EP4028773A1 - Verfahren zur durchmusterung porenbildender membranproteine, membrantransporter und molekularer schalter - Google Patents

Verfahren zur durchmusterung porenbildender membranproteine, membrantransporter und molekularer schalter

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Publication number
EP4028773A1
EP4028773A1 EP20772252.1A EP20772252A EP4028773A1 EP 4028773 A1 EP4028773 A1 EP 4028773A1 EP 20772252 A EP20772252 A EP 20772252A EP 4028773 A1 EP4028773 A1 EP 4028773A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
membrane
cell
seq
pore
protein
Prior art date
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Pending
Application number
EP20772252.1A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Viktor STEIN
Wadim Weber
Markus Roeder
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Technische Universitaet Darmstadt
Original Assignee
Technische Universitaet Darmstadt
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Technische Universitaet Darmstadt filed Critical Technische Universitaet Darmstadt
Publication of EP4028773A1 publication Critical patent/EP4028773A1/de
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C40—COMBINATORIAL TECHNOLOGY
    • C40B—COMBINATORIAL CHEMISTRY; LIBRARIES, e.g. CHEMICAL LIBRARIES
    • C40B30/00—Methods of screening libraries
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/68—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving proteins, peptides or amino acids
    • G01N33/6872—Intracellular protein regulatory factors and their receptors, e.g. including ion channels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/4727—Calcium binding proteins, e.g. calmodulin

Definitions

  • the present invention relates to a method for screening pore-forming membrane proteins, membrane transporters and molecular switches.
  • the invention also relates to a kit for carrying out the method.
  • Growth-dependent screening methods are based on the intrinsic toxicity of (protein) nanopores: Specifically, pore-forming membrane peptides and proteins depolarize the membrane potential and thus prevent growth.
  • growth assays have been used successfully, for example, to characterize pore-forming properties of individual membrane peptides (ACS Chemical Biology, 2016,
  • Liposome Display refers to an artificial cell-based screening process.
  • a first step artificial cells surrounded by phospholipid bilayers are created using a water-in-oil emulsion and centrifugation through a phospholipid bilayer.
  • in-vitro proteins build themselves into the membrane autonomously.
  • the formation or opening of nanopores is investigated with the addition of a dye which, depending on the (protein) nanopore, diffuses into the interior of the artificial cell and remains there for one day through covalent conjugation (PNAS, 2013, 110, 16796- 801; Nature Protocols, 2014, 9, 1578-91).
  • screening systems could be visualized with both voltage-dependent membrane dyes such as DiSC3 (5) or membrane-impermeable DNA-binding dyes such as propidium iodide.
  • imaging substances e.g. MRI-active reporter molecules
  • a screening method was developed to determine the structural and functional properties of a (protein) nanopore (e.g. formation or opening), preferably with promiscuous permeability, combinatorially in different screening formats (e.g. in microtiter plates, by colony patterning and by means of flow cytometry), preferably on average - to be measured and selected up to a high throughput of 10 2 -10 8.
  • a reporter substance flowing into a cell; Inflow of the reporter substance is in turn converted into a biophysical signal (eg fluorescence, bioluminescence or absorption) by means of a genetically encoded sensor protein and thus made visible.
  • the method can also be used to screen either membrane transporters with specific permeabilities or molecular sensors / switches.
  • the former includes the detection of a specific sensor that detects the inflow or outflow of a certain metabolic product.
  • By forming unspecific pores (especially in the inner membrane of E. coli), the latter enables the inflow or outflow of a specific metabolic product and thus a positive-negative selection strategy at the level of individual cells with a very high throughput using flow cytometry.
  • a screening method comprising the following steps: a) providing a cell and a medium surrounding the cell,
  • the cell has a cell membrane which is impermeable to a reporter substance
  • the quotient of the concentration of the reporter substance inside the cell and the concentration of the reporter substance in the medium surrounding the cell is at least 2 or at most 0.5; b) detecting a signal dependent on the concentration of the reporter substance in the cell, which signal is generated with the aid of a sensor protein expressed in the cell; c) inducing the expression of a membrane protein which increases the permeability of the cell membrane for the reporter substance; d) detecting the signal dependent on the concentration of the reporter substance in the cell, which signal is generated with the aid of the sensor protein expressed in the cell; e) Calculation of one or more comparison parameters from the signal strengths detected in steps b) and d), step b) being carried out before step c) and step d) being carried out after step c), steps a) to e) be carried out for at least two membrane proteins with different amino acid sequences and / or for at least two sensor proteins with different amino acid sequences.
  • the screening method of the present invention can be carried out in a variety of formats.
  • the method is preferably carried out in microtiter plates, by colony patterning and / or by means of flow cytometry.
  • the method is particularly preferably carried out by means of microfluidics, in particular with the aid of single cell measurements, in particular dynamic single cell measurements.
  • This enables light has a particularly high temporal resolution.
  • Microfluidic methods enable high-resolution functional studies, especially in combination with optical measurement methods such as those based on fluorescence.
  • Microfluidic processes offer a number of technical advantages such as miniaturization of bioanalytical processes (Journal of Laboratory Automation, 2013, 18, 350-66), time-resolved dynamic studies of microorganisms on the single cell level in a microfluidic cultivation chamber (see examples in the respective review articles Journal of Molecular Biology, 431, 2019, 4569-4588) or possibilities for high-throughput screening in droplet-based compartments with individual cells or in microcolonies (see examples in the respective review articles Current Opinion Structural Biology, 2018, 48, 149-156 and Current Opinion in Chemical Biology, 2017, 37, 137-1995 and specifically ACS Synthetic Biology, 2017, 6, 1988-1995).
  • the quotient of the concentration of the reporter substance inside the cell and the concentration of the reporter substance in the medium surrounding the cell is at least 2 or at most 0.5, preferably at least 5 or at most 0.2, more preferably in step a) of the method according to the invention at least 10 or at most 0.1, more preferably at least 100 or at most 0.01.
  • a difference in concentration of the reporter substance between the cell interior and the surrounding medium acts as a driving force for a change in the concentration of the reporter substance with increased permeability of the cell membrane. If the concentration in the surrounding medium is higher than in the interior of the cell, there will be an increase in the concentration in the interior of the cell if the permeability of the cell membrane is increased. However, if the concentration in the surrounding medium is lower than in the interior of the cell, the higher the permeability of the cell membrane results in a reduction in the concentration in the interior of the cell.
  • the permeability of the cell membrane for the reporter substance is also referred to as permeability.
  • a permeability for a specific molecule is difficult to determine and ultimately depends on a number of physiological factors such as the intrinsic or passive permeability of the lipid membrane and active import and export mechanisms.
  • the change in the permeability of the membrane is therefore defined empirically - i.e. preferably in particular specifically by the measured difference in the signal depending on the expression of the membrane protein.
  • the cell membrane is impermeable to the reporter substance therefore means that the detected signal is constant before inducing the expression of the membrane protein with a constant Ge content of sensor protein in the cell, i.e. with two or more measurements at different times, for example in one At intervals of one minute, two minutes, five minutes or ten minutes, the quotient of the highest measured signal value and the lowest measured signal value in a range from 0.75 to 1.25, further preferably from 0.8 to 1.2, more preferably from 0.85 to 1.15, more preferably from 0.9 to 1.1, more preferably from 0.95 to 1.05.
  • step c) of the method the expression of a membrane protein is induced which increases the permeability of the cell membrane for the reporter substance.
  • the dynamic range of the process can be specifically set by choosing the promoter. In the case of membrane proteins with strong pore-forming properties in particular, it can be advantageous to use a weaker promoter. As a result, a greater spread of the mean value with regard to the slope and the half-maximum time can be achieved, so that the dynamic range of the method can be improved. With a weaker protein expression, stronger pore structures can be differentiated better.
  • a particularly preferred weaker promoter is T7.100.sRBS (SEQ ID NO: 27).
  • the promoter T7.wt.sRBS (SEQ ID NO: 26), which leads to a stronger protein expression, is, however, also well suited for carrying out the method according to the invention.
  • the two named SEQ ID NOs show the sequence of the promoter region, including the actual promoter sequence (which is identical for T7.100.sRBS and T7.wt.sRBS) as well as the binding site of the lac repressor and the ribosome binding site binding site (RBS) ”) ⁇
  • the two promoter regions differ in the distance between the ribosombinant site and the binding site for the lac repressor. In the case of the T7.100.sRBS, this distance is shortened by eight nucleotides in the promoter region and thus causes a weaker expression of the membrane protein.
  • the induction of the expression of a membrane protein according to step c) of the method can in particular take place by adding an inducer, preferably by adding isopropyl ß-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), in particular in concentrations of 0.1 mM to 100 mM, for example from 0.2 mM to 50 mM, preferably 0.3 mM to 1 mM or 0.4 mM to 0.6 mM.
  • an inducer preferably by adding isopropyl ß-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG), in particular in concentrations of 0.1 mM to 100 mM, for example from 0.2 mM to 50 mM, preferably 0.3 mM to 1 mM or 0.4 mM to 0.6 mM.
  • IPTG isopropyl ß-d-1-thiogalactopyranoside
  • relevant delays can occur between the addition of the inductor and the point in time at which the inductor reaches the cell. For example, times of 20 to 30 minutes between the addition of the inductor and the arrival of the inductor in the microfluidic cultivation chamber are not unusual.
  • the time at which the expression of the membrane protein is induced in accordance with step c) of the method is thus clearly different from the time at which the inducer is added.
  • Step d) is preferred at least twice, more preferably at least three times, more preferably at least five times, more preferably at least ten times, more preferably at least twenty times, more preferably at least fifty times, more preferably at least 100 times at different times, in particular regularly, for example at intervals of 1 to 10 minutes or 2 to 5 minutes, in particular at intervals of one minute, two minutes, five minutes or ten minutes. In this way, a profile over time can be created that is particularly helpful in evaluating the properties of the proteins under investigation.
  • Step d) is preferably not carried out more than a thousand times.
  • one or more comparison parameters are calculated from the signal strengths detected in steps b) and d).
  • a comparison parameter is particularly helpful for comparing the effect of two or more different membrane proteins on the permeability of the cell membrane for the reporter substance, a comparison parameter being determined for each of the membrane proteins using the method of the invention.
  • a comparison parameter can also be used to compare two or more different sensor proteins.
  • a comparison parameter can be calculated particularly easily, for example, by forming a difference or a quotient of the signal strengths detected in steps b) and d).
  • the quotient of a signal value according to step d) and a signal value according to step b) has already been described above.
  • the difference between a signal value in accordance with step d) and a signal value in accordance with step b) can also be formed accordingly and serve as comparison parameters.
  • Such simple comparison parameters are particularly advantageous if step d) was carried out only once, in particular when a determination is made at a point in time at which there is no longer any relevant change in signal strength, preferably if step d) is 60 to 240 minutes, for example 90 to 150 minutes is carried out after step c).
  • a normalization can be carried out, for example, to the optical density at 600 nm (OD600nm).
  • OD600nm optical density at 600 nm
  • the OD600nm is a measure of the number of cells in a sample.
  • normalization to the OD600nm has various disadvantages. For example, such a normalization can change the kinetics of the curve. Such normalization is also problematic for measurements in which the OD600nm exceeds a value of 1.
  • a normalization to the OD600nm is also not advantageous for cell-lysing variants, since the OD600nm decreases over time in such variants and can falsify the signal.
  • normalization can therefore preferably take place in another way, in particular via negative controls.
  • the selection of the negative control depends on the reporter substance that is to be used. In particular, the negative control must be different from the reporter substance.
  • normalization can be carried out using H + or K + as a negative control if H + or K + are not the reporter substance, for example in the case of Ca 2+ or glutamate as the reporter substance.
  • the BM2 proton channel or a K + -specific channel are particularly relevant for these negative controls.
  • normalization is dispensed with.
  • normalization is preferably dispensed with when the method is carried out in microtiter plates, since with microtiter plates the signal strength is already averaged over many cells so that normalization is generally not associated with any further advantages .
  • the time course of the signal strength is taken into account (e.g. with the help of half the maximum time (T1 / 2) and / or the slope of the signal strength as a function of time, see equation 1), the properties to be investigated can be mapped very well without that normalization has further advantages.
  • the kinetics are independent of the expression pattern.
  • normalization can be carried out. Normalization can be achieved, for example, by using one or more membrane proteins, each with known parameters, at half the maximum time and / or for the slope as control references.
  • normalization can be dispensed with by ensuring that the expression level of the membrane proteins to be examined does not change or is only insignificant differs. This can be achieved, for example, by testing under comparable conditions, in particular by expressing the membrane proteins with the aid of the same promoter or the same promoter region.
  • a comparison parameter calculated from the signal strengths can in particular be a kinetic parameter, that is to say a parameter with which the time course of the change in the signal strength can be characterized.
  • step d) is preferably carried out several times at different times, so that a time profile of the change in the signal strength can be created.
  • a temporal profile of the signal strength with a sigmoid curve profile is regularly obtained.
  • the course of the signal strength over time can therefore preferably be described with a sigmoid function.
  • the calculation of the comparison parameter from the signal strengths according to step e) preferably includes the data obtained on the signal strengths being empirically fitted with a sigmoid function, the comparison parameter calculated from the signal strengths being half the maximum time c and / or the maximum slope d is.
  • the parameter a describes the lower signal level (baseline) and the parameter b describes the upper signal level (saturation).
  • the parameter c specifies half the maximum time, that is to say the point in time x at which the signal strength f has reached half of its maximum value f max.
  • the half-maximum time c corresponds in particular to the point in time at the turning point of the sigmoid curve.
  • the parameter d indicates the maximum slope of f (x), i.e. the maximum rate of change of the signal strength as a function of time.
  • the maximum slope d is at the turning point of the sigmoid curve.
  • a comparison parameter calculated from the signal strengths is particularly preferably half the maximum time c and / or the maximum slope d Equation 1 requires that a high value for d corresponds to a low slope and that, conversely, a low value for d corresponds to a high slope.
  • the method according to the invention it is possible to compare the properties of different membrane proteins with one another.
  • the properties of different sensor proteins can also be compared with one another.
  • the comparison parameters obtained according to step e) of the various proteins investigated are preferably compared with one another.
  • Conclusions about the properties of the membrane proteins and / or sensor proteins can preferably be drawn from the comparison parameters according to step e) of the method according to the invention.
  • a particularly large (high maximum value f max ) and / or rapid (low half-maximum time c and / or high slope, which is manifested by a low value d) increase in the signal strength due to the induction of the expression of the membrane protein preferably indicates that it is a particularly beneficial protein.
  • a particularly small (low maximum value f max ) and / or slow (high half-maximum time c and / or low slope, which is manifested by a high value d) increase in the signal strength preferably indicates that it is a particularly disadvantageous protein acts. Ultimately, however, it depends on the application scenario. If a rapid and strong influx of the reporter substance is desired, then the slope d should be high and the half the maximum time c may be low. If, on the other hand, one would like to have a slow influx of the report substance, a small slope d and a high half-maximum time c are given before.
  • the proteins examined can be classified based on the comparison results.
  • a particularly large and / or rapid increase in the signal strength due to the induction of the expression of the membrane protein shows that this increases the permeability of the cell membrane for the reporter substance to a particular degree.
  • a particularly small and / or slow increase in the signal strength shows that the permeability of the cell membrane for the reporter substance was only increased to a small extent.
  • there is no increase in permeability at all so that there is no increase in signal strength.
  • the appropriate membrane proteins can then be selected based on the results obtained. In order to obtain comparable results, it is advantageous to use the same sensor proteins in all experiments when examining different membrane proteins.
  • the method according to the invention is also suitable for characterizing various sensor proteins.
  • a particularly large increase in the signal strength (high maximum value f max ) due to the induction of the expression of the membrane protein shows in this case that the sensor protein achieves a particularly high signal strength per reporter substance.
  • a particularly rapid increase in signal strength indicates a high temporal resolution of the sensor protein.
  • a particularly small (low maximum value f max ) and / or slow (high half-maximum time c and / or low slope d) increase in the signal strength shows that the signal strength per reporter substance or the temporal resolution of the sensor protein is not high. In extreme cases, there is no increase in signal strength at all. This shows that the sensor protein tested is not at all suitable for detecting the corresponding report substance.
  • the appropriate sensor proteins can be selected based on the results obtained.
  • the screening process therefore preferably comprises the further step: f) determining the DNA sequence coding for the membrane protein and / or the DNA sequence coding for the sensor protein.
  • the protein sequence of the membrane protein and / or sensor protein can also be determined.
  • the DNA sequence can be determined with much simpler means than the protein sequence. Therefore, the DNA sequence is preferably determined.
  • the DNA sequence can be determined using DNA sequencing methods. A large number of such sequencing methods are known to the person skilled in the art.
  • the protein sequence can easily be determined using the known triplet coding.
  • cells and a medium surrounding the cells are provided.
  • the cells are preferably microorganisms, in particular selected from the group consisting of bacteria, unicellular fungi, microscopic algae, protozoa and combinations thereof. Due to their comparatively high transformation efficiency and “genetic malleability”, microorganisms are preferably used in the context of the present invention.
  • the cells can be, for example, gram-negative or gram-positive bacteria or yeasts.
  • the cells are particularly preferably selected from the group consisting of E. coli, S. cerevisiae, B. subtilis and combinations thereof.
  • the cells are particularly preferably selected from the group consisting of E. coli, B. subtilis and combinations thereof.
  • the cells are particularly preferably prokaryotic microorganisms, in particular bacteria, for example selected from the group consisting of gram-positive bacteria and gram-negative bacteria. Even more preferably, the cells are gram-positive bacteria, in particular Bacillus subtilis.
  • the E. coli cell is particularly preferred.
  • the E. coli cell is very particularly preferably the E. coli inner membrane and the cell membrane is the inner membrane.
  • Steps a) to e), more preferably a) to f), are preferably carried out for at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 20, further preferably at least 50, more preferably 10 2 to 10 8 membrane proteins with different amino acid sequences .
  • Steps a) to e), more preferably a) to f) are preferably carried out for at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 20, more preferably at least 50, more preferably 10 2 to 10 8 sensor proteins with different amino acid sequences.
  • the method of the present invention includes the detection of a signal which is dependent on the concentration of a reporter substance in the cell and which is generated with the aid of a sensor protein expressed in the cell.
  • the signal is preferably a fluorescence signal, a bioluminescence signal or an absorption signal.
  • the sensor protein is preferably selected from the group consisting of cation-specific protein sensors, amino acid-specific protein sensors and combinations thereof, in particular from the group consisting of Ca 2+ -specific protein sensors, L-Glu-specific protein sensors and combinations thereof.
  • the sensor protein is particularly preferably selected from the group consisting of R-GECO-1 (SEQ ID NO: 23), G-GECO-1 (SEQ ID NO: 24), iGluSnFR (SEQ ID NO: 25) and variants of the sensor proteins mentioned , in particular those variants which have a sequence identity with the protein sequence of at least one of the sensor proteins R-GECO-1, G-GECO-1 and iGluSnFR of at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99%.
  • the method of the present invention is particularly suitable for comparing different variants of a sensor protein with one another and selecting those with desired properties from the large number of variants.
  • Relevant properties for the selection of certain sensor proteins can be, for example, the signal strength per reporter substance and / or the temporal resolution of the sensor protein. It is often desirable to select sensor proteins with particularly high sensitivity and / or specificity with regard to the respective reporter substance.
  • sequence identity refers to the ratio of the number of these identical amino acids to the total number of amino acids in the sequence listed in the sequence listing of the present invention.
  • the reporter substance is preferably selected from the group consisting of cations, amino acids, peptides, proteins and metabolic products and intermediates (the metabolic products and intermediates in particular aromatic substances such as 3,4-hydrobenzoic acid, 4-hydroxybenzoic acid, 1, 2-catechol and cis-cis-muconic acid), and combinations thereof.
  • the reporter substance is particularly preferably selected from the group consisting of cations, amino acids and combinations thereof, in particular from the group consisting of Ca 2+ , glutamate and combinations thereof.
  • the reporter substance can be a cation.
  • Various cations are suitable as reporter substances.
  • the reporter substance is preferably selected from the group consisting of Ca 2+ , Na + , K + , Mg 2+ , Zn 2+ and combinations thereof.
  • the reporter substance Ca 2+ is particularly preferred.
  • the reporter substance can be an amino acid.
  • Various amino acids are suitable as report substances.
  • the amino acid is preferably selected from the group consisting of glutamate (L-Glu), glycine (L-Gly), threonine (L-Thr) and combinations thereof.
  • a particularly preferred amino acid is glutamate (L-Glu).
  • the membrane protein is selected from the group consisting of pore-forming membrane proteins, membrane transporters and combi nations thereof, in particular from the group consisting of Pinholinen (particularly S 21 -68 S 21 -71 S 21 -71 M4A, SGS ATMD1-S 21 68 , TVMV ATMD1-S 21 68), Holinen (S 105 , S 107 , S 107 -M3A, T4, ⁇ A c- Taii AN - Taii ⁇ A c- Taii ⁇ vira
  • en potassium channels especially K CV NTS , K CV NTS G77S , K CV PBCV1
  • components of the toxin / antitoxin (TA) system especially HokB, TisB), hemolysin proteins (especially aHLA), artificial pores (especially cWZA), proton porters (especially BM2), HCV -Membran
  • S 21 -68 SEQ ID NO: 1
  • S 21 -71 SEQ ID NO: 2
  • S 21 -71 M4A SEQ ID NO: 3
  • SG S ATMD1-S 21 68 SEQ ID NO: 4
  • TVMV ATMD1-S 21 68 SEQ ID NO: 5
  • S 105 SEQ ID NO: 6
  • S 107 SEQ ID NO: 7
  • S 107 -M3A SEQ ID NO: 8
  • T4 SEQ ID NO: 9
  • T4 AC - ail SEQ ID NO: 10
  • AN-Taii T4A c-Taii S EQ
  • K CV NTS SEQ ID NO: 12
  • K C v NTS G77S SEQ ID NO: 13
  • Kcv PBCV1 SEQ ID NO: 14
  • HokB SEQ ID NO: 15
  • TisB SEQ ID NO: 16
  • the method of the present invention is particularly suitable for comparing different variants of a membrane protein with one another and for selecting those with desired properties from the large number of variants.
  • a particularly relevant property for the selection of certain membrane proteins can be, for example, the degree of permeability for a reporter substance. It is often desirable to select membrane proteins with particularly high sensitivity and / or specificity with regard to the respective reporter substance.
  • Another preferred membrane proteins are S 21 -66 (SEQ ID NO: 28), S 21 -64 (SEQ ID NO: 29), S 21 -62 (SEQ ID NO: 30), S 21 -60 (SEQ ID NO: 31 ), S 21 -58 (SEQ ID NO: 32), S 21 -56 (SEQ ID NO: 33), S 21 -54 (SEQ ID NO: 34), S 21 -52 (SEQ ID NO: 35), S 21 -50 (SEQ ID NO: 36), S 21 -48 (SEQ ID NO: 37), S 21 -46 (SEQ ID NO: 38), S 21 -44 (SEQ ID NO: 39), S 21 -42 (SEQ ID NO: 40), S 21 -40 (SEQ ID NO: 41), S 21 -38 (SEQ ID NO: 42) and variants of said proteins, particularly those variants that have a sequence identity with at least one of Have sequences from SEQ ID NO: 28-42 of at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 98%, more
  • Membranprote ine Particularly preferred are S 21 -64 (SEQ ID NO: 29), S 21 -62 (SEQ ID NO: 30), S 21 -60 (SEQ ID NO: 31), S 21 -58 (SEQ ID NO: 32), S 21 -56 (SEQ ID NO: 33), S 21 -54 (SEQ ID NO: 34), S 21 -52 (SEQ ID NO: 35), S 21 -50 (SEQ ID NO: 36) , S 21 -48 (SEQ ID NO: 37) and variants of said proteins, particularly those variants that have a sequence identity with at least one of the sequences of SEQ ID NO: 29-37 of at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99%.
  • pin holin variant S 21 -48 (SEQ ID NO: 37) and variants thereof, particularly those variants that have a sequence identity with SEQ ID NO: 37 of at least 90%, more preferably Minim least 95%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99%.
  • Another preferred membrane proteins are N-terminal variants of S 21 -71 of SEQ ID NO: 43 and variants thereof, particularly those variants that have a sequence identity with SEQ ID NO: of at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably min 43 at least 98%, more preferably at least 99%.
  • SEQ ID NO: 43 Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr or, independently of one another, can be used at each of the positions indicated by “Xaa” Val be provided.
  • membrane proteins are the N-terminal variants of S 21 -71 of SEQ ID NO: 44 (clone P14E5), SEQ ID NO: 45 (clone P14C11), SEQ ID NO: 46 (clone P15D3)
  • SEQ ID NO: 47 (clone P7D10), SEQ ID NO: 48 (clone P3G3), SEQ ID NO: 49 (clone P3E5), and variants of the proteins mentioned, in particular those variants which have a sequence identity with at least one of the sequences from SEQ ID NO: 44-49 of at least 90%, more preferably at least 95%, more preferably at least 98%, more preferably at least 99%.
  • the screening method of the present invention is distinguished from known methods in particular by its high temporal resolution.
  • the temporal resolving power is determined in particular by the speed of expression and the speed of the membrane protein when increasing the permeability of the cell membrane for the reporter substance. There are also other factors, such as the sensitivity of the method used to detect the signal.
  • a particularly high temporal resolution can be achieved, for example, with the help of dynamic single cell measurements using microfluidics.
  • Step d) is preferably carried out at most 120 minutes, preferably at most 60 minutes, more preferably at most 45 minutes, more preferably at most 30 minutes, more preferably at most 15 minutes, more preferably at most 10 minutes after step c).
  • maintaining a certain time interval between steps c) and d), for example at least 2 minutes or at least 5 minutes, can be advantageous, in particular to ensure particularly robust signal detection.
  • step d) takes place in a period of 2 to 1000 minutes, for example 5 to 750 minutes, 10 to 500 minutes, 15 to 400 minutes, 20 to 300 minutes, 30 to 240 minutes, 45 to 180 minutes Minutes or 60 to 150 minutes after inducing according to step c) of the method.
  • Step d) is preferably carried out after step c) at most 1000 minutes, preferably at most 750 minutes, more preferably at most 500 minutes, more preferably at most 400 minutes, more preferably at most 300 minutes, more preferably at most 240 minutes.
  • the present invention also relates to a kit for performing the screening method.
  • the kit preferably comprises i. DNA coding for at least two membrane proteins and DNA coding for a sensor protein, or ii. DNA coding for at least two sensor proteins and DNA coding for a membrane protein.
  • the kit preferably contains DNA encoding at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 20, more preferably at least 50, more preferably 10 2 to 10 8 membrane proteins.
  • the kit preferably contains DNA encoding at least 5, preferably at least 10, more preferably at least 20, more preferably at least 50, more preferably 10 2 to 10 8 sensor proteins.
  • the DNA for the various membrane proteins (case i.) Or sensor proteins (case ii.) Is preferably in a separate form in the kit. This makes it easier to carry out the process specifically with the desired proteins.
  • the DNA is preferably in the form of plasmid DNA.
  • the DNA can be present in the kit in isolated form, for example in dried form or in the form of solutions.
  • the DNA can also be located within cells. In this case the cells are also part of the kit.
  • the kit can also comprise the reporter substance, for example in the form of a salt.
  • Figure 1 Formation or opening of a (protein) nanopore with promiscuous or specifically Ca2 + -specific permeability, for example in the inner membrane of Escherichia coli, leads to the inflow or outflow of Ca2 +.
  • the possibility can consequently be used to measure the ligand-dependent fluorescence of a genetically encoded sensor inside the cell at the individual cell level.
  • this enables the construction of pore-forming membrane peptides by means of various screening formats from microtiter plates down to the single cell level by means of a flow cytometer.
  • Figure 2 The formation or opening of a (protein) nanopore with promiscuous permeability, for example in the inner membrane of Escherichia coli, leads to the inflow or outflow of a ligand such as a specific metabolic product.
  • a ligand such as a specific metabolic product.
  • the possibility can consequently be used to measure the ligand-dependent fluorescence of a genetically-coded sensor inside the cell at the individual cell level. In practice, this enables the construction of tailor-made protein sensors using various screening formats down to the individual cell level using a flow cytometer.
  • Figure 3 Assay validation with (A) pACYCT2- TVMV ATMD1-S 21 68 (negative control) and (B) pACYCT2- SGS ATMD1-S 21 68 (positive control) each in double transformation with pPR ⁇ 24-R- GEC01 in the microtiter plate test. While the pACYCT2- TVMV ATMD1-S 21 68 variant shows a steady ODeoo nm increase and thus unchanged growth after induction, the growth curve of the pACYCT2-ATMD1-S 21 68 variant stagnates promptly.
  • the fluorescence channel (Ex: 555 nm; Em: 600 nm) shows a sigmoidal increase in the R-GEC01 signal in the toxic SGS ATMD1-S 21 68 variant, while the negative control TVMV ATMD1-S 21 68 has a steady baseline shows;
  • Figure 4 Analysis of the pore-forming properties for the wild type holins or Pinholine S 21 -68 and S 105 as well as the corresponding anti-holins / Pinholine.
  • Figure 5 Analysis of the pore-forming properties for the wild-type T4 holin as well as holin fragments derived therefrom with deleted N- and C-terminal domains.
  • Figure 6 Analysis of the pore-forming properties for different variants of Kcv channels with different opening states.
  • Figure 7 Analysis of the pore-forming properties for various nanopores HokB, TisB, cWZA and a-hemolysin.
  • Figure 8 Analysis of the pore-forming properties for various nanopores and transmembrane peptides.
  • Figure 9 Model selection for the 1: 5 dilution of pACYCT2- SGS ATMD1-S 21 68 to pACY CT2- TVMV ATM D 1 -S 21 68 (20% positive control and 80% negative control) + pPR ⁇ 24-R- GEC01.
  • A Blank H6, positive control H7-H9; Negative control H10-H12.
  • the values of A (before induction) and B (after induction) are RFU (Ex: 555 nm; Em: 600 nm) divided by the ODeoo nm ; C shows the ratio of B to A.
  • B After the induction of R-GEC01 but before the induction of the pore, the signal is consistently low.
  • Figure 10 Model selection for the 1:10 dilution of pACYCT2-ATMD1-S 21 68 to pACY CT2- TVMV ATM D 1 -S 21 68 (20% positive control and 80% negative control) + pPR ⁇ 24-R-GEC01.
  • A Blank H6, positive control H7-H9; Negative control H10-H12.
  • the values of A (before induction) and B (after induction) are AU (Ex: 555 nm; Em: 600 nm) divided by the OD 6 oo nm; C shows the ratio of B to A. Similar to the 1: 5 model selection, the signal is low after induction of R-GEC01, but before induction of the pore.
  • Figure 11 Overview of the pore-forming properties from the 3xNNK s 21 -68 library measured at the half-maximum time. Holine and pinholin fragments are each entered as a reference.
  • Figure 12 Overview of the pore-forming properties from the 3xNNK s 21 -68 library measured on the slope. Holine and pinholin fragments are each entered as a reference.
  • Figure 13 Characterization of five individual variants selected from the 3xNNK s 21 -68 library.
  • the selected variants each have different tendencies to form pores, depending on the N-terminal mutations.
  • Figure 14 After expression of various pore-forming membrane peptides, the outflow of the GECO from the cell was determined quantitatively in the cell pellet and in the supernatant by means of a fluorescent SDS-PAGE (the latter is assessed as a loss of cellular integrity). The GECO and the various nanopores were expressed for different times as indicated. In contrast to SGS ATMD1-S 21 68 and BM2, the expression of T4 holin and HokB leads to complete lysis in the exponential growth phase (- R-GECO 2h // pore 3h). The Antiholine S 21 -71 and S 107 as well as TisB lead to averaged values. In the anti-Holi- NEN S 21 -71 and S 107 is, however, to consider that the pore-forming holins can be expressed by shifting the raster translation and thus may lead to a aboveaverage high lysis of the cell.
  • Figure 15 Time-resolved measurement of the GECO-related fluorescence in the pellet in comparison to the supernatant as a function of cell growth measured using the OD600.
  • SGS ATMD1-S 21 68 and the BM2 proton channel the fluorescence is retained in the case of stagnant growth.
  • the expression of HokB and the T4 holin leads to a loss of cellular integrity and a time-dependent increase in fluorescence in the supernatant.
  • Figure 17 Example image for the model selection from pACYCT2- SGS ATMD1-S 21 68 to pACY CT2- TVMV ATM D 1 -S 21 68 (20% positive control and 80% negative control) + pPR024-R- GEC01. The colonies of the positive control appear dark to black in contrast to colonies of the negative control, which appear light gray.
  • Figure 18 Exemplary FACS cytograms. All Events (left diagrams): Refers to forward and backward scatter and provides an indication of cellular integrity (remains independent of the expression of SGS ATMD1-S 21 68 and TVMV ATMD1-S 21 68) ; M (diagram on the right): Refers to fluorescence as a function of the expression of SGS ATMD1-S 21 68 and TVMV ATMD1-S 21 68 (also separated according to the Forward Scattefy.Two different populations can be seen depending on the expression of the two different membrane peptides; M (bottom diagram): Refers exclusively to the GECO-related fluorescence signal. Again, two different populations can be recognized depending on the expression of the two different membrane peptides.
  • Figure 19 Exemplary FACS cytograms. All Events (diagram, top left): Refers to forward and backward scatter and provides an indication of cellular integrity (remains independent of the expression SGS ATMD1-S 21 68 and TVMV ATMD1-S 21 68) ; M: Refers to the distribution of the fluorescence signal (depending on the forward scatter).
  • the marked gate (circled) marks the area that will be preselected; Fluorescence All Events (diagram, top right): Refers to the distribution of the fluorescence signal within the preselected gate (this time independent of Forward Scattefy U: Refers exclusively to the distribution of the fluorescent signal in the preselected gate in which in final instance the events (ie events) with the highest fluorescence are selected (in this case 17.1%)
  • Figure 20 Expression of the iGluSNFr leads to an increase in fluorescence, which, through coexpression of the pore-forming peptide SGS ATMD1-S 21 68, causes an outflow of L-Glu from the cell and thus a reduction in fluorescence. No reduction in fluorescence was observed when the proton channel BM2 and the non-pore-forming membrane peptide TVMV ATMD1-S 21 68 were coexpressed.
  • Figure 21 Expression of iGluSNFr leads to an increase in fluorescence, S107-M3A and HokB effected by coexpression of the pore-forming peptides S-21 M4A -71 to a discharge of L-Glu from the cell and thus reduction in fluorescence.
  • Figure 22 Expression of the iGluSNFr leads to an increase in fluorescence. However, coexpression of different K + -conducting ion channels does not cause any outflow of L-Glu and thus no reduction in fluorescence.
  • Figure 23 Exemplary image sections of the fluorescence microscopic images of cells in the microfluidic cultivation chamber shown for the S 21 68 pinholin at four different times after 21 min (0:21 h), 63 min (1:03 h), 105 min (1st : 45 h) and 399 min (6:39 h).
  • FIG. 24 Summary of the fluorescent signal course for the S 21 68 pinholin as well as for the T4 holin in a microfluidic cultivation chamber.
  • the fluorescence in Relative Fluorescence Units (RFU) was plotted against time for all cells from a single cultivation chamber. The induction of the nanopore is shown with a dashed line.
  • Fig. 25 Comparison of the 3xNNK S21 68 library examined in the context of the two different expression vectors pCTRL2 and pCTRL2.T7.100.sRBS.
  • the spread of the half maximum time c and the slope d is greater in the case of the weaker expressing promoter pCTRL2.T7.100.sRBS than in comparison to pCTRL2 in the context of the T7.wt.sRBS promoter.
  • Using a weaker expressing promoter enables, for example in the context of a library selection, a better differentiation of the pore-forming properties.
  • Fig. 26A Summary of the fluorescent signal course for the 3xNNK s 21 68 library in microtiter plates. The analysis was carried out for each individual amino acid at the three different positions Xi, X2 and X3 (each marked in the graph as position 1, position 2 and position 3) in order to calculate the average half-maximum time c and the average slope d. The average values were calculated regardless of the context of the sequence.
  • Fig. 26B Summary of the fluorescent signal course for the 3xNNK s 21 68 library in microtiter plates.
  • the individual amino acids at the three different positions Xi, X2 and X3 (each marked in the graph as position 1, position 2 and position 3) were combined into groups with comparable chemical properties by the average half-maximum time c and calculate the average slope d. The average values were calculated regardless of the context of the sequence.
  • Fig. 27 Summary of the fluorescent signal curve for the S 21 68 truncation library in microtiter plates.
  • the kinetic course curves for the individual truncation variants were empirically fitted with equation 1 in order to quantitatively determine the half-maximum time c and the slope d.
  • Fig. 28 Summary of the fluorescent signal curve for the S 21 68 truncation library in colonies on agar plates. For the evaluation, the data from a constant image section of the agar plate were analyzed with the aid of image evaluation software and the maximum fluorescence was plotted against time. The numbers along the X-axis indicate the truncation variant.
  • pPR024 The pPR024 plasmid contains a class A Ori and a titratable propionate-inducible promoter (Environmental Microbiology, 2005, 71, 6856-62). This enables flexible control of the expression of a molecular sensor such as the Ca 2+ -specific R- and G-GECOs (Science, 2011, 333, 1888-1891).
  • pOSIP-CH enables the installation of gene expression cassettes of co-expression in defined locations of the E.coii genome. Specifically, the incorporation is made possible by co-expression of the HK022 integrase. Integration of gene expression cassettes e.g. for the R- and G-GECO sensors enables a more stable propagation and expression of the R- and G-GECOs cassettes in E.coii (due to uniform copy numbers).
  • pACYCT2 The pACYCT2 plasmid contains a class B Ori (p15A) + chloro- mphenicol resistance and a tac promoter that can be induced by IPTG (Nucleic Acids Research, 2013, 41, e150). Is used as an expression vector for various dene Pinholine derived therefrom as well as variants of S 21 -68 Pinholine: In particular, the probe-pore and non-pore forming membrane peptides ATMD1 SGS-S 21 68 (PNAS, 2009, 106, 18966-18971) and TVMV ATMD1- S 21 -68.
  • pTeT7W Dual promoter vector based on the pACYCT2 backbone with p15A Ori + chloramphenicol resistance and Lacl repressor for the independent co-expression of two proteins.
  • a TetR expression cassette including promoter from pASK and tac was replaced with the T7 promoter from pET24. This enables the expression of the two proteins by means of IPTG and tetracycline.
  • pCTRL2 Expression vector for the expression of toxic membrane channels and membrane peptides. Based on the pACYCT2 vector. The gene expression cassette is flanked on both sides by transcription terminators (ACS Synthetic Biology, 2015, 20, 4, 265-73) and the basal expression of potentially non-specific proteins is to be suppressed. Expression takes place under the control of a Lacl repressor mutant with increased suppression of gene expression (Microbial Cell Factories, 2013, 12, 67). The underlying promoter is referred to in the present disclosure as T7.wt.sRBS. The transcription cassette in the context of the pCTRL2 with T7.wt.sRBS promoter is shown in SEQ ID NO: 50 as an example for the expression of the fluorescent protein mkO-kappa. The fluorescent protein mkO-kappa is replaced by a membrane protein in each of the experiments.
  • pCTRL2.T7.100.sRBS Expression vector for the expression of toxic membrane channels and membrane peptides. Based on the pACYCT2 vector. The gene expression cassette is flanked on both sides by transcription terminators (ACS Synthetic Biology, 2015, 20, 4, 265-73) in order to suppress the basal expression of potentially non-specific proteins. Expression takes place under the control of a Lacl repressor mother with increased suppression of gene expression (Microbial Cell Factories, 2013, 12, 67). Compared to pCTRL2, the distance between the ribosome-binding site and the binding site for the lac repressor in this expression vector is shortened in pCTRL2.T7.100.sRBS and thus causes less expression of the respective nanopore.
  • the underlying promoter is referred to in the present disclosure as T7.100.sRBS.
  • the transcription cassette in the context of the pCTRL2.T7.100.sRBS with T7.100.sRBS promoter is shown in SEQ ID NO: 51 as an example for the expression of the fluorescent protein mkO-kappa.
  • the fluorescent protein mkO-kappa is replaced by a membrane protein in each of the experiments.
  • the BL21 (DE3) E. coli were made chemically competent together with the pPR024-R-GEC01 or pPR024-G-GEC01. This strain enables efficient transformation and screening of pore-forming membrane peptides, nanopores and ion channels that are expressed via the pACYCT2, pTeT7W or pCTRL2.
  • This strain contains the expression cassette for R- and G-GEC01 in a genomically integrated variant. Specifically, the gene for the R- or G-GEC01 was stably integrated into the attB site of the E. coli genome using the pOSIP-CH plasmid (ACS Synthetic Biology, 2013, 2, 537-41). This strain enables efficient transformation and screening of pore-forming membrane peptides, nanopores and ion channels that are introduced via the pACYC2, pTeT7W or pCTRL2
  • R-GECO-1 Red fluorescent Ca 2+ -specific protein sensor (Science, 2011, 333, 1888-1891). Is preferably used in microtiter plates and colonies as a genetically coded reporter to detect the influence of Ca 2+ after a pore has formed in the inner membrane of E. coli.
  • G-GECO-1 Green fluorescent Ca 2+ specific protein sensor (Science, 2011, 333, 1888-1891). Is preferably used in the flow cytometer as a genetically coded reporter to detect the influence of Ca 2+ after a pore has formed in the inner membrane of E. coli.
  • iGluSnFR Designates a class of fluorescent protein sensors specifically for L-Glu (Nature Methods, 2013, 10, 162-70). Is used to detect low molecular weight substances and substances beyond Ca 2+ or to cause nanopore-dependent changes in the fluorescent signal. Overview of membrane proteins, ion channels and pore-forming membrane peptides:
  • S 21 -68 wild type of the S 21 -68 pinholin of the bacteriophage P21 with pronounced and defined pore-forming properties (PNAS, 2009, 106, 18966-18971). The exact mechanism of pore formation is currently unclear. Initially, an inactive conformation is assumed in the form of an antiparallel a-helix with cytosolic N and C termini that accumulates in the inner membrane of E. coli. A concentration-related increase in S 21 -68 then leads to a flip of the first transmembrane domain through the lipid bilayer and to pore formation.
  • S 21 -71 M4A mutant of S 21 -71 Anti-Pinholins is mutated in the fourth, the second methionine to alanine. This basically prevents the expression of the wild-type S 21 -68 pinholin, which in the case of S 21 -71 can in principle also be expressed by shifting the translation initiation site by three amino acids. Compared to S 21 -71 Anti-Pinholin, pore formation is thus further delayed.
  • N-terminal S 21 -71 mutants N-terminal mutants of S 21 -71 Anti-Pinholins with the following polypeptide sequence:
  • MXXXDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGSLVLGFL- TYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO: 43), where A, R, N, D, Q, E, G, H, F, S, L, K, K, T, W, Y or V can be provided.
  • SGS ATMD1-S 21 68 fragment of the S 21 -68 pinholin in which the first transmembrane domain ⁇ TMD1 was deleted. Expression is principally toxic, presumably due to the ability to form at least transient pores in the inner membrane of E. coli (PN AS, 2009, 106, 18966-18971; Molecular Microbiology, 2010, 76, 68-77).
  • MSGSMWAAIGVLGSLVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE SEQ ID NO: 4
  • MSSSGGSETVRFQSGSMWAAIGVLGSLVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE SEQ ID NO: 5
  • S 105 wild type of S 105 pinholin of bacteriophage I with pronounced pore-forming properties (PNAS, 2010, 107, 2219-23). In contrast to the S 21 -68 Pinholin is believed that the S105 Holin big pm-large pores formed. However, the exact mechanism is unclear based on the current state of knowledge.
  • S 107 wild type of the S 107 anti-pinholin of bacteriophage 1. Analogous to S 21 -71 anti-pinholin, the pore-forming properties are severely restricted due to two additional amino acids MK at the N-terminus. According to the current state of knowledge, however, the exact mechanism is unclear (Molecular Microbiology, 1993, 8, 525-33).
  • Polypeptide sequence MKMPEKHDLLAAILAAKEQGIGAILAFAMAYLRGRYNGGAFTKTVIDATMCAIIA- WFIRDLLDFAGLSSNLAYITSVFIGYIGTDSIGSLIKRFAAKKAGVEDGRNQ (SEQ ID NO: 7)
  • S 107 -M3A mutant of S 107 anti-pinholin in which the third methione is mutated to alanine. This basically prevents the expression of the wild-type S 105 holin, which in the case of S 107 can in principle also be expressed by shifting the translation initiation site by 3 amino acids. Compared to S 107 Anti-Holin, pore formation is thus further delayed.
  • T4 pinholin wild type of the T4 pinholin of the bacteriophage T4 with strongly pronounced pore-forming properties.
  • the T4 pinholin has a tansmembrane mane with a long periplasmic C-terminus and a short cytosolic N-terminus.
  • both terms are regulated by an antiholin mechanism, which is completely different from the previously known Holinen S 105 and S 21 68 (Journal of Bacteriology, 2016, 198, 2448-57). This means that no flipping of individual transmembrane helices is currently postulated. However, the exact mechanism currently remains unclear.
  • T4 AC Tai ' Truncated version of the T4 pinholin in which the periplasmic C-terminus was deleted. This variant is not toxic. Mechanism so far unknown.
  • Polypeptide sequence AAPRISFSPSDILFGVLDRLFKDNATGKVLASRVAVVILLFIMAIVWY (SEQ ID NO: 10)
  • Kcv NTS Viral potassium channel that specifically conducts potassium, but also lets calcium through.
  • Kcv NTS G77S Based on Kcv NTS with a mutation at position 77 from glycine to serin. This mutation leads to a medium open probability and thus to a reduction in the conductivity of the potassium channel.
  • Kcv PBCV1 Viral potassium channel that specifically conducts potassium, but is also permeable to calcium. Very low probability of opening and thus low conductivity (FEBS Lett, 2003, 552, 12-6).
  • HokB pore-forming membrane peptide; Forms part of a bacterial efflux or toxin-antitoxin system. Specifically, HokB forms nanopores in the inner membrane and thus enables the unspecific outflow of toxic substances such as antibiotics (MBio. 2018, 9, pii: e00744-18).
  • TisB pore-forming membrane peptide; Forms part of a bacterial efflux or toxin-antitoxin system. Specifically, TisB forms nanopores in the inner membrane and thus enables the unspecific outflow of toxic substances such as antibiotics (Biophysical Journal, 2012, 103, 1460-1469).
  • aHLA refers to a pore-forming toxin from S. aureus (PN AS, 2008, 105, 19720-19725) Serves as a prototypical nanopore for a number of studies and projects in the field of nanopore engineering, especially in the development sensory applications. However, such projects are almost exclusively realized through the expression of aHLA in cell-free systems. Functional states are examined either using high-resolution biophysical methods or with blood cells as a substrate. Is basically exported extracellularly, also in E.coli.
  • cWZA minimal pore-forming membrane peptide artificially derived from the transmembrane region of the membrane protein Wza (Nature Chemistry, 2017, 9, 411-419).
  • cWZA has been shown to form well-defined heptameric pores; However, it is dependent on ring-shaped, low-molecular-weight substances that associate with the individual membrane peptides in order to form stable or defined nanopores in the membrane.
  • MAPLVRWNRVISQLVPTITGVHDLTETVRYIKTWPN SEQ ID NO: 18
  • BM2 proton channel from the influenza B virus (Chemical Sciences, 2018, 9, 2365-2375).). Permeable only for protons, depolarizes the inner membrane of E. coli, leads to cell death. Serves as a control to check the specificity of the pore-related influence of Ca 2+ in various screening formats.
  • HCV TME1 and TME2 transmembrane domains of the hepatitis C virus envelope protein that bind to the membrane and have a toxic effect.
  • HCV-TME1 MIAGAHWGVLAGIAYFSMVGNWAKVLVVLLLFAGVDA (SEQ ID NO: 20)
  • HCV-TME2 MEYVVLLFLLLADARVCSCLWMMLLISQAEA (SEQ ID NO: 21)
  • pore-forming from non-pore-forming membrane peptides can be quantitatively mapped and differentiated in E. coli using the newly developed genetic assay in microtiter plate format.
  • Various parameters can be used to quantitatively characterize the pore-forming properties of a membrane peptide, a nanopore or an ion channel (Fig. 3). This includes the time-dependent influence of Ca 2+ (and the associated increase in fluorescence or the half-maximum time of the fluorescence signal) as well as the OD600:
  • the intensity of the fluorescence signal reflects, among other things, the ability of a membrane peptide to form pores in the inner membrane; And the OD600 gives complementary information about the toxicity of a pore-forming peptide and the cellular integrity.
  • Example 2 Investigation of the pore-forming properties of various membrane peptides, nanopores and ion channels in microtiter plates
  • K + specific Kcv channels have a promiscuous permeability with regard to Ca 2+ ions, which lead to fluorescent signals of different levels depending on the opening state (Fig. 6).
  • the method can thus be widely used in order to quantitatively measure the pore-forming properties or flow specificity of ion channels and nanopores in E. coli.
  • Table 1 Overview of the different classes of nanopores and ion channels that were investigated using the novel method.
  • the threshold value for both model selections and thus to select different properties.
  • the kinetics i.e. the half-maximal time of the fluorescence signal or the slope
  • the kinetics can also be analyzed, which can be seen immediately after the induction of the nanoprepore.
  • the newly developed method can convert the DNA of the pore-forming membrane peptide SGS ATMD1-S 21 68 from a five- or ten-fold dilution to the non-pore-forming peptide TVMV ATMD1-S 21 68 in correspondingly equal proportions within a selection cycle in microtiter plate format re-identified, selected and thus enriched.
  • this demonstrates that the link between genotype and phenotype is within the Selection cycle is retained and there is no counter-sense lesson under the given circumstances - for example, due to the toxicity of the pore-forming peptides - the desired properties takes place.
  • Example 4 Selection experiments to find new properties and functions of pore-forming membrane peptides in microtiter plates
  • a library of pore-forming variants of the wild-type pinholin S 21 68 in microtiter plate format was screened for new properties and functions.
  • the primary goal of a real selection is to examine the extent to which a screening process can be used to identify novel properties or functions of pore-forming membrane peptides.
  • analogous to the model selection experiments with the two pinholin variants TVMV ATMD1-S 21 68 and SGS ATMD1-S 21 68 (see example 3), the extent to which the pore-forming properties change in the context of a larger library when growing - i.e. before a function test is carried out - affects the relative frequency of variants.
  • the three N-terminal amino acids of the natural S 21 71 pinholin were randomized by means of saturation mutagenesis in order to investigate which mutations had a positive or negative effect on the pore-forming properties of the wild-type S 21 71 pinholin.
  • the mutagenesis primer for the S 21 71 antiholin is designed on the following base pair or amino acid sequence:
  • R-GEC01 was first induced with 25 mM sodium propionate, pH 8.0, and the fluorescence was measured over 120 min. • The library and the positive and negative controls were then induced with 0.5 mM IPTG and the fluorescence was measured over a further 120 min.
  • the screening of part of the library shows that changes in the N-terminal sequence in front of the first transmembrane domain (TMD) can change the pore-forming properties of the S 21 -68 pinholin.
  • the first structure-function correlations indicate that charges have a strong influence on the slope as well as the half-maximum time of pore formation.
  • the high transformation efficiency of the libraries of> 10 5 per pg DNA indicates that sufficiently large libraries of a principally toxic, pore-forming membrane peptide are routinely transformed into E.coli and its pore-forming properties using the optical reporter R-GEC01 and G-GEC01 can be read out. If necessary, the expression of the pore-forming peptides can be further suppressed in the non-induced state.
  • Example 5 Preservation of the cellular integrity or extent of the cell lysis after expression of pore-forming membrane peptides
  • R-GEC01 was first induced with 25 mM sodium propionate, pH 8.0, at 30 ° C and 180 rpm for 120 min.
  • Example 6 Assay validation for screening pore-forming membrane peptides in individual colonies on agar plates
  • the newly developed assay can also be used in the colony format on agar plates.
  • screening methods based on colonies enable a higher throughput and are also not dependent on expensive laboratory equipment such as a microtiter plate spectrophotometer.
  • the pore-forming membrane peptide SGS ATMD1-S 21 68 and the non-pore-forming membrane peptide TVMV ATMD1-S 21 68 served as model peptides again as positive and negative controls.
  • the plate is cultivated for a further 2 hours at 37 ° C until it is subsequently stored at 4 ° C until the following day (protected from light)
  • the newly developed method can also be used in the colony format on agar plates in order to distinguish pore-forming from non-pore-forming membrane peptides. Significant differences in the fluorescent signal between individual colonies can be observed after a single point in time, depending on the expression of pore-forming SGS ATMD1-S 21 68 or non-pore-forming membrane peptide TVMV ATMD1-S 21 68 (FIG. 16).
  • Example 7 Model selections for screening pore-forming membrane peptides in colonies on agar plates
  • model selections were used to test the extent to which the connection between genotype and phenotype was retained in individual colonies on agar plates within the entire selection cycle and the DNA of a pore-forming membrane peptide was re-identified from a larger amount of non-pore-forming membrane peptides, selected and can be enriched. Similar to the validation of the method in microtiter plates, screening for colonies enables a higher throughput and does not depend on expensive microtiter plate spectrophotometers. As before, the pore-forming membrane peptide SGS ATMD1-S 21 68 and the non-pore-forming membrane peptide TVMV ATMD1-S 21 68 served as model peptides again as positive and negative controls.
  • the stamped plate is cultivated for 4 h at 37 ° C.
  • the expression of the pinholin fragments is then induced with 0.5 mM IPTG.
  • a filter paper is sprayed with the appropriate solution and held for approx. 10 seconds. placed on the colonies.
  • the plate is cultivated for a further 2 hours at 37 ° C, protected from light, until it is subsequently stored at 4 ° C until the following day.
  • Fig. 17 shows a representative picture of the fluorescence of the colonies. From the ratio 1: 5, 8 colonies with high fluorescence and 6 colonies of the 1:10 dilution were sequenced. Sequencing resulted in the positive control PACYCT2- SGS ATM D 1 -S 21 68 in all colonies.
  • the pore-forming membrane peptides SGS ATMD1-S 21 68 can be distinguished from the non-pore-forming membrane peptide TVMV ATMD1-S 21 68 (a) quantitatively on agar plates and (b) selected from a greater dilution of 1: 5 and 1:10 can be enriched (Fig. 17).
  • Example 8 Assay validation on single cell levels using a flow cytometer
  • the newly developed assay can also be used to examine the pore-forming properties or functions of membrane peptides at the single cell level using a flow cytometer. Compared to microtiter plates (see Examples 1-5) or colonies on agar plates (see Examples 6 and 7), this has the advantage that the assay can be measured in high resolution and with a high statistical significance:> 10 6 variants within a FACS Measurement. Specifically, it was necessary to examine to what extent the quantitative evaluation or differentiation between pore-forming and non-pore-forming peptides is also possible at the level of individual cells.
  • G-GEC01 was first cultured with 25 mM sodium propionate, pH 8.0, induced for 120 min at 30 ° C and 220 rpm.
  • the flow cytometric analysis shows two different fluorescent populations of E. coli (depending on the expression of a pore-forming SGS ATMD1-S 21 68 compared to a non-pore-forming peptide TVMV ATMD1-S 21 68).
  • a separation according to forward and backward scatter indicates that the cellular integrity is largely retained after expression of the pore-forming peptide and is therefore possible - that is, the method is in principle to distinguish suitable membrane peptides with different pore-forming properties at the individual cell level by flow cytometry.
  • Example 9 Model selections at the single cell level using a flow cytometer
  • the newly developed assay can be used to sort and enrich the pore-forming properties or functions of membrane peptides at the level of individual cells using a flow cytometer.
  • this has the advantage that the assay can be carried out quantitatively with a very high throughput, which in principle enables> 10 6 variants to be screened within a selection cycle.
  • the already known transmembrane peptides SGS ATMD1-S 21 68 and TVMV ATMD1-S 21 68 were used as positive and negative controls for this.
  • G-GEC01 was first cultured with 25 mM sodium propionate, pH 8.0, induced for 120 min at 30 ° C and 220 rpm.
  • the pore-forming membrane peptide SGS ATMD1-S 21 68 can be distinguished from the non-pore-forming membrane peptide TVMV ATMD1-S 21 68 (a) quantitatively at the single-cell level and (b) selected and enriched from a greater dilution of 1:10 . It should be noted that depending on the expression of a pore-forming peptide - in this case SGS ATMD1-S 21 68 - the cellular integrity of the cell is preserved to such an extent that selection by means of FACS is possible.
  • the method can be reconfigured in order to optimize the combination of molecular sensors and switches.
  • the challenge is to measure the molecular state of a sensor with and without a ligand (and thus to select the highest possible differential in the signal).
  • a critical and technically demanding task is to feed a defined amount of a ligand to the sensor or switch in order to activate it.
  • the senor or switch can e.g. be exported extracellularly or periplasmic.
  • an externally added ligand can relatively easily associate with the sensor and switch.
  • This also applies to sensors and switches exported periplasmic, since the outer E. coli membrane is comparatively permeable to a large number of low-molecular substances.
  • fluorescent protein sensors consisting of several independently folding domains, however, this is only possible to a limited extent and also restricts folding properties and the stability of the sensor or switch.
  • the challenge is to allow the ligand to flow into or out of the cell via the membrane. Due to the intrinsically impermeable membrane, however, this severely restricts the number and type of ligands.
  • an increased permeability of the inner E. coli membrane should now be made possible through the expression of nanopores.
  • the key development step is to investigate the extent to which low molecular weight substances, which are many times larger than Ca 2+ ions, can diffuse through nanopores of different sizes.
  • the R- and G- GECOs with L-Glu-specific fluorescence sensors, so-called iGluSnFRs are exchanged in order to detect the inflow and outflow of L-Glu beyond Ca 2+ ions.
  • the oboe of the precultures was set to 0.1 in microtiter plates (MTP) and the samples, each 200 ml of M9 medium, were shaken for 30 min at 37 ° C. and 180 rpm. • Then the iGluSNFr was first induced with 25 mM sodium propionate, pH 8.0, and the fluorescence was measured over 290 min.
  • MTP microtiter plates
  • Microfluidic methods enable high-resolution functional studies, especially in combination with optical measurement methods such as those based on fluorescence.
  • Microfluidic processes offer a number of technical advantages such as miniaturization of bioanalytical processes (Journal of Laboratory Automation, 2013, 18, 350-66), time-resolved dynamic studies of microorganisms on the single cell level in a microfluidic cultivation chamber (see examples in the respective review articles Journal of Molecular Biology, 431, 2019, 4569-4588) or possibilities for high-throughput screening in droplet-sized compartments with single cells or in microcolonies (see examples in the respective review articles Current Opinion Structural Biology, 2018, 48, 149-156 and Current Opinion in Chemical Biology, 2017, 37, 137-144 and specifically ACS Synthetic Biology, 2017, 6, 1988-1995).
  • the pore-forming properties of two different membrane proteins were examined in a microfluidic cultivation chamber at the individual cell level in a time-resolved form with a fluorescence microscope.
  • microfluidic chip was flooded with LB medium, the cells were added and the flow rate through the microfluidic chip was set to 1 ml / min. The Cells were left in the microfluidic chip for 3 h at 37 ° C. so that they could collect and grow accordingly in the cultivation chambers.
  • G-GEC01 was induced by changing to LB medium with 25 mM sodium propionate, pH 8.0, for 2 h at 30 ° C.
  • nanopores were then induced by changing to LB medium with 0.5 mM IPTG and the development of the fluorescent signal was measured over 16 h.
  • the fluorescent signal was measured using a fluorescence microscope at 30 ° C at an interval of 3 minutes. A transmitted light image and then a fluorescence image (Ex: 488 nm; Em: 504-539 nm) were made in the form of a Z-stack. From the induction of G-GEC01, a flow rate of 4 mI / min was applied.
  • test series demonstrates the application of the method in a microfluidic device. Specifically, cells were cultivated in a microfluidic cultivation chamber and the pore-forming properties of the S 21 68 pinholin and the T4 holin were examined at the individual cell level in a time-resolved form using a fluorescence microscope.
  • the expression of the S 21 68 pinholin causes the cells to rapidly stop dividing as well as a rapid increase in the fluorescent signal (Fig. 24). Measured by the shape of the cells, however, the cellular integrity remains intact for a comparatively long period of time (Fig. 23).
  • the expression of the T4 holin also causes the cells to rapidly stop dividing, as well as a rapid increase in the fluorescent signal. In the case of the T4 holin, however, the fluorescent signal falls off again quickly (within 30 min). This is due to the fact that the T4 Holin is expected to form very large pores very quickly and these lead to a rapid influence of Ca 2+ and thus the cell to light up before the sensor flows out relatively quickly or the cellular integrity and cell lysis are lost (Fig. 24).
  • the results obtained show that the “cellular container” remains intact despite pore-forming properties and that depending on the nanopore, Ca 2+ ions influence the cell.
  • the time window is comparatively short (in this case 30 min) before either a loss of cellular integrity or leakage of the sensor occurs (Fig. 24).
  • a library of pore-forming variants of the S 21 71 pinholin in microtiter plate format was also screened for changed pore-forming properties.
  • the primary goal of a real selection is to examine the extent to which the process can be used to select membrane proteins with novel pore-forming properties and functions.
  • the three N-terminal amino acids of the S 21 71 pinholin were randomized by means of saturation mutagenesis in order to investigate which mutations had a positive or negative effect on the pore-forming properties of the wild-type S 21 71 pinholin.
  • it must be clarified to what extent the promoter strength, measured by the half-maximum time c and the slope d, has an influence on the dynamic range of the method in the context of a library selection.
  • the mutagenesis primer for the S 21 71 pinholin is designed on the following DNA or amino acid sequence:
  • the randomized codons are referred to as Xi, X2 and X ß or position 1, position 2 and position 3, respectively.
  • the S 21 71 pinholin was amplified with the above-mentioned forward primer and a suitable reverse primer and cloned into the pCTRL2 or pCTRL2.T7.100.sRBS vector with the respective cleavage sites for Ndel / Kpnl.
  • the OD600 of the precultures was set to 0.1 in microtiter plates and the samples, each 200 ml, shaken for 30 min at 37 ° C. and 180 rpm.
  • the samples each 200 ml, shaken for 30 min at 37 ° C. and 180 rpm.
  • pCTRL2- 3xNNK S 21 68 library were then picked with 271 clones.
  • 576 clones were picked.
  • the pore-forming properties of the 3xNNK s 21 68 library can be better experimentally resolved than with the stronger promoter (Fig. 25).
  • this is clearly noticeable through a greater spread of the mean value with regard to the slope and the half-maximum time and consequently improves the dynamic range of the method, so that stronger pore images can be differentiated better due to the weaker protein expression.
  • a sequence-structure-function analysis shows that negative charges at position 3, measured at half the maximum time c, accelerate pore formation by way of example (Fig. 26B, Tab. 1).
  • aromatic amino acids at positions 1 and 3 can inhibit pore formation, measured at half the maximum time (Fig. 26B, Tab. 1).
  • the S 21 68 pinholin was additionally truncated in increments of two amino acids and one functional using the method Subjected to investigations.
  • Variant 1 screening of the S 21 68 truncation library in microtiter plates
  • Microtiter plate read-out • After the cultivation of individual clones from 2. overnight, the oboe of the precultures was set to 0.1 in microtiter plates and the samples each 200 ⁇ l were shaken for 30 min at 37 ° C. and 180 rpm.
  • Variant 2 screening of the S 21 68 truncation library in agar plates
  • the reporter G-GEC01 was induced by spraying 500 mM sodium propionate pH 8.0 onto the agar plate with an airbrush so that all colonies were slightly wetted. The agar plates were then incubated for 180 minutes at 20 ° C. in the dark. • The expression of the truncation variants was then induced by spraying a 50 mM IPTG solution onto the agar plate again with an airbrush and all colonies were slightly wetted. The agar plates were then incubated for a further 240 minutes at 20 ° C. in the dark.
  • a truncation of the S 21 -68 pinholin in increments of two amino acids causes different fluorescent signals and provides new insights into the structural and functional properties that are subject to the pore formation of the S 21 -68 pinholin.
  • the two N-terminal amino acids D and K in the context of the S 21 -68 pinholin have an inhibitory effect on the formation of the nanopore.
  • Further truncation improves the pore-forming properties up to the complete truncation of the aromatic motif YWFQLW.
  • the S 21 -48 pinholin variant can now serve as a minimal nanopore motif for further construction projects.
  • the course of the fluorescent signals in microtiter plates is consistent with the fluorescent signals in the colony format on agar plates (Fig. 28).
  • the latter thus enables cost-effective screening of colonies on agar plates and can be used, for example, to preselect libraries with a very high throughput in order to then determine the pore-forming properties for a reduced number of variants with the help of a fluorescence spectometer with regard to half the maximum time c and the slope d to quantify.

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Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchmusterung porenbildender Membranproteine, Membrantransporter und molekularer Schalter. Die Erfindung betrifft außerdem ein Kit zur Durchführung des Verfahrens.

Description

Verfahren zur Durchmusterung porenbildender Membranproteine, Membrantransporter und molekularer Schalter
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Durchmusterung porenbildender Membran proteine, Membrantransporter und molekularer Schalter. Die Erfindung betrifft außerdem ein Kit zur Durchführung des Verfahrens.
Einleitung
Die Konstruktion von Proteinen mit maßgeschneiderten Struktur- und/oder Funktionseigen schaften ist aufgrund des vergleichsweise unverstandenen Zusammenhangs zwischen Se quenz, Struktur und Funktion eines Proteins immer noch auf empirisches Testen vieler ver schiedener Proteinmutanten angewiesen. In der Praxis wird das Testen vieler einzelner Protein mutanten in vergleichsweise kurzen Zeitspannen mittels sogenannter Durchmusterungsverfah ren erreicht. Dabei wird zunächst eine Bibliothek von Proteinmutanten auf eine gewünschte Ei genschaft getestet, selektiert und angereichert. Anschließend werden, die auf eine gewünschte Funktion angereicherten Mutanten sequenziert und identifiziert. Dabei ist es kritisch die physi sche Assoziation zwischen Genotyp (d.h. der kodierenden DNA, die jeweils "ausgelesen", "be schrieben" und "propagiert" werden kann) und dem Phänotyp (d.h. der Funktion eines Proteins) zu gewährleisten. Darüber hinaus spielen bei der Entwicklung neuartiger Durchmusterungsver fahren u.a. Handbarkeit, Durchsatz, Empfindlichkeit, dynamische Spanne sowie quantitative und zeitliche Auflösung eine entscheidende Rolle um in der Praxis Bibliotheken von Proteinmu tanten möglichst effizient und flexibel auf eine gewünschte strukturelle und/oder funktionale Ei genschaft zu untersuchen.
Die Entwicklung geeigneter Durchmusterungsverfahren stellt sich dabei für (Protein-)Nanoporen als besonders anspruchsvoll dar: Zumal die Expression vieler Membranproteine insbesondere von (Protein-) Nanoporen toxisch ist und bis jetzt nur eine vergleichsweise geringe Anzahl an Durchmusterungsverfahren entwickelt wurde, die zudem unter einer Reihe von Einschränkun gen leiden.
Traditionell werden strukturelle und funktionale Eigenschaften von (Protein-)Nanoporen mittels elektrophysiologischer Techniken untersucht, allen voran der technisch anspruchsvollen in-vitro Bilayer Technik. Hier wird das Bilden und Öffnen einer (Protein-) Nanopore, die jeweils integriert in einem Phospholipid-Bilayer ist, mittels eines Stromflusses zwischen zwei Elektroden vermes sen. Elektrophysiologische Messmethoden sind jedoch begrenzt auf das Testen definierter Mu- tanten in aufgereinigter Form und ermöglichen keine Durchmusterung im Hochdurchsatz. Dies bezüglich wurden eine Reihe idiosynkratischer Systeme entwickelt, die jedoch eine Vielzahl von Nachteilen aufweisen:
(1) Wachstumsabhängige Durchmusterungsverfahren, insbesondere in Escherichia coli , aber auch in anderen Mikroorganismen wie z.B. Saccharomyces cerevisiae, basieren auf der intrinsi schen Toxizität von (Protein-)Nanoporen: Konkret depolarisieren porenbildende Membranpep tide und Proteine das Membranpotential und verhindern so das Wachstum. In der Vergangen heit konnten Wachstumsassays zum Beispiel erfolgreich eingesetzt werden, um porenbildende Eigenschaften einzelner Membranpeptide zu charakterisieren (ACS Chemical Biology, 2016,
11, 910-20) oder auch kombinatorisch Peptide mittels eines Durchmusterungsverfahren mit an tibiotischer Wirkung zu identifizieren, die u.a. auch porenbildende Eigenschaften aufweisen konnten (Cell, 2018, 172, 618-628).
Konkrete Nachteile: (i) Schlechte zeitliche Auflösung der porenbildenden Eigenschaften (z.B. Stunden bis Tage in Spot Dilution Assays (Wachstums-basierte Assays benötigen in E. coli mindestens 12-16 Stunden im Gegensatz zu den Verfahren der vorliegenden Erfindung, die in Abhängigkeit von der Expressionsstärke sowie den porenbildenden Eigenschaften eines Memb ranpeptids bzw. Membranproteins um 1-2 Größenordnungen schneller ((insbesondere im Minu tenbereich)) ein Signal generieren.)); (ii) Geringfügige Unterschiede in porenbildendenden Ei genschaften können nur bedingt aufgelöst werden; (iii) Porenbildende Eigenschaften können nicht positiv, sondern nur negativ selektiert werden. Somit sind wachstumsbasierte Durchmus terungsverfahren immer angewiesen auf technisch anspruchsvolles Colony Blotting oder glo bale Analysen mittels kostenintensivem Next-Generation DNA Sequencing; (iv) Toxizität auf grund porenbildender Eigenschaften kann nicht direkt von anderweitiger Toxizität unterschieden werden.
(2) Darüber hinaus wurde ein Haemolytischer Assay für Kolonien und Mikrotiterplatten entwi ckelt: Konkret werden porenbildende Toxine wie z.B. Cytolysin A und Fragatoxin C in E- scherichia coli exprimiert, und anschließend die Eigenschaften einzelner Mutanten unter Hinzu gabe roter Blutkörperchen, die zum Aufschluss der Erythrozyten und der damit verbundenen Freisetzung von Hämoglobin führen, visualisiert (JACS, 2013, 135, 13456-63; Angewandte Chemie, 2016, 55, 12494-8).
Konkrete Nachteile: (i) Einzelzellanalyse mittels eines Durchflusszytometers nicht möglich, son dern benötigt Ko-Inkubation mit Erythrozyten entweder in Mikrotiter- oder auf Agarplatten; (ii) Der Assay ist begrenzt auf Erythrozyten-spezifische Toxine, deren porenbildende Eigenschaf ten durch Sphingomyelin-haltige Lipidmembranen aktiviert werden. (3) Ein genetischer Komplementationsassay basierend auf Saccharomyces cerevisiae Stäm men mit defizienten Kaliumkanälen. Durch Rekombination optogenetischer Rezeptoren mit vira len Kaliumkanälen können lichtgesteuerte Kaliumkanäle konstruiert werden (Science, 2015,
348, 707-10; Methods in Molecular Biology, 2017, 1596, 271-285).
Konkrete Nachteile: (i) Ähnlich wie bei Wachstums-Assays, schlechte zeitliche Auflösung der porenbildenden Eigenschaften (z.B. Stunden bis Tage in Spot-Dilution-Assays); (ii) Ähnlich wie bei Wachstumsassays können geringfügige Unterschiede in Eigenschaften sowohl zeitlich wie auch quantitativ nur bedingt aufgelöst werden.
(4) Liposom Display bezieht sich auf ein Durchmusterungsverfahren auf Basis künstlicher Zel len. In einem ersten Schritt werden künstliche, phospholipid Bilayer umgebene Zellen mittels ei ner Wasser-in-ÖI Emulsion und Zentrifugation durch eine Phospholipid Bilayer erstellt. Nach ei ner in-vitro Exprimierung bauen sich in-vitro Proteine autonom in die Membran ein. Die Bildung oder Öffnung von Nanoporen wird unter Hinzugabe eines Farbstoff untersucht, der in Abhängig keit von der (Protein-)Nanopore ins Innere der künstlichen Zelle diffundiert und durch eine kova lente Konjugation mit einem Tag dort verbleibt (PNAS, 2013, 110, 16796-801 ; Nature Protocols, 2014, 9, 1578-91 ).
Konkrete Nachteile: (i) Komplexe und technisch anspruchsvolle in vitro Prozedur (ii) Faltung und Einbau kann nicht durch bakterielle Faltungsmaschinerie kontrolliert werden; (iii) Geringe Anreicherung pro Selektionsrunde: z.B. 20 Selektionsrunden wurden benötigt um die funktio nale Inserierung von alpha-Hemolysin 20-fach zu verbessern.
(5) Prinzipiell könnten Durchmusterungssysteme sowohl mit spannungsabhängigen Membran farbstoffen wie z.B. DiSC3(5) oder membranundurchlässigen DNA bindenden Farbstoffen wie z.B. Propidium-Iodid visualisiert werden.
Konkrete Nachteile: (i) Synthetische Farbstoffe müssen extern hinzugefügt werden und erhöhen somit die Komplexität und Kosten des Assays; (ii) Propidium-Iodid wurde bis jetzt ausschließlich genutzt um die Wirkung extern hinzugefügter Peptide zu untersuchen und wurde noch nicht an gewendet, um intrazellulär exprimierte (Protein-)Nanoporen zu durchmustern - d.h. es ist un klar, inwieweit sich Propidium lodid als spezifischer Marker für die innere Membran eignet bzw. Propidium-Iodid ist als allgemeiner Marker der Membranintegrität vergleichsweise undifferen ziert; (iii) Propidium-Iodid ist zu groß, um durch definierte Poren von Pinholinen zu gelangen.
Die Konstruktion von (Protein-)Nanoporen, Kanälen und Transportern mit maßgeschneiderten Funktionen und Eigenschaften hat großes Potential für eine Reihe biotechnologischer Anwen dungen: (a) In der Biosensorik als hochempfindliche Sensoren, die klinisch oder biotechnologisch relevante Moleküle in komplexen molekularen Umgebungen detektieren können.
(b) In der nicht-invasiven Bildgebung als genetisch-enkodierte Reporter um niedermoleku lare, bildgebende Substanzen (z.B. MRI-aktive Reportermoleküle) spezifisch in einzel nen Zellen anzureichern und diese somit zu kennzeichnen.
(c) In der Konstruktion künstlicher Biosynthese und Stoffwechselwege wie auch in der che mischen Reaktionstechnik als Membrantransporter, die den Import von Substraten bzw. den Export von Produkten durch undurchlässige Phospholipid-Membranen ermöglichen z.B. in natürlichen Zellen wie auch biomimetische Zellkompartimenten.
(d) In der Aufbereitungstechnik um spezifische Moleküle aus komplexen Umgebungen (z.B. direkt aus der Umwelt oder chemischen Reaktionskompartimenten) reinigen zu können.
Es ist daher eine Aufgabe der Erfindung, die Nachteile aus dem Stand der Technik zu überwin den und ein entsprechend verbessertes Durchmusterungsverfahren sowie ein Kit zur Durchfüh rung des Verfahrens bereitzustellen. Die Aufgabe wird durch die Gegenstände der Patentan sprüche gelöst.
Konkret wurde ein Durchmusterungsverfahren entwickelt, um strukturelle und funktionale Eigen schaften einer (Protein-)Nanopore (z.B. Bilden oder Öffnen), bevorzugt mit promisker Durchläs sigkeit, kombinatorisch in verschiedenen Durchmusterungsformaten (z.B. in Mikrotiterplatten, durch Koloniemusterung und mittels Durchflusszytometrie), bevorzugt im Mittel- bis Hochdurch satz von 102-108 zu vermessen und zu selektieren. Auf molekularer Ebene führt das Bilden oder Öffnen einer (Protein-)Nanopore zum Einströmen einer Reportersubstanz in eine Zelle; Einströ men der Reportersubstanz wird wiederum mittels eines genetisch-enkodierten Sensorproteins in ein biophysikalisches Signal (z.B. Fluoreszenz, Biolumineszenz oder Absorption) umgewan delt und somit sichtbar gemacht. Dies wiederum ermöglicht die DNA Sequenz, die für die ge wünschte porenbildende Eigenschaft kodiert, zu selektieren und mittels verschiedener DNA Se quenzierungsmethoden (z.B. nach der Sänger Methode oder mittels DNA Sequenzierungsver fahren der nächsten Generation) auszulesen, und darüber hinaus weiter zu propagieren und zu mutieren. Zudem kann das Verfahren genutzt werden, um entweder Membrantransporter mit spezifischen Durchlässigkeiten oder molekulare Sensoren/Schalter zu durchmustern. Ersteres beinhaltet dabei die Detektion eines spezifischen Sensors der den Ein- bzw. Ausfluss eines be stimmten Stoffwechselproduktes detektiert. Letzteres ermöglicht durch das Bilden von unspezi fischen Poren (insbesondere in der inneren Membran von E. coli) den Ein- bzw. Ausfluss eines spezifischen Stoffwechselproduktes und somit eine positiv-negativ Selektionsstrategien auf Ebene einzelner Zellen mit sehr hohem Durchsatz mittels Durchflusszytometrie. Detaillierte Beschreibung
Die oben beschriebenen Aufgaben werden durch die Gegenstände der Patentansprüche gelöst. Insbesondere werden die Aufgaben gelöst durch ein Durchmusterungsverfahren, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen einer Zelle und eines die Zelle umgebenden Mediums,
- wobei die Zelle eine Zellmembran aufweist, die für eine Reportersubstanz undurchlässig ist,
- wobei der Quotient aus der Konzentration der Reportersubstanz im Inneren der Zelle und der Konzentration der Reportersubstanz im die Zelle umge benden Medium mindestens 2 oder höchstens 0,5 beträgt; b) Detektieren eines von der Konzentration der Reportersubstanz in der Zelle abhängi gen Signals, das mit Hilfe eines in der Zelle exprimierten Sensorproteins erzeugt wird; c) Induzieren der Expression eines Membranproteins, das die Durchlässigkeit der Zell membran für die Reportersubstanz erhöht; d) Detektieren des von der Konzentration der Reportersubstanz in der Zelle abhängi gen Signals, das mit Hilfe des in der Zelle exprimierten Sensorproteins erzeugt wird; e) Berechnung eines oder mehrerer Vergleichsparameter aus den in den Schritten b) und d) detektierten Signalstärken, wobei Schritt b) vor Schritt c) durchgeführt wird und wobei Schritt d) nach Schritt c) durchgeführt wird, wobei die Schritte a) bis e) für mindestens zwei Membranproteine mit unterschiedlicher Aminosäuresequenz und/oder für mindestens zwei Sensorproteine mit unterschiedlicher Amino säuresequenz durchgeführt werden.
Das Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung kann in verschiedenen Formaten durchgeführt werden. Bevorzugt wird das Verfahren in Mikrotiterplatten, durch Koloniemuste rung und/oder mittels Durchflusszytometrie durchgeführt.
Besonders bevorzugt wird das Verfahren mittels Mikrofluidik durchgeführt, insbesondere mit Hilfe von Einzelzellmessungen, insbesondere dynamischen Einzelzellmessungen. Dies ermög- licht eine besonders hohe zeitliche Auflösung. Mikrofluidische Verfahren ermöglichen hochauf lösende funktionale Studien insbesondere in Kombination mit optischen Messverfahren wie z.B. auf Basis von Fluoreszenz. Mikrofluidische Verfahren bieten dabei eine Reihe technischer Vor teile wie z.B. Miniaturisierung bioanalytischer Verfahren ( Journal of Laboratory Automation, 2013, 18, 350-66), zeitaufgelöste dynamische Studien von Mikroorgansimen auf Einzelzelle bene in einer mikrofluidischen Kultivierungskammer (siehe Beispiele in den jeweiligen Über sichtsartikeln Journal of Molecular Biology, 431, 2019, 4569-4588) oder Möglichkeiten zur Durchmusterung im Hochdurchsatz in tröpfchenbasierten Kompartimenten mit einzelnen Zellen oder in Mikrokolonien (siehe Beispiele in den jeweiligen Übersichtsartikeln Current Opinion Structural Biology, 2018, 48, 149-156 und Current Opinion in Chemical Biology, 2017, 37, 137- 144 sowie konkret ACS Synthetic Biology, 2017, 6, 1988-1995).
Der Quotient aus der Konzentration der Reportersubstanz im Inneren der Zelle und der Kon zentration der Reportersubstanz im die Zelle umgebenden Medium beträgt in Schritt a) des er findungsgemäßen Verfahrens mindestens 2 oder höchstens 0,5, bevorzugt mindestens 5 oder höchstens 0,2, weiter bevorzugt mindestens 10 oder höchstens 0,1, weiter bevorzugt mindes tens 100 oder höchstens 0,01. Ein Konzentrationsunterschied der Reportersubstanz zwischen Zellinnerem und dem umgebenden Medium wirkt als Triebkraft für eine Veränderung der Kon zentration der Reportersubstanz bei erhöhter Durchlässigkeit der Zellmembran. Wenn die Kon zentration im umgebenden Medium höher ist als im Zellinneren, wird sich bei erhöhter Durch lässigkeit der Zellmembran eine Erhöhung der Konzentration im Zellinneren ergeben. Ist die Konzentration im umgebenden Medium jedoch geringer ist als im Zellinneren, ergibt sich bei er höhter Durchlässigkeit der Zellmembran eine Verringerung der Konzentration im Zellinneren.
Die Durchlässigkeit der Zellmembran für die Reportersubstanz wird erfindungsgemäß auch als Permeabilität bezeichnet. Eine Permeabilität für ein spezifisches Molekül ist nur schwer zu be stimmen und hängt letzten Endes von einer Reihe physiologischer Faktoren ab wie z.B. der intrinsischen bzw. passiven Permeabilität der Lipidmembran sowie aktiver Import und Export mechanismen. Im Rahmen der vorliegenden Erfindung definiert sich die Änderung der Permea bilität der Membran daher empirisch - d.h. bevorzugt insbesondere konkret durch die gemes sene Differenz des Signals abhängig von der Expression des Membranproteins.
Dass die Zellmembran für die Reportersubstanz undurchlässig ist, bedeutet daher, dass das detektierte Signal vor dem Induzieren der Expression des Membranproteins bei konstantem Ge halt an Sensorprotein in der Zelle konstant ist, dass also bei zwei oder mehr Messungen zu un terschiedlichen Zeitpunkten, beispielsweise in einem Abstand von einer Minute, von zwei Minu ten, von fünf Minuten oder von zehn Minuten der Quotient aus dem höchsten gemessenen Sig nalwert und dem niedrigsten gemessenen Signalwert in einem Bereich von 0,75 bis 1,25, weiter bevorzugt von 0,8 bis 1 ,2, weiter bevorzugt von 0,85 bis 1 ,15, weiter bevorzugt von 0,9 bis 1 ,1, weiter bevorzugt von 0,95 bis 1 ,05 liegt.
Gemäß Schritt c) des Verfahrens wird die Expression eines Membranproteins induziert, das die Durchlässigkeit der Zellmembran für die Reportersubstanz erhöht. Über die Wahl des Promo tors lässt sich die dynamische Spanne des Verfahrens gezielt einstellen. Insbesondere im Fall von Membranproteinen mit starken porenbildenden Eigenschaften, kann es vorteilhaft sein, ei nen schwächeren Promotor zu verwenden. Dadurch kann sich eine größere Streuung vom Mit telwert bezüglich der Steigung und der halbmaximalen Zeit erreichen lassen, so dass die dyna mische Spanne des Verfahrens verbessert werden kann. Mit einer schwächeren Proteinexpres sion können stärkere Porenbilder besser differenziert werden. Ein besonders bevorzugter schwächerer Promotor ist T7.100.sRBS (SEQ ID NO: 27). Der Promotor T7.wt.sRBS (SEQ ID NO: 26), der zu einer stärkeren Proteinexpression führt, ist jedoch ebenfalls gut für die Durch führung des erfindungsgemäßen Verfahrens geeignet. Die beiden genannten SEQ ID NOs zei gen die Sequenz der Promotorregion, einschließlich der eigentlichen Promotorsequenz (die bei T7.100.sRBS und T7.wt.sRBS identisch ist) sowie der Bindestelle des Lac-Repressors und der ribosombindenden Stelle (englisch: „ribosome binding site (RBS)“)· Bezüglich der Promotorstär ken unterscheiden sich die beiden Promotorregionen in der Distanz zwischen der ribosombin denden Stelle und der Bindestelle für den Lac-Repressor. Im Falle des T7.100.sRBS ist dieser Abstand um acht Nukleotide in der Promotorregion verkürzt und bewirkt somit eine schwächere Expression des Membranproteins.
In den SEQ ID NOs: 50 und 51 sind die Transkriptionskassetten im Kontext des pCTRL2 mit T7.wt.sRBS Promoter (SEQ ID NO:50) beziehungsweise im Kontext des pCTRL2.T7.100.sRBS mit T7.100.sRBS Promoter (SEQ ID NO:51) gezeigt. Drei weitere Unterschiede zwischen den beiden Konstrukten sind darin ersichtlich. Erstens wurden bei T7.100.sRBS im Vergleich zu T7.wt.sRBS sechs Nukleotide vor der eigentlichen Promotorsequenz entfernt. Zweitens wird eine andere RBS verwendet. Sowohl die RBS von T7.100.sRBS als auch die RBS von T7.wt.sRBS sind als starke RBS bekannt (Elowitz, M. B., and S. Leibier. 2000. “A Synthetic Os- cillatory Network of Transcriptional Regulators.” Nature 403 (6767): 335-38 sowie Olins, P. O., and S. H. Rangwala. 1989. “A Novel Sequence Element Derived from Bacteriophage T7 mRNA Acts as an Enhancer of Translation of the lacZ Gene in Escherichia Coli.” The Journal of Biolo gical Chemistry 264 (29): 16973-76). Drittens wurden bei T7.100.sRBS im Vergleich zu T7.wt.sRBS vier Nukleotide hinter der RBS entfernt und durch drei andere Nukleotide ersetzt. Die Induktion der Expression eines Membranproteins gemäß Schritt c) des Verfahrens kann insbesondere durch Zugabe eines Induktors, bevorzugt durch Zugabe von Isopropyl ß-d-1-thio- galactopyranoside (IPTG) erfolgen, insbesondere in Konzentrationen von 0,1 mM bis 100 mM, beispielsweise von 0,2 mM bis 50 mM, bevorzugt 0,3 mM bis 1 mM oder 0,4 mM bis 0,6 mM.
Insbesondere in mikrofluidischen Ausführungsformen kann es zwischen der Zugabe des Induk tors und dem Zeitpunkt, an dem der Induktor die Zelle erreicht zu relevanten Verzögerungen kommen. Beispielsweise sind Zeiten von 20 bis 30 Minuten zwischen der Zugabe des Induktors und dem Eintreffen des Induktors in der mikrofluidischen Kultivierungskammer nicht ungewöhn lich. Insbesondere in solchen Ausführungsformen ist der Zeitpunkt des Induzierens der Expres sion des Membranproteins gemäß Schritt c) des Verfahrens also deutlich verschieden vom Zeit punkt der Zugabe des Induktors.
Dass das Membranprotein die Durchlässigkeit der Zellmembran für die Reportersubstanz er höht, bedeutet dementsprechend, dass der gemäß Schritt d) ermittelte Signalwert im Vergleich zum gemäß Schritt b) ermittelten Vergleichswert vor der Induktion der Expression des Memb ranproteins höhere Werte erreicht, insbesondere derart, dass der Quotient eines Signalwerts gemäß Schritt d) und eines Signalwerts gemäß Schritt b) bevorzugt in einem Bereich von >1,25 bis 10, weiter bevorzugt von 1 ,5 bis 7,5, weiter bevorzugt von 2 bis 5 liegt. Bevorzugt wird Schritt d) mindestens zweimal, weiter bevorzugt mindestens dreimal, weiter bevorzugt mindes tens fünfmal, weiter bevorzugt mindestens zehnmal, weiter bevorzugt mindestens zwanzigmal, weiter bevorzugt mindestens fünfzigmal, weiter bevorzugt mindestens hundertmal zu verschie denen Zeitpunkten, insbesondere regelmäßig, beispielsweise im Abstand von 1 bis 10 Minuten oder 2 bis 5 Minuten, insbesondere im Abstand von einer Minute, von zwei Minuten, von fünf Minuten oder von zehn Minuten durchgeführt. Auf diese Weise kann ein zeitliches Profil erstellt werden, das bei der Bewertung der Eigenschaften der untersuchten Proteine besonders hilf reich ist. Bevorzugt wird Schritt d) nicht mehr als tausendmal durchgeführt.
Gemäß Schritt e) des erfindungsgemäßen Verfahrens werden ein oder mehrere Vergleichspa rameter aus den in den Schritten b) und d) detektierten Signalstärken berechnet. Ein solcher Vergleichsparameter ist besonders hilfreich, um die Wirkung zweier oder mehr verschiedener Membranproteine auf die Durchlässigkeit der Zellmembran für die Reportersubstanz miteinan der zu vergleichen, wobei für jedes der Membranproteine mit dem Verfahren der Erfindung ein Vergleichsparameter ermittelt wird. Ein Vergleichsparameter kann auch zum Vergleich zweier oder mehr verschiedener Sensorproteine verwendet werden.
Besonders einfach lässt sich ein Vergleichsparameter beispielsweise durch Bildung einer Diffe renz oder eines Quotienten der in den Schritten b) und d) detektierten Signalstärken berechnen. Der Quotient eines Signalwerts gemäß Schritt d) und eines Signalwerts gemäß Schritt b) wurde bereits oben beschrieben. Auch die Differenz eines Signalwerts gemäß Schritt d) und eines Sig nalwerts gemäß Schritt b) kann entsprechend gebildet werden und als Vergleichsparameter die nen. Solche einfachen Vergleichsparameter sind insbesondere dann vorteilhaft, wenn Schritt d) nur einmal durchgeführt wurde, insbesondere bei einer Bestimmung zu einem Zeitpunkt, in dem sich keine relevante Änderung der Signalstärke mehr ergibt, bevorzugt wenn Schritt d) 60 bis 240 Minuten beispielsweise 90 bis 150 Minuten nach Schritt c) durchgeführt wird.
Es ist erfindungsgemäß auch möglich, beispielsweise im Rahmen der Berechnung des Ver gleichsparameters, eine Normalisierung der Signalstärken vorzunehmen. Eine Normalisierung kann beispielsweise auf die optische Dichte bei 600 nm vorgenommen werden (OD600nm). Die OD600nm ist ein Maß für Zellanzahl in einer Probe. Eine Normalisierung auf die OD600nm bringt jedoch verschiedene Nachteile mit sich. Beispielsweise kann eine solche Normalisierung die Kinetik der Kurve verändern. Außerdem ist eine solche Normalisierung für solche Messun gen problematisch, bei denen die OD600nm einen Wert von 1 überschreitet. Auch für Zell-lysie- rende Varianten ist eine Normalisierung auf die OD600nm nicht vorteilhaft, da die OD600nm bei solchen Varianten mit der Zeit sinkt und das Signal verfälschen kann. Eine Normalisierung kann daher erfindungsgemäß bevorzugt auf anderem Wege erfolgen, insbesondere über Negativ- Kontrollen. Die Auswahl der Negativkontrolle hängt von der Reportersubstanz ab, auf die abge stellt werden soll. Insbesondere muss die Negativkontrolle von der Reportersubstanz verschie den sein. Beispielsweise kann eine Normalisierung mit Hilfe von H+ oder K+ als Negativkontrolle erfolgen, wenn H+ oder K+ nicht die Reportersubstanz sind, beispielsweise bei Ca2+ oder Gluta mat als Reportersubstanz. Für diese Negativkontrollen sind insbesondere der BM2 Protonen- Kanal beziehungsweise ein K+-spezifischer Kanal relevant.
In vielen Ausführungsformen der Erfindung wird auf eine Normalisierung verzichtet. Beispiels weise wird bei einer Durchführung des Verfahrens in Mikrotiter-Platten bevorzugt auf eine Nor malisierung verzichtet, da bei Mikrotiter-Platten die Signalstärke ohnehin bereits über viele Zel len gemittelt erhalten wird, so dass eine Normalisierung in der Regel nicht mit weiteren Vortei len verbunden ist. Auch wenn auf den zeitlichen Verlauf der Signalstärke abgestellt wird (z.B. mit Hilfe der halbmaximale Zeit (T1/2) und/oder der Steigung der Signalstärke in Abhängigkeit von der zeit, siehe Gleichung 1), können die zu untersuchenden Eigenschaften hervorragend abgebildet werden, ohne dass eine Normalisierung weitere Vorteile mit sich bringt. Die Kinetik ist in einigen Ausführungsformen der Erfindung unabhängig vom Expressionsmuster. Das be deutet, dass es beispielsweise bei unterschiedlicher Expression des Sensorproteins, lediglich zu einer Veränderung der maximalen Signalstärke kommen kann, T1/2 und die Steigung jedoch gleich bleiben. Auch wenn Poren als Membranproteine verwendet werden, um die Durchlässig keit der Zellmembran für die Reportersubstanz zu erhöhen, bringt eine Normalisierung in der Regel keine Vorteile mit sich, da die Expressionslevel des Sensorproteins so hoch sind, dass ohnehin eine maximale Signalstärke erreicht wird.
In Ausführungsformen, in denen die halbmaximale Zeit und/oder die Steigung der Signalstärke vom Expressionslevel des Membranproteins abhängig sind, kann hingegen eine Normalisierung durchgeführt werden. Eine Normalisierung kann beispielsweise erreicht werden, indem ein oder mehrere Membranproteine mit jeweils bekannten Parametern zur halbmaximalen Zeit und/oder zur Steigung als Kontroll-Referenzen eingesetzt werden.
Auch in Ausführungsformen, in denen die halbmaximale Zeit und/oder die Steigung der Signal stärke vom Expressionslevel des Membranproteins abhängig sind, kann jedoch auf eine Nor malisierung verzichtet werden, indem darauf geachtet wird, dass sich der Expressionslevel der zu untersuchenden Membranproteine nicht oder nur unwesentlich unterscheidet. Dies kann bei spielsweise dadurch erreicht werden, dass unter vergleichbaren Bedingungen getestet wird, insbesondere dadurch, dass die Membranproteine mit Hilfe desselben Promotors bzw. dersel ben Promotorregion exprimiert werden.
Ein aus den Signalstärken berechneter Vergleichsparameter kann insbesondere ein kinetischer Parameter sein, also ein Parameter, mit dem der zeitliche Verlauf der Änderung der Signal stärke charakterisiert werden kann. Wie oben beschrieben, wird Schritt d) bevorzugt mehrmals zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt, so dass ein zeitliches Profil der Änderung der Sig nalstärke erstellt werden kann. Regelmäßig ergibt sich ein zeitliches Profil der Signalstärke mit einem sigmoidalen Kurvenverlauf. Der zeitliche Verlauf der Signalstärke lässt sich also bevor zugt mit einer Sigmoidfunktion beschreiben. Bevorzugt beinhaltet die Berechnung des Ver gleichsparameters aus den Signalstärken gemäß Schritt e), dass die zu den Signalstärken er haltenen Daten mit einer Sigmoidfunktion empirisch gefittet werden, wobei der aus den Signal stärken berechnete Vergleichsparameter die halbmaximale Zeit c und/oder die maximale Stei gung d ist.
Dem Fachmann sind viele Gleichungen mit sigmoidalem Kurvenverlauf bekannt, die prinzipiell zur Beschreibung des zeitlichen Signalstärkenverlaufs geeignet sind. Solche Gleichungen be schreiben den sigmoidalen Kurvenverlauf bevorzugt mit Hilfe der folgenden vier Parametern: der Baseline, der Sättigung, der maximalen Steigung und der halbmaximale Zeit.
Besonders bevorzugt werden die erhaltenen Daten mit der folgenden Gleichung 1 empirisch ge fittet. Die halbmaximale Zeit c und die Steigung d können dadurch quantitativ ermittelt werden. b fix) = a + —(x—c)
1 + e~
Gleichung 1
In Gleichung 1 beschreibt f(x) die zum Zeitpunkt x ermittelte Signalstärke f Dabei entspricht x=0 dem Zeitpunkt der Induktion der Expression. Der Parameter a beschreibt das untere Signallevel (Baseline) und der Parameter b beschreibt das obere Signallevel (Sättigung). Der Parameter c gibt die halbmaximale Zeit an, also den Zeitpunkt x, an dem die Signalstärke fdie Hälfte ihres Maximalwerts fmax erreicht hat. Die halbmaximale Zeit c entspricht insbesondere dem Zeitpunkt am Wendepunkt der sigmoidalen Kurve. Der Parameter d gibt die maximale Steigung von f(x) an, also die maximale Änderungsrate der Signalstärke in Abhängigkeit von der Zeit. Die maxi male Steigung d liegt am Wendepunkt der sigmoidalen Kurve vor. Ein aus den Signalstärken berechneter Vergleichsparameter ist besonders bevorzugt die halbmaximale Zeit c und/oder die maximale Steigung d Gleichung 1 bedingt, dass ein hoher Wert für d einer geringen Steigung entspricht und dass umgekehrt ein geringer Wert für d einer hohen Steigung entspricht.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich die Eigenschaften verschiedener Memb ranproteine miteinander zu vergleichen. Es können auch die Eigenschaften verschiedener Sen sorproteine miteinander verglichen werden. Zu diesem Zweck werden bevorzugt die gemäß Schritt e) erhaltenen Vergleichsparameter der verschiedenen untersuchten Proteine miteinan der verglichen. Aus dem Vergleichsparameter gemäß Schritt e) des erfindungsgemäßen Ver fahrens können bevorzugt Rückschlüsse auf die Eigenschaften der Membranproteine und/oder Sensorproteine gezogen werden. Eine besonders große (hoher Maximalwert fmax) und/oder schnelle (geringe halbmaximale Zeit c und/oder hohe Steigung, die sich durch einen geringen Wert d manifestiert) Zunahme der Signalstärke durch die Induktion der Expression des Memb ranproteins zeigt bevorzugt an, dass es sich um ein besonders vorteilhaftes Protein handelt. Eine besonders kleine (geringer Maximalwert fmax) und/oder langsame (hohe halbmaximale Zeit c und/oder geringe Steigung, die sich durch einen hohen Wert d manifestiert) Zunahme der Sig nalstärke zeigt hingegen bevorzugt an, dass es sich um ein besonders nachteiliges Protein han delt. Letztendlich kommt es jedoch auf das Anwendungsszenario an. Wenn ein schneller und starker Einstrom der Reportersubstanz gewünscht ist, dann sollte die Steigung d hoch und die halbmaximale Zeit c niedrig sein. Möchte man hingegen einen langsamen Einstrom der Repor tersubstanz haben, so sind eine kleine Steigung d und eine hohe halbmaximale Zeit c bevor zugt.
Wenn die Ergebnisse verschiedener Membranproteine miteinander verglichen werden, so las sen sich die untersuchten Proteine basierend auf den Vergleichsergebnissen klassifizieren.
Eine besonders große und/oder schnelle Zunahme der Signalstärke durch die Induktion der Ex pression des Membranproteins zeigt, dass dieses die Durchlässigkeit der Zellmembran für die Reportersubstanz in besonderem Maße erhöht. Eine besonders kleine und/oder langsame Zu nahme der Signalstärke zeigt hingegen, dass die Durchlässigkeit der Zellmembran für die Re portersubstanz nur in geringem Ausmaß erhöht wurde. Im Extremfall findet überhaupt keine Er höhung der Durchlässigkeit statt, so dass es zu keinem Anstieg der Signalstärke kommt. Je nach den gewünschten Durchlässigkeitseigenschaften können dann basierend auf den erhalte nen Ergebnissen die passenden Membranroteine ausgewählt werden. Um vergleichbare Ergeb nisse zu erhalten, ist es vorteilhaft, im Falle einer Untersuchung verschiedener Membranprote ine bei allen Experimenten dieselben Sensorproteine einzusetzen.
Das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich jedoch auch zur Charakterisierung verschiedener Sensorproteine. In diesem Fall ist es vorteilhaft, bei allen Experimenten dieselben Membranpro teine einzusetzen, um Unterschiede im Anstieg der Signalstärke allein auf Unterschiede zwi schen den getesteten Sensorproteinen zurückführen zu können. Eine besonders große Zu nahme der Signalstärke (hoher Maximalwert fmax) durch die Induktion der Expression des Membranproteins zeigt in diesem Fall, dass das Sensorprotein eine besonders hohe Signal stärke pro Reportersubstanz erzielt. Eine besonders schnelle Zunahme der Signalstärke (ge ringe halbmaximale Zeit c und/oder hohe Steigung d) zeigt eine hohe zeitliche Auflösung des Sensorproteins an. Eine besonders kleine (geringer Maximalwert fmax) und/oder langsame (hohe halbmaximale Zeit c und/oder geringe Steigung d) Zunahme der Signalstärke zeigt hingegen, dass die Signalstärke pro Reportersubstanz bzw. die zeitliche Auflösung des Sensorproteins nicht hoch ist. Im Extremfall findet überhaupt keine Erhöhung der Signalstärke statt. Dies zeigt, dass das getestete Sensorprotein überhaupt nicht zum Nachweis der entsprechenden Repor tersubstanz geeignet ist. Je nach den gewünschten Sensoreigenschaften können basierend auf den erhaltenen Ergebnissen die passenden Sensorproteine ausgewählt werden.
Für eine Auswahl geeigneter Proteine basierend auf den oben diskutierten Vergleichsergebnis sen, ist es vorteilhaft, wenn die Proteine leicht identifizierbar sind. Das Durchmusterungsverfah ren umfasst daher bevorzugt den weiteren Schritt: f) Bestimmen der das Membranprotein kodierenden DNA-Sequenz und/oder der das Sensorprotein kodierenden DNA-Sequenz.
Alternativ oder zusätzlich kann auch die Proteinsequenz des Membranproteins und/oder Sen sorproteins bestimmt werden.
Die DNA-Sequenz lässt sich mit deutlich einfacheren Mitteln bestimmen als die Proteinsequenz. Daher wird die DNA-Sequenz bevorzugt bestimmt. Die DNA-Sequenz kann mit DNA-Sequen- zierungsmethoden bestimmt werden. Eine Vielzahl solcher Sequenzierungsmethoden ist dem Fachmann bekannt.
Aus der DNA-Sequenz wiederum lässt sich die Proteinsequenz leicht anhand der bekannten Triplet-Kodierung ermitteln.
Gemäß Schritt a) des Verfahrens der vorliegenden Erfindung werden Zellen und ein die Zellen umgebendes Medium bereitgestellt. Bevorzugt ist sind die Zellen Mikroorganismen, insbeson dere ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Bakterien, einzelligen Pilzen, mikroskopischen Algen, Protozoen und Kombinationen davon. Mikroorganismen werden aufgrund ihrer ver gleichsweise hohen Transformationseffizienz und „genetischen Formbarkeit“ bevorzugt im Rah men der vorliegenden Erfindung eingesetzt.
Die Zellen können beispielsweise gram-negative oder gram-positive Bakterien oder auch Hefen seien. Besonders bevorzugt sind die Zellen ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus E. coli , S. cerevisiae, B. subtilis und Kombinationen davon. Besonders bevorzugt sind die Zellen aus gewählt aus der Gruppe bestehend aus E. coli , B. subtilis und Kombinationen davon.
Besonders bevorzugt sind die Zellen prokaryotische Mikroorganismen, insbesondere Bakterien, beispielsweise ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus gram-positiven Bakterien und gram negativen Bakterien. Noch weiter bevorzugt sind die Zellen gram-positive Bakterien, insbeson dere Bacillus subtilis.
Besonders bevorzugt ist die Zelle E. coli. Ganz besonders bevorzugt ist die Zelle E. coli und die Zellmembran die innere Membran von E. coli.
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich die Eigenschaften verschiedener Memb ranproteine miteinander zu vergleichen. Bevorzugt werden die Schritte a) bis e), weiter bevor zugt a) bis f) für mindestens 5, bevorzugt mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 20, wei ter bevorzugt mindestens 50, weiter bevorzugt 102 bis 108 Membranproteine mit unterschiedli cher Aminosäuresequenz durchgeführt. Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich die Eigenschaften verschiedener Sensor proteine miteinander zu vergleichen. Bevorzugt werden die Schritte a) bis e), weiter bevorzugt a) bis f) für mindestens 5, bevorzugt mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 20, weiter be vorzugt mindestens 50, weiter bevorzugt 102 bis 108 Sensorproteine mit unterschiedlicher Ami nosäuresequenz durchgeführt.
Das Verfahren der vorliegenden Erfindung beinhaltet das Detektieren eines von der Konzentra tion einer Reportersubstanz in der Zelle abhängigen Signals, das mit Hilfe eines in der Zelle ex- primierten Sensorproteins erzeugt wird.
Bevorzugt ist das Signal ein Fluoreszenz-Signal, ein Biolumineszenz-Signal oder ein Absorpti onssignal.
Das Sensorprotein ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kationen-spezifi- schen Proteinsensoren, Aminosäure-spezifischen Proteinsensoren und Kombinationen davon, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Ca2+-spezifischen Proteinsensoren, L-Glu-spezifi- schen Proteinsensoren und Kombinationen davon. Besonders bevorzugt ist das Sensorprotein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus R-GECO-1 (SEQ ID NO:23), G-GECO-1 (SEQ ID NO:24), iGluSnFR (SEQ ID NO:25) und Varianten der genannten Sensorproteine, insbesondere solcher Varianten, die eine Sequenzidentität mit der Proteinsequenz mindestens eines der Sen sorproteine R-GECO-1, G-GECO-1 und iGluSnFR von mindestens 90%, weiter bevorzugt min destens 95%, weiter bevorzugt mindestens 98%, weiter bevorzugt mindestens 99% aufweisen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbesondere dazu geeignet, verschiedene Vari anten eines Sensorproteins miteinander zu vergleichen und aus der Vielzahl der Varianten sol che mit gewünschten Eigenschaften auszusuchen. Relevante Eigenschaften für die Auswahl bestimmter Sensorproteine können beispielsweise die Signalstärke pro Reportersubstanz und/oder die zeitliche Auflösung des Sensorproteins sein. Häufig ist es wünschenswert, Sensor proteine mit besonders hoher Sensitivität und/oder Spezifität im Hinblick auf die jeweilige Re portersubstanz auszuwählen.
Dem Fachmann ist bekannt, was unter einer Sequenzidentität zwischen zwei Proteinsequenzen zu verstehen ist und wie diese bestimmt werden kann. Wenn eine bestimmte Sequenz mit einer im Sequenzprotokoll der vorliegenden Erfindung aufgeführten Sequenz verglichen werden soll, kann insbesondere einer der bekannten Sequenzvergleichsalgorithmen verwendet werden, bei spielsweise BLAST. Ein Vergleich der beiden Sequenzen ermöglicht eine einfache Bestimmung der Anzahl der Aminosäuren, die in beiden Sequenzen in identischer weise Vorkommen. Der Ausdruck „Sequenzidentität bezeichnet das Verhältnis der Anzahl dieser identischen Amino säuren zur Gesamtanzahl der Aminosäuren der im Sequenzprotokoll der vorliegenden Erfin dung aufgeführten Sequenz.
Die Reportersubstanz ist bevorzugt ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kationen, Ami nosäuren, Peptiden, Proteinen sowie Stoffwechselprodukten und -Intermediaten (wobei die Stoffwechsel produkte und -Intermediate insbesondere aromatische Stoffe wie z.B. 3,4-Hydro- benzoesäure, 4-Hydroxybenzoesäure, 1,2-Catechol sowie cis-cis- Mukonsäure umfassen), und Kombinationen davon. Besonders bevorzugt ist die Reportersubstanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Kationen, Aminosäuren und Kombinationen davon, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Ca2+, Glutamat und Kombinationen davon.
Die Reportersubstanz kann ein Kation sein. Verschiedene Kationen sind als Reportersubstan zen geeignet. Bevorzugt ist die Reportersubstanz ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Ca2+, Na+, K+, Mg2+, Zn2+ und Kombinationen davon. Besonders bevorzugt ist die Reportersub stanz Ca2+.
Die Reportersubstanz kann eine Aminosäure sein. Verschiedene Aminosäuren sind als Repor tersubstanzen geeignet. Bevorzugt ist die Aminosäure ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Glutamat (L-Glu), Glycin (L-Gly), Threonin (L-Thr) und Kombinationen davon. Eine beson ders bevorzugte Aminosäure ist Glutamat (L-Glu).
Mit dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es möglich die Eigenschaften verschiedener Memb ranproteine miteinander zu vergleichen. Bevorzugt ist das Membranprotein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus porenbildenden Membranproteinen, Membrantransportern und Kombi nationen davon, insbesondere aus der Gruppe bestehend aus Pinholinen (insbesondere S21-68, S21-71, S21-71 M4A, SGSATMD1-S2168, TVMVATMD1-S2168), Holinen (S105 , S107 , S107-M3A, T4, ^Ac-Taii AN-Taii^Ac-Taii^ vira|en Kaliumkanälen (insbesondere KCV NTS, KCV NTS G77S, KCV PBCV1), Be standteilen des Toxin/Antitoxin (TA) Systems (insbesonder HokB, TisB), Hämolysin-Proteinen (insbesondere aHLA), künstlichen Poren (insbesondere cWZA), Protonen-Portern (insbeson dere BM2), HCV-Membranproteinen (insbesondere HCV TME1 , HCV TME2) und Kombinatio nen davon, besonders bevorzugt aus der Gruppe bestehend aus Holinen, Pinholinen, lonenka- nälen und Kombinationen davon. Ganz besonders bevorzugt ist das Membranprotein ausge wählt aus der Gruppe bestehend aus S21-68 (SEQ ID NO:1), S21-71 (SEQ ID NO:2), S21-71 M4A (SEQ ID NO:3), SGSATMD1-S2168 (SEQ ID NO:4), TVMVATMD1-S2168 (SEQ ID NO:5), S105 (SEQ ID NO:6), S107 (SEQ ID NO:7), S107-M3A (SEQ ID NO:8), T4 (SEQ ID NO:9), T4AC- ail (SEQ ID NO:10), AN-TaiiT4Ac-Taii (SEQ |D N0:11), KCV NTS (SEQ ID NO: 12), KCvNTS G77S (SEQ ID NO:13), KcvPBCV1 (SEQ ID NO:14), HokB (SEQ ID NO:15), TisB (SEQ ID NO:16), aHLA (SEQ ID NO:17), cWZA (SEQ ID NO:18), BM2 (SEQ ID NO:19), HCV TME1 (SEQ ID NO:20), HCV TME2 (SEQ ID N0:21) und Varianten der genannten Proteine, insbesondere solcher Varianten, die eine Sequenzidentität mit mindestens einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 1-21 von min destens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95%, weiter bevorzugt mindestens 98%, weiter be vorzugt mindestens 99% aufweisen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung ist insbeson dere dazu geeignet, verschiedene Varianten eines Membranproteins miteinander zu verglei chen und aus der Vielzahl der Varianten solche mit gewünschten Eigenschaften auszusuchen. Eine besonders relevante Eigenschaft für die Auswahl bestimmter Membranproteine kann bei spielsweise das Ausmaß der Durchlässigkeit für eine Reportersubstanz sein. Häufig ist es wün schenswert, Membranproteine mit besonders hoher Sensitivität und/oder Spezifität im Hinblick auf die jeweilige Reportersubstanz auszuwählen.
Weitere bevorzugte Membranproteine sind S21-66 (SEQ ID NO:28), S21-64 (SEQ ID NO:29), S21-62 (SEQ ID NO:30), S21-60 (SEQ ID NO:31), S21-58 (SEQ ID NO:32), S21-56 (SEQ ID NO:33), S21-54 (SEQ ID NO:34), S21-52 (SEQ ID NO:35), S21-50 (SEQ ID NO:36), S21-48 (SEQ ID NO:37), S21-46 (SEQ ID NO:38), S21-44 (SEQ ID NO:39), S21-42 (SEQ ID NO:40), S21-40 (SEQ ID NO:41), S21-38 (SEQ ID NO:42) und Varianten der genannten Proteine, insbesondere solcher Varianten, die eine Sequenzidentität mit mindestens einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 28-42 von mindestens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95%, weiter bevorzugt mindes tens 98%, weiter bevorzugt mindestens 99% aufweisen. Besonders bevorzugte Membranprote ine sind S21-64 (SEQ ID NO:29), S21-62 (SEQ ID NO:30), S21-60 (SEQ ID NO:31), S21-58 (SEQ ID NO:32), S21-56 (SEQ ID NO:33), S21-54 (SEQ ID NO:34), S21-52 (SEQ ID NO:35), S21-50 (SEQ ID NO:36), S21-48 (SEQ ID NO:37), und Varianten der genannten Proteine, insbesondere solcher Varianten, die eine Sequenzidentität mit mindestens einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 29-37 von mindestens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95%, weiter bevorzugt mindes tens 98%, weiter bevorzugt mindestens 99% aufweisen. Ganz besonders bevorzugt ist die Pin- holin-Variante S21-48 (SEQ ID NO:37) sowie Varianten davon, insbesondere solche Varianten, die eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO:37 von mindestens 90%, weiter bevorzugt mindes tens 95%, weiter bevorzugt mindestens 98%, weiter bevorzugt mindestens 99% aufweisen.
Weitere bevorzugte Membranproteine sind N-terminale Varianten von S21-71 gemäß SEQ ID NO:43 sowie Varianten davon, insbesondere solche Varianten, die eine Sequenzidentität mit SEQ ID NO:43 von mindestens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95%, weiter bevorzugt min destens 98%, weiter bevorzugt mindestens 99% aufweisen. In SEQ ID NO:43 kann an jeder der durch „Xaa“ angezeigten Positionen unabhängig voneinander Ala, Arg, Asn, Asp, Gin, Glu, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Phe, Ser, Thr, Trp, Tyr oder Val vorgesehen sein. Besonders bevorzugte Membranproteine sind die N-terminalen Varianten von S21-71 gemäß SEQ ID NO:44 (Klon P14E5), SEQ ID NO:45 (Klon P14C11), SEQ ID NO:46 (Klon P15D3),
SEQ ID NO:47 (Klon P7D10), SEQ ID NO:48 (Klon P3G3), SEQ ID NO:49 (Klon P3E5), und Varianten der genannten Proteine, insbesondere solche Varianten, die eine Sequenzidentität mit mindestens einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 44-49 von mindestens 90%, weiter be vorzugt mindestens 95%, weiter bevorzugt mindestens 98%, weiter bevorzugt mindestens 99% aufweisen.
Das Durchmusterungsverfahren der vorliegenden Erfindung zeichnet sich gegenüber bekann ten Verfahren insbesondere durch sein hohes zeitliches Auflösungsvermögen aus. Das zeitliche Auflösungsvermögen wird insbesondere durch die Geschwindigkeit der Expression sowie die Geschwindigkeit des Membranproteins bei der Erhöhung der Durchlässigkeit der Zellmembran für die Reportersubstanz bestimmt. Hinzu kommen weitere Faktoren, beispielsweise die Emp findlichkeit der Methode der Detektion des Signals. Eine besonders hohe zeitliche Auflösung kann beispielsweise mit Hilfe dynamischer Einzelzellmessungen mittels Mikrofluidik erreicht werden.
Bevorzugt wird Schritt d) höchstens 120 Minuten, bevorzugt höchstens 60 Minuten, weiter be vorzugt höchstens 45 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 30 Minuten, weiter bevorzugt höchs tens 15 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 10 Minuten nach Schritt c) durchgeführt. Einen ge wissen zeitlichen Abstand zwischen den Schritten c) und d) einzuhalten, beispielsweise mindes tens 2 Minuten oder mindestens 5 Minuten, kann jedoch vorteilhaft sein, insbesondere um eine besonders robuste Signaldetektion zu gewährleisten.
Die Zeit zwischen den Schritten c) und d) kann flexibel der jeweils zu untersuchenden Kinetik angepasst werden. In Ausführungsformen der Erfindung erfolgt die Detektion gemäß Schritt d) in einem Zeitraum von 2 bis 1000 Minuten, beispielsweise 5 bis 750 Minuten, 10 bis 500 Minu ten, 15 bis 400 Minuten, 20 bis 300 Minuten, 30 bis 240 Minuten, 45 bis 180 Minuten oder 60 bis 150 Minuten nach dem Induzieren gemäß Schritt c) des Verfahrens. Bevorzugt wird Schritt d) höchstens 1000 Minuten, bevorzugt höchstens 750 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 500 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 400 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 300 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 240 Minuten nach Schritt c) durchgeführt.
Die vorliegende Erfindung betrifft auch ein Kit zur Durchführung des Durchmusterungsverfah rens. Bevorzugt umfasst das Kit i. DNA kodierend für mindestens zwei Membranproteine und DNA kodierend für ein Sensor protein, oder ii. DNA kodierend für mindestens zwei Sensorproteine und DNA kodierend für ein Membran protein.
Im Fall i. enthält das Kit bevorzugt DNA kodierend für mindestens 5, bevorzugt mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 50, weiter bevorzugt 102 bis 108 Membranproteine. Im Fall ii. enthält das Kit bevorzugt DNA kodierend für mindestens 5, bevor zugt mindestens 10, weiter bevorzugt mindestens 20, weiter bevorzugt mindestens 50, weiter bevorzugt 102 bis 108 Sensorproteine. Die DNA für die verschiedenen Membranproteine (Fall i.) bzw. Sensorproteine (Fall ii.) liegt bevorzugt in separater Form im Kit vor. Dies erleichtert es, das Verfahren gezielt mit den gewünschten Proteinen durchzuführen.
Die DNA liegt bevorzugt in Form von Plasmid-DNA vor.
Die DNA kann in isolierter Form im Kit vorhanden sein, beispielsweise in getrockneter Form o- der in Form von Lösungen. Die DNA kann sich auch innerhalb von Zellen befinden. In diesem Fall sind die Zellen ebenfalls Bestandteil des Kits.
Das Kit kann auch die Reportersubstanz umfassen, beispielsweise in Form eines Salzes.
Kurze Beschreibung der Figuren
Abbildung 1 : Bilden oder Öffnen einer (Protein-)Nanopore mit promisker bzw. konkret Ca2+ spezifischer Durchlässigkeit, beispielsweise in der inneren Membran von Escherichia coli, führt zum Einströmen bzw. Ausströmen von Ca2+. Die Möglichkeit kann folglich genutzt werden um die Liganden-abhängige Fluoreszenz eines genetisch-kodierten Sensors im Zellinneren auf Einzelzellebene zu vermessen. In der Praxis ermöglicht dies die Konstruktion porenbildender Membranpeptides mittels verschiedener Durchmusterungsformate von Mikrotiterplatten bis auf Einzelzellebene mittels eines Durchflusszytometers.
Abbildung 2: Bilden oder Öffnen einer (Protein-)Nanopore mit promisker Durchlässigkeit, bei spielsweise in der inneren Membran von Escherichia coli, führt zum Einströmen bzw. Ausströ men eines Liganden wie z.B. eines spezifischen Stoffwechselprodukts. Die Möglichkeit kann folglich genutzt werden um die Liganden-abhängige Fluoreszenz eines genetisch-kodierte Sen soren im Zellinneren auf Einzelzellebene zu vermessen. In der Praxis ermöglicht dies die Kon struktion massgeschneiderter Proteinsensoren mittels verschiedener Durchmusterungsformate bis auf Einzelzellebene mittels eines Durchflusszytometers.
Abbildung 3: Assay Validierung mit (A) pACYCT2-TVMVATMD1-S2168 (negativ Kontrolle) und (B) pACYCT2-SGSATMD1-S2168 (positiv Kontrolle) je in Doppeltransformation mit pPRÖ24-R- GEC01 im Mikrotiterplatten-Test. Während die pACYCT2-TVMVATMD1-S2168 Variante nach In duktion eine stetige ODeoonm Zunahme und somit unverändertes Wachstum zeigt, stagniert die Wachstumsurve bei der pACYCT2-ATMD1-S2168 Variante zeitnah. Korrelierend dazu sieht man im Fluoreszenzkanal (Ex: 555 nm; Em: 600 nm) einen sigmoidalen Anstieg des R-GEC01 Sig nals bei der toxischen SGSATMD1-S2168 Variante, während die negativ Kontrolle TVMVATMD1- S2168 eine stetige Basislinie zeigt; Die gestrichelte Linie zeigt die Induktion durch 0,5 mM IPTG bei 120 min (SD, n=3).
Abbildung 4: Analyse der porenbildender Eigenschaften für die wildtyp Holine bzw. Pinholine S21-68 und S105 sowie die zugehörigen Anti-Holine/Pinholine.
Abbildung 5: Analyse der porenbildender Eigenschaften für das wildtyp T4 Holin sowie daraus abgeleitete Holin-Fragmente mit deletierten N- und C-terminalen Domänen.
Abbildung 6: Analyse der porenbildender Eigenschaften für verschiedene Varianten von Kcv- Kanälen mit unterschiedlichen Öffnungszuständen.
Abbildung 7: Analyse der porenbildender Eigenschaften für verschiedene Nanoporen HokB, TisB, cWZA sowie a-Hemolysin.
Abbildung 8: Analyse der porenbildender Eigenschaften für verschiedene Nanoporen und T ransmembranpeptide.
Abbildung 9: Modelselektion für die 1:5 Verdünnung von pACYCT2-SGSATMD1-S2168 zu pACY CT2-TVMVATM D 1 -S2168 (20 % positive Kontrolle und 80 % negativ Kontrolle) + pPRÖ24-R- GEC01. (A) Blank H6, Positiv Kontrolle H7-H9; Negativ Kontrolle H10-H12. Die Werte von A (vor Induktion) und B (nach Induktion) sind RFU (Ex: 555nm; Em: 600nm) geteilt durch die ODeoonm; C zeigt das Verhältnis von B zu A. (B) Nach Induktion von R-GEC01 aber vor der In duktion der Pore ist das Signal durchgehend niedrig. Wird die Pore induziert, so steigt die Fluo reszenz einzelner Kavitäten, die die positiv Kontrolle pACYCT2-ATMD1-S2168 beinhalten. (C) Zur besseren Verdeutlichung kann das Verhältnis von B zu A dargestellt werden und der Schwellenwert ermittelt werden. Der Blank in H6 zeigt bei A und B ein positives Signal, da die Autofluoreszenz des Mediums geteilt durch eine sehr niedrige ODeoonm (da keine Bakterien darin vorhanden sind) ein extrem hohes Signal gibt.
Abbildung 10: Modelselektion für die 1 :10 Verdünnung von pACYCT2-ATMD1-S2168 zu pACY CT2-TVMVATM D 1 -S2168 (20 % positive Kontrolle und 80 % negativ Kontrolle) + pPRÖ24-R- GEC01. (A) Blank H6, Positiv Kontrolle H7-H9; Negativ Kontrolle H10-H12.Die Werte von A (vor Induktion) und B (nach Induktion) sind A.U. (Ex: 555nm; Em: 600nm) geteilt durch die OD6oonm; C zeigt das Verhältnis von B zu A. Ähnlich wie bei der 1 :5 Modelselektion ist das Sig nal nach Induktion von R-GEC01 , aber vor Induktion der Pore niedrig. (B) Nach Induktion der Pore steigt auch hier da Signal (Ex: 555nm, Em: 600nm) in einzelnen Kavitäten stark an. (C) Setzt man die Daten nach der Induktion und vor der Induktion der Pore ins Verhältnis, kann das Signal zu Rausch Verhältnis noch mal verbessert werden. Der Blank in H6 zeigt bei A und B ein positives Signal, da die Autofluoreszenz des Mediums geteilt durch eine sehr niedrige ODeoonm (da keine Bakterien darin vorhanden sind) ein extrem hohes Signal gibt.
Abbildung 11 : Übersicht der porenbildenden Eigenschaften aus der 3xNNKs21-68 Bibliothek ge messen an der Halbmaximalen Zeit. Holine und Pinholin Fragment sind jeweils als Referenz miteingetragen.
Abbildung 12: Übersicht der porenbildenden Eigenschaften aus der 3xNNKs21-68 Bibliothek ge messen an der Steigung. Holine und Pinholin Fragment sind jeweils als Referenz miteingetra gen.
Abbildung 13: Charakterisierung fünf einzelner Varianten die aus der 3xNNKs21-68 Bibliothek se lektiert wurden. Die selektierten Varianten weisen dabei in Abhängigkeit N-terminaler Mutatio nen jeweils unterschiedliche Neigungen Poren zu bilden.
Abbildung 14: Nach Expression verschiedener porenbildender Membranpeptide wurde mittels eines fluoreszenten SDS-PAGE der Ausfluss des GECOs aus der Zelle quantitativ im Zellpellet und im Überstand ermittelt (letzteres wird als Verlust der zelluläre Integrität gewertet). Dabei wurde der GECO und die verschiedenen Nanoporen wie angezeigt für unterschiedliche Zeiten exprimiert. Im Gegensatz zu SGSATMD1-S2168 und BM2, führt die Expression des T4 Holins und HokB in der exponentiellen Wachstumsphase zu einer kompletten Lyse (— R-GECO 2h // Pore 3h). Die Antiholine S21-71 und S107 sowie TisB führen zu gemittelten Werten. Bei den Anti-Holi- nen S21-71 und S107 ist jedoch zu bedenken, dass durch Verschieben des Translationsrasters auch die porenbildenden Holine exprimiert werden können und somit zu einem überdurch schnittlichen hohen Lyse der Zelle führen können.
Abbildung 15: Zeitaufgelöste Messung des GECO bedingenten Fluoreszenz im Pellet im Ver gleich zum Überstand in Abhängigkeit zum Zellwachstum gemessen anhand der OD600. Für SGSATMD1-S2168 sowie den BM2 Protonenkanal bleibt die Fluoreszenz bei stagnierendem Wachstum erhalten. Im Gegensatz dazu führt die Expression von HokB und des T4 Holins zu einem Verlust der zellulären Integrität und einer zeitabhängigen Zunahme der Fluoreszenz im Überstand. Abbildung 16: Assay Validierung mit den Pinholin-Fragmenten in Doppeltransformation mit pPR024-R-GEC01. Aufnahme der Fluoreszenz von Kolonien bei 520 nm für 0,3 s. p <0,0001. N=2, n>180.
Abbildung 17: Beispielbild für die Modellselektion von pACYCT2-SGSATMD1-S2168 zu pACY CT2-TVMVATM D 1 -S2168 (20 % Positiv-Kontrolle und 80 % Negativ-Kontrolle) + pPR024-R- GEC01. Die Kolonien der Positiv-Kontrolle erscheinen jeweils dunkel bis schwarz im Gegen satz zu Kolonien der Negativ-Kontrolle, die hellgrau erscheinen.
Abbildung 18: Beispielhafte FACS Zytogramme. All Events (Alle Ereignisse) (Diagramme Links): Bezieht sich auf Forward und Backward Scatter und bietet ein Indiz für die zelluläre In tegrität (bleibt unabhängig von der Expression von jeweils SGSATMD1-S2168 und TVMVATMD1- S2168 erhalten); M (Diagramme Rechts): Bezieht sich auf Fluoreszenz in Abhängigkeit der Ex pression von jeweils SGSATMD1-S2168 und TVMVATMD1-S2168 (zusätzlich aufgetrennt nach dem Forward Scattefy Zu erkennen sind zwei unterschiedliche Population abhängig von der Expres sion der zwei unterschiedlichen Membranpeptide; M (Diagramm Unten): Bezieht sich aus schliesslich auf das GECO-bedingte Fluoreszenzsignal. Zu erkennen sind wieder zwei unter schiedliche Population abhängig von der Expression der zwei unterschiedlichen Membranpep tide.
Abbildung 19: Beispielhafte FACS Zytogramme. All Events (Alle Ereignisse) (Diagramm, Links Oben): Bezieht sich auf Forward und Backward Scatter und bietet ein Indiz für die zellu läre Integrität (bleibt unabhängig von der Expression SGSATMD1-S2168 und TVMVATMD1-S2168 erhalten); M: Bezieht sich auf die Verteilung des Fluoreszenzsignal (in Abhängigkeit des For ward Scatters). Das markierten Gate (eingekreist) markiert den Bereich, der vorselektiert wird; Fluoreszenz All Events (Alle Ereignisse) (Diagramm, Rechts Oben): Bezieht sich auf die Verteilung des Fluoreszenzsignals innerhalb des vorselektierten Gates (diesmal unbhängigkeit vom Forward Scattefy U: Bezieht sich ausschliesslich auf die Verteilung des fluorezenten Sig nals im vorselektierten Gate, in dem in finaler Instanz die Events (d.h. Ereignisse) mit der höchsten Fluoreszenz selektiert werden (in diesem Fall 17.1%). 1: DNA Leiter; 2: PCR Frag ment SGSATMD1-S2168; 3: PCR Fragment TVMVATMD1-S2168; 4: Pre-Selektions PCR; 5: Post- Selektions PCR.
Abbildung 20: Expression des iGluSNFr führt zu einem Anstieg der Fluoreszenz, die durch Koexpression des porenbildenden Peptids SGSATMD1-S2168 zu einem Ausfluss von L-Glu aus der Zelle und somit Reduktion der Fluoreszenz bewirkt. Keine Reduktion der Fluoreszenz ist zu beobachten bei Koexpression des Protonenkanals BM2 sowie des nicht-porenbildenden Memb ranpeptids TVMVATMD1-S2168. Abbildung 21 : Expression des iGluSNFr führt zu einem Anstieg der Fluoreszenz, die durch Koexpression der porenbildenden Peptide S21-71-M4A, S107-M3A und HokB zu einem Ausfluss von L-Glu aus der Zelle und somit Reduktion der Fluoreszenz bewirkt.
Abbildung 22: Expression des iGluSNFr führt zu einem Anstieg der Fluoreszenz. Koexpression verschiedenen K+-Ieitenden lonenkanäle bewirkt jedoch keinen Ausfluss von L-Glu und somit keine Reduktion der Fluoreszenz.
Abbildung 23: Beispielhafte Bildausschnitte der fluoreszenz-mikroskopischen Aufnahmen von Zellen in der mikrofluidischen Kultivierungskammer dargestellt für das S2168 Pinholin zu vier verschiedenen Zeitpunkten nach 21 min (0:21 h), 63 min (1:03 h), 105 min (1 :45 h) und 399 min (6:39 h).
Abbildung 24: Zusammenfassung des fluoreszenten Signalverlaufs für das S2168 Pinholin so wie für das T4 Holin in einer mikrofluidischen Kultivierungskammer. Für die Auswertung wurden alle Zellen aus einer einzelnen Kultivierungskammer die Fluoreszenz in Relative Fluorescence Units (RFU) gegen die Zeit aufgetragen. Die Induktion der Nanopore ist mit einer gestrichelten Linie dargestellt.
Abb. 25: Vergleich der 3xNNKS2168 Bibliothek jeweils untersucht im Kontext der zwei unter schiedlichen Expressionsvektoren pCTRL2 und pCTRL2.T7.100.sRBS. Die Streuung der halb maximalen Zeit c und der Steigung d ist im Falle des schwächer exprimierenden Promoters pCTRL2.T7.100.sRBS grösser als im Vergleich zum pCTRL2 im Kontext des T7.wt.sRBS Pro moters. Nutzen eines schwächer exprimierenden Promoters ermöglicht beispielhaft im Kontext einer Bibliotheksselektion eine bessere Differenzierung der porenbildenden Eigenschaften.
Abb. 26A: Zusammenfassung des fluoreszenten Signalverlaufs für die 3xNNKs2168 Bibliothek in Mikrotiterplatten. Zur Analyse wurde für jede einzelne Aminosäure an den drei verschiedenen Positionen Xi, X2 und X3 (im Graphen jeweils gekennzeichnet als Position 1, Position 2 und Po sition 3) um jeweils die durchschnittliche halbmaximale Zeit c und die durchschnittliche Steigung d zu berechnen. Die Durchschnittswerte wurden dabei unabhängig vom Kontext der Sequenz berechnet.
Abb. 26B: Zusammenfassung des fluoreszenten Signalverlaufs für die 3xNNKs2168 Bibliothek in Mikrotiterplatten. Zur Analyse wurde für die einzelnen Aminosäuren an den drei verschiedenen Positionen Xi, X2 und X3 (im Graphen jeweils gekennzeichnet als Position 1, Position 2 und Po sition 3) in Gruppen mit vergleichbaren chemischen Eigenschaften zusammengefasst, um je weils die durchschnittliche halbmaximale Zeit c und die durchschnittliche Steigung d zu berech nen. Die Durchschnittswerte wurden dabei unabhängig vom Kontext der Sequenz berechnet. Abb. 27: Zusammenfassung des fluoreszenten Signalverlaufs für die S2168 Trunkierungsbiblio thek in Mikrotiterplatten. Zur Auswertung wurden die kinetische Verlaufskurven für die einzelnen Trunkierungsvarianten mit Gleichung 1 empirisch gefittet, um die halbmaximale Zeit c und die Steigung d quantitativ zu ermitteln.
Abb. 28: Zusammenfassung des fluoreszenten Signalverlaufs für die S2168 Trunkierungsbiblio thek in Kolonien auf Agarplatten. Für die Auswertung wurden die Daten von einem konstanten Bildausschnitt der Agarplatte mit Hilfe einer Bildauswertungssoftware analysiert und die maxi male Fluoreszenz gegen die Zeit aufgetragen. Die Zahlen entlang der X-Achse weisen jeweils die Trunkierungsvariante aus.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung soll durch die folgenden Beispiele näher erläutert werden.
Übersicht Expressionskonstrukte und Durchmusterungsstämme für Nanoporen und lo- nenkanäle
Protein Expressionskonstrukte:
• pPR024: Das pPR024 Plasmid beinhaltet einen Klasse A Ori und einen titrierbaren Propionat-Induzierbaren Promotor (Environmental Microbiology, 2005, 71, 6856-62). Dieser ermöglicht eine flexible Steuerung der Expression eines molekularen Sensors wie z.B. den Ca2+-spezifischem R-und G-GECOs ( Science , 2011, 333, 1888-1891).
• pOSIP-CH: Das pOSIP-CH ermöglicht den Einbau von Genexpresssions Kassetten von Ko-Expression in definierte Stellen des E.coii Genoms. Konkret wird der Einbau durch Ko-Expression der HK022 Integrase ermöglicht. Integration von Genexpressi- ons-Kasette z.B. für die R- und G-GECO Sensoren ermöglicht eine stabilere Propa gierung und Expression der R- und G-GECOs Kasetten in E.coii (bedingt durch gleichmäßige Copy Numbers).
• pACYCT2: Das pACYCT2 Plasmid beinhaltet einen Klasse B Ori (p15A) + Chlora- mphenikol Resistenz und einen tac Promotor, der durch IPTG induziert werden kann (Nucleic Acids Research, 2013, 41, e150). Dient als Expressionsvektor für verschie dene Pinholine sowie daraus abgeleitete Varianten des S21-68 Pinholine: Insbe- sonde die poren- und nicht-porenbildenden Membranpeptide SGSATMD1-S2168 (PNAS, 2009, 106, 18966-18971) und TVMVATMD1-S21-68. • pTeT7W: Dual Promotor Vektor basierend auf dem pACYCT2 Backbone mit p15A Ori + Chloramphenikol Resistenz und Lacl Repressor zur unabhängigen Ko-Expres- sion zweier Proteine. Zusätzlich zu den gegebenen Elementen des pACYCT2 wurde eine TetR Expressionskasette mitsamt Promotor aus dem pASK und der tac mit dem T7 Promoter aus dem pET24 ersetzt. Dies ermöglicht die Expression der zwei Prote ine mittels IPTG und Tetrazyklin.
• pCTRL2: Expressionsvektor zur Expression toxischer Membrankanäle und Memb ranpeptide. Basiert auf dem pACYCT2 Vektor. Die Genexpressionskasette ist beid- seitg flankiert von Transkriptionsterminatoren ( ACS Synthetic Biology, 2015, 20, 4, 265-73) und die basale Expression potentiell nicht spezifischer Proteine zu suppri- mieren. Die Expression geschieht unter Kontrolle einer Lacl Repressor Mutante mit erhöhter Supprimierung der Genexpression ( Microbial Cell Factories, 2013, 12, 67). Der zugrunde liegende Promotor ist in der vorliegenden Offenbarung jeweils mit T7.wt.sRBS bezeichnet. Die Transkriptionskassette im Kontext des pCTRL2 mit T7.wt.sRBS Promotor ist in SEQ ID NO:50 beispielhaft für die Expression des fluo reszenten Proteins mkO-Kappa gezeigt. Das fluoreszente Protein mkO-Kappa wird in den einzelnen Experimenten jeweils durch ein Membranprotein ersetzt.
• pCTRL2.T7.100.sRBS: Expressionsvektor zur Expression toxischer Membrankanäle und Membranpeptide. Basiert auf dem pACYCT2 Vektor. Die Genexpressionskas sette ist beidseitig flankiert von Transkriptionsterminatoren ( ACS Synthetic Biology, 2015, 20, 4, 265-73), um die basale Expression potentiell nicht spezifischer Proteine zu supprimieren. Die Expression geschieht unter Kontrolle einer Lacl Repressor Mu tante mit erhöhter Supprimierung der Genexpression ( Microbial Cell Factories, 2013, 12, 67). Im Vergleich zum pCTRL2 ist im pCTRL2.T7.100.sRBS der Abstand zwi schen der ribosombindenen Stelle und der Bindestelle für den Lac-Repressor in die sem Expressionsvektor verkürzt und bewirkt somit eine geringere Expression der je weiligen Nanopore. Der zugrunde liegende Promotor ist in der vorliegenden Offenba rung jeweils mit T7.100.sRBS bezeichnet. Die Transkriptionskassette im Kontext des pCTRL2.T7.100.sRBS mit T7.100.sRBS Promotor ist in SEQ ID NO:51 beispielhaft für die Expression des fluoreszenten Proteins mkO-Kappa gezeigt. Das fluoreszente Protein mkO-Kappa wird in den einzelnen Experimenten jeweils durch ein Membran protein ersetzt. E.coli Stämme zur Assay Entwicklung und Durchmusterung:
• BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01. Die BL21(DE3) E. coli wurden zusammen mit dem pPR024-R-GEC01 bzw. pPR024-G-GEC01 chemisch kompetent gemacht. Dieser Stamm ermöglicht die effiziente Transformation und Durchmusterung poren bildender Membranpeptide, Nanoporen und Ionen Kanäle, die über den pACYCT2, pTeT7W oder pCTRL2 exprimiert werden.
• BL21(DE3) mit genomisch integrierten R- und G-GEC01 : Dieser Stamm beinhal tet die Expressionskasette für R- bzw. G-GEC01 in einer genomisch integrierten Va riante. Konkret wurde das Gen für den R- bzw. G-GEC01 mittels des pOSIP-CH Plasmids stabil in die attB site des E.coli Genoms integriert ( ACS Synthetic Biology, 2013, 2, 537-41). Dieser Stamm ermöglicht die effiziente Transformation und Durch musterung porenbildender Membranpeptide, Nanoporen und Ionen Kanäle, die über den pACYC2, pTeT7Woder pCTRL2 eingeführt werden
Übersicht fluoreszierende Proteinsensoren, Nanporen und lonenkanäle
Übersicht fluoreszierender Proteinsensoren:
• R-GECO-1 : Rot fluoreszierender Ca2+-spezifischer Proteinsensor ( Science , 2011 , 333, 1888-1891). Wird bevorzugt im Mikrotiterplatten sowie im Kolonien-Format als genetisch kodierter Reporter genutzt um den Einfluss von Ca2+ nach Bilden einer Pore in der inneren Membran von E.coli zu detektieren.
• G-GECO-1 : Grün fluoreszierender Ca2+ spezifischer Proteinsensor ( Science , 2011 , 333, 1888-1891). Wird bevorzugt im Durchflusszytometer als genetisch kodierter Re porter genutzt um den Einfluss von Ca2+ nach Bilden einer Pore in der inneren Membran von E.coli zu detektieren.
• iGluSnFR: Bezeichnet eine Klasse fluoreszierender Proteinsensoren spezifisch für L-Glu ( Nature Methods, 2013, 10, 162-70). Wird genutzt um niedermolekulare Stoffe und Substanzen über Ca2+ hinaus zu detektieren bzw. Nanoporen abhängige Verän derung im fluroszenten Signal zu bewirken. Übersicht Membranproteine, lonenkanäle und porenbildende Membranpeptide:
Holine und Pinholine:
• S21-68: Wildtyp des S21-68 Pinholins des Bakteriophagen P21 mit ausgeprägten und definierten porenbildenen Eigenschaften ( PNAS , 2009, 106, 18966-18971). Exakter Mechanismus der Porenbildung ist derzeit unklar. Vermutet wird zunächst eine inak tive Konformation in Form einer antiparallen a-Helix mit jeweils zytosolischen N- und C-Termini die sich in der inneren Membran von E.coli ansammelt. Ein konzentrati onsbedingter Anstieg von S21-68 führt im Anschluss zu einem Flippen der ersten Transmembrandomäne durch den Lipid-Bilayer und zur Porenbildung. Vermutet wird eine definierte Pore bestehend aus sieben Subeinheiten und einem Membrankanal bestehend aus der zweiten Transmembrandomäne, der durch homomerische Inter aktionen der ersten Transmembrandomäne im Periplasma stabilisiert wird. (PNAS, 2013, 110, E2054-E2063)
Polypetidsequenz:
MDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGSLVLGFL- TYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:1)
• S21-68-Trunkierungen: N-terminale Trunkierungen des Wildtyps des S21-68 Pinho lins des Bakteriophagen P21.
Die Polypetidsequenzen sind in folgender Tabelle zusammengefasst:
• S21-71: Wildtyp des S21-71 Anti-Pinholins des Bakteriophagen P21. Im Vergleich zu
S21-68 ist der N-Terminus um drei zusätzliche Aminosäuren MKS erweitert, die die porenbildenden Eigenschaften einschränken. Exakter Mechanismus, wie die Poren bildung eingeschränkt wird ist nach jetzigem Stand des Wissens noch unklar ( Cur rent Opinion in Microbiology , 2013, 16, 790-797). Vermutet wird eine Rolle positiver Ladungen, die ein Flippen der ersten Transmembran Domäne verhindern.
Polypetidsequenz: MKSMDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGSLVLGFL- TYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:2)
• S21-71 M4A: Mutante des S21-71 Anti-Pinholins in der an vierter Stelle, das zweite Methion zu Alanin mutiert ist. Verhindert somit grundsätzlich die Expression des wildtyp S21-68 Pinholins, das im Fall von S21-71 durch Verschieben der Translations- initierungsstelle um drei Aminosäuren prinzipiell auch exprimiert werden kann. Im Vergleich zu S21-71 Anti-Pinholin ist die Porenbildung somit weiter verzögert.
Polypetidsequenz:
MKSADKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGSLVLGFL- TYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:3)
• N-terminale S21-71 Mutanten: N-terminale Mutanten des S21-71 Anti-Pinholins mit folgender Polypetidsequenz:
MXXXDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGSLVLGFL- TYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:43), wobei an jeder der durch „X“ ange zeigten Positionen unabhängig voneinander A, R, N, D, Q, E, G, H, I, L, K, F, S, T, W, Y oder V vorgesehen sein kann.
Besonders bevorzugte Sequenzen sind:
Klon P14E5: MYLEDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGS- LVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:44)
Klon P14C11: MNFEDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGS- LVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:45)
Klon P15D3: MDWDDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGS- LVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:46)
Klon P7D10: MAGWDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGS- LVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:47)
Klon P3G3: MWRGDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGS- LVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:48)
Klon P3E5: MFQWDKISTGIAYGTSAGSAGYWFLQWLDQVSPSQWAAIGVLGS- LVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:49) • SGSATMD1-S2168: Fragment des S21-68 Pinholins in dem die erste Transmembran Domäne ÄTMD1 deletiert wurde. Expression ist prinzipiell toxisch vermutlich auf grund der Fähigkeit mindestens transiente Poren in der inneren Membran von E.coli zu bilden (PN AS, 2009, 106, 18966-18971; Molecular Microbiology, 2010, 76, 68- 77).
Polypetidsequenz:
MSGSMWAAIGVLGSLVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:4)
• ^''DTMϋI-b^qd: Fragment des S21-68 Pinholins in dem die erste Transmembran Domäne TMD1 fehlt und die Schnittsequenz ETVRFQ’S der TVMV Protease N-ter- minal vorgeschaltet ist. Expression ist nicht toxisch vermutlich voraussichtlich be dingt durch die proteolytische TVMV Schnittstelle, die die porenbildenden Eigen schaften stark einschränkt.
Polypetidsequenz:
MSSSGGSETVRFQSGSMWAAIGVLGSLVLGFLTYLTNLYFKIREDRRKAARGE (SEQ ID NO:5)
• S105: Wildtyp des S105 Pinholins des Bakteriophagen l mit ausgeprägten porenbilde- nen Eigenschaften ( PNAS , 2010, 107, 2219-23). Im Gegensatz zum S21-68 Pinholin wird vermutet, dass das S105 Holin große pm-große Poren ausbildet. Exakter Me chanismus ist nach jetzigem Stand des Wissens jedoch unklar.
Polypetidsequenz:
M PEKH DLLAAI LAAKEQGIGAI LAFAM AYLRGRYNGGAFTKTVI DATMCAI I AWFI R- DLLDFAGLSSNLAYITSVFIGYIGTDSIGSLIKRFAAKKAGVEDGRNQ (SEQ ID NO:6)
• S107: Wildtyp des S107 Anti-Pinholins des Bakteriophagen l. Analog zum S21-71 Anti- Pinholin sind die porenbildenden Eigenschaften aufgrund zwei zusätzlicher Amino säuren MK am N-Terminus stark eingeschränkt. Exakter Mechanismus ist nach jetzi gem Stand des Wissens jedoch unklar (Molecular Microbiology, 1993, 8, 525-33).
Polypetidsequenz: MKMPEKHDLLAAILAAKEQGIGAILAFAMAYLRGRYNGGAFTKTVIDATMCAIIA- WFIRDLLDFAGLSSNLAYITSVFIGYIGTDSIGSLIKRFAAKKAGVEDGRNQ (SEQ ID NO:7)
• S107-M3A: Mutante des S107Anti-Pinholins in der an dritter Stelle das zweite Methion zu Alanin mutiert ist. Verhindert somit grundsätzlich die Expression des wildtyp S105 Holins, das im Fall von S107 durch Verschieben der Translationsinitierungsstelle um 3 Aminosäuren prinzipiell auch exprimiert werden kann. Im Vergleich zu S107 Anti-Holin ist die Porenbildung somit weiter verzögert.
Polypetidsequenz:
MKAPEKHDLLAAILAAKEQGIGAILAFAMAYLRGRYNGGAFTKTVIDATMCAIIA- WFIRDLLDFAGLSSNLAYITSVFIGYIGTDSIGSLIKRFAAKKAGVEDGRNQ (SEQ ID NO:8)
• T4 Pinholin: Wildtyp des T4 Pinholins des Bakteriophagen T4 mit stark ausgepräg ten porenbildenden Eigenschaften. Das T4 Pinholin besitzt eine Tansmembrando- mäne mit einem langen periplasmatischen C-Terminus und einem kurzen zytosoli- schen N-Terminus. Beide Termini werden laut Literatur durch einen Antiholin Mecha nismus reguliert, der gänzlich unterschiedlich verläuft als bei den bisher bekannten Holinen S105 und S2168 ( Journal of Bacteriology, 2016, 198, 2448-57). Das heißt, es wird derzeit keine Flipping einzelner Transmembran-Helices postuliert. Der genaue Mechanismus bleibt derzeit jedoch unklar.
Polypetidsequenz:
MAAPRISFSPSDILFGVLDRLFKDNATGKVLASRVAVVILLFIMAIVWYR- GDSFFEYYKQSKYETYSEIIEKERTARFESVALEQLQIVHISSEADFSA- VYSFRPKNLNYFVDIIAYEGKLPSTISEKSLGGYPVDKTMDEYTVHLNGRHYYSNLK- FAFLPTKKPTPEINYMYSCPYFNLDNIYAGTITMYWYRNDHISNDRLESICAQAARIL- GRAK (SEQ ID NO:9)
• T4AC Tai': Trunkierte Version des T4 Pinholins bei dem der periplasmatische gelegene C-Terminus deletiert wurde. Diese Variante ist nicht toxisch. Mechanismus bisher unbekannt.
Polypetidsequenz: AAPRISFSPSDILFGVLDRLFKDNATGKVLASRVAVVILLFIMAIVWY (SEQ ID NO:10)
• AN-Taii- ^Ac-Taii. -rrunkjerte Version des T4 Pinholins, das nur noch die Transmemb ranedomäne besitzt. Diese Variante ist toxisch, Mechanismus unbekannt.
Polypetidsequenz:
MVAVVILLFIMAIVWY (SEQ ID NO:11) lonenkanäle
• KcvNTS: Viraler Kaliumkanal der spezifisch Kalium leitet, aber auch Calcium durch lässt. (BBA- Biomembranes, 2014, 1838, 1096-1103).
Polypetidsequenz:
MLLLIIHLSILVIFTAIYKMLPGGMFSNTDPTWVDCLYFSASTHTTVGYGDLT- PKSPVAKLTATAHMLIVFAIVISSFTFPW (SEQ ID NO:12)
• KcvNTS G77S: Basierend auf KcvNTS mit einer Mutation an Position 77 von Glycin zu Se rin. Diese Mutation führt zu einer mittleren Offenwahrscheinlichkeit und somit zu ei ner Verringerung der Leitfähigkeit des Kaliumkanals.
Polypetidsequenz:
MLLLIIHLSILVIFTAIYKMLPGGMFSNTDPTWVDCLYFSASTHTTVGYGDLT- PKSPVAKLTATAHMLIVFAIVISGFTFPW (SEQ ID NO:13)
• KcvPBCV1: Viraler Kaliumkanal der spezifisch Kalium leitet, aber auch für Calcium durchlässig ist. Sehr geringe Offenwahrscheinlichkeit und somit geringe Leitfähigkeit (FEBS Lett, 2003, 552, 12-6).
Polypetidsequenz:
MLVFSKFLTRTEPFMIHLFILAMFVMIYKFFPGGFENNFSVANPDKKAS- WIDCIYFGVTTHSTVGFGDILPKTTGAKLCTIAHIVTVFFIVLTL (SEQ ID NO:14)
Weitere
• HokB: Porenbildendes Membranpeptid; Bildet Teil eines bakterielles Efflux bzw. To xin-Antitoxin Systems. Konkret bildet HokB Nanoporen in der inneren Membran und ermöglicht somit den unspezifischen Ausfluss toxischer Substanzen wie z.B. Antibio tika ( MBio . 2018, 9, pii: e00744-18).
Polypetidsequenz:
MKHNPLVVCLLIICITILTFTLLTRQTLYELRFRDGDKEV AALMACTSR (SEQ ID NO:15)
• TisB: Porenbildendes Membranpeptid; Bildet Teil eines bakterielles Efflux bzw. To xin-Antitoxin Systems. Konkret bildet TisB Nanoporen in der inneren Membran und ermöglicht somit den unspezifischen Ausfluss toxischer Substanzen wie z.B. Antibio tika (Biophysical Journal, 2012, 103, 1460-1469).
Polypetidsequenz:
MNLVDIAILILKLIVAALQLLDAVLKYLK (SEQ ID NO:16)
• aHLA: a-Hemolysin bezieht sich auf ein porenbildendes Toxin aus S. aureus (PN AS, 2008, 105, 19720-19725) Dient als prototypische Nanopore für eine Reihe von Stu dien und Vorhaben im Bereich des Nanopore Engineering, insbesondere im Er schlossen sensorischer Anwendungen. Solche Vorhaben sind jedoch fast aus schliesslich durch die Exprimierung von aHLA in zellfreien Systemen realisiert. Funk tionszustände werden entweder mittels hochauflösender biophysikalischer Methoden untersucht oder mit Blutzellen als Substrat. Wird grundsätzlich extrazellulär expor tiert, auch in E.coli.
Polypetidsequenz:
MKTRIVSSVTTTLLLGSILMNPVAGAADSDINIKTGTTDIGSNTTVKTGDLVTYDKEN-
GMHKKVFYSFIDDKNHNKKLLVIRTKGTIAGQYRVYSEEGANKS-
GLAWPSAFKVQLQLPDNEVAQISDYYPRNSIDTKEYMSTL-
TYGFNGNVTGDDTGKIGGLIGANVSIGHTLKYVQPDFKTI-
LESPTDKKVGWKVIFNNMVNQNWGPYDRDSWNPVYGNQLFMKTRNGSM-
KAADNFLDPNKASSLLSSGFSPDFATVITMDRKASKQQTNIDVIYERVRD-
DYQLHWTSTNWKGTNTKDKWTDRSSERYKI DWEKEEMTN (SEQ ID NO: 17)
• cWZA: Minimales porenbildendes Membranpeptid künstlich abgeleitet aus der Transmembranregion des Membranproteins Wza ( Nature Chemistry, 2017, 9, 411- 419). In rekonstituierten Lipidmembranbilayern bildet cWZA nachweislich definierte heptamerische Poren; Ist jedoch angewiesen auf ringförmige niedermolekulare Sub stanzen, die mit den einzelnen Membranpeptide assoziieren um stabile bzw. defi nierte Nanoporen in der Membran zu bilden.
Polypetidsequenz:
MAPLVRWNRVISQLVPTITGVHDLTETVRYIKTWPN (SEQ ID NO:18)
• BM2: Protonen Kanal aus dem Influenza B Virus ( Chemical Sciences, 2018, 9, 2365-2375).). Durchlässig ausschliesslich für Protonen, depolarisiert die innere Membran von E.coli, führt zum Zelltod. Dient als Kontrolle um die Spezifizität des po renbedingten Einflusses von Ca2+ in verschiedenen Durchmusterungsformaten zu überprüfen.
Polypetidsequenz:
MLEPFQILSISSFILSALHFIAWTIGHLNQIKR (SEQ ID NO:19)
• HCV TME1 und TME2: Transmembran Domänen des Hepatitis C Virus Hüllenpro teins, die an die Membran binden und toxisch wirken. (Biochim Biophys Acta, 2004, 28; 1660(1-2) : 53-65)
Polypetidsequenzen:
HCV-TME1: MIAGAHWGVLAGIAYFSMVGNWAKVLVVLLLFAGVDA (SEQ ID NO:20)
HCV-TME2: MEYVVLLFLLLADARVCSCLWMMLLISQAEA (SEQ ID NO:21)
Beispiel 1: Validierung des Fluoreszenz Assays in Mikrotiterplatten
Hintergrund:
Zunächst wurde das neuentwickelte Verfahren in E.coli im Mikrotiterplattenformat validiert. Ins besondere sollte geklärt werden inwieweit ein Einfluss von Ca2+ in Abhängigkeit der Expression einer Pore in der inneren Membran von E.coli mit einem Anstieg der Fluoreszenz verbunden ist. Als Modelpeptide dienten das porenbildende Membranpeptid SGSATMD1-S2168 sowie das nicht porenbildende Membranpeptid TVMVATMD1-S2168 als Positiv- bzw. als Negativkontrolle. Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Ko-Transformation des R-GEC01 und der zwei Pinholin Fragmente in chemisch kompeten ten E. coli:
• Jeweils einzeln transformiert:
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pACYCT2-SGSATMD1-S2168 (Positiv)
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pACYCT2-TVMVATMD1-S2168 (Negativ)
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter)
2. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 1. wurden gepickt und in Deep-Well Plat ten mit 300 pl LB-Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 1300 rpm kultiviert.
3. Mikrotiterplatten Read-Out:
• Nach der Kultivierung einzelner Klone über Nacht aus 2. wurde die ODeoo der Vorkul turen in Mikrotiterplatten (MTP) auf 0,1 eingestellt und die Proben, je 200 mI_, über 30 min bei 37°C und 180 rpm geschüttelt.
• Danach wurde zunächst der R-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, indu ziert und die Fluoreszenz über 120 min gemessen.
• Im Anschluss wurden dann die beiden Pinholin Fragmente mit 0,5 mM IPTG indu ziert und die Fluoreszenz über weitere 120 min gemessen.
• Allgemeine Information: Die Messung im Reader erfolgt bei 30°C alle 10 min. Zwi schen den Messungen wird die Platte bei 180 rpm geschüttelt. Gemessen wird die ODeoonm und die Fluoreszenz (Ex: 555 nm; Em: 600 nm). Das Volumen in den Kavitä ten beträgt 200 mI nach Zugabe aller Induktoren.
4. Experimentelle Auswertung:
• Für die Auswertung wurden die Daten von drei unterschiedlichen Kolonien gemittelt und jeweils die ODeoonm und in Relative Fluorescence Units (RFU) (Abb. 3) in einem Graphen aufgetragen. Aus den jeweiligen Kurven lassen sich im Anschluss verschie dene Funktionen und Eigenschaften ableiten: z.B. ob die Expression einer Nanopore toxische Auswirkungen hat oder gar zu einem Verlust der zellulären Integrität führt und wie dieser jeweils mit dem Ca2+-bedingten Anstieg eines fluoreszentem Signal korreliert. Hier können weitere Parameter herangezogen und quantifiziert werden wie z.B. die halbmaximale Zeit des Fluoreszenzsignals oder dessen Steigung.
Schlussfolgerung:
Insgesamt können porenbildende von nicht-porenbildende Membranpeptiden mittels des neu entwickelten genetischen Assay in E.coli quantitativ im Mikrotiterplatten-Format abgebildet und unterschieden werden. Verschiedene Parameter können dabei herangezogen werden um die porenbildendene Eigenschaften eines Membranpeptids, einer Nanopore oder eines lonenka- nals quantitativ zu charakterisieren (Abb. 3). Dies beinhaltet u.a. den zeitabhängigen Einfluss von Ca2+ (und damit verbundene Steigung des Fluoreszenzanstiegs oder die halbmaximale Zeit des Fluoreszenzsignals) sowie die OD600: Die Intensität des Fluoroeszenzsignals reflektiert u.a. die Fähigkeit eines Membranpeptids Poren in der inneren Membran zu bilden; Und die OD600 gibt komplementäre Informationen über die Toxizität eines porenbildenden Peptids und sowie die zelluläre Integrität wider.
Beispiel 2: Untersuchung der porenbildenden Eigenschaften verschiedener Membrapep- tide, Nanoporen und lonenkanäle in Mikrotiterplatten
Hintergrund:
Anschliessend wurde geklärt, ob bzw. wie einfach das entwickelte Verfahren auf weitere poren- bildendener Membranpeptide, Nanoporen und lonenkanäle angewendet werden kann. Hierfür testeten wir 19 verschiedene Varianten abgeleitet aus insgesamt 10 verschiedenen Klassen von Nanoporen bzw. lonenkanälen bezüglich eines Expressions-bedingten Anstiegs des fluo reszenten Signals in E.coli. Messungen wurden grundsätzlich im Mikrotiterplatten-Format durchgeführt. Die Ergebnisse sind zusammengefasst (Abb. 4) mit jeweils kurzen Erläuterungen (Tabelle 1).
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Ko-Transformation des R-GEC01 und der Porenbildenden Proteine in chemisch kompeten ten E. coli:
• Jeweils einzeln transformiert: BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-„Nanopore“ (Tabelle 1).
2. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 1. wurden gepickt und in Deep-Well Plat ten mit 300 pl LB-Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 1300 rpm kultiviert.
3. Mikrotiterplatten Read-Out:
• Nach der Kultivierung einzelner Klone über Nacht aus 2. wurde die Oϋdoo der Vorkul turen in Mikrotiterplatten (MTP) auf 0,1 eingestellt und die Proben, je 200 mI_, über 30 min bei 37°C und 180 rpm geschüttelt.
• Danach wurde zunächst der R-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, indu ziert und die Fluoreszenz über 120 min gemessen.
• Im Anschluss wurden dann die Poren mit 0,5 mM IPTG induziert und die Fluores zenz über weitere 120 min gemessen.
• Allgemeine Information: Die Messung im Reader erfolgt bei 30°C alle 10 min. Zwi schen den Messungen wird die Platte bei 180 rpm geschüttelt. Gemessen wird die ODeoonm und die Fluoreszenz (Ex: 555 nm; Em: 600 nm). Das Volumen in den Kavitä ten beträgt 200 mI nach Zugabe aller Induktoren.
4. Experimentelle Auswertung:
• Für die Auswertung wurden die Daten von drei unterschiedlichen Kolonien gemittelt und jeweils die ODeoonm und die Fluoreszenz in Relative Fluorescence Units (RFU) (Abb. 4-8) in einem Graphen aufgetragen. Aus den jeweiligen Kurven lassen sich dann verschiedene Eigenschaften ableiten. Dabei können je nach Kurvenverlauf un terschiedliche Eigenschaften und Funktionen abgeleitet werden: z.B. ob die Expres sion einer Nanopore toxische Auswirkungen hat oder gar zu einem Verlust der zellu lären Integrität führt und wie dieser jeweils mit dem Ca2+-bedingten Anstieg eines flu oreszentem Signal korreliert.
Schlussfolgerung:
Zusammenfassend insgesamt konnten 20 Varianten von 10 verschiedenen Nanoporen, lonnen- kanälen und Membranpeptiden mit dem Verfahren erfolgreich vermessen werden (Abb. 3. und Abb. 4-8). Die Experimente zeigen, dass der Einfluss von Ca2+ und somit ein Anstieg im fluo reszenten Signal ausschliesslich in Abhängigkeit der Porenbildung stattfindet und nicht etwa durch porenbedingte toxische Effekte, die die Integrität der Zellmembran beeinträchtigen. Dies beinhaltete u.a. auch den Protonenkanal BM2 abgeleitet aus dem Influenza B Virus, der nach weislich nur für Protonen, aber nicht Ca2+ durchlässig ist, als Negativkontrolle sowie trans- membran Peptide aus dem Hepatitis C Virus deren Expression toxisch für E.coli ist, aber nicht zu einem Einfluss von Ca2+ führt (Abb. 8). Darüber hinaus konnte nachgewiesen werden, dass K+ spezifische Kcv Kanäle eine promiske Durchlässigkeit bezüglich von Ca2+ Ionen haben, die in Abhängigkeit des Öffnungszustands zu unterschiedlich hohen fluoreszenten Signalen führen (Abb. 6). Insgesammt kann das Verfahren somit breite Anwendung finden um die porenbil dende Eigenschaften bzw. Durchflussspezifizität von lonenkanälen und Nanoporen quantitativ in E.coli zu vermessen.
Tabelle 1 : Übersicht der verschiedenen Klassen von Nanoporen und lonenkanälen, die mittels des neuartigen Verfahrens untersucht wurden.
Beispiel 3: Modelselektionsexperimente in Mikrotiterplatten
Hintergrund:
Ein wichtiger Aspekt bei der Entwicklung von Durchmusterungsverfahren besteht darin zu prü fen inwieweit eine funktionale Variante aus einer grösseren Menge nicht-funktionaler Varianten identifiziert, selektiert und angereichert werden kann. Dies wird üblicherweise in Modelselektio nen nachgewiesen in denen die DNA eines funktionalen Proteins relativ zu einem nicht-funktio nalem Protein verdünnt und dann mittels eines funktionalen Assays re-identifziert wird.
Im Zuge einer Modelselektion wird somit umfassend demonstriert, dass die Verbindung zwi schen Genotyp und Phänotyp - d.h. die physische Assoziation bzw. Zuordnung zwischen der Funktion eines Proteins und seiner kodierenden DNA - während des gesammten Durchmuste- rungszykluses erhalten bleibt. Im Kontext porenbildender Membranpeptide gilt auch zu prüfen inwieweit toxische Effekte verbunden mit den porenbildenden Eigenschaften der Membranpep tide z.B. beim Anwachsen aufgrund unspezifischer Expression - d.h. bevor diese einem funktio nalem Test unterzogen werden - negativ angereichert werden bzw. eine Selektion gegen die gewünschten Eigenschaften stattfindet. Als Modelpeptide dienten wie schon in Beispiel 1 SGSATMD1-S2168 als porenbildendes sowie TVMVATMD1-S2168 als nicht-porenbildendes Membranpeptid.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Ko-Transformation des R-GEC01 und der zwei Pinholin-Fragmente in chemisch kompeten ten E. coli. Der R-GEC01 konnte wie zuvor im pPR024 und die Pinholin-Fragmente im pTeT7W exprimiert werden.
• Folgende Kombinationen wurden jeweils als Verdünnung getestet:
^ Im Verhältnis 1:5 von SGSATMD1-S2168 zu TVMVATMD1-S2168 + R-GEC01 ^ Im Verhältnis 1:10 von SGSATMD1-S2168 zu TVMVATMD1-S2168 + R-GEC01
2. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der 1:5 und 1:10 Verhältnisse wurden zufällig gepickt und in Deep-Well Platten mit 500 pl LB-Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16h bei 30°C und 1300 rpm kultiviert.
• Dazu wurden jeweils 89 Kolonien gepickt
• Zusätzlich wurden pro 96-well Mikrotiterplatte 3x positiv Kontrollen und 3* negativ Kon trollen gezielt gepickt
• 1 Kavität wurde nur mit LB-Medium gefüllt als Kontrolle
• Die Deep-Well Platte wurde bei 4°C aufbewahrt
3. Vorbereitung für Mikrotiterplatten-Read-Out:
• Nach der Kultivierung über Nacht aus 2. wurde die Oϋboo der Vorkulturen in Mikrotiter platten (MTP) auf ungefähr 0,1 eingestellt und die Proben, je 200 pL, über 30 min bei 37°C und 180 rpm geschüttelt. Es wurde davon ausgegangen, dass alle anderen eine ähnliche ODeoonm haben und somit alle Proben gleich verdünnt werden können.
• Danach wurde zunächst der R-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, indu ziert und die Fluoreszenz über 120 min gemessen.
• Anschließend wurde die Expression der Pinholin Fragmente mit 0,5 mM IPTG indu ziert und die Fluoreszenz über weitere 120 min gemessen. • Allgemeine Information: Die Messung im Reader erfolgt bei 30°C alle 10 min. Zwi schen den Messungen wird die Platte bei 180 rpm geschüttelt. Gemessen wird die ODeoonm und die Fluoreszenz (Ex: 555 nm; Em: 600 nm). Das Volumen in den Kavitä ten beträgt 200 mI.
4. Experimentelle Auswertung
• Für die Auswertung wurden die Daten jeder Kavität: d.h. die ODeoonm sowie die Fluores zenz in Relative Fluorescence Units (RFU) jeweils getrennt aufgetragen. Zur Normie rung und besseren Verdeutlichung unabhängig von der Toxizität kann die Fluoreszenz auch durch die Oϋboo geteilt werden. Zur übersichtlicheren Auswertung sind im folgen den Endpunktmessungen dargestellt:
-> 120 min nach Natrium Propionat, aber vor IPTG Zugabe und Induktion der Pore (Abb. 9A sowie Abb. 10A).
-> 120 min nach IPTG Zugabe und Induktion der Pore (Abb. 9B sowie Abb. 10B)
• Anschließend wurden die Klone mit den höchsten Fluoreszenz-Werten wurden in der Deep-Well Platte, die bei 4°C aufbewahrt wurde erneut inokuliert und die DNA isoliert. Die Sequenzierung ergab bei allen Kolonien die positive Kontrolle pACYCT2- SGSATMD1-S2168.
-> In der 1 :5 Verdünnung (Abb. 9C) aus B1 , B4, B7, C4, D5 und E7.
^ In der 1:10 Verdünnung (Abb. 10C) aus A12, B3, C4, D3, H1 und H5.
• Optional ist es möglich bei beiden Modelselektionen den Schwellenwert zu verändern und somit auf unterschiedliche Eigenschaften zu selektieren. Zusätzlich kann auch die Kinetik (d.h. die halbmaximale Zeit des Fluoreszenzsignals oder die Steigung) während der Porenbildung analysiert werden, die unmittelbar nach der Induktion der Nanoprepore ersichtlich ist.
Schlussfolgerung:
Insgesamt kann mittels des neuentwickelten Verfahrens, die DNA des porenbildenden Memb ranpeptids SGSATMD1-S2168 aus einer fünf- bzw. zehnfachen Verdünnung zum nicht porenbil denden Peptid TVMVATMD1-S2168 in entsprechend gleichen Anteilen innerhalb eines Selektions zyklus im Mikrotiterplatten-Format re-identifiziert, selektiert und somit angereichert werden. Ei nerseits demonstriert dies, dass die Verbindung zwischen Genotyp und Phänotyp innerhalb des Selektionszykluses erhalten bleibt und es auch unter den gegeben Umständen keine Gegense lektion - z.B. aufgrund der Toxizität des porenbildenden Peptide - der gewünschten Eigen schaften stattfindet.
Beispiel 4: Selektionsexperimente zur Findung neuer Eigenschaften und Funktionen porenbildender Membranpeptide in Mikrotiterplatten
Hintergrund:
Neben Modelselektionen wurde auch eine Bibliothek porenbildender Varianten des wildtyp Pin- holins S2168 im Mikrotiterplattenformat auf neue Eigenschaften bzw. Funktionen durchmustert. Primäres Ziel einer echten Selektion ist zu prüfen, inwieweit ein Durchmusterungverfahren ge nutzt werden kann um neuartige Eigenschaften bzw. Funktionen porenbildendener Membran peptide zu identifizieren. Darüber hinaus - d.h. analog zu den Modelselektionsexperimente mit den zwei Pinholin Varianten TVMVATMD1-S2168 und SGSATMD1-S2168 (siehe Beispiel 3) - gilt zu prüfen inwieweit sich die porenbildenden Eigenschaften im Kontext einer grösseren Bibliothek beim Anwachsen - d.h. bevor ein Funktionstest vollzogen wird - auf die relative Häufigkeit von Varianten auswirkt.
Konkret wurden die drei N-terminal Aminosäuren des natürlichen S2171 Pinholins mittels Sätti- gungsmutagenese randomisiert um zu untersuchen, welche Mutationen sich positiv bzw. nega tiv auf die porenbildenden Eigenschaften des wildtyp S2171 Pinholins auswirken.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Design des Mutations-Primers
• Der Mutagenese Primer für das S2171 Antiholin auf der folgenden Basenpaar- bzw. Ami nosäuresequenz konzipiert:
ATG AAA TCT ATG GAC AAA ATC TCA ACT
Aminosäuren: M K S M D K I S T
Primer: TGATGAGG CAT ATG NNK NNK NNK GAC AAA ATC TCA ACT (SEQ
ID NO:22)
2. Klonierung der Bibliothek • Zunächst wurde das S2171 Antiholin mit dem oben erwähnten Vorwärts-Primer und ei nem passenden Rückwärts-Primer amplifiziert und mit den jeweiligen Schnittstellen Ndel/Kpnl in den pCTRL2 Vektor gebracht. Es wurde aus ca. 4000 Klonen (DH10ß) eine kleine Modellbibliothek angefertigt.
3. Kotransformation der Bibliothek in chemisch kompetente BL21(DE3)
• Jeweils einzeln transformiert
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-SGSATMD1-S2168 (Positiv)
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-TVMVATMD1-S2168 (Negativ)
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-S2168
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-S2171
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-S2171 M4A
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-3xNNKS2168 (Bibliothek)
• Erst durch den eigens entwickelten pCTRL2 Vektor konnte überhaupt eine Retransfor- mation des Wildtyp Holins in diesem Ausmaß gewährleistet werden.
4. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 3. wurden gepickt und in Deep-Well Plat ten mit 300 pl LB-Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 1300 rpm kultiviert.
5. Mikrotiterplatten Read-Out:
• Nach der Kultivierung einzelner Klone über Nacht aus 2. wurde die Oϋboo der Vorkul turen in Mikrotiterplatten (MTP) auf 0,1 eingestellt und die Proben, je 200 mI_, über 30 min bei 37°C und 180 rpm geschüttelt.
• Danach wurde zunächst der R-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, indu ziert und die Fluoreszenz über 120 min gemessen. • Im Anschluss wurden dann die Bibliothek, sowie die positv und negativ Kontrolle mit 0,5 mM IPTG induziert und die Fluoreszenz über weitere 120 min gemessen.
• Allgemeine Information: Die Messung im Reader erfolgt bei 30°C alle 10 min. Zwi schen den Messungen wird die Platte bei 180 rpm geschüttelt. Gemessen wird die ODeoonm und die Fluoreszenz (Ex: 555 nm; Em: 600 nm). Das Volumen in den Kavitä ten beträgt 200 pl nach Zugabe aller Induktoren.
6. Auswertung
• Zur Auswertung wurden die Kurven mit Gleichung 1 empirisch gefittet um dabei z.B. die halbmaximale Zeit c oder die Steigung d quanitativ zu ermitteln. Die Verteilung der un tersuchten Parameter bezüglich der halbmaximalen Zeit c und der Steigung d der Biblio thek ist beispielhaft zusammengefasst in Abb. 11 und Abb. 12.
• Einzelne Mutanten werden im Anschluss sequenziert und einer detailierten funktionalen Charakterisierung unterzogen. Fünf individuell untersuchte Mutanten weisen dabei in Abhängigkeit der N-terminalen Sequenzen unterschiedliche porenbildende Eigenschaf ten auf (Abb. 13). b — (x—c)
1 + e~ d
Gl. 1
Schlussfolgerung:
Darüber hinaus zeigt die Durchmusterung eines Teils der Bibliothek, dass Veränderungen in der N-terminalen Sequenz vor der ersten transmembran Domäne (TMD) die porenbildenden Ei genschaften des S21-68 Pinholins verändern können. Erste Struktur-Funktions-Korrelationen deuten darauf hin, dass Ladungen einen starken Einfluss auf die Steigung sowie die halbmaxi male Zeit der Porenbildung Auswirkung haben. Die hohe Transformationseffizienz der Bibliothe ken von >105 pro pg DNA deutet darauf hin, dass ausreichend grosse Biblikotheken eines prin zipiell toxischen, porenbildenden Membranpeptides routinemässig in E.coli transformiert und dessen porenbildenden Eigenschaften mittels des optischen Reporter R-GEC01 und G-GEC01 ausgelesen werden können. Bei Bedarf kann die Expression der porenbildenden Peptide im nicht-induzierten Zustand weiter supprimiert werden.
Beispiel 5: Erhalt der zellulären Integrität bzw. Umfang der Zelllyse nach Expression po- renbildendener Membranpeptide
Hintergrund:
Grundsätzlich kann im Mikrotiterplatten nicht geprüft werden in welchem Umfang es jeweils nach Expression eines porenbildenden Membranpeptids zur Zelllyse kommt oder die zelluläre Integrität der E.coli erhalten bleibt. Beide Aspekte beinhalten Vor- und Nachteile bzw. erschlies- sen unterschiedliche biotechnologische Anwendungen: (a) Um Durchmusterungen porenbilden der Membranpeptide auf Einzellzellebene durchzuführen z.B. mittels eines Durchflusszytome- ters oder im Kontext eines mikrofluidischen Systems ist es kritisch, dass die zelluläre Integrität erhalten bleibt um die Verbindung zwischen Genotyp und Phäntoyp während des gesammten Selektionszykluses zu wahren; (b) Alternativ kann der Verlust der zellulären Integrität und die damit verbundene Zelllyse Anwendung in biotechnologischen Prozessen finden um den zytoso- lischen Inhalt eines Mikroorganismus freizusetzen: z.B. in der rekombinanten Expression von Proteinen oder auch in der industriellen Biotechnologie um industriell wichtige Stoffwechselpro dukte freizusetzen.
Konkret wurde untersucht inwieweit die Expression eines porenbildenden Peptids Zellen lysiert oder die zelluläre Integrität in Form einer Hülle erhalten bleibt. Nachgewiesen wurde dies durch den Anteil fluoreszenter Proteine in der löslichen im Vergleich zur nicht-löslichen Fraktion. Lösli ches Protein ist bedingt durch einen Aufschluss der Zelle, wobei Fluoreszenz in der unlöslichen Fraktion auf Zellen zurückzuführen ist in denen die zelluläre Integrität erhalten bleibt.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Ko-Transformation des R-GEC01 und der lysierenden und nicht lysierenden Poren in che misch kompetente E. coli :
• Jeweils einzeln transformiert:
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-SGSATMD1-S2168 (nicht lysierend) -» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-BM2 (nicht lysierend)
BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pTeT7W- S2171 (semi-lysierend) BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-S107 (lysierend)
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-T4 (lysierend)
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-TisB (lysierend)
-» BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-HokB (lysierend)
— BL21(DE3) mit pPR024-R-GEC01 (Reporter) (negativ Kontrolle)
2. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 1. wurden gepickt und in Deep-Well Plat ten mit 300 pl LB-Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 1300 rpm kultiviert.
3. Proben Vorbereitung: Semi-denaturierendes SDS-PAGE Gel
• Nach der Kultivierung einzelner Klone über Nacht aus 2. wurde die Oϋboo der Vorkul turen in 24-Kavitäteten Platten auf 0,1 eingestellt und die Proben, je 2 ml, über 30 min bei 37°C und 180 rpm geschüttelt.
• Danach wurde zunächst der R-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, indu ziert bei 30°C und 180 rpm für 120 min.
• Im Anschluss wurden dann die Poren mit 0,5 mM IPTG induziert bei 30°C und 180 rpm für 180 min
4. Analyse: Semi-denaturierendes SDS-PAGE Gel
• Nach den 180 min wurde von jeder Probe 20 pl gesammelt und der Überstand vom Pel let per Zentrifugation getrennt
• Das Pellet wurde in 20 mI Resuspensionspuffer (200 mM Na3P04, 1 mM CaCh) gelöst und weitere 20 mI 2c SDS Puffer hinzugegeben (Gesamtvolumen 40 mI)
• Zum Überstand wurde 20 mI 2c SDS Puffer (+1mM CaCh) hinzugegeben (Gesamtvolu men 40 mI)
• Die Proben wurden bei 72°C für 180 sec erwärmt und anschließend wurde das gesamte Volumen von 40 mI aufgetragen. • Allgemeine Informationen: 12 % SDS-PAGE Gel, bei 120 V für ca. 110 min laufen gelas sen. Gele wurden mit der Amersham Imager 600 Geldokumentationseinheit (Extinktion: 520 nm; Emmision 605/BP40 nm) aufgenommen. Alle Gele wurden identisch belichtet um Vergleichbarkeit zu garantieren.
Schlussfolgerung:
Insgesamt zeigen unterschiedliche Poren unter den gegebenen Expressionsbedingungen unter schiedliche Propensitäten die zelluläre Integrität zu erhalten bzw. die Zellen zu lysieren. Unter exponentiellem Wachstum nach 3 h (Abb. 14), sowie nach Wachstumssättigung nach 16 h liegt insbesondere nach Expression von SGSATMD1-S2168 und BM2 keine Fluoreszenz im extrazel- luären Medium vor sondern nur im Zellpellet (Abb. 15). Konkret deutet dies darauf hin, dass für diese Poren die zelluläre Integrität erhalten bleibt. Im Gegensatz dazu zeigt das T4 Pinholin so wie HokB und TisB unter den exponentiellen Wachstum nach 3h ausgeprägte Zelllyse durch ei nen ausserordentlich hohen Anteil der Fluoreszenz im extrazellulären Medium vor (Abb. 14), jedoch nicht unter sättigenden Wachstumsbedingungen nach 16 h (Abb. 15). Dies ist vermut lich darauf zurückzuführen, dass nach Wachstumssättigung der Stoffwechsel so weit reduziert wird, dass nicht ausreichend Poren exprimiert werden können um eine effektive Zelllyse zu be wirken.
Beispiel 6: Assay Validierung zur Durchmusterung porenbildender Membranpeptide in einzelnen Kolonien auf Agarplatten
Hintergrund:
Alternativ kann der neuentwickelte Assay auch im Kolonien-Format auf Agarplatten angewendet werden. Im Vergleich zu Mikrotiterplatten (siehe Beispiele 1-5), ermöglichen Durchmusterungs verfahren die auf Kolonien basieren einen höheren Durchsatz und sind zudem nicht auf kosten aufwendige Labogeräte wie z.B einen Mikrotiterplatten-Spektrophotometer angewiesen. Konk ret galt es zu prüfen inwieweit die quantitative Auswertung bzw. Unterscheidung porenbildender von nicht-porenbildenden Peptiden auch auf Ebene einzelner Kolonien möglich ist. Als Model peptide dienten wie zuvor als porenbildendes Membranpeptid SGSATMD1-S2168 sowie das nicht porenbildendes Membranpeptid TVMVATMD1-S2168 wieder als Positiv- bzw. als Negativkontrolle.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Ko-Transformation des R-GEC01 und der zwei Pinholin Fragmente in chemisch kompeten ten E. coli: Folgende Kombinationen wurden getestet:
^ BL21(DE3) mit pACYCT2-ATMD1-S2168 + pPR024-R-GEC01 ^ BL21(DE3) mit pACYCT2-TVMVATMD1-S2168 + pPR024-R-GEC01
• Die T ransformationsansätze werden auf LB-Agar mit entsprechendem Antibiotika ausge strichen und über Nacht bei 37 °C kultiviert
2. Durchführung des koloniebasierten Assay:
• Am Folgetag werden die Kolonien mit einem Filterpapier auf eine weitere LB-Agar Platte mit 25 mM Natrium-Propionat übertragen um R-GEC01 zu exprimieren.
• Die gestempelte Platte wird für 4 h bei 37 °C kultiviert. Anschließend wird die Exprimie- rung der Pinholin-Fragmente mit 0,5 mM IPTG induziert
• Dazu wird ein Filterpapier mit der entsprechenden Lösung besprüht und für ca. 10 Sek. auf die Kolonien gelegt
• Die Platte wird für weitere 2 h bei 37 °C kultiviert bis zur anschließenden Lagerung bei 4 °C bis zum Folgetag (lichtgeschützt)
• Am Folgetag wird die Fluoreszenz der Kolonien aufgenommen bei der Extinktionswel lenlänge von 520 nm (0,3 Sek. Belichtungszeit)
3. Experimentelle Auswertung:
• Die Fluoreszenz von jeweils mindestens >180 Kolonien ist in Abb. 16 dargestellt. Zwi schen der Positivkontrolle (ATMD1-S2168) und der Negativkontrolle (TVMVATMD1-S2168) ergab sich im Mittel eine Differenz von einem Faktor von 6,5.
Schlussfolgerung:
Der neuentwickelte Verfahren kann auch im Kolonienformat auf Agarplatten angewendet wer den um porenbildende von nicht-porenbildenden Membranpeptiden zu unterscheiden. Signifi kante Unterschiede im fluoreszenten Signal zwischen einzelnen Kolonien können nach einer Einzelzeitpunkt beobachtet werden in Abhängigkeit der Expression porenbildender SGSATMD1- S2168 bzw. nicht-porenbildenden Membranpeptids TVMVATMD1-S2168 (Abb. 16). Beispiel 7: Modelselektionen zur Durchmusterung porenbildender Membranpeptide in Kolonien auf Agarplatten
Hintergrund:
Analog zur Vorgehensweise auf Mikrotiterplatten, wurde in Modelselektionen geprüft inwieweit die Verbindung zwischen Genotyp und Phäntyp auch in einzelnen Kolonien auf Agarplatten in nerhalb des gesamten Selektionszykluses erhalten bleibt und die DNA eines porenbildendes Membranpeptids aus einer grösseren Menge nicht porenbildender Membranpeptide re-identifi- ziert, selektiert und angereichert werden kann. Analog zur Validierung des Verfahrens in Mikro titerplatten ermöglicht eine Durchmusterung auf Kolonien einen höheren Durchsatz und ist nicht auf kostenaufwendiges Mikrotiterplatten Spektrophotometer angewiesen. Als Modelpeptide dienten wie zuvor als porenbildendes Membranpeptid SGSATMD1-S2168 sowie das nicht-poren- bildendes Membranpeptid TVMVATMD1-S2168 wieder als Positiv- bzw. als Negativkontrolle.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Ko-Transformation des R-GEC01 und der zwei Pinholin Fragmente in chemisch kompeten ten E. coli:
• Folgende Kombinationen wurden jeweils als Verdünnung getestet:
^ Im Verhältnis 1:5 von ATMD1-S2168 zu TVMVATMD1-S2168 + R-GEC01 ^ Im Verhältnis 1:10 von ATMD1-S2168 zu TVMVATMD1-S2168 + R-GEC01
• Die T ransformationsansätze werden auf LB-Agar mit entsprechendem Antibiotika ausge strichen und über Nacht bei 37 °C kultiviert
2. Durchführung des koloniebasierten Assays:
• Am Folgetag werden die Kolonien mit einem Filterpapier auf eine weitere LB-Agar Platte mit 25 mM Natrium-Propionat übertragen um R-GEC01 zu exprimieren
• Die gestempelte Platte wird für 4 h bei 37 °C kultiviert. Anschließend wird die Expression der Pinholin-Fragmente mit 0,5 mM IPTG induziert. Dazu wird ein Filterpapier mit der entsprechenden Lösung besprüht und für ca. 10 sek. auf die Kolonien gelegt. • Die Platte wird für weitere 2 h bei 37 °C lichtgeschützt kultiviert bis zur anschließenden Lagerung bei 4 °C bis zum Folgetag.
• Am Folgetag wird die Fluoreszenz der Kolonien aufgenommen bei der Extinktionswel lenlänge von 460 nm (0,1 s), 520 nm (1 s) und 630 nm (1 s)
3. Auswertung:
• Für die Ermittlung der Kolonien mit der höchsten Fluoreszenz werden lediglich die Daten aus dem Kanal bei 520 nm herangezogen.
• Abb. 17 zeigt ein repräsentatives Bild der Fluoreszenzen der Kolonien. Von dem Ver hältnis 1 :5 wurden 8 Kolonien mit hoher Fluoreszenz, sowie 6 Kolonien der Verdünnung 1 :10 sequenziert. Die Sequenzierung ergab bei allen Kolonien die positive Kontrolle PACYCT2- SGSATM D 1 -S2168.
Schlussfolgerung:
Zusammenfassend können die porenbildende Membranpeptide SGSATMD1-S2168 vom nicht-po- renbildenden Membranpeptid TVMVATMD1-S2168 (a) quantitativ auf Agarplatten unterschieden werden und (b) aus einer grösseren Verdünnung von 1 :5 und 1:10 selektiert und angereichert werden (Abb. 17).
Beispiel 8: Assay Validierung auf Einzelzelleben mittels eines Durchflusszytometers
Hintergrund:
Alternativ kann der neuentwickelte Assay auch eingesetzt werden um die porenbildenden Ei genschaften bzw. Funktionen von Membranpeptiden auf Einzelzellebene mittels eines Durch flusszytometers zu untersuchen. Im Vergleich zu Mikrotiterplatten (siehe Beispiele 1-5) oder auch Kolonien auf Agarplatten (siehe Beispiele 6 und 7) hat dies den Vorteil, dass der Assay hochauflösend und mit einer hohen statistischen Signifikanz gemessen werden kann: >106 Vari anten innerhalb einer FACS Messung. Konkret galt es zu prüfen inwieweit die quantitative Aus wertung bzw. Unterscheidung zwischen porenbildenden von nicht-porenbildenden Peptiden auch auf Ebene einzelner Zellen möglich ist. Als Modelpeptide dienten wie zuvor als porenbil dendes Membranpeptid SGSATMD1-S2168 sowie das nicht-porenbildendes Membranpeptid TVMVATMD1-S2168 wieder als Positiv- bzw. als Negativkontrolle. Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Kotransformation der Bibliothek in chemisch kompetente BL21(DE3)
• Jeweils einzeln transformiert
^ BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-SGSATMD1-S2168 (Po sitiv)
^ BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pTeT7W- VMVATMD1-S2168 (Ne gativ)
^ BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pTeT7W-SGSATMD1-S2168 (Po sitiv) + pTeT7W- VMVATMD1-S2168 (Negativ) im Verhältnis 1:10 von positiv zu ne gativ
2. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 1. wurden gepickt und in Kulturöhrchen mit 2 ml LB-Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 220 rpm kultiviert.
• Die Mix Varianten 1:10 und 1:100 von positiv zu negativ wurden nicht ausplattiert, sondern wurden direkt nach der Transformation in Medium überführt und auswach- sen gelassen
3. FACS Probenvorbereitung:
• Nach der Kultivierung über Nacht aus 2. wurde die ODeoo der Vorkulturen in Kul turröhrchen auf 0,1 eingestellt und die Proben, je 2 ml, über 30 min bei 37°C und 180 rpm geschüttelt.
• Danach wurde zunächst der G-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, indu ziert für 120 min bei 30°C und 220 rpm kultiviert.
• Im Anschluss wurde dann die die positiv und negativ Kontrolle, als auch die 1:10 und 1:100 Mixkulturen mit 0,5 mM IPTG induziert für 60 min bei 30°C und 220 rpm kulti viert.
• Nach erneuter Messung der ODeoonm wurden die Kulturen mit 2x mit PBS gewaschen und anschließend mit PBS auf eine ODeoonm von 0,05 eingestellt und auf Eis gelagert 4. FACS Messungen
• Die Fluoreszenz-Messungen am FACS (SONY SH800S) erfolgten mit einer Extinktion von 480 nm und einer Emission von 525 nm. Die Ergebnisse der Assay Validierung sind zusammengefasst in Abb. 18.
Schlussfolgerung:
Zusammenfassend ergeben sich bei der durchflusszytometrischen Analyse zwei unterschiedlich fluoreszierende Populationen von E.coli (je in Abhängigkeit der Expression eines porenbilden den SGSATMD1-S2168 im Vergleich zu einem nicht-porenbildenden Peptids TVMVATMD1-S2168). Parallel weist eine Auftrennung nach Forward und Backward Scatter darauf hin, dass die zellu läre Integrität nach Expression des porenbildenden Peptids weitesgehend erhalten bleibt und somit möglich ist - d.h. des Verfahren is prinzipiell geeignete Membranpeptide mit unterschiedli chen porenbildenden Eigenschaften auf Einzelzellebene durchflusszytometrisch voneinander zu unterscheiden.
Beispiel 9: Modelselektionen auf Einzelzellebene mittels eines Duchflusszytometers
Hintergrund:
Alternativ kann der neuentwickelte Assay eingesetzt werden um die porenbildenden Eigen schaften bzw. Funktionen von Membranpeptiden auf Ebene einzelner Zellen mittels eines Durchflusszytometers zu zu sortieren und anzureichern. Im Vergleich zu Mikrotiterplatten (siehe Beispiele 1-5) oder auch Kolonien auf Agarplatten (siehe Beispiele 6 und 7) hat dies den Vor teil, dass der Assay quantitativ mit einem sehr hohem Durchsatz durchgeführt werden kann, der es prinzipiell ermöglicht >106 Varianten innerhalb eines Selektionszyklus zu durchmustern. Kon kret galt es zu prüfen inwieweit die quantitative Auswertung bzw. Unterscheidung porenbilden der von nicht porenbildenden Peptiden auch auf Ebene einzelner Zellen möglich ist. Hierfür dienten die bereits bekannten Transmembranpeptide SGSATMD1-S2168 und TVMVATMD1-S2168 als Positiv- bzw. Negativkontrolle.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Kotransformation der Peptide in chemisch kompetente BL21(DE3)
• Jeweils einzeln transformiert
^ BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-SGSATMD1-S2168 (Po sitiv) ^ BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-TVMVATMD1-S2168 (Ne gativ)
^ BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-SGSATMD1-S2168 (Po sitiv) + pCTRL2-TVMVATMD1-S2168 (Negativ) im Verhältnis 1:10 von positiv zu ne gativ okulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 1. wurden gepickt und in Kulturöhrchen mit 2 ml LB-Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 220 rpm kultiviert.
• Die Mix Varianten 1:10 und 1:100 von positiv zu negativ wurden nicht ausplattiert, sondern wurden direkt nach der Transformation in Medium überführt und auswach- sen gelassen ACS Probenvorbereitung:
• Nach der Kultivierung über Nacht aus 2. wurde die Oϋdoo der Vorkulturen in Kul turröhrchen auf 0,1 eingestellt und die Proben, je 2 ml, über 30 min bei 37°C und 180 rpm geschüttelt.
• Danach wurde zunächst der G-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, indu ziert für 120 min bei 30°C und 220 rpm kultiviert.
• Im Anschluss wurde dann die die positiv und negativ Kontrolle, als auch die 1:10 Mixkulturen mit 0,5 mM IPTG induziert für 60 min bei 30°C und 220 rpm kultiviert.
• Nach erneuter Messung der ODeoonm wurden die Kulturen mit 2x mit PBS gewaschen und anschließend mit PBS auf eine ODeoonm von 0,05 eingestellt und auf Eis gelagertACS Messungen
• Die Fluoreszenz-Messungen am FACS (SONY SH800S) erfolgten mit einer Extinktion von 480 nm und einer Emission von 525 nm. Die Ergebnisse der Modelselektionsexperi mente im FACS sind zusammengefasst in Abb. 18. Schlussfolgerung:
Zusammenfassend können das porenbildende Membranpeptid SGSATMD1-S2168 vom nicht-po- renbildenden Membranpeptid TVMVATMD1-S2168 (a) quantitativ auf Einzellzellebene unterschie den werden und (b) aus einer grösseren Verdünnung von 1:10 selektiert und angereichert wer den. Anzumerken ist dabei, dass in Abhängigkeit der Expression eines porenbildenden Peptids - in diesem Fall SGSATMD1-S2168 - die zelluläre Integrität der Zelle so weit erhalten bleibt, dass eine Selektion mittels FACS möglich ist.
Beispiel 10: Valideriung eines Verfahrens zur Durchmusterung molekularer Sensoren und Schalter
Hintergrund:
Neben der Entwicklung eines Verfahrens zur Durchmusterung porenbildender Membranpeptide, Nanoporen und Inonenkanäle (siehe Beispiele 1-9), kann das Verfahren rekonfiguriert werden um molekulare Sensoren und Schalter kombinatorisch zu optimieren. Konkret besteht bei der Entwicklung Verfahren zur Durchmusterung von Proteinsensoren bzw. Schaltern die Herausfor derung darin den molekularen Zustand eines Sensors jeweils mit und ohne Ligand zu vermes sen (und somit auf ein möglichst hohes Differential im Signal zu selektieren). Kritisch und tech nisch anspruchsvoll dabei ist dem Sensor oder Schalter eine definierte Menge eines Liganden zuzuführen um diesen zu aktivieren.
Hierfür kann der Sensor oder Schalter z.B. extrazellulär oder periplasmisch exportiert werden.
In diesen Fällen kann ein extern hinzugefügter Ligand vergleichsweise einfach mit dem Sensor und Schalter assoziieren. Dies gilt auch bei periplasmisch exportierten Sensoren und Schaltern, da die äussere E.coli Membran vergleichsweise durchlässig für eine Vielzahl niedermolekularer Substanzen ist. Für fluoreszente Proteinsensoren bestehend aus mehreren, sich unabhängig faltenden Domänen ist dies jedoch nur bedingt möglich und schränkt zudem auch Faltungsei genschaften und Stabilität des Sensors oder Schalters ein. Alternativ, bei einer zytosolischen Expression, besteht die Herausforderung den Liganden über die Membran in die Zelle ein- bzw. ausfliessen zu lassen. Aufgrund der intrinsisch undurchlässigen Membran schränkt dies die An zahl und die Art der Liganden jedoch stark ein.
Als Teil des zugrunde liegenden Verfahrens soll nun über die Expression von Nanoporen eine erhöhte Durchlässigkeit der inneren E.coli Membran ermöglicht werden. Der Schlüsselentwick lungsschritt besteht darin zu untersuchen inwieweit, niedermolekulare Substanzen, die um ein Vielfaches größer als Ca2+ Ionen sind, durch Nanoporen unterschiedlicher Größen diffundieren können. Konkret sollen die R- und G- GECOs mit L-Glu-spezifischen Fluoreszenz Sensoren, sogenannten iGluSnFRs, ausgetauscht werden um über Ca2+ Ionen hinaus Ein- und Ausfluss von L-Glu zu detektieren.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Ko-Transformation des iGluSNFr und der zwei Pinholin Fragmente in chemisch kompetenten E. coli:
• Jeweils einzeln transformiert:
^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2-SGSATMD1-S2168 (Posi tiv)
^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2-- VMVATMD1-S2168 (Ne gativ)
^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2-BM2 (Negativ)
^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2-S2171-M4A ^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2-S2171-M3A ^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2~HokB ^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2-Kcv NTS ^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2-Kcv G77S ^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter) + pCTRL2-KPBcvi ^ BL21(DE3) mit pPR024- iGluSNFr (Reporter)
2. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 1. wurden gepickt und in Deep-Well Plat ten mit 300 pl M9-Medium (definiertes Medium ohne Glutamat) mit den nötigen Anti biotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 1300 rpm kultiviert.
3. Mikrotiterplatten Read-Out:
• Nach der Kultivierung einzelner Klone über Nacht aus 2. wurde die Oϋboo der Vorkul turen in Mikrotiterplatten (MTP) auf 0,1 eingestellt und die Proben, je 200 mI_ M9 Me dium, über 30 min bei 37°C und 180 rpm geschüttelt. • Danach wurde zunächst der iGluSNFr mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, indu ziert und die Fluoreszenz über 290 min gemessen.
• Im Anschluss wurden dann die beiden porenpbildenden Peptide mit 0,5 mM IPTG induziert und die Fluoreszenz über weitere 260 min gemessen.
• Allgemeine Information: Die Messung im Reader erfolgt bei 30°C alle 10 min. Zwi schen den Messungen wird die Platte bei 180 rpm geschüttelt. Gemessen wird die ODeoonm und die Fluoreszenz (Ex: 480 nm; Em: 525 nm). Das Volumen in den Kavitä ten beträgt 200 pl nach Zugabe aller Induktoren.
Schlussfolgerung:
Insgesamt führt die Expression des porenbildenden Membranpeptids SGSÄTMD1-S2168 zu einer Reduktion des fluoreszenten Signals des iGluSNFr; im Gegensatz dazu bleibt nach Expression des nicht-porenbildendes Membranpeptids TVMVÄTMD1-S2168 iGluSNFr-bedingte Signal unver ändert hoch (Ergebnisse jeweils zusammengefasst in Abb. 20). Dies ist darauf zurückzuführen, dass L-Glu aus der Zelle nach Koexpression des porenbildenden Membranpeptids SGSÄTMD1- S2168 aus der Zelle ausfliessen kann. Ähnliches trifft für die porenbildenden Membranpeptide S21-71 M4A, S-107 M3A und HokB zu, die zu einer starken Reduktion des iGluSNFr abhängi gen Signals führen (siehe Abb. 21). Expression des verschiedener Negativkontrollen wie z.B. des Protonenkanals BM2 und des K+ durchlässigen Kanals KcvNTS, KcvNTS G77S und KPBCVI füh ren jeweils zum Zelltod, aber nicht zu einer Reduktion der Fluoreszenz (sieh Abb. 20 und Abb. 22). Zusammenfassend zeigt dies, dass nach Expression ausreichend grosser Nanoporen in der inneren Membran es zu einem Ausfluss von L-Glu aus der Zelle kommt, der wiederum indi rekt über die Abnahme des fluoreszenten Signals nachgewiesen werden kann.
Beispiel 11 - Validierung des Verfahrens in einer mikrofluidischen Versuchsanordnung
Hintergrund:
Mikrofluidische Verfahren ermöglichen hochauflösende funktionale Studien insbesondere in Kombination mit optischen Messverfahren wie z.B. auf Basis von Fluoreszenz. Mikrofluidische Verfahren bieten dabei eine Reihe technischer Vorteile wie z.B. Miniaturisierung bioanalytischer Verfahren (Journal of Laboratory Automation, 2013, 18, 350-66), zeitaufgelöste dynamische Studien von Mikroorgansimen auf Einzelzellebene in einer mikrofluidischen Kultivierungskam mer (siehe Beispiele in den jeweiligen Übersichtsartikeln Journal of Molecular Biology, 431, 2019, 4569-4588) oder Möglichkeiten zur Durchmusterung im Hochdurchsatz in tröpfchenba- sierten Kompartimenten mit einzelnen Zellen oder in Mikrokolonien (siehe Beispiele in den je weiligen Übersichtsartikeln Current Opinion Structural Biology, 2018, 48, 149-156 und Current Opinion in Chemical Biology, 2017, 37, 137-144 sowie konkret ACS Synthetic Biology, 2017, 6, 1988-1995).
In diesem Zusammenhang wurden die porenbildenden Eigenschaften von zwei verschiedenen Membranproteinen (konkret des S2168 Pinholins und T4 Holins) in einer mikrofluidischen Kulti vierungskammer auf Einzelzellebene in zeitaufgelöster Form mit einem Fluoreszenzmikroskop untersucht. Ergänzend und weiterführend zu Beispiel 5 wurde außerdem untersucht, inwieweit die Expression eines porenbildenden Membranproteins die Zellen lysiert oder die zelluläre In tegrität in Form einer Hülle erhalten bleibt.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Ko-Transformation des G-GEC01 und der Nanoporen Varianten in chemisch kompetenten E. coli:
• Jeweils einzeln transformiert:
-» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2.T7.100.sRBS-S2168 -» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2.T7.100.T4
2. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB Agarplatten aus 1. wurden gepickt und in Kultivierungs röhrchen mit 2 ml LB Medium und den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 180 rpm kultiviert.
3. Mikrofluidik Read-Out:
• Nach der Kultivierung einzelner Klone über Nacht aus 2. wurden die Zellen in frisches sterilfiltriertes LB Medium überführt, die Oϋboo der Vorkulturen auf 0,1 eingestellt und im Anschluss bei 37 °C über einen Zeitraum von 3 h bis zu einer Oϋboo von 2 angewach sen.
• Zur Kultivierung und funktionalen fluoreszenzmikroskopischen Untersuchung der Zellen in einer mikrofluidischen Kultivierungskammer konnte auf ein zuvor publiziertes mikroflu- idisches Chipdesign zurückgegriffen werden (siehe Supplementary Figure 5 in Nature Communications, 2020, 11, 2746).
• Nachdem der Mikrofluidikchip mit LB Medium geflutet wurde, wurden die Zellen hinzuge geben und die Flussrate durch den mikrofluidischen Chip auf 1 mI/min eingestellt. Die Zellen wurden für 3 h bei 37 °C in den Mikrofluidikchip gelassen, damit sich diese ent sprechend in den Kultivierunskammern ansammeln und anwachsen konnten.
• Danach wurde die Expression des G-GEC01 durch einen Wechsel auf LB Medium mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, für 2 h bei 30 °C induziert.
• Im Anschluss wurden dann die Nanoporen durch Wechsel auf LB Medium mit 0,5 mM IPTG induziert und die Entwicklung des fluoreszenten Signals über 16 h vermessen.
• Die Messung des fluoreszenten Signals erfolgte mittels eines Fluoreszenzmikroskops bei 30 °C in einem Interval von 3 Minuten. Es wurde je eine Durchlichtaufnahme und da nach eine Fluoreszenzaufnahme (Ex: 488 nm; Em: 504-539 nm) in Form eines Z-Stacks gemacht. Ab der Induktion von G-GEC01 lag eine Flussrate von 4 mI/min an.
• Bildausschnitte der fluoreszenz-mikroskopischen Aufnahmen in der mikrofluidischen Kultivierungskammer sind beispielhaft dargestellt für das S2168 Pinholin zu vier verschie denen Zeitpunkten (Abb. 23). Die Induktion der Expression der Nanopore mit IPTG er folgte in der Aufnahme zum Zeitpunkt 21 min (in Abb. 23 mit 0:21 gekennzeichnet).
4. Experimentelle Auswertung:
• Für die Auswertung wurden die gesamten Zellen aus einer einzelnen Kultivierungskam mer (beispielhaft dargestellt in Abb. 23) mit Hilfe einer Bildauswertungssoftware (Fijji ImageJ 1.51; Nature Methods, 2012, 9, 676-82) analysiert und die Fluoreszenz in Rela tive Fluorescence Units (RFU) gegen die Zeit aufgetragen (Abb. 24). Anhand des Ver laufs des fluoroszenten Signals können dann detaillierte Aussagen über die Zellintegrität oder den Ausfluss und das Bleichverhalten des Sensors getroffen werden.
Schlussfolgerungen:
Zusammenfassend demonstriert die Versuchsreihe die Anwendung des Verfahrens in einer mikrofluidischen Vorrichtung. Konkret wurden Zellen in einer mikrofluidischen Kultivierungskam mer kultiviert und die porenbildenden Eigenschaften des S2168 Pinholins und des T4 Holins auf Einzelzellebene in zeitaufgelöster Form fluoreszenzmikroskopisch untersucht.
Dabei ergaben sich in Abhängigkeit unterschiedlicher Membranproteine unterschiedliche fluo reszente Signale: Die Expression des S2168 Pinholins bewirkt einen schnellen Teilungsstop der Zellen, sowie einen schnellen Anstieg der fluoreszenten Signals (Abb. 24). Gemessen an der Form der Zellen bleibt die zelluläre Integrität dabei jedoch über einen vergleichsweise langen Zeitraum intakt (Abb. 23). Die Expression des T4 Holins bewirkt ebenfalls einen schnellen Tei lungsstop der Zellen, sowie einen schnellen Anstieg des fluoreszenten Signals. Im Falle des T4 Holins fällt das fluoreszente Signal jedoch schnell wieder ab (innerhalb von 30 min). Dies ist da rauf zurückzuführen, dass das T4 Holin voraussichtlich sehr schnell, sehr große Poren bildet und diese zu einem schnellen Einfluss von Ca2+ und somit Aufleuchten der Zelle führen bevor es dann vergleichsweise schnell zu einem Ausfluss des Sensors bzw. Verlust der zellulären In tegrität und Zelllyse kommt (Abb. 24).
Ergänzend zu Beispiel 5 zeigen die erzielten Ergebnisse, dass der „zelluläre Container“ trotz porenbildender Eigenschaften intakt bleibt und es in Abhängigkeit der Nanopore zum Einfluss von Ca2+ Ionen in die Zelle kommt. Für vergleichsweise große Nanoporen wie z.B. das T4 Holin ist das Zeitfenster vergleichsweise kurz (in diesem Fall 30 min) bevor es entweder zu einem Verlust der zellulären Integrität oder zu einem Ausfließen des Sensors kommt (Abb. 24).
Beispiel 12 - Selektionsexperimente zur Findung neuer Eigenschaften und Funktionen porenbildender Membranpeptide in Mikrotiterplatten II
Hintergrund:
Neben Modelselektionen wurde auch eine Bibliothek porenbildender Varianten des S2171 Pin- holins im Mikrotiterplattenformat auf veränderte porenbildende Eigenschaften durchmustert. Pri märes Ziel einer realen Selektion ist zu prüfen, inwieweit das Verfahren genutzt werden kann, um Membranproteine mit neuartigen porenbildenden Eigenschaften und Funktionen zu selektie ren.
Konkret wurden die drei N-terminalen Aminosäuren des S2171 Pinholins mittels Sättigungsmuta- genese randomisiert, um zu untersuchen, welche Mutationen sich positiv bzw. negativ auf die porenbildenden Eigenschaften des wildtyp S2171 Pinholins auswirken. Darüber hinaus gilt zu klären, inwieweit die Promoterstärke gemessen an der halbmaximalen Zeit c und der Steigung d einen Einfluss auf die dynamische Spanne des Verfahrens im Kontext einer Bibliotheksselek tion hat.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
1. Design des Mutagenese Primers:
• Der Mutagenese Primer für das S2171 Pinholin auf der folgenden DNA bzw. Aminosäu resequenz konzipiert:
N-Terminale Sequenz des S2171 Pinholins
DNA Sequenz ATG AAA TCT ATG GAC AAA ATC TCA ACT
Protein Sequenz M K S M D K I S T
Primer (SEQ ID NO:22) 5'-TGATGAGG CAT ATG NNK NNK NNK GAC AAA ATC TCA ACT-3'
Protein Sequenz M XI X2 X3 D K I S T
• Die randomisierten Kodone werden im Kontext der N-terminal randomisierten Pinholin Bibliothek 3xNNKs2168 jeweils als Xi, X2 und Xßbzw. Position 1, Position 2 und Position 3 bezeichnet.
2. Klonierung der Bibliothek
• Zunächst wurde das S2171 Pinholin mit dem oben erwähnten Vorwärts-Primer und ei nem passenden Rückwärts-Primer amplifiziert und mit den jeweiligen Schnittstellen für Ndel/Kpnl in den pCTRL2 oder pCTRL2.T7.100.sRBS Vektor kloniert.
• Es wurde aus ca. 300.000 Klonen für pCTRL2 und 270.000 Klonen für pCTRL2.T7.10O.sRBS je eine Bibliothek gebaut.
3. Ko-Transformation des G-GEC01 mit der Bibliothek und Kontroll-Referenz in chemisch kom petente BL21(DE3)
• Jeweils einzeln transformiert:
-» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2.T7.100.sRBS-3xNNKS2168 -» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-3xNNKS2168 -» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2.T7.100.sRBS-S2171 M4A -» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2-S2171 M4A
4. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 3. wurden gepickt und in Deep-Well Platten mit 300 pl LB Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 1300 rpm kultiviert.
5. Mikrotiterplatten Read-Out:
• Nach der Kultivierung einzelner Klone über Nacht aus 4. wurde die OD600 der Vorkultu ren in Mikrotiterplatten auf 0,1 eingestellt und die Proben, je 200 mI_, über 30 min bei 37 °C und 180 rpm geschüttelt. Im Rahmen der pCTRL2-3xNNKS2168 Bibliothek wurden so mit 271 Klone gepickt. Im Rahmen der pCTRL2.T7.100.sRBS-3xNNKS2168 Bibliothek wur den 576 Klone gepickt.
• Danach wurde zunächst der G-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, induziert und die Fluoreszenz über 110 min gemessen. • Im Anschluss wurden dann alle Nanoporen Varianten mit 0,5 mM IPTG induziert und die Fluoreszenz über weitere 190 min gemessen.
• Allgemeine Information: Die Messung im Reader erfolgt bei 30 °C alle 3 min. Zwischen den Messungen wird die Platte bei 180 rpm geschüttelt. Gemessen wird die Oϋboo und die Fluoreszenz (Ex: 485 nm; Em: 525 nm). Das Volumen in den Kavitäten beträgt 200 pl nach Zugabe aller Induktoren. uswertung
• Zur Auswertung wurden die Kurven mit Gleichung 1 empirisch gefittet um dabei z.B. die halbmaximale Zeit c oder die Steigung d quantitativ zu ermitteln. Die Verteilung der un tersuchten Parameter bezüglich der halbmaximalen Zeit c und der Steigung d der bei den untersuchten Bibliotheken pCTRL2-3xNNKS2168 und pCTRL2.T7.100.sRBS- 3xNNKg2iQg jst jn Abb 25 zusammengefasst.
• Einzelne Mutanten aus der pCTRL2.T7.100.sRBS-3xNNKS2168 Bibliothek wurden im An schluss sequenziert (240 sequenziert von 576 insgesamt gemessenen) und einer detail lierten Sequenz-Struktur-Funktionsanalyse unterzogen. Sequenzen mit Methion wurden dabei aufgrund der Möglichkeit eines alternativ Start Kodons nicht berücksichtigt.
Ebenso wurden Sequenzen mit vorzeitigen Stop Kodons nicht berücksichtigt. Sequen zen mit Cysteinen wurden aufgrund möglicher Disulphidbrücken ebenfalls nicht berück sichtigt. Das gleiche gilt für Proline, die nur selten auftraten. Zudem wurden Sequenzen mit Leserasterverschiebung auch nicht berücksichtigt. Dies führte am Ende zu einer Auswahl von 142 Sequenzen von ursprünglich 240 sequenzierten Varianten, die jeweils analysiert wurden.
• Zur Analyse der zugrundeliegenden Struktur-Funktions-Eigenschaften wurde für jede einzelne Aminosäure an den drei verschiedenen Positionen Xi, X2 und X3 jeweils die durchschnittliche halbmaximale Zeit c und die durchschnittliche Steigung d berechnet (Abb. 26A). Die Durchschnittswerte wurden dabei unabhängig vom Kontext der Se quenz berechnet.
• Parallel wurden die einzelnen Aminosäuren in Gruppen mit vergleichbaren chemischen Eigenschaften zusammengefasst und jeweils die durchschnittliche halbmaximale Zeit c und die durchschnittliche Steigung d berechnet. Diese Ergebnisse sind als Heatmap zu sammengefasst (Abb. 26B). Die Durchschnittswerte wurden dabei unabhängig vom Kontext der Sequenz berechnet.
• Darüber hinaus sind spezifische Sequenzen mit charakteristischen porenbildenden Ei genschaften (jeweils positiv und negativ) zusammen mit den Werten für die jeweilige halbmaximale Zeit c und die Steigung d in Tab. 1 zusammengefasst. Schlussfolgerung:
Ergänzend zu Beispiel 4 wurde im Rahmen einer Durchmusterungskampagne mit bis zu 8.000 randomisierten Varianten der Einfluss der N-terminaler Sequenz des S21-71 Pinholins auf des sen porenbildenden Eigenschaften systematisch untersucht.
Zunächst können mithilfe des schwächeren Promoters (konkret T7.100.sRBS im Gegensatz zu T7.wt.sRBS) die porenbildenden Eigenschaften der 3xNNKs2168 Bibliothek besser experimen tell aufgelöst werden als mit dem stärkeren Promoter (Abb. 25). Konkret macht sich dies durch eine größere Streuung vom Mittelwert bzgl. der Steigung und der halbmaximalen Zeit deutlich bemerkbar und verbessert folglich die dynamische Spanne des Verfahrens, dass aufgrund der schwächeren Proteinexpression jeweils stärkere Porenbilder besser differenziert werden kön nen.
Darüber hinaus zeigt eine Sequenz-Struktur-Funktions-Analyse, dass negative Ladungen an der Position 3 gemessen an der halbmaximalen Zeit c die Porenbildung beispielhaft beschleu nigen (Abb. 26B, Tab. 1). Im Gegensatz dazu können aromatische Aminosäuren an Position 1 und 3 gemessen an der halbmaximalen Zeit die Porenbildung hemmen (Abb. 26B, Tab. 1).
Tab. 1 : Vereinzelte Klone aus der Durchmusterung der 3xNNKS21-68 Pinholin Bibliothek
Hinweis: Die vollständigen Sequenzen der folgenden Klone sind im Sequenzprotokoll unter SEQ ID NOs: 44-49 zusammengefasst. Beispiel 13 - Selektionsexperimente zur Findung neuer Eigenschaften und Funktionen porenbildender Membranpeptide in Mikrotiterplatten III
Hintergrund:
Neben den Modelselektionen (siehe Beispiel 3) und der Durchmusterung der S2168 Pinholin Bibliothek mit bis zu 8.000 unterschiedlichen Varianten (siehe Beispiel 4 und 12) wurde zusätz lich das S2168 Pinholin in Inkrementen von zwei Aminosäuren trunkiert und einer mithilfe des Verfahrens funktionalen Untersuchungen unterzogen.
Zum einen gilt zu prüfen, inwieweit mithilfe des Verfahrens schlüssige Struktur-Funktionseigen schaften im Rahmen einer systematischen Durchmusterung identifiziert werden können. Zum anderen gilt zu prüfen, welche Komponenten ausreichend und notwendig für die Porenbildung des S2168 Pinholins sind. Solche minimalen Nanoporenmotive bieten dann beispielhaft vielver sprechende Ausgangspunkte für weitere Konstruktionsvorhaben. Darüber hinaus gilt zu prüfen, inwieweit für unterschiedliche Durchmusterungsformate - konkret in Mikrotiterplatten und auf Basis einzelner Kolonien auf Agarplatten - der Verlauf des fluoreszenten Signals vergleichbar ist.
Experimentelle Prozedur und Resultate:
Variante 1: Durchmusterung der S2168 Trunkierungsbibliothek in Mikrotiterplatten
1. Ko-Transformation des G-GEC01 und der trunkierten S2168 Pinholine (SEQ ID NOs: 28-42) in chemisch kompetenten E. coli :
• Jeweils einzeln transformiert:
-» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2.T7.100.sRBS-S2168 Trun kierungsbibliothek
-» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2.T7.100.sRBS-S2171 -» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2.T7.100.sRBS-S2171 M4A
2. Inokulation über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) auf LB-Agar aus 1. wurden gepickt und in Deep-Well Platten mit 300 mI LB Medium mit den nötigen Antibiotika über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C und 1300 rpm kultiviert.
3. Mikrotiterplatten Read-Out: • Nach der Kultivierung einzelner Klone über Nacht aus 2. wurde die Oϋboo der Vorkultu ren in Mikrotiterplatten auf 0,1 eingestellt und die Proben je 200 pl über 30 min bei 37 °C und 180 rpm geschüttelt.
• Danach wurde zunächst der G-GEC01 mit 25 mM Natrium-Propionat, pH 8.0, induziert und der Verlauf des fluoreszenten Signals über 110 min gemessen.
• Im Anschluss wurden dann die Expression der S2168 Trunkierungsvariante mit 0,5 mM IPTG induziert und der Verlauf des fluoreszenten Signals über weitere 190 min gemes sen.
• Allgemeine Information: Die Messung im Mikrotiterplatten-Spektrometer erfolgte bei 30 °C in einem Interval von 3 min. Zwischen den Messungen wurde die Mikrotiter bei 180 rpm geschüttelt. Gemessen wird die Oϋboo und die Fluoreszenz (Ex: 485 nm; Em: 525 nm). Das Volumen in den Kavitäten beträgt 200 pl nach Zugabe aller Induktoren.
4. Experimentelle Auswertung:
• Zur Auswertung wurden die Kurven mit Gleichung 1 empirisch gefittet um die halbmaxi male Zeit c oder die Steigung d quanitativ zu ermitteln. Die Verteilung der untersuchten Parameter bezüglich der halbmaximalen Zeit c und der Steigung d der Trunkierung ist zusammengefasst in (Abb. 27).
Variante 2: Durchmusterung der S2168 Trunkierungsbibliothek in Agarplatten
1. Ko-Transformation des G-GEC01 und der trunkierten S2168 Pinholine (SEQ ID NOs: 28-42) in chemisch kompetenten E. coli.
• Jeweils einzeln transformiert:
-» BL21(DE3) mit pPR024-G-GEC01 (Reporter) + pCTRL2.T7.100.sRBS-S2168 Trun kierungsbibliothek.
2. Anwachsen über Nacht:
• Kolonien der BL21(DE3) wurden auf LB-Agar ausgestrichen und über Nacht für ca. 16 Stunden bei 37 °C angewachsen.
3. Agarplatten Read-Out:
• Zu Beginn wurde der Reporter G-GEC01 induziert, indem mit einer Airbrush 500 mM Natrium-Propionat pH 8.0 auf die Agarplatte gesprüht, so dass alle Kolonien leicht be netzt waren. Die Agarplatten wurden dann für 180 Minuten bei 20 °C im Dunkeln inku biert. • Danach wurde die Expression der Trunkierungsvarianten induziert, indem erneut mit ei ner Airbrush eine 50 mM IPTG Lösung auf die Agarplatte gesprüht wurde und alle Kolo nien leicht benetzt waren. Die Agarplatten wurden dann für weitere 240 Minuten bei 20°C im Dunkeln inkubiert.
• Ab dem Zeitpunkt der IPTG Zugabe wurden Bilder im Abstand von einer Stunde aufge nommen, beginnend mit dem Zeitpunkt 0 Minuten bis 240 Minuten
• Allgemeine Information: Die Messung erfolgt bei Blaulicht in einem Geldokumentations gerät (Ex: 470nm; Em: F-590.M58 UV-Filter). Alle Platten wurden mit der selben Belich tungszeit aufgenommen um Vergleichbarkeit zu garantieren.
4. Experimentelle Auswertung:
• Für die Auswertung wurden die Daten von je einem Bildausschnitt mit Hilfe einer Bild auswertungssoftware (Fijji ImageJ 1.51; Nature Methods, 2012, 9, 676-82) analysiert und die maximale Fluoreszenz gegen die Zeit aufgetragen (Abb. 28).
Schlussfolgerung:
Konkret bewirkt eine Trunkierung des S21-68 Pinholins in Inkrementen von zwei Aminosäuren unterschiedliche fluoreszente Signale und liefert dabei neue Einsichten in die Struktur-Funkti onseigenschaften, die der Porenbildung des S21-68 Pinholins unterliegen. Gemessen an der halbmaximalen Zeit c und der Steigung d wirken sich die zwei N-terminalen Aminosäuren D und K im Kontext des S21-68 Pinholins hemmend auf die Bildung der Nanopore aus. Eine wei tere Trunkierung verbessert die porenbildenden Eigenschaften bis zur vollständigen Trunkie rung des aromatischen Motifs YWFQLW. Beispielhaft kann nun die S21-48 Pinholin Variante als minimales Nanoporen Motiv für weitere Konstruktionsvorhaben dienen.
Mit Blick auf die unterschiedlichen Durchmusterungsformate ist der Verlauf der fluoreszenten Signale in Mikrotiterplatten (quantifiziert und zusammengefasst in Abb. 27) dabei konsistent mit den fluoreszenten Signalen im Kolonienformat auf Agarplatten (Abb. 28). Letztere ermöglicht somit kostenkünstige Durchmusterungen in Kolonien auf Agarplatten und kann beispielhaft ge nutztwerden, um Bibliotheken mit einem sehr hohen Durchsatz vorzuselektieren, um dann im Anschluss für eine reduzierte Anzahl an Varianten die porenbildenden Eigenschaften mithilfe eines Fluoreszenzspektometers bzgl. der halbmaximalen Zeit c und der Steigung d zu quantifi zieren.

Claims

Ansprüche
1. Durchmusterungsverfahren, umfassend die folgenden Schritte: a) Bereitstellen einer Zelle und eines die Zelle umgebenden Mediums,
- wobei die Zelle eine Zellmembran aufweist, die für eine Reportersubstanz undurchlässig ist,
- wobei der Quotient aus der Konzentration der Reportersubstanz im Inneren der Zelle und der Konzentration der Reportersubstanz im die Zelle umge benden Medium mindestens 2 oder höchstens 0,5 beträgt; b) Detektieren eines von der Konzentration der Reportersubstanz in der Zelle abhängi gen Signals, das mit Hilfe eines in der Zelle exprimierten Sensorproteins erzeugt wird; c) Induzieren der Expression eines Membranproteins, das die Durchlässigkeit der Zell membran für die Reportersubstanz erhöht; d) Detektieren des von der Konzentration der Reportersubstanz in der Zelle abhängi gen Signals, das mit Hilfe des in der Zelle exprimierten Sensorproteins erzeugt wird; e) Berechnung eines oder mehrerer Vergleichsparameter aus den in den Schritten b) und d) detektierten Signalstärken, wobei Schritt b) vor Schritt c) durchgeführt wird und wobei Schritt d) nach Schritt c) durchgeführt wird, wobei die Schritte a) bis e) für mindestens zwei Membranproteine mit unterschiedlicher Aminosäuresequenz und/oder für mindestens zwei Sensorproteine mit unterschiedlicher Aminosäuresequenz durchgeführt werden.
2. Durchmusterungsverfahren nach Anspruch 1 umfassend den weiteren Schritt: f) Bestimmen der das Membranprotein kodierenden DNA-Sequenz und/oder der das Sensorprotein kodierenden DNA-Sequenz.
3. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle ein Mikroorganismus ist.
4. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle Escherichia coli ist und die Zellmembran die innere Membran von E. coli ist.
5. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schritte a) bis f) für mindestens 5, bevorzugt mindestens 10, weiter bevorzugt mindes tens 20, weiter bevorzugt mindestens 50, weiter bevorzugt 102 bis 108 Membranproteine mit unterschiedlicher Aminosäuresequenz durchgeführt werden.
6. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Schritte a) bis f) für mindestens 5, bevorzugt mindestens 10, weiter bevorzugt mindes tens 20, weiter bevorzugt mindestens 50, weiter bevorzugt 102 bis 108 Sensorproteine mit unterschiedlicher Aminosäuresequenz durchgeführt werden.
7. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Signal ein Fluoreszenz-Signal, ein Biolumineszenz-Signal oder ein Absorptionssignal ist.
8. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Sensorprotein ausgewählt ist aus der Gruppe der Ca2+-spezifischen Proteinsensoren und der L-Glu-spezifischen Proteinsensoren.
9. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Reportersubstanz ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Kationen und Amino säuren.
10. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Membranprotein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus porenbildenden Memb ranproteinen und Membrantransportern.
11. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Membranprotein ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Holinen, Pinholinen und lonenkanälen.
12. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das Membranprotein ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus S21-68 (SEQ ID NO: 1), HokB (SEQ ID NO:15), TisB (SEQ ID NO:16), aHLA (SEQ ID NO:17), cWZA (SEQ ID NO:18), BM2 (SEQ ID NO:19), HCV TME1 (SEQ ID NO:20), HCV TME2 (SEQ ID NO:21) und Varianten davon, die eine Sequenzidentität mit mindestens einer der Sequenzen aus SEQ ID NO: 1-21 von mindestens 90%, weiter bevorzugt mindestens 95%, weiter bevor zugt mindestens 98%, weiter bevorzugt mindestens 99% aufweisen.
13. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt d) höchstens 120 Minuten, bevorzugt höchstens 60 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 45 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 30 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 15 Minuten, weiter bevorzugt höchstens 10 Minuten, nach Schritt c) durchgeführt wird.
14. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei Schritt d) mindestens fünfmal, bevorzugt mindestens zehnmal, weiter bevorzugt mindes tens zwanzigmal zu verschiedenen Zeitpunkten durchgeführt wird und die Berechnung des Vergleichsparameters aus den Signalstärken gemäß Schritt e) beinhaltet, dass die zu den Signalstärken erhaltenen Daten mit einer Sigmoidfunktion empirisch gefittet werden, wobei der aus den Signalstärken berechnete Vergleichsparameter die halbmaximale Zeit c und/o der die maximale Steigung d ist.
15. Durchmusterungsverfahren nach Anspruch 14, wobei die zu den Signalstärken erhaltenen Daten mit der folgenden Gleichung 1 empirisch gefittet werden b — (x—c)
1 + e~ d
Gleichung 1
16. Durchmusterungsverfahren nach mindestens einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Zelle ein prokaryotischer Mikroorganismus ist.
17. Kit zur Durchführung des Durchmusterungsverfahrens nach mindestens einem der vorher gehenden Ansprüche, wobei das Kit umfasst:
DNA kodierend für mindestens zwei Membranproteine und DNA kodierend für ein Sensorprotein, oder ii. DNA kodierend für mindestens zwei Sensorproteine und DNA kodierend für ein Membranprotein.
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