FR3099932A1 - Peptides dérivés de la sortiline - Google Patents

Abstract

Polypeptide isolé dérivé de la sortiline humaine comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO 2Val Leu Ile Val Lys Lys Tyr Val Cys Gly Gly Arg Phe Leu Val His Arg Tyr Ser Val Leu Gln Gln His Ala Glu Ala Asn Gly Val Asp Gly Val Asp Ala Leu Asp Thr Ala Ser His Thr Asn Lys Ser Gly Tyr His Asp Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Gluà la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d’identité avec la dite séquence SEQ ID NO 3, pour son utilisation en tant que médicament.

Description

Peptides dérivés de la sortiline

La présente invention concerne des peptides dérivés de la sortiline et leur utilisation dans une pathologie associée à une dérégulation de la sortiline, comme les cancers, en particulier les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, les maladies coronariennes et l’athérosclérose.

La sortiline (NCBI, NP_002950, 18-Jun-2019) ou NTSR3 (Neurotension Receptor 3), pour Récepteur à la neurotensine 3, a initialement été découverte et caractérisée au niveau du système nerveux. Son gèneSORT1(NM_002959) est localisé sur le bras court du chromosome 1 au locus 1p13.21 (109 309 568 – 109 397 951). A l’inverse des deux premiers récepteurs à la neurotensine décrits, NTSR1 et NTSR2 (respectivement sur les chromosomes 20 et 2 ; NM_002531 et NM_012344) qui sont des récepteurs à sept domaines transmembranaires couplés aux protéines G, la sortiline est un récepteur de type I. Sa partie extracellulaire partage un domaine VPS10 (Vacuolar Protein Sorting) avec quatre autres membres ; SORCS1 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 1), SORCS2 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 2), SORCS3 (sortilin-related VPS10 domain containing receptor 3) et SORLA (sortilin-related receptor 1). L’ensemble des membres de cette famille VPS10 fonctionne à la fois comme récepteur de tri dans les compartiments golgiens et transporteur de protéines vacuolaires solubles.

L’expression de la sortiline est ubiquitaire mais demeure plus élevée dans le cerveau, la moelle épinière, les testicules et les muscles squelettiques. Elle est synthétisée dans le réticulum endoplasmique (RE) sous la forme d'une protéine précurseur de 831 acides aminés (aa) et répond à la séquence SEQ ID NO 1. Dans sa partieN-terminale, un peptide signal permettant d’acheminer la sortiline au travers du RE et du réseau golgien précède un pro-peptide de 44 aa. Ce pro-peptide masque le domaine VPS10, empêchant ainsi, dès le RE, la liaison des ligands de la sortiline à sa forme immature. Dans le Golgi, une furine convertase clive le pro-peptide, libérant ainsi l’accès au domaine VPS10 et activant les fonctions de tri de la sortiline. Le pro-peptide libéré, qui correspond aux résidus d’acides aminés 1 à 44, est biologiquement actif. Une molécule dérivée de ce pro-peptide (résidus 17 à 28), modifiée par l’addition des résidus APLRP, a été générée et nommée « spadine ». Celle-ci présente des effets antidépresseurs par l'inhibition du canal potassique TREK-1 (US2012322060 et EP 3099313). Une fois mature, la sortiline se lie à différents ligands via son domaine VPS10 tels les précurseurs des facteurs de croissanceNerve Growth Factor(pro-NGF) ouBrain Derived Nerve Factor(pro-BDNF), la pro-granuline, la lipoprotéine lipase, le transporteur de glucose de type 4 (GLUT4), RAP12, et y compris à son propre pro-peptide. La sortiline jouerait ainsi un rôle régulateur sur la quantité de facteurs neurotrophiques à sécréter en dirigeant l’excédent vers le lysosome (PMID : 21730062 Evans S.F.et al.J. Biol. Chem. (2011), 286(34), 29556-29567).

Au niveau de la membrane plasmique, la sortiline peut i) soit être recyclée vers les endosomes ou le trans-Golgi par l’intermédiaire de motifs contenus dans sa partie intracellulaire ou ii) soit assurer sa deuxième fonction comme co-récepteur via son domaine VPS10 et former des hétérodimères avec des récepteurs membranaires, tel que le récepteur à domaine de mort p75NTR ou les récepteurs des neurotrophines (TrkA, -B, -C) favorisant l’activation de signalisations cellulaires. Le domaine VPS10 constitue l’ensemble du domaine luminal / extracellulaire de la sortiline sous la forme d’une structure riche en cystéines conservée entre la levure et l’Homme. Sa structure cristalline (PDB: 3F6K, https://www.rcsb.org/) a été obtenue à pH neutre en présence de son ligand naturel, la neurotensine. Le domaine VPS10 se divise en trois domaines; la partieN-terminale (résidus 45-576 de la sortiline) forme une structure hélicoïdale formée de dix sous-structures organisées en feuillets β au centre de laquelle la partieC-terminale de la neurotensine se lie, suivie de deux petits domaines appelés 10CCa et 10CCb (résidus 577-633 et 634-716 de la sortiline, respectivement). Ces deux domaines constituent le module 10CC contenant peu de structures secondaires et interagissant fortement avec la structure hélicoïdale. Dans ses fonctions de tri intracellulaire, la sortiline s’expose à des variations de pH entre les différents compartiments subcellulaires, en particulier dans les endosomes tardifs, où l’acidité de ces derniers permet la libération des ligands associés à leurs récepteurs. La structure cristalline du domaine VPS10 à pH acide (5,5) révèle une distorsion globale de la structure hélicoïdale suivie d’une homodimérisation de la sortiline bloquant dès lors l’accès aux ligands.

La partie intracellulaire de la sortiline contient une homologie de séquence avec le domaineC-terminal des Récepteurs au Mannose-6-Phosphate (M6PR), en particulier celui indépendant des cations ou Cation Independent Mannose-6-Phosphate Receptor (CI-M6PR). En effet, les séquencesC-terminales du CI-M6PR et de la sortiline partagent huit acides aminés (DDSDEDLL) communs. Cet octapeptide comprend deux sites fonctionnels; le site de phosphorylation par la caséine kinase II (résidu sérine) et un motif dileucine (LL). Ces deux sites représentent les motifs fonctionnels essentiels des M6PR pour leurs trafics entre les compartiments golgiens et les endosomes tardifs. Bien que le site de phosphorylation par la caséine kinase II soit essentiel pour le recrutement de la protéine adaptatrice 1 (AP-1) nécessaire à la formation des vésicules trans-golgiennes, le motif dileucine est impliqué dans les mécanismes de tri ultérieurs. Des mutations générées au sein de l’octapeptide altèrent l’interaction de la CI-M6PR avec le domaine VHS des protéines Golgi-associated, gamma adaptin ear containing, ADP ribosylation factor binding proteins (GGAs). Du fait que les GGAs lient la clathrine nécessaire aux transports spécifiques, ces mutations bloquent la sortie des CI-M6PR du golgi. De plus, ces mêmes mutations modifient le tri des CI-M6PR, des compartiments de recyclage endocytaires (CRE) aux autres organites intracellulaires pendant leurs transports rétrogrades sans pour autant modifier leurs taux d'internalisation à partir de la membrane plasmique. Par conséquent, ce motif représente un signal de tri / d'internalisation actif qui dirige les récepteurs à différents niveaux de leur trafic intracellulaire. Au-delà du motif di-leucine (résidus 829 et 830 de la protéine), la sortiline contient au moins deux autres signaux de tri ; le tétrapeptide YSVL et le motif FLVHRY (respectivement aux positions 792-795 et 787-792 de la sortiline) immédiatement adjacents au domaine transmembranaire. Le tétrapeptide YSVL respecte un motif consensus YXXZ, où Z représente un résidu hydrophobe volumineux ou aromatique. Cette séquence est impliquée dans l'internalisation et le tri rapide de protéines membranaires telles que LRP (Lipoprotein receptor-related protein), les protéines membranaires du réseau trans-Golgien 38/41 (TGN38 / 41) et des M6PR 20–22 de 46 kDa. La séquence FLVHRY constitue un autre signal de tri / internalisation selon le motif (F / Y) XXXX (F / Y) nécessaire au trafic des récepteurs M6PR et de ceux de la famille LRP.

La sortiline, notamment la sortiline humaine est connue pour ses différents rôles dans la maladie d'Alzheimer, la maladie de Parkinson et le diabète. Elle est également impliquée dans les effets de la neurotensine sur la croissance de cellules cancéreuses d’origine prostatique, pancréatique ou colonique (Dal Farra C. et al. Int J Cancer, 2001 ; 92, 503-9) et possède des fonctions importantes dans le contrôle du métabolisme des lipoprotéines (Current Opinion in Lipidology, 2011 , 22(2), 79–85).

Les adénocarcinomes bronchiques représentent la plus grande proportion (~80 %) des cancers du poumon non à petites cellules (CBNPC) qui demeurent la principale cause de décès par cancer en France et dans le monde. Les CBNPC appartiennent aux cancers les plus difficiles à traiter avec une survie sans progression limitée en comparaison aux cancers du sein et du colon qui partagent des caractéristiques cliniques communes. Face à ce constat, des efforts intenses ont été déployés pour améliorer nos connaissances sur les mécanismes facilitant l'initiation et la progression des CBNPC. Dès lors, les études moléculaires révèlent que ces derniers ont le taux le plus élevé de « charges » mutationnelles sur les récepteurs à activité tyrosine kinase (RTK), tel que le récepteur au facteur de croissance épidermique (EGFR), qui demeure l’archétype des RTK. Des mutations somatiques dans son domaine tyrosine kinase (TK) génèrent une forme constitutivement active du récepteur, indépendamment de la fixation de ses ligands, et activent de manière aberrante les voies de signalisations associées à la prolifération cellulaire. Dès lors, une "addiction cellulaire" s’instaure, plaçant les mutations activatrices de l’EGFR comme principaux facteurs oncogéniques.

De manière surprenante, il n’existe aucune différence entre la fréquence ou le type de mutation entre les CBNPC précoces ou avancés. Ainsi, d’un point de vue thérapeutique, ces mutations offrent l’opportunité de cibler précisément l’EGFR et d’orienter les stratégies cliniques vers des thérapies dites « personnalisées », comme les inhibiteurs d’activité tyrosine kinase (ITK). Les ITK limitent à la fois l'intensité et la durée des signalisations prolifératives de l'EGFR, diminuant ainsi l'agressivité des tumeurs et la progression de la maladie chez les patients. L’insertion des ITK dans les protocoles cliniques augmente la survie globale des patients, cependant, celle-ci reste toujours inférieure à 15% à 5 ans. En effet, les avantages cliniques des ITK chutent inévitablement indépendamment du stade de la maladie. Pour principale raison, une mutation secondaire se produit dans l'exon 20 de l’EGFR (T790M) inhibant la fixation des inhibiteurs, réactivant ainsi son activité kinase et la progression tumorale. Cependant, une question cruciale demeure quant à l’apparition ou la préexistence de cette mutation dite de « résistance acquise ».

L’EGFR posséderait des fonctions autres que la transduction d'un signal à la surface cellulaire, notamment un rôle de facteur de transcription (dans le noyau des cellules) qui induirait l'expression de gènes mitogéniques et de résistance aux thérapies. Le programme transcriptionnel de l'EGFR favoriserait une résistance aux ITK. Ainsi, le récepteur EGFR, indépendamment de son activité kinase, favoriserait l’échappement thérapeutique.

Dans des travaux précédents (Al-Akhrass H.et al., Nat. Commun. (2017); 8(1):1182), les inventeurs ont mis en évidence un rôle inédit de la sortiline, protéine appartenant à la famille VPS10, sur la régulation et la stabilité de l’EGFR. Ils ont montré que la sortiline intervient activement dans l’internalisation et la dégradation de l'EGFR. L’inhibition de la sortiline conduit à l’accumulation de l’EGFR sous un état hyperactivé, forçant les cellules tumorales à proliférer et survivre.

Des études histopathologiques et moléculaires menées par les inventeurs sur une cohorte de 72 patients atteints d’un adénocarcinome bronchique ont révélé une répression croissante de la sortiline avec les grades pathologiques de la maladie. En effet, l’expression de la sortiline est intimement liée à une meilleure survie des patients. Son expression demeure forte dans des tumeurs faiblement actives (peu proliférantes) et différenciées. En d’autres termes, l’expression de la sortiline est de bon pronostic dans les adénocarcinomes et particulièrement dans le cas de tumeurs présentant une forte expression de l’EGFR (Al Akhrass H. Thèse de doctorat « Un rôle inédit de la sortiline dans le contrôle du transport rétrograde de l’EGFR pour limiter la croissance tumorale.» https://www.theses.fr/204476984).

Les inventeurs ont également montré que, dans des tumeurs présentant une mutation sensibilisant l’EGFR aux ITK, la sortiline est fortement exprimée. A l’inverse, dans des tumeurs présentant la mutation T790M, insensibilisant l’EGFR aux ITK, l’expression de la sortiline est faible. La surexpression de la sortiline dans un modèle cellulaire exprimant l’EGFR muté T790M, réverse le phénotype résistant de ces cellules et "re-sensibilise" ces dernières aux ITK (Al Akhrass H. Thèse de doctorat déjà citée).

Les inventeurs ont également montré que l’EGFR et la sortiline interagissent mutuellement au travers de leur partie extracellulaire, soit le domaine VPS10 de la sortiline avec la partie extracellulaire de l’EGFR. L’expression d’une forme tronquée de sortiline (amputée de sa partie intracellulaire, soit des acides aminés 778-831) perturbe l’internalisation de l’EGFR suggérant que la partie intracellulaire de la sortiline servirait à acheminer l’EGFR vers les compartiments de dégradation. De manière surprenante, cette partie peut être libérée au sein des cellules à la suite d’un clivage par les gamma-sécrétases, et plus précisément par la préséniline 1 (PSEN1). Ce mécanisme cellulaire n’est pas propre à la sortiline et demeure commun au clivage de la partie intracellulaire de protéines connues telles que Notch et APP. Les peptides relatifs à ces deux protéines sont biologiquement actifs et possèdent des fonctions nucléaires. Les travaux de recherche des inventeurs ont permis de caractériser et d'isoler, à partir de la sortiline, un polypeptide possédant une activité biologique intracellulaire. Des analyses réalisées directement sur des fragments tumoraux de patients, ont révélé que l'expression de l’EGFR est inversement corrélée à celle dudit polypeptide nommé SICD (Sortilin IntraCellular Domain) et suggèrent que le polypeptide SICD pourrait jouer un rôle sur la dégradation et/ou l’expression de l’EGFR.

Ainsi il existe un besoin de disposer de nouveaux composés pour le traitement d'états pathologiques liés à une dérégulation de la sortiline.

Il existe également un besoin de disposer d'outils pour le pronostic d'états pathologiques impliquant la sortiline et notamment une altération de son expression voire de son activité biologique.

La présente invention a pour but de satisfaire ces besoins.

Selon un premier aspect, l’invention a pour objet un polypeptide isolé dérivé de la sortiline et correspondant à sa partieC-terminale. L’invention a également pour objet la séquence nucléotidique codant pour le polypeptide selon l’invention, des vecteurs d'expression comprenant ladite séquence nucléotidique et des cellules hôtes transformées par lesdits vecteurs d'expression.

Selon un second aspect, l’invention a pour objet une composition pharmaceutique comprenant ledit polypeptide ou la séquence nucléotidique correspondante.

Selon un troisième aspect, l’invention a pour objet un médicament contenant le polypeptide ou la séquence nucléotidique correspondante ou la composition pharmaceutique pour son utilisation dans le traitement d’une maladie liée à une dérégulation de la sortiline.

Enfin selon un quatrième aspect, l’invention a pour objet l’utilisation du polypeptide comme marqueur ou comme agent de pronostic d’au moins une pathologie liée à une dérégulation de la sortiline, notamment les cancers, en particulier les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, en particulier la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer, les maladies coronariennes et l’athérosclérose.

La présente invention a pour objet un polypeptide isolé dérivé de la sortiline comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO 2 à la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d’identité avec ladite séquence SEQ ID NO 3.

Conformément à l’invention, un ou plusieurs acides aminés du polypeptide peuvent être remplacés par un acide aminé non naturel ou un analogue naturel ou non naturel d'acide aminé à condition que la structure tridimensionnelle du polypeptide soit respectée. Outre les 20 acides aminés naturels (Ala, Arg, Asn, Asn, Asp, Cys, Gln, Glu, Gly, Gly, His, Ile, Leu, Lys, Met, Phe, Pro, Ser, Thr, Trp, Tyr et Val), il en existe d’autres, naturels ou non qui sont décrits par exemple, par Hunt S. (The Non-Protein Amino Acids : In Chemistry and Biochemistry of the Amino Acids, Barrett, Chapman et Hall, 1985). Ainsi un acide aminé aromatique comme la phénylalanine peut être remplacé par la 3,4-dihydroxy-L-phénylalanine, la 3-iodo-L-tyrosine, la triiodothyronine, la L-thyroxine, la phénylglycine (Phg) ou la nor-tyrosine (norTyr). Phg et norTyr et d'autres acides aminés, y compris Phe et Tyr, peuvent être substitués par, par exemple, un halogène, un groupe -CH3, -OH, -CH2NH3, - C(O)H, -CH2CH3, - CN, -CH2CH2CH3, -SH ou un autre groupe. Tout acide aminé peut être substitué par la forme D de l'acide aminé.

En ce qui concerne les acides aminés non naturels ou les analogues d'acides aminés naturels et non naturels, un certain nombre de substitutions sont possibles, seules ou en association. L’homme du métier, à la lumière de ses connaissances générales, pourra faire de telles substitutions. Ainsi, à titre d’exemple, les résidus de glutamine (Glu) peuvent être substitués par la gamma-hydroxy-Glu ou la gamma-carboxy-Glu. Les résidus de tyrosine peuvent être substitués par un acide aminé alpha substitué tel que la L-alpha-méthylphénylalanine ou par des analogues tels que : 3-Amino-Tyr ; Tyr(CH3) ; Tyr(PO3(CH3)2) ; Tyr(SO3H) ; beta-Cyclohexyl-Ala ; beta-(1-Cyclopentenyl)-Ala ; beta- Cyclopentyl-Ala ; beta-Cyclopropyl-Ala ; beta-Quinolyl-Ala ; beta-(2-Thiazolyl)-Ala ; bêta-(Triazole-1-yl)-Ala ; bêta-(2-Pyridyl)-Ala ; bêta-(3-Pyridyl)-Ala ; Amino-Phe ; Fluoro-Phe ; Cyclohexyl-Gly ; tBu-Gly ; beta-(3-benzothienyl)-Ala ; beta-(2-thienyl)-Ala ; 5-Methyl-Trp et A-Methyl-Trp. Les résidus de proline peuvent être substitués par de l'homopro (acide L-pipécolique) ; hydroxy-Pro ; 3,4-Dehydro-Pro ; 4-fluoro-Pro ; ou alpha-méthyl-Pro ; ou un N(alpha)-C(alpha) cyclized aminoacides analogues avec la structure : n = 0, 1, 2, 3. Les résidus Alanine peuvent être substitués par un acide aminé alpha-substitué ou N-méthylé comme l'acide alpha-amino isobutyrique (aib), la L/D-alpha-éthylalanine (L/D-isovaline), la L/D-méthylvaline ou la L/D-alpha-méthylleucine ou un acide aminé non naturel tel que bêta-fluoro-Ala. L'alanine peut également être substituée par : n = 0, 1, 2, 3. Les résidus glycine peuvent être substitués par l'acide alpha-amino isobutyrique (aib) ou L/D-alpha-éthylalanine (L/D-isovaline).

Dans certains cas, un acide aminé peut être remplacé par un acide aminé non essentiel d'origine naturelle, comme la taurine.

Le terme « sortiline » désigne un polypeptide comprenant 831 acides aminés et répondant à la séquence SEQ ID NO 1 ou un polypeptide présentant au moins 80 % d’identité avec ladite séquence SEQ ID NO 1.

Conformément à l’invention, les polypeptides sont dérivés de la sortiline d’origine humaine ou animale. Ils peuvent être d’origine naturelle ou recombinante. Ils peuvent enfin être synthétiques.

Le terme « polypeptide isolé » désigne un polypeptide obtenu par une méthode connue par un homme du métier, et notamment par voie recombinante ou par synthèse chimique, ledit polypeptide étant ensuite séparé, par purification partielle ou totale, de son environnement initial. De même, le terme « acide nucléique isolé » désigne un acide nucléique obtenu par une méthode connue par un homme du métier, et notamment selon toute méthode connue du génie génétique ou par synthèse chimique, suivie d’une purification dudit acide nucléique. Un polypeptide isolé selon l’invention diffère donc d’un polypeptide naturel, mais n’est pas limité à une méthode particulière de préparation ou de synthèse. De même, un acide nucléique isolé selon l’invention diffère d’un acide aminé naturel tout en n’étant pas limité à une méthode particulière de synthèse.

De préférence, un polypeptide selon l’invention est produit par voie recombinante, selon des techniques bien connues de l’homme du métier spécialisé dans ce domaine. La production d’une protéine recombinante inclut notamment le choix de l’hôte destiné à la production, par exemple une bactérie, une cellule eucaryote de levure ou de mammifère ou un animal transgénique, et la conception d’une séquence nucléotidique synthétique adaptée à ladite production, notamment par le choix d’un vecteur de production et le choix des codons utilisés afin d’optimiser la production. Une protéine recombinante peut être produite sous la forme d’une protéine de fusion, qui associe la protéine d’intérêt à un domaine « étiquette » (ou « Tag ») destiné à permettre l’identification et/ou la purification de ladite protéine d’intérêt. La purification de la protéine d’intérêt est ensuite réalisée selon une méthode parmi les nombreux protocoles accessibles à l’homme du métier.

Dans l’expression « présente au moins 80 % d’identité avec ladite séquence », le pourcentage est purement statistique et les différences entre les deux séquences nucléotidiques ou en acides aminés peuvent être réparties au hasard et sur toute leur longueur. Le pourcentage d’identité de séquence entre deux séquences est défini après l’alignement des séquences à comparer. Quand une position dans l’une des séquences est occupée par la même base ou le même acide aminé, les molécules sont identiques à cette position. Un degré d’identité entre deux séquences est une fonction du nombre de positions identiques entre les deux séquences. Les comparaisons de séquence peuvent être effectuées en utilisant tout algorithme prévu à cet effet connu de l’homme du métier.

Selon un aspect particulier d’un polypeptide selon l’invention, la séquence en acides aminés présente au moins 80%, de préférence au moins 85%, au moins 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, au moins 99% ou 100% d’identité avec la séquence SEQ ID NO 2.

Lorsque le polypeptide selon l’invention répond à la SEQ ID NO 2, alors il correspond aux acides aminés 775-831 de la sortiline humaine. Il appartient au domaine intracellulaire de la sortiline et est appelé SICD (Sortilin IntraCellular Domain).

Selon un autre aspect particulier de l’invention, le polypeptide répondant à la SEQ ID NO 2 est lié de façon covalente à un peptide de pénétration cellulaire. Cette liaison covalente peut se faire soit à l’extrémitéN-terminale, soit à l’extrémitéC-terminale du peptide.

Conformément à l’invention, on entend par peptide de pénétration cellulaire (cell-penetrating peptide, ou CPP) des molécules qui peuvent se transloquer dans les cellules sans endommager les membranes. On peut citer à titre d’exemple les CPP cités par Borelli A.et al. (Molecules 2018, 23, 295) et celles citées par Guidotti G.et al.(Trends in Pharmacological Sciences, April 2017, 38(4)), notamment la protéine Tat du VIH-1, la penetratin, peptide issu de l’homéodomaine de la protéine antennapédia, le p28 provenant de l’azurin, le VP22 du virus Herpes Simplex (HSV-1) ou encore des peptides synthétiques comme le MAP (model ampiphatic peptide) de séquence SEQ ID NO 11). Ces peptides peuvent traverser la membrane cellulaire et atteindre le cytoplasme et/ou le noyau des cellules. Ils peuvent donc transporter dans la cellule une grande variété de molécules biologiquement actives. En outre certains de ces CPP ont une activité propre susceptible de renforcer celle de la molécule qu’il transporte.

Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, le peptide de pénétration cellulaire est la protéine Tat et le polypeptide selon l’invention présente la séquence SEQ ID NO 4 correspondant au polypeptide de séquence SEQ ID NO 2 lié de manière covalente à la protéine Tat de séquence SEQ ID NO 8. La présence de la protéine Tat du VIH-1 offre l’opportunité de traverser la barrière hémato-encéphalique et les muqueuses des bronches et de l’intestin. Dès lors, la plage d’action du peptide peut s’étendre des formes localement avancées aux métastases profondes, comme les métastases cérébrales.

L’invention a également pour objet une séquence nucléotidique isolée choisie parmi les polynucléotides suivants :

a. un polynucléotide codant pour le polypeptide selon l’invention de séquence SEQ ID NO 2 et consistant en la séquence SEQ ID NO 5,
b. un polynucléotide qui présente au moins 80 % ou plus, au moins 85 % ou plus , au moins 90 % ou plus, au moins 95 % ou plus d’homologie avec le polynucléotide de séquence SEQ ID NO 5 et
c. un polynucléotide qui est dégénéré par rapport aux polynucléotides a et b

Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, le polynucléotide répondant à la SEQ ID NO 5 est lié de façon covalente à un polynucléotide codant pour un peptide de pénétration cellulaire. Lorsque le polynucléotide code pour la protéine Tat du VIH-1 alors le polynucléotide présente la séquence SEQ ID NO 6.

L’invention a également pour objet un vecteur d’expression comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l’invention.

Conformément à l’invention, « vecteur » désigne une molécule d’acide nucléique capable de transporter une séquence nucléotidique à laquelle elle est liée, ou bien de permettre l’expression de la protéine codée par une séquence nucléotidique à laquelle elle est liée de façon opérationnelle (vecteur d’expression).

Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, le vecteur nucléotidique comprend la séquence SEQ ID NO 5 ou la séquence SEQ ID NO 6.

L’invention a également pour objet une cellule hôte comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon l’invention ou un vecteur selon l’invention. La cellule hôte peut être toute cellule communément utilisée et est notamment choisie dans le groupe comprenant les bactéries, les levures, les lignées cellulaires humaines, des cellules animales.

L’invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant un polypeptide ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable ou un polynucléotide selon l’invention ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable en association avec un excipient pharmaceutiquement acceptable. Cette composition peut aussi contenir un autre agent actif.

Conformément à l’invention, on entend par « excipient pharmaceutiquement acceptable », toute substance autre que la substance active, destinée à apporter une consistance, un goût, une couleur à un médicament, tout en évitant toute interaction avec le principe actif. L’excipient pharmaceutiquement acceptable selon l’invention sera choisi selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels qui sont connus de l'homme du métier, en vue d’être administré à l’Homme ou aux animaux.

Par « agents actifs », on entend toute substance autre que le polypeptide ou le polynucléotide selon l’invention et ayant un effet thérapeutique. On peut notamment citer à titre d’exemples les molécules chimiothérapeutiques conventionnelles (telle que le cisplatine) ou des molécules pharmacologiques inhibitrices de récepteurs à tyrosine kinase (ITK) ou de voies de signalisation utilisées en thérapie ciblée ou des anticorps inhibiteurs de récepteurs ou des voies de suppression immunitaire (check point inhibiteurs des lymphocytes-T) tels que le gefitinib, ou encore l’erlotinib. La présente liste n’étant pas limitative.

Conformément à l’invention, les compositions pharmaceutiques peuvent se présenter sous toute forme pharmaceutique adaptée à l’administration locale, régionale, systémique ou continue. On peut citer à titre d’exemple les voies d’administration suivantes : voie orale, sublinguale, sous-cutanée, parentérale, intramusculaire, intraveineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, oculaire, intrapéritonéale, par diffusion endopariétale, transdermique ou rectale, ou par toute autre voie d’administration. Les formes d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules molles ou dures, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, par inhalation, les formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, les formes d'administration rectale et les implants. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des crèmes, des émulsions huile dans l’eau ou eau dans l’huile, des gels, des pommades, des patches, des solutions ou des lotions.

L’invention a également pour objet un polypeptide ou un polynucléotide ou une composition pharmaceutique selon l’invention en tant que médicament. Conformément à l’invention, ils peuvent être utilisés tels quels ou sous forme de sel pharmaceutiquement acceptable. On peut citer à titre d’exemple les sels d'addition d'acide avec un acide organique ou inorganique comme l'acide acétique, l'acide succinique et l'acide chlorhydrique, les sels d'ammonium ou les sels de métal alcalin comme le sel de sodium ou de potassium.

Dans un mode de réalisation avantageux de l’invention, le polypeptide selon l’invention ou la composition pharmaceutique selon l’invention peuvent être utilisés en tant que médicament en association avec au moins une seconde thérapie anticancéreuse, ladite seconde thérapie anticancéreuse étant administrée avant, après ou en même temps que le polypeptide ou le polynucléotide ou la composition pharmaceutique.

Un polypeptide ou un de ses sels pharmaceutiquement acceptable selon l’invention ou un polynucléotide ou un de ses sels selon l’invention ou une composition pharmaceutique selon l’invention peuvent être utilisés dans une pathologie liée à une dérégulation de la sortiline comme par exemple, les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, les maladies coronariennes et l’athérosclérose.

On entend par « dérégulation de la sortiline » des variations de la quantité de sortiline.

L’invention a également pour objet une méthode de traitement de pathologies liées à une dérégulation de la sortiline comme par exemple les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, les maladies coronariennes et l’athérosclérose comprenant l’administration d’un polypeptide ou d’un polynucléotide ou d’un de leurs sels selon l’invention à un sujet qui en a besoin.

Un polypeptide selon l’invention peut également être utilisé comme marqueur ou comme agent de pronostic de pathologies liées à une dérégulation de la sortiline comme par exemple les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, les maladies coronariennes et l’athérosclérose.

Aussi l’invention a pour objet un procédé de pronosticin vitroouex vivod'un état pathologique lié à une dérégulation de la sortiline comme par exemple les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer, les maladies coronariennes et l’athérosclérose, comprenant une première évaluation de l’expression du polypeptide de séquence SEQ ID NO 2 présent dans un échantillon biologique obtenu dudit sujet, la comparaison de ladite première évaluation avec des évaluations de l’expression dudit polypeptide déterminées dans une population de sujets sains, où une variation de l’expression dudit polypeptide dans ledit échantillon biologique par rapport à l’expression déterminée pour des sujets sains est indicative de la présence de l'état pathologique.

Conformément à l’invention, la détection du polypeptide peut se faire par toute technique connue de l’homme du métier ; elle peut notamment directement se faire dans les tissus pathologiques des patients, tels que les tumeurs ou les biopsies ou les échantillons sanguins. Cette détection peut se faire par la technique de western-blotting, la technique associant une chromatographie d’exclusion couplée à de la spectrométrie de masse, la technique d’ELISA en condition de compétitivité, à l’aide d’anticorps spécifiques couplés ou non à un traceur enzymatique ou isotopique afin de détecter le polypeptide par imagerie.

Description des figures

Les figures 1 à 4 et les exemples 1 à 3 qui suivent illustrent l’invention :

La figure 1A représente la détection par western-blotting du peptide de synthèse de séquence SEQ ID NO 7 selon l’invention dans le milieu intracellulaire selon l’exemple 1. « SICD peptide » correspond aux concentrations croissantes en peptide de SEQ ID NO 7 (peptide SICD couplé au tag-V5 et au Tat) utilisées selon l’exemple 1. « IB : anti-V5 » quantité de peptide intracellulaire mesurée avec l’anticorps anti-V5 ; « IB : anti-SORT-ICD » quantité de peptide intracellulaire mesurée avec l’anticorps dirigée contre la partie intracellulaire de la sortiline ; « IB : anti-actine » contrôle interne.

La figure 1B représente la visualisation de ce peptide de synthèse au niveau nucléaire par immunofluorescence selon l’exemple 1. Le DAPI marque les noyaux des cellules, tandis que le tag-V5 permet de visualiser la localisation intracellulaire du peptide de synthèse. En effet, lors d’une prise d’images en deux dimensions et lorsque les deux marquages sont superposés, la répartition du V5, et donc celle du peptide de synthèse, se superpose à celle du noyau. Cette répartition est punctiforme, sous forme de spots localisés au niveau nucléaire. L’imagerie en trois dimensions permet d’apprécier la répartition de ces spots dans la profondeur des noyaux, selon l’axe z, et pas seulement sur leur surface comme le permet l’imagerie en 2D. Ainsi, comme le montre la figure 1.B, le peptide de synthèse forme des spots qui se répartissent à l’intérieur des noyaux cellulaires.

La figure 2 représente la quantification en temps réel de la fixation de l’annexine V induite par l’effet pro-apoptotique du peptide SICD couplé au tag-V5 et au Tat répondant à la séquence SEQ ID NO 7, conformément à l’exemple 3.

La figure 3 représente la quantification en temps réel de la fixation de l’annexine V induite par l’effet pro-apoptotique du peptide SICD couplé au tag-V5 et au Tat répondant à la séquence SEQ ID NO 7 conformément à l’exemple 3.

La figure 4 représente la quantification en temps réel de l’activation des caspase 3 et 7 induite par l’effet pro-apoptotique du peptide SICD couplé au tag-V5 et au Tat répondant à la séquence SEQ ID NO 7 conformément à l’exemple 3.

Descriptif des techniques utilisées

1.Cellules et culture cellulaire
La lignée embryonnaire de rein HEK293T (ATCC® CCL-1573^TM) et les lignées cellulaires d’adénocarcinome bronchique A549 (ATCC® CCL-185^TM) et H1975 (ATCC® CCL-5908^TM) proviennent de l’American Type Culture Collection (ATCC).
La lignée H3255 a été gracieusement donnée par Madame Sylvie Gazzeri (DR2 INSERM, U823, Institut Albert Bonniot, Grenoble).
Les cellules sont cultivées dans du milieu de culture DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium) + Glutamax (réf : 10566016, Gibco, ThermoFisher Scientific) complété avec 10% de sérum de veau fœtal (réf: 9215-50, H2B), 1% de pyruvate (réf : 11360070, Gibco, ThermoFisher Scientific) et 1% de Pénicilline/Streptomycine (réf : 10378016, Gibco, ThermoFisher Scientific). Le milieu de culture DMEM + Glutamax ainsi complété sera dénommé « milieu complet » dans la présente demande. Les cellules sont maintenues en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C contenant 5% de CO₂(Binder, ThermoFisher Scientific). Pour les repiquages et entretiens hebdomadaires des cellules, le milieu de culture contenant des cellules mortes et débris est retiré, le tapis cellulaire est rincé avec du PBS 1X (Phosphate Buffer Saline) (réf : 14190144, Gibco, ThermoFisher) puis les cellules sont décollées de leur support par l’ajout de Trypsine-EDTA (0,05 %) (réf : 25300054, Gibco, ThermoFisher) pendant 5 minutes en atmosphère humide dans un incubateur à 37°C contenant 5% de CO₂. Une fois décollées, les cellules sont collectées dans un tube de 15 ou 50 mL (respectivement Réf : 62554502 ; 62547254, Sarstedt) et énumérées au microscope (x40) sur une cellule de numération type « Malassez » (réf : 631-0975 ; VWR). En parallèle, la viabilité cellulaire est estimée sur la cellule de numération après coloration d’un échantillon de la suspension cellulaire dilué au quart dans une solution de bleu Trypan 0.4 % (réf : 15250061, Gibco, ThermoFisher). Les cellules sont ensuite centrifugées à 100x-g à 20°C (réf : 75004380, Sorvall, ThermoFisher) pendant 10 minutes. Le culot cellulaire ainsi obtenu est soit remis en suspension de sorte que les cellules soient à la densité appropriée pour les différentes expériences planifiées, soit stocké à sec à -80°C pour des utilisations ultérieures. Une concentration de 10.10³cellules/cm²est habituellement utilisée pour l’ensemencement de chaque sous-type cellulaire utilisé dans cette invention. Les cellules sont ensemencées dans des flacons de culture de 25 ou 75 cm²(respectivement réf : 83.3910.002 et 83.39.11.502, Sarstedt), ou encore dans des plaques de culture de 6 ou 24 puits (respectivement réf : 83.3920 et 83.3922, Sarstedt) en fonction des expériences à réaliser.

2.Conservation des cellules à long terme : Congélation-Décongélation
Les cellules en culture sont décollées, collectées et centrifugées comme décrit précédemment. Elles sont ensuite reprises en suspension dans 1 mL de Serum de Veau Fœtal (SVF) additionné de 10% d’un cryoprotecteur, le diméthylsulfoxide (DMSO) (réf : D-8418, Sigma-Aldrich) à raison de 3x10⁶cellules par cryotube (réf : 72380002, Sarstedt). Ceux-ci sont placés dans un bloc à congélation (réf : 479-0966, VWR) contenant de l’isopropanol (réf : 563935, Sigma-Aldrich) pendant 24 heures à 1 semaine pour une congélation progressive, avant d'être stockés dans un container d’azote liquide à -196°C. L’étape de décongélation doit être rapide pour obtenir une viabilité cellulaire optimale. Ainsi, aussitôt sorti de l’azote liquide, le cryotube est placé dans un bain-marie à 37°C jusqu'à décongélation complète de la suspension cellulaire. Les cellules sont reprises dans 10 mL de milieu complet et centrifugées (300x-g, 10 minutes à 25°C) afin d'éliminer le DMSO. Elles sont alors remises en culture selon les conditions préalablement décrites.

3.Extraction des protéines en condition dénaturante
L’extraction des protéines totales est réalisée directement sur les tapis cellulaires, après élimination des surnageants et rinçage des cellules en PBS 1X, ou encore sur des culots cellulaires préalablement stockés à -80°C. Elle est réalisée par incubation des cellules avec le tampon de lyse Laemmli (62.5 mM Tris-HCl réf :11814273001 ROCHE, pH 6.8, 2% SDS réf : L-4509, Sigma-Aldrich , 25% glycerol réf : G5516 , Sigma-Aldrich) additionné d’1% (v/v) de cocktail d’inhibiteurs de protéases (réf : P8340-1ML, Sigma-Aldrich) et d’1% (v/v) de cocktail d’inhibiteurs de phosphatases (réf: P0044-1ML, Sigma-Aldrich), dans les proportions 100µL de tampon pour 1.10⁶cellules pendant 30 min sur glace. Dans le cas d’extraction sur tapis cellulaire, un scrapeur (réf : 179693PK, Nunc, ThermoFisher) est utilisé pour collecter les cellules dans le tampon de lyse. La lyse est ensuite complétée par sonification paramétrée à 60 Hz, amplitude 2 s, pendant 1 minute (réf : SONIVCX-130-220, VWR). Les lysats sont ensuite centrifugés à 17 000xg (réf : 75002442, Sorvall, ThermoFisher) pendant 20 min à 4°C, le surnageant contenant les protéines est transféré dans un tube stérile de 1,5 mL (réf : 0030120086, eppendorf) et les protéines sont dosées par la méthode de Bradford.

4.Dosage protéique
La concentration protéique des divers échantillons est évaluée par la méthode de Bradford (Bradford 1976). Le test est réalisé par incubation des échantillons dilués (ou des différentes concentrations du standard d’albumine bovine (réf : 5000206, Biorad) avec les réactifs du Kit DC^TMProtein Assay Kit II (réf : 5000112, Biorad) en respectant le protocole du fournisseur. La lecture de l’absorbance est effectuée à 595 nm sur un spectrophotomètre (réf : 51119000, ThermoFisher). La concentration protéique de chaque échantillon est estimée par rapport à la droite obtenue avec la gamme de concentration de BSA (0 ; 125 ; 250 ; 500 ; 750 ; 1000 ; 1500 et 2000 µg / mL). Une fois les concentrations des échantillons déterminées par cette méthode, le volume de protéines nécessaire est prélevé puis équilibré en fonction de chaque échantillon, généralement 20 µL. Ces derniers sont complétés respectivement avec 0.01% de bleu de bromophenol et 5% de β-mercaptoethanol avant d’être dénaturés à 95°C pendant 5 minutes.

5.Electrophorèse des protéines en gel de polyacrylamide (SDS-PAGE)
Les protéines sont séparées sur un gel d’électrophorèse SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate PolyAcrilamide Gel, système miniprotean de Biorad). La concentration des gels de polyacrylamide varie de 8 à 15 % en fonction du poids moléculaire des protéines à séparer et analyser. Tous les gels de séparation sont invariablement précédés d’un gel de concentration 4 % selon le tableau 1 ci-dessous.

Pour 10mL	Gel de séparation (en mL)	Gel de concentration (en mL)
	8%		12%	15%
Eau distillée	5,3	4,3	3	7,25
40 % Acrylamide	2	3	3,75	1,25
1,5M Tris (pH : 8,8)	2,5	2,5	2,5
1M Tris (pH : 6,8)				1,25
10 % SDS	0,1	0,1	0,1	0,05
10 % APS	0,1	0,1	0,1	0,1
TEMED	0,006	0,006	0,006	0,01

Tableau 1 : Composition des gels de séparation et de concentration.

La migration s’effectue pendant 1h30 (150 V) dans le tampon de migration 1X (réf : 1610732, Biorad). Un marqueur de poids moléculaire est utilisé à chaque migration (réf : 26619 PageRulerTM Plus Prestained Protein Ladder, Fermantas life Science). Une fois séparées par électrophorèse, les protéines sont transférées sur une membrane de PVDF (Polyvinylidène difluoride) (réf : 10600023). Millipore). La membrane est préalablement incubée 15 secondes dans du méthanol avant d’être rincée à l’eau puis équilibrée quelques minutes dans le tampon de transfert (réf : 161-0771, Biorad). Le gel de polyacrylamide est également équilibré quelques minutes dans le tampon de transfert avant d’être mis en contact avec la membrane. Le transfert s’effectue pendant 1 h à 20V avec un appareil Transblotting ID Dryer (Biorad), selon un montage faisant intervenir des papiers whatmann. La membrane de PVDF et le gel sont compris entre 2 x 4 papiers Whatmann préalablement imbibés de tampon de transfert (figure 1). Les qualités du dépôt, de la migration et du transfert sont vérifiées par une coloration de la membrane PVDF au Rouge Ponceau (0.2% Ponceau S réf : P3504-50G, Sigma-Aldrich ; 3% TCA réf : T8657-250G, Sigma-Aldrich) pendant quelques secondes avant d’être lavé 3 fois 5 min avec du Tert-butyldiméthylsilyle (TBS).

6.Incubation des membranes avec l’anticorps
Les membranes sont ensuite incubées pendant 1h à température ambiante dans du TBS 1X contenant 0,1 % de Tween-20 (réf : P1379 et 5% de lait écrémé (Régilait), pour saturer les sites de fixation non spécifiques. L’immuno-marquage est réalisé par incubation avec l’anticorps primaire, dirigé contre les épitopes spécifiques des protéines d’intérêt et selon les conditions décrites dans le tableau 2. Après trois lavages dans du tampon TBS 1X-Tween 20 (0,1%), les membranes sont incubées pendant 1h à température ambiante avec l’anticorps secondaire adéquat couplé à la peroxydase (tableau 3) (dilution au 1/1000^èmedans la solution de saturation). Les membranes sont ensuite lavées deux fois avec du TBS 1X-Tween 20 (0,1%), puis 2 fois avec du TBS 1X seul pour retirer le Tween-20 en excès.

Anticorps	Clones	Espèces	Sociétés	Dilution	Temps d’Incubation	Solution d’Incubation	Réf.	PM kDa
				WB 1	IF 2	WB			IF	WB	IF
β-actine	-	Lapin	Ozyme	1/1000	-	2-12h	-	a-b	-	4970	45
Sortiline		lapin	Abcam	1/1000	1/200	12h	12h	b	b	Ab16640	95
Anti-V5	2F11F7	souris	Invitrogen, ThermoFisher	1/5000	1/200	12h	12h	b	b	37-7500	5

Tableau 2 : Anticorps primaires utilisés en western blotting

-: non utilisable, NC : non communiqué, (a): TBS 1X Tween 0.1%, Lait 5%, (b) : TBS 1X-Tween 0.1%, BSA 3%, (c) : TBS 1X, BSA 5%, (d): TBS 1X, BSA 3%, WB : western blotting, IF : immunofluorescence.

Anticorps secondaires	Hôte	Fournisseur	Dilution
Anti-IgG de souris HRP	Lapin	Dako	1/1000
Anti-IgG de Lapin HRP	Porc	Dako	1/1000

Tableau 3 : Anticorps secondaires utilisés en western blotting. HRP :HorseradishPeroxydase

7.Révélation par réaction de chimioluminescence
La révélation du western-blotting est effectuée par chimioluminescence. Ce système repose sur l’oxydation du luminol par l’O₂, produit par l’action de la peroxydase sur l’H₂O₂. Il se forme un composé intermédiaire instable qui émet de la lumière. La membrane est mise en contact pendant 1 minute avec le mélange du kit « ECL » (réf : WBULS0500, Millipore) dans les proportions 1:1. La chimioluminescence est collectée par le système numérique G box (Ozyme). Les images numériques obtenues à partir des révélations des western-blotting sont traitées à l’aide des logiciels d’analyse d’images Genesnap (Syngene) et ImageJ (NIH).

8.Immunofluorescence indirecte
Les cellules sont ensemencées en plaque 24 puits sur des lamelles de verre de 14 mm de diamètre. Après chaque condition de traitement, les cellules sont fixées soit avec du milieu complet contenant du paraformaldéhyde (PFA) à 3,7% pendant 20 min à 4°C, soit avec du méthanol à -20° C pendant 5 min. Avec le méthanol la fixation s'effectue par déshydratation (dénaturation des protéines) alors qu'avec les aldéhydes (formaldéhyde) on conserve la structure 3D de la protéine (fixation par pontage). Les phosphorylations sont analysées après fixation au PFA. Après fixation, le tapis cellulaire est lavé 3 fois 5 min avec 500 µL de PBS. Dans le cas d’une fixation au PFA, les cellules sont perméabilisées au triton X-100 à 0.1% dans du PBS pendant 10 min à 4°C, puis lavées de nouveau. La fixation au méthanol confère quant à elle l’avantage de fixer et de perméabiliser les cellules en même temps. La saturation des sites non spécifiques est effectuée avec du PBS-sérum 1% (de même origine que l’animal dont est issu l’anticorps secondaire) ou en PBS-BSA 5 %, pendant 1 h à température ambiante. A partir de l’étape de fixation, toutes les solutions sont préalablement filtrées sur filtre de 0,2 µm pour éliminer les artefacts de fluorescence et le bruit de fond. L’anticorps primaire dirigé contre la protéine d’intérêt, c’est-à-dire le tag-V5 (permettant la visualisation du peptide synthétique)) est incubé une nuit à 4°C dans une solution de PBS contenant 3 % de BSA (tableau 2). Puis, trois lavages de 5 min en PBS sont effectués, avant l’incubation de l’anticorps secondaire couplé à un Alexa fluor 488® (Fluorescence verte) (tableau 4) pendant 1 h à température ambiante dans la solution de PBS-BSA. Après trois lavages de 5 min en PBS, les noyaux sont marqués par une solution de PBS 1X contenant le fluorochrome DAPI à 1 µM pendant 5 min. A l’issue de cette étape, les cellules sont de nouveau rincées par trois lavages de 5 min en PBS. Les lamelles sont ensuite placées sur des lames porte-objet à l’aide du milieu de montage aqueux Aequous Mounting Medium (Dako) et placées une nuit à 4°C. Les préparations sont visualisées par un microscope confocal de type LSM 880 (Zeiss) équipé de laser Helium/Néon et argon (grossissement 63X ou 100X). Les images sont traitées avec le logiciel Zen (Zeiss) ou Image J (NIH).

Anticorps secondaires	Hôte	Fournisseur	Dilution
Anti IgG de souris Alexa Fluor 488	Chèvre	Invitrogen	1/1000

Tableau 4 : Anticorps secondaires utilisés en Immunofluorescence.

9.Analyse de la mort cellulaire par imagerie en temps réelle via le système IncuCyteZOOM®
Afin d’étudier la mort cellulaire par apoptose, les cellules sont ensemencées à une concentration de 2000 cellules par puits dans 100 µL de milieu de culture, dans des plaques 96 puits. 24 heures plus tard, le milieu des cellules est retiré, puis les cellules sont rincées une fois avec du PBS 1X stérile avant d’ajouter le milieu de culture contenant les différents traitements, dont le peptide selon l’invention à 600nM, et les réactifs nécessaires à l’analyse de la mort cellulaire. Ces derniers sont : IncuCyte® Caspase-3/7 Green Reagent (réf : 4440 ; Essenbio) dilué au 1:1000 dans le milieu de culture; IncuCyte® Annexin V Green Reagent (réf : 4642 ; Essenbio) dilué au 1:200 dilué dans le milieu de culture. L’acquisition des images se fait ensuite en positionnant les plaques dans le système IncuCyte ZOOM® (Réf : EssenBio) pendant 96 heures. Quatre images par puits sont alors obtenues, en haute définition, toutes les deux heures, avec l’objectif x10 et les canaux en contraste de phase et en vert. Ces acquisitions se font automatiquement et de manière non-invasive. Les données sont traitées automatiquement via le logiciel IncuCyte Live-Cell Analysis System ZOOM (réf : Essenbio).

Exemple 1 : Test de pénétration cellulaire par western-blotting et immunofluorescence

Il est réalisé selon la technique décrite précédemment. Le peptide synthétique de séquence SEQ ID NO 2 (SICD ou Sortilin IntraCellular Domain) est rendu compétant à pénétrer les cellules par ajout d’une séquence Tat (Trans Activator of Transcription, SEQ ID NO 8 appartenant à la famille des peptides pénétrant cellulaires du virus de l’immunodéficience humaine (VIH). Par ailleurs une étiquette V5 (SEQ ID NO 10), épitope connu pour une mise en évidence facile via un anticorps spécifique ou une molécule fluorescente est greffé sur le peptide, conduisant alors au peptide synthétique de séquence SEQ ID NO 7. Les cellules sont traitées avec une gamme de concentration du peptide SICD couplé au tag-V5 et au Tat de séquence SEQ ID NO 7, allant de 0 à 500 nM dilué dans du milieu de culture complet. A l’issue de 24 heures de traitement, les cellules sont lysées et le peptide est mis en évidence dans le lysat cellulaire (milieu intra-cellulaire) avec un anticorps anti-V5. Suite aux différentes étapes de western-blotting, une augmentation croissante de la quantité de peptide intra-cellulaire est mise en évidence avec un maximum à la concentration la plus élevé (500 nM) suggérant ainsi une pénétration du peptide dose dépendante, comme illustré à la figure 1.A ligne IB : anti-V5. L’actine sert de contrôle interne de dépôt démontrant qu’une quantité identique de protéine a été déposée dans chaque piste protéique présentée (Figure 1.A ligne IB : anti-actine). Un profil similaire est obtenu en utilisant un anticorps dirigé contre la partie intracellulaire de la sortiline (Figure 1.A ligne IB : anti-SORT ICD). Ces résultats confirment d’une part que le peptide est bien internalisé par les cellules, et d’autre part qu’il s’agit bien d’un peptide dérivé de la partie intracellulaire de la sortiline.

La répartition subcellulaire du peptide de synthèse a été visualisée par immunofluorescence (Figure 1.B). Les images montrent une répartition punctiforme nucléaire du peptide synthétique de séquence SEQ ID NO 7 en utilisant un anticorps dirigé contre le tag V5. Cette répartition est également confirmée en utilisant le peptide de séquence SEQ ID NO 7 et un anticorps anti-sortiline. La superposition des marquages (DAPI, marquant le noyau des cellules et V5 marquant le peptide de synthèse) confirme la présence spécifique du peptide dans le noyau des cellules. Les images prises en 3D viennent confirmer cette localisation à l’intérieur des noyaux, et non en surface de ces derniers. La présence du peptide synthétique dans ce compartiment cellulaire atteste de son action au niveau nucléaire.

Exemple 2 : Mesure de l’effet antitumoral par mesure de la survie cellulaire

L’effet anti-tumoral du peptide synthétique, comprenant le Tat et un tag V5 de séquence SEQ ID NO 7, a été testé sur la lignée cellulaire A549 (lignée d'adénocarcinome ne présentant pas de mutation sur l'EGFR). Une gamme de concentration (0 à 10 µM) du peptide synthétique de séquence SEQ ID NO 7 selon l’invention a été incubée pendant 24, 48 et 72h dans le milieu des cellules et l'activité déshydrogénase de celles-ci (assimilée à une viabilité) a été mesurée (Cell Proliferation Kit II (XTT) – Roche) à la fin de chaque incubation, soit à 24, 48 et 72 h. Les résultats sont donnés dans la figure 2. L'analyse du graphique représentant l'activité en fonction du log de la concentration du peptide synthétique a permis d'établir des valeurs de CI₅₀correspondant aux concentrations pour lesquelles le peptide entraîne 50% d'inhibition de l'activité cellulaire. Celles-ci sont respectivement égales à 1,42 ; 1,52 et 0,57 µM pour les temps d'incubation de 24 ; 48 et 72h.

Exemple 3 : Mesure de l’effet pro-apoptotique du peptide synthétique

L'effet pro-apoptotique du peptide de séquence SEQ NO 7 à la concentration de 1 µM a été mesuré en temps réel via le système IncuCyteZOOM® pendant 96 heures sur la lignée A549, sur des fibroblastes humains (cellules non-cancéreuses), ainsi que sur deux lignées d’adénocarcinomes H3255 et H1975, présentant respectivement des mutations de l’EGFR sensibles (L858R) et résistantes (L858R/T790M) aux ITK (Inhibiteurs de récepteurs à activité Tyrosine Kinase) utilisées en clinique au travers de l'activation de deux marqueurs de l'apoptose à savoir l'annexine V et les caspases 3 et 7. Les résultats montrent que le peptide ne semble pas entraîner d’activation des deux marqueurs de l’apoptose dans la culture de fibroblastes humains (annexine V figure 3 et caspases 3 et 7 figure 4). En effet, les niveaux d’expression de ces marqueurs sont identiques dans les conditions traitées avec le peptide et les conditions contrôles. Le peptide pourrait donc présenter une toxicité spécifique aux cellules cancéreuses.

En revanche, on observe, sur les trois lignées d’adénocarcinomes testées, une augmentation du processus apoptotique dans les cellules au cours du temps. En effet, les niveaux d’expression de l’annexine V (figure 3) ou des caspases 3 et 7 (figure 4) augmentent dans les trois lignées d’adénocarcinomes testées, reflétant un mécanisme d'action du peptide par rapport à son effet anti-tumoral.

A la différence des molécules disponibles en chimiothérapie conventionnelle, le peptide synthétique selon l’invention résulte d’un assemblage d’acides aminés pour former un peptide naturellement présent dans nos cellules et non de molécules chimiques. Dès lors, une meilleure tolérance par l’organisme est envisagée. Du fait de la facilité de sa synthèse à des coûts raisonnables et de sa cible intra-cellulaire particulière différente de celles des ITKs le peptide selon l’invention pourrait être un bon candidat pour une utilisation en bithérapie. Il permettrait dans ce cas, de diminuer les doses administrées d'anti-tumoraux conventionnels, et de diminuer le coût thérapeutique associé à ces derniers

Claims (14)

1. Polypeptide isolé dérivé de la sortiline humaine comprenant ou consistant en une séquence en acides aminés présentant au moins 80% d’identité avec la séquence SEQ ID NO 2
   Val Leu Ile Val Lys Lys Tyr Val Cys Gly Gly Arg Phe Leu Val His Arg Tyr Ser Val Leu Gln Gln His Ala Glu Ala Asn Gly Val Asp Gly Val Asp Ala Leu Asp Thr Ala Ser His Thr Asn Lys Ser Gly Tyr His Asp Asp Ser Asp Glu Asp Leu Leu Glu
   à la condition que ledit polypeptide ne contienne pas la séquence SEQ ID NO 3 ou une séquence présentant au moins 80 % d’identité avec la dite séquence SEQ ID NO 3.
2. Polypeptide selon la revendication 1, caractérisé en ce que ledit peptide est lié de façon covalente à un peptide de pénétration cellulaire.
3. Polypeptide selon la revendication 2 caractérisé en ce que ledit peptide de pénétration cellulaire est choisi dans le groupe comprenant Tat du VIH-1, la penetratin, peptide issu de l’homéodomaine de la protéine antennapédia, le p28 provenant de l’azurin, le VP22 du virus Herpès Simplex (HSV-1) ou le peptids synthétique MAP de séquence SEQ ID NO 11.
4. Séquence nucléotidique isolée choisie parmi les polynucléotides suivants :
   a. un polynucléotide codant pour le polypeptide selon la revendication 1 de séquence SEQ ID NO 2 et consistant en la séquence SEQ ID NO 5
   b. un polynucléotide qui présente au moins 80 %, au moins 85 %, au moins 90 %, au moins 95 % d’homologie avec le polynucléotide de séquence SEQ ID NO 5 et
   c. un polynucléotide qui est dégénéré par rapport aux polynucléotides a et b.
5. Vecteur d’expression comprenant un polynucléotide selon la revendication 4.
6. Cellule hôte comprenant un polynucléotide codant pour un polypeptide selon la revendication 4 ou un vecteur selon la revendication 5.
7. Composition pharmaceutique comprenant un polypeptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou un polynucléotide selon la revendication 4 ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptables en association avec au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
8. Composition selon la revendication 7 comprenant en outre un autre agent actif choisi parmi des molécules chimiothérapeutiques, des inhibiteurs des récepteurs à tyrosine kinase, des inhibiteurs des voies de signalisation utilisées en thérapie ciblées, des anticorps spécifiques de récepteurs oncogéniques ou de check-point inhibiteurs des lymphocytes T.
9. Polypeptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 ou polynucléotide selon la revendication 4 ou un de leurs sels pharmaceutiquement acceptable ou composition pharmaceutique selon l’une quelconque des revendications 7 ou 8 pour son utilisation en tant que médicament.
10. Polypeptide pour son utilisation en tant que médicament selon la revendication 9 dans le traitement d’une pathologie liée à une dérégulation de la sortiline choisie dans le groupe comprenant les cancers, notamment les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, notamment la maladie de Parkinson, la maladie d’Alzheimer, les maladies coronariennes et l’athérosclérose.
11. Polypeptide pour son utilisation en tant que médicament selon la revendication 10 caractérisé en ce que la pathologie liée à une dérégulation de la sortiline est choisie parmi les cancers, notamment des cancers du poumon non à petites cellules.
12. Polypeptide pour son utilisation en tant que médicament selon l’une quelconque des revendications 10 et 11, caractérisé en ce qu’il se présente sous une forme pharmaceutique adaptée à une administration locale, régionale, systémique ou continue.
13. Polypeptide en association avec au moins une seconde molécules, choisie parmi des molécules chimiothérapeutiques, des inhibiteurs des récepteurs à tyrosine kinase, des inhibiteurs des voies de signalisation utilisées en thérapie ciblées, des anticorps spécifiques de récepteurs oncogéniques ou de check-point inhibiteurs des lymphocytes T ? pour son utilisation en tant que médicament selon l’une quelconque des revendications 10 et 11.
14. Polypeptide selon l’une quelconque des revendications 1 à 3 pour son utilisation comme marqueur de pathologies liées à une dérégulation de la sortiline, notamment les cancers, en particulier les cancers du poumon non à petites cellules, les troubles neurologiques, en particulier la maladie de Parkinson et la maladie d’Alzheimer, les maladies coronariennes et l’athérosclérose