COMPOSITION COMPRENANT UNE CONCENTRATION ELEVEE
EN LIPOPEPTIDES ITURINIQUES
L'invention a trait à des compositions présentant une concentration élevée en lipopeptides ituriniques. En particulier, les compositions selon l'invention présentent une concentration en lipopeptides ituriniques comprise entre 5 et 200 g/L, et sont stables et homogènes grâce à la présence de tensioactifs et/ou de molécules hydrotropes.
Les lipopeptides ituriniques sont des molécules produites par différentes souches de Bacillus sp. et plus particulièrement les souches de Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus thermocloacae, Bacillus firmus, Bacillus mojavensis, Bacillus velenzensis, Bacillus valissmortis. On citera en exemple et de manière non exhaustive, les souches Bacillus subtilis ATCC6633, W23, ATCC19659, DSM23117, QST713 ou AQ713, FMBJ, 3-10, RB14 , BH072 et leurs dérivées, les souches Bacillus amyloliquefaciens FZB42, KB3, SYBC H47, GAI et leurs dérivés.
Cette famille de molécules comprend l'iturine A, AL et C, la mojavensine, la mycosubtilline et les bacillomycines A, B, C, D, F, L et Le. Ces composants sont connus essentiellement pour leur pouvoir antifongique mais ils présentent également des propriétés antibactériennes. Ces propriétés proviennent de leur nature amphiphile qui leur permet d'interagir avec différents constituants membranaires.
Les molécules ituriniques peuvent être produites en solution dans le bouillon de fermentation par les différentes souches mentionnées ci-dessus, puis elles peuvent être récupérées selon des méthodes connues de l'homme du métier afin de les extraire, de les concentrer et de les purifier à partir d'un surnageant de culture. Néanmoins, leur comportement en solution est dépendant de leur concentration. En effet, il est connu qu'au-dessus de la concentration micellaire critique (située entre 10 et 20 mg/L), les composés ituriniques comme les autres molécules de types lipopeptides forment des micelles plus ou moins complexes. Par ailleurs, la taille de ces micelles va évoluer pour former des structures de plus en plus complexes quand on augmente leur concentration, passant d'une taille moyenne de 10 nm à des concentrations en dessous de 500 mg/L (Jauregi et al., 2013), à des structures vésiculaires d'un diamètre moyen de 150 nm au- dessus d'1 g/L (Grau et al. 2001), puis à des superstructures de type bicouche lamellaire à une concentration de 10 g/L (Hamley et al., 2013). Comme le révèlent ces travaux sur la mycosubtiline (Hamley et al., 2013) ou sur l'iturine A (Grau et al. 2001), ces superstructures ne sont pas retrouvées chez les autres molécules lipopeptidiques de la famille des surfactines par exemple. Par ailleurs l'augmentation de la concentration en composés ituriniques tant à augmenter leur interaction avec les protéines contenues dans
le milieu de culture et ainsi à augmenter la taille des structures conduisant à les rendre insolubles (Jauregi et al. 2013) .
Ces propriétés physico-chimiques des composés ituriniques posent donc des problèmes de solubilité, donnant lieu à des compositions instables et ayant tendance à précipiter ou à gélifier lorsque l'on augmente la concentration en iipopeptides ituriniques des compositions.
État de la technique le plus proche de l'invention .
L'art antérieur présente peu de compositions ayant une concentration en Iipopeptides ituriniques supérieure à 5g/L et encore moins ayant une concentration supérieure à 20g/L, principalement car il est connu de l'homme du métier que les iipopeptides ituriniques tendent à former des miceiies à haute concentration, rendant les compositions instables du fait des miceiies d'iturine empêchant leur bonne solubilité. On connaît cependant dans l'art antérieur le brevet JP2003 128512 (SHOWA DENKO) qui présente des compositions cosmétiques, comprenant des tensio-actifs, dans lesquelles sont ajoutées de i'iturine et de la surfactine pour leurs propriétés antimicrobiennes, mais la stabilité et l'homogénéité de I'iturine dans ces compositions ne sont pas évoquées, celles-ci n'étant pas le composé principal des différentes compositions.
On connaît également le brevet US 2016/183537 qui décrit une composition issue de Bacillus amyioiiquefaciens contenant de I'iturine, de la surfactine et de la fengycine pour améliorer la croissance des plantes ou protéger les plantes. Ce document ne mentionne pas les concentrations des molécules contenues dans cette composition, il n'est pas fait mention de concentrations en iturine élevées.
On connaît aussi la publication de Choukri HBID et. ai. décrivant l'influence d'extraits de Iipopeptides sur le transfert d'oxygène lors de la fermentation. Ces extraits correspondant à un mélange iturine/surfactine à des concentrations allant jusqu'à 4 g/L la possibilité d'une concentration d'iturine plus élevée n'est pas décrite dans le document.
Ainsi, aucun des documents de l'art antérieur n'incite l'homme du métier à réaliser des compositions à concentration élevée en Iipopeptides ituriniques, car il sait que celles-ci ne seront pas stables et homogènes et donc n'auront que peu d'applications.
Problèmes résolus par la présente invention
Les inventeurs ont montré qu'il est possible de préparer une composition stable et homogène dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 5g/L grâce à l'ajout de molécules ayant des propriétés tensioactives. En effet, les inventeurs ont mis en évidence que les agents tensioactifs permettent d'améliorer la solubilisation des lipopeptides ituriniques au-delà de 5g/L, en particulier à 10 g/L et à 20g/L et jusqu'à 50, 100 voire 200 g/L sans apparition de précipité ou de gel.
La présente invention trouve notamment des applications dans la production de solutions concentrées de molécules biopesticides antifongiques, antibactériennes ou biosurfactants pour l'industrie phytosanitaire, mais également dans les domaines des industries alimentaire, cosmétique, pharmaceutique et pétrolière.
DESCRIPTION DETAILLEE DE L'INVENTION
Le concept général de l'invention concerne une composition liquide stable et homogène comprenant un mélange de lipopeptides dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 5 g/L.
Dans une telle composition, les lipopeptides sont associés à des molécules ayant des propriétés tensioactives, grâce auxquelles la composition concentrée en lipopeptides ituriniques reste stable et homogène.
Un premier objet de l'invention concerne une composition stable et homogène comprenant une concentration en lipopeptides ituriniques supérieure à 20g/L et un ou plusieurs tensio- actifs choisis parmi les familles des tensio-actifs anioniques, des tensio-actifs non ioniques ou des huiles.
Par composition « stable et homogène », on entend une composition qui ne comprend pas de précipité, et qui reste homogène à des températures comprises entre 4°C et 40°C. L'absence de prise en masse est également un critère important, c'est-à-dire que la solution est liquide et non sous forme gélifiée. Le terme liquide se comprend au sens de l'invention comme une composition fluide c'est- à-dire une composition dont la viscosité (le rapport entre la contrainte de cisaillement et la vitesse de cisaillement) est faible.
Le terme homogène se comprend comme un mélange dont on ne peut distinguer les différents constituants à l'oeil nu après agitation. L'homogénéité peut s'apprécier à l'uniformité des concentrations en tout point du mélange et à l'absence de structures ou micro-structures (prise de masse ou précipité) visible à l'oeil.
Une telle homogénéité du mélange est avantageuse car elle permet des concentrations uniformes en lipopeptides ituriniques, qui peuvent être diluée ensuite en solution aqueuse
Le terme stable se comprend comme le fait que la composition reste homogène dans le temps. Ainsi, un mélange stable et homogène est un mélange ayant une concentration uniforme qui reste constante dans le temps.
Selon un mode de réalisation préféré, la composition selon l'invention comprend entre 20 et 200 g/L de lipopeptides ituriniques. Elle peut comprendre par exemple 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 ou 200 g/L de lipopeptides ituriniques. De manière préférée la concentration en lipopeptides ituriniques de la composition est comprise entre 20 et 150 g/L, ou entre 20 et 100 g/L. De manière encore plus préférée, la concentration en lipopeptides ituriniques de la composition est supérieure à 50 g/L, c'est-à-dire comprise par exemple entre 50 et 150 g/L, ou entre 50 et 100 g/L ou entre 50 et 80 g/L. Par « molécules de la famille des iturines », on entend l'iturine A, AL et C, la mojavensine, la mycosubtiline et les bacillomycines A, B, C, D, F, L et Le.
Les compositions de la présente invention comprennent des molécules ayant des propriétés tensioactives.
Par « molécules ayant des propriétés tensioactives », aussi appelées « agents tensioactifs » ou plus simplement « tensioactifs », on entend notamment les molécules amphiphiles, les surfactants, les lipopeptides, comme par exemple, la surfactine, la fengycine (ou plipastatine), les tensioactifs chimiques et les tensioactifs biologiques, comme par exemple les rhamnolipides, les polysaccharides, etc.... Ces molécules peuvent être utilisées seules ou en association dans les compositions de l'invention.
Parmi les agents tensioactifs, on peut citer l'héparine, l'acide hyaluronique, le dextrane, l'amylose, le chitosane, des tensioactifs anioniques dérivés d'acides aminés, des tensioactifs non-ioniques dérivés des poly-glycosides, des tensio-actifs hydrotropes, des lipopeptides tels que les isomères de surfactine et/ou les isomères de fengycine (ou plipastatine), les rhamnolipides et les huiles végétales.
Plus particulièrement l'invention concerne les tensio-actifs anioniques, non ioniques et des huiles. Les tensioactifs de la famille des tensio-actifs anioniques sont choisis parmi : les surfactines, les fengycines, ou des dérivés d'acide aminés.
Par surfactine on entend toute molécule de la « famille des surfactines », à savoir les surfactines A, B, C, la lichenysine et la pumilacidine.
Par fengycine on entend toute molécules de la « famille des fengycines », on entend les fengycines A et B, les plipastatines A et B et l'agrastatine.
Les tensioactifs de la famille des tensio-actifs non ioniques sont choisis parmi : les fatty alcohol axalkylate, le pentylène glycol et ses dérivés, les molécules hydrotropes de type alkylpolyglycoside (alkypolyglycoside et alkylethoxypolyglycoside, les molécules de type agent de texture polyglycoside (gomme de xanthane, gomme arabique, gomme adragante, gomme guar, gomme de caroube, gomme de tamarin, pectine, gomme gellane, carraghénates, agar-agar, alginates.)
Les tensioactifs de la famille des huiles sont choisis parmi : les huiles et extraits d'huiles modifiés (acifidiés, méthylés, esterifiés) notamment issus de : amande, arachide, argan, avocat, colza, lorenzo, neem, noisette, noix de cajou, noix de macadamia, olive, pistache, riz, tournesol oléique, cameline, lin, bourrache, carthame, chanvre, coton, germe de blé, mais, noix, oeillette, onagre, orge, pépins de courge, pépins de raisin, pois, sésame, soja, tournesol. Les lipopeptides ituriniques seront micro-émulsionnés dans ces composés huileux ou corps gras afin d'obtenir l'effet tensioactif des huiles et extraits d'huiles modifiés.
Les compositions de l'invention peuvent, en outre, contenir des adjuvants tels que des sources lipidiques, des sels et des solvants. Ces adjuvants peuvent participer à la solubilisation sans pour autant être des tensioactifs. A titre d'exemple de solvants, on peut citer l'éthanol, le méthanol, l'acétonitrile, le dimethyl sulfoxide, le butanol, le pentanol, l'acétone.
Selon un premier aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 50 g/L de lipopeptides ituriniques et entre 1 et 40 g/L de surfactine.
Dans une composition particulière, les lipopeptides ituriniques sont des mycosubtilines. Dans une autre composition particulière, la quantité de lipopeptides ituriniques est de préférence comprise entre 10 g/L et 50g/L, préférentiellement entre 20 et 50 g/L, de manière encore préférée entre 30 et 50 g/L.
Selon un second aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 100 g/L de lipopeptides ituriniques, entre 1 et 40 g/1 de surfactine et entre 1 et 100 g/1 de fengycine (ou plipastatine,).
Dans une composition particulière, la quantité de lipopeptides ituriniques est de préférence comprise entre 10 et 80 g/L, préférentiellement entre 20 et 80 g/L, de manière la plus préférée entre 30 et 80 g/L.
Selon un troisième aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 100 g/L de lipopeptides ituriniques, entre 1 et 40 g/1 de surfactine et entre 1 et 30 g/1 de tensioactifs chimiques.
Dans une composition particulière, la quantité de lipopeptides ituriniques est de préférence comprise entre 10 et 80 g/L, préférentiellement entre 20 et 80 g/L, de manière préférée entre 30 et 80 g/L. Dans un mode de réalisation particulier, les tensioactifs chimiques peuvent être des tensioactifs non ioniques de la famille des polyglycosides ou des tensioactifs anioniques dérivés d'acides aminés. De manière préférée, les tensioactifs chimiques consistent en un mélange de tensioactifs anioniques et de tensioactifs non ioniques. Selon un quatrième aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 100 g/L de lipopeptides ituriniques, entre 1 et 40 g/1 de surfactine, entre 1 et 100 g/1 de de fengycine (ou plipastatine) et entre 1 et 30 g/1 de tensioactifs chimiques.
Dans une composition particulière, la quantité de lipopeptides ituriniques est de préférence comprise entre 10 et 80 g/L, préférentiellement entre 20 et 80 g/L, de manière préférée entre 30 et 80 g/L.
Selon un cinquième aspect, l'invention concerne une composition comprenant entre 5 et 100 g/L de lipopeptides ituriniques micro-émulsionnée dans des composés huileux ou corps gras, comme par exemple de l'huile végétale. Dans une telle composition, la concentration en huile est comprise entre 1% et 100%, de préférence entre 50% et 100%, de manière particulièrement préférée entre 80% et 100%. Parmi les huiles végétales qui peuvent être utilisées, on peut citer l'huile de maïs, mais aussi les huiles et extraits d'huile modifiés d'amande, arachide, argan, avocat, colza, lorenzo, neem, noisette, noix de cajou, noix de macadamia, olive, pistache, riz, tournesol oléique, cameline, lin, bourrache, carthame, chanvre, coton, germe de blé, mais, noix, oeillette, onagre, orge, pépins de courge, pépins de raisin, pois, sésame, soja, et tournesol.
Préférentiellement les huiles utilisées sont issues de l'arachide, de l'olive, du tournesol oléique, du lin, du maïs, des noix, du soja et du tournesol. De telles huiles présentent
l'avantage d'être disponibles en grandes quantités et d'avoir un faible coût. De manière encore plus préférée, l'huile utilisée est issue de l'arachide du maïs ou du tournesol.
Dans un mode de réalisation préféré, une telle composition comprend entre 10 et 80 g/L, préférentiellement entre 20 et 80 g/L de mycosubtiline, de manière préférée entre 30 et 80g/L et de manière tout à fait préférée entre 50 et 80 g/L de mycosubtiline.
Ainsi, une composition particulière selon l'invention comprend :
2 à 8 % de lipopeptides ituriniques
- 3 % de tensioactifs chimiques constitués d'un mélange de tensioactifs non-ioniques et anioniques à hauteur de 1,5 % chacun
2 à 4 % de surfactines
0 à 10% de fengycines ou de plipastatines Dans un mode de réalisation particulier, la composition comprend environ 3% de lipopeptides (1,25% de mycosubtiline et 1,85% de surfactine), 1,5% d'un tensioactif non- ionique dérivé des poly-glycosides et 1,5% d'un tensio-actif anionique dérivé d'acides aminés. Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprend environ 5% de lipopeptides (2,45% de mycosubtiline et 2,65% de surfactine) et 3 à 8% de fengycine (ou de plipastatine).
Dans un autre mode de réalisation particulier, la composition comprend entre 30 et 80 g/L de mycosubtiline et 30 à 80g/L de fengycine (ou de plipastatine).
Dans un mode de réalisation particulier la composition comprend une concentration en lipopeptides ituriniques est comprise entre 20 et 100g/l et les tensioactifs sont un extrait d'huile végétale, des dérivés de polyglycosides et de la surfactine. Dans un autre mode de réalisation particulier la composition comprend une concentration en lipopeptides ituriniques est comprise entre 20 et 100g/l et les tensioactifs sont un extrait d'huile de graine végétale méthylée et du polyglycérol ester d'huile de coco (Synergen OS™).
Dans un autre mode de réalisation particulier la composition comprend une concentration en lipopeptides ituriniques est comprise entre 20 et 100g/l et les tensioactifs sont un
mélange d'alkylpolyglucoside (Simulsol™) de dérivé d'acide aminé (Protéol™) et de surfactine.
Dans un autre mode de réalisation particulier la composition comprend une concentration en lipopeptides ituriniques est comprise entre 20 et 100g/l et les tensioactifs sont un mélange de fatty alcohol oxalkylate (Emulsogen™) et de surfactine.
Dans un autre mode de réalisation particulier la composition comprend une concentration en lipopeptides ituriniques est comprise entre 20 et 100g/l et les tensioactifs sont un mélange d'huile végétale, de gomme de xanthane et de surfactine.
Les compositions selon l'invention peuvent être prêtes à l'emploi ou sous forme concentrée ; les solutions concentrées peuvent être diluées avant emploi. Un deuxième objet selon l'invention concerne une composition déshydratée comprenant un mélange de lipopeptides dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 0,5%. Dans un mode de réalisation préféré, la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 2%.
De telles compositions déshydratées se présentent sous forme de poudre ou de lyophilisât et sont « prêtes à l'emploi » ; en effet, il suffit de les réhydrater dans 100 ml_ de solution pour obtenir une composition dont la concentration en lipopeptides ituriniques est au minimum de 5 g/L. Dans un mode de réalisation préféré, de telles compositions ont une concentration en lipopeptides ituriniques au minimum de 20g/L.
Les ingrédients et leurs quantités relatives dans ces compositions solides sont les mêmes que celles décrites ci-dessus pour les compositions liquides. En effet, les concentrations en poids sec des différents composants de ces solutions déshydratées permettent d'obtenir des compositions liquides dont la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 5 g/L qui sont stables et homogènes conformément à l'invention. Dans un mode de réalisation préféré la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 20g/L.
Un troisième objet de l'invention concerne un procédé de préparation d'une composition comprenant un mélange de lipopeptides dans laquelle la concentration en lipopeptides ituriniques est supérieure à 5 g/L. Dans un mode de réalisation préféré, la concentration en lipopeptides ituriniques dans le mélange est de 20g/L.
Les lipopeptides ituriniques de la composition peuvent être obtenus par fermentation d'une souche de Bacillus sp. et récoltés et concentrés depuis le surnageant de culture.
Les compositions selon l'invention peuvent être préparées en utilisant des préparations de lipopeptides disponibles dans le commerce sous forme de poudre. Ces poudres de départ contiennent une quantité de lipopeptides ituriniques variable pouvant aller de 10 à plus de 80%, par exemple 15% ou 75%. Ces poudres peuvent contenir un mélange de mycosubtiline et de surfactine dans un rapport de 30/70 à 70/30, voire de 95/5, par exemple de 35/65, de 40/60, de 45/55 ou de 50/50.
Pour préparer une composition selon l'invention, il faut ajouter au moins un tensioactif à une solution contenant une teneur élevée en lipopeptides ituriniques.
Le procédé de préparation de telles compositions peut comporter une étape supplémentaire de déshydratation de sorte à proposer une composition « prête à l'emploi » sous forme de poudre, dont les caractéristiques sont conformes aux compositions de la présente invention une fois réhydratée.
Ainsi le procédé permet de préparer des solutions liquides ou solides (sous forme de poudre ou de lyophilisât). De telles solutions concentrées sont particulièrement adaptées pour le stockage et la distribution. Elles sont à diluer avant utilisation. De ce fait, une composition selon l'invention peut être obtenue par dissolution d'une poudre permettant la reconstitution d'une composition liquide telle que définie précédemment.
Les compostions selon l'invention trouvent leurs applications dans le domaine de l'agroalimentaire, des phytosanitaires et de la cosmétique ainsi que dans le domaine médical et pharmaceutique.
L'invention est illustrée à l'aide des exemples qui suivent.
EXEMPLES
A. Préparation de solutions contenant des lipopeptides à partir de surnageant de cultures de souches Bacillus 1 - Obtention des surnageants de culture
Les lipopeptides sont obtenus à partir d'un procédé de fermentation aérobie d'une souche Bacillus dérivée de la souche Bacillus subtilis ATCC 6633 pour la production de lipopeptides
ituriniques et de souches dérivées de la souche de Bacillus subtilis 168 pour la production de surfactine et/ou de fengycine (ou de plipastatine). La culture est réalisée dans un milieu contenant une source de carbone (glucose, saccharose...), une source d'azote (sulfate d'ammonium, peptone, acides aminés libres, extrait de levures,...) et des oligoéléments et des sels sous agitation à 30°C. Le pH est maintenu à une valeur de 7. La culture est récoltée après 48 à 72h. Elle est ensuite centrifugée ou filtrée pour éliminer les cellules. Le surnageant de culture est ensuite concentré.
2 - Préparation de compositions à teneur élevée en lipopeptides ituriniques à partir de surnageants de culture
Pour obtenir des compositions à teneur élevée en lipopeptides ituriniques, les surnageants de culture peuvent être concentrés. La concentration du surnageant de culture peut être obtenue par toute méthode connue de l'homme du métier, en particulier :
- Par ultrafiltration tangentielle en utilisant une membrane dont le seuil de coupure peut être de lKDa à 300 KDa. Pour exemple, 1000L de surnageant de culture obtenu comme décrit précédemment sont concentrés par passage sur la membrane d'ultrafiltration pour obtenir un retentât d'un volume de 10 à 100L. Les petites molécules sont ensuite éliminées par une ou des étapes de diafiltration. La solution ainsi obtenue peut être séchée par lyophilisation, atomisation ou utilisée telle quelle.
Par précipitation à pH acide : une diminution du pH dans le but de précipiter sélectivement les lipopeptides est réalisée. Une addition d'acide sulfurique concentré est réalisée sur le surnageant obtenu. Après l'obtention d'un pH final aux alentours de 1, la solution est laissée sous agitation de 2 à 12h. Une centrifugation permet de récupérer un culot de matière contenant les lipopeptides. Ce culot est ensuite dissout par addition d'eau et de soude afin d'obtenir une valeur de pH comprise entre 7 et 8,5. La solution ainsi obtenue peut être séchée par lyophilisation, atomisation ou utilisée telle quelle.
- Par évaporation : le surnageant est concentré par évaporation sous vide. Par exemple 20L sont introduits dans un rotavapor et concentrés à 1 à 2L.
Le pourcentage de lipopeptides obtenu à l'issue de ces deux exemples de préparation est de l'ordre de 0,5 à 20% (poids/volume). B- Préparation de compositions concentrées en lipopeptides ituriniques
1 - Etude de l'effet de différents tensioactifs sur la solubilité d'un lipopeptide iturinique et dans une composition à haute concentration
Un lipopeptide iturinique (ici la mycosubtiline), ayant une pureté (sur matière sèche) comprise entre 45% et 80%, a été solubilisée seule dans l'eau à différente concentration et cette composition témoin a été comparée à différentes compositions dans lesquelles ont été ajoutés différents composés tensioactifs comme décrit dans la demande. Après 15 jours de stockage à 21°C, seules les compositions ayant un comportement rhéologique de type fluide et un aspect homogène (ne présentant pas de prise en masse empêchant un écoulement et/ou de déphasage et/ou de précipité) sont sélectionnées, mélangées par agitation, puis ces compositions sont centrifugées pendant 10 minutes à 10 000 g et le surnageant est analysé par la méthode de référence en RP-HPLC. Cette méthode permet de vérifier la solubilité des composés ituriniques qui se retrouvent alors dans le surnageant après centrifugation.
La solubilité du lipopeptide iturinique (ici la mycosubtiline) seul dans une solution aqueuse en fonction de sa concentration est présentée dans la Figure 1.
La concentration maximale de lipopeptides ituriniques soluble dans les différentes compositions est présentée en Figure 2.
Aucun tensioactif n'est ajouté dans la composition 1 qui ne contient que des lipopeptides ituriniques. Les tensioactifs ajoutés dans les compositions 2 à 13 sont :
-des fengycines à 10% (composition 2)
- des alkylpolyglucoside et des dérivés d'acide aminé (Simulsol™/Protéo M) à raison de 10% chacun (composition 3)
-de la lécithine de soja à (4%) et des dérivés de poly-glycosides (0,1%) (Elvis™/Xanthane Gum) (composition 4)
- d'extrait d'huile de graine végétale méthylée et de polyglycerol ester issu d'huile de coco (de 0,2%) (Synergen OS™) (composition 5)
- de tensioactif non ionique de type fatty alcool oxalkylate (0,2%)(Emulsogen™) (composition 6)
- de tensioactif non ionique de type pentylène glycol (50%) (composition 7)
-de dérivés des poly-glycosides à 0.4% (AlkylEthoxyGlycoside = AEG) (composition 8) -des surfactines à 4% (composition 9)
- des surfactines à 4% et des fengycines à 10% (composition 10)
- d'extrait d'huile végétale (30%) et des dérivés des poly-glycosides (0,1%) et de la surfactine (4%) (Huile de maïs/Xanthane Gum/Surfactine) (composition 11)
- des alkylpolyglucoside et des dérivés d'acide aminé (Simulsol™/Protéo M) à raison de 10% chacun et de la surfactine à 4% (composition 12)
- de tensioactif non ionique de type fatty alcool oxalkylate à 0,2%(Emulsogen™) et de la surfactine à 4% (composition 13)
Analyse des résultats
La figure 1 présente la solubilité des lipopeptides ituriniques (ici la mycosubtiline) en solution aqueuse à température ambiante en fonction de leur concentration
Dans la figure 1, il peut être observé que la mycosubtiline seule se solubilise très bien dans une solution aqueuse à une concentration maximale de 2 g/L, mais au-delà de cette concentration (par exemple entre 5 et 25 g/L) un précipité qui décante peut être observé et seule une petite partie reste soluble.
La figure 2 présente l'analyse de la solubilité de différentes compositions comprenant un lipopeptide iturinique (ici la mycosubtiline) et différents composés permettant d'obtenir des concentrations élevées et solubles en lipopeptide iturinique après 15 jours de stockage à température ambiante. La mesure est faite sur le surnageant après une étape de centrifugation permettant d'éliminer les insolubles
Dans la figure 2, il peut être observé que l'ajout de différents tensioactifs permet d'augmenter de façon significative la solubilité de la mycosubtiline, en particulier avec des composés anioniques seul ou en mélange avec des tensioactifs non-ioniques. La présence de fengycine ou de surfactine permet d'obtenir une solubilité de la mycosubtiline proche de 30 g/L. De façon surprenante et originale la combinaison de ces deux composés lipopeptides anioniques permet d'atteindre une solubilité du composé iturinique encore supérieure. On notera également que l'utilisation de certains tensioactifs malgré une composition homogène et stable ne permet pas d'obtenir une solubilisation au-dessus de 20 g/L. C'est le cas de la lécithine de soja couplée à la gomme de Xanthane (max= l,5g/L), le cas du composé non ionique Emulsogen™ (Clariant) (max= 11,6 g/L) mais également des composés non ionique Simulsol™ et anionique Protéol™ (Ceppic) (max= 15,3 g/L). Il a été remarqué pour ces compositions la présence d'un précipité important après l'étape de centrifugation. En revanche quand ces compositions sont complétées par un autre composé lipopeptidique anionique comme la surfactine la solubilité de la mycosubtiline augmente alors pour atteindre des valeurs entre 55 et 120 g/L. D'autres composés non ioniques tels que le penthylène glycol et l'alkylethoxyglycoside permettent également d'obtenir une solubilité supérieure à 30 g/L. La composition permettant un maximum de solubilité du composé iturinique (112 g/L) est celle contenant un lipopeptide anionique (surfactine) et un tensioactif non ionique (Emulsogen™).
2 - Préparation de compositions à teneur élevée en lipopeptides ituriniques à partir de poudres de lipopeptides Une composition à teneur élevée en lipopeptides ituriniques peut être préparée à partir de poudre de lipopeptides, comme illustré dans les deux exemples de compositions ci-après : Composition 1 : Une composition comprenant environ 3,1% (m/v) de lipopeptides (soit 1,25% de mycosubtiline et 1,85% de surfactine) a été obtenue en resuspendant une poudre de lipopeptides comprenant un mélange mycosubtiline/surfactine en proportions 40/60 et d'une pureté environ égale à 15% en phase aqueuse (pH compris entre 7,5 et 8,5).
Composition 2 : Une composition comprenant environ 5,1% (m/v) de lipopeptides (soit 2,45% de mycosubtiline et 2,65% de surfactine) a été obtenue en resuspendant une poudre de lipopeptides comprenant un mélange mycosubtiline/surfactine en proportions 45/55 et d'une pureté environ égale à 75 % en phase aqueuse (pH compris entre 7,5 et 8,5).
3 - Préparation de compositions à teneur élevée en lipopeptides ituriniques comprenant des tensioactifs.
Des tensioactifs ont été ajoutés aux compositions 1 et 2 décrites précédemment de sorte à évaluer l'effet de telles molécules sur les propriétés des compositions.
Composition 1A : Deux tensioactifs ont été ajoutés à la composition 1 chacun dans une proportion de 10% (v/v), à savoir un tensioactif hydrotrope non-ionique dérivé des poly- glycosides (Nom commercial = Simulsol™ SL 7C commercialisé par la société Seppic) et un tensio-actif anionique dérivé d'acides aminés (Nom commercial = Proteol™ APL commercialisé par la société Seppic).
Composition 2A : 3 à 8% (m/v) de fengycine (ou de plipastatine) ont été ajoutés à la composition 2.
4 - Caractérisation des compositions obtenues : homogénéité et stabilité dans le temps.
Essai de stabilité à température ambiante
L'aspect des compositions avec et sans tensioactifs a été étudié à température ambiante,
ici à environ 21°C.
Composition 1 : L'ajout des deux tensioactifs a permis d'obtenir une composition homogène (composition 1A) et d'éviter tout phénomène de précipitation ou de sédimentation. La composition 1A contenant des tensioactifs présente un aspect trouble mais homogène.
Composition 2 : L'ajout de fengycine (ou de plipastatine) a permis d'obtenir une composition homogène et éviter tout phénomène de prise en masse (qui a lieu en absence de fengycine ou de plipastatine). La composition 2A avec fengycine (ou de plipastatine) présente un aspect limpide et homogène. b. Essais de stabilité à basse température
Des solutions lipopeptidiques concentrées (Compositions 1, 2 et 1A, 2A) ont été placées à 4°C pour une période de 1 à 30 jours. Seules les solutions complémentées en tensioactifs ou en fengycine (ou de plipastatine) (à savoir 1A et 2A) sont restées homogènes et aucun dépôt n'a été observé. Sans ces ajouts, les solutions lipopeptidiques concentrées sont susceptibles de prendre en masse ou de présenter un dépôt insoluble important.
5 - Caractérisation de la rhéologie des compositions obtenues : impact de la conservation à température ambiante et d'un vieillissement accéléré
a. Méthodes d'analyses
Les 2 compositions décrites précédemment (1 et 2) et celles contenant des adjuvants (1A et 2A) ont été conservées pendant 15 jours à 21°C et pendant 15 jours à 54°C (afin de simuler un vieillissement accéléré). La conservation des compositions à à température élevée (54°C) est une méthode connue de l'homme du métier, qui permet de mimer un vieillissement accéléré des compositions en augmentant le mouvement brownien, accélérant la déstabilisation des compositions.
A l'issue de ces périodes la rhéologie des compostions a été étudiée en utilisant un rhéomètre compact modulaire Anton PAAR MCR102. La méthode a consisté au suivi de la vitesse de cisaillement lorsque la contrainte de cisaillement augmentait progressivement entre 1 et 100 Pa (durée du test de 500 s). La viscosité (le rapport entre la contrainte de cisaillement et la vitesse de cisaillement) a été aussi exprimée en fonction de la contrainte de cisaillement. Cela permettait de visualiser l'évolution de la viscosité au cours du test. Ces essais ont été réalisés à partir de trilplicat d'échantillons.
Deux paramètres rhéologiques ont été étudiés sur ces compositions après stockage à 21°C ou à 54°C à savoir :
La viscosité minimale (Pa.s)
La contrainte de cisaillement à la viscosité maximale (Pa) b. Résultats
L'ensemble des échantillons ont montré des comportements de fluides non- newtoniens (la viscosité n'a pas été constante au cours des tests). Avec l'augmentation de la contrainte de cisaillement la viscosité diminuait en se rapprochant à une viscosité minimale. La diminution de la viscosité avec l'agitation peut être expliquée par un alignement progressif des unités structurelles (ou molécules) dans le sens de l'écoulement au fur et à mesure que la vitesse de cisaillement augmente, favorisant ainsi l'écoulement des différentes couches de liquides. Les fluides sont alors qualifiés de rhéfluidifiants et peuvent être caractérisés par leurs viscosités minimales (dans le cas des tests appliqués il s'agissait de la viscosité à la fin du test) et par la contrainte de cisaillement à la viscosité maximale (Pa).
Etude de la viscosité minimale
La figure 3 présente l'analyse de la viscosité minimale des différentes compositions ituriniques concentrées sans ou avec ajouts de tensioactifs et autres adjuvants (A), après stockage à 21°C ou à 54°C
Les résultats présentés dans la figure 3 montrent que la viscosité minimale de la composition 1A après stockage à 21°C est significativement différente et inférieure à la celle de la composition non formulée (1). Pas de différence significative est observée entre les compostions 2 et 2A après stockage à 21°C. Néanmoins, lors du test de vieillissement à 54°C la viscosité minimale de la composition 2 a très nettement augmenté alors que celle de la composition 2A est restée proche de 0. Ceci montre l'effet très important de l'ajout de fengycine (plipastatine) dans cette dernière pour faciliter la solubilité des lipopeptides ituriniques. On notera un effet similaire entre la composition 1 et 1A après stockage à 54°C, montrant l'intérêt de la formulation de la composition 1A.
Etude de la contrainte cisaillement à la viscosité maximale
La figure 4 présente l'analyse de la contrainte de cisaillement à la viscosité maximale des différentes compositions lipopeptidiques concentrées sans ou avec ajouts de tensioactifs et autres adjuvants (A), après stockage à 21°C ou à 54°C.
Les résultats présentés dans la figure 4 montrent que les contraintes de cisaillement à la viscosité maximale après stockage 15 jours à 21°C de la composition 1A est inférieure
à celles obtenues avec la composition non formulée 1. Pas de différence significative n'est observée entre les compositions 2 et 2A. Néanmoins lorsque l'on étudie l'impact d'un vieillissement accéléré à 54°C sur ce paramètre les résultats de la figure 4 montrent que la contrainte de cisaillement augmente très fortement dans les compostions non formulées 1 et 2, alors que celles des compositions formulées (1A et 2A) sont restées quasiment identiques à celles obtenues à 21°C. Ces résultats montrent l'impact très positif des formulations selon l'invention pour faciliter la solubilisation dans le temps et à haute concentration des composées ituriniques. En conclusion de ces études, il peut être établi que :
La composition 1A permet de solubiliser les composés ituriniques évitant la formation de précipité et/ou de gel et ceci est caractérisé par une diminution significative de la viscosité minimale et de la contrainte cisaillement à la viscosité maximale que ce soit après un stockage à 21°C ou de façon encore plus importante lors de son vieillissement. Les compositions 1 et 1A sont apparentées à des fluides non newtoniens de type Casson
La composition 2A permet de solubiliser les composés ituriniques évitant la formation de précipité et/ou de gel à l'issu d'une période de conservation longue et ceci est caractérisé par une diminution significative de la viscosité minimale et de la contrainte cisaillement à la viscosité maximale après un stockage à 54°C. Les compositions 2 et 2A sont apparentées à des fluides non newtoniens de type rhéofluidifiant au départ, mais la composition 2 non formulée devient très épaisse lors du vieillissement.