EP4065987A1 - Normierungsverfahren und normierungssystem für eine trockenblutmatrix - Google Patents

Normierungsverfahren und normierungssystem für eine trockenblutmatrix

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EP4065987A1
EP4065987A1 EP20816447.5A EP20816447A EP4065987A1 EP 4065987 A1 EP4065987 A1 EP 4065987A1 EP 20816447 A EP20816447 A EP 20816447A EP 4065987 A1 EP4065987 A1 EP 4065987A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dry blood
hemoglobin
analyte
concentration
blood matrix
Prior art date
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Pending
Application number
EP20816447.5A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Tina BUCHHOLZ
Nancy KRÜGER
Oliver BLANKENSTEIN
Falko BÖHRINGER
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Labor Berlin Charite Vivantes Services GmbH
Original Assignee
Labor Berlin Charite Vivantes Services GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Labor Berlin Charite Vivantes Services GmbH filed Critical Labor Berlin Charite Vivantes Services GmbH
Publication of EP4065987A1 publication Critical patent/EP4065987A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6803—General methods of protein analysis not limited to specific proteins or families of proteins
    • G01N33/6848—Methods of protein analysis involving mass spectrometry
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/72—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving blood pigments, e.g. haemoglobin, bilirubin or other porphyrins; involving occult blood
    • G01N33/721—Haemoglobin

Definitions

  • the present invention relates to a standardization method and a standardization system for a dry blood matrix for the standardized determination of at least one analyte in the dry blood matrix.
  • Newborn screening has a special position in routine high-throughput analysis, since dry blood is used as the sample matrix for analysis. Analysis from dry blood is therefore particularly dependent on the fact that liquid blood is only available in very limited quantities in newborns. The dry blood analysis in newborn screening is currently carried out in combination with highly sensitive special analysis.
  • the object of the present invention is to at least partially take into account the above-described problems.
  • a normalization method for a dry blood matrix has the following steps:
  • the standardization method according to the invention is universally applicable to a large number of clinically relevant analytes.
  • the method can also be applied to species other than humans, in particular to all vertebrates.
  • the analysis of dry blood as a sample matrix can be made available to the laboratory market in greater detail and more widely. Due to the flexible and fundamentally non-time-critical handling of dry blood matrices, logistics costs that have been incurred up to now can be greatly reduced.
  • the first part of the dry blood matrix and / or the second part of the dry blood matrix can each be provided in the form of a dry blood spot by manual or automatic punching. That is, at least a first dry blood spot for the analyte and a second dry blood spot for the hemoglobin to be analyzed can be worked out, in particular punched out, from the dry blood matrix. The at least one first dry blood spot and the second dry blood spot are then preferably processed separately.
  • analytes can be extracted from the at least one first dry blood spot or from the first part of the dry blood matrix, or one analyte can be extracted from several dry blood spots or corresponding parts of the dry blood matrix.
  • the hemoglobin is preferably extracted by an aqueous buffer.
  • a quantitative analysis is preferably to be understood as a quantitative determination and / or a corresponding measurement. That is, through the quantitative analysis of the at least one extracted analyte and the extracted hemoglobin, the amount of the respective substance is determined.
  • the quantitative analysis of the hemoglobin is preferably carried out by mass spectrometry by means of enzymatic fragmentation.
  • the quantitative analysis of the analyte and the hemoglobin can be carried out simultaneously or separately.
  • the highly sensitive analysis is preferably carried out as part of an analysis using liquid chromatography-electrospray-mass spectrometry.
  • hemoglobin and / or enzymatic fragments of the hemoglobin can also be detected by means of the MRM process (Multiple Reaction Monitoring).
  • the proportion of the substance is determined from the respective part of the dry blood matrix.
  • the hematocrit of the second part of the dry blood matrix can then be derived from the concentration of the hemoglobin.
  • the derivation from the hemoglobin concentration is preferably carried out via a linear relationship between the hemoglobin concentration and the hematocrit.
  • a calibration function can be used to determine the concentration of the at least one analyte and the hemoglobin, by means of which an area of the signals can be translated into a concentration.
  • the hematocrit can be derived using a translation of the hemoglobin concentration into hematocrit.
  • the hematocrit can according to the relationship can be calculated, where cHb is the hemoglobin concentration.
  • the extraction of hemoglobin can be understood to mean the extraction of hemoglobin and / or hemoglobin fragments.
  • determining the concentration of the hemoglobin can be understood to mean determining the concentration of the hemoglobin and / or determining the concentration of the hemoglobin fragments.
  • hemoglobin can also be understood to mean hemoglobin fragments.
  • the normalization factor can be calculated and / or determined on the basis of various test series by means of which an adapted mathematical relationship can be established empirically.
  • At least one peptide fragment of the hemoglobin is analyzed quantitatively and then a concentration of the at least one peptide fragment in the second part of the dry blood matrix is determined, the concentration of the at least one peptide fragment being based on the concentration of hemoglobin in the second part of the dry blood matrix is closed.
  • This is particularly advantageous when analyzing several analytes at the same time. That is, if several analytes are extracted from the dry blood matrix at the same time, specific peptide fragments of the hemoglobin can preferably be quantitatively determined simultaneously as part of the quantitative analysis of the hemoglobin.
  • the quantitative analysis of the hemoglobin or of the at least one peptide fragment is carried out on the basis of a multiple selection of analyte-specific mass fragments generated in a mass spectrometer.
  • This can be carried out in an advantageous manner using a quadrupole mass spectrometer as part of an MRM process. It has been found to be particularly efficient if the quantitative analysis of the hemoglobin or of the at least one peptide fragment is carried out on the basis of a double selection of analyte-specific mass fragments generated in a mass spectrometer.
  • the quantitative analysis of the hemoglobin or of the at least one peptide fragment in a standardization method according to the invention is carried out on the basis of analyte-specific mass-over-charge signals, m / z.
  • the hemoglobin and / or the at least one peptide fragment is advantageously selected by means of mass spectrometry not by mass alone, but by means of a mass / charge ratio. This enables particularly precise analysis results to be achieved.
  • hemoglobin is enzymatically cleaved by adding a peptidase. This enabled meaningful analysis values to be generated, which form an advantageous basis for further development with regard to the desired standardization factor.
  • a plasma-equivalent concentration of the at least one analyte is determined on the basis of the normalization factor.
  • the plasma-equivalent concentration of the at least one analyte is to be understood as a concentration which is analogous to a conventional plasma and / or serum concentration of an analyte from a plasma and / or serum sample.
  • the normalization factor determined can be used to normalize the analyte concentration in the dry blood sample and to calculate a concentration value analogous to the previously established plasma and / or serum concentration, ie a plasma-equivalent concentration.
  • the corresponding hematocrit normalization of the analyte concentration enables quantitative analyzes from dry blood matrices and from liquid sample matrices to be directly compared with one another.
  • a further advantage of the present invention arises if, in a normalization process, the at least one analyte is extracted from the dry blood matrix by means of an extraction liquid. This allows the analyte to be extracted from the dry blood matrix in a simple and reliable manner.
  • the at least one analyte is preferably extracted from the dry blood matrix by means of rehydration.
  • the at least one analyte can also be extracted from the dry blood matrix in an advantageous manner by means of electromagnetic radiation.
  • the at least one extracted analyte can then be converted into a gas phase for further use, in particular for the subsequent quantitative analysis.
  • a normalization system for a dry blood matrix comprises the following components: an extraction unit for extracting at least one analyte from a first part of the dry blood matrix and hemoglobin from a second part of the dry blood matrix, an analysis unit for quantitative analysis of the at least one extracted analyte and the extracted hemoglobin , a determination unit for determining a concentration of the at least one analyte in the first part of the dry blood matrix and a concentration of the hemoglobin in the second part of the dry blood matrix, a deriving unit for deriving a hematocrit of the second part of the dry blood matrix based on the concentration of the hemoglobin, and a computing unit for calculating a normalization factor based on the hematocrit determined to normalize a concentration of the at least one analyte in the first part of the dry blood matrix.
  • a standardization system according to the invention thus has the same advantages as have been described in detail with reference to the
  • FIG. 1 shows a flow chart for explaining a preferred embodiment of the present invention
  • FIG. 2 is a block diagram to illustrate a standardization system according to the invention.
  • Fig. 1 is a block diagram for explaining a normalization method for a dry blood matrix is shown.
  • a dry blood matrix is first provided in a preparation step S1, from which a first dry blood spot for the extraction of the analyte and a second dry blood spot for the extraction of hemoglobin are punched out.
  • a second step S2 the analyte is extracted from the first dry blood spot using an organic solvent and the hemoglobin is extracted from the second dry blood spot using an aqueous buffer.
  • the extracted analyte and the extracted hemoglobin are then quantitatively analyzed as part of measurements in a third step S3 based on a two-time selection of analyte-specific mass fragments generated in a mass spectrometer. In other words, an absolute amount of the respective substance is determined in each case.
  • peptide fragments of the hemoglobin are quantitatively analyzed and then a concentration of the peptide fragments in the second dry blood spot is determined, the concentration of the peptide fragments being used to infer the concentration of the hemoglobin in the second dry blood spot.
  • the hemoglobin is enzymatically cleaved by adding a peptidase for the quantitative analysis of the hemoglobin.
  • a concentration of the at least one analyte in the first dry blood spot and a concentration of the hemoglobin in the second dry blood spot are determined.
  • a subsequent fifth step S5 the evaluation results are used to derive the hematocrit of the second dry blood spot based on the determined hemoglobin concentration, and a normalization factor is calculated using the hematocrit to normalize the concentration of the analyte.
  • a plasma-equivalent concentration of the at least one analyte is also determined on the basis of the normalization factor.
  • FIG. 2 shows a normalization system 10 for the dry blood matrix which is configured to carry out a normalization method as described above.
  • the standardization system 10 has an extraction unit 11 for extracting at least one analyte from a first part of the dry blood matrix or the first dry blood spot and hemoglobin from a second part of the dry blood matrix or the second dry blood spot.
  • the standardization system has an analysis unit 12 for quantitative analysis of the at least one extracted analyte and the extracted hemoglobin and a determination unit 13 for Determining a concentration of the at least one analyte in the first part of the dry blood matrix and a concentration of the hemoglobin in the second part of the dry blood matrix.
  • the standardization system has a derivation unit 14 for deriving a hematocrit of the second part of the dry blood matrix based on the concentration of the hemoglobin and a computing unit 15 for calculating a standardization factor based on the determined hematocrit for normalizing a concentration of the at least one analyte in the first part of the dry blood matrix .
  • the invention permits further design principles. In other words, the invention should not be viewed as being limited to the embodiment shown in the figures.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Normierungsverfahren für eine Trockenblutmatrix, aufweisend die Schritte: Bereitstellen der Trockenblutmatrix, Extrahieren von wenigstens einem Analyten aus einem ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie von Hämoglobin aus einem zweiten Teil der Trockenblutmatrix, quantitatives Analysieren des wenigstens einen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins, Ermitteln einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix, Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Trockenblutmatrix anhand der Konzentration des Hämoglobins, und Berechnen eines Normierungsfaktors anhand des ermittelten Hämatokrits zur Normierung der Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix. Die Erfindung betrifft ferner eine Normierungsvorrichtung (10) zum Durchführen eines erfindungsgemäßen Verfahrens.

Description

Beschreibung
Normierungsverfahren und Normierungssystem für eine Trockenblutmatrix
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Norm ierungsverfahren sowie ein Normierungs system für eine Trockenblutmatrix zur normierten Bestimmung von wenigstens einem Analyten in der Trockenblutmatrix.
Die Routineanalytik klinisch relevanter Parameter erfolgt bislang in der Regel aus flüssigen Blutprobenmatrices in Form von Vollblut, Serum oder Plasma. Die Refe renzbereiche bzw. Normkonzentrationen fast aller klinischen Parameter sind dement sprechend auf flüssige Probenmatrices definiert. Da in den flüssigen Probenmatrices weiterhin alle Bedingungen und Komponenten vorhanden sind, die die Degradation von Analyten in vivo steuern und sicherstellen, müssen häufig aufwändige Maßnah men, beispielsweise in Form von Enzym blockade und/oder Kühlung ergriffen wer den, um diese Prozesse zu unterbinden und damit die korrekten Konzentrationen der Analyten im Labor bestimmen zu können. Die meisten Abbauprozesse sind zeitkri tisch und temperaturabhängig. Ausnahme bilden nur Stoffwechselendprodukte, die keine weitere enzymatische Degradation erfahren.
Das Neugeborenenscreening nimmt eine Sonderstellung in der Routine-Hochdurch- satzanalytik ein, da hierbei für die Analytik Trockenblut als Probenmatrix Verwen dung findet. Auf die Analytik aus Trockenblut ist man insbesondere deshalb angewie sen, da flüssiges Blut bei Neugeborenen nur in stark begrenzter Menge zur Verfü gung steht. Die T rockenblutanalytik im Neugeborenenscreening erfolgt aktuell in Kombination mit hochsensitiver Spezialanalytik.
Zur Generierung des benötigten Trockenbluts wird Vollblut auf spezielle, saugfähige Trägermaterialien appliziert. Die im Blut enthaltene Flüssigkeit wird aufgrund des Chromatographie-Effekts im Trägermaterial aufgenommen, wodurch das Blut inner halb kurzer Zeit getrocknet wird. Durch die Trocknung werden enzymatische Abbau prozesse unterbunden. Aufgrund der zum Teil planaren Dimension des Trockenblut- Trägermaterials kann ein Transport von Trockenblutproben auf einfache und güns tige Weise auf postalischem Wege erfolgen. Darüber hinaus ist Trockenblut nicht in fektiös und bedarf keiner speziellen Deklarierung.
Trotz der genannten Vorteile hat Trockenblut bisher keine weite Verbreitung in der klinischen Routineanalytik gefunden. Alle auf Vollblut als Probenmatrix basierenden T rockenblutanalysen weisen nämlich Schwankungen auf, durch welche es schwierig bis unmöglich ist, aussagekräftige Analyseergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus ist dadurch eine Vergleichbarkeit zu den etablierten Analysen aus flüssigen Proben matrices nicht möglich.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, der voranstehend beschriebenen Proble matik zumindest teilweise Rechnung zu tragen. Insbesondere ist es Aufgabe der vor liegenden Erfindung, ein verbessertes Normierungsverfahren sowie ein verbessertes Norm ierungssystem für eine Trockenblutmatrix zu schaffen.
Die voranstehende Aufgabe wird durch die Patentansprüche gelöst. Insbesondere wird die voranstehende Aufgabe durch das Norm ierungsverfahren gemäß Anspruch 1 sowie das Normierungssystem gemäß Anspruch 9 gelöst. Weitere Vorteile der Er findung ergeben sich aus den Unteransprüchen, der Beschreibung und den Zeich nungen. Dabei gelten Merkmale und Details, die im Zusammenhang mit dem Nor mierungsverfahren beschrieben sind, selbstverständlich auch im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Norm ierungssystem und jeweils umgekehrt, sodass bezüg lich der Offenbarung zu den einzelnen Erfindungsaspekten stets wechselseitig Bezug genommen wird bzw. werden kann.
Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Normierungsver fahren für eine Trockenblutmatrix zur Verfügung gestellt. Das Norm ierungsverfahren weist die folgenden Schritte auf:
Bereitstellen der Trockenblutmatrix,
Extrahieren von wenigstens einem Analyten aus einem ersten Teil der Trocken blutmatrix sowie von Hämoglobin aus einem zweiten Teil der Trockenblutmatrix, quantitatives Analysieren des wenigstens einen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins,
Ermitteln einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix,
Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Trockenblutmatrix anhand der Konzentration des Hämoglobins,
Berechnen eines Norm ierungsfaktors anhand des ermittelten Hämatokrits zur Normierung der Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix.
Das erfindungsgemäße Norm ierungsverfahren ist universell auf eine Vielzahl von kli nisch relevanten Analyten anwendbar. Ebenso lässt sich das Verfahren auf andere Spezies als den Menschen, insbesondere bei allen Vertebraten, anwenden. Mit Hilfe der Erfindung kann die Analytik aus Trockenblut als Probenmatrix dem Labormarkt eingehender und breiter verfügbar gemacht werden. Durch die flexible und grund sätzlich zeitunkritische Handhabbarkeit von T rockenblutmatrices können bisher ent stehende Logistikkosten stark reduziert werden.
Der erste Teil der Trockenblutmatrix und/oder der zweite Teil der Trockenblutmatrix können jeweils in Form eines Trockenblutspots durch ein manuelles oder automati sches Ausstanzens bereitgestellt werden. D.h., es können wenigstens ein erster Tro ckenblutspot für den Analyten und ein zweiterT rockenblutspot für das zu analysie rende Hämoglobin aus der Trockenblutmatrix herausgearbeitet, insbesondere ausge stanzt, werden. Der wenigstens eine erste Trockenblutspot und der zweite T rocken blutspot werden anschließend bevorzugt separat aufbereitet.
Erfindungsgemäß können mehrere Analyten aus dem wenigstens einen ersten Tro ckenblutspot bzw. aus dem ersten Teil der Trockenblutmatrix extrahiert werden, oder es kann jeweils ein Analyt aus mehreren Trockenblutspots bzw. entsprechenden Tei len der Trockenblutmatrix extrahiert werden. Das Hämoglobin wird bevorzugt durch einen wässrigen Puffer extrahiert. Unter ei nem quantitativen Analysieren ist vorliegend vorzugsweise eine quantitative Bestim mung und/oder eine entsprechende Messung zu verstehen. D.h., durch die quantita tive Analyse des wenigstens einen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hä moglobins wird die Menge der jeweiligen Substanz ermittelt. Die quantitative Analyse des Hämoglobins wird vorzugsweise mittels enzymatischer Fragmentisierung mas senspektrametrisch durchgeführt. Bei umfangreichen Versuchen im Rahmen der vor liegenden Erfindung hat sich herausgestellt, dass eine enzymatische Spaltung des Hämoglobins nicht zwangsweise erforderlich ist und in manchen Teilaspekten zu Nachteilen bei der Extraktion führen könnte. D.h., bei einer vorteilhaften, alternativen Extraktion kann auf eine enzymatische Spaltung des Hämoglobins verzichtet werden.
Die quantitative Analyse des Analyten und des Hämoglobins kann simultan oder se parat durchgeführt werden. Die hochsensitive Analytik wird vorzugsweise im Rahmen einer Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Massenspektromet- rie durchgeführt. Bei einer massenspektrometrischen Messung können Hämoglobin und/oder enzymatische Fragmente des Hämoglobins auch mittels MRM-Prozess (Multiple Reaction Monitoring) detektiert werden.
Durch das Ermitteln der Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie der Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix wird der Anteil der Substanz aus dem jeweiligen Teil der Trocken blutmatrix ermittelt. Anhand der Konzentration des Hämoglobins kann anschließend der Hämatokrit des zweiten Teils der Trockenblutmatrix abgeleitet werden. Die Ablei tung aus der Hämoglobinkonzentration erfolgt bevorzugt über einen linearen Zusam menhang zwischen der Hämoglobinkonzentration und dem Hämatokrit. Zur Konzent rationsbestimmung des wenigstens einen Analyten sowie des Hämoglobins kann eine Kalibrierungsfunktion genutzt werden, durch welche eine Fläche der Signale in eine Konzentration übersetzt werden kann. Das Ableiten des Hämatokrits kann an hand einer Translation der Hämoglobinkonzentration in Hämatokrit durchgeführt wer den.
Der Hämatokrit kann gemäß der Beziehung berechnet werden, wobei cHb für die Hämoglobinkonzentration steht.
Unter dem Extrahieren von Hämoglobin kann das Extrahieren von Hämoglobin und/oder Hämoglobinfragmenten verstanden werden. Entsprechend kann unter dem Ermitteln der Konzentration des Hämoglobins das Ermitteln der Konzentration des Hämoglobins und/oder das Ermitteln der Konzentration der Hämoglobinfragmente verstanden werden. Entsprechend können vorliegend unter Hämoglobin auch Hämo globinfragmente verstanden werden.
Der Normierungsfaktor kann berechnet und/oder anhand verschiedener Versuchsrei hen, durch welche empirisch eine angepasste mathematische Beziehung erstellt werden kann, ermittelt werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass zur quantitativen Analyse des Hämoglobins wenigstens ein Peptidfragment des Hämoglobins quantitativ analysiert wird und anschließend eine Konzentration des wenigstens einen Peptidfragments im zweiten Teil der Trockenblutmatrix ermittelt wird, wobei anhand der Konzentration des wenigstens einen Peptidfragments auf die Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix geschlossen wird. Dies ist insbesondere bei der gleichzeitigen Analyse von mehreren Analyten von Vorteil. D.h., werden mehrere Analyten gleichzeitig aus der Trockenblutmatrix extrahiert, können im Rahmen der quantitativen Analyse des Hämoglobins vorzugs weise simultan spezifische Peptidfragmente des Hämoglobins quantitativ bestimmt werden.
Weiterhin ist es möglich, dass bei einem Normierungsverfahren gemäß der vorlie genden Erfindung die quantitative Analyse des Hämoglobins oder des wenigstens ei nen Peptidfragments anhand einer mehrmaligen Selektion von in einem Massen spektrometer erzeugten analytenspezifischen Massenfragmenten durchgeführt wird. Dies kann auf vorteilhafte Weise unter Verwendung eines Quadrupol-Massenspekt- rometers im Rahmen eines MRM-Prozesses durchgeführt werden. Als besonders ef fizient hat es sich herausgestellt, wenn die quantitative Analyse des Hämoglobins o- der des wenigstens einen Peptidfragments anhand einer zweimaligen Selektion von in einem Massenspektrometer erzeugten analytenspezifischen Massenfragmenten durchgeführt wird.
Ferner ist es möglich, dass die quantitative Analyse des Hämoglobins oder des we nigstens einen Peptidfragments bei einem erfindungsgemäßen Norm ierungsverfah- ren anhand analytenspezifischer Masse-über-Ladung-Signale, m/z, durchgeführt wird. Hierbei wird das Hämoglobin und/oder das wenigstens eine Peptidfragment an hand einer Massenspektrometrie auf vorteilhafte Weise nicht nach der Masse allein, sondern anhand eines Masse/Ladung-Verhältnisses selektiert. Damit können beson ders genaue Analyseergebnisse erzielt werden.
Von weiterem Vorteil kann es sein, wenn bei einem erfindungsgemäßen Normie rungsverfahren für die quantitative Analyse des Hämoglobins das Hämoglobin durch Zusatz einer Peptidase enzymatisch gespaltet wird. Damit konnten aussagekräftige Analysewerte generiert werden, welche eine vorteilhafte Basis für die Weiterentwick lung hinsichtlich des gewünschten Norm ierungsfaktors bilden.
Gemäß einer weiteren Ausgestaltungsvariante der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass bei einem Normierungsverfahren anhand des Normierungsfaktors eine plasmaäquivalente Konzentration des wenigstens einen Analyten ermittelt wird. Un ter der plasmaäquivalenten Konzentration des wenigstens einen Analyten ist eine Konzentration zu verstehen, die analog zu einer konventionellen Plasma- und/oder Serumskonzentration eines Analyten aus einer Plasma- und/oder Serumsprobe ist. D.h., der ermittelte Normierungsfaktor kann der Normierung der Analytenkonzentra- tion in der Trockenblutprobe sowie der Berechnung einer der bisherig etablierten, Plasma- und/oder Serumskonzentration analogen Konzentrationsangabe, also einer plasmaäquivalente Konzentration, dienen. Durch die entsprechende Hämatokrit-Nor mierung der Analytenkonzentration sind quantitative Analysen aus Trockenblutmatri ces und aus flüssigen Probenmatrices direkt miteinander vergleichbar. Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ergibt sich, wenn bei einem Normie rungsverfahren der wenigstens eine Analyt mittels einer Extraktionsflüssigkeit aus der Trockenblutmatrix extrahiert wird. Damit kann der Analyt auf einfache und zuver lässige Weise aus der Trockenblutmatrix extrahiert werden. Bevorzugt wird der we nigstens eine Analyt mittels Rehydration aus der Trockenblutmatrix extrahiert. Ferner hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn der wenigstens eine Analyt unter Ver wendung einer organischen oder teil-organischen Flüssigkeit, ohne oder mit gerin gem Wasseranteil von beispielsweise weniger als 10% Gewichtsanteil, aus der Tro ckenblutmatrix extrahiert wird. Bei Versuchen im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich außerdem überraschend herausgestellt, dass der wenigstens eine Analyt auf vorteilhafte Weise auch mittels elektromagnetischer Strahlung aus der Trockenblut matrix extrahiert werden kann. Hierbei kann der wenigstens eine extrahierte Analyt anschließend für die weitere Verwendung, insbesondere für die anschließende quan titative Analyse, in eine Gasphase überführt werden.
Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Normierungssys tem für eine Trockenblutmatrix zur Verfügung gestellt. Das Norm ierungssystem um fasst die folgenden Komponenten: eine Extraktionseinheit zum Extrahieren von wenigstens einem Analyten aus ei nem ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie von Hämoglobin aus einem zwei ten Teil der Trockenblutmatrix, eine Analyseeinheit zum quantitativen Analysieren des wenigstens einen extra hierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins, eine Ermittlungseinheit zum Ermitteln einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix, eine Ableiteinheit zum Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Tro ckenblutmatrix anhand der Konzentration des Hämoglobins, und eine Recheneinheit zum Berechnen eines Normierungsfaktors anhand des er mittelten Hämatokrits zur Normierung einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix. Damit bringt ein erfindungsgemäßes Norm ierungssystem die gleichen Vorteile mit sich, wie sie ausführlich mit Bezug auf das erfindungsgemäße Normierungsverfahren beschrieben worden sind. Das Norm ierungssystem kann ferner zum Berechnen ei nes Norm ierungsfaktors gemäß einem wie vorstehend im Detail beschriebenen Nor mierungsverfahren konfiguriert sein.
Weitere, die Erfindung verbessernde Maßnahmen ergeben sich aus der nachfolgen den Beschreibung zu verschiedenen Ausführungsbeispielen der Erfindung, welche in den Figuren schematisch dargestellt sind. Sämtliche aus den Ansprüchen, der Be schreibung oder der Zeichnung hervorgehende Merkmale und/oder Vorteile, ein schließlich konstruktiver Einzelheiten und räumlicher Anordnungen können sowohl für sich als auch in den verschiedenen Kombinationen erfindungswesentlich sein.
Es zeigen jeweils schematisch:
Figur 1 eine Flussdiagramm zum Erläutern einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, und
Figur 2 ein Blockschaltbild zum Darstellen eines erfindungsgemäßen Normie rungssystems.
In Fig. 1 ist ein Blockschaltbild zum Erläutern eines Norm ierungsverfahrens für eine Trockenblutmatrix dargestellt. Gemäß der dargestellten Ausführungsform wird in ei nem Vorbereitungsschritt S1 zunächst eine Trockenblutmatrix bereitgestellt, aus wel cher ein erster Trockenblutspot für die Extraktion des Analyten sowie ein zweiter Tro ckenblutspot für die Extraktion von Hämoglobin ausgestanzt werden.
In einem zweiten Schritt S2 werden der Analyt mittels organischem Lösungsmittel aus dem ersten Trockenblutspot und das Hämoglobin mittels wässrigem Puffer aus dem zweiten Trockenblutspot extrahiert. Anschließend werden im Rahmen von Messungen in einem dritten Schritt S3 der extrahierte Analyt sowie das extrahierte Hämoglobin anhand einer zweimaligen Se lektion von in einem Massenspektrometer erzeugten analytenspezifischen Massen fragmenten quantitativ analysiert. D.h., es wird jeweils eine absolute Menge der je weiligen Substanz ermittelt. Zur quantitativen Analyse des Hämoglobins werden Pep tidfragmente des Hämoglobins quantitativ analysiert und anschließend eine Konzent ration der Peptidfragmente im zweiten Trockenblutspot ermittelt, wobei anhand der Konzentration der Peptidfragmente auf die Konzentration des Hämoglobins im zwei ten Trockenblutspot geschlossen wird. Darüber hinaus wird für die quantitative Ana lyse des Hämoglobins das Hämoglobin durch Zusatz einer Peptidase enzymatisch gespaltet.
In einem weiteren Schritt S4 werden die gemessenen Daten bzw. die Analyseergeb nisse ausgewertet. Insbesondere werden eine Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Trockenblutspot sowie eine Konzentration des Hämoglobins im zweiten Trockenblutspot ermittelt.
In einem daran anschließenden fünften Schritt S5 werden anhand der Auswertungs ergebnisse der Hämatokrit des zweiten Trockenblutspots auf Basis der ermittelten Hämoglobinkonzentration hergeleitet sowie ein Normierungsfaktor anhand des Hä matokrits zur Normierung der Konzentration des Analyten berechnet. Im Rahmen der Translation wird anhand des Normierungsfaktors außerdem eine plasmaäquivalente Konzentration des wenigstens einen Analyten ermittelt.
Fig. 2 zeigt ein Normierungssystem 10 für die Trockenblutmatrix, das zum Durchfüh ren eines wie vorstehend beschriebenen Norm ierungsverfahrens konfiguriert ist. Das Norm ierungssystem 10 weist eine Extraktionseinheit 11 zum Extrahieren von wenigs tens einem Analyten aus einem ersten Teil der Trockenblutmatrix bzw. dem ersten Trockenblutspot sowie von Hämoglobin aus einem zweiten Teil der Trockenblutmat rix bzw. dem zweiten Trockenblutspot auf. Ferner weist das Norm ierungssystem eine Analyseeinheit 12 zum quantitativen Analysieren des wenigstens einen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins und eine Ermittlungseinheit 13 zum Ermitteln einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Tro ckenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Tro ckenblutmatrix auf. Darüber hinaus weist das Norm ierungssystem eine Ableiteinheit 14 zum Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Trockenblutmatrix anhand der Konzentration des Hämoglobins sowie eine Recheneinheit 15 zum Berechnen ei nes Norm ierungsfaktors anhand des ermittelten Hämatokrits zur Normierung einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix.
Die Erfindung lässt neben den dargestellten Ausführungsformen weitere Gestal- tungsgrundsätze zu. D.h., die Erfindung soll nicht auf die in den Figuren dargestellten Ausführungsform beschränkt betrachtet werden.
Bezugszeichenliste
10 Norm ierungssystem
11 Extraktionseinheit
12 Analyseeinheit
13 Ermittlungseinheit
14 Ableiteinheit
15 Recheneinheit

Claims

Patentansprüche
1. Norm ierungsverfahren für eine Trockenblutmatrix, aufweisend die Schritte:
Bereitstellen der Trockenblutmatrix,
Extrahieren von wenigstens einem Analyten aus einem ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie von Hämoglobin aus einem zweiten Teil der Tro ckenblutmatrix, quantitatives Analysieren des wenigstens einen extrahierten Analyten so wie des extrahierten Hämoglobins,
Ermitteln einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix,
Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Trockenblutmatrix an hand der Konzentration des Hämoglobins, und
Berechnen eines Norm ierungsfaktors anhand des ermittelten Hämatokrits zur Normierung der Konzentration des wenigstens einen Analyten im ers ten Teil der Trockenblutmatrix.
2. Norm ierungsverfahren nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass zur quantitativen Analyse des Hämoglobins wenigstens ein Peptidfragment des Hämoglobins quantitativ analysiert wird und anschließend eine Konzentration des wenigstens einen Peptidfragments im zweiten Teil der Trockenblutmatrix ermittelt wird, wobei anhand der Konzentration des wenigstens einen Peptid fragments auf die Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trocken blutmatrix geschlossen wird.
3. Norm ierungsverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Analyse des Hämoglobins oder des wenigstens einen Peptid fragments anhand einer mehrmaligen Selektion von in einem Massenspektro meter erzeugten analytenspezifischen Massenfragmenten durchgeführt wird.
4. Norm ierungsverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die quantitative Analyse des Hämoglobins oder des wenigstens einen Peptid fragments anhand analytenspezifischer Masse-über-Ladung-Signale, m/z, durchgeführt wird.
5. Norm ierungsverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die quantitative Analyse des Hämoglobins das Hämoglobin durch Zusatz ei ner Peptidase enzymatisch gespaltet wird.
6. Norm ierungsverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass anhand des Normierungsfaktors eine plasmaäquivalente Konzentration des we nigstens einen Analyten ermittelt wird.
7. Norm ierungsverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Analyt mittels einer Extraktionsflüssigkeit aus der Trocken blutmatrix extrahiert wird.
8. Norm ierungsverfahren nach einem der voranstehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der wenigstens eine Analyt unter Verwendung eines organischen Lösungsmit tels aus der Trockenblutmatrix extrahiert wird.
9. Norm ierungssystem (10) für eine Trockenblutmatrix, aufweisend eine Extraktionseinheit (11 ) zum Extrahieren von wenigstens einem Analy ten aus einem ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie von Hämoglobin aus einem zweiten Teil der Trockenblutmatrix, eine Analyseeinheit (12) zum quantitativen Analysieren des wenigstens ei nen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins, eine Ermittlungseinheit (13) zum Ermitteln einer Konzentration des we nigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix, eine Ableiteinheit (14) zum Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Trockenblutmatrix anhand der Konzentration des Hämoglobins, und eine Recheneinheit (15) zum Berechnen eines Normierungsfaktors an hand des ermittelten Hämatokrits zur Normierung einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix.
10. Norm ierungssystem nach Anspruch 9, das zum Berechnen eines Normierungs faktors gemäß einem Norm ierungsverfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 8 konfiguriert ist.
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