EP4013779A1 - Peptides derives de la sortiline - Google Patents

Peptides derives de la sortiline

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Publication number
EP4013779A1
EP4013779A1 EP20756814.8A EP20756814A EP4013779A1 EP 4013779 A1 EP4013779 A1 EP 4013779A1 EP 20756814 A EP20756814 A EP 20756814A EP 4013779 A1 EP4013779 A1 EP 4013779A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
asp
sequence seq
val
polypeptide
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP20756814.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Camille GRANET
Eric LAPEYRONNIE
Thomas NAVES
Paul-François GALLET
Marie-Odile Jauberteau
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Universite de Limoges
Original Assignee
Universite de Limoges
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Universite de Limoges filed Critical Universite de Limoges
Publication of EP4013779A1 publication Critical patent/EP4013779A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/10—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a tag for extracellular membrane crossing, e.g. TAT or VP22
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/40—Fusion polypeptide containing a tag for immunodetection, or an epitope for immunisation

Definitions

  • the present invention relates to peptides derived from sortilin and their use in a pathology associated with deregulation of sortilin, such as cancers, in particular non-small cell lung cancers, neurological disorders, in particular Parkinson's disease, Alzheimer's disease, coronary heart disease and atherosclerosis.
  • Sortilin (NCBI, NP-002950, 18-Jun-2019) or NTSR3 (Neurotension Receptor 3), for Neurotensin 3 receptor, was initially discovered and characterized in the nervous system. Its SORTI gene (NM_002959) is located on the short arm of chromosome 1 at locus lpl3.21 (109 309 568 - 109 397 951). Unlike the first two neurotensin receptors described, NTSR1 and NTSR2 (on chromosomes 20 and 2, respectively; NM_002531 and NM_012344) which are receptors with seven transmembrane domains coupled to G proteins, sortilin is a type I receptor.
  • VPS10 domain (Vacuolar Protein Sorting) with four other members; SORCS1 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 1), SORCS2 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 2), SORCS3 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) and SORLA (sortilin-related receptor 1). All of the members of this VPS10 family function both as a sort receptor in the Golgi compartments and as a transporter of soluble vacuolar proteins.
  • sortilin is ubiquitous but remains higher in the brain, spinal cord, testes and skeletal muscles. It is synthesized in the endoplasmic reticulum (ER) in the form of a precursor protein of 831 amino acids (aa) and responds to the sequence SEQ ID NO 1. In its / V-terminal part, a signal peptide making it possible to route sortilin through the ER and the Golgian network precedes a 44 aa pro-peptide. This pro peptide masks the VPS10 domain, thus preventing from the ER the binding of sortilin ligands to its immature form.
  • ER endoplasmic reticulum
  • aa 831 amino acids
  • a furin convertase cleaves the pro-peptide, thereby freeing access to the VPS10 domain and activating sortilin sorting functions.
  • the released pro-peptide which corresponds to amino acid residues 1 to 44, is biologically active.
  • a molecule derived from this pro-peptide (residues 17 to 28), modified by the addition of the residues APLRP, was generated and named "spadine". This exhibits antidepressant effects by inhibiting the TREK-1 potassium channel (US2012322060 and EP 3099313).
  • sortilin binds different ligands via its VPS10 domain such as the precursors of the growth factors Nerve Growth Factor (pro-NGF) or Brain Derived Nerve Factor (pro-BDNF), pro-granulin, lipoprotein lipase, the transporter glucose type 4 (GLUT4), RAP12, and including its own pro-peptide. Sortilin would thus play a regulatory role on the quantity of neurotrophic factors to be secreted by directing the excess towards the lysosome (PMID: 21730062 Evans SF et al. J. Biol. Chem. (2011), 286 (34), 29556-29567 ).
  • Pro-NGF Nerve Growth Factor
  • pro-BDNF Brain Derived Nerve Factor
  • pro-granulin pro-granulin
  • lipoprotein lipase the transporter glucose type 4
  • RAP12 transporter glucose type 4
  • Sortilin would thus play a regulatory role on the quantity of neurotrophic factors to be secreted by directing the
  • sortilin can i) either be recycled to endosomes or trans-GoIgi via motifs contained in its intracellular part or ii) or perform its second function as a co-receptor via its VPS10 domain and forming heterodimers with membrane receptors, such as the p75NTR death domain receptor or at neurotrophin receptors (TrkA, -B, -C) promoting activation of cellular signaling.
  • the VPS10 domain constitutes the entire luminal / extracellular domain of sortilin in the form of a structure rich in cysteines conserved between yeast and humans.
  • VPS10 domain is divided into three domains; the / V-terminal part (residues 45-576 of sortilin) forms a helical structure formed of ten substructures organized in b-sheets at the center of which the C-terminal part of neurotensin binds, followed by two small domains called lOCCa and lOCCb (sortilin residues 577-633 and 634-716, respectively). These two domains constitute the 10CC module containing few secondary structures and strongly interacting with the helical structure.
  • sortilin In its intracellular sorting functions, sortilin is exposed to variations in pH between the different subcellular compartments, in particular in late endosomes, where the acidity of the latter allows the release of ligands associated with their receptors.
  • the crystal structure of the VPS10 domain at acidic pH (5.5) reveals a global distortion of the helical structure followed by homodimerization of sortilin, therefore blocking access to ligands.
  • the intracellular part of sortilin contains sequence homology with the C-terminal domain of Mannose-6-Phosphate Receptors (M6PR), in particularly the cation independent or Cation Independent Mannose-6- Phosphate Receptor (CI-M6PR). Indeed, the C-terminal sequences of CI-M6PR and sortilin share eight common amino acids (DDSDEDLL).
  • This octapeptide comprises two functional sites; the site of phosphorylation by casein kinase II (serine residue) and a dileucine (LL) motif. These two sites represent the essential functional motifs of M6PRs for their traffic between the Golgian compartments and the late endosomes.
  • sortilin contains at least two other sorting signals; the YSVL tetrapeptide and the FLVHRY motif (respectively at positions 792-795 and 787-792 of sortilin) immediately adjacent to the transmembrane domain.
  • the YSVL tetrapeptide respects a YXXZ consensus motif, where Z represents a bulky or aromatic hydrophobic residue.
  • This sequence is involved in the internalization and rapid sorting of membrane proteins such as LRP (Lipoprotein receptor-related protein), membrane proteins of the trans-Golgien network 38/41 (TGN38 / 41) and M6PR 20-22 of 46 kDa.
  • LRP Lipoprotein receptor-related protein
  • TGN38 / 41 membrane proteins of the trans-Golgien network 38/41
  • M6PR 20-22 of 46 kDa.
  • the FLVHRY sequence constitutes another sorting / internalization signal according to the (F / Y) XXXX (F / Y) motif necessary for the traffic of M6PR receptors and of those of the LRP family.
  • Sortilin especially human sortilin, is known for its different roles in Alzheimer's disease, Parkinson's disease and diabetes. It is also involved in the effects of neurotensin on the growth of cancer cells of prostatic, pancreatic or coionic origin (Dal Farra C. et al. Int J Cancer, 2001; 92, 503-9) and has important functions in the control of lipoprotein metabolism (Current Opinion in Lipidology, 2011, 22 (2), 79-85).
  • Bronchial adenocarcinomas represent the largest proportion ( ⁇ 80%) of non-small cell lung cancers (NSCLC) which remain the leading cause of cancer death in France and around the world.
  • NSCLC non-small cell lung cancers
  • NSCLC belong to the most difficult cancers to treat with limited progression-free survival compared to breast and colon cancers which share common clinical characteristics.
  • intense efforts have been made to improve our knowledge of the mechanisms facilitating the initiation and progression of NSCLC. Therefore, molecular studies reveal that the latter have the highest rate of mutational "loads" on receptors with tyrosine kinase (RTK) activity, such as the epidermal growth factor receptor (EGFR), which remains the archetype.
  • RTKs tyrosine kinase
  • Somatic mutations in its tyrosine kinase (TK) domain generate a constitutively active form of the receptor, independent of the binding of its ligands, and aberrantly activate the signaling pathways associated with cell proliferation. Therefore, a "cell addiction" is established, placing the activating mutations of EGFR as the main oncogenic factors.
  • TKIs tyrosine kinase
  • TKIs limit both the intensity and duration of EGFR proliferative signaling, thereby decreasing tumor aggressiveness and disease progression in patients.
  • the inclusion of TKIs in clinical protocols increases the overall survival of patients, however, this is still less than 15% at 5 years. Indeed, the clinical benefits of TKI inevitably decline regardless of the stage of the disease.
  • EGFR would have functions other than the transduction of a signal at the cell surface, in particular a role of transcription factor (in the nucleus of cells) which would induce the expression of mitogenic genes and resistance to therapies.
  • EGFR's transcriptional program is said to promote resistance to TKIs.
  • the EGFR receptor independently of its kinase activity, would promote therapeutic escape.
  • sortilin a protein belonging to the VPS10 family, on the regulation and stability of EGFR. They have shown that sortilin is actively involved in the internalization and degradation of EGFR. Inhibition of sortilin leads to the accumulation of EGFR under an overactivated state, forcing tumor cells to proliferate and survive.
  • sortilin is strongly expressed. Conversely, in tumors exhibiting the T790M mutation, insensitizing EGFR to TKIs, the expression of sortilin is low. Overexpression of sortilin in a cell model expressing the mutated EGFR T790M, reverses the phenotype resistant of these cells and "re-sensitizes" the latter to TKIs (Al Akhrass H. PhD thesis already cited).
  • EGFR and sortilin interact with each other through their extracellular part, namely the VPS10 domain of sortilin with the extracellular part of EGFR.
  • the expression of a truncated form of sortilin (amputated of its intracellular part, i.e. amino acids 778-831) disrupts the internalization of EGFR suggesting that the intracellular part of sortilin would serve to transport EGFR to the compartments degradation.
  • this part can be released within cells following cleavage by gamma-secretases, and more precisely by presenilin 1 (PSEN1). This cellular mechanism is not unique to sortilin and remains common to the cleavage of the intracellular part of known proteins such as Notch and APP.
  • the peptides relating to these two proteins are biologically active and have nuclear functions.
  • the research work of the inventors made it possible to characterize and isolate, from sortilin, a polypeptide possessing intracellular biological activity. Analyzes carried out directly on tumor fragments from patients revealed that the expression of EGFR is inversely correlated to that of said polypeptide called SICD (Sortilin IntraCellular Domain) and suggest that the SICD polypeptide could play a role in the degradation and / or expression of EGFR.
  • SICD Sesortilin IntraCellular Domain
  • the object of the present invention is to meet these needs.
  • the inventors have demonstrated this peptide naturally generated in cells following proteolytic cleavage of sortilin, isolated and modified it to allow its penetration into cells and nuclear targeting, and have demonstrated its anti-cancer effect. .
  • the subject of the invention is an isolated polypeptide derived from sortilin and corresponding to its C-terminal part for its use as a medicament.
  • a subject of the invention is also an isolated polypeptide derived sortilin and corresponding to its C-terminal part linked to a cell penetrating peptide and the nucleotide sequence encoding the polypeptide according to the invention, expression vectors comprising said nucleotide sequence and host cells transformed by said vectors of expression.
  • the invention relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising the said polypeptide or the corresponding nucleotide sequence.
  • the subject of the invention is a medicament containing the polypeptide or the corresponding nucleotide sequence or the pharmaceutical composition for its use in the treatment of a disease linked to a deregulation of sortilin.
  • the subject of the invention is the use of the polypeptide as a marker or as an agent for the prognosis of at least one pathology linked to a deregulation of sortilin, in particular cancers (in particular cancers of the lung which are not small cells), neurological disorders, in particular Parkinson's disease and Alzheimer's disease, coronary heart disease and atherosclerosis.
  • sortilin in particular cancers (in particular cancers of the lung which are not small cells)
  • neurological disorders in particular Parkinson's disease and Alzheimer's disease, coronary heart disease and atherosclerosis.
  • the present invention relates to an isolated polypeptide derived from sortilin comprising or consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO 2 on the condition that said polypeptide does not contain the sequence SEQ ID NO 3 or a sequence having at least 80% identity with said sequence SEQ ID NO 3 or one of its pharmaceutically acceptable salts for its use as a medicament.
  • one or more amino acids of the polypeptide can be replaced by an unnatural amino acid or a natural or unnatural analogue of amino acid provided that the three-dimensional structure of the polypeptide is respected.
  • an unnatural amino acid or a natural or unnatural analogue of amino acid provided that the three-dimensional structure of the polypeptide is respected.
  • the 20 natural amino acids Al, Arg, Asn, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr and Val
  • there are others, natural or otherwise, which are described for example by Hunt S. The Non-Protein Amino Acids: In Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, Barrett, Chapman and Hall, 1985).
  • aromatic amino acid such as phenylalanine can be replaced by 3,4-dihydroxy-L-phenylalanine, 3-iodo-L-tyrosine, triiodothyronine, L-thyroxine, phenylglycine (Phg) or nor-tyrosine (norTyr).
  • Phg and norTyr and other amino acids, including Phe and Tyr may be substituted with, for example, halogen, -CH3, -OH, -CH2NH3, - C (0) H, -CH2CH3, - CN , - CH2CH2CH3, -SH or another group. Any amino acid can be substituted with the D form of the amino acid.
  • glutamine (Glu) residues can be substituted by gamma-hydroxy-Glu or gamma-carboxy-Glu.
  • Tyrosine residues can be substituted with a substituted alpha amino acid such as L-alpha-methylphenylalanine or with analogs such as: 3-Amino-Tyr; Tyr (CH3); Tyr (PO3 (CH3) 2); Tyr (SO3H); beta-Cyclohexyl-Ala; beta- (1-Cyclopentenyl) - Ala; beta-Cyclopentyl-Ala; beta-Cyclopropyl-Ala; beta-Quinolyl-Ala; beta- (2-Thiazolyl) -Ala; beta (Triazol-1-yl) -Ala; beta (2-Pyridyl) -Ala; beta (3-Pyridyl) - Ala; Amino-Phe; Fluoro-Phe; Cyclohexyl-Gly; tBu-Gly; beta- (3-benzothienyl) - Ala; beta- (2-thienyl) -Ala; 5-Met
  • Alanine residues can be substituted with an alpha-substituted or N-methylated amino acid like alpha acid -amino isobutyric (aib), L / D-alpha-ethylalanine (L / D-isovaline), L / D-methylvaline or L / D-alpha-methylleucine or an unnatural amino acid such as beta-fluoro- To the.
  • Glycine residues can be substituted with alpha-amino isobutyric acid (aib) or b / D-alpha-ethylalanine (L / D-isovaline ).
  • an amino acid can be replaced with a non-essential amino acid of natural origin, such as taurine.
  • sortilin denotes a polypeptide comprising 831 amino acids and corresponding to the sequence SEQ ID NO 1 or a polypeptide exhibiting at least 80% identity with said sequence SEQ ID NO 1.
  • the polypeptides are derived from sortilin of human or animal origin. They can be of natural or recombinant origin. They can finally be synthetic.
  • isolated polypeptide denotes a polypeptide obtained by a method known to a person skilled in the art, and in particular by the recombinant route or by chemical synthesis, said polypeptide then being separated, by partial or total purification, from its initial environment.
  • isolated nucleic acid denotes a nucleic acid obtained by a method known to a person skilled in the art, and in particular according to any known method of genetic engineering or by chemical synthesis, followed by purification of said nucleic acid.
  • An isolated polypeptide according to the invention therefore differs from a natural polypeptide, but is not limited to a particular method of preparation or synthesis.
  • an isolated nucleic acid according to the invention differs from a natural amino acid while not being limited to a particular method of synthesis.
  • a polypeptide according to the invention is produced by the recombinant route, according to techniques well known to those skilled in the art specializing in this field.
  • the production of a recombinant protein includes in particular the choice of the host intended for the production, for example a bacterium, a eukaryotic yeast or mammalian cell or a transgenic animal, and the design of a synthetic nucleotide sequence suitable for said production, in particular by the choice of a production vector and the choice of codons used in order to optimize production.
  • a recombinant protein can be produced in the form of a fusion protein, which associates the protein of interest with a “tag” domain (or “Tag”) intended to allow the identification and / or purification of said protein. 'interest. The purification of the protein of interest is then carried out according to one method among the many protocols accessible to those skilled in the art.
  • the percentage is purely statistical and the differences between the two nucleotide sequences or in amino acids can be distributed at random and over their entire length.
  • the percentage sequence identity between two sequences is defined after the alignment of the sequences to be compared. When a position in one of the sequences is occupied by the same base or the same amino acid, the molecules are identical at that position.
  • a degree of identity between two sequences is a function of the number of identical positions between both sequences.
  • the sequence comparisons can be carried out using any algorithm provided for this purpose known to those skilled in the art.
  • the amino acid sequence has at least 80%, preferably at least 85%, at least 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95% , 96%, 97%, 98%, at least 99% or 100% identity with the sequence SEQ ID NO 2.
  • polypeptide according to the invention corresponds to SEQ ID NO 2, then it corresponds to amino acids 775-831 of human sortilin. It belongs to the intracellular domain of sortilin and is called SICD (Sortilin IntraCellular Domain).
  • the polypeptide corresponding to SEQ ID NO 2 is covalently linked to a cell penetrating peptide.
  • This covalent bond can be made either at the / V-terminus or at the C-terminus of the peptide.
  • CPP cell-penetrating peptide
  • Tat protein of HIV-1 in particular the Tat protein of HIV-1, penetratin, a peptide derived from the homeodomain of the antennapedia protein, p28 from azurin, VP22 of the virus Herpes Simplex (HSV-1) or else synthetic peptides such as MAP (model ampiphatic peptide) of sequence SEQ ID NO 11 or DPV1047 of sequence SEQ ID NO 12 described by Guidotti G. et al. (Trends in Pharmacological Sciences, April 2017, Vol. 38, No. 4).
  • MAP model ampiphatic peptide
  • These peptides can cross the cell membrane and reach the cytoplasm and / or the nucleus of cells. They can therefore transport a wide variety of biologically active molecules into the cell.
  • some of these CPPs have their own activity capable of reinforcing that of the molecule which they transport.
  • the cell penetrating peptide is the Tat protein and the polypeptide according to the invention has the sequence SEQ ID NO 4 corresponding to the polypeptide of sequence SEQ ID NO 2 covalently linked to the protein Tat of sequence SEQ ID NO 8.
  • the presence of the Tat protein of HIV-1 offers the opportunity to cross the blood barrier. encephalic and mucous membranes of the bronchi and intestine. Therefore, the range of action of the peptide can extend to locally advanced forms with deep metastases, such as brain metastases.
  • a subject of the invention is also an isolated nucleotide sequence chosen from the following polynucleotides: a. a polynucleotide encoding the polypeptide according to the invention of sequence SEQ ID NO 2 and consisting of the sequence SEQ ID NO 5, b. a polynucleotide which has at least 80% or more, at least 85% or more, at least 90% or more, at least 95% or more of homology with the polynucleotide of sequence SEQ ID NO 5 and c. a polynucleotide that is degenerate from polynucleotides a and b
  • the genetic code is degenerate (or redundant), which means that there can be several codons to designate the same amino acid.
  • a degenerate polynucleotide is a polynucleotide of different sequence, but capable of performing the same function or producing the same result as the initial polynucleotide which corresponds to the sequence SEQ ID NO 2.
  • the degenerated polynucleotide will have a sequence different from that of the a and polynucleotides. b, but meets the rules of the degeneration of the genetic code which are accessible on the following link:
  • the polynucleotide corresponding to SEQ ID NO 5 is covalently linked to a polynucleotide encoding a cell penetrating peptide.
  • the polynucleotide codes for the Tat protein of HIV-1 then the polynucleotide has the sequence SEQ ID NO 6.
  • a subject of the invention is also an expression vector comprising a polynucleotide encoding a polypeptide according to the invention.
  • vector designates a nucleic acid molecule capable of transporting a nucleotide sequence to which it is linked, or of allowing the expression of the protein encoded by a nucleotide sequence to which it is linked in a manner.
  • operational expression vector
  • the nucleotide vector comprises the sequence SEQ ID NO 5 or the sequence SEQ ID NO 6.
  • a subject of the invention is also a host cell comprising a polynucleotide encoding a polypeptide according to the invention or a vector according to the invention.
  • the host cell can be any cell commonly used and is in particular chosen from the group comprising bacteria, yeasts, human cell lines, animal cells.
  • a subject of the invention is also a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising a polypeptide or one of its pharmaceutically acceptable salts or a polynucleotide according to the invention or one of its pharmaceutically acceptable salts in association with a pharmaceutically acceptable excipient.
  • This composition can also contain another active agent.
  • the term “pharmaceutically acceptable excipient” is intended to mean any substance other than the active substance, intended to provide a consistency, a taste or a color to a medicament, while avoiding any interaction with the active principle.
  • the pharmaceutically acceptable excipient according to the invention will be chosen according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration, from the usual excipients which are known to a person skilled in the art, with a view to being administered to humans or to animals. .
  • active agents any substance other than the polypeptide or the polynucleotide according to the invention and having a therapeutic effect.
  • chemotherapeutic molecules such as cisplatin
  • TKIs tyrosine kinase receptors
  • immune suppression T-lymphocyte checkpoint inhibitors or checkpoint inhibitors of T-lymphocytes
  • gefitinib or erlotinib This list is not exhaustive.
  • the pharmaceutical compositions can be presented in any pharmaceutical form suitable for local, regional, systemic or continuous administration. Mention may be made, by way of example, of the following administration routes: oral, sublingual, subcutaneous, parenteral, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, ocular, intraperitoneal, by endoparietal, transdermal or rectal diffusion, or by any other route of administration.
  • Suitable administration forms include oral forms such as tablets, capsules soft or hard, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual, buccal, intratracheal, intraocular, intranasal, inhalation administration forms, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration forms , forms of rectal administration and implants.
  • the compounds according to the invention can be used in creams, oil-in-water or water-in-oil emulsions, gels, ointments, patches, solutions or lotions.
  • a subject of the invention is also a polypeptide or a polynucleotide or a pharmaceutical composition according to the invention as a medicament.
  • they can be used as such or in the form of a pharmaceutically acceptable salt.
  • acid addition salts with an organic or inorganic acid such as acetic acid, succinic acid and hydrochloric acid, ammonium salts or alkali metal salts such as sodium or potassium salt.
  • the polypeptide according to the invention or the pharmaceutical composition according to the invention can be used as a medicament in combination with at least one second anticancer therapy, said second anticancer therapy being administered before, after or at the same time as the polypeptide or the polynucleotide or the pharmaceutical composition.
  • a second anticancer therapy there may be mentioned surgery, chemotherapy (treatment with a molecule with anticancer activity), radiotherapy (administration of a radiotherapy agent), hormone therapy (administration of hormonal derivatives), toxin therapy, immunotherapy and cryotherapy.
  • a polypeptide or one of its pharmaceutically acceptable salts according to the invention or a polynucleotide or one of its salts according to the invention or a pharmaceutical composition according to the invention can be used in a pathology linked to a deregulation of sortilin such as, for example, cancers, including non-small cell lung cancers, neurological disorders, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, coronary heart disease and atherosclerosis.
  • sortilin such as, for example, cancers, including non-small cell lung cancers, neurological disorders, including Parkinson's disease, Alzheimer's disease, coronary heart disease and atherosclerosis.
  • sortilin deregulation is understood to mean variations in the amount of sortilin.
  • a subject of the invention is also a method of treating pathologies linked to a deregulation of sortilin such as, for example, cancers, in particular non-small cell lung cancers, neurological disorders, in particular Parkinson's disease, Alzheimer's, coronary heart disease and atherosclerosis comprising the administration of a polypeptide or a polynucleotide or one of their salts according to the invention to a subject in need thereof.
  • a polypeptide according to the invention comprising or consisting of an amino acid sequence having at least 80% identity with the sequence SEQ ID NO 2
  • a subject of the invention is also a method for the in vitro or ex vivo prognosis of a pathological state linked to a deregulation of sortilin such as, for example, cancers, in particular non-small cell lung cancers, neurological disorders, in particular Parkinson's disease and Alzheimer's disease, coronary heart disease and atherosclerosis, comprising a first evaluation of the expression of the polypeptide of sequence SEQ ID NO 2 present in a biological sample obtained from said subject, comparing said first evaluation with evaluations of the expression of said polypeptide determined in a population of healthy subjects, where a variation of the expression of said polypeptide in said biological sample from the expression determined for healthy subjects is indicative of the presence of the pathological condition .
  • sortilin such as, for example, cancers, in particular non-small cell lung cancers, neurological disorders, in particular Parkinson's disease and Alzheimer's disease, coronary heart disease and atherosclerosis
  • the detection of the polypeptide can be done by any technique known to those skilled in the art; it can in particular be done directly in the pathological tissues of patients, such as tumors or biopsies or blood samples.
  • This detection can be done by the western blotting technique, the technique combining exclusion chromatography coupled with mass spectrometry, the ELISA technique under competitive conditions, using specific antibodies coupled or not. with an enzymatic or isotopic tracer in order to detect the polypeptide by imaging.
  • FIG. 1A represents the detection by western blotting of the synthetic peptide of sequence SEQ ID NO 7 according to the invention in the intracellular medium according to Example 1.
  • “SICD peptide” corresponds to the increasing concentrations of peptide of SEQ ID NO 7 (SICD peptide coupled to the V5 tag and to the Tat) used according to Example 1.
  • IB anti-V5” quantity of intracellular peptide measured with the anti-V5 antibody
  • IB anti-SORT-ICD” quantity of intracellular peptide measured with the antibody directed against the intracellular part of sortilin
  • IB anti-actin
  • FIG. IB represents the visualization of this synthetic peptide at the nuclear level by immunofluorescence according to Example 1.
  • the DAPI marks the nuclei of the cells, while the tag-V5 makes it possible to visualize the intracellular localization of the peptide of synthesis. Indeed, when taking images in two dimensions and when the two markings are superimposed, the distribution of V5, and therefore that of the synthetic peptide, is superimposed on that of the nucleus. This distribution is punctiform, in the form of spots located at nuclear level. Three-dimensional imaging makes it possible to appreciate the distribution of these spots in the depth of the nuclei, along the z axis, and not only on their surface as allowed by 2D imaging. Thus, as shown in FIG. 1.B, the synthetic peptide forms spots which are distributed inside cell nuclei.
  • FIG. 2 represents the evaluation of cell survival, measured by XTT (Cell Proliferation Kit II - Roche), in the presence of the SICD peptide coupled to the tag-V5 and to the Tat and responding to the sequence SEQ ID NO 7 at different concentrations after 24 h, 48 h and 72 h of incubation according to Example 2.
  • FIG. 3 represents the real-time quantification of the binding of annexin V induced by the pro-apoptotic effect of the SICD peptide coupled to the tag-V5 and to the Tat corresponding to the sequence SEQ ID NO 7 in accordance with in example 3.
  • FIG. 4 represents the real-time quantification of the activation of caspase 3 and 7 induced by the pro-apoptotic effect of the SICD peptide coupled to the tag-V5 and to the Tat corresponding to the sequence SEQ ID NO 7 according to example 3.
  • the embryonic kidney line HEK293T (ATCC® CCL-1573 TM) and the bronchial adenocarcinoma cell lines A549 (ATCC® CCL-185 TM) and H1975 (ATCC® CCL-5908 TM) are from the American Type Culture Collection ( ATCC).
  • Line H3255 was kindly donated by Mrs. Sylvie Gazzeri (DR2 INSERM, U823, Institut Albert Bonniot, Grenoble).
  • the cells are cultured in DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) + Glutamax (ref: 10566016, Gibco, ThermoFisher Scientific) culture medium supplemented with 10% fetal calf serum (ref: 9215-50, H2B), 1% of pyruvate (ref: 11360070, Gibco, ThermoFisher Scientific) and 1% Penicillin / Streptomycin (ref: 10378016, Gibco, ThermoFisher Scientific).
  • the DMEM + Glutamax culture medium thus completed will be called “complete medium” in the present application.
  • the cells are maintained in a humid atmosphere in an incubator at 37 ° C.
  • the cells are collected in a 15 or 50 mL tube (respectively Ref: 62554502; 62547254, Sarstedt) and enumerated under a microscope (x40) on a “Malassez” type counting cell (ref: 631-0975; VWR ).
  • a “Malassez” type counting cell (ref: 631-0975; VWR ).
  • cell viability is estimated on the counting cell after staining of a sample of the cell suspension diluted to a quarter in a 0.4% Trypan blue solution (ref: 15250061, Gibco, ThermoFisher).
  • the cells are then centrifuged at 100x-g at 20 ° C (ref: 75004380, Sorvall, ThermoFisher) for 10 minutes.
  • the cell pellet as well obtained is either resuspended so that the cells are at the appropriate density for the various planned experiments, or stored dry at -80 ° C for later uses.
  • a concentration of 10.10 3 cells / cm 2 is usually used for the seeding of each cell subtype used in this invention.
  • the cells are inoculated in culture flasks of 25 or 75 cm 2 (respectively ref: 83.3910.002 and 83.39.11.502, Sarstedt), or in culture plates of 6 or 24 wells (respectively ref: 83.3920 and 83.3922, Sarstedt) depending on the experiments to be carried out.
  • FCS Fetal Calf Serum
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • DMSO dimethylsulfoxide
  • a freezer block containing isopropanol (ref: 563935, Sigma-Aldrich) for 24 hours to 1 week for gradual freezing, before being stored in a container of liquid nitrogen at -196 ° C.
  • the thawing step must be rapid to obtain optimum cell viability.
  • the cryotube immediately out of the liquid nitrogen, the cryotube is placed in a water bath at 37 ° C. until the cell suspension has completely thawed.
  • the cells are taken up in 10 mL of complete medium and centrifuged (300x-g, 10 minutes at 25 ° C.) in order to remove the DMSO. They are then returned to culture according to the conditions previously described.
  • the extraction of the total proteins is carried out directly on the cell mats, after removal of the supernatants and rinsing of the cells in PBS IX, or else on cell pellets previously stored at -80 ° C. It is carried out by incubating the cells with the Laemmli lysis buffer (62.5 mM Tris-HCI ref: 11814273001 ROCHE, pH 6.8, 2% SDS ref: L-4509, Sigma-Aldrich, 25% glycerol ref: G5516, Sigma-Aldrich ) supplemented with 1% (v / v) of cocktail of protease inhibitors (ref: P8340-1ML, Sigma-Aldrich) and 1% (v / v) of cocktail of phosphatase inhibitors (ref: P0044 -1 ML, Sigma-Aldrich), in the proportions of 100 ⁇ L of buffer for 1.10 6 cells for 30 min on ice.
  • Laemmli lysis buffer 62.5 mM Tris
  • a scraper (ref: 179693PK, Nunc, ThermoFisher) is used to collect cells in lysis buffer.
  • the lysis is then completed by sonication set at 60 Hz, amplitude 2 s, for 1 minute (ref: SONIVCX-130-220, VWR).
  • the lysates are then centrifuged at 17,000xg (ref: 75002442, Sorvall, ThermoFisher) for 20 min at 4 ° C, the supernatant containing the proteins is transferred into a sterile 1.5 mL tube (ref: 0030120086, eppendorf) and the proteins are assayed by the Bradford method.
  • the protein concentration of the various samples is evaluated by the Bradford method (Bradford 1976).
  • the test is carried out by incubating the diluted samples (or the different concentrations of the bovine albumin standard (ref: 5000206, Biorad) with the reagents of the DC TM Protein Assay Kit II (ref: 5000112, Biorad) while respecting the protocol of the supplier
  • the absorbance reading is carried out at 595 nm on a spectrophotometer (ref: 51119000, ThermoFisher)
  • the protein concentration of each sample is estimated relative to the line obtained with the concentration range of BSA (0; 125; 250; 500; 750; 1000; 1500 and 2000 pg / mL).
  • the volume of protein required is taken and then equilibrated according to each sample, generally 20 pL. These are completed. respectively with 0.01% bromophenol blue and 5% b-mercaptoethanol before being denatured at 95 ° C for 5 minutes.
  • the proteins are separated on an SDS-PAGE electrophoresis gel (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrilamide Gel, miniprotean system from Biorad).
  • SDS-PAGE electrophoresis gel Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrilamide Gel, miniprotean system from Biorad.
  • concentration of polyacrylamide gels varies from 8 to 15% depending on the molecular weight of the proteins to be separated and analyzed. All the separation gels are invariably preceded by a gel of 4% concentration according to Table 1 below.
  • Table 1 Composition of the separation and concentration gels.
  • Migration is carried out for 1 hour 30 minutes (150 V) in IX migration buffer (ref: 1610732, Biorad).
  • a molecular weight marker is used for each migration (ref: 26619 PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder, Fermantas life Science).
  • the proteins are transferred to a PVDF (Polyvinylidene difluoride) membrane (ref: 10600023). Millipore).
  • the membrane is incubated beforehand for 15 seconds in methanol before being rinsed with water and then equilibrated for a few minutes in the transfer buffer (ref: 161-0771, Biorad).
  • the polyacrylamide gel is also equilibrated for a few minutes in the transfer buffer before being brought into contact with the membrane.
  • the transfer is carried out for 1 hour at 20V with a Transblotting ID Dryer (Biorad) device, according to a setup involving whatmann papers.
  • the PVDF membrane and the gel are comprised between 2 x 4 Whatmann papers previously soaked in transfer buffer (FIG. 1).
  • the qualities of the deposition, migration and transfer are verified by staining the PVDF membrane with Ponceau Red (0.2% Ponceau S ref: P3504-50G, Sigma-Aldrich; 3% TCA ref: T8657-250G, Sigma-Aldrich ) for a few seconds before being washed 3 times 5 min with Tert-butyldimethylsilyl (TBS).
  • the membranes are then incubated for 1 hour at room temperature in TBS IX containing 0.1% Tween-20 (ref: P1379 and 5% skimmed milk (Régilait), to saturate the non-specific binding sites. labeling is carried out by incubation with the primary antibody, directed against the epitopes specific proteins of interest and under the conditions described in Table 2.
  • Table 2 Primary antibodies used in western blotting that cannot be used, NC: not communicated, (a): TBS IX Tween 0.1%, Milk 5%, (b): TBS IX-Tween 0.1%, BSA 3%, (c): TBS IX, BSA 5%, (d): TBS IX, BSA
  • the western blotting is revealed by chemiluminescence.
  • This system is based on the oxidation of luminol by GO2, produced by the action of peroxidase on I ⁇ 2O2.
  • An unstable intermediate compound is formed which emits the light.
  • the membrane is brought into contact for 1 minute with the mixture of the “ECL” kit (ref: WBULS0500, Millipore) in the proportions 1: 1.
  • the chemiluminescence is collected by the digital G box system (Ozyme).
  • the digital images obtained from the revelations of western blotting are processed using image analysis software Genesnap (Syngene) and ImageJ (NIH).
  • the cells are inoculated in a 24-well plate on glass coverslips 14 mm in diameter. After each treatment condition, cells are fixed either with complete medium containing 3.7% paraformaldehyde (PFA) for 20 min at 4 ° C, or with methanol at -20 ° C for 5 min. With methanol, the binding takes place by dehydration (denaturation of proteins) while with aldehydes (formaldehyde) the 3D structure of the protein is preserved (binding by bridging). The phosphorylations are analyzed after binding to PFA. After fixation, the cell layer is washed 3 times 5 min with 500 ⁇ L of PBS.
  • PFA paraformaldehyde
  • the cells are permeabilized with 0.1% Triton X-100 in PBS for 10 min at 4 ° C., then washed again.
  • Fixation with methanol confers the advantage of fixing and permeabilizing the cells at the same time.
  • the saturation of the non-specific sites is carried out with PBS-1% serum (of the same origin as the animal from which the secondary antibody is derived) or with 5% PBS-BSA, for 1 h at room temperature. From the fixing step, all the solutions are filtered beforehand on a 0.2 ⁇ m filter to eliminate fluorescence artefacts and background noise.
  • the primary antibody directed against the protein of interest is incubated overnight at 4 ° C in a PBS solution containing 3% BSA (table 2). Then, three washes of 5 min in PBS are performed, before incubation of the secondary antibody coupled to an Alexa fluor 488® (green fluorescence) (Table 4) for 1 h at room temperature in the PBS-BSA solution. After three washes of 5 min in PBS, the nuclei are labeled with a 1 ⁇ PBS solution containing fluorochrome DAPI at 1 ⁇ M for 5 min. At the end of this step, the cells are rinsed again with three washes of 5 min in PBS.
  • the coverslips are then placed on slides using Aequous Mounting Medium (Dako) aqueous mounting medium and placed overnight at 4 ° C.
  • the preparations are visualized by a confocal microscope of LSM 880 type (Zeiss) equipped with Helium / Neon and argon laser (63X or 100X magnification).
  • the images are processed with Zen (Zeiss) or Image J (NIH) software.
  • the cells are inoculated at a concentration of 2000 cells per well in 100 ⁇ L of culture medium, in 96-well plates. 24 hours later, the medium from the cells is removed, then the cells are rinsed once with sterile PBS IX before adding the culture medium containing the various treatments, including the peptide according to the invention at 600nM, and the reagents. necessary for the analysis of cell death.
  • These are: IncuCyte® Caspase-3/7 Green Reagent (ref: 4440; Essenbio) diluted to 1: 1000 in the culture medium; IncuCyte® Annexin V Green Reagent (ref: 4642; Essenbio) diluted 1: 200 diluted in culture medium.
  • the images are then acquired by positioning the plates in the IncuCyte ZOOM® system (Ref: EssenBio) for 96 hours.
  • Four images per well are then obtained, in high definition, every two hours, with the x10 objective and the channels in phase contrast and in green. These acquisitions are done automatically and non-invasively.
  • the data is processed automatically using the IncuCyte Live-Cell Analysis System ZOOM software (ref: Essenbio).
  • Example 1 Cell penetration test by western blotting and immunofluorescence
  • the synthetic peptide of sequence SEQ ID NO 2 (SICD or Sortilin IntraCellular Domain) is made competent to penetrate cells by adding a Tat sequence (Trans Activator of Transcription, SEQ ID NO 8 belonging to the family of cell penetrating peptides of the virus human immunodeficiency (HIV).
  • Tat sequence Trans Activator of Transcription, SEQ ID NO 8 belonging to the family of cell penetrating peptides of the virus human immunodeficiency (HIV).
  • tag V5 (SEQ ID NO 10)
  • an epitope known for easy detection via a specific antibody or a fluorescent molecule is grafted onto the peptide, then leading to the synthetic peptide of sequence SEQ ID NO 7.
  • the cells are treated with a range concentration of the SICD peptide coupled to the tag-V5 and to the Tat of sequence SEQ ID NO 7, ranging from 0 to 500 nM diluted in complete culture medium. After 24 hours of treatment, the cells are lysed and the peptide is demonstrated in the cell lysate (intracellular medium) with an anti-V5 antibody. Following the different western blotting steps, an increasing increase in the amount of intracellular peptide is demonstrated with a maximum at the highest concentration (500 nM) thus suggesting dose-dependent penetration of the peptide, as illustrated in Figure lA line IB: anti-V5.
  • Actin serves as an internal deposition control demonstrating that an identical amount of protein has been deposited in each protein lane presented ( Figure 1A line IB: anti-actin).
  • Figure 1A line IB anti-actin
  • FIG. 1A line IB anti-SORT ICD
  • the subcellular distribution of the synthetic peptide was visualized by immunofluorescence (Figure 1.B).
  • the images show a nuclear punctiform distribution of the synthetic peptide of sequence SEQ ID NO 7 using an antibody directed against the V5 tag. This distribution is also confirmed using the peptide of sequence SEQ ID NO 7 and an anti-sortilin antibody.
  • the superposition of the labels confirms the specific presence of the peptide in the nucleus of the cells.
  • the images taken in 3D confirm this location inside the nuclei, and not on the surface of the latter. The presence of the synthetic peptide in this cell compartment attests to its action at the nuclear level.
  • a concentration range (0 to 10 mM) of the synthetic peptide of sequence SEQ ID NO 7 according to the invention was incubated for 24, 48 and 72 h in the medium of the cells and the dehydrogenase activity of these (assimilated to viability) was measured (Cell Proliferation Kit II (XTT) - Roche) at the end of each incubation, ie at 24, 48 and 72 h.
  • the results are given in FIG. 2.
  • the pro-apoptotic effect of the peptide of sequence SEQ NO 7 at a concentration of 1 mM was measured in real time via the IncuCyteZOOM® system for 96 hours on the A549 line, on human fibroblasts (non-cancerous cells), as well as than on two lines of adenocarcinomas H3255 and H1975, respectively presenting mutations of EGFR sensitive (L858R) and resistant (L858R / T790M) to TKIs (Inhibitors of receptors with Tyrosine Kinase activity) used clinically through activation of two markers of apoptosis, namely annexin V and caspases 3 and 7.
  • the peptide does not appear to induce activation of the two markers of apoptosis in the culture of human fibroblasts (annexin V figure 3 and caspases 3 and 7 figure 4). Indeed, the levels of expression of these markers are identical under the conditions treated with the peptide and the control conditions. The peptide could therefore exhibit specific toxicity to cancer cells.
  • the synthetic peptide according to the invention results from an assembly of amino acids to form a peptide naturally present in our cells and not from chemical molecules. Therefore, better tolerance by the body is considered. Due to the ease of its synthesis at reasonable costs and its particular intracellular target different from those of ITKs, the peptide according to the invention could be a good candidate for use in dual therapy. In this case, it would make it possible to reduce the administered doses of conventional anti-tumor agents, and to reduce the therapeutic cost associated with the latter.

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Abstract

Polypeptide isolé dérivé de la sortiline humaine comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO 2 Val Leu Ile Val Lys Lys Tyr Val Cys Gly Gly Arg Phe Leu Val Mis Arg Tyr Ser Val Leu Gin Gin Mis Ala Glu Ala Asn Gly Val Asp Gly Val Asp Ala Leu Asp Thr Ala Ser Mis Thr Asn Lys Ser Gly Tyr Mis Asp Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Glu à la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la dite séquence SEQ ID NO 3, pour son utilisation en tant que médicament.

Description

Description
Titre de l'invention : Peptides dérivés de la sortiline
[La présente invention concerne des peptides dérivés de la sortiline et leur utilisation dans une pathologie associée à une dérégulation de la sortiline, comme les cancers, en particulier les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les maladies coronariennes et l'athérosclérose.
La sortiline (NCBI, NP-002950, 18-Jun-2019) ou NTSR3 (Neurotension Receptor 3), pour Récepteur à la neurotensine 3, a initialement été découverte et caractérisée au niveau du système nerveux. Son gène SORTI (NM_002959) est localisé sur le bras court du chromosome 1 au locus lpl3.21 (109 309 568 - 109 397 951). A l'inverse des deux premiers récepteurs à la neurotensine décrits, NTSR1 et NTSR2 (respectivement sur les chromosomes 20 et 2 ; NM_002531 et NM_012344) qui sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G, la sortiline est un récepteur de type I. Sa partie extracellulaire partage un domaine VPS10 (Vacuolar Protein Sorting) avec quatre autres membres ; SORCS1 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 1), SORCS2 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 2), SORCS3 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) et SORLA (sortilin-related receptor 1). L'ensemble des membres de cette famille VPS10 fonctionne à la fois comme récepteur de tri dans les compartiments golgiens et transporteur de protéines vacuolaires solubles.
L'expression de la sortiline est ubiquitaire mais demeure plus élevée dans le cerveau, la moelle épinière, les testicules et les muscles squelettiques. Elle est synthétisée dans le réticulum endoplasmique (RE) sous la forme d'une protéine précurseur de 831 acides aminés (aa) et répond à la séquence SEQ ID NO 1. Dans sa partie /V-terminale, un peptide signal permettant d'acheminer la sortiline au travers du RE et du réseau golgien précède un pro-peptide de 44 aa. Ce pro peptide masque le domaine VPS10, empêchant ainsi dès le RE la liaison des ligands de la sortiline à sa forme immature. Dans le Golgi, une furine convertase clive le pro-peptide, libérant ainsi l'accès au domaine VPS10 et activant les fonctions de tri de la sortiline. Le pro-peptide libéré, qui correspond aux résidus d'acides aminés 1 à 44, est biologiquement actif. Une molécule dérivée de ce pro-peptide (résidus 17 à 28), modifiée par l'addition des résidus APLRP, a été générée et nommée « spadine ». Celle-ci présente des effets antidépresseurs par l'inhibition du canal potassique TREK-1 (US2012322060 et EP 3099313). Une fois mature, la sortiline lie différents ligands via son domaine VPS10 tels les précurseurs des facteurs de croissance Nerve Growth Factor (pro-NGF) ou Brain Derived Nerve Factor (pro-BDNF), la pro-granuline, la lipoprotéine lipase, le transporteur de glucose de type 4 (GLUT4), RAP12, et y compris à son propre pro-peptide. La sortiline jouerait ainsi un rôle régulateur sur la quantité de facteurs neurotrophiques à sécréter en dirigeant l'excédent vers le lysosome (PMID : 21730062 Evans S. F. et al. J. Biol. Chem. (2011), 286(34), 29556- 29567).
Au niveau de la membrane plasmique, la sortiline peut i) soit être recyclée vers les endosomes ou le trans-GoIgi par l'intermédiaire de motifs contenus dans sa partie intracellulaire ou ii) soit assurer sa deuxième fonction comme co-récepteur via son domaine VPS10 et former des hétérodimères avec des récepteurs membranaires, tel que le récepteur à domaine de mort p75NTR ou aux récepteurs des neurotrophines (TrkA, -B, -C) favorisant l'activation de signalisations cellulaires. Le domaine VPS10 constitue l'ensemble du domaine luminal / extracellulaire de la sortiline sous la forme d'une structure riche en cystéines conservée entre la levure et l'Homme. Sa structure cristalline (PDB: 3F6K, https://www.rcsb.org/) a été obtenue à pH neutre en présence de son ligand naturel, la neurotensine. Le domaine VPS10 se divise en trois domaines; la partie /V-terminale (résidus 45-576 de la sortiline) forme une structure hélicoïdale formée de dix sous-structures organisées en feuillets b au centre de laquelle la partie C-terminale de la neurotensine se lie, suivie de deux petits domaines appelés lOCCa et lOCCb (résidus 577-633 et 634-716 de la sortiline, respectivement). Ces deux domaines constituent le module 10CC contenant peu de structures secondaires et interagissant fortement avec la structure hélicoïdale. Dans ses fonctions de tri intracellulaire, la sortiline s'expose à des variations de pH entre les différents compartiments subcellulaires, en particulier dans les endosomes tardifs, où l'acidité de ces derniers permet la libération des ligands associés à leurs récepteurs. La structure cristalline du domaine VPS10 à pH acide (5,5) révèle une distorsion globale de la structure hélicoïdale suivie d'une homodimérisation de la sortiline bloquant dès lors l'accès aux ligands.
La partie intracellulaire de la sortiline contient une homologie de séquence avec le domaine C-terminal des Récepteurs au Mannose-6-Phosphate (M6PR), en particulier celui indépendant des cations ou Cation Independent Mannose-6- Phosphate Receptor (CI-M6PR). En effet, les séquences C-terminales du CI-M6PR et de la sortiline partagent huit acides aminés (DDSDEDLL) communs. Cet octapeptide comprend deux sites fonctionnels; le site de phosphorylation par la caséine kinase II (résidu sérine) et un motif dileucine (LL). Ces deux sites représentent les motifs fonctionnels essentiels des M6PR pour leurs trafics entre les compartiments golgiens et les endosomes tardifs. Bien que le site de phosphorylation par la caséine kinase II soit essentiel pour le recrutement de la protéine adaptatrice 1 (AP-1) nécessaire à la formation des vésicules trans- golgiennes, le motif dileucine est impliqué dans les mécanismes de tri ultérieurs. Des mutations générées au sein de l'octapeptide altèrent l'interaction du CI- M6PR avec le domaine VHS des protéines Golgi-associated, gamma adaptin ear containing, ADP ribosylation factor binding proteins (GGAs). Du fait que les GGAs lient la clathrine nécessaire aux transports spécifiques, ces mutations bloquent la sortie des CI-M6PR du golgi. De plus, ces mêmes mutations modifient le tri des CI-M6PR, des compartiments de recyclage endocytaires (CRE) aux autres organites intracellulaires pendant leurs transports rétrogrades sans pour autant modifier leurs taux d'internalisation à partir de la membrane plasmique. Par conséquent, ce motif représente un signal de tri / d'internalisation actif qui dirige les récepteurs à différents niveaux de leur trafic intracellulaire. Au-delà du motif dileucine (résidus 829 et 830 de la protéine), la sortiline contient au moins deux autres signaux de tri ; le tétrapeptide YSVL et le motif FLVHRY (respectivement aux positions 792-795 et 787-792 de la sortiline) immédiatement adjacents au domaine transmembranaire. Le tétrapeptide YSVL respecte un motif consensus YXXZ, où Z représente un résidu hydrophobe volumineux ou aromatique. Cette séquence est impliquée dans l'internalisation et le tri rapide de protéines membranaires telles que LRP (Lipoprotein receptor- related protein), les protéines membranaires du réseau trans-Golgien 38/41 (TGN38 / 41) et des M6PR 20-22 de 46 kDa. La séquence FLVHRY constitue un autre signal de tri / internalisation selon le motif (F / Y) XXXX (F / Y) nécessaire au trafic des récepteurs M6PR et de ceux de la famille LRP.
La sortiline, notamment la sortiline humaine, est connue pour ses différents rôles dans la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et le diabète. Elle est également impliquée dans les effets de la neurotensine sur la croissance de cellules cancéreuses d'origine prostatique, pancréatique ou coionique (Dal Farra C. et al. Int J Cancer, 2001 ; 92, 503-9) et possède des fonctions importantes dans le contrôle du métabolisme des lipoprotéines (Current Opinion in Lipidology, 2011 , 22(2), 79-85).
De nombreux travaux basés sur le découpage artificiel de la sortiline qui permet d'identifier les rôles des différents domaines qui la composent ont permis de mettre en évidence un domaine interagissant avec la protéine précurseur de l'amyloïde (APP ou Amyloid precursor Protein). (Miao Yang et al., PLOS ONE, 8, no 5, 21 mai 2013 page e63049, XP055671832).
Les adénocarcinomes bronchiques représentent la plus grande proportion (~80 %) des cancers du poumon non à petites cellules (CBNPC) qui demeurent la principale cause de décès par cancer en France et dans le monde. Les CBNPC appartiennent aux cancers les plus difficiles à traiter avec une survie sans progression limitée en comparaison aux cancers du sein et du colon qui partagent des caractéristiques cliniques communes. Face à ce constat, des efforts intenses ont été déployés pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes facilitant l'initiation et la progression des CBNPC. Dès lors, les études moléculaires révèlent que ces derniers ont le taux le plus élevé de « charges » mutationnelles sur les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), tel que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR), qui demeure l'archétype des RTK. Des mutations somatiques dans son domaine tyrosine kinase (TK) génèrent une forme constitutivement active du récepteur, indépendamment de la fixation de ses ligands, et activent de manière aberrante les voies de signalisations associées à la prolifération cellulaire. Dès lors, une "addiction cellulaire" s'instaure, plaçant les mutations activatrices de l'EGFR comme principaux facteurs oncogéniques.
De manière surprenante, il n'existe aucune différence entre la fréquence ou le type de mutation entre les CBNPC précoces ou avancés. Ainsi, d'un point de vue thérapeutique, ces mutations offrent l'opportunité de cibler précisément l'EGFR et d'orienter les stratégies cliniques vers des thérapies dites « personnalisées », comme les inhibiteurs d'activité tyrosine kinase (ITK). Les ITK limitent à la fois l'intensité et la durée des signalisations prolifératives de l'EGFR, diminuant ainsi l'agressivité des tumeurs et la progression de la maladie chez les patients. L'insertion des ITK dans les protocoles cliniques augmente la survie globale des patients, cependant, celle-ci reste toujours inférieure à 15% à 5 ans. En effet, les avantages cliniques des ITK chutent inévitablement indépendamment du stade de la maladie. Pour principale raison, une mutation secondaire se produit dans l'exon 20 de l'EGFR (T790M) inhibant la fixation des inhibiteurs, réactivant ainsi son activité kinase et la progression tumorale. Cependant, une question cruciale demeure quant à l'apparition ou la préexistence de cette mutation dite de « résistance acquise ».
L'EGFR posséderait des fonctions autres que la transduction d'un signal à la surface cellulaire, notamment un rôle de facteur de transcription (dans le noyau des cellules) qui induirait l'expression de gènes mitogéniques et de résistance aux thérapies. Le programme transcriptionnel de l'EGFR favoriserait une résistance aux ITK. Ainsi, le récepteur EGFR, indépendamment de son activité kinase, favoriserait l'échappement thérapeutique.
Dans des travaux précédents (Al-Akhrass H. et al., Nat. Commun. (2017); 8(1): 1182), les inventeurs ont mis en évidence un rôle inédit de la sortiline, protéine appartenant à la famille VPS10, sur la régulation et la stabilité de l'EGFR. Ils ont montré que la sortiline intervient activement dans l'internalisation et la dégradation de l'EGFR. L'inhibition de la sortiline conduit à l'accumulation de l'EGFR sous un état hyperactivé, forçant les cellules tumorales à proliférer et survivre.
Des études histopathologiques et moléculaires menées par les inventeurs sur une cohorte de 72 patients atteints d'un adénocarcinome bronchique ont révélé une répression croissante de la sortiline avec les grades pathologiques de la maladie. En effet, l'expression de la sortiline est intimement liée à une meilleure survie des patients. Son expression demeure forte dans des tumeurs faiblement actives (peu proliférantes) et différenciées. En d'autres termes, l'expression de la sortiline est de bon pronostic dans les adénocarcinomes et particulièrement dans le cas de tumeurs présentant une forte expression de l'EGFR (Al Akhrass H. Thèse de doctorat « Un rôle inédit de la sortiline dans le contrôle du transport rétrograde de l'EGFR pour limiter la croissance tumorale. » https://www.theses.fr/204476984).
Les inventeurs ont également montré que, dans des tumeurs présentant une mutation sensibilisant l'EGFR aux ITK, la sortiline est fortement exprimée. A l'inverse, dans des tumeurs présentant la mutation T790M, insensibilisant l'EGFR aux ITK, l'expression de la sortiline est faible. La surexpression de la sortiline dans un modèle cellulaire exprimant l'EGFR muté T790M, réverse le phénotype résistant de ces cellules et "re-sensibilise" ces dernières aux ITK (Al Akhrass H. Thèse de doctorat déjà citée).
Les inventeurs ont également montré que l'EGFR et la sortiline interagissent mutuellement au travers de leur partie extracellulaire, soit le domaine VPS10 de la sortiline avec la partie extracellulaire de l'EGFR. L'expression d'une forme tronquée de sortiline (amputée de sa partie intracellulaire, soit des acides aminés 778-831) perturbe l'internalisation de l'EGFR suggérant que la partie intracellulaire de la sortiline servirait à acheminer l'EGFR vers les compartiments de dégradation. De manière surprenante, cette partie peut être libérée au sein des cellules à la suite d'un clivage par les gamma-sécrétases, et plus précisément par la préséniline 1 (PSEN1). Ce mécanisme cellulaire n'est pas propre à la sortiline et demeure commun au clivage de la partie intracellulaire de protéines connues telles que Notch et APP. Les peptides relatifs à ces deux protéines sont biologiquement actifs et possèdent des fonctions nucléaires. Les travaux de recherche des inventeurs ont permis de caractériser et d'isoler, à partir de la sortiline, un polypeptide possédant une activité biologique intracellulaire. Des analyses réalisées directement sur des fragments tumoraux de patients, ont révélé que l'expression de l'EGFR est inversement corrélée à celle dudit polypeptide nommé SICD (Sortilin IntraCellular Domain) et suggèrent que le polypeptide SICD pourrait jouer un rôle sur la dégradation et/ou l'expression de l'EGFR.
Ainsi il existe un besoin de disposer de nouveaux composés pour le traitement d'états pathologiques liés à une dérégulation de la sortiline.
Il existe également un besoin de disposer d'outils pour le pronostic d'états pathologiques impliquant la sortiline et notamment une altération de son expression voire de son activité biologique.
La présente invention a pour but de satisfaire ces besoins.
Les inventeurs ont mis en évidence ce peptide naturellement généré dans les cellules suite à un clivage protéolytique de la sortiline, l'ont isolé et modifié pour permettre sa pénétration dans les cellules et un ciblage nucléaire, et ont mis en évidence son effet anti-cancéreux.
Selon un premier aspect, l'invention a pour objet un polypeptide isolé dérivé de la sortiline et correspondant à sa partie C-terminale pour son utilisation en tant que médicament. L'invention a également pour objet un polypeptide isolé dérivé de la sortiline et correspondant à sa partie C-terminale liée à un peptide de pénétration cellulaire et la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide selon l'invention, des vecteurs d'expression comprenant ladite séquence nucléotidique et des cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs d'expression.
Selon un second aspect, l'invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant ledit polypeptide ou la séquence nucléotidique correspondante.
Selon un troisième aspect, l'invention a pour objet un médicament contenant le polypeptide ou la séquence nucléotidique correspondante ou la composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement d'une maladie liée à une dérégulation de la sortiline.
Enfin selon un quatrième aspect, l'invention a pour objet l'utilisation du polypeptide comme marqueur ou comme agent de pronostic d'au moins une pathologie liée à une dérégulation de la sortiline, notamment les cancers (en particulier les cancers du poumon non à petites cellules), les troubles neurologiques, en particulier la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer, les maladies coronariennes et l'athérosclérose.
La présente invention a pour objet un polypeptide isolé dérivé de la sortiline comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO 2 à la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec ladite séquence SEQ ID NO 3 ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour son utilisation en tant que médicament.
Conformément à l'invention, un ou plusieurs acides aminés du polypeptide peuvent être remplacés par un acide aminé non naturel ou un analogue naturel ou non naturel d'acide aminé à condition que la structure tridimensionnelle du polypeptide soit respectée. Outre les 20 acides aminés naturels (Ala, Arg, Asn, Asn, Asp, Cys, Gin, Glu, Gly, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val), il en existe d'autres, naturels ou non qui sont décrits par exemple, par Hunt S. (The Non-Protein Amino Acids : In Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, Barrett, Chapman et Hall, 1985). Ainsi un acide aminé aromatique comme la phénylalanine peut être remplacé par la 3,4-dihydroxy-L- phénylalanine, la 3-iodo-L-tyrosine, la triiodothyronine, la L-thyroxine, la phénylglycine (Phg) ou la nor-tyrosine (norTyr). Phg et norTyr et d'autres acides aminés, y compris Phe et Tyr, peuvent être substitués par, par exemple, un halogène, un groupe -CH3, -OH, -CH2NH3, - C(0)H, -CH2CH3, - CN, - CH2CH2CH3, -SH ou un autre groupe. Tout acide aminé peut être substitué par la forme D de l'acide aminé.
En ce qui concerne les acides aminés non naturels ou les analogues d'acides aminés naturels et non naturels, un certain nombre de substitutions sont possibles, seules ou en association. L'homme du métier, à la lumière de ses connaissances générales, pourra faire de telles substitutions. Ainsi, à titre d'exemple, les résidus de glutamine (Glu) peuvent être substitués par la gamma- hydroxy-Glu ou la gamma-carboxy-Glu. Les résidus de tyrosine peuvent être substitués par un acide aminé alpha substitué tel que la L-alpha- méthylphénylalanine ou par des analogues tels que : 3-Amino-Tyr ; Tyr(CH3) ; Tyr(P03(CH3)2) ; Tyr(S03H) ; beta-Cyclohexyl-Ala ; beta-(l-Cyclopentenyl)- Ala ; beta- Cyclopentyl-Ala ; beta-Cyclopropyl-Ala ; beta-Quinolyl-Ala ; beta-(2- Thiazolyl)-Ala ; bêta-(Triazole-l-yl)-Ala ; bêta-(2-Pyridyl)-Ala ; bêta-(3-Pyridyl)- Ala ; Amino-Phe ; Fluoro-Phe ; Cyclohexyl-Gly ; tBu-Gly ; beta-(3-benzothienyl)- Ala ; beta-(2-thienyl)-Ala ; 5-Methyl-Trp et A-Methyl-Trp. Les résidus de proline peuvent être substitués par de l'homopro (acide L-pipécolique) ; hydroxy-Pro ; 3,4-Dehydro-Pro ; 4-fluoro-Pro ; ou alpha-méthyl-Pro ; ou un N(alpha)-C(alpha) cyclized aminoacides analogues avec la structure : n = 0, 1, 2, 3. Les résidus Alanine peuvent être substitués par un acide aminé alpha-substitué ou N- méthylé comme l'acide alpha-amino isobutyrique (aib), la L/D-alpha-éthylalanine (L/D-isovaline), la L/D-méthylvaline ou la L/D-alpha-méthylleucine ou un acide aminé non naturel tel que bêta-fluoro-Ala. L'alanine peut également être substituée par : n = 0, 1, 2, 3. Les résidus glycine peuvent être substitués par l'acide alpha-amino isobutyrique (aib) ou b/D-alpha-éthylalanine (L/D-isovaline).
Dans certains cas, un acide aminé peut être remplacé par un acide aminé non essentiel d'origine naturelle, comme la taurine.
Le terme « sortiline » désigne un polypeptide comprenant 831 acides aminés et répondant à la séquence SEQ ID NO 1 ou un polypeptide présentant au moins 80 % d'identité avec ladite séquence SEQ ID NO 1. Conformément à l'invention, les polypeptides sont dérivés de la sortiline d'origine humaine ou animale. Ils peuvent être d'origine naturelle ou recombinante. Ils peuvent enfin être synthétiques.
Le terme « polypeptide isolé » désigne un polypeptide obtenu par une méthode connue par un homme du métier, et notamment par voie recombinante ou par synthèse chimique, ledit polypeptide étant ensuite séparé, par purification partielle ou totale, de son environnement initial. De même, le terme « acide nucléique isolé » désigne un acide nucléique obtenu par une méthode connue par un homme du métier, et notamment selon toute méthode connue du génie génétique ou par synthèse chimique, suivie d'une purification dudit acide nucléique. Un polypeptide isolé selon l'invention diffère donc d'un polypeptide naturel, mais n'est pas limité à une méthode particulière de préparation ou de synthèse. De même, un acide nucléique isolé selon l'invention diffère d'un acide aminé naturel tout en n'étant pas limité à une méthode particulière de synthèse.
De préférence, un polypeptide selon l'invention est produit par voie recombinante, selon des techniques bien connues de l'homme du métier spécialisé dans ce domaine. La production d'une protéine recombinante inclut notamment le choix de l'hôte destiné à la production, par exemple une bactérie, une cellule eucaryote de levure ou de mammifère ou un animal transgénique, et la conception d'une séquence nucléotidique synthétique adaptée à ladite production, notamment par le choix d'un vecteur de production et le choix des codons utilisés afin d'optimiser la production. Une protéine recombinante peut être produite sous la forme d'une protéine de fusion, qui associe la protéine d'intérêt à un domaine « étiquette » (ou « Tag ») destiné à permettre l'identification et/ou la purification de ladite protéine d'intérêt. La purification de la protéine d'intérêt est ensuite réalisée selon une méthode parmi les nombreux protocoles accessibles à l'homme du métier.
Dans l'expression « présente au moins 80 % d'identité avec ladite séquence », le pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences nucléotidiques ou en acides aminés peuvent être réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le pourcentage d'identité de séquence entre deux séquences est défini après l'alignement des séquences à comparer. Quand une position dans l'une des séquences est occupée par la même base ou le même acide aminé, les molécules sont identiques à cette position. Un degré d'identité entre deux séquences est une fonction du nombre de positions identiques entre les deux séquences. Les comparaisons de séquence peuvent être effectuées en utilisant tout algorithme prévu à cet effet connu de l'homme du métier.
Selon un aspect particulier d'un polypeptide selon l'invention, la séquence en acides aminés présente au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, au moins 99% ou 100% d'identité avec la séquence SEQ ID NO 2.
Lorsque le polypeptide selon l'invention répond à la SEQ ID NO 2, alors il correspond aux acides aminés 775-831 de la sortiline humaine. Il appartient au domaine intracellulaire de la sortiline et est appelé SICD (Sortilin IntraCellular Domain).
Selon un autre aspect particulier de l'invention, le polypeptide répondant à la SEQ ID NO 2 est lié de façon covalente à un peptide de pénétration cellulaire. Cette liaison covalente peut se faire soit à l'extrémité /V-terminale, soit à l'extrémité C-terminale du peptide.
Conformément à l'invention, on entend par peptide de pénétration cellulaire (cell-penetrating peptide, ou CPP) des molécules qui peuvent se transloquer dans les cellules sans endommager les membranes. On peut citer à titre d'exemple les CPP cités par Borelli A. et al. (Molécules 2018, 23, 295) et celles citées par Guidotti G. et al. (Trends in Pharmacological Sciences, April 2017, 38(4)), notamment la protéine Tat du VIH-1, la penetratin, peptide issu de l'homéodomaine de la protéine antennapédia, le p28 provenant de l'azurin, le VP22 du virus Herpes Simplex (HSV-1) ou encore des peptides synthétiques comme le MAP (model ampiphatic peptide) de séquence SEQ ID NO 11 ou le DPV1047 de séquence SEQ ID NO 12 décrits par Guidotti G. et al. (Trends in Pharmacological Sciences, April 2017, Vol. 38, No. 4). Ces peptides peuvent traverser la membrane cellulaire et atteindre le cytoplasme et/ou le noyau des cellules. Ils peuvent donc transporter dans la cellule une grande variété de molécules biologiquement actives. En outre certains de ces CPP ont une activité propre susceptible de renforcer celle de la molécule qu'il transporte.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le peptide de pénétration cellulaire est la protéine Tat et le polypeptide selon l'invention présente la séquence SEQ ID NO 4 correspondant au polypeptide de séquence SEQ ID NO 2 lié de manière covalente à la protéine Tat de séquence SEQ ID NO 8. La présence de la protéine Tat du VIH-1 offre l'opportunité de traverser la barrière hémato- encéphalique et les muqueuses des bronches et de l'intestin. Dès lors, la plage d'action du peptide peut s'étendre à des formes localement avancées aux métastases profondes, comme les métastases cérébrales.
L'invention a également pour objet une séquence nucléotidique isolée choisie parmi les polynucléotides suivants : a. un polynucléotide codant pour le polypeptide selon l'invention de séquence SEQ ID NO 2 et consistant en la séquence SEQ ID NO 5, b. un polynucléotide qui présente au moins 80 % ou plus, au moins 85 % ou plus, au moins 90 % ou plus, au moins 95 % ou plus d'homologie avec le polynucléotide de séquence SEQ ID NO 5 et c. un polynucléotide qui est dégénéré par rapport aux polynucléotides a et b
Le code génétique est dégénéré (ou redondant), ce qui signifie qu'il peut exister plusieurs codons pour désigner un même acide aminé. Ainsi un polynucléotide dégénéré est un polynucléotide de séquence différente, mais apte à réaliser la même fonction ou produire le même résultat que le polynucléotide initial qui correspond à la séquence SEQ ID NO 2. Le polynucléotide dégénéré aura une séquence différente de celle des polynucléotides a et b, mais répond aux règles de la dégénérescence du code génétique qui sont accessibles sur le lien suivant :
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le polynucléotide répondant à la SEQ ID NO 5 est lié de façon covalente à un polynucléotide codant pour un peptide de pénétration cellulaire. Lorsque le polynucléotide code pour la protéine Tat du VIH-1 alors le polynucléotide présente la séquence SEQ ID NO 6.
L'invention a également pour objet un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention.
Conformément à l'invention, « vecteur » désigne une molécule d'acide nucléique capable de transporter une séquence nucléotidique à laquelle elle est liée, ou bien de permettre l'expression de la protéine codée par une séquence nucléotidique à laquelle elle est liée de façon opérationnelle (vecteur d'expression).
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le vecteur nucléotidique comprend la séquence SEQ ID NO 5 ou la séquence SEQ ID NO 6. L'invention a également pour objet une cellule hôte comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l'invention ou un vecteur selon l'invention. La cellule hôte peut être toute cellule communément utilisée et est notamment choisie dans le groupe comprenant les bactéries, les levures, les lignées cellulaires humaines, des cellules animales.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable ou un polynucléotide selon l'invention ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. Cette composition peut aussi contenir un autre agent actif.
Conformément à l'invention, on entend par « excipient pharmaceutiquement acceptable », toute substance autre que la substance active, destinée à apporter une consistance, un goût, une couleur à un médicament, tout en évitant toute interaction avec le principe actif. L'excipient pharmaceutiquement acceptable selon l'invention sera choisi selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels qui sont connus de l'homme du métier, en vue d'être administré à l'Homme ou aux animaux.
Par « agents actifs », on entend toute substance autre que le polypeptide ou le polynucléotide selon l'invention et ayant un effet thérapeutique. On peut notamment citer à titre d'exemples les molécules chimiothérapeutiques conventionnelles (tel que le cisplatine) ou des molécules pharmacologiques inhibitrices de récepteurs à tyrosine kinase (ITK) ou de voies de signalisation utilisées en thérapie ciblée ou des anticorps inhibiteurs de récepteurs ou des voies de suppression immunitaire (inhibiteurs de points de contrôle des lymphocytes-T ou check point inhibitors of T-lymphocytes) tels que le gefitinib, ou encore l'erlotinib. La présente liste n'étant pas limitative.
Conformément à l'invention, les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter sous toute forme pharmaceutique adaptée à l'administration locale, régionale, systémique ou continue. On peut citer à titre d'exemple les voies d'administration suivantes : voie orale, sublinguale, sous-cutanée, parentérale, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, oculaire, intrapéritonéale, par diffusion endopariétale, transdermique ou rectale, ou par toute autre voie d'administration. Les formes d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules molles ou dures, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, par inhalation, les formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, les formes d'administration rectale et les implants. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, des émulsions huile dans l'eau ou eau dans l'huile, des gels, des pommades, des patches, des solutions ou des lotions.
L'invention a également pour objet un polypeptide ou un polynucléotide ou une composition pharmaceutique selon l'invention en tant que médicament. Conformément à l'invention, ils peuvent être utilisés tels quels ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable. On peut citer à titre d'exemple les sels d'addition d'acide avec un acide organique ou inorganique comme l'acide acétique, l'acide succinique et l'acide chlorhydrique, les sels d'ammonium ou les sels de métal alcalin comme le sel de sodium ou de potassium.
Dans un mode de réalisation avantageux de l'invention, le polypeptide selon l'invention ou la composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être utilisés en tant que médicament en association avec au moins une seconde thérapie anticancéreuse, ladite seconde thérapie anticancéreuse étant administrée avant, après ou en même temps que le polypeptide ou le polynucléotide ou la composition pharmaceutique.
A titre d'exemple de seconde thérapie anticancéreuse, on peut citer une chirurgie, une chimiothérapie (traitement par une molécule à activité anticancéreuse), une radiothérapie (administration d'un agent de radiothérapie), une hormonothérapie (administration de dérivés hormonaux), une thérapie par toxine, une immunothérapie et une cryothérapie.
Un polypeptide ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable selon l'invention ou un polynucléotide ou un de ses sels selon l'invention ou une composition pharmaceutique selon l'invention peuvent être utilisés dans une pathologie liée à une dérégulation de la sortiline comme par exemple, les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les maladies coronariennes et l'athérosclérose.
On entend par « dérégulation de la sortiline » des variations de la quantité de sortiline. L'invention a également pour objet une méthode de traitement de pathologies liées à une dérégulation de la sortiline comme par exemple les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les maladies coronariennes et l'athérosclérose comprenant l'administration d'un polypeptide ou d'un polynucléotide ou d'un de leurs sels selon l'invention à un sujet qui en a besoin.
Un polypeptide selon l'invention comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO 2
Val Leu Ile Val Lys Lys Tyr Val Cys Gly Gly Arg Phe Leu Val His Arg Tyr Ser Val Leu Gin Gin His Ala Glu Ala Asn Gly Val Asp Gly Val Asp Ala Leu Asp Thr Ala Ser His Thr Asn Lys Ser Gly Tyr His Asp Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Glu à la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la dite séquence SEQ ID NO 3 qu'il soit lié ou non de manière covalente à un peptide de pénétration intracellulaire peut également être utilisé comme marqueur ou comme agent de pronostic de pathologies liées à une dérégulation de la sortiline comme par exemple les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les maladies coronariennes et l'athérosclérose.
Aussi l'invention a pour objet un procédé de pronostic in vitro ou ex vivo d'un état pathologique lié à une dérégulation de la sortiline comme par exemple les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer, les maladies coronariennes et l'athérosclérose, comprenant une première évaluation de l'expression du polypeptide de séquence SEQ ID NO 2 présent dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, la comparaison de ladite première évaluation avec des évaluations de l'expression dudit polypeptide déterminées dans une population de sujets sains, où une variation de l'expression dudit polypeptide dans ledit échantillon biologique par rapport à l'expression déterminée pour des sujets sains est indicative de la présence de l'état pathologique. Conformément à l'invention, la détection du polypeptide peut se faire par toute technique connue de l'homme du métier ; elle peut notamment directement se faire dans les tissus pathologiques des patients, tels que les tumeurs ou les biopsies ou les échantillons sanguins. Cette détection peut se faire par la technique de western-blotting, la technique associant une chromatographie d'exclusion couplée à de la spectrométrie de masse, la technique d'ELISA en condition de compétitivité, à l'aide d'anticorps spécifiques couplés ou non à un traceur enzymatique ou isotopique afin de détecter le polypeptide par imagerie.
Description des figures
Les figures 1 à 4 et les exemples 1 à 3 qui suivent illustrent l'invention :
[Fig.lA] La figure IA représente la détection par western-blotting du peptide de synthèse de séquence SEQ ID NO 7 selon l'invention dans le milieu intracellulaire selon l'exemple 1. « SICD peptide » correspond aux concentrations croissantes en peptide de SEQ ID NO 7 (peptide SICD couplé au tag-V5 et au Tat) utilisées selon l'exemple 1. « IB : anti-V5 » quantité de peptide intracellulaire mesurée avec l'anticorps anti-V5 ; « IB : anti-SORT-ICD » quantité de peptide intracellulaire mesurée avec l'anticorps dirigée contre la partie intracellulaire de la sortiline ; « IB : anti-actine » contrôle interne.
[Fig.lB] La figure IB représente la visualisation de ce peptide de synthèse au niveau nucléaire par immunofluorescence selon l'exemple 1. Le DAPI marque les noyaux des cellules, tandis que le tag-V5 permet de visualiser la localisation intracellulaire du peptide de synthèse. En effet, lors d'une prise d'images en deux dimensions et lorsque les deux marquages sont superposés, la répartition du V5, et donc celle du peptide de synthèse, se superpose à celle du noyau. Cette répartition est punctiforme, sous forme de spots localisés au niveau nucléaire. L'imagerie en trois dimensions permet d'apprécier la répartition de ces spots dans la profondeur des noyaux, selon l'axe z, et pas seulement sur leur surface comme le permet l'imagerie en 2D. Ainsi, comme le montre la figure l.B, le peptide de synthèse forme des spots qui se répartissent à l'intérieur des noyaux cellulaires.
[Fig.2] La figure 2 représente l'évaluation de la survie cellulaire, mesurée par XTT (Cell Prolifération Kit II - Roche), en présence du peptide SICD couplé au tag-V5 et au Tat et répondant à la séquence SEQ ID NO 7 à différentes concentrations après 24 h, 48 h et 72 h d'incubation selon l'exemple 2. [Fig.3] La figure 3 représente la quantification en temps réel de la fixation de l'annexine V induite par l'effet pro-apoptotique du peptide SICD couplé au tag- V5 et au Tat répondant à la séquence SEQ ID NO 7 conformément à l'exemple 3.
[Fig.4] La figure 4 représente la quantification en temps réel de l'activation des caspase 3 et 7 induite par l'effet pro-apoptotique du peptide SICD couplé au tag- V5 et au Tat répondant à la séquence SEQ ID NO 7 conformément à l'exemple 3.
Descriptif des techniques utilisées
1. Cellules et culture cellulaire
La lignée embryonnaire de rein HEK293T (ATCC® CCL-1573™) et les lignées cellulaires d'adénocarcinome bronchique A549 (ATCC® CCL-185™) et H1975 (ATCC® CCL-5908™) proviennent de l'American Type Culture Collection (ATCC). La lignée H3255 a été gracieusement donnée par Madame Sylvie Gazzeri (DR2 INSERM, U823, Institut Albert Bonniot, Grenoble). Les cellules sont cultivées dans du milieu de culture DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) + Glutamax (réf : 10566016, Gibco, ThermoFisher Scientific) complété avec 10% de sérum de veau fœtal (réf: 9215-50, H2B), 1% de pyruvate (réf : 11360070, Gibco, ThermoFisher Scientific) et 1% de Pénicilline/Streptomycine (réf : 10378016, Gibco, ThermoFisher Scientific). Le milieu de culture DMEM + Glutamax ainsi complété sera dénommé « milieu complet » dans la présente demande. Les cellules sont maintenues en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C contenant 5% de CO2 (Binder, ThermoFisher Scientific). Pour les repiquages et entretiens hebdomadaires des cellules, le milieu de culture contenant des cellules mortes et débris est retiré, le tapis cellulaire est rincé avec du PBS IX (Phosphate Buffer Saline) (réf : 14190144, Gibco, ThermoFisher) puis les cellules sont décollées de leur support par l'ajout de Trypsine-EDTA (0,05 %) (réf : 25300054, Gibco, ThermoFisher) pendant 5 minutes en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C contenant 5% de CO2. Une fois décollées, les cellules sont collectées dans un tube de 15 ou 50 mL (respectivement Réf : 62554502 ; 62547254, Sarstedt) et énumérées au microscope (x40) sur une cellule de numération type « Malassez » (réf : 631- 0975 ; VWR). En parallèle, la viabilité cellulaire est estimée sur la cellule de numération après coloration d'un échantillon de la suspension cellulaire dilué au quart dans une solution de bleu Trypan 0.4 % (réf : 15250061, Gibco, ThermoFisher). Les cellules sont ensuite centrifugées à 100x-g à 20°C (réf : 75004380, Sorvall, ThermoFisher) pendant 10 minutes. Le culot cellulaire ainsi obtenu est soit remis en suspension de sorte que les cellules soient à la densité appropriée pour les différentes expériences planifiées, soit stocké à sec à -80°C pour des utilisations ultérieures. Une concentration de 10.103 cellules/cm2 est habituellement utilisée pour l'ensemencement de chaque sous-type cellulaire utilisé dans cette invention. Les cellules sont ensemencées dans des flacons de culture de 25 ou 75 cm2 (respectivement réf : 83.3910.002 et 83.39.11.502, Sarstedt), ou encore dans des plaques de culture de 6 ou 24 puits (respectivement réf : 83.3920 et 83.3922, Sarstedt) en fonction des expériences à réaliser.
2. Conservation des cellules à long terme : Congélation-Décongélation
Les cellules en culture sont décollées, collectées et centrifugées comme décrit précédemment. Elles sont ensuite reprises en suspension dans 1 mL de Sérum de Veau Fœtal (SVF) additionné de 10% d'un cryoprotecteur, le diméthylsulfoxide (DMSO) (réf : D-8418, Sigma-Aldrich) à raison de 3xl06 cellules par cryotube (réf : 72380002, Sarstedt). Ceux-ci sont placés dans un bloc à congélation (réf : 479-0966, VWR) contenant de l'isopropanol (réf : 563935, Sigma-Aldrich) pendant 24 heures à 1 semaine pour une congélation progressive, avant d'être stockés dans un container d'azote liquide à -196°C. L'étape de décongélation doit être rapide pour obtenir une viabilité cellulaire optimale. Ainsi, aussitôt sorti de l'azote liquide, le cryotube est placé dans un bain-marie à 37°C jusqu'à décongélation complète de la suspension cellulaire. Les cellules sont reprises dans 10 mL de milieu complet et centrifugées (300x-g, 10 minutes à 25°C) afin d'éliminer le DMSO. Elles sont alors remises en culture selon les conditions préalablement décrites.
3. Extraction des protéines en condition dénaturante
L'extraction des protéines totales est réalisée directement sur les tapis cellulaires, après élimination des surnageants et rinçage des cellules en PBS IX, ou encore sur des culots cellulaires préalablement stockés à -80°C. Elle est réalisée par incubation des cellules avec le tampon de lyse Laemmli (62.5 mM Tris-HCI réf : 11814273001 ROCHE, pH 6.8, 2% SDS réf : L-4509, Sigma-Aldrich , 25% glycerol réf : G5516 , Sigma-Aldrich) additionné d'1% (v/v) de cocktail d'inhibiteurs de protéases (réf : P8340-1ML, Sigma-Aldrich) et d'1% (v/v) de cocktail d'inhibiteurs de phosphatases (réf: P0044-1ML, Sigma-Aldrich), dans les proportions 100pL de tampon pour 1.106 cellules pendant 30 min sur glace. Dans le cas d'extraction sur tapis cellulaire, un scrapeur (réf : 179693PK, Nunc, ThermoFisher) est utilisé pour collecter les cellules dans le tampon de lyse. La lyse est ensuite complétée par sonification paramétrée à 60 Hz, amplitude 2 s, pendant 1 minute (réf : SONIVCX-130-220, VWR). Les lysats sont ensuite centrifugés à 17 OOOxg (réf : 75002442, Sorvall, ThermoFisher) pendant 20 min à 4°C, le surnageant contenant les protéines est transféré dans un tube stérile de 1,5 mL (réf : 0030120086, eppendorf) et les protéines sont dosées par la méthode de Bradford.
4. Dosage protéique
La concentration protéique des divers échantillons est évaluée par la méthode de Bradford (Bradford 1976). Le test est réalisé par incubation des échantillons dilués (ou des différentes concentrations du standard d'albumine bovine (réf : 5000206, Biorad) avec les réactifs du Kit DC™ Protein Assay Kit II (réf : 5000112, Biorad) en respectant le protocole du fournisseur. La lecture de l'absorbance est effectuée à 595 nm sur un spectrophotomètre (réf : 51119000, ThermoFisher). La concentration protéique de chaque échantillon est estimée par rapport à la droite obtenue avec la gamme de concentration de BSA (0 ; 125 ; 250 ; 500 ; 750 ; 1000 ; 1500 et 2000 pg / mL). Une fois les concentrations des échantillons déterminées par cette méthode, le volume de protéines nécessaire est prélevé puis équilibré en fonction de chaque échantillon, généralement 20 pL. Ces derniers sont complétés respectivement avec 0.01% de bleu de bromophenol et 5% de b-mercaptoethanol avant d'être dénaturés à 95°C pendant 5 minutes.
5. Electrophorèse des protéines en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)
Les protéines sont séparées sur un gel d'électrophorèse SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrilamide Gel, système miniprotean de Biorad). La concentration des gels de polyacrylamide varie de 8 à 15 % en fonction du poids moléculaire des protéines à séparer et analyser. Tous les gels de séparation sont invariablement précédés d'un gel de concentration 4 % selon le tableau 1 ci- dessous.
Tableau 1 : Composition des gels de séparation et de concentration.
La migration s'effectue pendant lh30 (150 V) dans le tampon de migration IX (réf : 1610732, Biorad). Un marqueur de poids moléculaire est utilisé à chaque migration (réf : 26619 PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder, Fermantas life Science). Une fois séparées par électrophorèse, les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF (Polyvinylidène difluoride) (réf : 10600023). Millipore). La membrane est préalablement incubée 15 secondes dans du méthanol avant d'être rincée à l'eau puis équilibrée quelques minutes dans le tampon de transfert (réf : 161-0771, Biorad). Le gel de polyacrylamide est également équilibré quelques minutes dans le tampon de transfert avant d'être mis en contact avec la membrane. Le transfert s'effectue pendant 1 h à 20V avec un appareil Transblotting ID Dryer (Biorad), selon un montage faisant intervenir des papiers whatmann. La membrane de PVDF et le gel sont compris entre 2 x 4 papiers Whatmann préalablement imbibés de tampon de transfert (figure 1). Les qualités du dépôt, de la migration et du transfert sont vérifiées par une coloration de la membrane PVDF au Rouge Ponceau (0.2% Ponceau S réf : P3504-50G, Sigma-Aldrich ; 3% TCA réf : T8657-250G, Sigma-Aldrich) pendant quelques secondes avant d'être lavé 3 fois 5 min avec du Tert-butyldiméthylsilyle (TBS).
6. Incubation des membranes avec l'anticorps
Les membranes sont ensuite incubées pendant lh à température ambiante dans du TBS IX contenant 0,1 % de Tween-20 (réf : P1379 et 5% de lait écrémé (Régilait), pour saturer les sites de fixation non spécifiques. L'immuno-marquage est réalisé par incubation avec l'anticorps primaire, dirigé contre les épitopes spécifiques des protéines d'intérêt et selon les conditions décrites dans le tableau 2.
Tableau 2 : Anticorps primaires utilisés en western blotting non utilisable, NC : non communiqué, (a): TBS IX Tween 0.1%, Lait 5%, (b) : TBS lX-Tween 0.1%, BSA 3%, (c) : TBS IX, BSA 5%, (d): TBS IX, BSA
3%, WB : western blotting, IF : immunofluorescence.
Après trois lavages dans du tampon TBS lX-Tween 20 (0,1%), les membranes sont incubées pendant lh à température ambiante avec l'anticorps secondaire adéquat couplé à la peroxydase (tableau 3) (dilution au l/1000ème dans la solution de saturation). Les membranes sont ensuite lavées deux fois avec du TBS lX-Tween 20 (0,1%), puis 2 fois avec du TBS IX seul pour retirer le Tween-20 en excès.
Tab eau 3 : Anticorps secondaires utilisés en western blotting. HRP :
Horseradish Peroxydase
7. Révélation par réaction de chimioluminescence
La révélation du western-blotting est effectuée par chimioluminescence. Ce système repose sur l'oxydation du luminol par GO2, produit par l'action de la peroxydase sur IΉ2O2. Il se forme un composé intermédiaire instable qui émet de la lumière. La membrane est mise en contact pendant 1 minute avec le mélange du kit « ECL » (réf : WBULS0500, Millipore) dans les proportions 1:1. La chimioluminescence est collectée par le système numérique G box (Ozyme). Les images numériques obtenues à partir des révélations des western-blotting sont traitées à l'aide des logiciels d'analyse d'images Genesnap (Syngene) et ImageJ (NIH).
8. Immunofluorescence indirecte
Les cellules sont ensemencées en plaque 24 puits sur des lamelles de verre de 14 mm de diamètre. Après chaque condition de traitement, les cellules sont fixées soit avec du milieu complet contenant du paraformaldéhyde (PFA) à 3,7% pendant 20 min à 4°C, soit avec du méthanol à -20° C pendant 5 min. Avec le méthanol la fixation s'effectue par déshydratation (dénaturation des protéines) alors qu'avec les aldéhydes (formaldéhyde) on conserve la structure 3D de la protéine (fixation par pontage). Les phosphorylations sont analysées après fixation au PFA. Après fixation, le tapis cellulaire est lavé 3 fois 5 min avec 500 pL de PBS. Dans le cas d'une fixation au PFA, les cellules sont perméabilisées au triton X-100 à 0.1% dans du PBS pendant 10 min à 4°C, puis lavées de nouveau. La fixation au méthanol confère quant à elle l'avantage de fixer et de perméabiliser les cellules en même temps. La saturation des sites non spécifiques est effectuée avec du PBS-sérum 1% (de même origine que l'animal dont est issu l'anticorps secondaire) ou en PBS-BSA 5 %, pendant 1 h à température ambiante. A partir de l'étape de fixation, toutes les solutions sont préalablement filtrées sur filtre de 0,2 pm pour éliminer les artefacts de fluorescence et le bruit de fond. L'anticorps primaire dirigé contre la protéine d'intérêt, c'est-à-dire le tag-V5 (permettant la visualisation du peptide synthétique)) est incubé une nuit à 4°C dans une solution de PBS contenant 3 % de BSA (tableau 2). Puis, trois lavages de 5 min en PBS sont effectués, avant l'incubation de l'anticorps secondaire couplé à un Alexa fluor 488® (Fluorescence verte) (tableau 4) pendant 1 h à température ambiante dans la solution de PBS-BSA. Après trois lavages de 5 min en PBS, les noyaux sont marqués par une solution de PBS IX contenant le fluorochrome DAPI à 1 pM pendant 5 min. A l'issue de cette étape, les cellules sont de nouveau rincées par trois lavages de 5 min en PBS. Les lamelles sont ensuite placées sur des lames porte-objet à l'aide du milieu de montage aqueux Aequous Mounting Medium (Dako) et placées une nuit à 4°C. Les préparations sont visualisées par un microscope confocal de type LSM 880 (Zeiss) équipé de laser Helium/Néon et argon (grossissement 63X ou 100X). Les images sont traitées avec le logiciel Zen (Zeiss) ou Image J (NIH).
Tab eau 4 : Anticorps secondaires utilisés en Immunofluorescence.
9. Analyse de la mort cellulaire par imagerie en temps réelle via le système IncuCyteZOOM®
Afin d'étudier la mort cellulaire par apoptose, les cellules sont ensemencées à une concentration de 2000 cellules par puits dans 100 pL de milieu de culture, dans des plaques 96 puits. 24 heures plus tard, le milieu des cellules est retiré, puis les cellules sont rincées une fois avec du PBS IX stérile avant d'ajouter le milieu de culture contenant les différents traitements, dont le peptide selon l'invention à 600nM, et les réactifs nécessaires à l'analyse de la mort cellulaire. Ces derniers sont : IncuCyte® Caspase-3/7 Green Reagent (réf : 4440 ; Essenbio) dilué au 1:1000 dans le milieu de culture; IncuCyte® Annexin V Green Reagent (réf : 4642 ; Essenbio) dilué au 1:200 dilué dans le milieu de culture. L'acquisition des images se fait ensuite en positionnant les plaques dans le système IncuCyte ZOOM® (Réf : EssenBio) pendant 96 heures. Quatre images par puits sont alors obtenues, en haute définition, toutes les deux heures, avec l'objectif xlO et les canaux en contraste de phase et en vert. Ces acquisitions se font automatiquement et de manière non-invasive. Les données sont traitées automatiquement via le logiciel IncuCyte Live-Cell Analysis System ZOOM (réf : Essenbio).
Exemple 1 : Test de pénétration cellulaire par western-blotting et immunofluorescence
Il est réalisé selon la technique décrite précédemment. Le peptide synthétique de séquence SEQ ID NO 2 (SICD ou Sortilin IntraCellular Domain) est rendu compétant à pénétrer les cellules par ajout d'une séquence Tat (Trans Activator of Transcription, SEQ ID NO 8 appartenant à la famille des peptides pénétrant cellulaires du virus de l'immunodéficience humaine (VIH). Par ailleurs une étiquette V5 (SEQ ID NO 10), épitope connu pour une mise en évidence facile via un anticorps spécifique ou une molécule fluorescente est greffé sur le peptide, conduisant alors au peptide synthétique de séquence SEQ ID NO 7. Les cellules sont traitées avec une gamme de concentration du peptide SICD couplé au tag- V5 et au Tat de séquence SEQ ID NO 7, allant de 0 à 500 nM dilué dans du milieu de culture complet. A l'issue de 24 heures de traitement, les cellules sont lysées et le peptide est mis en évidence dans le lysat cellulaire (milieu intra-cellulaire) avec un anticorps anti-V5. Suite aux différentes étapes de western-blotting, une augmentation croissante de la quantité de peptide intra-cellulaire est mise en évidence avec un maximum à la concentration la plus élevé (500 nM) suggérant ainsi une pénétration du peptide dose dépendante, comme illustré à la figure l.A ligne IB : anti-V5. L'actine sert de contrôle interne de dépôt démontrant qu'une quantité identique de protéine a été déposée dans chaque piste protéique présentée (Figure l.A ligne IB : anti-actine). Un profil similaire est obtenu en utilisant un anticorps dirigé contre la partie intracellulaire de la sortiline (Figure l.A ligne IB : anti-SORT ICD). Ces résultats confirment d'une part que le peptide est bien internalisé par les cellules, et d'autre part qu'il s'agit bien d'un peptide dérivé de la partie intracellulaire de la sortiline.
La répartition subcellulaire du peptide de synthèse a été visualisée par immunofluorescence (Figure l.B). Les images montrent une répartition punctiforme nucléaire du peptide synthétique de séquence SEQ ID NO 7 en utilisant un anticorps dirigé contre le tag V5. Cette répartition est également confirmée en utilisant le peptide de séquence SEQ ID NO 7 et un anticorps anti- sortiline. La superposition des marquages (DAPI, marquant le noyau des cellules et V5 marquant le peptide de synthèse) confirme la présence spécifique du peptide dans le noyau des cellules. Les images prises en 3D viennent confirmer cette localisation à l'intérieur des noyaux, et non en surface de ces derniers. La présence du peptide synthétique dans ce compartiment cellulaire atteste de son action au niveau nucléaire.
Exemple 2 : Mesure de l'effet antitumoral par mesure de la survie cellulaire
L'effet anti-tumoral du peptide synthétique, comprenant le Tat et un tag V5 de séquence SEQ ID NO 7, a été testé sur la lignée cellulaire A549 (lignée d'adénocarcinome ne présentant pas de mutation sur l'EGFR). Une gamme de concentration (0 à 10 mM) du peptide synthétique de séquence SEQ ID NO 7 selon l'invention a été incubée pendant 24, 48 et 72h dans le milieu des cellules et l'activité déshydrogénase de celles-ci (assimilée à une viabilité) a été mesurée (Cell Prolifération Kit II (XTT) - Roche) à la fin de chaque incubation, soit à 24, 48 et 72 h. Les résultats sont donnés dans la figure 2. L'analyse du graphique représentant l'activité en fonction du log de la concentration du peptide synthétique a permis d'établir des valeurs de CI50 correspondant aux concentrations pour lesquelles le peptide entraîne 50% d'inhibition de l'activité cellulaire. Celles-ci sont respectivement égales à 1,42 ; 1,52 et 0,57 mM pour les temps d'incubation de 24 ; 48 et 72h.
Exemple 3 : Mesure de l'effet pro-apoptotique du peptide synthétique
L'effet pro-apoptotique du peptide de séquence SEQ NO 7 à la concentration de 1 mM a été mesuré en temps réel via le système IncuCyteZOOM® pendant 96 heures sur la lignée A549, sur des fibroblastes humains (cellules non- cancéreuses), ainsi que sur deux lignées d'adénocarcinomes H3255 et H1975, présentant respectivement des mutations de l'EGFR sensibles (L858R) et résistantes (L858R/T790M) aux ITK (Inhibiteurs de récepteurs à activité Tyrosine Kinase) utilisées en clinique au travers de l'activation de deux marqueurs de l'apoptose à savoir l'annexine V et les caspases 3 et 7. Les résultats montrent que le peptide ne semble pas entraîner d'activation des deux marqueurs de l'apoptose dans la culture de fibroblastes humains (annexine V figure 3 et caspases 3 et 7 figure 4). En effet, les niveaux d'expression de ces marqueurs sont identiques dans les conditions traitées avec le peptide et les conditions contrôles. Le peptide pourrait donc présenter une toxicité spécifique aux cellules cancéreuses.
En revanche, on observe, sur les trois lignées d'adénocarcinomes testées, une augmentation du processus apoptotique dans les cellules au cours du temps. En effet, les niveaux d'expression de l'annexine V (figure 3) ou des caspases 3 et 7 (figure 4) augmentent dans les trois lignées d'adénocarcinomes testées, reflétant un mécanisme d'action du peptide par rapport à son effet anti-tumoral.
A la différence des molécules disponibles en chimiothérapie conventionnelle, le peptide synthétique selon l'invention résulte d'un assemblage d'acides aminés pour former un peptide naturellement présent dans nos cellules et non de molécules chimiques. Dès lors, une meilleure tolérance par l'organisme est envisagée. Du fait de la facilité de sa synthèse à des coûts raisonnables et de sa cible intra-cellulaire particulière différente de celles des ITKs le peptide selon l'invention pourrait être un bon candidat pour une utilisation en bithérapie. Il permettrait dans ce cas, de diminuer les doses administrées d'anti-tumoraux conventionnels, et de diminuer le coût thérapeutique associé à ces derniers.
Ces résultats montrent qu'après son administration le peptide selon l'invention est bien présent à l'intérieur des noyaux (figure 1) et qu'il est capable d'inhiber l'activité de cellules tumorales (figure 2) et présente un effet pro-apoptotique (figure 3). Ainsi ce peptide peut être utilisé dans les maladies liées à une dérégulation de la sortiline, notamment dans les cas où la sortiline est réprimée.

Claims

Revendication^
1. Polypeptide isolé dérivé de la sortiline humaine comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO 2
Val Leu Ile Val Lys Lys Tyr Val Cys Gly Gly Arg Phe Leu Val His Arg Tyr Ser Val Leu Gin Gin His Ala Glu Ala Asn Gly Val Asp Gly Val Asp Ala Leu Asp Thr Ala Ser His Thr Asn Lys Ser Gly Tyr His Asp Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Glu à la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec ladite séquence SEQ ID NO 3 ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptables pour son utilisation en tant que médicament.
2. Polypeptide pour son utilisation en tant que médicament selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit peptide est lié de façon covalente à un peptide de pénétration cellulaire.
3. Polypeptide pour son utilisation en tant que médicament selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit peptide de pénétration cellulaire est choisi dans le groupe comprenant Tat du VIH-1, la penetratin, peptide issu de l'homéodomaine de la protéine antennapédia, le p28 provenant de l'azurin, le VP22 du virus Herpès Simplex (HSV-1), le peptide synthétique MAP de séquence SEQ ID NO 11 ou le DPV1047 de séquence SEQ ID NO 12.
4. Polypeptide pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 3 dans le traitement d'une pathologie liée à une dérégulation de la sortiline choisie dans le groupe comprenant les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d'Alzheimer, les maladies coronariennes et l'athérosclérose.
5. Polypeptide pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce qu'il se présente sous une forme pharmaceutique adaptée à une administration locale, régionale, systémique ou continue.
6. Polypeptide pour son utilisation en tant que médicament selon l'une quelconque des revendications 1 à 5 en association avec au moins une seconde molécule, choisie parmi des molécules chimiothérapeutiques anticancéreuses, des inhibiteurs des récepteurs à tyrosine kinase, des inhibiteurs des voies de signalisation utilisées en thérapie ciblées, des anticorps spécifiques de récepteurs oncogéniques ,des inhibiteurs de point de contrôle des lymphocytes T, des hormones, des toxines et des agents de radiothérapie.
7. Polypeptide isolé dérivé de la sortiline humaine comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO 2 Val Leu Ile Val Lys Lys Tyr Val Cys Gly Gly Arg Phe Leu Val His Arg Tyr Ser Val Leu Gin Gin His Ala Glu Ala Asn Gly Val Asp Gly Val Asp Ala Leu Asp Thr Ala Ser His Thr Asn Lys Ser Gly Tyr His Asp Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Glu à la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la dite séquence SEQ ID NO 3 caractérisé en ce que ledit peptide est lié de façon covalente à un peptide de pénétration cellulaire.
8. Polypeptide selon la revendication 7 caractérisé en ce que ledit peptide de pénétration cellulaire est choisi dans le groupe comprenant Tat du VIH-1, la penetratin, peptide issu de l'homéodomaine de la protéine antennapédia, le p28 provenant de l'azurin, le VP22 du virus Herpès Simplex (HSV-1) ou le peptide synthétique MAP de séquence SEQ ID NO 11 ou le DV.
9. Séquence nucléotidique isolée choisie parmi les polynucléotides suivants : a. un polynucléotide codant pour le polypeptide selon la revendication 7 de séquence SEQ ID NO 4 et consistant en la séquence SEQ ID NO -6, b. un polynucléotide qui présente au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % d'homologie avec le polynucléotide de séquence SEQ ID NO 6 et c. un polynucléotide qui est dégénéré par rapport aux polynucléotides a et b.
10. Vecteur d'expression comprenant un polynucléotide selon la revendication 9.
11. Cellule hôte comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon la revendication 9 ou un vecteur selon la revendication 10.
12. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide selon l'une quelconque des revendications 7 ou 8 ou un polynucléotide selon la revendication 9 ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
13. Composition selon la revendication 11 comprenant en outre un autre agent actif choisi parmi des molécules chimiothérapeutiques, des inhibiteurs des récepteurs à tyrosine kinase, des inhibiteurs des voies de signalisation utilisées en thérapie ciblées, des anticorps spécifiques de récepteurs oncogéniques, des inhibiteurs de point de contrôle des lymphocytes T, des hormones, des toxines et des agents de radiothérapie.
14. Polypeptide isolé dérivé de la sortiline humaine comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d'identité avec la séquence SEQ ID NO 2 Val Leu Ile Val Lys Lys Tyr Val Cys Gly Gly Arg Phe Leu Val His Arg Tyr Ser Val Leu Gin Gin His Ala Glu Ala Asn Gly Val Asp Gly Val Asp Ala Leu Asp Thr Ala Ser His Thr Asn Lys Ser Gly Tyr His Asp Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Glu à la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d'identité avec la dite séquence SEQ ID NO 3 et ses sels pharmaceutiquement acceptables, ledit peptide étant lié de façon covalente ou non à un peptide de pénétration cellulaire pour son utilisation comme marqueur de pathologies liées à une dérégulation de la sortiline, notamment les cancers, en particulier les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, en particulier la maladie de Parkinson et la maladie d'Alzheimer, les maladies coronariennes et l'athérosclérose.
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