EP4153718A1 - Zellkulturvorrichtung - Google Patents

Zellkulturvorrichtung

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Publication number
EP4153718A1
EP4153718A1 EP21710314.2A EP21710314A EP4153718A1 EP 4153718 A1 EP4153718 A1 EP 4153718A1 EP 21710314 A EP21710314 A EP 21710314A EP 4153718 A1 EP4153718 A1 EP 4153718A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
microwells
compartment
cell culture
culture device
cell
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP21710314.2A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Patrick Kugelmeier
Martin Meier
Guillaume Jung
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Kugelmeiers Ag
Original Assignee
Kugelmeiers Ag
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Kugelmeiers Ag filed Critical Kugelmeiers Ag
Publication of EP4153718A1 publication Critical patent/EP4153718A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/14—Bags
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/12—Well or multiwell plates

Definitions

  • the present invention relates to devices for the in vitro aggregation of cells.
  • the devices are distinguished by the fact that they contain specially shaped cavities which enable the aggregation of individual cells to form cell spheroids when a cell suspension is seeded onto the device.
  • the present invention also relates to a method for the aggregation of cells and the use of the devices according to the invention for the aggregation of cells.
  • Stem cell research deals with the principles of tissue regeneration processes in order to develop methods for regenerative medicine.
  • a very important factor in stem cell biology is the constant communication between the stem cells themselves and the interaction between the stem cells and the surrounding tissue, the so-called stem cell niche. Together, these cells form organizational units, called cell clusters, cell spheroids or organoids, which in large numbers and with a sophisticated architecture ultimately form a whole organ.
  • stem cells are simulated by adding a certain amount of stem and other cells to a drop, which then develop into cell clusters that can be analyzed.
  • the disadvantages of this widespread technology are that only a limited number of cell clusters can be generated in this way and that only a limited change of medium can be carried out. This would be important, however, since the differentiation of stem cells depends on the presence of certain cytokines at a certain point in time, which could be added when the medium is changed.
  • a transplant would be sufficient for a diabetic to be functionally cured and no longer need to inject insulin.
  • islets would have to be dissociated into individual cells and re-aggregated into small "pseudoislets”. Approximately 1,000,000 pseudoislets would be required for transplantation, a number that cannot be achieved with the hanging drop technique.
  • the device described is of limited use for stem cell cluster production, since the microwells have a purely inverted pyramid shape or the shape of a pyramid with a flat bottom. In any case, however, the side edges of the pyramid are not rounded. The cultivated cells are therefore forced into a pointed pyramid shape or into the corresponding side edges instead of a round spheroid / cluster shape. This contradicts the basic physical principles of "free energy minimization" to which all cell processes are subject. In addition, in this form of microwells, the cells are not supported in forming a round cell spheroid, but instead forced into an unnatural conformation.
  • such a device prevents the natural communication mechanisms of cells, since in the cell clusters formed in this way, due to their irregular shape, there are different concentrations of oxygen and signal molecules for the individual cells.
  • This device is therefore unsuitable for cell therapies, since the shape of the microwells can cause a disruption of the signal pathways, which can lead to incorrect programming and, in later applications with stem cells, ultimately to tumor formation.
  • a solution must be found in this device Reduction of cell attachment can be used. This solution is not clinically approved, so that for this reason too the device is not suitable for clinical use.
  • WO 2010/142755 A2 proposes the use of inserts that are placed on the protruding edge.
  • the object to be solved objectively is therefore to provide a cell culture device which is constructed in such a way that all introduced cells are cultivated under defined conditions and growth of individual cells outside the microwells is prevented.
  • a cell culture device for cultivating cell spheroids comprising at least one compartment with n compartment walls and a volume V ′′, which define a compartment floor area, and a multiplicity of microwells with p upper edges and a volume VM, the microwells being arranged in the compartment bottom surface in such a way that the compartment bottom surface outside the microwells only has sloping surfaces, the number of microwells is selected so that the entire compartment bottom surface is covered with microwells, all microwells have the same volume V M and the microwells have the shape of a pyramid or a cone with a rounded tip for receiving the cells and furthermore rounded edges between the tip and the base of the pyramid or the cone.
  • the object is also achieved by a method for producing cell spheroids, the cell spheroids being cultivated in a cell culture device according to the invention.
  • FIG. 1 shows two side views, two sectional views and a top view of a cell culture device according to the invention.
  • FIG. 2 shows an isometric view, a top view and a sectional view and two detailed views of the arrangement of the microwells in one embodiment of the device according to the invention Base G and d the diameter of the rounded tip.
  • Fig. 3 shows a sectional view of part of a device according to the invention.
  • G denotes the base area of a microwave, ß the angle between the compartment wall and the compartment floor area.
  • G denotes the base area of the microwave
  • S the side area of the microwave
  • c the upper edges of the base area G
  • f the side area edges
  • d the diameter of the rounded tip
  • d fi the diameter of the rounded edge of the side surface edge near the base area G
  • 5 shows a plan view, an isometric view and a side view of microwells of a device according to the invention with p equal to 3, 4, 6 or infinitely large.
  • FIG. 6 shows a top view of an arrangement of microwells according to the present invention and a top view, sectional view and isometric view of a microwell, where p is 3 and n is 6.
  • FIG. 7 shows a top view of an arrangement of microwells according to the present invention and a top view, sectional view and isometric view of a microwell, where p equals 4.
  • FIG. 8 shows a top view and isometric view of an arrangement of microwells according to the present invention and a top view, sectional view and isometric view of a microwell, where p equals 4.
  • FIG. 9 shows a top view of an array of microwells in accordance with the present invention and a top, sectional and isometric view of a microwell, where p is equal to 6 and n is approaching infinity.
  • FIG. 10 shows top and isometric views of an array of microwells in accordance with the present invention and top, sectional and isometric views of a microwell, where p approaches infinity.
  • the invention relates to a cell culture device comprising at least one compartment with n compartment walls which define a compartment bottom surface, and a plurality of microwells with p top edges and a volume VM, the microwells being arranged in the compartment bottom surface in such a way that the compartment bottom surface outside the microwells only has sloping surfaces has, the number of microwells is selected so that the entire compartment floor area is covered with microwells, and all microwells have the same volume V M.
  • a cell culture device is suitable for the cultivation of eukaryotic cells, in particular stem cells, and differs from assay plates, inter alia, in the material used, which Surface quality, attachment properties, sterility, gas permeability, light permeability, and the refractive index.
  • the cell culture device consists of a material that prevents cell adhesion.
  • materials include, for example, specifically suitable plastics (e.g., polystyrene, polycarbonate), and glass, with or without coatings to reduce cell adhesion.
  • the cell culture device consists of cycloolefin copolymers.
  • the cell culture device according to the invention comprises at least one compartment with n compartment walls.
  • the cell culture device according to the invention is thus delimited on all sides by a compartment wall, so that a liquid, e.g. cell culture medium, can be held within the compartment.
  • the compartment walls can all have the same or different heights.
  • the typical height of a compartment wall is from 1 to 100 mm, preferably 10 to 30 mm. In any case, the compartment walls are smooth, i.e. they have no protrusions.
  • compartment walls define a compartment floor area. This extends over the entire area delimited by the compartment walls and is delimited by the compartment walls.
  • the compartments of the cell culture device according to the invention are open at the top, i.e. the side opposite the compartment bottom surface is not closed, so that the compartments are directly accessible.
  • the compartment volume V « is located above the compartment floor area.
  • n can be any natural number. In a preferred embodiment, n is so large that the opening of the compartment is approximately circular. In a further preferred embodiment, n is 3, 4, or 6, particularly preferably 4. Such a geometry facilitates production.
  • two opposing compartment walls are each of the same length, so that the compartment has a symmetrical opening.
  • all compartment walls are the same long, so that the compartment has an opening in the shape of an equilateral triangle, hexagon or, particularly preferably, a square.
  • the compartment walls are essentially perpendicular to the compartment bottom surface outside the microwells. Any wall angle ⁇ from 90 ° to 110 ° to the compartment floor surface is referred to herein as essentially perpendicular.
  • the cell culture device comprises at least one compartment, but can also comprise several, e.g. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 48, 96, 384, 1536, 3456 or 9600 compartments.
  • the cell culture device preferably comprises 4, 6, 12, 24, 96, 384 or 1536 compartments. In a particularly preferred embodiment, the cell culture device comprises 6 compartments.
  • the cell culture device furthermore comprises a multiplicity of microwells with p upper edges c.
  • Microwells are defined as depressions in the compartment floor area in which cells can settle, approach one another and grow as cell clusters. Microwells can also be referred to herein as picowells, nanowells, microcavities and depressions.
  • the microwells of the cell culture device according to the invention have a square base.
  • the base G is an opening through which the cells can slide into the interior of the microwells.
  • the opening has p upper edges c, which border the opening p can be any natural number.
  • p is so large that the base area G is approximately a circle.
  • p is 3, 4 or 6, particularly preferably 4.
  • p is equal to n. In a preferred embodiment, p is equal to n is equal to 4. This ensures optimal use of the available floor space. In a further embodiment, n is 6 and p is 3. In a further embodiment, n is so large that the opening of the compartment is approximately circular, and p is 4 or 6. In yet another embodiment, n and p approach infinity.
  • the microwells have a pyramid or conical shape, the tip of the pyramid being located within the compartment floor area and the base area of the pyramid or cone forming the opening of the microwells. In other words, extends the volume V of the microwells from the surface of the compartment floor area into the compartment floor area.
  • the tip of the pyramid or the cone is therefore also referred to as the bottom B of a microwell.
  • the triangular side edges f which delimit the side surfaces S, are located between the tip and the base G of a microwave, more precisely between the corners of the opening and the base B.
  • the tips are used to receive the cells. Rounding them off promotes the formation of regular spheroids.
  • all the tips of the microwells in a compartment are equidistant from one another. This is important to maintain communication between the spheroids.
  • the cells communicate using messenger substances. The information transmitted depends on the concentration of the messenger substances. These principles of morphogen gradients and lateral inhibition make it necessary that the distances between the cell spheroids are the same so that the cell spheroids develop at the same rate. Safe use in cell therapy is only possible if all cell spheroids are at the same stage of development during transplantation.
  • the microwells are in the shape of a pyramid.
  • the tip of the pyramid is rounded with a diameter d B.
  • the microwells have the shape of a cone.
  • the tip of the cone is rounded with a diameter d ß.
  • the tip of the cone or the pyramid has a diameter d ß between 2 pm and 500 pm, preferably 5 pm to 400 pm and particularly preferably 70 pm to 200 pm.
  • the diameter d ß 90 ⁇ m.
  • the diameter d B 180 pm or 270 pm.
  • the tip of the pyramid or the cone of the microwell has a radius r B between 1 and 250 pm, preferably 2.5 pm to 200 pm and particularly preferably 35 pm to 100 pm.
  • the radius r B is 45 ⁇ m.
  • the radius r B is 90 pm or 135 pm.
  • the microwells have a depth h. The depth is between 10 pm and 2000 pm, preferably 50 pm to 1000 pm, more preferably 100 pm to 500 pm and most preferably 200 pm to 400 pm. In a further preferred embodiment, the depth is 600 ⁇ m to 700 ⁇ m, particularly preferably 641 ⁇ m.
  • the upper edges c have a length between 0 ⁇ m to 5 mm, preferably 200 ⁇ m to 2 mm, and most preferably 400 ⁇ m to 1200 ⁇ m. In a preferred embodiment, all of the upper edges are of the same length.
  • the triangular side edges f ie the edges between the side surfaces of the pyramid, are rounded.
  • the rounding of the triangular side edges f increases progressively from the opening to the pyramid top or bottom of the microwell, where s, ie the diameter d fi of the rounding near the opening of the microwell differs from the diameter de near the top of the Pyramid or the bottom of the microwave.
  • d fi is smaller than d f 2.
  • d fi is 0 and d f 2 is d ß .
  • the side surfaces S form a wall angle a with the base surface G or the imaginary surface in the opening of the microwells or with the compartment bottom surface.
  • a is between 35 ° to 75 °, preferably 40 ° to 70 °, more preferably 50 ° to 60 ° and most preferably 54.7 °. This angle ensures that all cells slide down to the bottom or into the tip B and that optimal conditions exist to support the cells in forming a natural cell spheroid, but at the same time not to constrict or force them into an unnatural conformation.
  • the depth of the microwells and the length of the upper edges depend on the radius or diameter d ß and the angle ⁇ .
  • p is 4 and the diameter d ß is 90 ⁇ m
  • the length of the upper edges is c 500 ⁇ m
  • the depth h is 320 ⁇ m.
  • the diameter d ß 180 pm
  • the length of the upper edges c 1000 pm
  • the depth h 641 pm the diameter of the upper edges
  • Each compartment of the cell culture device according to the invention has a large number of microwells.
  • a large number is defined here as a natural number between 1 and 1,000,000.
  • a compartment therefore comprises between one and 1,000,000 microwells. ok
  • a compartment comprises more than one microwell. In a further preferred embodiment, a compartment comprises exactly one microwell.
  • the compartment floor area of a compartment is completely covered with microwells.
  • the microwells are arranged in such a way that there is as little space as possible between them.
  • the microwells are arranged in regular columns and rows. In the context of the invention, there is little space between two microwells if the surface of the edge between the two microwells has a width of less than 15 ⁇ m.
  • each microwell has at least one upper edge in common with each neighboring microwell.
  • a common upper edge is to be understood here as meaning that the openings of the microwells lie seamlessly next to one another.
  • a microwell x which is located between four further microwells Xi, X2, X3, X4, has with each of the four adjacent microwells between x and Xi, x2, X3 and X4 together, ie with Xi the upper edge Ci, with X2 the upper edge c 2 , with x 3 the upper edge c 3 and with x the upper edge c.
  • a microwell y which is located in a row or column adjoining a compartment wall, has a common upper edge with the three neighboring microwells.
  • a microwell z which is located in a corner of the compartment floor area, has a common upper edge with the two neighboring microwells. The same applies to values of n and p not equal to 4.
  • the common upper edge prevents cells from remaining between the microwells, where they could develop in an uncontrolled manner.
  • all cells are directed into the interior of a microwell, so that each cell can develop correctly in the desired environment.
  • the upper edges of the microwells y and z which are not shared with the neighboring microwells, are flush with the compartment walls.
  • Flush is defined here as form-fitting, so that there is no flat edge at the transition between the upper edge and the compartment wall on which individual cells can settle.
  • an upper edge is flush with a compartment wall when the resulting edge has a maximum width of 15 ⁇ m. In one embodiment, this edge is not horizontal, that is to say parallel to the compartment bottom surface, but rather beveled.
  • each microwell has at least one edge in common with each neighboring microwell, and the top edges of the outer microwells are flush with the compartment walls, the compartment floor area outside the microwells only has sloping surfaces on which no cells can settle. Thus, in the device according to the invention, no cells can grow outside the microwells in an uncontrolled manner.
  • all microwells have the same volume V.
  • the corresponding upper edges of all microwells are each of the same length.
  • the cell culture device according to the invention does not have any cut-off microwells. This ensures that the same growth conditions prevail in all microwells.
  • all of the microwells in a compartment are in fluid connection with one another. As a result, the same growth conditions prevail in all microwells.
  • the invention further relates to the use of the cell culture device described for the cultivation of cells. Due to the special geometry of the microwells, when using suitable starting cells and cultivation conditions, cell clusters can arise from the cultivated cells.
  • Cell spheroids, cell clusters, organoids or 3D cell colonies are regularly or irregularly shaped aggregates of cells that extend in all spatial directions.
  • Spherical cell clusters are also known as cell spheroids.
  • the terms cell cluster, cell accumulation and cell aggregate are used synonymously herein.
  • the cell culture devices according to the invention are therefore particularly suitable for 3D cell culture with the aim of obtaining cell spheroids.
  • the cultivation method according to the invention does not require any further devices, reactors or special skills on the part of the experimenter in order to reliably obtain cell spheroids.
  • the cells can like are applied on a conventional cell culture plate and automatically form cell spheroids as a result of the special geometry of the microwells, which are characterized by a high degree of homogeneity in size and functionality.
  • Another advantage of using the cell culture device according to the invention is that all cells applied to the cell culture device inevitably grow in cell clusters, since no individual cells remain outside the microwells and can grow there in an uncontrolled manner. This is of enormous importance especially in therapeutic applications in which the (stem) cell clusters obtained are to be transplanted into a patient. This is equally beneficial in research to ensure that only cells with the same properties are present.
  • Cell culture device are cultured. However, the cultivation of eukaryotic cells is particularly preferred. All animal cells can be cultivated with the cell culture device according to the invention, in particular mammalian cells, particularly preferably human cells.
  • the cell culture device is used to cultivate stem cells.
  • Cell culture devices can be obtained from stem cells, stem cell spheroids which are suitable for use in regenerative medicine.
  • stem cell spheroids have already been used successfully experimentally for the regeneration of various organs and tissues, including the heart, lungs, liver, salivary glands, bone tissue, skin, thymus and nerve cells (Ong CS, Zhou X, Han J, et al. In vivo therapeutic applications of cell spheroids. Biotechnology Advances. 2018 Mar-Apr; 36 (2): 494-505.).
  • the transplantation of such stem cell spheroids however, carries the risk of tumor formation if the cell spheroids are programmed incorrectly.
  • the geometry of the microwells and the arrangement in the device according to the invention can prevent incorrect programming of the stem cells, see above that the stem cell spheroids obtained in this way are safe for therapeutic use.
  • the cell culture device is used to cultivate islet cells.
  • islet cells is familiar to the person skilled in the art and refers to a group of insulin-producing cells from the human pancreas. With the transplantation of these cells, diabetes can be functionally cured. Islet cell spheroids known from the prior art are usually too large, which is why they largely die off during transplantation due to a lack of oxygen.
  • the size of the spheroids can be standardized and their survival rate can be improved, since oxygen can diffuse into the center if the size is optimal.
  • the cell culture device is used to cultivate tumor cells.
  • tumor cells are degenerate stem cells (so-called “cancer stem cells”).
  • the cell culture device according to the invention can therefore also be used to obtain tumor cell spheroids.
  • tumor cells isolated from patients can be grown as spheroids that show exactly the same properties as the patient's tumor. This means that therapies can be tested outside the body (ex vivo), e.g. which chemotherapy should be used in the patient.
  • These tumor cell spheroids also offer great potential for drug development and can thus reduce the number of animal experiments required.
  • the invention further relates to cell spheroids which can be obtained using the cell culture device described. These cell spheroids can be used for medical applications such as medicine.
  • the invention accordingly also relates to methods for treating the human body in which cell spheroids are administered which are cultured by means of the devices according to the invention.
  • the range of applications is enormous and includes practically all organ systems, e.g. the treatment of heart attacks, cardiac insufficiency, liver failure, strokes, wound healing, pulmonary fibrosis or vascular diseases.
  • the cell culture device has six compartments with n equal to four.
  • the microwells p are equal to 4.
  • the microwells are arranged in such a way that each microwell has a common upper edge with each adjacent microwell (cf. FIG. 3A).
  • the microwells have the same volume V and a rounded tip with a diameter d B or radius r B.
  • G denotes the imaginary base of the pyramid, c the upper edges that delimit the base.
  • the side surfaces of the microwells form an angle ⁇ with the base.
  • FIG 3 shows a sectional view of a device according to the invention at the transition between the compartment bottom surface and the compartment side wall.
  • the angle ⁇ which is approximately 90 ° C., is present between the compartment bottom surface and the compartment side wall. There is no edge between the compartment side wall and the adjacent microwell.
  • FIG. 4 shows an embodiment of a single microwell in which the microwell has the shape of a pyramid (FIG. 4A) or a cone (FIG. 4B) with a rounded tip.
  • the edges f between the side surfaces S are rounded, the diameter of the rounding d fi near the opening or base area G being smaller than the diameter de near the tip of the pyramid. It can be seen that de corresponds approximately to d B.
  • p is equal to 3 and the microwell has the shape of a three-sided pyramid with a rounded tip.
  • p is equal to 4 and the microwell has the shape of a four-sided pyramid with a rounded tip.
  • p is equal to 6 and the microwell has the shape of a six-sided pyramid with a rounded tip.
  • p is so large that the base area G of the microwell is approximately circular and the microwell has the shape of a cone with a rounded tip. As can be seen from FIG.
  • the triangular side edges f are rounded, the diameter of the rounding d fi near the opening or base G being smaller than the diameter de near the pyramid or cone apex.
  • the microwells have the shape of a three-sided pyramid with a rounded tip and rounded edges between the side surfaces (cf. FIG. 6A).
  • the microwells have the shape of a four-sided pyramid with a rounded tip and rounded edges between the side surfaces (cf. FIG. 7A).
  • the microwells have the shape of a four-sided pyramid with a rounded tip and rounded edges between the side surfaces (cf. FIG. 8A).
  • the microwells have the shape of a six-sided pyramid with a rounded tip and rounded edges between the side surfaces (cf. FIG. 9A).
  • the microwells have the shape of a cone with a rounded tip (cf. FIG. 10A).
  • the microwells have a common upper edge with each neighboring microwell.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine Zellkulturvorrichtung zur Kultivierung von Zellsphäroiden umfassend mindestens ein Kompartiment mit n Kompartimentwänden, die eine Kompartimentbodenfläche definieren, und einem Volumen VK oberhalb der Kompartimentbodenfläche und eine Vielzahl von Microwells mit p Oberkanten und einem Volumen VM, wobei die Microwells so in der Kompartimentbodenfläche angeordnet sind, dass die Kompartimentbodenfläche außerhalb der Microwells lediglich schräge Oberflächen aufweist, die Zahl der Microwells so gewählt ist, dass die gesamte Kompartimentbodenfläche mit Microwells bedeckt ist, alle Microwells das gleiche Volumen VM aufweisen und die Microwells die Form einer Pyramide oder eines Kegels mit einer abgerundeten Spitze zur Aufnahme von Zellen aufweisen und weiterhin abgerundete Kanten zwischen der Spitze und der Grundfläche der Pyramide bzw. des Kegels.

Description

Zellkulturvorrichtung
Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft Vorrichtungen zur in vitro-Aggregation von Zellen. Die Vorrichtungen zeichnen sich dadurch aus, dass sie speziell geformte Hohlräume enthalten, die eine Aggregation von einzelnen Zellen zu Zellsphäroiden ermöglichen, wenn eine Zellsuspension auf die Vorrichtung ausgesät wird. Ferner betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Aggregation von Zellen und die Verwendung der erfindungsgemäßen Vorrichtungen zur Aggregation von Zellen.
Hintergrund der Erfindung
Die Stammzellforschung beschäftigt sich mit den Prinzipien von Regenerationsprozessen bei Gewebe, um Methoden für die regenerative Medizin zu entwickeln. Ein sehr wichtiger Faktor der Stammzellbiologie ist dabei die ständige Kommunikation zwischen den Stammzellen selbst und das Zusammenspiel der Stammzellen und des umgebenden Gewebes, der sogenannten Stammzell-Nische. Zusammen bilden diese Zellen organisatorische Einheiten, Zellcluster, Zellsphäroide oder Organoide" genannt, die in großer Zahl und ausgefeilter Architektur schließlich ein ganzes Organ bilden.
Verschiedene experimentelle Umgebungen erlauben die Analyse derartiger Prozesse, wobei der Standard hierbei die Verwendung von "hängenden Tropfen" ist. Hierbei wird die Entwicklung von Stammzellen simuliert, indem eine bestimmte Menge von Stamm- und anderen Zellen in einen Tropfen gegeben wird, die sich dann zu Zellclustern entwickeln, welche analysiert werden können. Die Nachteile dieser weit verbreiteten Technologie sind, dass auf diese Weise nur eine begrenzte Anzahl von Zellclustern erzeugt werden kann und dass nur beschränkt Mediumwechsel durchgeführt werden kann. Dies wäre jedoch wichtig, da die Differenzierung von Stammzellen von der Anwesenheit bestimmter Cytokine zu einem bestimmten Zeitpunkt abhängt, welche bei einem Mediumwechsel hinzugefügt werden könnten.
Im klinischen Umfeld wäre die Möglichkeit der großtechnischen Produktion von Zellclustern definierter Größe mit der Möglichkeit eines Mediumwechsels für verschiedene therapeutische Ansätze, wie z.B. die Inselzelltransplantation sehr wünschenswert. Bei dieser Technik sind kleine Inseln aufgrund der begrenzten Nährstoff- und Sauerstoffversorgung auf Diffusionsbasis in der frühen Zeit nach der Transplantation besser als große Inseln, da große Inseln aufgrund von Sauerstoffmangel nach der Transplantation absterben. Dies führt im Ergebnis dazu, dass zwei bis drei Transplantationen benötigt werden, bis im Patienten genug funktionale Inseln vorhanden sind, damit er kein gespritztes Insulin mehr benötigt (Lehmann R. et al., Diabetes. 2007 Mar; 56 (3): 594-603). Es wäre daher wünschenswert, statt weniger großer Inseln viele kleine Inseln zu erzeugen. Damit würde rechnerisch eine Transplantation ausreichen, damit ein Diabetiker funktionell geheilt ist und kein Insulin mehr spritzen muss. Für eine erfolgreiche Produktion von kleinen Inseln und eine klinische Anwendung müssten Inseln jedoch in einzelne Zellen dissoziiert und zu kleinen "Pseudoislets" reaggregiert werden. Für die Transplantation wären etwa 1 000 000 Pseudoislets erforderlich, eine Zahl, die mit der Technik der hängenden Tropfen nicht zu erreichen ist.
In der WO 2008/106771 ist eine Vorrichtung zur Fierstellung von Zellaggregaten beschrieben. Diese Vorrichtung wird unter dem Handelsnamen Aggrewell verkauft (Stemcell Technologies, Vancouver, BC, Kanada V5Z 1 B3). Diese ist jedoch nur als Laborprodukt und nicht als Medical Device entwickelt worden, weshalb sie für die Anwendung am Mensch nur mit Risikoübernahme des Anwenders verwendet werden dürfte.
Zudem ist die beschriebene Vorrichtung für die Stammzellclusterproduktion von begrenztem Nutzen, da die Microwells eine rein umgekehrte Pyramidenform haben oder die Form einer Pyramide mit flachem Boden. In jedem Fall sind jedoch die Seitenkanten der Pyramide nicht abgerundet. So werden die kultivierten Zellen anstatt in eine runde Sphäroid-/Clusterform in eine spitze Pyramidenform oder in die entsprechenden Seitenkanten gezwängt. Dies widerspricht den physikalischen Grundprinzipen der „Free energy minimisation“, welcher alle Zellprozesse unterworfen sind. Zudem werden die Zellen bei dieser Form von Microwells nicht dabei unterstützt, ein rundes Zellsphäroid zu bilden, sondern stattdessen in eine unnatürliche Konformation gezwängt.
Des Weiteren verhindert eine solche Vorrichtung die natürlichen Kommunikationsmechanismen von Zellen, da in den so geformten Zellclustern aufgrund ihrer unregelmäßigen Form für die einzelnen Zellen unterschiedliche Konzentrationen an Sauerstoff und Signalmolekülen vorliegen. Für Zelltherapien ist diese Vorrichtung daher ungeeignet, da die Form der Microwells eine Störung der Signalwege verursachen kann, was zur Fehlprogrammierung und in späteren Anwendungen mit Stammzellen letztendlich zur Tumorbildung führen kann. Zudem muss bei dieser Vorrichtung eine Lösung zur Reduktion von Zellanhaftung verwendet werden. Diese Lösung ist klinisch nicht zugelassen, sodass auch aus diesem Grund die Vorrichtung nicht für die klinische Anwendung geeignet ist.
Aus dem Stand der Technik ist bisher nur eine einzige Vorrichtung bekannt, die das Anzüchten von Zellclustern im geforderten Maßstab ermöglicht (WO 2010/142755 A2). Diese weist eine Vielzahl von Microwells mit einem Design auf. Nachteilig ist hierbei jedoch, dass die Microwells aufgrund technischer Einschränkungen nicht die gesamte Bodenfläche der Vorrichtung bedecken, sondern entlang der Kompartimentwand eine im Wesentlichen waagrechte Kante stehenbleibt, auf der sich potentiell Einzelzellen absetzen können. Um dies zu vermeiden, schlägt die WO 2010/142755 A2 die Verwendung von Einsätzen vor, die auf die überstehende Kante aufgesetzt werden.
Allerdings birgt dieses System die Gefahr, dass bei unvorsichtiger Handhabung einzelne Zellen unter den Rand des Einsatzes auf die Kante gelangen, die im Fall von Stammzellen unkontrolliert wachsen können, was im schlimmsten Fall zur Tumorbildung im mit diesem Zellprodukt behandelten Patienten führen kann.
Somit besteht weiterhin ein Bedarf an Zellkulturvorrichtungen, die aufgrund ihres Designs verhindern, dass sich Einzelzellen außerhalb der Microwells absetzen und dort unkontrolliert ausdifferenzieren können.
Zu lösende technische Aufgabe
Die objektiv zu lösende Aufgabe besteht daher in der Bereitstellung einer Zellkulturvorrichtung, die so konstruiert ist, dass alle eingebrachten Zellen unter definierten Bedingungen kultiviert werden und ein Wachstum einzelner Zellen außerhalb der Microwells verhindert wird.
Zusammenfassung der Erfindung
Die Aufgabe wird gelöst durch eine Zellkulturvorrichtung zur Kultivierung von Zellsphäroiden, umfassend mindestens ein Kompartiment mit n Kompartimentwänden und einem Volumen V«, die eine Kompartimentbodenfläche definieren, und eine Vielzahl von Microwells mit p Oberkanten und einem Volumen VM, wobei die Microwells so in der Kompartimentbodenfläche angeordnet sind, dass die Kompartimentbodenfläche außerhalb der Microwells lediglich schräge Oberflächen aufweist, die Zahl der Microwells so gewählt ist, dass die gesamte Kompartimentbodenfläche mit Microwells bedeckt ist, alle Microwells das gleiche Volumen VM aufweisen und die Microwells die Form einer Pyramide oder eines Kegels mit einer abgerundeten Spitze zur Aufnahme der Zellen aufweisen und weiterhin abgerundete Kanten zwischen der Spitze und der Grundfläche der Pyramide bzw. des Kegels.
Die Aufgabe wird weiterhin gelöst durch ein Verfahren zur Herstellung von Zellsphäroiden, wobei die Zellsphäroide in einer Zellkulturvorrichtung gemäß der Erfindung kultiviert werden.
Kurze Beschreibung der Figuren
Fig. 1 zeigt zwei Seitenansichten, zwei Schnittansichten und eine Draufsicht einer erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung.
Fig. 2 zeigt eine isometrische Ansicht, eine Draufsicht sowie eine Schnittansicht sowie zwei Detailansichten der Anordnung der Microwells in einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung h bezeichnet dabei die Tiefe der Microwells, c die Oberkanten der Grundfläche G, a den Winkel zwischen den Seitenflächen S mit der Grundfläche G und d den Durchmesser der abgerundeten Spitze.
Fig. 3 zeigt eine Schnittansicht eines Teiles einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. G bezeichnet dabei die Grundfläche eines Microwells, ß den Winkel zwischen der Kompartimentwand und der Kompartimentbodenfläche.
Fig. 4 zeigt eine isometrische Ansicht eines pyramidenförmigen Microwells mit abgerundeter Spitze gemäß einer Ausführungsform der erfindungsgemäßen Vorrichtung. G bezeichnet dabei die Grundfläche des Microwells, S die Seitenfläche des Microwells, c die Oberkanten der Grundfläche G, f die Seitenflächenkanten, d den Durchmesser der abgerundeten Spitze, dfi den Durchmesser der Abrundung der Seitenflächenkante nahe der Grundfläche G und de den Durchmesser der Abrundung der Seitenflächenkante nahe der Spitze der Pyramide. Fig. 5 zeigt Draufsicht, isometrische Ansicht und Seitenansicht von Microwells einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit p gleich 3, 4, 6 oder unendlich groß.
Fig. 6 zeigt Draufsicht einer Anordnung von Microwells gemäß der vorliegenden Erfindung sowie Draufsicht, Schnittansicht und isometrische Ansicht eines Microwells, wobei p gleich 3 und n gleich 6.
Fig. 7 zeigt Draufsicht einer Anordnung von Microwells gemäß der vorliegenden Erfindung sowie Draufsicht, Schnittansicht und isometrische Ansicht eines Microwells, wobei p gleich 4.
Fig. 8 zeigt Draufsicht und isometrische Ansicht einer Anordnung von Microwells gemäß der vorliegenden Erfindung sowie Draufsicht, Schnittansicht und isometrische Ansicht eines Microwells, wobei p gleich 4.
Fig. 9 zeigt Draufsicht einer Anordnung von Microwells gemäß der vorliegenden Erfindung sowie Draufsicht, Schnittansicht und isometrische Ansicht eines Microwells, wobei p gleich 6 und n sich unendlich nähert.
Fig. 10 zeigt Draufsicht und isometrische Ansicht einer Anordnung von Microwells gemäß der vorliegenden Erfindung sowie Draufsicht, Schnittansicht und isometrische Ansicht eines Microwells, wobei p sich unendlich nähert.
Beschreibung der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine Zellkulturvorrichtung umfassend mindestens ein Kompartiment mit n Kompartimentwänden, die eine Kompartimentbodenfläche definieren, und eine Vielzahl von Microwells mit p Oberkanten und einem Volumen VM, wobei die Microwells so in der Kompartimentbodenfläche angeordnet sind, dass die Kompartimentbodenfläche außerhalb der Microwells lediglich schräge Oberflächen aufweist, die Zahl der Microwells so gewählt ist, dass die gesamte Kompartimentbodenfläche mit Microwells bedeckt ist, und wobei alle Microwells das gleiche Volumen VM aufweisen.
Gemäß der vorliegenden Definition ist eine Zellkulturvorrichtung zur Kultivierung von eukaryotischen Zellen, insbesondere Stammzellen, geeignet und unterscheidet sich von Assayplatten unter anderem durch das verwendete Material, die Oberflächenbeschaffenheit, Anheftungseigenschaften, die Sterilität, die Gasdurchlässigkeit, Lichtdurchlässigkeit, und den Brechungsindex.
In einer bevorzugten Ausführungsform besteht die Zellkulturvorrichtung aus einem Material, das die Zellanhaftung verhindert. Solche Materialien umfassen z.B. spezifisch geeignete Kunststoffe (z.B. Polystyrol, Polycarbonat), und Glas, mit oder ohne Beschichtungen zur Verringerung von Zelladhäsion. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform besteht die Zellkulturvorrichtung aus Cycloolefin-Copolymeren.
Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung umfasst mindestens ein Kompartiment mit n Kompartimentwänden. Damit ist die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung an allen Seiten durch eine Kompartimentwand begrenzt, so dass eine Flüssigkeit, z.B. Zellkulturmedium, innerhalb des Kompartiments gehalten werden kann. Die Kompartimentwände können dabei alle die gleiche oder unterschiedliche Höhe haben. Die typische Höhe einer Kompartimentwand beträgt von 1 bis 100 mm, vorzugsweise 10 bis 30 mm. In jedem Fall sind die Kompartimentwände glatt, d.h. sie verfügen über keine Vorsprünge.
Die Kompartimentwände definieren eine Kompartimentbodenfläche. Diese erstreckt sich über die gesamte von den Kompartimentwänden eingegrenzte Fläche und wird von den Kompartimentwänden begrenzt. In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Kompartimente der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung nach oben hin offen, d.h. die der Kompartimentbodenfläche gegenüberliegende Seite ist nicht geschlossen, sodass die Kompartimente direkt zugänglich sind. Oberhalb der Kompartimentbodenfläche befindet sich das Kompartimentvolumen V«.
Die Kompartimente der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung weisen eine n-eckige Öffnung auf. n kann dabei jede natürliche Zahl sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist n so groß, dass die Öffnung des Kompartiments annähernd kreisförmig ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt n 3, 4, oder 6, besonders bevorzugt 4. Eine solche Geometrie erleichtert die Produktion.
In einer weiteren Ausführungsform sind jeweils zwei einander gegenüberliegenden Kompartimentwände gleich lang, so dass das Kompartiment eine symmetrische Öffnung aufweist. In einer bevorzugten Ausführungsform sind alle Kompartimentwände gleich lang, so dass das Kompartiment eine Öffnung in Form eines gleichseitigen Dreiecks, Sechsecks oder, besonders bevorzugt, eines Quadrats hat.
In einer bevorzugten Ausführungsform stehen die Kompartimentwände im Wesentlichen senkrecht auf die Kompartimentbodenfläche außerhalb der Microwells. Als im Wesentlichen senkrecht wird hierin jeder Wandwinkel ß von 90° bis 110° auf die Kompartimentbodenfläche bezeichnet.
Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung umfasst mindestens ein Kompartiment, kann aber auch mehrere, z.B. 2, 3, 4, 5, 6, 8, 10, 12, 18, 24, 48, 96, 384, 1536, 3456 oder 9600 Kompartimente umfassen. Vorzugsweise umfasst die Zellkulturvorrichtung 4, 6, 12, 24, 96, 384 oder 1536 Kompartimente. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zellkulturvorrichtung 6 Kompartimente.
Die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung umfasst weiterhin eine Vielzahl von Microwells mit p Oberkanten c. Microwells sind hierbei als Vertiefungen in der Kompartimentbodenfläche definiert, in denen sich Zellen absetzen, einander annähern und als Zellcluster wachsen können. Microwells können hierin auch als Picowells, Nanowells, Microcavities und Vertiefungen bezeichnet werden.
Die Microwells der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung weisen eine p-eckige Grundfläche auf. Die Grundfläche G ist dabei eine Öffnung, durch die die Zellen ins Innere der Microwells gleiten können. Die Öffnung weist p Oberkanten c auf, die die Öffnung umranden p kann dabei jede natürliche Zahl sein. In einer bevorzugten Ausführungsform ist p so groß, dass die Grundfläche G annähernd ein Kreis ist. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt p 3, 4, oder 6, besonders bevorzugt 4.
In einer Ausführungsform ist p gleich n. In einer bevorzugten Ausführungsform ist p gleich n gleich 4. Dadurch ist eine optimale Ausnutzung der zur Verfügung stehenden Bodenfläche gewährleistet. In einer weiteren Ausführungsform ist n gleich 6 und p gleich 3. In einer weiteren Ausführungsform ist n so groß, dass die Öffnung des Kompartiments annähernd kreisförmig ist, und p gleich 4 oder 6. In noch einer weiteren Ausführungsform nähern sich n und p unendlich.
Die Microwells weisen eine Pyramiden- oder kegelförmige Form auf, wobei sich die Spitze der Pyramide innerhalb der Kompartimentbodenfläche befindet und die Grundfläche der Pyramide bzw. des Kegels die Öffnung der Microwells bildet. Anders gesagt erstreckt sich das Volumen V der Microwells von der Oberfläche der Kompartimentbodenfläche in die Kompartimentbodenfläche hinein. Im Kontext der Erfindung wird die Spitze der Pyramide bzw. des Kegels daher auch als Boden B eines Microwells bezeichnet. Zwischen der Spitze und der Grundfläche G eines Microwells, genauer gesagt zwischen den Ecken der Öffnung und dem Boden B, befinden sich die Dreiecksseitenkanten f, die die Seitenflächen S begrenzen.
Die Spitzen dienen der Aufnahme der Zellen. Durch ihre Abrundung wird die Ausbildung von regelmäßigen Sphäroiden gefördert. In einer Ausführungsform haben alle Spitzen der Microwells eines Kompartiments den gleichen Abstand voneinander. Dies ist wichtig, um die Kommunikation zwischen den Sphäroiden aufrechtzuerhalten. Die Zellen kommunizieren mittels Botenstoffen. Die übermittelten Informationen sind dabei von der Konzentration der Botenstoffe abhängig. Diese Prinzipien der Morphogengradienten und lateralen Inhibition sind machen es notwendig, dass die Abstände zwischen den Zellsphäroiden gleich sind, damit sich die Zellsphäroide im gleichen Tempo entwickeln. Nur wenn sich alle Zellsphäroide bei der Transplantation im gleichen Entwicklungsstadium befinden, ist eine sichere Anwendung in der Zelltherapie möglich.
In einer Ausführungsform haben die Microwells die Form einer Pyramide. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Spitze der Pyramide abgerundet mit einem Durchmesser dB.
In einer Ausführungsform, bei der p so groß ist, dass die Grundfläche G annähernd ein Kreis ist, haben die Microwells die Form eines Kegels. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Spitze des Kegels abgerundet mit einem Durchmesser dß.
In einer bevorzugten Ausführungsform weist die Spitze des Kegels bzw. der Pyramide einen Durchmesser dß zwischen 2 pm und 500 pm, vorzugsweise 5 pm bis 400 pm und besonders bevorzugt 70 pm bis 200 pm auf. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Durchmesser dß 90 pm. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt der Durchmesser dß 180 pm oder 270 pm.
Anders gesagt hat die Spitze der Pyramide bzw. des Kegels der Microwells einen Radius rB zwischen 1 und 250 pm, bevorzugt 2.5 pm bis 200 pm und besonders bevorzugt 35 pm bis 100 pm. In einer bevorzugten Ausführungsform beträgt der Radius rB 45 pm. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform der Radius rB 90 pm oder 135 pm. Die Microwells haben eine Tiefe h. Die Tiefe beträgt zwischen 10 pm und 2000 pm, bevorzugt 50 pm bis 1000 pm, weiter bevorzugt 100 pm bis 500 pm und am meisten bevorzugt 200 pm bis 400 pm. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform beträgt die Tiefe 600 pm bis 700 pm, besonders bevorzugt 641 pm.
Die Oberkanten c haben eine Länge zwischen 0 pm bis 5 mm, bevorzugt 200 pm bis 2mm, und am meisten bevorzugt 400 pm bis 1200 pm. In einer bevorzugten Ausführungsform sind alle Oberkanten gleich lang.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Dreiecksseitenkanten f, d.h. die Kanten zwischen den Seitenflächen der Pyramide, abgerundet. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform nimmt die Abrundung der Dreiecksseitenkanten f von der Öffnung hin zur Pyramidenspitze bzw. Boden des Microwells progressiv zu, wobei s, d.h. der Durchmesser dfi der Abrundung nahe der Öffnung der Microwells unterscheidet sich von dem Durchmesser de nahe der Spitze der Pyramide bzw. des Bodens der Microwells. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist dfi kleiner als df2. In einer bevorzugten Ausführungsform ist dfi gleich 0 und df2 gleich dß.
Die Seitenflächen S bilden mit der Grundfläche G bzw. der gedachten Fläche in der Öffnung der Microwells bzw. mit der Kompartimentbodenfläche einen Wandwinkel a. a beträgt zwischen 35° bis 75°, vorzugsweise 40° bis 70°, weiter bevorzugt 50° bis 60° und am meisten bevorzugt 54,7°. Dieser Winkel stellt sicher, dass alle Zellen bis zum Boden bzw. in die Spitze B hinuntergleiten und zudem optimale Bedingungen herrschen, um die Zellen dabei zu unterstützen, ein natürliches Zellsphäroid zu formen, sie aber gleichzeitig nicht einzuengen oder in eine unnatürliche Konformation zu zwängen.
Gemäß der Erfindung hängen dabei Tiefe der Microwells und Länge der Oberkanten vom Radius bzw. Durchmesser dß und dem Winkel a ab. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform mit a gleich 54,7° ist p 4 und der Durchmesser dß beträgt 90 pm, die Länge der Oberkanten c 500 pm und die Tiefe h 320 pm. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform mit a gleich 54,7° beträgt der Durchmesser dß 180 pm, die Länge der Oberkanten c 1000 pm und die Tiefe h 641 pm.
Jedes Kompartiment der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung weist eine Vielzahl von Microwells auf. Eine Vielzahl ist hierbei definiert als eine natürliche Zahl zwischen 1 und 1 000 000. Ein Kompartiment umfasst demnach zwischen einem bis 1 000 000 Microwells. io
In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Kompartiment mehr als ein Microwell. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform umfasst ein Kompartiment genau ein Microwell.
Die Kompartimentbodenfläche eines Kompartiments ist erfindungsgemäß vollständig mit Microwells bedeckt. Die Microwells sind dabei so angeordnet, dass zwischen ihnen möglichst wenig Zwischenraum besteht. In einer Ausführungsform sind die Microwells in regelmäßigen Spalten und Reihen angeordnet. Im Rahmen der Erfindung gilt dabei, dass zwischen zwei Microwells wenig Zwischenraum besteht, wenn die Oberfläche der Kante zwischen den beiden Microwells eine Breite von weniger als 15 pm aufweist.
In einer Ausführungsform hat jedes Microwell hat mit jedem benachbarten Microwell mindestens eine gemeinsame Oberkante.
Unter einer gemeinsamen Oberkante ist hierbei zu verstehen, dass die Öffnungen der Microwells nahtlos nebeneinander liegen. So hat bei der Ausführungsform, bei der n gleich p gleich 4 ist, ein Microwell x, das sich zwischen vier weiteren Microwells Xi, X2, X3, X4 befindet, mit jedem der vier angrenzenden Microwells jeweils die zwischen x und Xi, x2, X3 und X4 befindliche Oberkante gemeinsam, d.h. mit Xi die Oberkante Ci, mit X2 die Oberkante c2, mit x3 die Oberkante c3 und mit x die Oberkante c . Ein Microwell y, das sich in einer an eine Kompartimentwand angrenzenden Reihe oder Spalte befindet, hat mit den drei benachbarten Microwells jeweils eine gemeinsame Oberkante. Ein Microwell z, das sich in einer Ecke der Kompartimentbodenfläche befindet, hat mit den zwei benachbarten Microwells jeweils eine gemeinsame Oberkante. Analoges gilt für Werte von n und p ungleich 4.
Durch die gemeinsame Oberkante wird verhindert, dass Zellen zwischen den Microwells liegenbleiben, wo sie sich unkontrolliert entwickeln könnten. Bei der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung werden alle Zellen aufgrund der besonderen Geometrie und Anordnung der Microwells ins Innere eines Microwells geleitet, sodass sich jede Zelle in dem gewünschten Umfeld korrekt entwickeln kann.
Die Oberkanten der Microwells y und z, die nicht mit den benachbarten Microwells geteilt sind, schließen bündig mit den Kompartimentwänden ab. Bündig ist hierbei definiert als formschlüssig, so dass am Übergang zwischen Oberkante und Kompartimentwand keine flache Kante entsteht, auf der sich einzelne Zellen absetzen können. Im Rahmen der Erfindung gilt dabei, dass eine Oberkante bündig mit einer Kompartimentwand abschließt, wenn die entstehende Kante eine Breite von maximal 15 pm aufweist. In einer Ausführungsform ist diese Kante nicht horizontal, d.h. parallel zur Kompartimentbodenfläche, sondern abgeschrägt.
Dadurch, dass jedes Microwell mit jedem benachbarten Microwell mindestens eine gemeinsame Kante aufweist, und die Oberkanten der außen liegenden Microwells bündig mit den Kompartimentwänden abschließen, weist die Kompartimentbodenfläche außerhalb der Microwells lediglich schräge Oberflächen auf, auf denen sich keine Zellen absetzen können. Somit können in der erfindungsgemäßen Vorrichtung keine Zellen unkontrolliert außerhalb der Microwells wachsen.
Erfindungsgemäß weisen alle Microwells das gleiche Volumen V auf. Anders gesagt sind bei allen Microwells die sich entsprechenden Oberkanten jeweils gleich lang. Noch anders ausgedrückt weist die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung keine abgeschnittenen Microwells auf. Dadurch wird sichergestellt, dass in allen Microwells dieselben Wachstumsbedingungen herrschen.
Erfindungsgemäß stehen alle Microwells eines Kompartiments miteinander in fluider Verbindung. Dadurch herrschen in allen Microwells die gleichen Wachstumsbedingungen.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung der beschriebenen Zellkulturvorrichtung zur Kultivierung von Zellen. Durch die besondere Geometrie der Microwells können bei Verwendung geeigneter Ausgangszeilen und Kultivierungsbedingungen aus den kultivierten Zellen Zellcluster entstehen.
Als Zellsphäroide, Zellcluster, Organoide oder 3D-Zellkolonien werden hierbei regelmäßig oder unregelmäßig geformte Aggregate aus Zellen bezeichnet, die sich in alle Raumrichtungen erstrecken. Kugelförmige Zellcluster werden auch als Zellsphäroide bezeichnet. Die Begriffe Zellcluster, Zellansammlung und Zellaggregat werden hierin synonym verwendet.
Die erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtungen eignen sich damit besonders für die 3D- Zellkultur mit dem Ziel, Zellsphäroide zu gewinnen. Anders als bei herkömmlichen 3D- Kultivierungsverfahren sind beim erfindungsgemäßen Kultivierungsverfahren keine weiteren Vorrichtungen, Reaktoren oder besonderes Geschick des Experimentators notwendig, um zuverlässig Zellsphäroide zu erhalten. Stattdessen können die Zellen wie auf einer herkömmlichen Zellkulturplatte ausgebracht werden und bilden in Folge der speziellen Geometrie der Microwells automatisch Zellsphäroide aus, die sich durch eine hohen Grad an Homogenität in Größe und Funktionalität auszeichnen.
Dies unterscheidet die erfindungsgemäßen Vorrichtungen von bereits bekannten Vorrichtungen, bei denen die Zellen in Zellclustern einer beliebigen Form wachsen können. Dies führt in der Folge zu ungleicher Sauerstoff- und Nährstoffverteilung innerhalb der Zellcluster, zum Absterben einzelnen Cluster und somit in der Summe zu weniger funktionalen Zellclustern.
Ein weiterer Vorteil bei der Verwendung der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung liegt darin, dass alle auf die Zellkulturvorrichtung aufgebrachten Zellen zwangsläufig in Zellclustern wachsen, da keine Einzelzellen außerhalb der Microwells liegenbleiben und dort unkontrolliert wachsen können. Dies ist insbesondere bei therapeutischen Anwendungen, bei denen die gewonnenen (Stamm-)Zellcluster einem Patienten transplantiert werden sollen, von enormer Wichtigkeit. Ebenso vorteilhaft ist dies in der Forschung, um sicherzustellen, dass nur Zellen mit gleichen Eigenschaften vorliegen.
Grundsätzlich können alle Arten von Zellen in der erfindungsgemäßen
Zellkulturvorrichtung kultiviert werden. Die Kultivierung von eukaryotischen Zellen ist jedoch besonders bevorzugt. Alle tierischen Zellen können mit der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung kultiviert werden, insbesondere Säugetierzellen, besonders bevorzugt menschliche Zellen.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die Zellkulturvorrichtung dafür verwendet, Stammzellen zu kultivieren. Durch die Verwendung der erfindungsgemäßen
Zellkulturvorrichtung können aus Stammzellen Stammzellsphäroide gewonnen werden, die für die die Verwendung in der regenerativen Medizin geeignet sind. Derartige Stammzellsphäroide wurden bereits experimentell erfolgreich für die Regeneration verschiedener Organe und Gewebe verwendet, unter anderem Herz, Lunge, Leber, Speicheldrüsen, Knochengewebe, Haut, Thymus und Nervenzellen (Ong CS, Zhou X, Han J, et al. In vivo therapeutic applications of cell spheroids. Biotechnology Advances. 2018 Mar - Apr;36(2):494-505.). Die Transplantation solcher Stammzellsphäroide birgt jedoch das Risiko der Tumorbildung, wenn die Zellsphäroide falsch programmiert sind. Durch die Geometrie der Microwells sowie der Anordnung in der erfindungsgemäßen Vorrichtung kann eine Falschprogrammierung der Stammzellen verhindert werden, so dass die so gewonnenen Stammzellsphäroide sicher für die therapeutische Anwendung sind.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zellkulturvorrichtung dazu verwendet, Inselzellen zu kultivieren. Der Begriff „Inselzellen“ ist dem Fachmann geläufig und bezieht sich auf eine Gruppe von insulinproduzierenden Zellen aus der menschlichen Bauchspeicheldrüse. Mit der Transplantation dieser Zellen kann Diabetes funktionell geheilt werden. Aus dem Stand der Technik bekannte Inselzellsphäroide sind meist zu groß, weshalb sie bei der Transplantation aufgrund von Sauerstoffmangel größtenteils absterben. Durch Verwendung der erfindungsgemäßen Zellkulturvorrichtung kann die Größe der Sphäroide standardisiert werden und so deren Überlebensrate verbessert werden, da bei optimaler Größe Sauerstoff bis ins Zentrum diffundieren kann.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Zellkulturvorrichtung dazu verwendet, Tumorzellen zu kultivieren. Tumorzellen sind gemäß aktuellem medizinischen Wissen entartete Stammzellen (sog. „cancer stem cells“). Daher kann die erfindungsgemäße Zellkulturvorrichtung, auch zur Gewinnung von Tumorzellsphäroiden eingesetzt werden. So können z.B. von Patienten isolierte Tumorzellen als Sphäroide gezüchtet werden, die exakt die Eigenschaften zeigen wie der Tumor des Patienten. Somit können außerhalb des Körpers (ex vivo) Therapien getestet werden, z.B. welche Chemotherapie genau beim Patienten eingesetzt werden soll. Auch für die Medikamentenentwicklung bieten diese Tumorzellsphäroide großes Potential und können damit auch die Zahl der notwendigen Tierversuche senken.
Die Erfindung betrifft weiterhin Zellsphäroide, die bei der Verwendung der beschriebenen Zellkulturvorrichtung gewonnen werden können. Diese Zellsphäroide können für medizinische Anwendungen, z.B. als Medikament, verwendet werden. Die Erfindung betrifft dementsprechend auch Verfahren zur Behandlung des menschlichen Körpers, bei der Zellsphäroide verabreicht werden, die mittels der erfindungsgemäßen Vorrichtungen gezüchtet werden. Die Anwendungsbreite ist enorm und umfasst praktisch alle Organsysteme, so z.B. die Behandlung von Herzinfarkt, Herzschwäche, Leberversagen, Schlaganfall, Wundheilung, Lungenfibrose oder Gefäßerkrankungen.
Im Folgenden werden bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung anhand der Figuren beschrieben. In der in Fig. 1 und 2 gezeigten Ausführungsform weist die Zellkulturvorrichtung sechs Kompartimente mit n gleich 4 auf. Dabei weisen die Microwells p gleich 4 auf. Die Microwells sind dabei so angeordnet, dass jedes Microwells mit jedem angrenzenden Microwell eine gemeinsame Oberkante aufweist (vgl. Fig. 3A). Zudem weisen die Microwells das gleiche Volumen V und eine abgerundete Spitze mit Durchmesser dB bzw. Radius rB auf. G bezeichnete die gedachte Grundfläche der Pyramide, c die Oberkanten, die die Grundfläche begrenzen. Die Seitenflächen der Microwells bilden einen Winkel a mit der Grundfläche.
Fig. 3 zeigt eine Schnittansicht einer erfindungsgemäßen Vorrichtung am Übergang zwischen Kompartimentbodenfläche und Kompartimentseitenwand. Zwischen Kompartimentbodenfläche und Kompartimentseitenwand liegt der Winkel ß vor, der annähernd 90°C beträgt. Zwischen der Kompartimentseitenwand und dem angrenzenden Microwell liegt keine Kante vor.
Fig. 4 zeigt eine Ausführungsform eines einzelnen Microwells, bei der das Microwell die Form einer Pyramide (Fig. 4A) oder Kegels (Fig. 4B) mit abgerundeter Spitze hat. Bei der Pyramide sind die Kanten f zwischen den Seitenflächen S abgerundet, wobei der Durchmesser der Abrundung dfi nahe der Öffnung bzw. Grundfläche G kleiner ist als der Durchmesser de nahe der Pyramidenspitze. Dabei ist der erkennbar, dass de annähernd dB entspricht.
Fig. 5 zeigt verschiedene Ausführungsformen der Microwells gemäß der Erfindung. Beispielsweise beträgt p gleich 3 und das Microwell hat die Form einer dreiseitigen Pyramide mit abgerundeter Spitze. In einer weiteren Ausführungsform beträgt p gleich 4 und das Microwell hat die Form einer vierseitigen Pyramide mit abgerundeter Spitze. In einer weiteren Ausführungsform beträgt p gleich 6 und das Microwell hat die Form einer sechsseitigen Pyramide mit abgerundeter Spitze. In einer anderen Ausführungsform ist p so groß, dass die Grundfläche G des Microwells annähernd kreisförmig ist und das Microwell die Form eines Kegels mit abgerundeter Spitze hat. Wie aus Fig. 5 ersichtlich, sind bei all diesen Ausführungsformen die Dreiecksseitenkanten f abgerundet, wobei der Durchmesser der Abrundung dfi nahe der Öffnung bzw. Grundfläche G kleiner ist als der Durchmesser de nahe der Pyramiden- bzw. Kegelspitze. Fig. 6 zeigt eine erfindungsgemäßen Vorrichtung mit p = 3 und n = 6 . Die Microwells haben dabei die Form einer dreiseitigen Pyramide mit abgerundeter Spitze und abgerundeten Kanten zwischen den Seitenflächen(vgl. Fig. 6A).
Fig. 7 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit p = 4 und n = °°. Die Microwells haben dabei die Form einer vierseitigen Pyramide mit abgerundeter Spitze und abgerundeten Kanten zwischen den Seitenflächen (vgl. Fig. 7A).
Fig. 8 zeigt eine weitere Anordnung von Microwells mit p = 4 in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung. Die Microwells haben dabei die Form einer vierseitigen Pyramide mit abgerundeter Spitze und abgerundeten Kanten zwischen den Seitenflächen (vgl. Fig. 8A). Fig. 9 zeigt eine erfindungsgemäße Vorrichtung mit p = 6 und n = °°. Die Microwells haben dabei die Form einer sechsseitigen Pyramide mit abgerundeter Spitze und abgerundeten Kanten zwischen den Seitenflächen (vgl. Fig. 9A).
Fig. 10 zeigt eine Anordnung von Microwells in einer erfindungsgemäßen Vorrichtung mit p = 00 Die Microwells haben dabei die Form eines Kegels mit abgerundeter Spitze (vgl. Fig. 10A). Auch hier weisen die Microwells mit jedem benachbarten Microwell eine gemeinsame Oberkante auf.

Claims

Ansprüche
1. Zellkulturvorrichtung zur Kultivierung von Zellsphäroiden umfassend mindestens ein Kompartiment mit n Kompartimentwänden, die eine Kompartimentbodenfläche definieren, und einem Volumen V« oberhalb der Kompartimentbodenfläche und eine Vielzahl von Microwells mit p Oberkanten und einem Volumen VM, wobei die Microwells so in der Kompartimentbodenfläche angeordnet sind, dass die Kompartimentbodenfläche außerhalb der Microwells lediglich schräge Oberflächen aufweist, die Zahl der Microwells so gewählt ist, dass die gesamte Kompartimentbodenfläche mit Microwells bedeckt ist, alle Microwells das gleiche Volumen VM aufweisen und die Microwells die Form einer Pyramide oder eines Kegels mit einer abgerundeten Spitze zur Aufnahme von Zellen aufweisen und weiterhin abgerundete Kanten zwischen der Spitze und der Grundfläche der Pyramide bzw. des Kegels.
2. Zellkulturvorrichtung gemäß Anspruch 1 , wobei alle Spitzen der Microwells eines Kompartiments den gleichen Abstand voneinander haben
3. Zellkulturvorrichtung gemäß Anspruch 1 , wobei die Microwells Seitenflächen aufweisen und die Seitenflächen mit der Kompartimentbodenfläche einen Winkel von 54,7° bilden.
4. Zellkulturvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jede Kompartimentwand bündig mit mindestens einer Oberkante von mindestens einem Microwell angeordnet ist.
5. Zellkulturvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes Microwell mit jedem benachbarten Microwell eine gemeinsame Oberkante hat.
6. Zellkulturvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei zwei gegenüberliegende Kompartimentwände gleich lang sind.
7. Zellkulturvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei alle Oberkanten der Microwells gleich lang sind.
8. Zellkulturvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei n und/oder p gleich 3, 4 oder 6 ist.
9. Zellkulturvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei n und/oder p so groß sind, dass das Kompartiment und/oder die Microwells eine annähernd runde Bodenfläche bzw. Grundfläche aufweisen.
10. Zellkulturvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei n gleich p ist.
11. Zellkulturvorrichtung gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, umfassend 1 ,
2, 4, 6, 12, 24, 96, 384, 1536, 3456 oder 9600 Kompartimente.
12. Verfahren zur Herstellung von Zellsphäroiden, wobei die Zellsphäroide in einer Zellkulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 kultiviert werden.
13. Verwendung einer Zellkulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12 zur Kultivierung von Stammzellsphäroiden.
14. Zellsphäroide, erhalten durch Kultivierung von Zellen in einer Zellkulturvorrichtung gemäß einem der Ansprüche 1 bis 12.
15. Zellsphäroide gemäß Anspruch 15, wobei die Zellen Inselzellen, Stammzellen oder Tumorzellen sind.
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