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Die vorliegende Erfindung betrifft ein Normierungsverfahren sowie ein Normierungssystem für eine Trockenblutmatrix zur normierten Bestimmung von wenigstens einem Analyten in der Trockenblutmatrix.
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Die Routineanalytik klinisch relevanter Parameter erfolgt bislang in der Regel aus flüssigen Blutprobenmatrices in Form von Vollblut, Serum oder Plasma. Die Referenzbereiche bzw. Normkonzentrationen fast aller klinischen Parameter sind dementsprechend auf flüssige Probenmatrices definiert. Da in den flüssigen Probenmatrices weiterhin alle Bedingungen und Komponenten vorhanden sind, die die Degradation von Analyten in vivo steuern und sicherstellen, müssen häufig aufwändige Maßnahmen, beispielsweise in Form von Enzymblockade und/oder Kühlung ergriffen werden, um diese Prozesse zu unterbinden und damit die korrekten Konzentrationen der Analyten im Labor bestimmen zu können. Die meisten Abbauprozesse sind zeitkritisch und temperaturabhängig. Ausnahme bilden nur Stoffwechselendprodukte, die keine weitere enzymatische Degradation erfahren.
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Das Neugeborenenscreening nimmt eine Sonderstellung in der Routine-Hochdurchsatzanalytik ein, da hierbei für die Analytik Trockenblut als Probenmatrix Verwendung findet. Auf die Analytik aus Trockenblut ist man insbesondere deshalb angewiesen, da flüssiges Blut bei Neugeborenen nur in stark begrenzter Menge zur Verfügung steht. Die Trockenblutanalytik im Neugeborenenscreening erfolgt aktuell in Kombination mit hochsensitiver Spezialanalytik.
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Zur Generierung des benötigten Trockenbluts wird Vollblut auf spezielle, saugfähige Trägermaterialien appliziert. Die im Blut enthaltene Flüssigkeit wird aufgrund des Chromatographie-Effekts im Trägermaterial aufgenommen, wodurch das Blut innerhalb kurzer Zeit getrocknet wird. Durch die Trocknung werden enzymatische Abbauprozesse unterbunden. Aufgrund der zum Teil planaren Dimension des Trockenblut-Trägermaterials kann ein Transport von Trockenblutproben auf einfache und günstige Weise auf postalischem Wege erfolgen. Darüber hinaus ist Trockenblut nicht infektiös und bedarf keiner speziellen Deklarierung.
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Trotz der genannten Vorteile hat Trockenblut bisher keine weite Verbreitung in der klinischen Routineanalytik gefunden. Alle auf Vollblut als Probenmatrix basierenden Trockenblutanalysen weisen nämlich Schwankungen auf, durch welche es schwierig bis unmöglich ist, aussagekräftige Analyseergebnisse zu erzielen. Darüber hinaus ist dadurch eine Vergleichbarkeit zu den etablierten Analysen aus flüssigen Probenmatrices nicht möglich.
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Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, der voranstehend beschriebenen Problematik zumindest teilweise Rechnung zu tragen. Insbesondere ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Normierungsverfahren sowie ein verbessertes Normierungssystem für eine Trockenblutmatrix zu schaffen.
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Die voranstehende Aufgabe wird durch die Patentansprüche gelöst. Insbesondere wird die voranstehende Aufgabe durch das Normierungsverfahren gemäß Anspruch 1 sowie das Normierungssystem gemäß Anspruch 9 gelöst. Weitere Vorteile der Erfindung ergeben sich aus den Unteransprüchen, der Beschreibung und den Zeichnungen. Dabei gelten Merkmale und Details, die im Zusammenhang mit dem Normierungsverfahren beschrieben sind, selbstverständlich auch im Zusammenhang mit dem erfindungsgemäßen Normierungssystem und jeweils umgekehrt, sodass bezüglich der Offenbarung zu den einzelnen Erfindungsaspekten stets wechselseitig Bezug genommen wird bzw. werden kann.
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Gemäß einem ersten Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Normierungsverfahren für eine Trockenblutmatrix zur Verfügung gestellt. Das Normierungsverfahren weist die folgenden Schritte auf:
- - Bereitstellen der Trockenblutmatrix,
- - Extrahieren von wenigstens einem Analyten aus einem ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie von Hämoglobin aus einem zweiten Teil der Trockenblutmatrix,
- - quantitatives Analysieren des wenigstens einen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins,
- - Ermitteln einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix,
- - Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Trockenblutmatrix anhand der Konzentration des Hämoglobins,
- - Berechnen eines Normierungsfaktors anhand des ermittelten Hämatokrits zur Normierung der Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix.
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Das erfindungsgemäße Normierungsverfahren ist universell auf eine Vielzahl von klinisch relevanten Analyten anwendbar. Ebenso lässt sich das Verfahren auf andere Spezies als den Menschen, insbesondere bei allen Vertebraten, anwenden. Mit Hilfe der Erfindung kann die Analytik aus Trockenblut als Probenmatrix dem Labormarkt eingehender und breiter verfügbar gemacht werden. Durch die flexible und grundsätzlich zeitunkritische Handhabbarkeit von Trockenblutmatrices können bisher entstehende Logistikkosten stark reduziert werden.
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Der erste Teil der Trockenblutmatrix und/oder der zweite Teil der Trockenblutmatrix können jeweils in Form eines Trockenblutspots durch ein manuelles oder automatisches Ausstanzens bereitgestellt werden. D.h., es können wenigstens ein erster Trockenblutspot für den Analyten und ein zweiterTrockenblutspot für das zu analysierende Hämoglobin aus der Trockenblutmatrix herausgearbeitet, insbesondere ausgestanzt, werden. Der wenigstens eine erste Trockenblutspot und der zweite Trockenblutspot werden anschließend bevorzugt separat aufbereitet.
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Erfindungsgemäß können mehrere Analyten aus dem wenigstens einen ersten Trockenblutspot bzw. aus dem ersten Teil der Trockenblutmatrix extrahiert werden, oder es kann jeweils ein Analyt aus mehreren Trockenblutspots bzw. entsprechenden Teilen der Trockenblutmatrix extrahiert werden.
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Das Hämoglobin wird bevorzugt durch einen wässrigen Puffer extrahiert. Unter einem quantitativen Analysieren ist vorliegend vorzugsweise eine quantitative Bestimmung und/oder eine entsprechende Messung zu verstehen. D.h., durch die quantitative Analyse des wenigstens einen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins wird die Menge der jeweiligen Substanz ermittelt. Die quantitative Analyse des Hämoglobins wird vorzugsweise mittels enzymatischer Fragmentisierung massenspektrometrisch durchgeführt. Bei umfangreichen Versuchen im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich herausgestellt, dass eine enzymatische Spaltung des Hämoglobins nicht zwangsweise erforderlich ist und in manchen Teilaspekten zu Nachteilen bei der Extraktion führen könnte. D.h., bei einer vorteilhaften, alternativen Extraktion kann auf eine enzymatische Spaltung des Hämoglobins verzichtet werden.
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Die quantitative Analyse des Analyten und des Hämoglobins kann simultan oder separat durchgeführt werden. Die hochsensitive Analytik wird vorzugsweise im Rahmen einer Analyse mittels Flüssigkeitschromatographie-Elektrospray-Massenspektrometrie durchgeführt. Bei einer massenspektrometrischen Messung können Hämoglobin und/oder enzymatische Fragmente des Hämoglobins auch mittels MRM-Prozess (Multiple Reaction Monitoring) detektiert werden.
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Durch das Ermitteln der Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie der Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix wird der Anteil der Substanz aus dem jeweiligen Teil der Trockenblutmatrix ermittelt. Anhand der Konzentration des Hämoglobins kann anschließend der Hämatokrit des zweiten Teils der Trockenblutmatrix abgeleitet werden. Die Ableitung aus der Hämoglobinkonzentration erfolgt bevorzugt über einen linearen Zusammenhang zwischen der Hämoglobinkonzentration und dem Hämatokrit. Zur Konzentrationsbestimmung des wenigstens einen Analyten sowie des Hämoglobins kann eine Kalibrierungsfunktion genutzt werden, durch welche eine Fläche der Signale in eine Konzentration übersetzt werden kann. Das Ableiten des Hämatokrits kann anhand einer Translation der Hämoglobinkonzentration in Hämatokrit durchgeführt werden.
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Der Hämatokrit kann gemäß der Beziehung
berechnet werden, wobei cHb für die Hämoglobinkonzentration steht.
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Unter dem Extrahieren von Hämoglobin kann das Extrahieren von Hämoglobin und/oder Hämoglobinfragmenten verstanden werden. Entsprechend kann unter dem Ermitteln der Konzentration des Hämoglobins das Ermitteln der Konzentration des Hämoglobins und/oder das Ermitteln der Konzentration der Hämoglobinfragmente verstanden werden. Entsprechend können vorliegend unter Hämoglobin auch Hämoglobinfragmente verstanden werden.
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Der Normierungsfaktor kann berechnet und/oder anhand verschiedener Versuchsreihen, durch welche empirisch eine angepasste mathematische Beziehung erstellt werden kann, ermittelt werden.
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Gemäß einer weiteren Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass zur quantitativen Analyse des Hämoglobins wenigstens ein Peptidfragment des Hämoglobins quantitativ analysiert wird und anschließend eine Konzentration des wenigstens einen Peptidfragments im zweiten Teil der Trockenblutmatrix ermittelt wird, wobei anhand der Konzentration des wenigstens einen Peptidfragments auf die Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix geschlossen wird. Dies ist insbesondere bei der gleichzeitigen Analyse von mehreren Analyten von Vorteil. D.h., werden mehrere Analyten gleichzeitig aus der Trockenblutmatrix extrahiert, können im Rahmen der quantitativen Analyse des Hämoglobins vorzugsweise simultan spezifische Peptidfragmente des Hämoglobins quantitativ bestimmt werden.
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Weiterhin ist es möglich, dass bei einem Normierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung die quantitative Analyse des Hämoglobins oder des wenigstens einen Peptidfragments anhand einer mehrmaligen Selektion von in einem Massenspektrometer erzeugten analytenspezifischen Massenfragmenten durchgeführt wird.
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Dies kann auf vorteilhafte Weise unter Verwendung eines Quadrupol-Massenspektrometers im Rahmen eines MRM-Prozesses durchgeführt werden. Als besonders effizient hat es sich herausgestellt, wenn die quantitative Analyse des Hämoglobins oder des wenigstens einen Peptidfragments anhand einer zweimaligen Selektion von in einem Massenspektrometer erzeugten analytenspezifischen Massenfragmenten durchgeführt wird.
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Ferner ist es möglich, dass die quantitative Analyse des Hämoglobins oder des wenigstens einen Peptidfragments bei einem erfindungsgemäßen Normierungsverfahren anhand analytenspezifischer Masse-über-Ladung-Signale, m/z, durchgeführt wird. Hierbei wird das Hämoglobin und/oder das wenigstens eine Peptidfragment anhand einer Massenspektrometrie auf vorteilhafte Weise nicht nach der Masse allein, sondern anhand eines Masse/Ladung-Verhältnisses selektiert. Damit können besonders genaue Analyseergebnisse erzielt werden.
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Von weiterem Vorteil kann es sein, wenn bei einem erfindungsgemäßen Normierungsverfahren für die quantitative Analyse des Hämoglobins das Hämoglobin durch Zusatz einer Peptidase enzymatisch gespaltet wird. Damit konnten aussagekräftige Analysewerte generiert werden, welche eine vorteilhafte Basis für die Weiterentwicklung hinsichtlich des gewünschten Normierungsfaktors bilden.
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Gemäß einer weiteren Ausgestaltungsvariante der vorliegenden Erfindung ist es möglich, dass bei einem Normierungsverfahren anhand des Normierungsfaktors eine plasmaäquivalente Konzentration des wenigstens einen Analyten ermittelt wird. Unter der plasmaäquivalenten Konzentration des wenigstens einen Analyten ist eine Konzentration zu verstehen, die analog zu einer konventionellen Plasma- und/oder Serumskonzentration eines Analyten aus einer Plasma- und/oder Serumsprobe ist. D.h., der ermittelte Normierungsfaktor kann der Normierung der Analytenkonzentration in der Trockenblutprobe sowie der Berechnung einer der bisherig etablierten, Plasma- und/oder Serumskonzentration analogen Konzentrationsangabe, also einer plasmaäquivalente Konzentration, dienen. Durch die entsprechende Hämatokrit-Normierung der Analytenkonzentration sind quantitative Analysen aus Trockenblutmatrices und aus flüssigen Probenmatrices direkt miteinander vergleichbar.
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Ein weiterer Vorteil der vorliegenden Erfindung ergibt sich, wenn bei einem Normierungsverfahren der wenigstens eine Analyt mittels einer Extraktionsflüssigkeit aus der Trockenblutmatrix extrahiert wird. Damit kann der Analyt auf einfache und zuverlässige Weise aus der Trockenblutmatrix extrahiert werden. Bevorzugt wird der wenigstens eine Analyt mittels Rehydration aus der Trockenblutmatrix extrahiert. Ferner hat es sich als vorteilhaft herausgestellt, wenn der wenigstens eine Analyt unter Verwendung einer organischen oder teil-organischen Flüssigkeit, ohne oder mit geringem Wasseranteil von beispielsweise weniger als 10% Gewichtsanteil, aus der Trockenblutmatrix extrahiert wird. Bei Versuchen im Rahmen der vorliegenden Erfindung hat sich außerdem überraschend herausgestellt, dass der wenigstens eine Analyt auf vorteilhafte Weise auch mittels elektromagnetischer Strahlung aus der Trockenblutmatrix extrahiert werden kann. Hierbei kann der wenigstens eine extrahierte Analyt anschließend für die weitere Verwendung, insbesondere für die anschließende quantitative Analyse, in eine Gasphase überführt werden.
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Gemäß einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Normierungssystem für eine Trockenblutmatrix zur Verfügung gestellt. Das Normierungssystem umfasst die folgenden Komponenten:
- - eine Extraktionseinheit zum Extrahieren von wenigstens einem Analyten aus einem ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie von Hämoglobin aus einem zweiten Teil der Trockenblutmatrix,
- - eine Analyseeinheit zum quantitativen Analysieren des wenigstens einen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins,
- - eine Ermittlungseinheit zum Ermitteln einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix,
- - eine Ableiteinheit zum Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Trockenblutmatrix anhand der Konzentration des Hämoglobins, und
- - eine Recheneinheit zum Berechnen eines Normierungsfaktors anhand des ermittelten Hämatokrits zur Normierung einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix.
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Damit bringt ein erfindungsgemäßes Normierungssystem die gleichen Vorteile mit sich, wie sie ausführlich mit Bezug auf das erfindungsgemäße Normierungsverfahren beschrieben worden sind. Das Normierungssystem kann ferner zum Berechnen eines Normierungsfaktors gemäß einem wie vorstehend im Detail beschriebenen Normierungsverfahren konfiguriert sein.
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Weitere, die Erfindung verbessernde Maßnahmen ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung zu verschiedenen Ausführungsbeispielen der Erfindung, welche in den Figuren schematisch dargestellt sind. Sämtliche aus den Ansprüchen, der Beschreibung oder der Zeichnung hervorgehende Merkmale und/oder Vorteile, einschließlich konstruktiver Einzelheiten und räumlicher Anordnungen können sowohl für sich als auch in den verschiedenen Kombinationen erfindungswesentlich sein.
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Es zeigen jeweils schematisch:
- 1 eine Flussdiagramm zum Erläutern einer bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung, und
- 2 ein Blockschaltbild zum Darstellen eines erfindungsgemäßen Normierungssystems.
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In 1 ist ein Blockschaltbild zum Erläutern eines Normierungsverfahrens für eine Trockenblutmatrix dargestellt. Gemäß der dargestellten Ausführungsform wird in einem Vorbereitungsschritt S1 zunächst eine Trockenblutmatrix bereitgestellt, aus welcher ein erster Trockenblutspot für die Extraktion des Analyten sowie ein zweiter Trockenblutspot für die Extraktion von Hämoglobin ausgestanzt werden.
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In einem zweiten Schritt S2 werden der Analyt mittels organischem Lösungsmittel aus dem ersten Trockenblutspot und das Hämoglobin mittels wässrigem Puffer aus dem zweiten Trockenblutspot extrahiert.
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Anschließend werden im Rahmen von Messungen in einem dritten Schritt S3 der extrahierte Analyt sowie das extrahierte Hämoglobin anhand einer zweimaligen Selektion von in einem Massenspektrometer erzeugten analytenspezifischen Massenfragmenten quantitativ analysiert. D.h., es wird jeweils eine absolute Menge der jeweiligen Substanz ermittelt. Zur quantitativen Analyse des Hämoglobins werden Peptidfragmente des Hämoglobins quantitativ analysiert und anschließend eine Konzentration der Peptidfragmente im zweiten Trockenblutspot ermittelt, wobei anhand der Konzentration der Peptidfragmente auf die Konzentration des Hämoglobins im zweiten Trockenblutspot geschlossen wird. Darüber hinaus wird für die quantitative Analyse des Hämoglobins das Hämoglobin durch Zusatz einer Peptidase enzymatisch gespaltet.
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In einem weiteren Schritt S4 werden die gemessenen Daten bzw. die Analyseergebnisse ausgewertet. Insbesondere werden eine Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Trockenblutspot sowie eine Konzentration des Hämoglobins im zweiten Trockenblutspot ermittelt.
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In einem daran anschließenden fünften Schritt S5 werden anhand der Auswertungsergebnisse der Hämatokrit des zweiten Trockenblutspots auf Basis der ermittelten Hämoglobinkonzentration hergeleitet sowie ein Normierungsfaktor anhand des Hämatokrits zur Normierung der Konzentration des Analyten berechnet. Im Rahmen der Translation wird anhand des Normierungsfaktors außerdem eine plasmaäquivalente Konzentration des wenigstens einen Analyten ermittelt.
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2 zeigt ein Normierungssystem 10 für die Trockenblutmatrix, das zum Durchführen eines wie vorstehend beschriebenen Normierungsverfahrens konfiguriert ist. Das Normierungssystem 10 weist eine Extraktionseinheit 11 zum Extrahieren von wenigstens einem Analyten aus einem ersten Teil der Trockenblutmatrix bzw. dem ersten Trockenblutspot sowie von Hämoglobin aus einem zweiten Teil der Trockenblutmatrix bzw. dem zweiten Trockenblutspot auf. Ferner weist das Normierungssystem eine Analyseeinheit 12 zum quantitativen Analysieren des wenigstens einen extrahierten Analyten sowie des extrahierten Hämoglobins und eine Ermittlungseinheit 13 zum Ermitteln einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix sowie einer Konzentration des Hämoglobins im zweiten Teil der Trockenblutmatrix auf. Darüber hinaus weist das Normierungssystem eine Ableiteinheit 14 zum Ableiten eines Hämatokrits des zweiten Teils der Trockenblutmatrix anhand der Konzentration des Hämoglobins sowie eine Recheneinheit 15 zum Berechnen eines Normierungsfaktors anhand des ermittelten Hämatokrits zur Normierung einer Konzentration des wenigstens einen Analyten im ersten Teil der Trockenblutmatrix.
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Die Erfindung lässt neben den dargestellten Ausführungsformen weitere Gestaltungsgrundsätze zu. D.h., die Erfindung soll nicht auf die in den Figuren dargestellten Ausführungsform beschränkt betrachtet werden.
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Bezugszeichenliste
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- 10
- Normierungssystem
- 11
- Extraktionseinheit
- 12
- Analyseeinheit
- 13
- Ermittlungseinheit
- 14
- Ableiteinheit
- 15
- Recheneinheit
