EP3645700A1 - Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe - Google Patents

Systeme fluidique de production de vesicules extracellulaires et procede associe

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Publication number
EP3645700A1
EP3645700A1 EP18737565.4A EP18737565A EP3645700A1 EP 3645700 A1 EP3645700 A1 EP 3645700A1 EP 18737565 A EP18737565 A EP 18737565A EP 3645700 A1 EP3645700 A1 EP 3645700A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
liquid medium
container
extracellular
extracellular vesicles
vesicles
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP18737565.4A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Florence GAZEAU
Amanda Karine Andriola SILVA
Otto-Wilhelm Merten
Claire WILHELM
Max PIFFOUX
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Genethon
Universite Paris Cite
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Paris Diderot Paris 7
Genethon
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Paris Diderot Paris 7, Genethon filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3645700A1 publication Critical patent/EP3645700A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/14—Rotation or movement of the cells support, e.g. rotated hollow fibers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/16—Particles; Beads; Granular material; Encapsulation
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M27/00—Means for mixing, agitating or circulating fluids in the vessel
    • C12M27/02—Stirrer or mobile mixing elements
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M29/00—Means for introduction, extraction or recirculation of materials, e.g. pumps
    • C12M29/04—Filters; Permeable or porous membranes or plates, e.g. dialysis
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M45/00—Means for pre-treatment of biological substances
    • C12M45/02—Means for pre-treatment of biological substances by mechanical forces; Stirring; Trituration; Comminuting
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M47/00—Means for after-treatment of the produced biomass or of the fermentation or metabolic products, e.g. storage of biomass
    • C12M47/10—Separation or concentration of fermentation products

Definitions

  • the invention relates to a system for producing extracellular vesicles from producing cells, a method for producing and recovering such vesicles and vesicles produced by such a system, for example used in cell therapy and in regenerative medicine.
  • Extracellular vesicles have been identified as effective means for administering drugs, in a personalized or targeted way, in the human body. They first have a native biocompatibility and an immune tolerance. They may also include theranostic nanoparticles, both for imaging certain parts of the body and for delivering active principles having therapeutic functions.
  • the extracellular vesicles also have an intercellular communication function: they make it possible, for example, to transport lipids, membrane and cytoplasmic proteins and / or nucleotides of the cellular cytoplasm, such as mRNAs, microRNAs or long non-coding RNAs. , between different cells.
  • extracellular vesicles may make it possible to solve known problems during the therapeutic use of cells, such as cell replication, differentiation, vascular occlusions, the risks of rejection and the difficulties of storage and freezing.
  • cell replication, differentiation, vascular occlusions, the risks of rejection and the difficulties of storage and freezing There is therefore an industrial need for the production of cell vesicles in quantities sufficient for therapeutic use, in particular as a replacement for or in addition to cellular therapies.
  • One method is to produce extracellular vesicles from umbilical vein vein endothelial cells (HUVEC) by subjecting these cells to hydrodynamic stresses mimicking stresses exerted under physiological conditions within the blood capillaries or under pathological conditions. when stenosis of blood vessels. These constraints are caused by the passage of the producing cells in microfluidic channels for four hours.
  • a microfluidic chip includes two hundred channels in which the cells are transported in a laminar flow to produce vesicles in a parallel fashion.
  • Watson et al. (Watson, D. C, Bayik, D., Srivatsan, A., Bergamaschi, C., Valentin, A., Niu, G., ... & Jones, J. C, 2016, Efficient production and enhanced tumor delivery engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205) describe a method of producing vesicles to increase the amount of vesicles produced. This method consists in cultivating HEK293 cells in culture flasks, then in hollow fiber membranes (Hollow Fiber Membrane). The central passage of the hollow fibers makes it possible to convey the culture medium to the producer cells.
  • Producing cells are first seeded around this passage, where they produce vesicles in an inter-fiber space.
  • the liquid medium comprised in the inter-fiber space is collected three times a week, making it possible to produce approximately 3.10 12 vesicles in several weeks, for very large amounts of seeded cells, for example of the order of 5 ⁇ 10 8 cells, resulting in a yield of approximately 6000 extracellular vesicles per cell and a very low purity ratio (e.g. 1, 09.10 9 particles per microgram of protein).
  • this production is not high enough and too slow compared to the applications mentioned above.
  • this method is described using production cells corresponding to a cell line that is particularly resistant to culture in serum-free medium: this method may not be transposable to vesicle production by producing cells such as stem cells, for example human, less resistant and particularly suitable for targeted therapeutic applications.
  • An object of the invention is to provide a solution for producing extracellular vesicles in large quantities from producing cells, more rapidly than with known methods, under GMP-compliant conditions. Another object of the invention is to propose a solution for increasing the efficiency of the vesicle production system, that is to say the ratio between the number of vesicles produced and the number of production cells introduced into the production system. Another object of the invention is to provide a system adapted to produce extracellular vesicles from a wide range of adherent producer cells, regardless of the resistance of the cell type introduced into the production system and resistant or not to a deficiency in serum. Another object of the invention is to provide a solution for producing and recovering extracellular vesicles continuously. Finally, another object of the invention is to simplify the structure of the fluidic system for the production of vesicles and reduce its manufacturing cost.
  • an object of the invention is a fluid system for producing extracellular vesicles from producer cells, comprising at least one container, a liquid medium contained by the container and producing cells, characterized in that it also comprises microcarriers suspended in the liquid medium, the majority of the producer cells being adherent to the surface of the microcarriers, and a liquid medium stirrer, the agitator and the form and the dimensions of the container being adapted to the generation of a turbulent flow of the liquid medium in the container.
  • the agitator of the liquid medium and the dimensions of the container are adapted to control a flow of the liquid medium, the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 75 ⁇ , and preferably to 50 ⁇ ;
  • the fluidic system comprises an output and a connection connected to the output, the connectors being capable of comprising liquid medium and extracellular vesicles;
  • the agitator is a rotary stirrer whose rotation speed (s), shape, size are adapted, with the shape and the dimensions of the container, to the generation of a turbulent flow of the liquid medium in the container;
  • the microcarriers are microbeads, the diameter of the microbeads being between 100 ⁇ and 300 ⁇ ;
  • the fluidic system comprises an extracellular vesicle separator, fluidly connected to the receptacle so as to be able to reintroduce into the receptacle a liquid medium depleted of vesicles.
  • Another subject of the invention is a process for the ex vivo production of extracellular vesicles from producer cells, comprising:
  • a control of an agitator causing a turbulent flow of a liquid medium in a container, the container comprising an outlet, the liquid medium comprising producer cells adhering to the surface of microcarriers, the microcarriers being in suspension in the liquid medium, and
  • the liquid medium is stirred for more than thirty minutes
  • the agitator is controlled to cause a flow of the liquid medium, the Kolmogorov length of the flow being less than or equal to 75 ⁇ and preferably 50 ⁇ ;
  • a separator depletes a portion of the liquid medium collected at the outlet of the container in extracellular vesicles, and the portion of the liquid medium is reintroduced into the container.
  • the subject of the invention is also extracellular vesicles that can be obtained by the process for producing extracellular vesicles that are the subject of the invention.
  • the subject of the invention is also a pharmaceutical composition comprising extracellular vesicles that can be obtained by the method for producing extracellular vesicles that is the subject of the invention.
  • the pharmaceutical composition comprising extracellular vesicles may be used in regenerative medicine.
  • extracellular vesicle generally refers to a vesicle released endogenously by a producer cell, whose diameter is between 30 nm and 5000 nm.
  • An extracellular vesicle corresponds in particular to an exosome and / or a microvesicle and / or a cell apoptotic body.
  • microcarrier and “microcarrier” designate a spherical matrix allowing the growth of producing cells adhering to its surface or inside and whose maximum size is between 50 ⁇ and 500 ⁇ , and preferably between 100 ⁇ and 300 ⁇ irr.
  • the microcarriers are generally beads whose density is chosen substantially close to that of the liquid culture medium of the producer cells. Thus, a gentle mixture allows the beads to remain in suspension in the liquid culture medium.
  • FIG. 1 schematically illustrates a fluid system for the production of extracellular vesicles
  • FIG. 2 illustrates the number of extracellular vesicles produced by HUVEC cells in a fluidic system for different agitations
  • FIG. 3 illustrates the number of extracellular vesicles produced by HUVEC cells in a fluid system for different agitations
  • FIG. 4 illustrates the number of extracellular vesicles produced by MSC cells in a fluidic system for different agitations
  • FIG. 5 illustrates the influence of Kolmogorov length on the number of extracellular vesicles produced by HUVEC and MSC cells
  • FIG. 6 illustrates adherent producer cells on the surface of microcarriers
  • FIG. 7 illustrates adherent producer cells on the surface of microcarriers
  • FIG. 8 illustrates the yield of the production of extracellular vesicles for different stirring times, for different production cells and for different stirring conditions
  • FIG. 9 illustrates the yield of the production of extracellular vesicles for different producer cells, and for different stirring conditions, after 240 minutes of agitation compared with the serum starvation method for 72 hours;
  • FIG. 10 illustrates the concentration of adherent producer cells on the microcarriers before and after stirring, for different stirring conditions
  • FIG. 11 illustrates the metabolism of HUVEC producing cells under agitation conditions for the production of extracellular vesicles
  • Figure 12 illustrates the metabolism of HUVEC producing cells under agitation conditions for the production of extracellular vesicles
  • Figure 13 illustrates the metabolism of murine MSC-producing cells under agitation conditions for the production of extracellular EV vesicles
  • Figure 14 illustrates the metabolism of murine MSC-producing cells under agitation conditions for the production of extracellular vesicles
  • FIG. 15 is an electron cryo-microscopy microphotograph of extracellular vesicles produced by a fluidic system
  • FIG. 16 illustrates the extracellular vesicle diameter distribution produced by the fluidic system
  • FIG. 17 illustrates the extracellular vesicle purity given by the ratio between the number of particles and the mass of proteins produced by the fluidic system in the liquid medium as compared with the serum deprivation method for 72 hours;
  • FIG. 18 illustrates the pro-angiogenic properties of a liquid medium comprising extracellular vesicles produced by the fluidic system
  • FIG. 19 illustrates the pro-angiogenic properties of a liquid medium comprising extracellular vesicles produced by the fluidic system, the serum deprivation method or the spontaneous vesicle release method;
  • FIG. 20 illustrates the metabolic activity of cardiomyocytes (H9C2 line) after a day's incubation in culture media comprising extracellular vesicles produced by the fluidic system;
  • FIG. 21 illustrates the metabolic activity of cardiomyocytes (H9C2 line) after two days of incubation in various culture media comprising extracellular vesicles produced by the fluidic system;
  • FIG. 22 illustrates the dose effect of an incubation of a liquid culture medium comprising a variable concentration of extracellular vesicles produced by a fluidic system on the proliferation of cardiomyocytes;
  • FIG. 23 illustrates the proliferation of cardiomyocytes (H9C2 line) after two days of incubation in the presence of a liquid culture medium comprising extracellular vesicles;
  • FIG. 24 illustrates the use of an extracellular vesicle composition produced by the fluidic system as a pharmaceutical composition in a poloxamer gel for the treatment of fistulas between the can and the caecum in rats;
  • FIG. 25 illustrates the use of an extracellular vesicle composition produced by the fluidic system as a composition in a poloxamer gel for the treatment of fistulas between the can and the caecum in rats.
  • FIG. 26 illustrates the proteomic profile of extracellular vesicles produced by the method according to the invention compared with the profile of extracellular vesicles produced by the conventional production methods according to the prior art.
  • the length of Kolmogorov (or Kolmogorov dimension or eddy length) is the length from which the viscosity of a fluid allows to dissipate the kinetic energy of a flow of this fluid. In practice, the length of Kolmogorov corresponds to the size of the smallest vortices in a turbulent flow. This length LK is calculated in Kolmogorov's publication (Kolmogorov, AN, 1941, January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl, Akad Nauk, SSSR, Vol 30, No. 4 , pp. 301-305) and described by the following formula (1):
  • N p is the unadjusted power number (or number of Newton) of the stirrer in the liquid medium
  • D is the diameter of the stirrer (in meters)
  • N is the speed of rotation (in revolutions per minute) second)
  • V is the volume of liquid medium (in cubic meters).
  • the fluidic system 1 for producing extracellular vesicles EV is intended for the large quantity production of extracellular vesicles EV in a container 4.
  • the invention is not limited to this embodiment and may comprise a series of connected containers 4. fluidically in parallel or in series.
  • the container 4 contains a liquid medium 5.
  • the container 4 may be a tank, a flange, for example glass or plastic, or any other container adapted to contain a liquid medium 5.
  • the volume of the container 4 is one factors making it possible to produce extracellular EV vesicles in large quantities: this volume can be between 50 mL and 500 L, preferably between 100 mL and 100 L, and preferably between 500 mL and 10 L.
  • the volume of the container 4 illustrated schematically in FIG. 1 is 1 L.
  • the container 4 typically comprises a gas inlet and a gas outlet, through which an atmosphere comprising O 2 and CO 2 concentrations adapted to the cell culture, for example comprising 5% of CO2. This atmosphere can come from a suitable gas injector / mixer or a CO2 controlled atmosphere oven.
  • a second pump 17 makes it possible to control this gaseous flow in the receptacle 4.
  • the receptacle 4 also comprises an outlet 9 capable of comprising liquid medium 5 and extracellular vesicles EV. This output is supplemented by a means of separation and / or filtration of the microcarriers 3 to not recover the microcarriers 3 outside the container 4. This outlet 9 allows to extract from the container 4 EV extracellular vesicles produced.
  • the container 4 may also comprise at least one inlet 8 adapted to introduce the liquid medium 5 into the container 4.
  • the liquid medium 5 may be generally a saline solution, for example isotonic.
  • the liquid medium 5 is a liquid culture medium with or addition of compounds for culturing the cells of interest, or supplemented medium in serum previously purified extracellular vesicles or serum-free medium, so as not to contaminate the extracellular vesicles EV produced by the fluidic system 1 by proteins or other vesicles from a serum.
  • a serum-free DMEM-type liquid medium can be used.
  • the maximum volume of liquid medium 5 is determined in part by the container 4. This maximum volume may also be between 50 mL and 500 L, preferably between 100 mL and 100 L, and more preferably between 500 mL and 10 L. The volume The minimum amount of liquid medium contained by the container 4 is partly determined by the choice of the stirrer 7 for agitating a liquid medium 5.
  • the fluidic system 1 also comprises microcarriers 3 suspended in the liquid medium 5.
  • the microcarriers 3 may be microbeads 14, for example Dextran, each microbead 14 may be covered with a layer of collagen or other material necessary for culture of cells.
  • Other materials can be used for the manufacture of microcarriers 3, such as glass, polystyrene, polyacrylamide, collagen and / or alginate.
  • all of the microcarriers adapted for cell culture are suitable for the production of extracellular EV vesicles.
  • the density of the microcarriers 3 may be slightly greater than that of the liquid medium 5.
  • the density of the microspheres 14 in Dextran is, for example, 1.04.
  • the maximum size of the microcarriers 3 can be between 50 ⁇ and 500 ⁇ , preferably between 100 ⁇ and 300 Mm, and preferably between 130 ⁇ and 210 ⁇ .
  • the microcarriers 3 may for example be microbeads 1 of Cytodex type 1 (registered trademark). It is possible to rehydrate and sterilize a powder formed by these microbeads 1 before use. 5 g of PBS can be used, then in serum-free culture media (eg, DMEM) at 4 ° C before use.
  • the fluidic system 1 also comprises producing cells 6.
  • the extracellular vesicles EV are produced by the fluidic system 1 from these producer cells 6.
  • the production cells 6 can be cultured, before the production of extracellular vesicles EV by the fluidic system 1 on the surface of microcarriers 3 in a suitable cell culture medium.
  • no cell transfer is necessary between the culture of the producer cells 6 and the production of the extracellular vesicles EV, which makes it possible to avoid any contamination and to simplify the process as a whole.
  • the majority of the producing cells 6 are adherent to the surface of the microcarriers 3, even if a minor proportion of producing cells 6 can be detached, for example by stirring the liquid medium 5.
  • producing cells 6 are then suspended in the In general, any type of producing cells 6 may be used, including nonadherent producer cells, and preferably adhering producer cells.
  • Producing cells 6 may be for example multipotent cells, or induced pluripotent stem cells (IPS or IPSCs, Induced Pluripotent Stem Cells). They may also be genetically modified cells and / or tumor lines.
  • the container 4 also comprises an agitator 7 for stirring the liquid medium 5.
  • the stirrer 7 can be a paddle wheel, whose blades are at least partially immersed in the liquid medium 5, and put in motion by a transmission of magnetic forces.
  • the stirrer 7 may also be a liquid medium infusion system 5 at a rate sufficient to agitate the liquid medium contained by the container, or a system with rotating walls (for example arranged on rollers).
  • the agitator 7 and the dimensions of the container 4 are adapted to control a turbulent flow of the liquid medium 5 in the vessel 4.
  • turbulent flow is meant a flow whose Reynolds number is greater than 2000.
  • the Reynolds number can example be calculated by the formula (4).
  • the Reynolds number Re of the flow of liquid medium 5 is greater than 7,000, preferably 10,000 and preferably 12,000.
  • the agitator 7 used in the exemplary embodiments of the invention comprises a blade wheel arranged in a container 4 and set in motion by a magnetic force transmission system.
  • the speed of the impeller in the liquid medium causes a flow of the liquid medium 5.
  • the agitator is adapted to control a flow, which, given the dimensions of the container 4, is turbulent. In the case of the stirrer 7 illustrated in FIG.
  • the agitator 7 is adapted to control a flow in which the length LK is less than or equal to 75 ⁇ and preferably 50 m.
  • the rotational speed of the stirrer 7 can be controlled at 100 rpm (rotations per minute), the diameter of a blade wheel is 10.8 cm and the the volume of liquid medium contained by the container 4 is 400 ml.
  • the measured NP power number of the blade wheel in the liquid medium 5, by the formula (3), is substantially equal to 3.2.
  • the energy dissipated per unit mass ⁇ , calculated by the formula (2), is equal to 5.44 ⁇ 10 1 J. kg 1 .
  • the length of Kolmogorov LK calculated by the formula (1) is thus equal to 41.8 ⁇ .
  • the container 4 may be disposable or sterilized before introduction of liquid medium 5, microcarriers 3 and producer cells 6.
  • the microcarriers 3, in this case microbeads 14, are also sterilized.
  • the microbeads 14 are incubated in the culture medium of the producer cells 6, comprising serum, in the container 4. This incubation allows the culture medium to be oxygenated and to cover the surface of the microbeads 14 with at least a partial layer. of proteins, promoting the adhesion of the producing cells 6 to the surface of the microbeads 14.
  • the producer cells 6, before being introduced into the fluidic system 1, are suspended using a medium comprising trypsin. They can then be centrifuged at 300 G for five minutes to be concentrated in the pellet of a tube, so as to replace the medium comprising trypsin with a DMEM medium.
  • the producer cells 6 are then introduced into the container 5, comprising culture medium and the microbeads 14, in an amount corresponding substantially to 5 to 20 producing cells 6 per microbead 14.
  • the production cells 6 and the microbeads 14 are then shaken and then sedimented, so as to bring into contact the microbeads 14 and the producer cells 6, and promote the adhesion of the production cells 6 on the surface of the microbeads 14.
  • the stirring can be periodically repeated, so as to promote the homogeneity of the adhesion of the producing cells 6 to the surface of the microbeads 14, for example every 45 minutes for 5 to 24 hours.
  • the culture of the producer cells is then carried out with slight stirring of the culture medium (for example the rotation of a paddle wheel at a speed of 20 rpm), as well as a regular replacement of the culture medium (for example a replacement from 5% to 40% of the culture medium each day).
  • Extracellular vesicles EV are produced in a container 4 containing a liquid medium 5, for example without serum, microcarriers 3 and producer cells 6 adherent to the surface of the microcarriers 3.
  • the medium used before production for the cultivation of the production cells 6 on the microcarriers 3 comprising serum the container 4 is washed three to four times with serum-free DMEM liquid medium, each washing corresponding for example to a volume of approximately 400 ml.
  • the agitation of the liquid medium 5 is then controlled by the stirrer 7 so as to cause a turbulent flow in the vessel 4.
  • the stirring is preferably adjusted so as to control a flow of the liquid medium 5 in which the length of Kolmogorov LK is less than or equal to 75 ⁇ and preferably 50 ⁇ .
  • the agitation of the liquid medium is controlled at least for half an hour, preferably for more than one hour, and preferably for more than two hours.
  • Extracellular vesicle production EV can be measured during production.
  • the agitation can be momentarily interrupted.
  • the microbeads 14 are allowed to settle at the bottom of the container 4, and then a sample of liquid medium 5 comprising extracellular vesicles EV is taken.
  • the sample is centrifuged at 2000 G for 10 minutes to remove cell debris.
  • the supernatant is analyzed by a monitoring method particle count (or NTA, acronym for Nanoparticie Tracking Analysis) in order to count the number of extracellular vesicles EV and to deduce the extracellular vesicle EV concentration of the samples. It can be verified that the concentration of extracellular vesicles EV at the beginning of the agitation is close to zero or negligible.
  • NTA acronym for Nanoparticie Tracking Analysis
  • Extracellular EV vesicles produced can also be observed and / or counted by transmission electron cryo-microscopy.
  • a drop of 2.7 ⁇ of solution comprising extracellular vesicles EV is deposited on a grid adapted to cryomicroscopy, then dipped in liquid ethane, resulting in an almost instantaneous freezing of said drop, avoiding the formation of ice crystals.
  • the grid supporting the extracellular vesicles EV is introduced into the microscope and the extracellular vesicles EV are observed at a temperature of the order of -170 ° C.
  • the extracellular vesicles EV produced in the container 4 can be extracted from the container 4 by the outlet 9 of the container 4, suspended in liquid medium 5.
  • a filter 18 can be arranged at the outlet 9 so as to filter the microcarriers 3 and the producer cells 6 adhered to the microcarriers 3 during the extraction of extracellular vesicles EV from the container 4.
  • a connector 13 is fluidly connected to the outlet 9, allowing the transport of the liquid medium 5 comprising the extracellular EV vesicles produced.
  • the fluidic system 1 may comprise an extracellular vesicle separator EV.
  • the separator 15 comprises an inlet of the separator 10, wherein the liquid medium comprising extracellular vesicles EV from the container 4 can be conveyed directly or indirectly.
  • the separator 15 may also comprise a first outlet 1 1 of the separator, by which the liquid medium 5 is likely to leave the separator 15 with a concentration of EV extracellular vesicles smaller than the inlet 10 of the separator 15, or substantially zero.
  • the separator 15 may also comprise a second outlet 12 of the separator 15, through which the liquid medium 5 is able to exit the separator 15 with an extracellular vesicle concentration EV higher than at the inlet 10 of the separator 15.
  • the extracellular vesicle separator EV may be fluidly connected to the container 4 so as to be able to reintroduce an EV vesicle-depleted liquid medium into the container 4, for example through the inlet 8 of the container 4.
  • the production and / or extraction of extracellular vesicles EV can be carried out continuously, with a substantially constant volume of liquid medium 5 in the container 4.
  • the liquid medium 5 can be extracted from the container 4 by a first pump 16, via a connector 13, so as to transport the liquid medium 5 in a collector 19.
  • Another first pump 16 allows the liquid medium 5 contained in the manifold 19 to be fed to the inlet 10 of the separator 15 via another connector.
  • the first output 1 1 of the separator 15 is connected to the container 4 via a connector, so as to reintroduce liquid medium 5 depleted extracellular vesicles EV in the container 4.
  • the second output 12 of the separator 15 is connected to the manifold 19 via a connector , so as to enrich the liquid medium contained in the collector 19 in extracellular vesicles EV.
  • the inlet 10 of the separator 15 may be directly connected to the outlet 9 of the container 4 (or via a first pump 16).
  • the first outlet 1 1 of the separator 15 is connected to the container 4 and the second outlet 12 of the separator 15 is connected to the manifold 19.
  • Several separators can also be arranged in series to vary the degree of separation in extracellular vesicles EV in the liquid medium 5, and / or in parallel to adapt the flow of liquid medium 5 in each separator 15 to the flow rate of a first pump 16.
  • FIG. 2 illustrates the number of extracellular vesicles EV produced in a fluidic system 1 for different agitations controlled by the stirrer 7.
  • the left ordinate corresponds to the numbers of extracellular vesicles EV 4.
  • Each column corresponds to an extracellular vesicle production EV for different rotational speeds of the agitator 7 in the container 4.
  • the ordinate on the right corresponds to the length LK driven by the stirrer 7 during the production.
  • extracellular vesicle EV calculated by the formulas (1), (2) and (3).
  • the extracellular vesicles EV are produced from HUVEC-type producer cells 6 in the vessel 4 using a concentration of 3 ⁇ l -1 of microcarriers 3 in 50 ml of liquid medium in a spinner flask. 100 ml.,
  • a significantly high production of extracellular vesicles EV is observable by controlling a flow of liquid medium in which the length LK is equal to 35 ⁇ (production corresponding to column 300 RPM) compared to extracellular vesicle production EV in lower stirring conditions in which the length LK is equal to 75 ⁇ and preferably 50 ⁇ (production corresponding to the column 150 RPM)
  • Figure 3 illustrates the number of extracellular vesicles EV produced in a fluidic system 1 for different agitators controlled by the agitator 7.
  • Twenty million production cells 6 of the HUVEC type are using a concentration of 3 gL 1 of microcarriers 3 in 350 mL of liquid medium in a 1000 ml spinner flask.
  • the left ordinate corresponds to the numbers of extracellular vesicles EV produced in the vessel 4.
  • Each column corresponds to production of extracellular vesicles EV for different rotational speeds of the agitator 7 in the container 4.
  • the ordinate on the right corresponds to the length entrained during the production of extracellular vesicles EV, calculated by the formulas (1), (2 ) and (3).
  • a significantly high production of extracellular vesicles EV is observable by controlling a flow of liquid medium in which the length U is less than 40 ⁇ compared to the extracellular vesicle production EV under lower agitation conditions (production corresponding to the columns 125 RPM, 150 RPM and 175 RPM).
  • FIG. 4 illustrates the number of extracellular vesicles EV produced in a fluidic system 1 for different stirrings controlled by the stirrer 7.
  • MSC mesenchymal stem cell acronym
  • the microcarriers 3 are introduced at a concentration of 3 ⁇ l 1 in 200 ml of liquid medium in a 500 ml spinner flask.
  • the left ordinate corresponds to the numbers of extracellular vesicles EV produced in the receptacle 4.
  • Each column corresponds to an extracellular vesicle production EV for different rotational speeds of the agitator 7 in the receptacle 4.
  • the ordinate on the right corresponds to the length LK entrained during the production of extracellular vesicles EV, calculated by formulas (1), (2) and (3).
  • a significantly high production of extracellular vesicles EV is observable by controlling a flow of liquid medium in which the length LK is equal to 35 ⁇ (production corresponding to the 175 RPM column), compared to extracellular vesicle production EV under conditions lower agitation in which the length LK is equal to 50 m.
  • Figure 5 illustrates the influence of Kolmogorov LK length on the number of EV extracellular vesicles produced.
  • Length LK is a scale parameter for the production of extracellular vesicles EV.
  • the squares (a) correspond to the extracellular vesicle production EV shown in Figure 2 for different lengths
  • the diamonds (b) correspond to the extracellular vesicle production EV shown in Figure 3 for different lengths U
  • the triangles (c) correspond to Extracellular vesicle production EV illustrated in FIG. 4 for different lengths U.
  • U 50 ⁇
  • FIG. 6 illustrates producing cells 6 adhered to the surface of microcarriers 3, in this case microbeads 14, suspended in the liquid medium 5, before the agitation corresponding to an extracellular vesicle production EV. Producing cells 6 adherent to the surface of microcarriers 3 are visible and quantifiable.
  • FIG. 7 illustrates producing cells 6 adhered to the surface of microcarriers 3, in this case microbeads 14, suspended in the liquid medium 5, after the agitation corresponding to an extracellular vesicle production EV.
  • Producing cells 6 adherent to the surface of microcarriers 3 are visible and quantifiable.
  • the comparison between the number of producer cells adhering to the surface of the microcarriers 3 before and after stirring for the production of extracellular vesicles EV makes it possible to verify that the stirring conditions described above, for example an agitation causing a flow in which the LK length is less than 75 ⁇ and preferentially to 50 ⁇ irr, do not cause the detachment of the producer cells 6 microporteurs 3.
  • FIG. 1 illustrates producing cells 6 adhered to the surface of microcarriers 3, in this case microbeads 14, suspended in the liquid medium 5, after the agitation corresponding to an extracellular vesicle production EV.
  • curve (a) illustrates the evolution, during agitation, of the ratio between the number of particles produced (including extracellular vesicles EV) and between the number of producing cells 6 introduced into the container 4, the producing cells 6 being of the murine MSC type, and the flow of the liquid medium 5 being characterized by a length LK substantially equal to 35 ⁇ .
  • Curve (b) illustrates the same evolution, the producer cells 6 being of human MSC type, and the flow of the liquid medium 5 being characterized by a length LK substantially equal to 33 m.
  • Curve (c) illustrates the same evolution, the producer cells 6 being of HUVEC type, and the flow of the liquid medium 5 being characterized by a length LK substantially equal to 35 m.
  • Curve (d) illustrates the same evolution, producing cells 6 being of human MSC type, and the flow of liquid medium 5 being characterized by a length LK substantially equal to 35 m.
  • Curve (e) illustrates the same evolution, the production cells being of HUVEC type, and the flow of the liquid medium being characterized by a length LK substantially equal to 50 Mm.
  • Curve (f) illustrates the same evolution, cells producing cells being of the murine MSC type, and the flow of the liquid medium being characterized by a length LK substantially equal to 50 ⁇ m.
  • the curve (g) illustrates the same evolution, the producer cells 6 being of the human MSC type, and the flow of the liquid medium 5 being characterized by a length LK substantially equal to 50 ⁇ .
  • Curve (h) illustrates the same evolution, the producer cells being of murine MSC type, and the flow of liquid medium 5 being characterized by a length LK substantially equal to 53 ⁇ .
  • Figure 9 illustrates the yield of extracellular vesicle production EV for different producer cells 6, and for different agitation conditions after 240 minutes of agitation. The four columns on the left illustrate the yield of EV extracellular vesicle production using murine MSC-like producer cells.
  • the production yield for three stirring conditions corresponding to a stirring resulting in a length LK of 50 ⁇ (first column), 47 ⁇ (second column) and 35 ⁇ (third column) is compared to the production yield according to the method of serum deficiency (or starvation method or serum deprivation in English).
  • Three columns illustrate the yield of EV extracellular vesicle production using HUVEC type 6 producer cells.
  • the production yield for two stirring conditions corresponding to a stirring resulting in a length LK of 50 ⁇ (fourth column) and 47 ⁇ (fifth column) is compared with the production yield according to the serum deficiency method.
  • the four rightmost columns of the figure illustrate the yield of EV extracellular vesicle production using human MSC-like producer cells.
  • the production yield for three stirring conditions corresponding to a stirring resulting in a length LK of 50 ⁇ (eighth column), 35 ⁇ (ninth column) and 33 ⁇ (tenth column) is compared to the production yield according to the method of deficiency in serum.
  • Figure 10 illustrates the concentration of producer cells 6 adherent on the microcarriers 3 before and after stirring, for different stirring conditions.
  • Figure 11 illustrates the metabolic activity of HUVEC type 6 producing cells under agitation conditions for the production of EV extracellular vesicles.
  • the stirring of the liquid medium is controlled by an agitator 7 rotating at 75 RPM, in a spinner flask of 1 L, resulting in a flow characterized by a length LK substantially equal to 50 ⁇ , for 240 minutes.
  • the metabolism is measured by observing the variation of the wavelength emitted by the reagent Alamar blue in the liquid medium 5. No significant decrease in the metabolism of the producing cells 6 is observable under these stirring conditions.
  • Figure 12 illustrates the metabolism of HUVEC producing cells 6 under agitation conditions for the production of EV extracellular vesicles.
  • Stirring of the liquid medium is controlled by an agitator 7 rotating at 125 RPM in a 1L spinner flask, causing a flow characterized by a length substantially equal to 35 ⁇ for 240 minutes.
  • the metabolism is measured by observing the variation of the wavelength emitted by the reagent Alamar blue in the liquid medium 5.
  • a decrease, or even a disappearance of the metabolism of the producer cells 6 is observable after 250 minutes of agitation. This decrease in cellular metabolism does not, however, prevent the production of extracellular EV vesicles during agitation.
  • Figure 13 illustrates the metabolism of MSC-like producing cells 6 under agitation conditions for the production of EV extracellular vesicles.
  • the stirring of the liquid medium 5 is controlled by an agitator 7 rotated at 75 RPM in a 1L spinner flask, resulting in a flow characterized by a length LK substantially equal to 50 ⁇ , for 240 minutes.
  • the metabolism is measured by observing the variation in wavelength emitted by the Alamar blue reagent in the liquid medium 5. No significant decrease in the metabolism of the producing cells 6 is observable under these stirring conditions.
  • Figure 14 illustrates the metabolism of MSC type 6 producing cells under agitation conditions for the production of extracellular EV vesicles.
  • the stirring of the liquid medium is controlled by an agitator 7 rotating at 125 RPM in a 1L spinner flask, resulting in a flow characterized by a length LK substantially equal to 35 ⁇ for 240 minutes.
  • the metabolism is measured by observing the variation in wavelength emitted by the Alamar blue reagent in the liquid medium 5. No significant decrease in the metabolism of the producing cells 6 is observable under these stirring conditions.
  • the conditions of low agitation corresponding to a stirring resulting in a flow characterized by a length LK substantially equal to 50 ⁇ m, make it possible to reuse the cells 6 for subsequent extracellular EV vesicle production.
  • Figure 15 is a photomicrograph of EV extracellular vesicles produced by murine MSC cells by a fluidic system 1.
  • the scale bar corresponds to a length of 200 nm.
  • Photomicrography is performed using the transmission electron cryomicroscopy technique (cryo-TEM).
  • Figure 16 illustrates the extracellular vesicle diameter distribution EV produced by fluid system 1 measured by cryo TEM.
  • the distribution (a) corresponds to extracellular EV vesicles produced by murine MSC cells with agitation causing a flow characterized by a length LK substantially equal to 35 ⁇ (condition of strong agitation).
  • the distribution (b) corresponds to extracellular EV vesicles produced with agitation causing a flow characterized by a length LK substantially equal to 50 ⁇ (low agitation condition).
  • the median diameter of the extracellular EV vesicles produced under low agitation conditions is greater than the median diameter of the extracellular EV vesicles produced under conditions of strong agitation.
  • the size of the extracellular vesicles EV may be substantially between 30 and 500 nm.
  • Figure 17 illustrates the purity of the extracellular EV vesicles produced by the fluidic system 1 in the liquid medium indicated by the ratio of the number of particles to the microgram protein mass.
  • different entities may be produced by the producing cells 6, in this case extracellular vesicles EV but also protein aggregates. Quantification of particles by individual particle monitoring (or NTA for Nanoparticle Tracking Analysis) does not allow To differentiate these different entities, it is also advantageous to quantify the ratio between the number of particles measured by NTA and the mass of proteins produced, defining the purity of the extracellular vesicles EV. Columns (a) illustrated in Fig.
  • FIG. 17 correspond to extracellular vesicle production EV from murine MSC-like producer cells 6, and columns (b) correspond to extracellular vesicle production EV from cell-producing cells 6.
  • human MSC type The two left-hand columns correspond to an extracellular vesicle production EV under conditions of strong agitation, and the two right-hand columns correspond to an extracellular EV vesicle production according to the serum deficiency method.
  • the extracellular vesicle purity EV of the medium obtained after the production is comparable in both methods.
  • Figure 18 illustrates the pro-angiogenic properties of a serum-free liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced by murine MSC cells by fluidic system 1.
  • Panel B of FIG. 18 is a photograph of the same surface, after 4 hours of incubation in the liquid medium comprising the extracellular vesicles EV.
  • Panel C of FIG. 18 is a photograph of the same surface after 9 hours of incubation in the liquid medium comprising extracellular vesicles EV. During the experiment, HUVEC cells cover the part of the surface on which no cells are present at the beginning of the experiment. So, the liquid medium comprising the extracellular vesicles EV has pro-angiogenic and / or pro-proliferative properties.
  • Figure 19 illustrates the pro-angiogenic properties of a liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced by murine MSC cells by the fluidic system 1 under different conditions.
  • Each column illustrates the normalized percentage of bank closure between 0 h (corresponding to panel A of FIG. 18) and 9 h (corresponding to panel C of FIG. 18) for each incubation condition.
  • the first column (“complete medium”) corresponds to an incubation in a culture medium of HUVEC cells (corresponding to a positive control).
  • the second column (“ctrl neg”) corresponds to an incubation in a liquid medium (culture medium) without extracellular EV vesicles, serum-free where a given volume of PBS was added.
  • the third column (“strong agitation 10/1”) corresponds to an incubation in a liquid culture medium where the same given volume of PBS was added comprising extracellular EV vesicles produced by a fluidic system 1 under conditions of strong agitation. in which the amount of producer cells 6 introduced corresponds to 10 murine MSC producer cells for a recipient HUVEC cell.
  • the fourth column (“low agitation 10/1”) corresponds to an incubation in a culture medium where the same given volume of PBS was added comprising extracellular EV vesicles produced by a fluidic system 1 under conditions of low agitation, in which the amount of producer cells 6 introduced corresponds to 10 murine MSC producer cells for a recipient HUVEC cell.
  • the fifth column corresponds to an incubation in a culture medium of HUVEC cells, depleted in exosomes, the amount of introduced producer cells 6 corresponding to 10 producer cells 6 for a recipient HUVEC cell.
  • the sixth column corresponds to an incubation in a liquid medium of culture where the same given volume of PBS was added comprising serum-deficient EV extracellular vesicles, the amount of introduced producer cells 6 corresponding to 10 murine MSC producer cells for a recipient HUVEC cell. Incubation in a liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced under high agitation conditions ("strong 10/1 agitation”) significantly overcomes the initially cell-free portion.
  • Figure 20 illustrates the proliferation of cardiomyocytes after one day of incubation in different liquid media, as measured by alamar blue included in the incubation medium.
  • the first column corresponds to an incubation in a medium adapted to the culture of cardiomyocytes H9C2 ("complete medium", positive control).
  • the second column corresponds to an incubation in PBS.
  • the third column corresponds to an incubation in a liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced by a fluid system 1 under conditions of strong agitation ("strong stirring 10/1"), the quantity of producing cells 6 introduced corresponding to 10 cells. producing 6 for a recipient cell.
  • the fourth column corresponds to an incubation in a liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced by a fluid system 1 under conditions of low agitation ("low agitation 10/1"), the amount of producer cells 6 introduced corresponding to 10 cells. producing 6 for a recipient cell.
  • the fifth column corresponds to an incubation in a culture medium of cardiomyocytes, depleted in exosomes ("lib 10/1"), the quantity of producing cells 6 introduced corresponding to 10 producer cells 6 for a recipient cell.
  • the sixth column corresponds to an incubation in a liquid medium comprising EV extracellular vesicles produced by a method of production in a serum-free "stress" medium, the amount of introduced producer cells 6 corresponding to 10 producer cells 6 for one cell. receptor.
  • Incubation conditions in a liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced in a fluidic system 1 under conditions of high agitation and / or low agitation result in a significantly higher proliferation of cardiomyocytes compared to incubation conditions in patients.
  • PBS and under the conditions "exo" and "stress".
  • FIG. 21 illustrates the proliferation of H9C2 cardiomyocytes after two days of incubation.
  • Cardiomyocytes incubated in a liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced from murine MSC-like producer cells 6 by a fluidic system 1 under conditions of low agitation, under conditions of strong agitation, as well as by spontaneous release in a exosome-depleted complete medium proliferate significantly more than cardiomyocytes incubated in serum deficient medium.
  • Cardiomyocytes incubated in a liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced under conditions of low agitation and under high agitation conditions proliferated significantly more than cardiomyocytes incubated in serum deficient medium.
  • Figure 22 illustrates the dose effect on H9C2 cardiomyocyte proliferation of an incubation of a liquid medium comprising a variable concentration of extracellular EV vesicles produced by a fluidic system 1.
  • the metabolic activity of the cardiomyocytes is measured after two days of incubation in a liquid medium by alamar blue.
  • the cardiomyocyte metabolism is measured for three incubation conditions: in a liquid medium comprising extracellular EV vesicles produced under low agitation conditions in (a), under low agitation conditions in (b) and in a liquid medium with serum deficiency in (c).
  • curves (a) and (b) The measurement of cardiomyocyte metabolism is performed in curves (a) and (b) for different ratio between the concentration of extracellular vesicles EV and the concentration of cardiomyocytes, displayed on the abscissa.
  • Curve (a) illustrates the dose effect of proliferation in the presence of extracellular EV vesicles: the metabolism of cardiomyocytes increases when the ratio of extracellular EV vesicle concentrations to cardiomyocytes increases.
  • Figure 23 illustrates the proliferation of cardiomyocytes after two days of incubation in the presence of a liquid medium comprising extracellular EV vesicles of murine MSC cells at a concentration of 100,000 extracellular EV vesicles by cardiomyocyte.
  • the proliferation of cardiomyocytes after two days is significantly greater when the liquid incubation medium comprises extracellular EV vesicles produced by a fluidic system 1 under conditions of high agitation or low agitation, compared to a liquid medium comprising vesicles.
  • extracellular EV obtained by serum deficiency and / or culture medium of cardiomyocytes containing extracellular EV vesicles obtained spontaneous release in complete medium depleted exosomes.
  • Fig. 24 illustrates the use of an extracellular vesicle composition EV produced by the fluidic system 1 as a pharmaceutical composition.
  • a caecostomy is performed on each rat of a group of rats. The presence of excrement is observed at the opening of a fistula formed by the caecostomy, under three conditions: a control condition, a condition corresponding to a treatment by the application of a gel comprising poloxamer 407 on the orifice of the fistula of each mouse ("gel”) and a condition corresponding to the application of this gel comprising extracellular EV vesicles produced by a fluidic system 1 according to a method which is the subject of the invention, for example under conditions of strong agitation ("gel + vesicles").
  • Figure 25 illustrates the use of an EV extracellular vesicle composition produced by the fluidic system 1 as a pharmaceutical composition.
  • a score is calculated from the observations presented in Figure 24. A score of 1 is assigned when the hole of a fistula shows faeces and a score equal to zero is assigned when the orifice of a fistula does not present no excrement.
  • Figure 25 illustrates the mean score, for all the caecostomies and for each of the conditions: control, "gel” and "gel + vesicles”.
  • the application of a gel comprising extracellular vesicles EV results in a decrease in the average score of fistula productivity compared to control groups and gel without vesicles and significantly reduces the presence of feces at the fistula orifice in these fistulas. conditions.
  • the extracellular vesicle composition EV produced by the fluidic system 1 can be used in regenerative medicine.
  • FIG. 26 illustrates the proteomic profile of extracellular vesicles produced by the method according to the invention compared with the extracellular vesicles produced by the conventional production methods according to the prior art, more particularly the proteomic profile of markers conventionally used to characterize the extracellular vesicles.
  • the proteomic profile of extracellular vesicles obtained by four different production methods were compared.
  • a method of production in flask by deprivation of serum for a period of 72 hours (2D)
  • a method of production in bioreactors by deprivation of serum for a duration of 72 hours (3D)
  • a production method in medium-speed bioreactor characterized by a Kolmogorov length equal to 50 ⁇ for a duration of 4 hours MS
  • a high-speed bioreactor production method characterized by a Kolmogorov length equal to 35 ⁇ for a duration of 4 hours (HS).
  • the extracellular vesicles produced by the method according to the invention have a similar proteomic profile to the extracellular vesicles produced by the methods of the prior art.
  • a similar proteomic profile is a proteomic profile characterized by the presence and the amount of markers conventionally used to characterize extracellular vesicles.

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Abstract

L'invention concerne un système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient et des cellules productrices, caractérisé en ce qu'il comprend également des microporteurs en suspension dans le milieu liquide, la majorité des cellules productrices étant adhérentes à la surface des microporteurs, et un agitateur de milieu liquide, l'agitateur et les dimensions du récipient étant adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient.

Description

SYSTEME FLUIDIQUE DE PRODUCTION DE VESICULES EXTRACELLULAIRES
ET PROCEDE ASSOCIE
DOMAINE DE L'INVENTION
L'invention concerne un système de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, un procédé de production et de récupération de telles vésicules et des vésicules produites par un tel système, par exemple utilisées dans la thérapie cellulaire et dans la médecine régénérative.
ETAT DE LA TECHNIQUE
Les cellules sont connues pour libérer des vésicules extracellulaires dans leur environnement, par exemple, in vivo, dans les fluides biologiques d'un organisme. Les vésicules extracellulaires ont été identifiées comme des moyens efficaces pour administrer des médicaments, de manière personnalisée ou ciblée, dans le corps humain. Elles présentent d'abord une biocompatibilité native et une tolérance immunitaire. Elles peuvent également comprendre des nanoparticules théranostiques, permettant à la fois d'imager certaines parties du corps et de délivrer des principes actifs ayant des fonctions thérapeutiques. Les vésicules extracellulaires ont également une fonction de communication intercellulaire : elles permettent, par exemple, de transporter des lipides, des protéines membranaires et cytoplasmiques et/ou des nucléotides du cytoplasme cellulaire, tels que des ARNm, des microARN ou des ARN longs non-codants, entre différentes cellules.
En particulier, l'utilisation de vésicules extracellulaires peut permettre de résoudre des problèmes connus lors de l'utilisation thérapeutique de cellules, tels que la réplication cellulaire, la différentiation, les occlusions vasculaires, les risques de rejet et les difficultés de stockage et congélation. Il existe en conséquent un besoin industriel pour la production de vésicules cellulaires en quantités suffisantes pour une utilisation thérapeutique, notamment en remplacement ou en complément de thérapies cellulaires.
A cet effet, Piffoux et al. (Piffoux, M. , Silva, A. K. , Lugagne, J. B., Hersen, P., Wilhelm, C, & Gazeau, F. , 2017, Extracellular Vesicle Production Loaded with Nanoparticies and Drugs in a Trade-off between Loading, Yield and Purity: Towards a Personalized Drug Delivery System, Advanced Biosystems) décrivent la comparaison de différentes méthodes de production de vésicules extracellulaires.
Une première méthode consiste à produire des vésicules extracellulaires à partir de cellules endothéliales de la veine du cordon ombilical (HUVEC), en soumettant ces cellules à des contraintes hydrodynamiques mimant les contraintes exercées dans des conditions physiologiques au sein des capillaires sanguins ou dans des conditions pathologiques lors de sténose des vaisseaux sanguins. Ces contraintes sont entraînées par le passage des cellules productrices dans des canaux microfluidiques, pendant quatre heures. Une puce microfluidique comprend deux cents canaux dans lesquels les cellules sont transportées dans un écoulement laminaire, pour produire des vésicules de manière parallélisée.
Toutefois, cette méthode présente des problèmes de dimensionnement : les quantités de vésicules produites par une puce microfluidique ne sont pas adaptées aux quantités requises pour les applications susmentionnées. De plus, le rendement de vésicules extracellulaires produites par cellule introduite dans une telle puce (environ 2.104 vésicules par cellule) est très inférieur au rendement théorique maximum de vésicules produites par une cellule, par exemple de l'ordre de 3,5.106 vésicules par cellule pour une cellule de type MSC (acronyme de cellule souche mésenchymateuse en anglais). Enfin, cette méthode nécessite une conformité aux normes dite G. M. P. (acronyme anglais de Bonnes Pratiques de Fabrication), nécessaires à la fabrication de médicaments. Une deuxième méthode couramment utilisée dans la littérature et décrite par Piffoux et al. consiste à cultiver des HUVEC dans un milieu de culture de type DMEM (acronyme anglais de Dulbecco' s Modified Eagle's Médium) sans sérum, pendant trois jours (technique dite de starvation en anglais, ou carence en sérum). L'absence de sérum entraîne un stress cellulaire déclenchant une libération de vésicules par les cellules productrices. Cette méthode présente un rendement plus élevé et permet de produire une plus grande quantité de vésicules que la méthode utilisant une puce microfluidique (environ 4.104 vésicules par cellule productrice). Toutefois, le rendement calculé correspond à une durée de production beaucoup plus longue que la durée de production de la méthode précédente. Cette méthode ne permet pas de produire une quantité de vésicules extracellulaires suffisante pour les applications susmentionnées. Enfin, cette méthode ne permet pas de produire des vésicules de manière continue car elle induit la mort des cellules.
Watson et al. (Watson, D. C, Bayik, D., Srivatsan, A. , Bergamaschi, C, Valentin, A., Niu, G. , ... & Jones, J. C , 2016, Efficient production and enhanced tumor delivery of engineered extracellular vesicles, Biomaterials, 105, 195-205) décrivent une méthode de production des vésicules permettant d'augmenter la quantité de vésicules produites. Cette méthode consiste à cultiver des cellules de type HEK293 dans des flasques de culture, puis dans des membranes à fibres creuses (Hollow Fiber Membrane en anglais). Le passage central des fibres creuses permet d'acheminer le milieu de culture aux cellules productrices. Les cellules productrices sont au préalable ensemencées autour de ce passage, où elles produisent des vésicules dans un espace inter-fibre. Le milieu liquide compris dans l'espace inter-fibre est collecté trois fois par semaine, permettant de produire environ 3.1012 vésicules en plusieurs semaines, pour des quantités de cellules ensemencées très grandes, par exemple de l'ordre de 5.108 cellules, entraînant un rendement d'environ 6000 vésicules extracellulaires par cellule et un ratio de pureté très bas (par exemple 1 ,09.109 particules par microgramme de protéines). Cette production n'est toutefois pas assez élevée et trop lente au regard des applications susmentionnées. De plus, cette méthode est décrite en utilisant des cellules productrices correspondant à une lignée cellulaire particulièrement résistante à la culture en milieu dépourvu en sérum : cette méthode peut ne pas être transposable à une production de vésicules par des cellules productrices telles que des cellules souches, par exemple humaines, moins résistantes et particulièrement appropriées aux applications thérapeutiques visées.
RESUME DE L'INVENTION
Un but de l'invention est de proposer une solution pour produire des vésicules extracellulaires en grande quantité à partir de cellules productrices, plus rapidement qu'avec les méthodes connues, dans des conditions conformes aux normes G. M. P. Un autre but de l'invention est de proposer une solution permettant d'augmenter le rendement du système de production de vésicules, c'est-à-dire le rapport entre le nombre de vésicules produites et le nombre de cellules productrices introduites dans le système de production. Un autre but de l'invention est de proposer un système adapté à produire des vésicules extracellulaires à partir d'une large gamme de cellules productrices adhérentes, quelle que soit la résistance du type de cellule introduite dans le système de production et résistante ou non à une carence en sérum. Un autre but de l'invention est de proposer une solution pour produire et récupérer des vésicules extracellulaires en continu. Enfin, un autre but de l'invention est de simplifier la structure du système fluidique pour la production de vésicules et de réduire son coût de fabrication.
En particulier, un objet de l'invention est un système fluidique de production de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant au moins un récipient, un milieu liquide contenu par le récipient et des cellules productrices, caractérisé en ce qu'il comprend également des microporteurs en suspension dans le milieu liquide, la majorité des cellules productrices étant adhérentes à la surface des microporteurs, et un agitateur de milieu liquide, l'agitateur et la forme et les dimensions du récipient étant adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient.
On comprend qu'avec un tel système, il est possible de produire des vésicules en grande quantité, et dans un système adapté aux normes G. M. P. On comprend également qu'un tel système est plus simple et moins coûteux à fabriquer que les systèmes connus pour produire des vésicules extracellulaires.
L'invention est avantageusement complétée par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- l'agitateur du milieu liquide et les dimensions du récipient sont adaptés à commander un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale 75 μιτι, et préférentiellement à 50 μητι ;
- le système fluidique comprend une sortie et une connectique reliée à la sortie, la connectique étant susceptible de comprendre du milieu liquide et des vésicules extracellulaires ;
- l'agitateur est un agitateur rotatif dont la ou les vitesses de rotation, la forme, la taille sont adaptés, avec la forme et les dimensions du récipient, à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide dans le récipient ;
- les microporteurs sont des microbilles, le diamètre des microbilles étant compris entre 100 μητι et 300 μητι ;
- le système fluidique comprend un séparateur de vésicules extracellulaires, relié fluidiquement au récipient de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient un milieu liquide appauvri en vésicules. Un autre objet de l'invention est un procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires à partir de cellules productrices, comprenant :
- une commande d'un agitateur entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide dans un récipient, le récipient comprenant une sortie, le milieu liquide comprenant des cellules productrices adhérentes sur la surface de microporteurs, les microporteurs étant en suspension dans le milieu liquide, et
- une collecte du milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires en sortie du récipient.
Le procédé est avantageusement complété par les caractéristiques suivantes, prises individuellement ou en l'une quelconque de leurs combinaisons techniquement possibles :
- on agite le milieu liquide pendant plus de trente minutes ;
- on commande l'agitateur pour entraîner un écoulement du milieu liquide, la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 75 μητι et préférentiellement à 50 μητι ;
- un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide collecté en sortie du récipient en vésicules extracellulaires, et on réintroduit la partie du milieu liquide dans le récipient.
L'invention a également pour objet des vésicules extracellulaires susceptibles d'être obtenus par le procédé de production de vésicules extracellulaires objet de l'invention.
L'invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant des vésicules extracellulaires susceptibles d'être obtenues par le procédé de production de vésicules extracellulaires objet de l'invention.
Avantageusement, la composition pharmaceutique comprenant des vésicules extracellulaires peut être utilisée en médecine régénérative. DEFINITIONS
Le terme « vésicule extracellulaire » désigne de manière générale une vésicule libérée de manière endogène par une cellule productrice, dont le diamètre est compris entre 30 nm et 5000 nm. Une vésicule extracellulaire correspond en particulier à un exosome et/ou une microvésicule et/ou un corps apoptotique cellulaire.
Les termes « microporteur » et « microsupport » désignent une matrice sphérique permettant la croissance de cellules productrices adhérentes à sa surface ou à l'intérieur et dont la taille maximum est comprise entre 50 μητι et 500 μιτι, et préférentiellement entre 100 μητι et 300 \irr . Les microporteurs sont généralement des billes dont la densité est choisie sensiblement proche de celle du milieu liquide de culture des cellules productrices. Ainsi, un mélange doux permet aux billes de rester en suspension dans le milieu liquide de culture.
PRESENTATION DES FIGURES
D'autres caractéristiques et avantages ressortiront encore de la description qui suit, laquelle est purement illustrative et non limitative, et doit être lue en regard des figures annexées, parmi lesquelles :
- la figure 1 illustre schématiquement un système fluidique pour la production de vésicules extracellulaires ;
- la figure 2 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules HUVEC dans un système fluidique pour différentes agitations ; - la figure 3 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules HUVEC dans un système fluidique pour différentes agitations ;
- la figure 4 illustre le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules MSC dans un système fluidique pour différentes agitations ;
- la figure 5 illustre l'influence de la longueur de Kolmogorov sur le nombre de vésicules extracellulaires produites par des cellules HUVEC et MSC ; - la figure 6 illustre des cellules productrices adhérentes sur la surface de microporteurs ;
- la figure 7 illustre des cellules productrices adhérentes sur la surface de microporteurs ;
- la figure 8 illustre le rendement de la production de vésicules extracellulaires pour différentes durées d'agitation, pour différentes cellules productrices et pour différentes conditions d'agitations ;
- la figure 9 illustre le rendement de la production de vésicules extracellulaires pour différentes cellules productrices, et pour différentes conditions d'agitations, après 240 minutes d'agitation en comparaison avec la méthode de privation de sérum pendant 72 h ;
- la figure 10 illustre la concentration de cellules productrices adhérentes sur les microporteurs avant et après agitation, pour différentes conditions d'agitation ;
- la figure 1 1 illustre le métabolisme des cellules productrices de type HUVEC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires ;
- la figure 12 illustre le métabolisme des cellules productrices de type HUVEC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires ;
- la figure 13 illustre le métabolisme des cellules productrices de type MSC murines dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV ;
- la figure 14 illustre le métabolisme des cellules productrices de type MSC murines dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires ;
- la figure 15 est une microphotographie en cryo-microscopie électronique de vésicules extracellulaires produites par un système fluidique ;
- la figure 16 illustre la distribution du diamètre de vésicules extracellulaires produites par le système fluidique ; - la figure 17 illustre la pureté en vésicules extracellulaires donnée par le rapport entre le nombre de particules et la masse de protéines, produites par le système fluidique dans le milieu liquide en comparaison avec la méthode de privation de sérum pendant 72 h ;
- la figure 18 illustre les propriétés pro-angiogéniques d'un milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique ;
- la figure 19 illustre les propriétés pro-angiogéniques d'un milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique, la méthode de privation de sérum ou la méthode de libération spontanée de vésicules ;
- la figure 20 illustre l'activité métabolique de cardiomyocytes (lignée H9C2) après une journée d'incubation dans des milieux de culture comprenant des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique ;
- la figure 21 illustre l'activité métabolique de cardiomyocytes (lignée H9C2) après deux journées d'incubation dans différents milieux de culture comprenant des vésicules extracellulaires produites par le système fluidique ;
- la figure 22 illustre l'effet dose d'une incubation d'un milieu de culture liquide comprenant une concentration variable de vésicules extracellulaires produites par un système fluidique sur la prolifération de cardiomyocytes ;
- la figure 23 illustre la prolifération de cardiomyocytes (lignée H9C2) après deux journées d'incubation en présence d'un milieu de culture liquide comprenant des vésicules extracellulaires ;
- la figure 24 illustre l'utilisation d'une composition de vésicules extracellulaires produites par le système fluidique comme composition pharmaceutique dans un gel de poloxamer pour le traitement des fistules entre le peux et le caecum chez le rat ;
- la figure 25 illustre l'utilisation d'une composition de vésicules extracellulaires produites par le système fluidique comme composition pharmaceutique dans un gel de poloxamer pour le traitement des fistules entre le peux et le caecum chez le rat.
La figure 26 illustre le profil protéomique de vésicules extracellulaires produites par la méthode selon l'invention comparé au profil de vésicules extracellulaires produites par les méthodes de production classique selon l'art antérieur.
DESCRITPION DETAI LLEE
Eléments théoriques
La longueur de Kolmogorov (ou dimension de Kolmogorov ou longueur d'eddy) est la longueur à partir de laquelle la viscosité d'un fluide permet de dissiper l'énergie cinétique d'un écoulement de ce fluide. En pratique, la longueur de Kolmogorov correspond à la taille des plus petits tourbillons dans un écoulement turbulent. Cette longueur LK est calculée dans la publication de Kolmogorov (Kolmogorov, A. N. , 1941 , January, The local structure of turbulence in incompressible viscous fluid for very large Reynolds numbers, In Dokl. Akad. Nauk, SSSR, Vol. 30, No. 4, pp. 301 -305) et décrite par la formule (1 ) suivante :
Lk = ν^. ε-1 4 (1 ) dans laquelle v est la viscosité cinématique du milieu liquide en écoulement et ε est l'énergie dissipée dans le fluide par unité de masse (ou taux d'injection d'énergie dans le fluide).
Zhou et al. (Zhou, G. , Kresta, S. M. , 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impellers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) décrivent la relation entre ε et la géométrie d'un récipient dans lequel un milieu liquide est agité par agitateur de type roue à aubes. Cette relation est donnée par la formule (2) suivante :
dans laquelle Np est le nombre de puissance (ou nombre de Newton) adimensionné de l'agitateur dans le milieu liquide, D est le diamètre de l'agitateur (en mètre), N est la vitesse de rotation (en nombre de tours par seconde) et V est le volume de milieu liquide (en mètre cube). Cette relation est utilisée pour le calcul de ε correspondant à la géométrie d'un récipient et d'un agitateur utilisés pour la mise en œuvre de l'invention. Le nombre de puissance Np est donné de manière connue par la formule (3) : dans laquelle P est la puissance apportée par l'agitateur, et p est la densité du milieu liquide. La formule (3) peut être ajustée comme décrit dans Nienow et al. (Nienow, A. W., & Miles, D., 1971 , Impeller power numbers in closed vessels, Industrial & Engineering Chemistry Process Design and Development, 10(1 ), 41 -43) ou Zhou et al. (Zhou, G., Kresta, S. M. , 1996, Impact of tank geometry on the maximum turbulence energy dissipation rate for impeliers, AlChE journal, 42(9), 2476-2490) en fonction du nombre de Reynolds de l'écoulement du milieu liquide. Il est également possible de calculer le nombre de Reynolds du système par la formule (4) suivante :
N.D2
Re = (4)
V
Architecture générale du système fluidique La figure 1 illustre schématiquement un système fluidique 1 pour la production de vésicules extracellulaires EV. Le système fluidique 1 de production de vésicules extracellulaires EV vise à la production en grande quantité de vésicules extracellulaires EV dans un récipient 4. Toutefois, l'invention n'est pas limitée à ce mode de réalisation et peut comprendre une série de récipients 4 reliés fluidiquement en parallèle ou en série.
Le récipient 4 contient un milieu liquide 5. Le récipient 4 peut être une cuve, une flasque, par exemple en verre ou en matière plastique, ou tout autre récipient adapté à contenir un milieu liquide 5. Le volume du récipient 4 est l'un des facteurs permettant de produire des vésicules extracellulaires EV en grande quantité : ce volume peut être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et préférentiellement entre 500 mL et 10 L. Le volume du récipient 4 illustré schématiquement dans la figure 1 est de 1 L. Le récipient 4 comprend typiquement une entrée gazeuse et une sortie gazeuse, par lesquels peut s'écouler une atmosphère comprenant des concentrations en 02 et en CO2 adaptées à la culture cellulaire, par exemple comprenant 5% de CO2. Cette atmosphère peut provenir d'un injecteur/mélangeur de gaz adapté ou d'une étuve à atmosphère contrôlée en CO2. Une deuxième pompe 17 permet de commander cet écoulement gazeux dans le récipient 4. Le récipient 4 comprend également une sortie 9 susceptible de comprendre du milieu liquide 5 et des vésicules extracellulaires EV. Cette sortie est complétée d'un moyen de séparation et/ou de filtration des microporteurs 3 permettant de ne pas récupérer des microporteurs 3 en dehors du récipient 4. Cette sortie 9 permet d'extraire hors du récipient 4 les vésicules extracellulaires EV produites. Le récipient 4 peut également comprendre au moins une entrée 8 adaptée à introduire le milieu liquide 5 dans le récipient 4. Le milieu liquide 5 peut être de manière générale une solution saline, par exemple isotonique. Préférentiellement, le milieu liquide 5 est un milieu liquide de culture avec ou adjonction de composés permettant la culture des cellules d'intérêt, ou un milieu complémenté en sérum préalablement purifié des vésicules extracellulaires ou un milieu sans sérum, permettant de ne pas contaminer les vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 par des protéines ou des d'autres vésicules provenant d'un sérum. Un milieu liquide 5 de type DMEM sans sérum peut être utilisé. Le volume maximum de milieu liquide 5 est déterminé en partie par le récipient 4. Ce volume maximum peut également être compris entre 50 mL et 500 L, préférentiellement entre 100 mL et 100 L, et plus préférentiellement entre 500 mL et 10 L. Le volume minimum de milieu liquide 5 contenu par la récipient 4 est en partie déterminé par le choix de l'agitateur 7 permettant d'agiter de milieu liquide 5.
Le système fluidique 1 comprend également des microporteurs 3 en suspension dans le milieu liquide 5. Les microporteurs 3 peuvent être des microbilles 14, par exemple en Dextran, chaque microbille 14 pouvant être recouverte d'une couche de collagène ou autre matériau nécessaire à la culture de cellules. D'autres matériaux peuvent être utilisés pour la fabrication des microporteurs 3, tels que le verre, le polystyrène, le polyacrylamide, le collagène et/ou l'alginate. De manière générale, l'ensemble des microporteurs adaptés pour la culture cellulaire est adapté à la production de vésicules extracellulaires EV. La densité des microporteurs 3 peut être par exemple légèrement supérieure à celle du milieu liquide 5. La densité des microbilles 14 en Dextran est par exemple de 1 ,04. Cette densité permet aux microbilles 14 d'être suspendues dans le milieu liquide 5 en agitant faiblement le milieu liquide 5, la traînée de chaque microporteur 3 dans le milieu liquide 5 étant dépendante de la densité du microporteur 3. La taille maximale des microporteurs 3 peut être comprise entre 50 μητι et 500 μιτι, préférentiellement entre 100 μητι et 300 Mm, et préférentiellement entre 130 μητι et 210 μητι. Les microporteurs 3 peuvent par exemple être des microbilles 1 de type Cytodex 1 (marque déposée). On peut réhydrater et stériliser une poudre formée par ces microbilles 1 avant utilisation. On peut utiliser 5g du PBS, puis dans un milieu de culture (par exemple du DMEM) sans sérum, à 4° C avant une utilisation.
Le système fluidique 1 comprend également des cellules productrices 6. Les vésicules extracellulaires EV sont produites par le système fluidique 1 à partir de ces cellules productrices 6. Les cellules productrices 6 peuvent être cultivées, avant la production de vésicules extracellulaires EV par le système fluidique 1 , sur la surface des microporteurs 3 dans un milieu de culture cellulaire adapté. Ainsi, aucun transfert de cellules n'est nécessaire entre la culture des cellules productrices 6 et la production des vésicules extracellulaires EV, ce qui permet d'éviter toute contamination et de simplifier le procédé dans son ensemble. La majorité des cellules productrices 6 sont adhérentes à la surface des microporteurs 3, même si une proportion minoritaire de cellules productrices 6 peuvent être décollées, par exemple par l'agitation du milieu liquide 5. Les autres cellules productrices sont alors et en suspension dans le milieu liquide 5 ou sédimentées au fond du récipient 4. De manière générale, tout type de cellules productrices 6 peut être utilisé, y compris des cellules productrices non adhérentes, et de préférence des cellules productrices 6 adhérentes. Les cellules productrices 6 peuvent être par exemple des cellules multipotentes, ou des cellules souches pluripotentes induites (IPS ou IPSCs, Induced Pluripotent Stem Cells en anglais). Elles peuvent être également des cellules génétiquement modifiées et/ou des lignées tumorales.
Le récipient 4 comprend également un agitateur 7 permettant d'agiter le milieu liquide 5. L'agitateur 7 peut être une roue à aubes, dont les aubes sont au moins en partie plongées dans le milieu liquide 5, et mise en mouvement par une transmission de forces magnétiques. L'agitateur 7 peut également être un système de perfusion de milieu liquide 5 à un débit suffisant pour agiter le milieu liquide 5 contenu par le récipient, ou un système à murs rotatifs (par exemple agencés sur des rouleaux). L'agitateur 7 et les dimensions du récipient 4 sont adaptés à commander un écoulement turbulent du milieu liquide 5 dans le récipient 4. Par écoulement turbulent, on entend un écoulement dont le nombre de Reynolds est supérieur à 2000. Le nombre de Reynolds peut par exemple être calculé par la formule (4). Préférentiellement, le nombre de Reynolds Re de l'écoulement de milieu liquide 5 est supérieur à 7 000, préférentiellement à 10 000 et préférentiellement à 12 000.
L'agitateur 7 utilisé dans les exemples de réalisation de l'invention comprend une roue à aube agencée dans un récipient 4 et mise en mouvement par un système de transmission de forces magnétiques. La vitesse de la roue à aube dans le milieu liquide 5 entraine un écoulement du milieu liquide 5. L'agitateur est adapté à commander un écoulement, qui, compte-tenu des dimensions du récipient 4, est turbulent. Dans le cas de l'agitateur 7 illustré en figure 1 , plusieurs paramètres permettent de calculer une valeur représentative de la turbulence du milieu liquide 5, en particulier la viscosité cinématique v du milieu liquide 5, les dimensions du récipient 4 et en particulier le volume V de milieu liquide 5 contenu dans le récipient 4, le nombre de puissance Np correspondant à la partie immergée de la roue à aube, le diamètre D de l'agitateur et en particulier de la roue, la vitesse N de rotation de la roue. L'utilisateur peut ainsi calculer, en fonction de ces paramètres, des valeurs représentatives de la turbulence de l'écoulement, et en particulier la longueur de Kolmogorov LK, telle que donnée par les équations (1 ), (2) et (3). En particulier, l'agitateur 7 est adapté à commander un écoulement dans lequel la longueur LK est inférieure ou égale à 75 μητι et préférentiellement à 50 m. Dans un exemple de réalisation du système fluidique 1 , la vitesse de rotation de l'agitateur 7 est susceptible d'être commandée à 100 rpm (rotations par minute), le diamètre d'une roue à aube est de 10,8 cm et le volume de milieu liquide contenu par le récipient 4 est de 400 mL. Le nombre de puissance N P mesuré de la roue à aube dans le milieu liquide 5, par la formule (3), est sensiblement égal à 3,2. L'énergie dissipée par unité de masse ε, calculée, par la formule (2), est égale à 5,44.10 1 J. kg 1. La longueur de Kolmogorov LK calculée par la formule (1 ) est ainsi égale à 41 , 8 μιτι.
Préparation des microporteurs et des cellules productrices
Le récipient 4 peut être à usage unique ou bien stérilisé avant toute introduction de milieu liquide 5, de microporteurs 3 et de cellules productrices 6. Les microporteurs 3, en l'occurrence des microbilles 14, sont également stérilisés. Les microbilles 14 sont incubées dans le milieu de culture des cellules productrices 6, comprenant du sérum, dans le récipient 4. Cette incubation permet d'oxygéner le milieu de culture et de recouvrir la surface des microbilles 14 d'une couche, au moins partielle, de protéines, favorisant l'adhésion des cellules productrices 6 à la surface des microbilles 14.
Les cellules productrices 6, avant d'être introduites dans le système fluidique 1 , sont mises en suspension au moyen d'un milieu comprenant de la trypsine. Elles peuvent être ensuite centrifugées à 300 G pendant cinq minutes pour être concentrées dans le culot d'un tube, de manière à remplacer le milieu comprenant de la trypsine par un milieu DMEM. Les cellules productrices 6 ensuite sont introduites dans le récipient 5, comprenant du milieu de culture et les microbilles 14, dans une quantité correspondant sensiblement à 5 à 20 cellules productrices 6 par microbille 14. Les cellules productrices 6 et les microbilles 14 sont ensuite agitées puis sédimentées, de manière à mettre en contact les microbilles 14 et les cellules productrices 6, et favoriser l'adhésion des cellules productrices 6 sur la surface des microbilles 14. L'agitation peut reprendre périodiquement, de manière à favoriser l'homogénéité de l'adhésion des cellules productrices 6 à la surface des microbilles 14, par exemple toutes les 45 minutes pendant 5 à 24 heures. La culture des cellules productrices est ensuite réalisée avec une faible agitation du milieu de culture (par exemple la rotation d'une roue à aube à une vitesse de 20 rpm), ainsi qu'un remplacement régulier du milieu de culture (par exemple un remplacement de 5% à 40% du milieu de culture chaque jour). Exemple de production des vésicules extracellulaires EV
Les vésicules extracellulaires EV sont produites dans un récipient 4 contenant un milieu liquide 5, par exemple sans sérum, des microporteurs 3 et des cellules productrices 6 adhérentes à la surface des microporteurs 3. Le milieu utilisé avant la production pour la culture des cellules productrices 6 sur les microporteurs 3 comprenant du sérum, on lave trois à quatre fois le récipient 4 avec du milieu liquide 5 DMEM sans sérum, chaque lavage correspondant par exemple à un volume d'environ 400 mL. On commande ensuite l'agitation du milieu liquide 5 par l'agitateur 7 de manière à entraîner un écoulement turbulent dans le récipient 4. L'agitation est préférentiellement réglée de manière à commander un écoulement du milieu liquide 5 dans lequel la longueur de Kolmogorov LK est inférieure ou égale à 75 μητι et préférentiellement à 50 μητι. L'agitation du milieu liquide 5 est commandée au moins pendant une demi-heure, préférentiellement pendant plus d'une heure, et préférentiellement pendant plus de deux heures. La production de vésicules extracellulaires EV peut être mesurée pendant la production. A cet effet, l'agitation peut être momentanément interrompue. On laisse sédimenter les microbilles 14 au fond du récipient 4, puis on prélève un échantillon de milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV. On réalise une centrifugation de l'échantillon à 2000 G pendant 10 minutes, de manière à éliminer les débris cellulaires. Le surnageant est analysé par une méthode de suivi individuel de particules (ou NTA, acronyme anglais de Nanoparticie Tracking Analysis) de manière à compter le nombre de vésicules extracellulaires EV et d'en déduire la concentration en vésicules extracellulaires EV des échantillons. On peut vérifier que la concentration en vésicules extracellulaires EV au début de l'agitation est proche de zéro ou négligeable.
Les vésicules extracellulaires EV produites peuvent également être observées et/ou comptées par cryo-microscopie électronique à transmission. A cet effet, une goutte de 2,7 μΙ_ de solution comprenant des vésicules extracellulaires EV est déposée sur une grille adaptée à la cryo- microscopie, puis plongée dans l'éthane liquide, entraînant une congélation quasi-instantanée de ladite goutte, évitant la formation de cristaux de glace. La grille supportant les vésicules extracellulaires EV est introduite dans le microscope et les vésicules extracellulaires EV sont observées à une température de l'ordre de -170°C.
Séparation des vésicules extracellulaires
Les vésicules extracellulaires EV produites dans le récipient 4 sont susceptibles d'être extraites du récipient 4 par la sortie 9 du récipient 4, suspendues dans du milieu liquide 5. Un filtre 18 peut être agencé à la sortie 9 de manière à filtrer les microporteurs 3 et les cellules productrices 6 adhérentes aux microporteurs 3 lors de l'extraction de vésicules extracellulaires EV du récipient 4. Une connectique 13 est fluidiquement reliée à la sortie 9, permettant le transport du milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV produites.
Le système fluidique 1 peut comprendre un séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV. Le séparateur 15 comprend une entrée du séparateur 10, dans laquelle le milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV issu du récipient 4 peut être acheminé de manière directe ou indirecte. Le séparateur 15 peut également comprendre une première sortie 1 1 du séparateur, par laquelle le milieu liquide 5 est susceptible de sortir du séparateur 15 avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus petite qu'en entrée 10 du séparateur 15, voire sensiblement nulle. Le séparateur 15 peut également comprendre une deuxième sortie 12 du séparateur 15, par laquelle le milieu liquide 5 est susceptible de sortir du séparateur 15 avec une concentration en vésicules extracellulaires EV plus élevée qu'en entrée 10 du séparateur 15.
De manière générale, le séparateur 15 de vésicules extracellulaires EV peut être relié fluidiquement au récipient 4 de manière à être susceptible de réintroduire un milieu liquide 5 appauvri en vésicules EV dans le récipient 4, par exemple par l'entrée 8 du récipient 4. Ainsi, la production et/ou l'extraction de vésicules extracellulaires EV peut être réalisée de manière continue, à volume de milieu liquide 5 sensiblement constant dans le récipient 4.
Dans l'exemple de réalisation d'un système fluidique 1 illustré dans la figure 1 , le milieu liquide 5 peut être extrait du récipient 4 par une première pompe 16, via une connectique 13, de manière à transporter le milieu liquide 5 dans un collecteur 19. Une autre première pompe 16 permet d'acheminer le milieu liquide 5 contenu dans le collecteur 19 à l'entrée 10 du séparateur 15, via une autre connectique. La première sortie 1 1 du séparateur 15 est reliée au récipient 4 via une connectique, de manière à réintroduire du milieu liquide 5 appauvri en vésicules extracellulaires EV dans le récipient 4. La deuxième sortie 12 du séparateur 15 est reliée au collecteur 19 via une connectique, de manière à enrichir le milieu liquide 5 contenu dans le collecteur 19 en vésicules extracellulaires EV. Dans une variante, l'entrée 10 du séparateur 15 peut être directement reliée à la sortie 9 du récipient 4 (ou par l'intermédiaire d'une première pompe 16). La première sortie 1 1 du séparateur 15 est reliée au récipient 4 et la deuxième sortie 12 du séparateur 15 est reliée au collecteur 19. Plusieurs séparateurs peuvent également être disposés en série pour faire varier le degré de séparation en vésicules extracellulaires EV dans le milieu liquide 5, et/ou en parallèle pour adapter le débit de milieu liquide 5 dans chaque séparateur 15 au débit d'une première pompe 16.
Influence de l'agitation sur la production des vésicules extracellulaires EV La figure 2 illustre le nombre de vésicules extracellulaires EV produites dans un système fluidique 1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur 7. L'ordonnée de gauche correspond aux nombres de vésicules extracellulaires EV produites dans le récipient 4. Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires EV pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur 7 dans le récipient 4. L'ordonnée de droite correspond à la longueur LK entraînée par l'agitateur 7 pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (1 ), (2) et (3). Les vésicules extracellulaires EV sont produites à partir de cellules productrices 6 de type HUVEC dans le récipient 4 en utilisant une concentration de 3 g.L"1 de microporteurs 3 dans 50 mL de milieu liquide 5 dans une flasque à agitation (spinner flask en anglais) de 100 ml. Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires EV est observable en commandant un écoulement de milieu liquide 5 dans lequel la longueur LK est égale à 35 μητι (production correspondant à la colonne 300 RPM) par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible dans lequel la longueur LK est égale à 75 μητι et préférentiellement à 50 μητι (production correspondant à la colonne 150 RPM). La figure 3 illustre le nombre de vésicules extracellulaires EV produites dans un système fluidique 1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur 7. Vingt millions de cellules productrices 6 de type HUVEC sont utilisées, en utilisant une concentration de 3 g.L 1 de microporteurs 3 dans 350 mL de milieu liquide 5 dans une spinner flask de 1000 ml. L'ordonnée de gauche correspond aux nombres de vésicules extracellulaires EV produits dans le récipient 4. Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires EV pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur 7 dans le récipient 4. L'ordonnée de droite correspond à la longueur entraînée pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (1 ), (2) et (3). Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires EV est observable en commandant un écoulement de milieu liquide 5 dans lequel la longueur U est inférieure à 40 μητι par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible (production correspondant aux colonnes 125 RPM, 150 RPM et 175 RPM).
La figure 4 illustre le nombre de vésicules extracellulaires EV produits dans un système fluidique 1 pour différentes agitations commandées par l'agitateur 7. Des cellules productrices 6 de type MSC (acronyme de cellule souche mésenchymateuse en anglais) sont utilisées, et les microporteurs 3 sont introduits à une concentration de 3 g.L1 dans 200 mL de milieu liquide 5 dans une spinner flask de 500 ml. L'ordonnée de gauche correspond aux nombres de vésicules extracellulaires EV produits dans le récipient 4. Chaque colonne correspond à une production de vésicules extracellulaires EV pour différentes vitesses de rotation de l'agitateur 7 dans le récipient 4. L'ordonnée de droite correspond à la longueur LK entraînée pendant la production de vésicules extracellulaires EV, calculée par les formules (1 ), (2) et (3). Une production significativement élevée de vésicules extracellulaires EV est observable en commandant un écoulement de milieu liquide 5 dans lequel la longueur LK est égale à 35 μητι (production correspondant à la colonne 175 RPM), par rapport à la production en vésicules extracellulaires EV dans des conditions d'agitation plus faible dans lequel la longueur LK est égale à 50 m.
La figure 5 illustre l'influence de la longueur de Kolmogorov LK sur le nombre de vésicules extracellulaires EV produites. La longueur LK est un paramètre d'échelle concernant la production des vésicules extracellulaires EV. Les carrés (a) correspondent aux productions de vésicules extracellulaires EV illustrées dans la figure 2 pour différentes longueurs , les losanges (b) correspondent aux productions de vésicules extracellulaires EV illustrées dans la figure 3 pour différentes longueurs U et les triangles (c) correspondent aux productions de vésicules extracellulaires EV illustrées dans la figure 4 pour différentes longueurs U. Une valeur caractéristique de U caractérisant le changement de pente de la production de vésicules extracellulaires EV en fonction de U peut être extraite du diagramme de la figure 5, sensiblement égale à U = 50 μητι. Ainsi, pour des valeurs de U inférieure ou égale à 50 μιτι, la production de vésicules extracellulaires EV augmente de manière significative.
La figure 6 illustre des cellules productrices 6 adhérentes sur la surface de microporteurs 3, en l'occurrence des microbilles 14, suspendus dans le milieu liquide 5, avant l'agitation correspondant à une production de vésicules extracellulaires EV. Des cellules productrices 6 adhérentes à la surface des microporteurs 3 sont visibles et quantifiables.
La figure 7 illustre des cellules productrices 6 adhérentes sur la surface de microporteurs 3, en l'occurrence des microbilles 14, suspendus dans le milieu liquide 5, après l'agitation correspondant à une production de vésicules extracellulaires EV. Des cellules productrices 6 adhérentes à la surface des microporteurs 3 sont visibles et quantifiables. La comparaison entre le nombre de cellules productrices adhérentes à la surface des microporteurs 3 avant et après l'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV permet de vérifier que les conditions d'agitation décrite précédemment, par exemple une agitation entraînant un écoulement dans lequel la longueur LK est inférieure à 75 μητι et préférentiellement à 50 \irr , n'entraînent pas le détachement des cellules productrices 6 des microporteurs 3. La figure 8 illustre le rendement de la production de vésicules extracellulaires EV pour différentes durées d'agitation, pour différentes cellules productrices, et pour différentes conditions d'agitations, correspondant à différentes longueurs U de l'écoulement commandé par l'agitateur 7. La courbe (a) illustre l'évolution, au cours de l'agitation, du rapport entre le nombre de particules produites (dont des vésicules extracellulaires EV) et entre le nombre de cellules productrices 6 introduites dans le récipient 4, les cellules productrices 6 étant de type MSC murines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 μητι. La courbe (b) illustre la même évolution, les cellules productrices 6 étant de type MSC humaines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 33 m. La courbe (c) illustre la même évolution, les cellules productrices 6 étant de type HUVEC, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 m. La courbe (d) illustre la même évolution, les cellules productrices 6 étant de type MSC humaines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 m. La courbe (e) illustre la même évolution, les cellules productrices étant de type HUVEC, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 Mm. La courbe (f) illustre la même évolution, les cellules productrices étant de type MSC murines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 Mm. La courbe (g) illustre la même évolution, les cellules productrices 6 étant de type MSC humaines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 ΜΠΓΙ. La courbe (h) illustre la même évolution, les cellules productrices étant de type MSC murines, et l'écoulement du milieu liquide 5 étant caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 53 ΜΠΓΙ. Ainsi, des vésicules extracellulaires EV sont produites à des rendement supérieurs à ceux connus, pour une durée de l'agitation supérieure à une demi-heure. La figure 9 illustre le rendement de la production de vésicules extracellulaires EV pour différentes cellules productrices 6, et pour différentes conditions d'agitations, après 240 minutes d'agitation. Les quatre colonnes de gauche illustrent le rendement de la production de vésicules extracellulaires EV en utilisant des cellules productrices 6 de type MSC murines. Le rendement de production pour trois conditions d'agitation, correspondant à une agitation entraînant une longueur LK de 50 μητι (première colonne), 47 μητι (deuxième colonne) et 35 μητι (troisième colonne) est comparé au rendement de production selon la méthode de carence en sérum (ou méthode de starvation ou sérum deprivation en anglais). Le rendement de production de vésicules extracellulaires EV dans les conditions LK = 47 μπ et LK = 35 μπ est significativement plus élevé que dans les conditions LK = 50 μητι et de carence en sérum. Trois colonnes illustrent le rendement de la production de vésicules extracellulaires EV en utilisant des cellules productrices 6 de type HUVEC. Le rendement de production pour deux conditions d'agitation, correspondant à une agitation entraînant une longueur LK de 50 μητι (quatrième colonne) et 47 μητι (cinquième colonne) est comparé au rendement de production selon la méthode de carence en sérum. Le rendement de production de vésicules extracellulaires EV dans la condition LK = 35 μητι est plus élevé que dans les conditions LK = 50 μπ et de carence en sérum. Les quatre colonnes les plus à droite de la figure illustrent le rendement de la production de vésicules extracellulaires EV en utilisant des cellules productrices 6 de type MSC humaines. Le rendement de production pour trois conditions d'agitation, correspondant à une agitation entraînant une longueur LK de 50 μητι (huitième colonne), 35 μητι (neuvième colonne) et 33 μητι (dixième colonne) est comparé au rendement de production selon la méthode de carence en sérum. Le rendement de production de vésicules extracellulaires EV dans les conditions LK = 35 μπ et LK = 33 μπ est significativement plus élevé que dans les conditions LK = 50 μητι et de carence en sérum. La figure 10 illustre la concentration de cellules productrices 6 adhérentes sur les microporteurs 3 avant et après agitation, pour différentes conditions d'agitation. Les colonnes (a) correspondent à la concentration des cellules productrices 6 avant une agitation (J0) pour la production de vésicules extracellulaires EV et une journée après l'agitation (J1 ), dans des conditions d'agitation dites « fortes », c'est-à-dire lorsqu'on commande l'agitateur 7 pour entraîner un écoulement caractérisé par une longueur LK = 35 μητι. Les colonnes (b) correspondent à la concentration des cellules productrices 6 avant une agitation (J0) pour la production de vésicules extracellulaires EV et une journée après l'agitation (J1 ), dans des conditions d'agitation dites « faibles », c'est-à-dire lorsqu'on commande l'agitateur 7 pour entraîner un écoulement caractérisé par une longueur LK = 50 μιτι. Aucune diminution significative de la concentration en cellules productrices 6 n'est observable après l'agitation du milieu liquide 5 pour la production de vésicules extracellulaires EV.
La figure 1 1 illustre l'activité métabolique des cellules productrices 6 de type HUVEC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV. L'agitation du milieu liquide 5 est commandé par un agitateur 7 en rotation à 75 RPM, dans une spinner flask de 1 L, entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 μιτι, pendant 240 minutes. Le métabolisme est mesuré en observant la variation de la longueur d'onde émise par le réactif Alamar blue dans le milieu liquide 5. Aucune baisse significative du métabolisme des cellules productrices 6 n'est observable dans ces conditions d'agitation.
La figure 12 illustre le métabolisme des cellules productrices 6 de type HUVEC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV. L'agitation du milieu liquide 5 est commandé par un agitateur 7 en rotation à 125 RPM dans une spinner flask de 1 L, entraînant un écoulement caractérisé par une longueur sensiblement égale à 35 μητι pendant 240 minutes. Le métabolisme est mesuré en observant la variation de la longueur d'onde émise par le réactif Alamar blue dans le milieu liquide 5. Une baisse, voire une disparition du métabolisme des cellules productrice 6 est observable au bout de 250 minutes d'agitation. Cette diminution du métabolisme cellulaire n'empêche cependant pas la production de vésicules extracellulaires EV au cours de l'agitation.
La figure 13 illustre le métabolisme des cellules productrices 6 de type MSC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV. L'agitation du milieu liquide 5 est commandé par un agitateur 7 en rotation à 75 RPM dans une spinner flask de 1 L, entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 μιτι, pendant 240 minutes. Le métabolisme est mesuré en observant la variation de longueur d'onde émise par le réactif Alamar blue dans le milieu liquide 5. Aucune baisse significative du métabolisme des cellules productrices 6 n'est observable dans ces conditions d'agitation.
La figure 14 illustre le métabolisme des cellules productrices 6 de type MSC dans des conditions d'agitation pour la production de vésicules extracellulaires EV. L'agitation du milieu liquide 5 est commandé par un agitateur 7 en rotation à 125 RPM dans une spinner flask de 1 L, entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 μητι pendant 240 minutes. Le métabolisme est mesuré en observant la variation de longueur d'onde émise par le réactif Alamar blue dans le milieu liquide 5. Aucune baisse significative du métabolisme des cellules productrices 6 n'est observable dans ces conditions d'agitation.
Ainsi, les conditions de faible agitation, correspondant à une agitation entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 \irr , permettent de réutiliser les cellules productrices 6 pour des productions de vésicules extracellulaires EV ultérieures.
La figure 1 5 est une microphotographie de vésicules extracellulaires EV produites par des cellules MSC murines par un système fluidique 1 . La barre d'échelle correspond à une longueur de 200 nm. La microphotographie est réalisée en utilisant la technique de cryo- microscopie électronique à transmission (cryo-TEM). La figure 16 illustre la distribution du diamètre des vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 mesurée par cryo TEM. La distribution (a) correspond à des vésicules extracellulaires EV produites par des cellules MSC murines avec une agitation entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 35 μητι (condition de forte agitation). La distribution (b) correspond à des vésicules extracellulaires EV produites avec une agitation entraînant un écoulement caractérisé par une longueur LK sensiblement égale à 50 μητι (condition de faible agitation). Le diamètre médian des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de faible agitation est supérieure au diamètre médian des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de forte agitation. La taille des vésicules extracellulaires EV peut être sensiblement comprise entre 30 et 500 nm.
La figure 17 illustre la pureté des vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 dans le milieu liquide 5 indiqués par le rapport entre le nombre de particules et la masse de protéines en microgramme. Lors de la production de vésicules extracellulaires EV, différentes entités peuvent être produites par les cellules productrices 6, en l'occurrence des vésicules extracellulaires EV mais aussi des agrégats de protéines. La quantification des particules par analyse du suivi individuel de particules (ou NTA pour Nanoparticle Tracking Analysis) ne permet pas de différencier ces différentes entités : aussi, il est avantageux de quantifier le rapport entre le nombre de particules mesurées par NTA et la masse de protéines produites, définissant la pureté en vésicules extracellulaires EV. Les colonnes (a) illustrée dans la figure 17 correspondent à une production de vésicules extracellulaires EV à partir de cellules productrices 6 de type MSC murines, et les colonnes (b) correspondent à une production de vésicules extracellulaires EV à partir de cellules productrices 6 de type MSC humaines. Les deux colonnes de gauche correspondent à une production de vésicules extracellulaires EV dans des conditions de forte agitation, et les deux colonnes de droite correspondent à une production de vésicules extracellulaires EV selon la méthode de carence en sérum. La pureté en vésicules extracellulaires EV du milieu obtenu après la production est comparable dans les deux méthodes. La figure 18 illustre les propriétés pro-angiogéniques d'un milieu liquide sans sérum 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par des cellules MSC murines par le système fluidique 1. Le panneau A de la figure 18 est une photographie d'une surface sur laquelle de cellules de type HUVEC sont adhérentes. Des cellules ont été enlevées d'une partie de la surface (zone sans cellules au milieu de la photographie). Cette photographie est prise au début d'une expérience, au temps t = 0 h, pendant de laquelle les cellules sont recouvertes d'un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1. Le panneau B de la figure 18 est une photographie de la même surface, après 4h d'incubation dans le milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV. Le panneau C de la figure 18 est une photographie de la même surface, après 9h d'incubation dans le milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV. Au cours de l'expérience, les cellules de types HUVEC recouvrent la partie de la surface sur laquelle aucune cellule n'est présente au début de l'expérience. Ainsi, le milieu liquide 5 comprenant les vésicules extracellulaires EV présente des propriétés pro-angiogéniques et/ou pro-prolifératives.
La figure 19 illustre les propriétés pro-angiogéniques d'un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par des cellules MSC murines par le système fluidique 1 dans différentes conditions. Chaque colonne illustre le pourcentage normalisé de fermeture des berges entre 0 h (correspondant au panneau A de la figure 18) et 9 h (correspondant au panneau C de la figure 18) pour chaque condition d'incubation. La première colonne (« milieu complet ») correspond à une incubation dans un milieu de culture des cellules HUVEC (correspondant à un contrôle positif). La deuxième colonne (« ctrl neg ») correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 (milieu de culture) sans vésicules extracellulaires EV, sans sérum où un volume donné de PBS a été ajouté. La troisième colonne (« forte agitation 10/ 1 ») correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 de culture où le même volume donné de PBS a été ajouté comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de forte agitation, dans lequel la quantité de cellules productrices 6 introduites correspond à 10 cellules productrices 6 MSC murines pour une cellule HUVEC réceptrice. La quatrième colonne (« faible agitation 10/ 1 ») correspond à une incubation dans un milieu 5 de culture où le même volume donné de PBS a été ajouté comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de faible agitation, dans lequel la quantité de cellules productrices 6 introduites correspond à 10 cellules productrices 6 MSC murines pour une cellule HUVEC réceptrice La cinquième colonne (« lib 10/ 1 ») correspond à une incubation dans un milieu de culture des cellules HUVEC, dépiété en exosomes, la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule HUVEC réceptrice. La sixième colonne (« stress 10/ 1 ») correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 de culture où le même volume donné de PBS a été ajouté comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par carence en sérum, la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 MSC murines pour une cellule HUVEC réceptrice. Une incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de forte agitation (« forte agitation 10/ 1 ») permet de recouvrir significativement la partie initialement dépourvue de cellules.
La figure 20 illustre la prolifération de cardiomyocytes après une journée d'incubation dans différents milieux liquides, mesurée par du bleu de alamar compris dans le milieu d'incubation. La première colonne correspond à une incubation dans un milieu adapté à la culture des cardiomyocytes H9C2 (« milieu complet », contrôle positif). La deuxième colonne correspond à une incubation dans du PBS. La troisième colonne correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de forte agitation (« forte agitation 10/ 1 »), la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule réceptrice. La quatrième colonne correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de faible agitation (« faible agitation 10/ 1 »), la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule réceptrice. La cinquième colonne correspond à une incubation dans un milieu de culture des cardiomyocytes, dépiété en exosomes (« lib 10/ 1 »), la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule réceptrice. La sixième colonne correspond à une incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par une méthode de production dans un milieu sans sérum « stress », la quantité de cellules productrices 6 introduites correspondant à 10 cellules productrices 6 pour une cellule réceptrice. Les conditions d'incubation dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites dans un système fluidique 1 dans des conditions de forte agitation et/ou de faible agitation entraînent une prolifération significativement plus élevée des cardiomyocytes par rapport aux conditions d'incubation dans du PBS, et dans les conditions « exo » et « stress ».
La figure 21 illustre la prolifération de cardiomyocytes H9C2 après deux journées d'incubation. Les cardiomyocytes incubés dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites à partir de cellules productrices 6 de type MSC murines par un système fluidique 1 dans des conditions de faible agitation, dans des conditions de forte agitation, ainsi que par libération spontanée dans un milieu complet dépiété en exosomes, prolifèrent significativement plus que des cardiomyocytes incubés dans un milieu présentant une carence en sérum. Les cardiomyocytes incubés dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de faible agitation et dans des conditions de forte agitation prolifèrent significativement plus que des cardiomyocytes incubés dans un milieu présentant une carence en sérum.
La figure 22 illustre l'effet dose sur la prolifération de cardiomyocytes H9C2 d'une incubation d'un milieu liquide 5 comprenant une concentration variable de vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 . L'activité métabolique des cardiomyocytes est mesurée après deux jours d'incubation dans un milieu liquide par bleu de alamar. Le métabolisme des cardiomyocytes est mesuré pour trois conditions d'incubation : dans un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV produites dans des conditions de faible agitation en (a), dans des conditions de faible agitation en (b) et dans un milieu liquide présentant une carence en sérum en (c). La mesure du métabolisme des cardiomyocytes est réalisée, dans les courbes (a) et (b), pour différents rapports entre la concentration de vésicules extracellulaires EV et la concentration de cardiomyocytes, affichés en abscisse. La courbe (a) illustre l'effet dose de la prolifération en présence de vésicules extracellulaires EV : le métabolisme des cardiomyocytes croît lorsque le rapport des concentrations entre vésicules extracellulaires EV et cardiomyocytes croît.
La figure 23 illustre la prolifération de cardiomyocytes après deux journées d'incubation en présence d'un milieu liquide 5 comprenant des vésicules extracellulaires EV des cellules MSC murines à une concentration de 100 000 vésicules extracellulaires EV par cardiomyocyte. La prolifération des cardiomyocytes après deux jours est significativement plus élevée quand le milieu liquide 5 d'incubation comprend des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 dans des conditions de forte agitation ou de faible agitation, par rapport à un milieu liquide comprenant des vésicules extracellulaires EV obtenues par carence en sérum et/ou à un milieu de culture des cardiomyocytes contenant des vésicules extracellulaires EV obtenues libération spontanée dans un milieu complet dépiété en exosomes.
La figure 24 illustre l'utilisation d'une composition de vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 comme composition pharmaceutique. Une caecostomie est réalisée sur chaque rat d'un groupe de rats. La présence d'excréments est observée à l'orifice d'une fistule formée par la caecostomie, dans trois conditions : une condition de contrôle, une condition correspondant à un traitement par l'application d'un gel comprenant du poloxamère 407 sur l'orifice de la fistule de chaque souris (« gel ») et une condition correspondant à l'application de ce gel comprenant des vésicules extracellulaires EV produites par un système fluidique 1 selon un procédé objet de l'invention, par exemple dans des conditions de forte agitation (« gel + vésicules »). Les colonnes en gris clair correspondent aux orifices de fistules présentant des excréments et les colonnes en gris foncé correspondent aux orifices de fistules ne présentant pas d'excréments. L'application d'un gel comprenant des vésicules extracellulaires EV permet de diminuer significativement la présence d'excréments à l'orifice de la fistule dans ces conditions et entraîne une diminution des cas de fistules productives (qui libèrent des sécrétions intestinales) par rapports aux groupes contrôle et gel sans vésicules. Ainsi, la composition de vésicules extracellulaires EV produite par le système fluidique 1 peut être utilisée en médecine régénérative.
La figure 25 illustre l'utilisation d'une composition de vésicules extracellulaires EV produites par le système fluidique 1 comme composition pharmaceutique. Un score est calculé à partir des observations présentées dans la figure 24. Un score égal à 1 est attribué lorsque l'orifice d'une fistule présente des excréments et un score égale à zéro est attribué lorsque l'orifice d'une fistule ne présente pas d'excréments. La figure 25 illustre le score moyen, pour l'ensemble des caecostomies et pour chacune des conditions : contrôle, « gel » et « gel + vésicules ». L'application d'un gel comprenant des vésicules extracellulaires EV entraîne une diminution du score moyen de productivité des fistules par rapports aux groupes contrôle et gel sans vésicules et permet de diminuer significativement la présence d'excréments à l'orifice de la fistule dans ces conditions. Ainsi, la composition de vésicules extracellulaires EV produite par le système fluidique 1 peut être utilisée en médecine régénérative.
La figure 26 illustre le profil protéomique de vésicules extracellulaires produites par la méthode selon l'invention comparé aux vésicules extracellulaires produites par les méthodes de production classiques selon l'art antérieur, plus particulièrement le profil protéomique de marqueurs classiquement utilisés pour caractériser les vésicules extracellulaires. Le profil proteomique des vésicules extracellulaires obtenu par quatre méthodes de production différente ont été comparé. Une méthode de production en flasque par privation de sérum pendant une durée de 72 heures (2D), une méthode de production en bioréacteurs par privation de sérum pendant une durée de 72 heures (3D), une méthode de production en bioréacteur à moyenne vitesse caractérisé par une longueur de Kolmogorov égale à 50 μητι pendant une durée de 4 heures (MS) et une méthode de production en bioréacteur à haute vitesse caractérisé par une longueur de Kolmogorov égale à 35 μητι pendant une durée de 4 heures (HS).
La présence de marqueurs biologiques classiquement utilisés pour caractériser les vésicules extracellulaires est ainsi observée. La présence et la quantité des marqueurs communs (CD63, CD9, CD81 , lamp2 et TSG101 ) entre les vésicules extracellulaires produites selon la méthode de l'invention ou les méthodes de production classiques sont similaires.
En conclusion, les vésicules extracellulaires produites par la méthode selon l'invention ont un profil protéomique similaire aux vésicules extracellulaires produites par les méthodes de l'art antérieur. S'entend comme profil protéomique similaire, un profil protéomique caractérisé par la présence et la quantité de marqueurs classiquement utilisés pour caractériser des vésicules extracellulaires.

Claims

REVENDICATIONS
1. Système fluidique (1 ) de production de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), comprenant au moins un récipient (4), un milieu liquide (5) contenu par le récipient (4) et des cellules productrices (6), caractérisé en ce qu'il comprend également des microporteurs (3) en suspension dans le milieu liquide (5), la majorité des cellules productrices (6) étant adhérentes à la surface des microporteurs (3), et un agitateur (7) de milieu liquide (5), l'agitateur (7) et la forme et les dimensions du récipient (4) étant adaptés à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient (4).
2. Système fluidique (1 ) selon la revendication 1 , dans lequel l'agitateur (7) du milieu liquide (5) et les dimensions du récipient (4) sont adaptés à commander un écoulement du milieu liquide (4), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 75 m.
3. Système fluidique (1 ) selon la revendication 1 ou 2, comprenant une sortie (9) et une connectique (13) reliée à la sortie (9), la connectique (13) étant susceptible de comprendre du milieu liquide (5) et des vésicules extracellulaires (EV).
4. Système fluidique (1 ) selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel un agitateur (7) de milieu liquide est un agitateur rotatif dont la ou les vitesses de rotation, la forme et la taille sont adaptées, avec la forme et les dimensions du récipient (4), à la génération d'un écoulement turbulent du milieu liquide (5) dans le récipient.
5. Système fluidique (1 ) selon l'une des revendications 1 à 4 dans lequel les microporteurs (3) sont des microbilles (14), le diamètre des microbilles (14) étant compris entre 100 μητι et 300 μητι.
6. Système fluidique (1 ) selon l'une des revendications 1 à 5 comprenant un séparateur (15) de vésicules extracellulaires (EV), relié fluidiquement au récipient (4) de manière à être susceptible de réintroduire dans le récipient (4) un milieu liquide (5) appauvri en vésicules extracellulaires (EV).
7. Procédé de production ex vivo de vésicules extracellulaires (EV) à partir de cellules productrices (6), dans lequel :
· on commande d'un agitateur (7) entraînant un écoulement turbulent d'un milieu liquide (5) dans un récipient (4), le récipient comprenant une sortie (9), le milieu liquide (5) comprenant des cellules productrices (6) adhérentes sur la surface de microporteurs (3), les microporteurs (3) étant en suspension dans le milieu liquide (5), et
· on collecte du milieu liquide (5) comprenant des vésicules extracellulaires (EV) en sortie (9) du récipient (4).
8. Procédé selon la revendication 7 dans lequel on agite le milieu liquide (5) pendant plus de trente minutes.
9. Procédé selon la revendication 7 ou 8, dans lequel on commande l'agitateur (7) pour entraîner un écoulement du milieu liquide (5), la longueur de Kolmogorov de l'écoulement étant inférieure ou égale à 75 μιτι, préférentiellement inférieure ou égale à 75 m.
10. Procédé selon l'une des revendications 7 à 9 dans lequel un séparateur appauvrit une partie du milieu liquide (5) collecté en sortie du récipient (4) en vésicule extracellulaire (EV), et dans lequel on réintroduit la partie du milieu liquide (5) dans le récipient (4).
1 1 . Vésicules extracellulaires (EV) susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une des revendications 7 à 10.
12. Composition pharmaceutique comprenant des vésicules extracellulaires (EV) selon la revendication 1 1 .
13. Composition pharmaceutique selon la revendication 12, pour son utilisation en médecine régénérative.
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