RU2801578C1 - Композиция, имеющая высокую концентрацию итуриновых липопептидов - Google Patents

Abstract

Группа изобретений относится к биопестицидной композиции, содержащей итуриновые липопептиды в концентрации от более 100 г/л до 200 г/л и одно или более поверхностно-активных веществ, где итуриновые липопептиды выбраны из группы, состоящей из итурина A, AL и С, можавенсина, микосубтилина, бацилломицинов A, B, C, D, F, L и Lc и их любой комбинации, и где поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из сурфактина, фенгицина и производного полигкликозида, также относится к способу приготовления композиции, включающему этапы приготовления раствора с высоким содержанием итуриновых липопептидов и добавления поверхностно-активных веществ, и также относится к применению композиции в агропищевых, фитосанитарных или косметических задачах. Группа изобретений обеспечивает стабильную и гомогенную комбинацию липопептидов с высоким содержанием итурина. 4 н. и 6 з.п. ф-лы, 4 ил.

Description

Изобретение относится к композициям с высокой концентрацией итуриновых липопептидов. В частности, композиции согласно изобретению имеют концентрацию итуриновых липопептидов между 5 и 200 г/л и являются стабильными и однородными благодаря наличию поверхностно-активных веществ и/или гидротропных молекул.

Итуриновые липопептиды представляют собой молекулы, вырабатываемые различными штаммами Bacillus sp. и, более конкретно, штаммами Bacillus subtilis, Bacillus amyloliquefaciens, Bacillus megaterium, Bacillus thermoamylovorans, Bacillus thermocloacae, Bacillus firmus, Bacillus mojavensis, Bacillus velenzensis, Bacillus valissmortis. Неисчерпывающие примеры включают штаммы Bacillus subtilis ATCC6633, W23, ATCC19659, DSM23117, QST713 или AQ713, FMBJ, 3-10, RB14, BH072 и их производные, штаммы Bacillus amyloliquefaciens FZB42, KB3, SYBC Н47, GA1 и их производные.

Это семейство молекул включает итурин A, AL и С, можавенсин, микосубтилин и бацилломицины А, В, С, С, D, F, L и Lc. Эти компоненты в основном известны своими противогрибковыми свойствами, однако они также обладают антибактериальными свойствами. Эти свойства являются следствием их амфифильной природы, что позволяет им взаимодействовать с различными компонентами мембраны.

Итуриновые молекулы могут быть выработаны в растворе в ферментантивном бульоне различными штаммами, указанными выше, затем они могут быть извлечены согласно способам, известным специалисту в данной области техники, для их экстракции, концентрирования и очистки от супернатанта культуры. Тем не менее, их поведение в растворе зависит от их концентрации. Действительно, известно, что выше критической мицеллярной концентрации (между 10 и 20 мг/л) итуриновые соединения, как и другие липопептидные молекулы, образуют более или менее сложные мицеллы. Кроме того, размер этих мицелл будет развиваться для образования все более сложных структур по мере увеличения их концентрации от среднего размера 10 нм до концентраций ниже 500 мг/л (Jauregi et al., 2013) до везикулярных структур со средним диаметром 150 нм выше 1 г/л (Grau et al. 2001), а затем до чешуйчатых двухслойных суперструктур при концентрации 10 г/л (Hamley et al., 2013). Как раскрыто в этих исследованиях микосубтилина (Hamley et al., 2013) или итурина A (Grau et al. 2001), эти суперструктуры не найдены, наример, в других липопептидных молекулах семейства сурфактина. Кроме того, увеличение концентрации итуриновых соединений имеет тенденцию к увеличению их взаимодействия с белками, содержащимися в культуральной среде, и, следовательно, к увеличению размера структур, приводя к их нерастворимости (Jauregi et al. 2013).

Поэтому эти физико-химические свойства итуриновых соединений приводят к проблемам растворимости, давая нестабильные композиции, которые имеют тенденцию к осаждению или гелеобразованию, когда концентрация итуриновых липопептидов в композициях повышена.

Уровень техники изобретения

Уровень техники относится к некоторым композициям с концентрацией итуриновых липопептидов выше 5 г/л и даже меньше с концентрацией выше 20 г/л, в основном ввиду того, что специалисту в данной области техники известно, что итуриновые липопептиды имеют тенденцию к образованию мицелл высокой концентрации, делая композиции нестабильными ввиду того, что итуриновые мицеллы предотвращают их хорошую растворимость.

Однако из уровня техники известен патент 3Р2003 128512 (SHOWA DENKO) на косметические композиции, включающие поверхностно-активные вещества, к которым добавлены итурин и сурфактин ввиду их противобикробных свойств, однако стабильность и однородность итурина в этих композициях не указаны, поскольку они не являются основным соединением различных композиций.

Также известен патент США 2016/183537, в котором описана композиция из Bacillus amyloliquefaciens, содержащая итурин, сурфактин и фенгицин, для улучшения роста растений или защиты растений. В данном документе не упомянуты концентрации молекул, содержащихся в этой композиции. Высокие концентрации итурина не упомянуты.

Также известна публикация Choukri HBID et al., в которой описано влияние липопептидных экстрактов на перенос кислорода во время ферментации. Эти экстракты соответствуют смеси итурина/сурфактина при концентрациях до 4 г/л. Возможность более высокой концентрации итурина не описана в данном документе.

Таким образом, ни один из документов уровня техники не побуждает специалиста в данной области техники к приготовлению композиций с высокой концентрацией итуриновых липопептидов, поскольку специалисту известно, что они не будут стабильными и однородными, а, следовательно, имеют мало сфер применения.

Задачи, решаемые настоящим изобретением

Авторами изобретения продемонстрировано, что возможно приготовить стабильную и однородную композицию, в которой концентрация итуриновых липопептидов составляет выше 5 г/л, путем добавления молекул с поверхностно-активными свойствами. Действительно, авторами изобретения было продемонстрировано, что поверхностно-активные вещества улучшают растворимость итуриновых липопептидов свыше 5 г/л, в частности, при 10 г/л и 20 г/л, и до 50, 100 или даже 200 г/л без появления осадка или геля.

Настоящее изобретение находит применение в производстве концентрированных растворов противогрибковых, антибактериальных или биологических поверхностно-активных биопестицидных молекул для сферы защиты растений, а также в пищевой, косметической, фармацевтической и нефтяных отраслях.

ПОДРОБНОЕ ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ

Общий замысел изобретения относится к стабильной и однородной жидкой композиции, содержащей смесь липопептидов, в которой концентрация итуриновых липопептидов составляет выше 5 г/л.

В такой композиции липопептиды комбинируются с молекулами с поверхностно-активными свойствами, при этом концентрированная композиция итуринового липопептида остается стабильной и однородной.

Первый объект изобретения относится к стабильной и однородной композиции, содержащей итуриновые липопептиды в концентрации выше 20 г/л и одно или более поверхностно-активных веществ, выбранных из семейств анионных поверхностно-активных веществ, неионных поверхностно-активных веществ или масел.

Под «стабильной и однородной» композицией подразумевается композиция, которая не содержит осадок и остается однородной при температурах между 4°С и 40°С. Отсутствие комкования также является важным критерием, т.е. раствор является жидким, а не в форме геля.

Термин «жидкая» следует понимать в контексте изобретения как текучая композиция, т.е. композиция, имеющая низкую вязкость (отношение напряжения сдвига к скорости сдвига).

Термин «однородный» следует понимать, как смесь, в которой различные компоненты нельзя различить невооруженным глазом после перемешивания. Однородность может быть оценена за счет однородности концентраций в любой точке в смеси и отсутствия структур или микроструктур (комков или осадка), видимых глазу.

Такая однородность смеси является преимуществом, поскольку она обеспечивает равномерные концентрации итуриновых липопептидов, которые затем могут быть разбавлены в водном растворе.

Термин «стабильная» следует понимать как тот факт, что композиция остается однородной с течением времени. Таким образом, стабильная и однородная смесь представляет собой смесь с однородной концентрацией, которая остается постоянной стечением времени.

Согласно предпочтительному варианту реализации композиция согласно изобретению включает между 20 и 200 г/л итуриновых липопептидов. Она может включать, например, 20, 25, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90, 100 или 200 г/л итуриновых липопептидов. Предпочтительно, концентрация итуриновых липопептидов в композиции составляет между 20 и 150 г/л или между 20 и 100 г/л. Еще более предпочтительно, концентрация итуриновых липопептидов в композиции составляет выше 50 г/л, т.е. между 50 и 150 г/л или между 50 и 100 г/л, или между 50 и 80 г/л.

«Молекулы семейства итуринов» означают итурин А, можавенсин, микосубтилин и бацилломицины А, В, С, D, F и L.

Композиции согласно настоящему изобретению включают молекулы с поверхностно-активными свойствами.

«Молекулы с поверхностно-активными свойствами», которые также известны как «поверхностно-активные агенты» или просто «поверхностно-активные вещества», включают амфифильные молекулы, поверхностно-активные вещества, липопептиды, такие как сурфактин, фенгицин (или плипастатин), химические поверхностно-активные вещества и биологические поверхностно-активные вещества, такие как рамнолипиды, полисахариды и т.д. Эти молекулы могут быть использованы одни или в комбинации в композициях согласно изобретению.

Поверхностно-активные вещества включают гепарин, гиалуроновую кислоту, декстран, амилозу, хитозан, анионные поверхностно-активные вещества, полученные из аминокислот, неионные поверхностно-активные вещества, полученные из полигликозидов, гидротропные поверхностно-активные вещества, липопептиды, такие как изомеры поверхностно-активного вещества и/или изомеры фенгицина (или плипастатина), рамнолипиды и растительные масла.

Более конкретно, изобретение относится к анионным, неанионным и масляным поверхностно-активным веществам.

Поверхностно-активные вещества из семейства анионных поверхностно-активных веществ выбраны из: сурфактинов, фенгицинов или производных аминокислот.

«Молекулы семейства сурфактинов» означают сурфактины А, В, С, лихенизин и пумилацидин.

«Молекулы семейства фенгицинов» означают фенгицины А и В, плипастатины А и В, и аграстатин.

Поверхностно-активные вещества из семейства неионных поверхностно-активных веществ выбираны из: аксалкилата жирного спирта, пентиленгликоля и его производных, гидротропных молекул по типу алкилполигликозида (алкилполигликозида и алкилэтоксиполигликозида), молекул по типу полигликозидного текстурирующего агента (ксантановой камеди, аравийской камеди, трагакантовой камеди, гуаровой камеди, камеди бобов рожкового дерева, тамариндовой камеди, пектина, гелеобразной камеди, каррагенатов, агар-агара, альгинатов).

Поверхностно-активные вещества семейства масел выбраны из: масел и экстрактов модифицированных (окисленных, метилированных, этерифицированных) масел, в частности полученных из: миндаля, арахиса, аргании, авокадо, рапса, «Lorenzo», нима, лесного ореха, ореха кешью, ореха макадамия, оливы, фисташки, риса, олеинового подсолнечника, рыжика, льна, бурачника, сафлора, конопли, хлопка, зерен пшеницы, кукурузы, грецкого ореха, масличного мака, примулы вечерней, ячменя, семян тыквы, виноградных косточек, семян гороха, кунжута, сои, подсолнечника.

Итуриновые липопептиды будут микроэмульгированы в этих масляных соединениях или жирах для получения поверхностно-активного эффекта модифицированных масел и экстрактов масла.

Композиции согласно изобретению также могут содержать добавки, такие как источники липида, соли и растворители. Эти добавки могут осаждаться при растворении, не являясь поверхностно-активными веществами. Примеры растворителей включают этанол, метанол, ацетонитрил, диметилсульфоксид, бутанол, пентанол, ацетон.

Согласно первому аспекту, изобретение относится к композиции, содержащей между 5 и 50 г/л итуриновых липопептидов и между 1 и 40 г/л сурфактина.

В конкретном варианте композиции итуриновые липопептиды представляют собой микосубтилины. В другом конкретном варианте композиции количество итуриновых липопептидов, предпочтительно, составляет между 10 г/л и 50 г/л, предпочтительно, между 20 и 50 г/л, и еще более предпочтительно, между 30 и 50 г/л.

Согласно второму аспекту, изобретение относится к композиции, содержащей между 5 и 100 г/л итуриновых липопептидов, между 1 и 40 г/л сурфактина и между 1 и 100 г/л фенгицина (или плипастатина).

В конкретном варианте композиции количество итуриновых липопептидов, предпочтительно, составляет между 10 между 80 г/л, предпочтительно, между 20 и 80 г/л, наиболее предпочтительно, между 30 и 80 г/л.

Согласно третьему аспекту, изобретение относится к композиции, содержащей между 5 и 100 г/л итуриновых липопептидов, между 1 и 40 г/л сурфактина и между 1 и 30 г/л химических поверхностно-активных веществ.

В конкретном варианте композиции количество итуриновых липопептидов, предпочтительно, составляет между 10 и 80 г/л, предпочтительно, между 20 и 80 г/л, предпочтительно, между 30 и 80 г/л.

В конкретном варианте реализации химические поверхностно-активные вещества могут быть неионными поверхностно-активными веществами семейства полигликозидов или анионными поверхностно-активными веществами, полученными из аминокислот. Предпочтительно, химические поверхностно-активные вещества состоят из смеси анионных поверхностно-активных веществ и неионных поверхностно-активных веществ.

Согласно четвертому аспекту, изобретение относится к композиции, содержащей между 5 и 100 г/л итуриновых липопептидов, между 1 и 40 г/л сурфактина, между 1 и 100 г/л фенгицина (или плипастатина) и между 1 и 30 г/л химических поверхностно-активных веществ.

В конкретном варианте композиции количество итуриновых липопептидов, предпочтительно, составляет между 10 и 80 г/л, предпочтительно, между 20 и 80 г/л, предпочтительно, между 30 и 80 г/л.

Согласно пятому аспекту, изобретение относится к композиции, содержащей между 5 и 100 г/л микроэмульгированных итуриновых липопептидов в масляных или жирных соединениях, таких как растительное масло. В такой композиции концентрация масла составляет между 1% и 100%, предпочтительно, между 50% и 100%, особенно предпочтительно, между 80% и 100%. В число растительных масел, которые могут быть использованы, входит кукурузное масло, а также модифицированные масла и экстракты миндаля, арахиса, аргании, авокадо, рапса, «Lorenzo», нима, лесного ореха, ореха кешью, ореха макадамия, оливы, фисташки, риса, олеинового подсолнечника, рыжика, льна, бурачника, сафлора, конопли, хлопка, зерен пшеницы, кукурузы, грецкого ореха, масличного мака, примулы вечерней, ячменя, семян тыквы, виноградных косточек, семян гороха, кунжута, сои и подсолнечника.

Предпочтительно, используемые масла получены из арахиса, оливок, олеиновых подсолнечников, льна, кукурузы, орехов, бобов сои и подсолнечников. Такие масла обладают преимуществом, заключающемся в том, что они доступны в больших количествах и имеют низкую стоимость. Еще более предпочтительно, используемое масло является маслом из арахиса, кукурузы или подсолнечника.

В предпочтительном варианте реализации такая композиция включает между 10 и 80 г/л, предпочтительно, между 20 и 80 г/л микосубтилина, предпочтительно, между 30 и 80 г/л и особенно предпочтительно, между 50 и 80 г/л микосубтилина.

Таким образом, конкретный вариант композиции согласно изобретению включает:

- от 2 до 8% итуриновых липопептидов,

- 3% химических поверхностно-активных веществ, состоящих из смеси неионных и анионных поверхностно-активных веществ, 1,5% каждого,

- от 2 до 4% поверхностно-активных веществ,

- от 0 до 10% фенгицинов или плипастатинов.

В конкретном варианте реализации композиция содержит примерно 3% липопептидов (1,25% микосубтилина и 1,85% сурфактина), 1,5% неионного поверхностно-активного вещества, полученного из полигликозидов, и 1,5% анионного поверхностно-активного вещества, полученного из аминокислот.

В другом конкретном варианте реализации композиция включает примерно 5% липопептидов (2,45% микосубтилина и 2,65% сурфактина) и от 3 до 8% фенгицина (или плипастатина).

В другом конкретном варианте реализации композиция включает между 30 и 80 г/л микосубтилина и от 30 до 80 г/л фенгицина (или плипастатина).

В конкретном варианте реализации композиция включает итуриновые липопептиды в концентрации между 20 и 100 г/л, а поверхностно-активные вещества представляют собой экстракт растительного масла, производные полигликозида и сурфактин.

В другом конкретном варианте реализации композиция включает итуриновые липопептиды в концентрации между 20 и 100 г/л, а поверхностно-активные вещества представляют собой экстракт метилированного масла семян растений и полиглицерил эфир кокосового масла (Synergen OS™).

В другом конкретном варианте реализации композиция включает итуриновые липопептиды в концентрации между 20 и 100 г/л, а поверхностно-активные вещества представляют собой смесь алкилполиглюкозида (Simulsol™), производной аминокислоты (Proteol™) и сурфактина.

В другом конкретном варианте реализации композиция включает итуриновые липопептиды в концентрации между 20 и 100 г/л, а поверхностно-активные вещества представляют собой смесь оксалкилата жирного спирта (Emulsogen™) и сурфактина.

В другом конкретном варианте реализации композиция включает итуриновые липопептиды в концентрации между 20 и 100 г/л, а поверхностно-активные вещества представляют собой смесь растительного масла, ксантановой камеди и поверхностно-активного вещества.

Композиции согласно изобретению могут быть готовы для применения или быть в концентрированной форме; концентрированные растворы могут быть разбавлены перед применением.

Второй объект согласно изобретению относится к дегидратированной композиции, содержащей смесь липопептидов, в которой концентрация итуриновых липопептидов составляет выше 0,5%. В предпочтительном варианте реализации концентрация итуриновых липопептидов составляет выше 2%.

Такие дегидратированные композиции находятся в порошкообразной или лиофилизированной форме и являются «готовыми к применению»; действительно, достаточно регидратировать их в 100 мл раствора для получения композиции, в которой концентрация итуриновых липопептидов составляет по меньшей мере 5 г/л. В предпочтительном варианте реализации такие композиции имеют концентрацию итуриновых липопептидов по меньшей мере 20 г/л.

Ингредиенты и их относительные количества в этих твердых композициях являются такими же, что и описанные выше для жидких композиций. Действительно, концентрации различных компонентов в пересчете на сухой вес этих дегидратированных растворов обеспечивают возможность получения жидких композиций, в которых концентрация итуриновых липопептидов составляет выше 5 г/л и которые являются стабильными и однородными согласно изобретению. В предпочтительном варианте реализации концентрация итуриновых липопептидов составляет выше 20 г/л.

Третий объект изобретения относится к способу приготовления композиции, содержащей смесь липопептидов, в которой концентрация итуриновых липопептидов составляет выше 5 г/л. В предпочтительном варианте реализации концентрация итуриновых липопептидов в смеси составляет 20 г/л.

Итуриновые липопептиды композиции могут быть получены путем ферментации штамма Bacillus sp. и собраны и концентрированы из супернатанта культуры.

Композиции согласно изобретению могут быть приготовлены с использованием коммерчески доступных липопептидных препаратов в порошкообразной форме. Эти начальные порошки содержат меняющееся количество итуриновых липопептидов в диапазоне от 10 до более чем 80%, например, 15% или 75%. Эти порошки могут содержать смесь микосубтилина и сурфактина в соотношении от 30/70 до 70/30 или даже 95/5, например, 35/65, 40/60, 45/55 или 50/50.

Для приготовления композиции согласно изобретению в раствор с высоким содержанием итуриновых липопептидов должно быть добавлено по меньшей мере одно поверхностно-активное вещество.

Способ приготовления таких композиций может включать дополнительный этап дегидратации для обеспечения «готовой к применению» композиции в порошкообразной форме, характеристики которой соответствуют композициям согласно настоящему изобретению после ре гидратации.

Таким образом, способ обеспечивает возможность приготовления жидких или твердых растворов (в порошкообразной форме или в форме лиофилизата). Такие концентрированные растворы являются особенно подходящими для хранения и распространения. Они должны быть разбавлены перед применением.

Таким образом, композиция согласно изобретению может быть получена путем растворения порошка, обеспечивая восстановление жидкой композиции, как определено выше.

Композиции согласно изобретению применимы в сферах питания, защиты растений и косметики, а также в сфере медицины и фармацевтики.

Изобретение показано с помощью следующих примеров.

ПРИМЕРЫ

А. Приготовление растворов, содержащих липопептиды из супернатанта культур штамма Bacillus

1 - Получение супернатантов культуры

Липопептиды получены из процесса аэробной ферментации штамма Bacillus, полученного из штамма Bacillus subtilis АТСС 6633 для получения итуриновых липопептидов, и штаммов, полученных из штамма Bacillus subtilis 168 для получения сурфактина и/или фенгицина (или плипастатина). Культивирование производилось в перемешиваемой среде, содержащей источник углерода (глюкозу, сахарозу, …), источник азота (сульфат аммония, пептон, свободные аминокислоты, экстракт дрожжей…) и микроэлементы и соли при 30°С. рН поддерживался на значении 7. Культура была собрана по прошествии 48-72 часов. Затем она была центрифугирована или фильтрована для удаления клеток. Супернатант культуры затем был концентрирован.

2 - Приготовление композиций с высоким содержанием итуриновых липопептидов из супернатантов культуры

Для получения композиций с высоким содержанием итуриновых липопептидов супернатанты культуры могут быть концентрированы. Концентрация супернатанта культуры может быть получена любым известным специалисту способом, в частности:

- Путем тангенциальной ультрафильтрации с использованием мембраны с порогом отсечения между 1 кДа и 300 кДа. Например, 1000 л супернатанта культуры, полученного так, как описано выше, концентрируют путем пропускания через мембрану для получения ретентата в объеме от 10 до 100 л. Небольшие молекулы затем удаляют посредством одного или более этапов диафильтрации. Полученный таким образом раствор может быть высушен путем лиофилизации, атомизации или использован в имеющемся виде.

- Путем осаждения при кислотном рН: достигается снижение рН для выборочного осаждения липопептидов. В полученный супернатант добавляют концентрированную серную кислоту. После получения конечного рН около 1 раствор оставляют перемешиваться в течение от 2 до 12 часов. Центрифугирование позволяет извлечь отходы материала, содержащие липопептиды. Эти отходы затем растворяют путем добавления воды и соды для получения значения рН между 7 и 8,5. Полученный таким образом раствор может быть высушен путем лиофилизации, атомизации или использован в имеющемся виде.

- Путем выпаривания: супернатант концентрируют путем вакуумного выпаривания. Например, 20 л вводят в ротационный испаритель и концентрируют при от 1 до 2 л.

Процентное содержание липопептидов в конце одного из этих двух примеров приготовления составляет между 0,5 и 20% (вес/объем).

В - Приготовление концентрированных композиций итуриновых липопептидов

1 - Исследование воздействия различных поверхностно-активных веществ на растворимость итуринового липопептида и в композиции с высокой концентрацией

Итуриновый липопептид (здесь - микосубтилин), имеющий чистоту (в пересчете на сухой вес) между 45% и 80%, был отдельно растворен в воде при различных концентрациях и эту контрольную композицию была сравнена с различными композициями, в которые были добавлены различные поверхностно-активных соединения, как описано в заявке. После 15 суток хранения при 21°С были выбраны лишь композиции с реологическими свойствами текучего типа и однородным внешним видом (без комкования, препятствующего течению, и/или фазового сдвига и/или осаждения), смешаны путем перемешивания, затем эти композиции были центрифугированы в течение 10 минут при 10000 g и супернатант был проанализирован с использованием стандартного метода обращенно-фазовой ВЭЖХ. Этот способ обеспечивает возможность проверки растворимости итуриновых соединений, которые затем обнаруживаются в супернатанте после центрифугирования.

Растворимость отдельно итуринового липопептида (здесь - микосубтилина) в водном растворе в зависимости от его концентрации показана на Фигуре 1.

Максимальная концентрация итуриновых липопептидов, растворимых в различных композициях, показана на Фигуре 2.

В композицию 1, которая содержит только итуриновые липопептиды, не добавлено поверхностно-активное вещество.

Поверхностно-активными веществами, добавленными в композиции 2-13, являются:

- 10% фенгицинов (композиция 2)

- алкилполиглюкозиды и производные аминокислот (Simulsol™/), каждое в количестве 10% (композиция 3)

- соевый лецитин (4%) и производные полигликозида (0,1%) (Elvis™/ксантановая камедь) (композиция 4)

- экстракт метилированного масла растительных семян и полиглицерил эфир из кокосового масла (0,2%) (Synergen OS™) (композиция 5)

- неионное поверхностно-активное вещество по типу оксалкилата жирного спирта (0,2%) (Emulsogen™) (композиция 6)

- неионное поверхностно-активное вещество по типу пентиленгликоля (50%) (композиция 7)

- 0,4% производных полигликозида (алкилэтоксигликозид = AEG) (композиция 8)

- 4% сурфактинов (композиция 9)

- 4% сурфактинов и 10% фенгицинов (композиция 10)

- экстракт растительного масла (30%) и производные полигликозидов (0,1%) и сурфактин (4%) (кукурузное масло/ксантановая камедь/сурфактин) (композиция 11)

- алкилполиглюкозид и производные аминокислот (Simulsol™/), каждое в количестве 10%, и 4% сурфактина (композиция 12)

0,2% неионного поверхностно-активного вещества по типу оксалкилата жирного спирта (Emulsogen™) и 4% сурфактина (композиция 13)

Анализ результатов

На Фигуре 1 показана растворимость итуриновых липопептидов (здесь - микосубтилина) в водном растворе при комнатной температуре в зависимости от их концентрации.

На Фигуре 1 можно увидеть, что микосубтилин, взятый отдельно, очень хорошо растворяется в водном растворе при максимальной концентрации 2 г/л, однако свыше этой концентрации (например, между 5 и 25 г/л) можно наблюдать выпадающий осадок, а растворимой остается лишь небольшая часть.

На Фигуре 2 показан анализ растворимости различных композиций, включающих итуриновый липопептид (здесь - микосубтилин) и различные соединения, для получения высоких и растворимых концентрацией итуринового липопептида после 15 суток хранения при комнатной температуре. Измерение выполнено на супернатанте после этапа центрифугирования для удаления нерастворимых веществ.

На Фигуре 2 можно увидеть, что добавление различных поверхностно-активных веществ существенно увеличивает растворимость микосубтилина, в частности, в случае одних только анионных соединений или в комбинации с неионными поверхностно-активными веществами. Наличие фенгицина или сурфактина обеспечивает возможность получения растворимости микосубтилина, близкой к 30 г/л. Неожиданно и оригинально, комбинация этих двух анионных соединений липопептида обеспечивает возможность достижения даже более высокой растворимости итуринового соединения. Следует также отметить, что применение некоторых поверхностно-активных веществ, несмотря на однородную и стабильную композицию, не приводит к растворимости выше 20 г/л. Это справедливо в случае соевого лецитина, соединенного с ксантановой камедью (макс = 1,5 г/л), для неионного соединения Emulsogen™ (Clariant) (макс = 11,6 г/л), а также неионного соединения Simulsol™ и анионного (Ceppic) (макс = 15,3 г/л). Для этих композиций было отмечено наличие существенного осадка после этапа центрифугирования. С другой стороны, когда в эти композиции добавлено другое анионное липопептидное соединение, такое как сурфактин, растворимость микосубтилина увеличивается для значений между 55 и 120 г/л. Другие неионные соединения, такие как пентиленгликоль и алкилэтоксигликозид, также обеспечивают растворимость выше 30 г/л. Композиция, обеспечивающая максимальную растворимость итуринового соединения (112 г/л), является композицией, содержащей анионный липопептид (сурфактин) и неионное поверхностно-активное вещество (Emulsogen™).

2 - Приготовление композиций с высоким содержанием итуринового липопептида из липопептидных порошков

Композиция с высоким содержанием итуриновых липопептидов может быть приготовлена из липопептидного порошка, как изображено в следующих двух примерах композиций: Композиция 1: Композиция, содержащая примерно 3,1% (м/об) липопептидов (1,25% микосубтилина и 1,85% сурфактина), была получена путем ресуспендирования липопептидного порошка, содержащего смесь микосубтилин/сурфактин в соотношении 40/60 и имеющего чистоту примерно 15%, в водной фазе (рН между 7,5 и 8,5).

Композиция 2: Композиция, содержащая примерно 5,1% (м/об) липопептидов (2,45% микосубтилина и 2,65% сурфактина), была получена путем ресуспендирования липопептидного порошка, содержащего смесь микосубтилин/сурфактин в соотношении 45/55 и имеющего чистоту примерно 75%, в водной фазе (рН между 7,5 и 8,5).

3 - Приготовление композиций с высоким содержанием итуриновых липопептидов, содержащих поверхностно-активные вещества

Поверхностно-активные вещества были добавлены в композиции 1 и 2, описанные выше, для оценки влияния таких молекул на свойства композиций.

Композиция 1А: В композицию 1 были добавлены два поверхностно-активных вещества в пропорции 10% (об/об), а именно, неионное гидротропное поверхностно-активное вещество, полученное из полигликозидов (торговое наименование Simulsol™ SL 7С, реализуемое на рынке Seppic), и анионное поверхностно-активное вещество, полученное из аминокислот (торговое наименование Proteol™ APL, реализуемое на рынке Seppic).

Композиция 2А: От 3 до 8% (вес/об) фенгицина (или плипастатина) было добавлено в композицию 2.

4 - Определение характеристик полученных композиций: однородность и стабильность с течением времени.

a. Испытание на стабильность при комнатной температуре

Внешний вид композиций с и без поверхностно-активных веществ было исследовано при комнатной температуре, здесь - примерно 21°С.

Композиция 1: Добавление двух поверхностно-активных веществ обеспечило возможность получения однородной композиции (композиция 1А) и предотвращения какого-либо явления осаждения или оседания. Композиция 1А, содержащая поверхностно-активные вещества, имеет мутный, но однородный внешний вид.

Композиция 2: Добавление фенгицина (или плипастатина) обеспечило возможность получения однородной композиции и предотвращения какого-либо явления комкования (которое происходит при отсутствии фенгицина или плипастатина). Композиция 2А с фенгицином (или плипастатином) имеет прозрачный и однородный внешний вид.

b. Испытания на стабильность при низкой температуре

Концентрированные растворы липопептидов (Композиции 1, 2 и 1А, 2А) были помещены при 4°С на период от 1 до 30 суток. Только растворы с добавлением поверхностно-активных веществ или фенгицина (или плипастатина) (т.е. 1А и 2А) остались однородными и не наблюдался осадок. Без этих добавлений, концентрированные растворы липопептидов, вероятно, будут комковаться или давать существенный нерастворимый осадок.

5 - Определение реологических характеристик полученных композиций: воздействие хранения при комнатной температуре и ускоренное старение а. Способы анализа

Две описанные выше композиции 1 и 2, а также те, которые содержат добавки, 1А и 2А, хранили в течение 15 суток при 21°С и в течение 15 суток при 54°С (для имитации ускоренного старения). Хранение композиций при высокой температуре (54°С) представляет собой способ, который известен специалисту в данной области техники, который обеспечивает возможность имитации ускоренного старения композиций путем усиления броуновского движения, ускоряя дестабилизацию композиций.

В конце этих периодов были изучены реологические свойства композиций с использованием компактного модульного реометра Anton PAAR MCR102. Способ заключался в отслеживании скорости сдвига, когда напряжение сдвига постепенно повышалось между 1 и 100 Па (длительность испытания: 500 с). Вязкость (отношение напряжение сдвига/скорость сдвига) также была выражена как зависимость от напряжения сдвига. Это обеспечило возможность визуализации развития вязкости в ходе испытания. Эти испытания были выполнены на трех экземплярах образцов.

После хранения при 21°С или 54°С были изучены два реологических параметра этих композиций, а именно:

Минимальная вязкость (Па*с)

Напряжение сдвига при максимальной вязкости (Па)

В. РЕЗУЛЬТАТЫ.

Все образцы продемонстрировали поведение неньютоновской текучей среды (вязкость не была постоянной в ходе испытаний). По мере увеличения напряжения сдвига вязкость снижалась близко к минимальной вязкости. Снижение вязкости при перемешивании может быть объяснено постепенным выравниванием структурных единиц (или молекул) в направлении потока по мере увеличения скорости сдвига, тем самым содействуя течению различных слоев жидкости. Текучие среды затем классифицированы как разжижители и могут быть охарактеризованы их минимальными значениями вязкости (в случае проведенных испытаний это была вязкость в конце испытания) и напряжением сдвига при максимальной вязкости (Па).

- Исследование минимальной вязкости

На Фигуре 3 показан анализ минимальной вязкости различных концентрированных итуриновых композиций с или без добавления поверхностно-активных веществ и других добавок А, после хранения при 21°C или 54°С.

Результаты, представленные на Фигуре 3, показывают, что минимальная вязкость композиции 1А после хранения при 21°С существенно отличается и меньше чем таковая у композиции без добавок 1. Между композициями 2 и 2А после хранения при 21°С не наблюдалось существенных отличий. Тем не менее, в ходе испытания старением при 54°С, минимальная вязкость композиции 2 была очень существенно увеличена, тогда как таковая у композиции 2А осталась близка к 0. Это показывает очень важный эффект от добавления фенгицина (плипастатина) в последнюю для способствования растворимости итуриновых липопептидов. Подобный эффект можно наблюдать между композицией 1 и 1А после хранения при 54°С, демонстрируя преимущество состава композиции 1А.

- Исследование напряжения сдвига при максимальной вязкости

На Фигуре 4 показан анализ напряжения сдвига при максимальной вязкости различных концентрированных композиций липопептидов с или без добавления поверхностно-активных веществ и других добавок А, после хранения при 21°С или 54°С.

Результаты, представленные на Фигуре 4, показывают, что напряжения сдвига при максимальной вязкости после хранения в течение 15 суток при 21°С композиции 1А ниже чем полученные для композиции без добавок 1. Между композициями 2 и 2А не наблюдались какие-либо существенные отличия. Тем не менее, при исследовании влияния ускоренного старения при 54°С на этот параметр результаты, представленные на Фигуре 4, показывают, что напряжение сдвига очень существенно увеличивается в композициях без добавок 1 и 2, тогда как таковые у композиций с добавками 1А и 2А оставались почти идентичными полученным при 21°С. Эти результаты показывают очень положительное влияние составов согласно изобретению способствованию растворимости с течением времени и при высокой концентрации итуриновых соединений.

В заключение этих испытаний может быть установлено, что:

- Композиция 1А обеспечивает возможность растворения итуриновых соединений, при этом предотвращая образование осадка и/или геля, и это характеризуется существенным снижением минимальной вязкости и напряжения сдвига при максимальной вязкости после хранения при 21°С или даже более существенно во время ее старения. Композиции 1 и 1А относятся к неньютоновским кассоновским текучим средам.

- Композиция 2А обеспечивает возможность растворения итуриновых соединений, при этом предотвращая образование осадка и/или геля после длительного периода хранения, и это характеризуется существенным снижением минимальной вязкости и напряжения сдвига при максимальной вязкости после хранения при 54°С. Композиции 2 и 2А, прежде всего, относятся к неньютоновским текучим средам типа разжижителей, но композиция без добавок 2 становится очень густой во время ее старения.

Claims (10)

1. Биопестицидная композиция, содержащая итуриновые липопептиды в концентрации от более 100 г/л до 200 г/л и одно или более поверхностно-активных веществ, где итуриновые липопептиды выбраны из группы, состоящей из итурина A, AL и С, можавенсина, микосубтилина, бацилломицинов A, B, C, D, F, L и L_c и их любой комбинации, и где поверхностно-активное вещество выбрано из группы, состоящей из сурфактина, фенгицина и производного полигкликозида.

2. Композиция по п. 1, в которой концентрация итуриновых липопептидов составляет между 100 и 150 г/л.

3. Композиция по п. 1 или 2, в которой поверхностно-активным веществом является сурфактин, при этом концентрация сурфактина в композиции составляет между 1 и 40 г/л.

4. Композиция по п. 1 или 2, в которой поверхностно-активным веществом является фенгицин, при этом концентрация фенгицина в композиции составляет между 1 и 100 г/л.

5. Композиция по п. 1 или 2, в которой поверхностно-активными веществами являются сурфактин и фенгицин, при этом концентрация сурфактина составляет между 1 и 40 г/л, а концентрация фенгицина составляет между 1 и 100 г/л.

6. Композиция по любому из пп. 1-5, где итуриновый липопептид представляет собой микосубтилин.

7. Способ приготовления композиции по одному из предыдущих пунктов, включающий этапы приготовления раствора с высоким содержанием итуриновых липопептидов и добавления поверхностно-активных веществ.

8. Способ приготовления по п. 7, дополнительно включающий этап дегидратации.

9. Применение композиции по одному из пп. 1-6 в агропищевых, фитосанитарных или косметических задачах.

10. Композиция по одному из пп. 1-6 для применения в медицинской или фармацевтической сфере.