant growth promotion
  • Aleksandrov and NBRIP media without any soluble source of K and P represent negative controls.
  • Aleksandrov and NBRIP media with soluble sources of K and P represent positive controls.
  • TCP source of P
  • Mica used for the solubilization of K and P in the same culture medium.
  • An example of the growth obtained is given in figure 4.
  • the solubilization performance of the insoluble forms of K and P of these isolates was measured via the analysis of the culture juices by ISP (Inductively Coupled Plasma).
  • ISP Inductively Coupled Plasma
  • the AIA assay was performed in the juice of cultures as well. Germination tests were carried out on Arabidopsis taliana seeds as a model plant. Before germinating the seeds, the latter were disinfected and bacterized by stem cells (NI, N4 and N 3) cultured for three days in Bennett's medium in order to produce sufficient biomass. Subsequently, the seeds of the model plant were cultivated under optimal growth conditions and the results are noted after 5 days.
  • the sandy soil used is characterized by the physicochemical parameters recorded in graph n ° 2.
  • the strains (NI, N4 and N3) are cultivated on liquid nutrient medium obtained from soybean flour juice after filtration (3 g / L of water). After 3 days, the propagules are recovered by filtration, washed with sterile water to remove all chemical traces from the nutrient medium used, then ground in a Waring Blender then dried. 100 g of the water-repellent sand of composition indicated in Table 2 are inoculated with 10 6 CFU (colony-forming unit) of each strain. The dried propagules were mixed well with the sand.
  • the N3 strain identified as Poyl angium bmchyspomm showed a biostimulating capacity of alfalfa seedlings with a yield of more than 50% compared to the commercial expansive vermiculite control product (Graph 5).
  • the results of alfalfa plants were found to be more interesting in terms of the biomass yield of the obtained plant material.
  • the biostimulatory effect of the N3 strain is the most important. In fact, this strain has made it possible to increase the yield in terms of plant biomass by more than 50% and it is the same strain that has made it possible to obtain the increase in water retention of about 10% of the soil. used.
  • the potassium contents of the different parts of the alfalfa seedlings were improved for the seedlings inoculated with the N3 strain.

Landscapes

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Abstract

Cette invention décrit l'obtention d'un biostimulant à base de 3 souches bactériennes pour booster la résistance des plantes aux stress hydrique et osmotique. Ces bactéries sont capables d'augmenter le potentiel hydrique des sols par le biais de dégradation des cires (BDC) qui enrobent les composantes des sols et réduisent la capacité de ces derniers à stocker suffisamment d'eau pluviale et/ou d'irrigation. En plus, ces bactéries aident les plantes à mieux maitriser l'économie de l'eau via une nutrition potassique optimale et permanente (BSK). Ces trois bactéries (BDC + BSK) sont codées N1, N4 et N3 et idenfiées(N1 = Streptomyces acrimycini N4= Streptomyces mutabilis et N3= Polyangium brachysporum. Cette invention décrit également une nouvelle formulation d'inoculum bactérien basée sur l'optimisation de certaines propriétés biologiques chez ces bactéries (N1, N4 et N3) à savoir leurs propriétés à augmenter la capacité de rétention d'eau par les sols et à solubiliser et à mobiliser les formes du potassium pour la plante à partir de formes inorganiques complexes qui ne sont pas accessibles à la plante sans son partenaire microbien(BCD et BSK). En incluant ensemble des propagules de ces bactéries et la perlite comme matrice, la capacité des (BDC et BSK) à augmenter la capacité éponge des sols à et à solubiliser les formes insolubles du potassium et les rendre accessibles à la plante seront accrues. De ce fait, le rôle du partenariat (BDC et BSK- Plante) sur le développement de la plante hôte sera optimisé en combinant intimement l'impact de ces bactéries sur la plante directement (maitrise de l'absorption, conduction et la transpiration) et indirectement (disponibilité de l'eau dans les sols de façon uniforme, par altération des composantes qui causent sa perte par le lessivage, évaporation).

Description

DESCRIPTION DETAILLEE DE L’INVENTION
Biostimulant à base de bactéries pour une meilleure adaptation des plantes aux stress hydrique et osmotique.
Figures et graphes listing
Figure 1: Schéma de la technique pour évaluer le degré d’hydrophobicité d’un sol sableux(a) et détermination du volume d’eau retenue (b)
Figure 2 : Analyse élémentaire du sable à basse altitude a : BNT : sable non traité, b : BT : sable traité par le butanone. (le % CK dans BNT est 29 contre 14 dans BT)
Figure 3a : Aspects macroscopiques et microscopiques des isolats (NI, N3 & N4) dégradant les cires commerciales.
Figure 3b : Arbre phylogénétiques des souches bactériennes capables de dégrader les cires (NI, N4 et N3) retenus pour cette invention. (NI, N4 et N3) sont caractérisées par les séquences Seq N3, Seq N4, & Seq NI (Planche 1) et déposées au service IDA des CCMM avec des accessions : Nl= CCMMP1, N4 = CCMMP2 etN3 = CCMM P3
Figure 4 : Exemples d’utilisation des formes insolubles du K et P exprimée par l’ampleur de croissance des souches (NI, N4 et N3) sur les milieux de criblages (Aleksandrov & NBRIP)
Figure 5 : Protocole suivi pour l’évaluation de la colonisation racinaire des plantules de luzerne et d ’Aradopsis par les souches (NI, N4 et N 3).
Figure 6. Le surnageant obtenu de la culture N3 mélangé à l’eau améliorer le mouillage et la pénétration d’un sol hydrofuge. (Légende : goutte eau et goutte eau + 50% de jus de culture de la souche N3,)
GRAPHES
Graphe 1 : Traits PGP des souches NI, N4 et N4 : Index de germination, la solubilisation du TCP du Mica et la production d’auxine
Graphe n° 2. Quelques les paramètres physico-chimiques du sol sableux utilisé
Graphe 3. Effet de l’inoculation d’un sol sableux par les souches (NI, N4 et N3) sur la capacité de rétention d’eau
Graphe 4 : Le design du protocole expérimental pour les tests agronomiques
Graphe 5. Effet biostimulant des différentes parties de plantules de luzernes par les souches (NI, N3 & N4) comparé au produit commercial (C)témoin vermiculite expansive et non inoculé (NI).
- Régime d’irrigation de 25% ; - Régime d’irrigation de 50% ; - Régime d’irrigation de 75% Le changement climatique est un sujet d’actualité depuis plusieurs années. De nombreuses études traitent le sujet et posent des constats et perspectives qui peuvent nous inquiéter sur le futur. L’agriculture se trouve face à un défi majeur dans plusieurs régions du monde (Ainsworth et Orth, 2010). Le changement climatique que nous subissons s’illustre notamment par des périodes de sécheresse de plus en plus fréquentes et plus longues. Les conséquences sur les rendements des cultures peuvent être dramatiques. Les stress hydrique et osmotique sont et seront toujours les stress abiotiques les plus importants au niveau global. Les terres cultivables souffrent d’un manque d’eau ce qui cause des stress hydriques fréquents. Ce phénomène est non seulement amplifié par le changement climatique mais aussi par la présence de la matière organique non mouillable sous forme de cires qui enrobent les composantes des sols et réduisent la capacité de ces derniers à stocker suffisamment d’eau pluviale et/ou d’irrigation. Le potassium(K) est un élément essentiel impliqué dans la gestion de l’eau au niveau des plantes. En effet, Pour les plantes, le potassium (K) joue un rôle important sur statut hydrique et osmotique : (i) en régulant l’ouverture et la fermeture des stomates, (ii) par l’ajustement osmotique de la plante (turgescence), (iii) et par la croissance racinaire. En plus de ces 3 fonctions, l’université de Halle a mis en évidence un impact significatif du potassium sur la réserve en eau utile du sol (Damm 2012).
Il existe des solutions aujourd’hui qui augmentent la capacité de rétention de l’eau par les sols. Cependant, ces solutions sont soit coûteuses, soit difficiles à appliquer. Par exemple, l’addition de l’argile dans le sol, nécessite 300t d’argile/hectare (Carter and Hetherington 2006).
La recherche d’autres voies supplémentaires moins chères, écologique et efficiente est devenue une exigence. La mise au point d’un nouveau produit biostimulant à base de microorganismes pour améliorer la mouillabilité des sols, booster la capacité de rétention d’eau par les sols et la bonne gestion de la transpiration pour renforcer l’économie de l’eau par les plantes est une nécessité urgente. Cette invention propose une alternative basée sur un concept innovant qui s ’ inspire de la nature.
Cette invention décrit l’obtention d’un biostimulant de plantes à base de bactéries isolées à partir du système racinaire des plantes désertiques (sols rhizosphériques). Le choix de cet habitat n’est pas anodin. Notre objectif était de comprendre comment les plantes de cet habitat stressé arrivent à résister et à gérer le manque d’eau. Ces bactéries qui aident les plantes désertiques sont capables de réduire le stress hydrique et osmotiques grâce à leurs propriétés essentielles suivantes :
Dégradation des cires (BDC) qui enrobent les particules des sols et réduisent la capacité de ces derniers à stocker suffisamment d’eau, atmosphérique ou rosée, pluviale et/ou d’irrigation.
Solubilisation et mobilisation des formes insolubles du potassium en formes assimilables par les plantes (B SK) pour maîtriser l’économie de l’eau.
Elle décrit également une nouvelle formulation d’inoculum bactérien basée sur l’optimisation de certaines propriétés biologiques chez ces bactéries (BDC +BSK) à savoir : leur capacité à dégrader les cires, à solubiliser et à mobiliser du potassium sous formes assimilables par la plante à partir de formes potassiques inorganiques complexes qui ne sont pas accessibles à la plante sans son partenaire microbien (BDC + B SK). En incluant ensemble des propagules de ces bactéries et une source de potassium minérale imbibée dans un jus de farine de soja, la capacité des (BDC+ BSK) à dégrader plusieurs cires et à solubiliser du potassium, du phosphore et à produire l’hormone de type auxine et les rendre accessibles aux plantes. De ce fait, le rôle du partenariat (BDC+ BSK- Plante) sur le développement de la plante hôte sera optimisé en combinant intimement l’impact de ces (BCD +BSK) sur la plante directement (effet hydrique, minéral, hormonal etc..) et indirectement (altération du potassium et du phosphate inorganique).
Ces bactéries (BCD+ BSK) sont cultivées sur milieu nutritif liquide obtenu à partir du jus de farine de soja après fdtration (3g /L d’eau). Après une durée de culture dépendant des caractéristiques physiologiques des (BCD+BSK), les propagules sont récupérées par filtration, lavées à l’eau stérile pour éliminer toutes traces chimiques issues du milieu nutritif utilisé puis broyés au Waring Blender et conservés à température ambiante et à 4°C. Des granules de potassium (Mica) (50 pm diamètre) ou de perlite commerciale sont immergées dans une solution stérile composée (i) du jus de farine de soja (3 g /L), préalablement stérilisée (ii) de propagules (1 g poids sec par litre de mélange). Après 2 heures d’immersion sous agitation, les granules du Mica et/ou perlite imprégnés par les bactéries (BCD+BSK), sont incubées à 28°C pendant 2 jours. Les granules de perlites et du Mica ainsi colonisées par (BCD+BSK) en formant des propagules à la surface sont ensuite séchées à l’air et mis des flacons pour les conserver à température ambiante et/ou à 4°C.
Un autre avantage de cette invention est le fait qu’on peut inoculer directement les semences ou graines par les propagules des (BCD+BSK) par le procédé de bactérisation de semences.
Pour la définition de l’invention, il s’agit d’ :
Un nouveau procédé d’isolement de bactéries, une nouvelle biotechnologie et d’un un nouveau biostimulant.
Pour le Problème(s) technique(s) que l’invention permettrait de résoudre ?
1) Optimisation de l’effet (BDC) pour augmenter le potentiel hydrique des sols en éliminant les cires qui empêchent l’absorption de l’eau par les particules des sols et booster la capacité de ces derniers à retenir plus d’eau. Parmi les avantages :
■ Réduire l’impact des changements climatiques sur les cultures
■ Augmenter la capacité des sols à retenir de l’eau
■ Optimiser l’utilisation de l’eau
■ Réduire l’évaporation de l’eau des sols sableux
■ Augmenter les surfaces des terres arables et améliorer les rendements agricoles
■ Améliorer les conditions d’adaptation des plantes aux stress hydriques
■ Homogénéiser la germination des semences dans les sols hydrofuges
■ Diminuer l’érosion des sols
2) Optimisation de l’effet (BSK) pour une meilleure gestion de l’économie de l’eau par la plante hôte grâce à une nutrition potassique optimale et permanente. Cette dernière permettra une bonne absorption, conduction et la maîtrise de la transpiration en conditions de stress hydriques et osmotique. La présence optimale et permanente du potassium permettra également d’avoir impact positif sur la réserve en eau utile du sol.
Pour mieux décrire l’invention cet exemple :
En première étape, l’obtention des (BDC + BSK) a- L’isolement des (BDC + BSK) à partir des échantillons de sables collectés à partir des sols rhizosphériques de certaines plantes désertiques adaptées aux stress hydrique et osmotique. Dans cette optique, les prélèvements ont été effectués dans la région de Merzouga et autres (Maroc). De même, des échantillons de plantes ont été récoltés à partir des sites étudiés. b- Etude des caractéristiques des sols sableux collectés :
L’étude de la capacité de rétention d’eau et l’hydrophobicité des sols sableux a été effectuée par deux techniques à savoirs, la technique «MED : Molarity Ethanol Drop» (figure la). Cette technique a pour principe, la concentration d'éthanol nécessaire pour pénétrer le sol en moins de 10 secondes(MED). La deuxième technique consiste en la mesure du volume retenu (figure lb).
> Détermination et appréciation de l’hydrophobicité du sable (norme standard : MED)
Temps mis par la goutte d'eau pour disparaître à la surface du sol non mouillant:
✓ <1 seconde Non significatif
✓ 1-10 secondes Très faible hydrofugation
✓ 10-50 secondes Faible hydrofugation
✓ 50-260 secondes Hydrofugation modérée
✓ >260 secondes Hydrofugation modérée à sévère Les sols rhizosphériques prélevés à côté des racines des plantes désertiques possèdent une très faible hydrophobicité (avec un temps inférieur à 10 secondes). Cependant, les sables nus loin du système racinaire des plantes montrent une hydrophobicité prononcée avec un temps qui se situe entre 250 -260 secondes.
Pour déterminer le volume d’eau retenu dans le sable, nous avons suivi le protocole suivant : 1- Installer un tissu (comme filtres) dans les deux entonnoirs.
2- Déposer chaque entonnoir sur une éprouvette différente graduée.
3- Prendre les deux échantillons du sable (50 grammes, 1 traité avec le butanone pour éliminer les cires qui entourent les grains du sable et l’autre non traité) et déposer chacun dans l’entonnoir.
4- Mettre 100 ml d’eau distillée dans un bêcher gradué.
5- Démarrer le chronomètre et verser doucement les 100 ml d’eau.
6- Avec l’éprouvette graduée, mesurer la quantité d’eau recueillie.
NB : Le traitement avec le butanone du sable hydrofuge a permis de solubiliser les minces couches de cires qui entourent les grains de sable ainsi d’augmenter la surface de contacte des grains de ce dernier avec l’eau.
Après la réalisation du test, nous avons constaté que :
- Le temps que prend l’eau pour traverser le sable traité (élimination des cires avec le butanone) est long par rapport au sable non traité.
- Le volume d’eau recueilli dans le sable traité est plus faible par rapport au sable non traité, donc le sable traité retient plus d’eau.
- La vitesse d'écoulement du sable non traité, vis-à-vis de l’eau, est importante par rapport à celle de l’échantillon traité. c- Détermination de la composition élémentaire du sable désertique exploré
La composition élémentaire du sable collecté et traité (BT) et non traité (BNT) par le butanone a été effectuée via l’analyse par le microscope électronique à balayage (figure 2a et 2b).
Les résultats montrent que les grains de sable contiennent une quantité non négligeable de matière organique sous forme de cire. Cela a été confirmé lors de l’élimination de cette peau mince de cire par le butanone. En effet, les pourcentages en carbone trouvés sont plus faibles par rapport au cas où le sable est non traité (figure 2). Pour le choix du butanone comme solvant pour éliminer la matière organique cirée du sable, le butanone est volatil et n’a pas d’effet antimicrobien prononcé. Ce choix nous a permis l’accès aux bactéries emprisonnées dans la cire et qui ne sont pas isolables par la technique standard de microbiologie du sol. d- Isolement et identification des bactéries capables de dégrader la cire : Afin d’isoler les bactéries ayant la capacité de dégrader la cire, deux méthodes ont été adoptées. Méthode 1: Les grains du sable rhizosphériques ou non rhizosphérique sont lavés à l’eau distillée stérile et séchés ont été ensemencés (déposés) directement dans un milieu de culture minimum (MM) sans aucune source de carbone organique. La composition de MM est constituée par les ingrédients suivants (pour 1 litre): (KNO3 2g, K2HPO4 lg, MgS04 0.5 g, NaCl 0.5g, CaC0 3g, FeS04 0.01g et agar-agar noble ou agarose 14g. Comme on peut le remarquer, la seule source de carbone organique est celle qui entoure les grains du sable.
Méthode 2 : A partir de 200g du sable rizhospérique ou non rhizosphérique, séché traité par le butanone pour extraire les cires et propagules des microorganismes. Après évaporation du butanone, la suspension de propagules a été ensemencée sur le MM + 5 g de cire commercial (pour 1 litre MM + agar-agar non utilisable par les bactéries). Trois cires ont été utilisées.
Les colonies développées ont été purifiées et testées pour leurs capacités à dégrader une large gamme de cires commerciales à savoirs, la cire de Carnauba, la cire de Candelilla et la cire de Mimosa. Les témoins ont été utilisés : MM + Agar-agar et cire + agar-agar
Au total, 13 isolats ont montré la capacité de dégrader une large gamme de cire et leurs diversités morphologiques et moléculaires ont été étudiées. La diversité morphologique a été étudiée via la détermination de la forme, le type de Gram, l’aspect macroscopique des colonies, aspects microscopiques des cellules, les pigments diffusibles produits. Dans le cas des actinobactéries, la couleur du mycélium aérien et de substrat (figure 3a) a été notée. La diversité moléculaire des isolats a été effectuée via l’isolement, la purification, l’amplification et le séquençage du gène qui code pour 1ARN 16S par la plateforme d’analyse «Macrogen-Corée du Sud». Les résultats ont montré que les isolats ne sont pas pathogènes et montrent une diversité taxonomique (figure 3b). Trois souches (NI, N4 et N3) ont été sélectionnées. De point taxinomique, l’isolat N3 est identifié comme Voyl anyium bmchyspomm, l’isolat N 4 identifié comme Streptomyces mutabilis et NI est identifié comme Streptomyces acûmycini. Dans la deuxième étape, étude des propriétés ou traits de promotion de la croissance des plantes (PGP) des souches (NI = CCMMP1, N4 = CCMMP2 et N3 = CCMMP 3) capables de dégrader les cires sélectionnées a) Etude qualitative de la solubilisation des formes insolubles du K, P
Pour étudier les traits PGP des bactéries (NI, N4 et N3) dégradant les cires sélectionnées, les tests de solubilisation de K et de P ont été effectués sur les milieux de cultures solides. La solubilisation de P a été réalisée dans le milieu NBRIP (National Botanical Research Institute of Phosphate) additionné du phosphate tricalcique(TCP) (Ca (P03)2 comme source inorganique de P. La solubilisation de K a été effectuée sur le milieu Aleksandrov avec le Mica comme seule source de K insoluble. Les résultats obtenus montrent la capacité de ces trois souches (NI, N4 et N3) à utiliser les formes insolubles du K et P. L’ampleur de l’utilisation des formes insolubles du K et P est évaluée par l’intensité de la croissance. Les milieux Aleksandrov et NBRIP sans aucune source soluble du K et P représentent les témoins négatifs. Les milieux Aleksandrov et NBRIP avec sources solubles du K et P représentent les témoins positifs. Le milieu Aleksandrov dont la source du P est le (TCP) et la source du K est le Mica a utilisé pour la solubilisation du K et P dans le même milieu de culture. Un exemple de croissance obtenue est consigné dans la figure 4. b) Etude quantitative de la solublisation du K, P, la production Acide Indolo Acétique(AIA) et l’effet sur la germination des graines d’Arabidopsis taliana comme plante modèle.
La performance de solubilisation des formes insolubles du K et P de ces isolats a été mesurée via l’analyse des jus de cultures par ISP (Inductively Coupled Plasma). Le dosage l’AIA a été effectué dans le jus de cultures également. Les tests de germination ont été effectués sur les graines d’Arabidopsis taliana comme plante modèle. Avant de faire germer les graines, ces dernières ont été désinfectées et bactérisées par les cellules des souches (NI, N4 et N 3) cultivées pendant trois jours dans le milieu Bennett afin de produire une biomasse suffisante. Par la suite, les graines de la plante modèle ont été cultivées dans les conditions optimales de croissance et les résultats sont notés après 5 jours. Les résultats de ces traits favorisant la croissance des plantes des souches (NI, N4 et N 3) sont consignés dans le graphe 1 c) Etude de la colonisation des racines des plantes d’Aradopsis taliania et la luzerne par les cellules des souches (NI, N4 et N 3).
Cette étude de la colonisation des racines des plantes par les cellules des souches (NI, N4 et N 3) a été réalisée selon le schéma de la figure 5. Les résultats obtenus ont montré que les trois souches ont bien colonisé les racines des plantules testées. Aucun effet négatif sur la santé des plantules n’est pas observé durant la durée du test.
En troisième étape, Etude de la performance des souches (NI, N4 et N 3) à augmenter la capacité de rétention d’eau par un sol sableux.
Le sol sableux utilisé est caractérisé par les paramètres physico-chimiques consignés dans le graphe n° 2.
Les souches (NI, N4 et N3) sont cultivées sur milieu nutritif liquide obtenu à partir du jus de farine de soja après fdtration (3g/L d’eau). Après 3 jours, les propagules sont récupérées par filtration, lavées à l’eau stérile pour éliminer toutes traces chimiques issues du milieu nutritif utilisé puis broyés au Waring Blender puis séchées. 100 g du sable hydrofuge de composition indiquée dans le tableau 2 sont ensemencés par 106UFC (unité formant colonie) de chaque souche. Les propagules séchées ont été bien mélangées avec le sable.
Après incubation pendant 3 semaines, nous avons pu confirmer la capacité des souches (NI, N4 et N3) à améliorer l’effet éponge des particules du sol sableux testé. Le sable inoculé par souche N3 ( Polyangium brachysporum ) CCMMP3 a montré la capacité de rétention d’eau avec une augmentation de 10% (graphe 3).
Dans l’avant dernière étape de cette invention, essais agronomique en conditions contrôlées sous serre après inoculation de la luzerne par les souches (NI, N3 et N4)
Pour valider les capacités d’amélioration de rétention d’eau par le sol sableux inoculé et son effet sur la promotion de la croissance, nous avons effectué des essais agronomiques sous serre sur une plante modèle « la luzerne ». Trois souches (NI, N4 et N3) ont été choisies afin d’étudier leurs effets sur la promotion de la croissance de la plante modèle choisie ( Medicago sativa) soumise aux régimes d’irrigation croissants et sous des conditions de température et d’humidité contrôlées. La souche N3 est identifiée comme Poyl angium bmchyspomm, Isolat N 4 identifié comme Streptomyces mutabilis et NI est identifié comme Streptomyces acrimycini. Des pots de 200 grammes de sol hydrofuge de composition indiquée dans le graphe 2 ont été utilisés. Pour l’inoculation, quatre graines de luzerne bactérisées par chaque souche par pot. Les 4 plantules de luzernes bactérisées et germées sur boites de Pétri puis exposer à un régime hydriques de 25, 50 et 75% par rapport à la capacité au champ du sol hydrofuge utilisé. Deux types de sols ont été utilisés, un avec 0.4 g de K insoluble (Mica) et l’autre normal sans aucune source de K. Un sol mélangé par de la vermiculite expansive à 25% a été utilisé comme témoin commercial. La culture a été effectuée pendant 1 mois et selon le protocole consigné dans le graphe 4.
Les résultats obtenus sont très intéressants. En effet, la souche N3 identifiée comme Poyl angium bmchyspomm a montré une capacité biostimulante des plantules de luzerne avec un rendement de plus de 50% par rapport au produit commercial témoin vermiculite expansive (Graphe 5).
Après la récolté, les résultats des plantes de luzerne sont avérés plus intéressants en termes du rendement en biomasse de la matière végétale obtenue. L’effet de biostimulation de la souche N3 ( Polyangium brachysporum) est le plus important. En effet, cette souche a permis d’augmenter le rendement en termes de biomasse végétale de plus de 50% et c’est la même souche qui a permis l’obtention l’augmentation de la rétention en eau d’environ 10% du sol utilisé. Pour les teneurs en K des différentes parties de plantules de luzernes, comparées aux témoins non inoculés, les teneurs en Potassium des différentes parties des plantules de luzernes ont été améliorées pour les plantules inoculées par la souche N3.
Dans la dernière étape de cette invention, il a été démontré que le processus de la dégradation de cires par des souches NI, N4 et N3 est lié à l’excrétion d’une ou plusieurs molécules de type bio-surfactant. Le processus de dissolution du Mica implique vraisemblablement la destruction des liaisons ioniques fortes existant entre les éléments constitutifs de cette roche potassique. La souche N3 apparentée à Polyangium brachysporum) a montré la meilleure capacité à dégrader les cires. Le bio-surfactant existant dans le jus de fermentation de cette souche a réduit la tension superficiel d’un sol hydrofuge (figure 6 )
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NI Sequence (ADNr 16S)
ACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACCTTCGGGTG
GGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGGACA
AGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGACCCGCTTGGGCATCCAAGCGGTTCG
AAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGG
CTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTG
AGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAA
AGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCA
GCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCC
AGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAG
CTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGTCTGCA
GTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGT
GAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCGATAC
TGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCAC
GCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCAACATTCCACGTTGTCCGTGCCGCAGCTA
ACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTG
ACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACC
TTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAAACCCTGGAGACAGGGTCCCCCTTGTGGTCGGT
GTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCG
CAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAGGCCCTTGTGGTGCTGGGGACTCAC
GGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCC
CCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGC
GAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGAC
CCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCC
CGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGG
CCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGACGAAGT
>N3 Sequence (ADNr 16S)
GCTCAGATTGAACGCTGGCGGCATGCCTTACACATGCAAGTCGAACGGCAGCACGGGA
GCAATCCTGGTGGCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAATACATCGGAACGTGCCCAGTAGT
GGGGGATAGCCCGGCGAAAGCCGGATTAATACCGCATACGACCTGAGGGTGAAAGCG
GGGGACCGCAAGGCCTCGCGCTATTGGAGCGGCCGATGTCAGATTAGCTAGTTGGTGG
GGTAAAGGCCTACCAAGGCGACGATCTGTAGCTGGTCTGAGAGGACGACCAGCCACAC
TGGGCGCAAGCCTGATCCAGCCATGCCGCGTGCGGGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAA
AAGAATAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGCAAGC
GTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGTGCGCAGGCGGTTGTGCAAGACAGATGTGA
AATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATTTGTGACTGCACGGCTAGAGTGCGGCAGA
GGGAGATGGAATTCCGCGTGTAGCAGTGAAATGCGTAGATATGCGGAGGAACACCGAT
GGCGAAGGCAATCTCCTGGGCCTGCACTGACGCTCATGCACGAAAGCGTGGGGAGCAA
ACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCCTAAACGATGTCAACTAGTTGTTGGACGG
CTTGCTGTTCAGTAACGTAGCTAACGCGTGAAGTTGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGC
AAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGACCCGCACAAGCGGTGGATGATGTGGTTT
AATTCGATGCAACGCGAAAAACCTTACCTACCCTTGACATGCCAGGAATCCTGCAGAGAT GTGGGAGTGCTCGAAAGAGAACCTGGACACAGGTGCTGCATGGCCGTCGTCAGCTCGT
GTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCATTAGTTGCTACG
AAAGGGCACTCTAATGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTC
AGGTCATCATGGCCCTTATGGGTAGGGCTACACACGTCATACAATGGCCGGTACAGAG
GGCTGCCAACCCGCGAGGGGGAGCTAATCCCAGAAAACCGGTCGTAGTCCGGATCGCA
GTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGTCGCG
GTGAATACGTTCCCGGGTCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGGGAGCGGGTTCTGC
CAGAAGTGGGTAGCCTAACCGCAAGGAGGGCGCTTACCACGGCAGGGTTCGTGACTGG
GGTGAAGTCGT
>N4 Sequence(ADNr 16S)
CTCAGGACGAACGCTGTCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAACCACTTCG
GTGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTGCACTCTGGG
ACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACTGAGGTCCGCAGGCATCTGTGGTTC
TCGAAAGCTCCGGCGGTGCAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAA
CGGCTCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGG
ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGG
CGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTC
TTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTAC
GTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTA
AAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCGCGTCGGTTGTGAAAGCCCGGGGCTTAACCCCGGGT
CTGCAGTCGATACGGGCAGGCTAGAGTTCGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAG
CGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCC
GATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTA
GTCCACGCCGTAAACGGTGGGCACTAGGTGTGGGCGACATTCCACGTCGTCCGTGCCG
CAGCTAACGCATTAAGTGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAG
GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGA
AGAACCTTACCAAGGCTTGACATACACCGGAAACGTCTGGAGACAGGCGCCCCCTTGTG
GTCGGTGTACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAA
GTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCCGTGTTGCCAGCAAGCCCTTCGGGGTGTTGGG
GACTCACGGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCA
TCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCG
ATACCGCGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCA
ACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAAT
ACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAG
CCGGTGGCCCAACCCCTTGTGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATTGGGA
CGAAGTC

Claims

REVENDICATIONS
1. Méthode d’isolement de Souches de bactéries déposées au CCMM sous N° CCMM PI, CCMM P2 et CCMMP 3 caractérisées par les séquences Seq NI, SeqN4, & SeqN3
2. Utilisation des souches selon de la revendication 1 ou des souches mutantes, pour inoculer les particules de perlite ou les roches potassiques ou graines et l’obtention des biostimulants.
3. Utilisation des souches de la revendication 1 ou des particules de la roche potassique, particule de perlite ou graines inoculées obtenues selon la revendication 2, pour la dégradation des cires et la solubiliser du potassium pour booster la résistance des plantes au stress hydrique et osmotique.
4. Utilisation des souches de la revendication 1 ou des souches mutantes, pour l’obtention de composés actifs par fermentation dans un milieu liquide des lesdites souches après centrifugation, filtration et purification.
5. Utilisation des souches de la revendication 1 ou des souches mutantes, ou d’un filtrat des cultures obtenues selon la revendication 4 ou d’un composé actif obtenu selon la revendication 4.
6. Utilisation des souches de la revendication 1, ou d’un filtrat des cultures ou composés actifs obtenus selon la revendication 4 ou d’un composé actif obtenu selon la revendication 5
7. Utilisation des souches de la revendication 1 ou des souches mutantes, ou d’un filtrat des cultures obtenues selon la revendication 4 ou d’un composé actif obtenu selon la revendication 6, pour stimuler la croissance des plantes.
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