EP3615654A1 - Dispositif de culture microbiologique comprenant un feuillet d'hydrogel polysaccharidique deshydrate - Google Patents

Dispositif de culture microbiologique comprenant un feuillet d'hydrogel polysaccharidique deshydrate

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Publication number
EP3615654A1
EP3615654A1 EP18728205.8A EP18728205A EP3615654A1 EP 3615654 A1 EP3615654 A1 EP 3615654A1 EP 18728205 A EP18728205 A EP 18728205A EP 3615654 A1 EP3615654 A1 EP 3615654A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
dehydrated
culture device
microbiological culture
hydrogel
polysaccharide hydrogel
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP18728205.8A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Marie-Pierre MONTET
Christine ROZAND
Jean-Pierre Flandrois
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Biomerieux SA
Original Assignee
Biomerieux SA
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Filing date
Publication date
Application filed by Biomerieux SA filed Critical Biomerieux SA
Publication of EP3615654A1 publication Critical patent/EP3615654A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M33/00—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus
    • C12M33/02—Means for introduction, transport, positioning, extraction, harvesting, peeling or sampling of biological material in or from the apparatus by impregnation, e.g. using swabs or loops
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/0006—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid
    • C08B37/0024—Homoglycans, i.e. polysaccharides having a main chain consisting of one single sugar, e.g. colominic acid beta-D-Glucans; (beta-1,3)-D-Glucans, e.g. paramylon, coriolan, sclerotan, pachyman, callose, scleroglucan, schizophyllan, laminaran, lentinan or curdlan; (beta-1,6)-D-Glucans, e.g. pustulan; (beta-1,4)-D-Glucans; (beta-1,3)(beta-1,4)-D-Glucans, e.g. lichenan; Derivatives thereof
    • C08B37/0033—Xanthan, i.e. D-glucose, D-mannose and D-glucuronic acid units, saubstituted with acetate and pyruvate, with a main chain of (beta-1,4)-D-glucose units; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08B—POLYSACCHARIDES; DERIVATIVES THEREOF
    • C08B37/00—Preparation of polysaccharides not provided for in groups C08B1/00 - C08B35/00; Derivatives thereof
    • C08B37/006—Heteroglycans, i.e. polysaccharides having more than one sugar residue in the main chain in either alternating or less regular sequence; Gellans; Succinoglycans; Arabinogalactans; Tragacanth or gum tragacanth or traganth from Astragalus; Gum Karaya from Sterculia urens; Gum Ghatti from Anogeissus latifolia; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M1/00—Apparatus for enzymology or microbiology
    • C12M1/16—Apparatus for enzymology or microbiology containing, or adapted to contain, solid media
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements

Definitions

  • the present invention belongs to the field of microbiology and culture of microorganisms on solid and semi-solid media. It relates more specifically to alternative solutions proposed to traditional agar culture media, intended in particular for culturing, detecting and / or identifying microorganisms present in a sample to be analyzed.
  • solid and semi-solid culture media more commonly referred to as agar or agar media nutritious - are valuable tools for the detection and study of potentially pathogenic and / or infectious microorganisms.
  • microorganism isolation techniques on agar medium, which are still widely used today in many microbiological analysis methods, given their great simplicity of execution. These are mainly techniques of isolation, exhaustion or the technique of dials.
  • isolation techniques on agar medium consist in dispersing, on the surface of the solid culture medium, the cells of a biological sample deposit to be analyzed. This dispersion is performed, for example, thanks to mechanical means / tools that are slid on the surface of the culture medium along a particular path. AT the outcome of this dispersion process, the cells arriving at the end of the spreading course are found individualized, separated from each other. Each of these individualized cells then develops to form ultimately a colony of pure culture, that is to say a cell cluster containing microorganisms, all genetically identical. Each colony can then be the subject of a morphological analysis (examination of the shape of the colony, its elevation, the regularity of the edges ...), directly on this same culture medium or on other environments. These cells may also be collected for conservation purposes and / or for subsequent complementary analyzes.
  • gelled / solidified culture media In addition to providing microorganisms with a support adapted to their growth and development, gelled / solidified culture media, conventionally based on agar, have the advantage of being able to present levels of hardness and surface conditions that make them perfectly adapted to cell isolation and spreading operations, and in particular to the pressure and friction forces exerted by the tools and instrumentations developed for this purpose (see, for example, EP 0 242 114, WO 2005/071055) .
  • Agar culture media however, have some major disadvantages. As such, we note a preparation, which when it is artisanal, requires time (at least one hour) and many operations (weighing ingredients, dissolutions, autoclaving, pouring, distribution in Petri dishes). Also, as is the case for liquid culture media, these solid or semi-solid media are extremely sensitive to any form of biological contamination. Finally, because of the great difficulty in ensuring sterility, "artisanal" agar media must be prepared extemporaneously or almost extemporaneously.
  • Petrifilm TM industrial microbiological culture devices
  • EP 0 070 310, EP 0 620 844 or EP 0 832 180 are formed of two waterproof films affixed to one another. At the interface, the inner face of each of the two films is covered with an adhesive composition for adhering a thin layer of powder (s) water soluble (s) cold.
  • one of the inner faces of the films is covered with a first powder, which corresponds to a dehydrated and micronized culture medium composition.
  • the other internal face is in turn covered with a second powder, which corresponds to a gelling agent (such as guar gum and / or xanthan gum) micronized.
  • a gelling agent such as guar gum and / or xanthan gum
  • the two inner faces are coated with the same powder, formed by a mixture of a dehydrated and micronized culture medium composition, and a micronized gelling agent.
  • Petrifilm TM devices are intended for the detection and / or enumeration of microorganisms present in a sample to be analyzed.
  • the culture device is opened by lifting the upper film, transparent.
  • the upper film is repositioned on the lower film.
  • the gelling agent forms a hydrogel with a high water content, having a gelatinous and viscous appearance, coming to swallow the cells present in the sample to be analyzed.
  • This same water present in the sample to be analyzed also makes it possible to solubilize and activate the culture medium.
  • the microbiological culture device is finally incubated at the temperature and for the prescribed time before reading the results.
  • Petrifilm TM devices if they effectively allow a good fixation of the cells, the hydrogel formed creates a surface, very gelatinous and viscous not suitable for operations of isolation and / or spreading cells as it could be done on an agar culture medium, and moreover is not compatible with the tools and instrumentations developed for this purpose (see, for example, EP 0 242 114, WO 2005/071055).
  • Compact Dry cultivation devices developed by the company NISSUI PHARMACEUTICAL (Japan), whose microbiological culture support is formed by a sheet of absorbent fibrous material, incorporating in its mass a dehydrated nutritive composition, optionally also selective, and / or or discriminant (see, for example, EP 1 179 586).
  • an alcoholic suspension is prepared by mixing, in ethanol, a composition of culture medium, an adhesive dissolved in both water and ethanol (e.g. ethylene] and hydroxypropylcellulose) and a water-soluble but ethanol-insoluble gelling agent (eg, locust bean gum, guar gum, carrageenan, hydroxyethylcellulose).
  • a composition of culture medium e.g. ethylene] and hydroxypropylcellulose
  • a water-soluble but ethanol-insoluble gelling agent eg, locust bean gum, guar gum, carrageenan, hydroxyethylcellulose.
  • Compact Dry TM devices are intended for the detection and / or enumeration of microorganisms present in a sample to be analyzed.
  • a volume of sample to be analyzed (liquid or previously made liquid) of a high fluidity, possibly previously diluted, is seeded with a pipette on the culture medium covering a maximum area.
  • the culture device is then incubated for the prescribed time and temperature, before reading the results.
  • This type of culture medium does not lend itself to isolation techniques implemented by spreading ⁇ samples to be analyzed. Indeed, because of their fibrous nature, these culture media have an irregular surface, with numerous asperities that hinder the continuous and regular sliding tools and instruments usually used to spread and disperse the cells on the surface of an agar medium classic. Also, the cells tend to develop in depth in the thickness of the porous support, which can make it difficult to visualize / identify the colonies formed.
  • microbiological culture devices ready for use, dedicated to the detection, identification and / or enumeration of microorganisms. These devices are also based on a culture support of fibrous and absorbent material, incorporating in its thickness a culture medium composition. The incorporation of the dehydrated culture medium composition into the thickness of the culture support is carried out by a dry impregnation technique. As for Compact Dry TM devices, because of their fibrous nature, these culture media have an irregular surface with many asperities; these devices are therefore not compatible with the techniques and tools developed so far for the isolation and spreading of cells on the surface of a conventional agar medium.
  • the cells grow deep in the thickness of the porous support.
  • Applicant proposes to cover this fibrous surface with a surface layer able to perfect the surface state.
  • a pore (micro) filtration membrane that is sufficiently narrow to prevent the cells from diffusing towards the underlying layers, and at the same time to form a relatively smooth rendering surface.
  • Said (micro) filtration membrane can be made based on one or more materials chosen from latex, polytetrafluoroethylene, poly (vinylidene) fluoride, polycarbonate, polystyrene, polyamide, polysulfone, polyethersulfone, cellulose, nitrocellulose.
  • a covering by a porous layer of composition comprising a mixture of kaolin pigments, talc, titanium dioxide, and / or calcium carbonate, and a binder of styrene butadiene latex type, acrylic styrene latex or carboxyl methyl cellulose.
  • the object of the present invention is therefore to propose a microbiological culture device which, while offering a long shelf life, including at room temperature, provides a real alternative to traditional agar culture media, both in terms of fertility and on the compatibility with the mechanical operations of spreading and dispersion of the cells.
  • Another objective of the present invention is to be able to propose a microbiological culture device that is compatible with the constraints of an industrial and commercial exploitation, particularly in terms of production cost and profitability.
  • the present invention aims at providing a microbiological culture device of design and manufacturing adapted to the facilities and means of production currently used in the industry of media and microbiological culture devices.
  • the present invention therefore proposes a microbiological culture device comprising:
  • a piece of absorbent material having an upper face at least substantially flat and incorporating in its thickness a dehydrated culture medium composition (dry or dried),
  • a polysaccharide hydrogel sheet dehydrated and rehydratable at room temperature in particular at temperatures between 5 ° C and 40 ° C; said dehydrated hydrogel sheet being affixed directly to the upper face of said piece of absorbent material, or indirectly through a permeable interlayable membrane.
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet has been previously prepared by dehydrating a hydrogel layer of water-based composition and at least one polysaccharide gelling agent. This dehydrated hydrogel sheet has the particularity of being rehydratable at room temperature.
  • hydrogel properties by simple absorption of an aqueous composition, without requiring any additional heat treatment and while retaining characteristics of shape, texture, hardness / rigidity and surface state very close to those a polysaccharide hydrogel slip constituting a microbiological culture device according to the invention would show if it had not been dehydrated after pouring (or after display / coating) but simply hardened.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel film restores a monoblock hydrogel layer, having a consistency and hardness / rigidity very comparable to those of a traditional agar culture medium ready to use.
  • said one-piece hydrogel layer has a hardness of between 500 and 2000 g. cm "2 , preferably between 700 and 1400 g cm -2 .
  • the hardness of said hydrogel layer can be measured by means of a texture analyzer, for example of the TA.XT plus type from STABLE MICRO SYSTEMS LTD (Great Britain).
  • a microbiological culture device In use, a microbiological culture device according to the invention must be hydrated to be activated. To do this, the piece of absorbent material is soaked with a quantity of water or an aqueous composition. The culture medium composition, initially present in a dry state, is thus solubilized and activated. In contact with the piece of absorbent material, or through a permeable interlayable membrane, the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet rehydrates in turn, almost instantaneously and at room temperature. By rehydrating liquid from the absorbent material part, the hydrogel sheet regains flexibility and provides a thin layer of one-piece hydrogel (or hydrogel film) soaked with a solubilized and activated culture medium composition.
  • Seeding of the sample to be analyzed on the polysaccharide hydrogel slip can be performed both before and after rehydration of the latter.
  • the surface of the polysaccharide hydrogel film, before or after rehydration, is sufficiently smooth and rigid / hard to lend itself to cell isolation and spreading operations, and in particular to withstand the pressure and friction forces exerted by the tools and instrumentations developed for this purpose.
  • the polysaccharide hydrogel layer provides the surface of the microbiological culture device with a lubricating effect which facilitates the mechanical operations of spreading and dispersing the cells. Also, by its consistency agar, it promotes the implantation of microorganisms closer to the nutritive ingredients and active agents of the culture medium. As for the piece of absorbent material, in addition to its role in the preservation and distribution of the composition of medium its structure contributes to the rigidity and overall firmness of the surface of the microbiological culture device, ensuring its compatibility with regard to the pressure and friction forces exerted by the tools and instrumentations used to spread and disperse the cells .
  • culture medium refers to a nutrient composition allowing the growth and development of cells, more particularly bacteria, molds and / or yeasts. These media can meet the nutritional needs of microorganisms to grow. Schematically, we find in their composition:
  • At least one carbohydrate as a carbon source and energy
  • nutrients in particular, amino acids, growth factors, vitamins, minerals, trace elements, iron salts, sodium citrate, sodium chloride, etc.
  • chemically complex compositions such as mixtures of peptones (milk, meat and / or potato starch, corn ...), yeast extracts, serum, and / or animal or vegetable tissue extracts.
  • a culture medium within the meaning of the present invention may optionally demonstrate a certain selectivity with regard to target microorganisms, that is to say that it promotes the development of these target microorganisms rather than that of the annex flora, and / or that it inhibits and / or slows the development of the annex flora.
  • This selective effect can in particular be obtained through the use of agents with an inhibitory effect for the subsidiary flora or of agents with an activating effect for the target microorganisms.
  • a culture medium within the meaning of the present invention can possibly demonstrate discriminating abilities that make it possible to differentiate and visually distinguish the different categories of microorganisms growing on the same culture medium.
  • the culture medium advantageously incorporates a chromogenic and / or fluorogenic component allowing a visual observation of the microorganisms in function of particular metabolic activities that they express.
  • composition and formulation of many culture media are described in particular in HANDBOOK OF MICROBIOLOGICAL MEDIA (2010; 4th Edition).
  • sample refers to a sample taken for analysis or a small or small portion of that sample.
  • the invention more specifically relates to biological samples containing or suspected of containing microorganisms to be detected and / or analyzed.
  • biological samples can be of human, animal, plant or environmental origin. They can also have an industrial origin and come from withdrawals operated on a manufactured product or a product in the course of manufacture, or on instruments, installations encountered in an industrial environment.
  • the industrial sectors targeted here are more particularly the agro-food, pharmaceutical, cosmetic and veterinary industries, medical devices, microbiology of environmental controls (water, air, surfaces).
  • microorganisms and “cells” are used here equivalently and refer to bacteria, yeasts, molds and / or amoebae.
  • isolation / spreading means / tools means mechanical instruments suitable for use in the implementation of isolation techniques (for example, the technique of exhaustion, the technique of striations or dials), spreading techniques or cell layering techniques (for example, for cell counting or antibiotic susceptibility testing), such as those commonly used on traditional agar culture media.
  • These mechanical instruments used manually or in an automated manner, make it possible to produce one or more point deposits of microorganisms on the surface of the culture medium, and by sliding on this surface, they spread out the cells.
  • the proposed microbiological culture device is essentially formed of the combination between a piece of absorbent material incorporating in its thickness a composition of dehydrated culture medium, and a sheet of dehydrated polysaccharide hydrogel, having the ability to rehydrate at temperature room.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet covers all or part of the upper face of the piece of absorbent material.
  • the absorbent material part which composes the inner / deep layer of the microbiological culture device according to the invention and serves as a reservoir for a composition of dehydrated culture medium
  • its structure, its design and its dimensions are largely described or suggested by EP 1 179 586, WO 2015/104501, WO 2014/013089, WO 2015/107228.
  • said piece of absorbent material is made from a nonwoven short fiber substrate, constituting an assembly having a structural integrity and a mechanical coherence.
  • Particularly suitable substrates are natural cellulosic fiber (such as cotton) or synthetic fiber (such as rayon), modified cellulosic fiber (for example, carboxymethylcellulose, nitrocellulose), absorbent chemical polymer fiber (such as polyacrylate salts). acrylate / acrylamide copolymers).
  • said piece of absorbent material is nonwoven fabric made of cellulose fiber, especially cotton.
  • liquid phase impregnation techniques see, for example, CN 102337324 or WO 2005/061013. These techniques involve imbibing an absorbent material from a culture medium composition formulated in solution in a volatile solvent (for example, water, an alcohol). Once well soaked, the drying of the absorbent material is achieved by evaporation of the solvent.
  • a volatile solvent for example, water, an alcohol
  • the amount of solution of the activated (hydrated) culture medium and the concentration of its constituents determine, on the one hand, the choice of material of the absorbent material part (especially in view of its retention capacity of water) and that of the dimensions of this piece of absorbent material and, secondly, the amount of culture medium powder to be incorporated, and vice versa.
  • said piece of absorbent material has a weight per unit area of between 50 gm "2 and 150 gm “ 2 , and preferably between 90 gm "2 and 110 gm “ 2 , for a thickness advantageously still between 0.5 mm and 10 mm, and more preferably between 1 mm and 4 mm.
  • the absorbent material part is advantageously subjected to a calendering operation.
  • the calendering by the pressure and the heating temperature generated, improves the retention of the composition of the dehydrated culture medium in the thickness of the absorbent material part, as well as its stability over time.
  • the calendering also has the advantage of improving the flatness of the surface of the piece of absorbent material, and to increase the capillary power of the latter.
  • the calendering is advantageously at a recommended temperature included between 30 ° C and 60 ° C. A temperature below 60 ° C makes it possible not to denature thermolabile compounds.
  • the piece of absorbent material incorporating in its thickness a dehydrated culture medium composition advantageously incorporates the technical characteristics of the dry-impregnated porous support described by WO 2015/104501.
  • the amount of culture medium composition formulated powder and incorporated in the thickness of the piece of absorbent material is between 0.01 g.cm "3 and 0.1 g. Cm" 3, preferably between 0 , 02 g. cm “3 and 0.09 g. cm” 3, more preferably between 0.03 g.cm "3 and 0.06 g.cm" 3.
  • this sheet of dehydrated polysaccharide hydrogel forms a hyperabsorbent and rehydratable material at room temperature, in particular at temperatures of between 5 ° C.
  • the spreading operations are often traumatic for the cells, they are generally displaced despite their adhesion to the culture medium, with a microbiological culture device according to the invention, thanks to a good surface quality of the hydrogel (possibly thixotropic properties), the cells are not abruptly detached from their support but are driven in motion with the hydrogel micro-fraction surrounding them.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is advantageously a dehydrated hydrogel sheet of gellan, xanthan, gallactomannan, starch and / or a mixture of these hydrogels.
  • Said dehydrated hydrogel sheet is obtained by dehydrating a hydrogel layer of water-based composition and at least one polysaccharide gelling agent.
  • Said polysaccharide gelling agent is preferably chosen from a gellan gum, a xanthan gum, a galactomannan gum (for example, a locust bean gum or a guar gum), starch and a mixture thereof.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a polysaccharide hydrogel layer previously prepared by mixing with one liter of water, 0.1 to 30 g of at least one polysaccharide gelling agent. .
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel film is obtained by dehydration of a layer of gellan hydrogel, previously prepared by mixing with one liter of water, 10 to 20 g of gellan gum and, preferably, 13 to 15 g of gellan gum.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a layer of xanthan hydrogel, previously prepared by mixing with one liter of water, 0.2 to 10 g of xanthan gum, preferably of the order of 0.5 g of xanthan gum.
  • the hydrogel sheet Dehydrated polysaccharide is obtained by dehydrating a layer of xanthan hydrogel and gallactomannan, previously prepared from a mixture of xanthan gum and locust bean gum.
  • the weight ratio [xanthan gum] / [locust bean gum] is advantageously between 1: 2 and 2: 1, preferably of the order of 1: 1.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a layer of starch hydrogel, preferably of potato starch, previously prepared by mixing with one liter of water, 0.5 to 15 g of starch.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydrating a layer of gellan hydrogel and starch, preferably potato starch, previously prepared from a mixture of gellan gum and starch.
  • the weight ratio [gellan gum] / [starch] is advantageously between 40: 1 and 2: 3.
  • a dehydrated polysaccharide slip can be prepared in multiple ways.
  • the hydrogel may be cast or spread in a continuous layer on a non-adherent surface. This continuous layer can also be obtained by a coating method.
  • the hydrogel layer is then dried / dewatered and then cut to the desired shape and size.
  • the preparation of the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet can also be carried out by a molding method, followed by a dehydration step.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is advantageously structurally strengthened chemically by means of a reinforcing additive chosen from glycerol, ethylene glycol and polyethylene glycol.
  • a reinforcing additive chosen from glycerol, ethylene glycol and polyethylene glycol.
  • the addition of said reinforcing additive is carried out during the preparation of the polysaccharide hydrogel composition.
  • this addition is carried out at the step of mixing the gelling agent and the water, prior to the dehydration step.
  • a sheet of dehydrated polysaccharide hydrogel according to the invention further comprises at least one reinforcing additive selected from glycerol, ethylene glycol and polyethylene glycol.
  • said reinforcing additive is glycerol.
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is a dehydrated gellan hydrogel sheet further comprising glycerol.
  • Such a dehydrated polysaccharide hydrogel slip is prepared from gellan gum and glycerol.
  • the weight ratio [gellan gum] / glycerol used in this preparation is advantageously between 2: 1 and 1: 8, preferably between 2: 7 and 2: 9, and is typically of the order of 1: 4.
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet further comprises at least one hardening agent chosen from divalent cation salts.
  • the curing agent is selected from magnesium chloride (MgCl 2 ), calcium chloride (CaCl 2 ), magnesium sulfate (MgSO 4) and manganese chloride (MnCl 2 ).
  • the curing agent is MgCl 2 .
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is a dehydrated gellan hydrogel sheet further comprising at least one curing agent selected from MgCl 2 , CaCl 2 , MgSC 4 and MnCl 2 .
  • the curing agent is advantageously MgCl 2 .
  • the gellan / MgCl 2 weight ratio is advantageously between 100: 1 and 3: 2, preferably between 30: 1 and 1: 3, and is typically of the order of 15: 1.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is prepared from gellan gum and MgCl 2 .
  • the weight ratio [gellan gum] / MgCl 2 used in this preparation is advantageously between 100: 1 and 3: 2, preferably between 30: 1 and 1: 3, and is typically of the order of 15: 1.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is prepared from gellan gum and MgSC.
  • the weight ratio [gellan gum] / MgSO4 used in this preparation is advantageously between 100: 1 and 3: 2, preferably between 30: 1 and 1: 3, and is typically of the order of 15: 1.
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is a dehydrated gellan hydrogel sheet comprising, in addition, at least one plasticizing agent such as, for example, a silicone oil.
  • a plasticizer makes it possible to obtain dehydrated hydrogels of greater flexibility and flexibility. The advantage is thus to be able to prepare large surfaces of dehydrated hydrogel, for example in long strips that can be rolled and thus preserved until they are cut into sheets of dimensions appropriate to the microbiological culture devices according to the invention.
  • incorporation of the plasticizer is performed during the preparation of the polysaccharide hydrogel composition.
  • this incorporation is carried out at the step of mixing the gelling agent and the water, prior to obtaining the dehydrated polysaccharide sheet.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet incorporates in its thickness chromogenic and / or fluorogenic compounds allowing a visual observation of the microorganisms as a function of the particular metabolic activities that they express.
  • These compounds may be, for example, synthetic substrates for the demonstration of defined enzymatic activities, colored pH indicators.
  • incorporation of the chromogenic and / or fluorogenic compounds is carried out during the preparation of the polysaccharide hydrogel composition.
  • this incorporation is carried out at the step of mixing the gelling agent and the water, prior to obtaining the dehydrated polysaccharide sheet.
  • a microbiological culture device in addition to the piece of absorbent material and the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet, may also comprise an intermediate permeable membrane disposed between said piece of absorbent material and said sheet of Dehydrated polysaccharide hydrogel.
  • the composition, the design and the thickness of this intermediate permeable membrane are chosen so that the latter impedes as little as possible the transfer of the liquids between the absorbent material part and the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet or the polysaccharide hydrogel layer. rehydrated.
  • it can be made from a substrate of natural cellulosic fiber (such as cotton) or synthetic (such as rayon), of modified cellulosic fiber (for example, carboxymethylcellulose, nitrocellulose), of polymer fiber absorbent chemicals (such as polyacrylate salts, acrylate / acrylamide copolymers) or stable protein fibers (such as silk, wool).
  • natural cellulosic fiber such as cotton
  • synthetic such as rayon
  • modified cellulosic fiber for example, carboxymethylcellulose, nitrocellulose
  • polymer fiber absorbent chemicals such as polyacrylate salts, acrylate / acrylamide copolymers
  • stable protein fibers such as silk, wool
  • this optional permeable permeable membrane can be used for a very wide variety of purposes, for example:
  • said intermediate permeable membrane is used to improve the contrast and observation of colonies growing on the surface of the microbiological culture device.
  • it is chosen sufficiently opaque to light and of a great whiteness (for example, a CIE whiteness of at least 65).
  • the design of the biological culture devices according to the invention and the methods of use thereof allow the main constituent elements, such as in particular: the piece of absorbent material,
  • microbiological culture device can be packaged and marketed in various forms, in particular:
  • a microbiological culture device composite, previously assembled and assembled, wherein the piece of absorbent material is surmounted by a sheet of dehydrated polysaccharide hydrogel, optionally with a permeable membrane interlayers;
  • a microbiological culture device in a kit, which the user will assemble by himself; such a kit comprises at least one piece of absorbent material, at least one dehydrated hydrogel sheet, optionally at least one intermediate permeable membrane.
  • microbiological culture device is packaged preassembled or conditioned so that it can be assembled extemporaneously by a user, to facilitate handling thereof:
  • a blocking system disposed within a receptacle (for example, the receptacle of a petri dish) specifically adapted to receive said microbiological culture device;
  • the different constituent elements of the microbiological culture device according to the invention are, in this case, of shape and dimensions adapted to those of said receptacle, and the rim of said receptacle is provided on its internal face (s) mechanical retention members, type pins, projecting out of the surface.
  • the invention also relates to a microbiological culture device as previously described, and presented in the form of a kit to be assembled.
  • a microbiological culture device in a kit to be assembled, according to the invention thus comprises:
  • At least one piece of absorbent material having an upper face which is at least substantially flat and incorporates in its thickness a composition of dehydrated culture medium
  • At least one polysaccharide hydrogel sheet that is dehydrated and rehydratable at ambient temperature, in particular at temperatures between 5 ° C. and 40 ° C., and optionally
  • At least one permeable membrane spacer is provided.
  • a polysaccharide hydrogel slip dehydrated and rehydratable at room temperature particularly at temperatures between 5 ° C and 40 ° C.
  • the said dehydrated and rehydratable polysaccharide hydrogel sheet at room temperature is intended to be used as a microbiological culture support.
  • a dehydrated and rehydratable polysaccharide hydrogel sheet according to the invention is characterized by all or part of the technical characteristics listed below:
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is a dehydrated hydrogel sheet of gellan, xanthan, galactomannan, starch or a mixture thereof,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet has been prepared by dehydrating a hydrogel layer of water-based composition and at least one polysaccharide gelling agent chosen from a gellan gum, a xanthan gum, a galactomannan gum, starch and a mixture thereof,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a polysaccharide hydrogel layer prepared by mixing with one liter of water 0.1 to 30 g of at least one of the above-mentioned polysaccharide gelling agents,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a layer of gellan hydrogel, previously prepared by mixing with one liter of water, 10 to 20 g of gellan gum and, preferably, 13 to 15 g of gellan gum,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a layer of xanthan hydrogel, previously prepared by mixing with one liter of water, 0.2 to 10 g of xanthan gum,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a layer of xanthan hydrogel and gallactomannan, previously prepared from a mixture of xanthan gum and locust bean gum,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a starch hydrogel layer, previously prepared by mixing with one liter of water, 0.5 to 15 g of starch,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is obtained by dehydration of a layer of gellan and starch hydrogel, prepared from a mixture of gellan gum and of starch, with a weight ratio of gellan gum ] / [starch] of between 40: 1 and 2: 3,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet is structurally reinforced chemically by means of a reinforcing additive chosen from glycerol, ethylene glycol and polyethylene glycol,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet further comprises at least one hardening agent chosen from divalent cation salts, in particular MgCl 2 , CaCl 2 , MgSO 4 and MnCl 2 ,
  • said dehydrated polysaccharide hydrogel sheet further comprises at least one plasticizing agent such as, for example, a silicone oil.
  • FIG. 1 is a schematic representation of a microbiological culture device according to the invention, and its general principle of use;
  • FIG. 2 is a photograph showing an example of dehydrated polysaccharide hydrogel leaflets at the end of the drying / dehydration process
  • FIGS. 3 to 13 show photographs of cultures and isolations of bacterial strains carried out on microbiological culture devices according to the invention.
  • a microbiological culture device consists, in the first place, of a piece of absorbent material 1, more or less thick and a sheet of dehydrated polysaccharide hydrogel 2, of lesser thickness.
  • these two elements 1 and 2 are substantially square shape.
  • the absorbent material part 1 made of hydrophilic and non-water-soluble material, incorporates in its thickness a composition of dehydrated culture medium.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2 is itself formed by drying / dehydration of a polysaccharide hydrogel layer, and its mechanical structure can be reinforced by means of a fibrous reinforcement, for example a woven fabric.
  • the piece of absorbent material 1 and the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2 can be provided already preassembled, joined together, or else in the form of two mechanically independent elements.
  • the design and manufacture of this piece of absorbent material 1 and this dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2 will be described in more detail in the following examples.
  • a receptacle 4 is associated with the microbiological culture device to facilitate handling thereof, in particular for the rehydration and activation stage of the device, and for any displacement (for example, a transfer from the bench to the incubator).
  • the use of a microbiological culture device according to the invention requires activation of the device through hydration by the absorbent material part 1, with water 4.
  • the microbiological culture device is placed inside the receptacle 4, with the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2 facing upwards. Since the receptacle 4 is larger than that of the culture device, the water 5 is poured into the receptacle 4, taking care not to pour directly onto the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2.
  • the volume of water used is more or less calibrated to be able to sufficiently wet the absorbent material part 1 and solubilize the composition of culture medium it contains.
  • Another way to operate is to pour into the bottom of the receptacle 4, the appropriate volume of water, then to deposit the piece of absorbent material 1, topped with the sheet of dehydrated polysaccharide hydrogel 2.
  • the hydration step can then be carried out in a third way.
  • the piece of absorbent material 1 is then placed inside the receptacle 4.
  • a sufficient quantity of water is poured in order to thoroughly soak the piece of absorbent material 1 Then we come cover the surface with dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2.
  • the hydration by the absorbent material part 1 makes it possible, initially, to solubilize the composition of culture medium contained in the thickness of the absorbent material part 1.
  • this activation is continued by the hydration of the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2, applied to the surface of the absorbent material part 1.
  • This rehydration of the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2 on the surface of the piece of absorbent material 1, a rehydrated polysaccharide hydrogel layer 2 ' is shown and swollen, not simply by the water coming from the piece of absorbent material 1 but rather by a solution of culture medium. from the absorbent material part 1.
  • the cell culture device is ready to receive the sample to be analyzed.
  • the sample is inoculated on the device, in particular by spreading and dispersing the cells, for example by means of an oesse 6, the whole is incubated at a temperature and for a fixed duration, before reading. results.
  • the layer / film of rehydrated polysaccharide hydrogel 2 'of a microbiological culture device makes it possible to create a culture surface, both lubricated and adherent for the cells, capable of to receive the microorganisms and allow their isolation by operations and mechanical means usually used to spread the cells on the surface of a conventional agar medium.
  • this layer / film of polysaccharide hydrogel 2 ' will be able to self-regenerate, throughout the period incubating continuously, the culture medium solution from the piece of absorbent material 1.
  • the microbiological culture device may also incorporate an intermediate permeable membrane 3 interposed between the absorbent material part 1 and the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2.
  • this membrane permeable insert 3 can be used for a variety of purposes, for example: to provide mechanical reinforcement and / or additional rigidity to the entire system, or only to the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 2 and the rehydrated polysaccharide hydrogel layer 2 ',
  • the piece of absorbent material 1 used in the constitution of a microbiological culture device according to the invention is shaped from a three-dimensional support, of open structure, porous, able to receive in its breast, both a liquid (in particular, an aqueous liquid) and solid particles of suitable particle size.
  • the microbiological culture devices tested comprise a piece of absorbent material incorporating a composition of culture medium, dry or dehydrated, made from the nonwoven Airlaid SCA95 N81, the company SCA ( Sweden).
  • This two-component PET / CoPET non-woven fabric (Polyester / coPolyester) has been specially treated to be tacky, by simple hot pressing (calendering), without adding glue. It is also characterized by a surface mass, before calendering (or non-calendered), of the order of 95 gm "2 for a thickness of 2 mm.From this non-woven, pieces of about 6 side cm were cut.
  • the nonwoven parts are calendered at 60 ° C. by applying a pressure of 3.10 5 Pa.cm -2 .
  • chromlD ® range media eg, chromlD ® CPS Elite, chromlD ® S. aureus, chromlD ® P. aeruginosa, chromlD ® VRE, chromlD ® Salmonella Elite.
  • microbiological culture devices according to the invention could then be tested for the detection and the isolation of bacteria such as Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Clostridium freundii, Streptococcus agalactiae and Serratia marcescens.
  • bacteria such as Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Clostridium freundii, Streptococcus agalactiae and Serratia marcescens.
  • the sheets of dehydrated polysaccharide hydrogel 2 which form part of the microbiological culture devices according to the invention, are designed above all so that, once rehydrated, they can offer microorganisms a support adapted to their growth and development. .
  • the composition and consistency of these sheets of dehydrated polysaccharide hydrogel 2 have also been specifically studied to obtain surfaces suitable for isolation and spreading operations. cells, that these polysaccharide hydrogel leaflets are in a rehydrated or dehydrated state.
  • Figure 2 is a photograph showing the dehydrated hydrogel leaflets at the oven outlet. As an indication, with 7 ml of hydrogel preparation poured into the Petri dishes, the thickness of the hydrogel pieces is of the order of 3 mm, before their preparation preparation in the oven or in the oven. After dehydration, the leaves are less than 1 mm thick.
  • the sheets of dehydrated polysaccharide hydrogel 2 of a microbiological culture device according to the invention have been declined in different versions, by varying, in particular: the nature of the polysaccharide gelling agent (for example, gellan gum, xanthan gum, galactomannan gums, starch, sodium alginate, pectin, methylcellulose and hydroxymethylcellulose),
  • the polysaccharide gelling agent for example, gellan gum, xanthan gum, galactomannan gums, starch, sodium alginate, pectin, methylcellulose and hydroxymethylcellulose
  • a light-fast and high-brightness membrane (for example, a CIE whiteness of at least 65) can be interposed between the piece of absorbent material and the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet.
  • This permeable interlayable membrane may consist of a sheet of absorbent paper, of cellulosic composition.
  • bacterial cultures have been carried out in particular with strains of Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Proteus mirabilis of Staphylococcus aureus, Serratia marcescens, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Clostridium freundii and Cronobacter sakazaki. .
  • the sheets of dehydrated polysaccharide hydrogel to be tested are associated with absorbent material parts incorporating in their thickness a particular dehydrated culture medium composition.
  • the peculiarity of this dehydrated culture medium composition lies in the fact that it has been chosen to be adapted to the growth and development of the bacteria of interest, and that they integrate chromogenic components facilitating the visual identification of these bacteria of interest.
  • the absorbent material parts which incorporate in their thickness a dehydrated culture medium composition, are placed in Petri dishes 90 mm in diameter, then wetted with 6-7 mL of sterile distilled water. These absorbent material parts are then overcome with a dehydrated polysaccharide hydrogel film. After hydration of the piece of absorbent material formed, the culture medium and the regenerated activated polysaccharide hydrogel layer, microbiological culture device is seeded with 10 ⁇ ⁇ a calibrated solution to a theoretical load of 10 bacterial 7 cfu / mL. The cell sample is deposited by means of a first oesse on the first dial of the hydrogel surface. The second dial is seeded with a new o ⁇ se by stretching several streaks from the first dial. The third dial is seeded like the second without changing o ⁇ se. The fourth dial is seeded by unstretched streaks from the second dial.
  • the boxes are placed in a jar with a little water so that the microbiological culture devices do not dry out. The whole is then incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • MgCl 2 at the rate of 1 g / L (that is to say 1 g of MgCl 2 per liter of water used in the preparation of the hydrogel) or
  • the gellan gum used here to prepare the dehydrated polysaccharide hydrogel leaflets is Gelrite ® , distributed by CARL ROTH GmbH, Germany.
  • the results obtained are very similar.
  • the colonies of E. coli grow on the surface of the hydrogel slip. They have a very nice size and a very beautiful color. Their morphotype corresponds to that of the colonies of E. coli growing on a reference chromogenic agar such as chromlD ® CPS Elite.
  • the gellan gum used here is Gelrite ® .
  • the gellan gum used here is Gelzan TM, distributed by CP KELCO, USA.
  • the gellan gum used here is Gelzan TM.
  • the colonies of E. faecalis growing on the surface of the hydrogel leaf are identical, in size, in color and in morphotype, to E. coli colonies. faecalis growing on chromogenic reference agar such as chromlD ® CPS Elite.
  • the gellan gum used here is Gelrite ® .
  • the P. mirabilis colonies growing on the surface of the hydrogel leaflet are identical in size, color and morphotype to colonies of P. mirabilis growing on chromogenic reference agar such as chromlD ® CPS Elite.
  • 8B, 8B ' gellan gum 13 g / L, CaCl 2 2 g / L,
  • 8C, 8C gellan gum 15 g / L, CaCl 2 1 g / L,
  • the gellan gum used here is Gelzan TM.
  • FIG. 9 a photograph of cultures and isolates of E. faecalis carried out on microbiological culture devices is presented, of which the dehydrated polysaccharide hydrogel sheets have been obtained from 15 g / L gellan hydrogels. of glycerol reinforced structure, at a rate of 43 ml / l, and hardened with:
  • the gellan gum used here is Gelzan TM.
  • the gellan gum used here is Gelrite ® .
  • a 2 gellan gum 30 g / L (Phytagel TM), glycerol 43mL / L, MgCl 2 1 g / L,
  • gellan gum 20 g / L (Gelrite ®), Glycerol 43ml / L, MgCl 2 1 g / L,
  • gellan gum 8 g / L (Gelrite ®), Glycerol 43ml / L, MgCl 2, 1 g / L,
  • gellan gum 6 g / L (Gelrite ® ), glycerol 43mL / L, MgCl 2 1 g / L,
  • 1 lCi gellan gum 20 g / L (Gelzan TM), glycerol 43mL / L, MgCl 2 1 g / L,
  • gellan gum 8 g / L Gellan TM
  • glycerol 43mL / L Gellan gum 8 g / L (Gelzan TM)
  • glycerol 43mL / L Gellan gum 8 g / L (Gelzan TM)
  • glycerol 43mL / L Gellan gum 8 g / L (Gelzan TM)
  • glycerol 43mL / L MgCl 2 1 g / L
  • FIG. 13 photographs of cultures and isolates of microorganisms conducted on microbiological culture devices are shown in which the dehydrated polysaccharide hydrogel sheets were obtained from a gelzan TM 15 g / L hydrogel, cured with MgCl 2 , at 1 g / L.
  • microbiological culture devices have also been successfully tested for the culture and detection of Streptococcus agalactiae (13A), Serratia marcescens, (13B), and for co-culture and co-detection of S. marcescens and S. aureus (13C).

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Abstract

La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et de la culture de microorganismes. Elle a trait plus spécifiquement aux solutions alternatives proposées aux milieux de culture gélosés traditionnels. Dans ce contexte, elle propose un dispositif de culture microbiologique, comprenant : - une pièce en matériau absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée, - reposant sur ladite pièce en matériau absorbant, un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à des températures comprises entre 5°Cet 40°C; ledit feuillet d'hydrogel déshydraté étant apposé directement sur la face supérieure de ladite pièce en matériau absorbant, ou indirectement au travers d'une membrane perméable intercalaire.

Description

DISPOSITIF DE CULTURE MICROBIOLOGIQUE COMPRENANT UN FEUILLET
D'HYDROGEL POLYSACCHARIDIQUE DESHYDRATE
La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et de la culture de microorganismes sur milieux solides et semi-solides. Elle a trait plus spécifiquement aux solutions alternatives proposées aux milieux de culture gélosés traditionnels, destinés notamment à la culture, la détection et/ou l'identification de microorganismes présents dans un échantillon à analyser. Dans le domaine du diagnostic clinique ou vétérinaire, ainsi que celui du contrôle microbiologique industriel (en particulier dans les industries agroalimentaire, pharmaceutique et cosmétique), les supports de culture solides et semi- solides plus communément désignés par milieux (de culture) gélosés ou géloses nutritives - constituent des outils précieux pour la détection et l'étude des microorganismes potentiellement pathogènes et/ou infectieux.
Apparus à la fin du XIXeme siècle avec l'utilisation de l'agar agar comme agent gélifiant, les milieux de culture solidifiés ont rapidement et profondément révolutionné la pratique de la microbiologie. Dès lors, les microorganismes à détecter, à identifier et/ou à étudier ont été appréhendés, observés et manipulés à échelle macroscopique, sous forme de colonies, c'est-à-dire des amas cellulaires visibles à l'œil nu et poussant à la surface de ces milieux de culture solides. Ce faisant, de nouvelles perspectives analytiques et expérimentales ont vu le jour, et des améliorations et simplifications de techniques préexistantes ont été rendues possibles.
A cet égard, on citera tout particulièrement les techniques d'isolement de microorganismes sur milieu gélosé, qui restent aujourd'hui encore très largement employées dans de nombreuses méthodes d'analyses microbiologiques, compte tenu de leur grande simplicité d'exécution. Il s'agit essentiellement des techniques d'isolement, par épuisement ou par la technique des cadrans.
Ces techniques d'isolement sur milieu gélosé consistent à disperser, sur la surface du milieu de culture solide, les cellules d'un dépôt d'échantillon biologique à analyser. Cette dispersion est exécutée, par exemple, grâce à des moyens/outils mécaniques que l'on fait glisser sur la surface du milieu de culture selon un parcours particulier. A l'issue de ce processus de dispersion, les cellules arrivées à la fin du parcours d'étalement se retrouvent individualisées, séparées les unes des autres. Chacune de ces cellules individualisées se développe alors pour former in fine une colonie de culture pure, c'est-à- dire un amas cellulaire renfermant des microorganismes, tous génétiquement identiques. Chaque colonie pourra alors faire l'objet d'une analyse morphologique (examen de la forme de la colonie, son élévation, la régularité des bords...), directement sur ce même milieu de culture ou sur d'autres milieux. Ces cellules pourront aussi être collectées à des fins de conservation et/ou en vue d'analyses complémentaires ultérieures.
Outre le fait d'offrir aux microorganismes un support adapté à leur croissance et développement, les milieux de culture gélifiés/solidifiés, classiquement à base de gélose, ont l'avantage de pouvoir présenter des niveaux de dureté et des états de surface qui les rendent parfaitement adaptés aux opérations d'isolement et d'étalement des cellules, et en particulier aux forces de pression et de friction exercées par les outils et instrumentations développés à cet effet (cf. par exemple, EP 0 242 114, WO 2005/071055).
Les milieux de culture gélosés connaissent cependant quelques inconvénients majeurs. A ce titre, on notera une préparation, qui lorsqu'elle est artisanale, requiert du temps (au moins une heure) et de nombreuses opérations (pesage des ingrédients, dissolutions, autoclavage, coulage, répartition en boîtes de Pétri). Egalement, comme cela est le cas pour les milieux de culture liquides, ces milieux solides ou semi- solides sont extrêmement sensibles à toute forme de contamination biologique. Enfin, du fait de la grande difficulté pour en assurer la stérilité, les milieux gélosés « artisanaux » doivent être préparés de façon extemporanée ou quasi-extemporanée.
Il existe également des milieux gélosés produits industriellement. Ces milieux gélosés prêts à l'emploi ont des durées de péremption courtes, qui ne dépassent guère quelques mois. Cette durée de péremption limitée peut notamment s'expliquer pour partie par la présence d'eau dans les milieux. Par ailleurs, pour en garantir une stérilité optimale et un niveau de performances acceptable, ils sont soumis à des mesures draconiennes en termes de conditionnement (traitement stérilisant aux UV, double emballage...), d'acheminement et de conservation (un stockage entre 2°C et 8°C, à l'abri de la lumière). Ces nombreuses contraintes impactent sur les coûts de vente et d'utilisation des milieux gélosés industriels.
Pour remédier aux inconvénients précités, des alternatives aux milieux de culture gélosés ont été proposées. Il s'agit en particulier de dispositifs de culture microbiologique prêts à l'emploi, industriellement produits, qui ont la particularité d'intégrer des compositions nutritives, éventuellement sélectives et/ou discriminantes, déshydratées et activables par simple (ré)hydratation. De ce fait, outre des modalités de conservation/stockage peu contraignantes (à l'abri de l'humidité et des fortes températures), leur durée de péremption peut atteindre plusieurs années.
A ce titre, la compagnie 3M (Etats-Unis) propose une gamme de dispositifs de culture microbiologique industriels dénommée Petrifilm™. Ces dispositifs, notamment décrits dans EP 0 070 310, EP 0 620 844 ou encore EP 0 832 180, sont formés de deux films étanches à l'eau, apposés l'un sur l'autre. A l'interface, la face interne de chacun des deux films est recouverte d'une composition adhésive permettant d'y faire adhérer une fine couche de poudre(s) hydrosoluble(s) à froid.
Pour certains des dispositifs Petrifilm™, l'une des faces internes des films est recouverte d'une première poudre, qui correspond à une composition de milieu de culture déshydratée et micronisée. L'autre face interne est quant à elle recouverte d'une seconde poudre, qui correspond à un agent gélifiant (tel que la gomme de guar et/ou la gomme de xanthane) micronisé.
Pour d'autres dispositifs Petrifilm™, les deux faces internes sont recouvertes d'une même poudre, formée par un mélange entre une composition de milieu de culture déshydratée et micronisée, et un agent gélifiant également micronisé.
Ces dispositifs Petrifilm™ sont destinés à la détection et/ou au dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon à analyser. Pour ce faire, le dispositif de culture est ouvert en soulevant le film supérieur, transparent. Un volume d'échantillon à analyser (liquide ou préalablement rendu liquide) d'une grande fluidité, éventuellement préalablement dilué et fluidisé, est déposé au centre du film inférieur. Le film supérieur est repositionné sur le film inférieur. Au contact de l'eau présent dans l'échantillon à analyser, le gélifiant forme un hydrogel à forte teneur en eau, ayant un aspect gélatineux et visqueux, venant engluer les cellules présentes dans l'échantillon à analyser. Cette même eau présente dans l'échantillon à analyser permet aussi de solubiliser et d'activer le milieu de culture. En comprimant quelque peu l'échantillon entre les deux films, l'échantillon est étalé sur une plus grande surface de culture. Le dispositif de culture microbiologique est finalement incubé à la température et pendant la durée prescrites avant la lecture des résultats.
De par leur conception, les dispositifs Petrifilm™, s'ils permettent effectivement une bonne fixation des cellules, l'hydrogel formé crée une surface, très gélatineuse et visqueuse ne se prêtant pas aux opérations d'isolement et/ou d'étalement des cellules comme on pourrait le faire sur un milieu de culture gélosé, et n'est d'ailleurs pas compatible avec les outils et instrumentations développés à cet effet (cf. par exemple, EP 0 242 114, WO 2005/071055).
On connaît également les dispositifs de culture Compact Dry , développés par la compagnie NISSUI PHARMACEUTICAL (Japon), dont le support de culture microbiologique est formé par une feuille en matériau fibreux absorbant, intégrant dans sa masse une composition nutritive déshydratée, éventuellement également sélective et/ou discriminante (cf. par exemple, EP 1 179 586).
Pour ce faire, une suspension alcoolique est préparée en mélangeant, dans de l'éthanol, une composition de milieu de culture, un adhésif so lubie à la fois dans l'eau et dans l'éthanol (par exemple, le poly[oxyde d'éthylène] et l'hydroxypropylcellulose) et un agent gélifiant soluble dans l'eau mais insoluble dans l'éthanol (par exemple, la gomme de caroube, la gomme de guar, la carragénine, Phydroxyéthylcellulose). Cette suspension alcoolique est utilisée pour imprégner la feuille en matériau fibreux absorbant. Après séchage, ladite feuille forme un support de culture déshydraté, prêt à l'emploi, de longue conservation, activable par simple réhydratation.
Ces dispositifs Compact Dry™ sont destinés à la détection et/ou au dénombrement de microorganismes présents dans un échantillon à analyser. Pour ce faire, un volume d'échantillon à analyser (liquide ou préalablement rendu liquide) d'une grande fluidité, éventuellement préalablement dilué, est ensemencé à l'aide d'une pipette sur le support de culture en recouvrant un maximum de surface. Le dispositif de culture est alors incubé pendant la durée et à la température prescrites, avant lecture des résultats.
Ce type de support de culture ne se prête pas aux techniques d'isolement mis en œuvre par étalement de Γ échantillons à analyser. En effet, du fait de leur nature fibreuse, ces supports de culture ont une surface irrégulière, présentant de nombreuses aspérités qui entravent le glissement continu et régulier des outils et instruments habituellement utilisés pour étaler et disperser les cellules sur la surface d'un milieu gélosé classique. Egalement, les cellules ont tendance à se développer en profondeur dans l'épaisseur du support poreux, ce qui peut rendre difficile la visualisation/identification des colonies formées.
Dans WO 2015/104501, la Demanderesse propose aussi des dispositifs de culture microbiologique prêts à l'emploi, dédiés à la détection, à l'identification et/ou à l'énumération de microorganismes. Ces dispositifs sont également basés sur un support de culture en matériau fibreux et absorbant, incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture. L'incorporation de la composition de milieu de culture déshydratée dans l'épaisseur du support de culture est réalisée par une technique d'imprégnation à sec. Comme pour les dispositifs Compact Dry™, du fait de leur nature fibreuse, ces supports de culture ont une surface irrégulière avec de nombreuses aspérités ; ces dispositifs ne sont donc pas compatibles avec les techniques et les outils développés jusqu'à présent pour l'isolement et l'étalement des cellules sur la surface d'un milieu gélosé classique.
Egalement, comme pour les dispositifs Compact Dry™, les cellules se développent en profondeur dans l'épaisseur du support poreux.
Pour remédier à ces défauts, dans WO 2014/013089 et WO 2015/107228, la
Demanderesse propose de recouvrir cette surface fibreuse d'une couche superficielle apte à en parfaire l'état de surface.
Dans WO 2014/013089, il est ainsi proposé d'utiliser une membrane de (micro)filtration aux pores suffisamment étroites pour empêcher la diffusion des cellules vers les couches sous-jacentes, et pour former par la même occasion une surface de rendu relativement lisse. Ladite membrane de (micro)fîltration peut être réalisée à base de un ou plusieurs matériaux choisis parmi le latex, le polytétrafluoroéthylène, le poly(vinylidène) fluoride, le polycarbonate, le polystyrène, le polyamide, le polysulfone, le polyéthersulfone, la cellulose, la nitrocellulose.
En alternative, dans WO 2015/107228, il est proposé un recouvrement par une couche poreuse de composition comprenant un mélange de pigments de kaolin, de talc, de dioxyde de titane, et/ou de carbonate de calcium, et d'un liant de type latex styrène butadiène, latex styrène acrylique ou carboxyle méthyle cellulose.
Malgré des résultats biologiques probants, de tels supports de culture ont été jugés commercialement peu viables à l'heure actuelle, notamment du fait d'un coût de fabrication encore élevé. La présente invention a ainsi pour objet de proposer un dispositif de culture microbiologique qui, tout en offrant une durée de péremption longue, y compris à température ambiante, procure une réelle alternative aux milieux de culture gélosés traditionnels, tant sur le plan de la fertilité que sur la compatibilité avec les opérations mécaniques d'étalement et de dispersion des cellules.
Un autre objectif de la présente invention est de pouvoir proposer un dispositif de culture microbiologique qui soit compatible avec les contraintes d'une exploitation industrielle et commerciale, notamment en termes de coût de production et de rentabilité. En particulier, la présente invention vise à proposer un dispositif de culture microbiologique de conception et de fabrication adaptées aux installations et moyens de production actuellement utilisés dans l'industrie des milieux et dispositifs de culture microbiologique.
La présente invention propose donc un dispositif de culture microbiologique comprenant :
- une pièce en matériau absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée (sèche ou séchée),
- reposant sur ladite pièce en matériau absorbant, un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à température ambiante, en particulier à des températures comprises entre 5°C et 40°C ; ledit feuillet d'hydrogel déshydraté étant apposé directement sur la face supérieure de ladite pièce en matériau absorbant, ou indirectement au travers d'une membrane perméable intercalaire. Selon l'invention, ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté a été préalablement préparé par déshydratation d'une couche d'hydrogel de composition à base d'eau et d'au moins un gélifiant polysaccharidique. Ce feuillet d'hydrogel déshydraté a la particularité d'être réhydratable à température ambiante. Il recouvre des propriétés d'hydrogel par simple absorption d'une composition aqueuse, sans nécessiter aucun traitement thermique additionnel et ce, tout en conservant des caractéristiques de forme, de texture, de dureté/rigidité et d'état de surface très proches de celles qu'un feuillet d'hydrogel polysaccharidique constitutif d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention présenterait s'il n'avait pas été déshydraté après coulage (ou après étalage/couchage) mais simplement durci.
Après réhydratation, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté redonne une couche d'hydrogel monobloc, ayant une consistance et une dureté/rigidité très comparables à celles d'un milieu de culture gélosé traditionnel prêt à l'emploi. En particulier, ladite couche d'hydrogel monobloc présente une dureté comprise entre 500 et 2000 g. cm"2, préférentiellement entre 700 et 1400 g. cm"2. La dureté de ladite couche d'hydrogel peut être mesurée au moyen d'un analyseur de texture, par exemple du type TA.XTplus de la société STABLE MICRO SYSTEMS LTD (Grande-Bretagne).
Lors de son utilisation, un dispositif de culture microbiologique selon l'invention doit être hydraté pour être activé. Pour ce faire, la pièce en matériau absorbant est imbibée avec une quantité d'eau ou une composition aqueuse. La composition de milieu de culture, initialement présente dans un état sec, est ainsi solubilisée et activée. Au contact même de la pièce en matériau absorbant, ou au travers d'une membrane perméable intercalaire, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté se réhydrate à son tour, presque instantanément et à température ambiante. En se réhydratant du liquide provenant de la pièce en matériau absorbant, le feuillet d'hydrogel regagne en flexibilité et donne une fine couche d'hydrogel (ou pellicule d'hydrogel) monobloc imbibée d'une composition de milieu de culture solubilisée et activée. L'ensemencement de l'échantillon à analyser sur le feuillet d'hydrogel polysaccharidique peut être effectué aussi bien avant qu'après réhydratation de ce dernier. La surface du feuillet d'hydrogel polysaccharidique, avant ou après réhydratation, est suffisamment lisse et rigide/dure pour se prêter aux opérations d'isolement et d'étalement des cellules, et en particulier pour supporter les forces de pression et de friction exercées par les outils et instrumentations développés à cet effet.
Dans ce système réhydraté, la couche d'hydrogel polysaccharidique procure à la surface du dispositif de culture microbiologique un effet de lubrification qui facilite les opérations mécaniques d'étalement et de dispersion des cellules. Egalement, par sa consistance gélosée, elle favorise l'implantation des microorganismes au plus près des ingrédients nutritifs et des agents actifs du milieu de culture. Quant à la pièce en matériau absorbant, outre son rôle dans la conservation et la distribution de la composition de milieu de culture, sa structure participe à la rigidité et la fermeté globales de la surface du dispositif de culture microbiologique, assurant sa compatibilité à l'égard des forces de pression et de friction qu'exercent les outils et instrumentations utilisés pour étaler et disperser les cellules.
Avant d'aller plus loin dans la description de l'invention, les définitions ci- après sont données afin de faciliter la compréhension de l'exposé de l'invention.
L'expression « milieu de culture » fait référence à une composition nutritive permettant la croissance et le développement de cellules, plus particulièrement des bactéries, des moisissures et/ou des levures. Ces milieux permettent de répondre aux besoins nutritionnels des microorganismes à cultiver. Schématiquement, on trouve dans leur composition :
de l'eau (généralement de l'eau distillée ou déionisée) stérile,
au moins un glucide, à titre de source carbonée et d'énergie,
ainsi que d'autres éléments nutritifs (notamment, acides aminés, facteurs de croissance, vitamines, minéraux, oligo-éléments, sels de fer, citrate de sodium, chlorure de sodium...) apportés sous la forme de compositions chimiquement complexes telles que des mélanges de peptones (de lait, de viande et/ou de fécules de pomme de terre, de maïs...), des extraits de levures, de sérum, et/ou des extraits de tissus d'origine animale ou végétale...
également divers sels, permettant d'établir une osmolarité adéquate au milieu, et de tamponner le pH.
Un milieu de culture au sens de la présente invention peut éventuellement démontrer une certaine sélectivité à l'égard de microorganismes cibles, c'est-à-dire qu'il favorise le développement de ces microorganismes cibles plutôt que celui de la flore annexe, et/ou qu'il inhibe et/ou ralentit le développement de la flore annexe. Cet effet sélectif peut notamment être obtenu grâce à l'emploi d'agents à effet inhibiteur pour la flore annexe ou d'agents à effet activateur pour les microorganismes cibles. Egalement, un milieu de culture au sens de la présente invention peut éventuellement démontrer des aptitudes de discrimination permettant de différencier, de distinguer visuellement les différentes catégories de microorganismes poussant sur ce même milieu de culture. A cet effet, le milieu de culture intègre avantageusement une composante chromogénique et/ou fluorogénique permettant une observation visuelle des microorganismes en fonction d'activités métaboliques particulières qu'ils expriment.
La composition et la formulation de nombreux milieux de culture sont décrites notamment dans le HANDBOOK OF MICROBIOLOGICAL MEDIA (2010 ; 4ème Edition).
Le terme « échantillon » fait référence à un prélèvement effectué à des fins d'analyse ou à une petite partie ou petite quantité de ce prélèvement. L'invention vise plus spécifiquement des échantillons biologiques contenant ou suspectés de contenir des microorganismes à détecter et/ou à analyser. Ces échantillons biologiques peuvent être d'origine humaine, animale, végétale ou environnementale. Ils peuvent aussi avoir une origine industrielle et provenir de prélèvements opérés sur un produit manufacturé ou un produit en cours de fabrication, ou sur des instruments, des installations rencontrés dans un environnement industriel. Les secteurs industriels visés ici sont plus particulièrement les industries agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique et vétérinaire, les dispositifs médicaux, la microbiologie des contrôles environnementaux (eaux, air, surfaces).
Les termes « microorganismes » et « cellules » sont utilisés ici de façon équivalente et font référence à des bactéries, des levures, des moisissures et/ou des amibes.
Par « moyens/outils d'isolement/étalement », on entend les instruments mécaniques aptes à être utilisés dans la mise en œuvre des techniques d'isolement (par exemple, la technique d'épuisement, la technique des stries ou des cadrans), des techniques d'étalement ou de nappage cellulaire (par exemple, en vue d'un dénombrement cellulaire ou de la réalisation de tests de susceptibilité aux antibiotiques), comme ceux qui sont couramment utilisés sur les milieux de culture gélosés traditionnels. Ces instruments mécaniques, utilisés manuellement ou de façon automatisée, permettent de réaliser un ou plusieurs dépôts ponctuels de microorganismes sur la surface du milieu de culture, et en glissant sur cette surface, ils en étalent les cellules. A titre d'exemples non exhaustifs, on peut citer les oëses, les anses de platine, les tiges rodées, des billes, les étaloirs, les ringards ou râteaux.
Selon l'invention, le dispositif de culture microbiologique proposé est formé, pour l'essentiel, de la combinaison entre une pièce en matériau absorbant incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée, et un feuillet d'hydrogel polysaccharidique également déshydraté, ayant la capacité de se réhydrater à température ambiante. Par ses dimensions, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté recouvre tout ou partie la face supérieure de la pièce en matériau absorbant.
A propos de la pièce en matériau absorbant, qui compose la couche interne/profonde du dispositif de culture microbiologique selon l'invention et qui fait office de réservoir à une composition de milieu de culture déshydratée, sa structure, sa conception et ses dimensions sont largement décrites ou suggérées par EP 1 179 586, WO 2015/104501, WO 2014/013089, WO 2015/107228.
De nombreux matériaux absorbants, hydrophiles et non hydrosolubles, peuvent être utilisés pour réaliser la pièce en matériau absorbant d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention. Ces matériaux sont principalement choisis pour leur pouvoir absorbant, leur capacité de rétention des liquides aqueux et leur faculté à laisser les liquides aqueux les traverser. Avantageusement et selon l'invention, ladite pièce en matériau absorbant est réalisée à partir d'un substrat de fibres courtes non-tissées, constituant un ensemble ayant une intégrité structurelle et une cohérence mécanique. Les substrats particulièrement adaptés sont en fibre cellulosique naturelle (comme le coton) ou synthétique (comme la rayonne), en fibre cellulosique modifiée (par exemple, la carboxyméthylcellulose, la nitrocellulose), en fibre de polymères chimiques absorbants (tels que les sels de polyacrylate, les copolymères acrylate/acrylamide). Selon un mode de réalisation préféré, ladite pièce en matériau absorbant est en textile non-tissé réalisé en fibre de cellulose, notamment le coton.
L'incorporation d'une composition de milieu de culture dans la masse d'une pièce réalisée en matériau fibreux peut être réalisée de diverses façons.
Elle peut se faire par des techniques dites d'imprégnation en phase liquide (cf. par exemple, CN 102337324 ou WO 2005/061013). Ces techniques consistent à imbiber un matériau absorbant d'une composition de milieu de culture, formulée en solution dans un solvant volatile (par exemple, l'eau, un alcool). Une fois bien imbibé, le séchage du matériau absorbant est réalisé par évaporation du solvant.
Elle peut également se faire par des techniques dites d'imprégnation à sec. Ces techniques visent à transférer, dans l'épaisseur d'une pièce en matériau absorbant, une composition poudreuse, en l'occurrence un milieu de culture préparé sous la forme d'une poudre ou d'un assemblage de poudres. A cet effet, les particules de ladite composition poudreuse sont saupoudrées sur la surface de la pièce en matériau absorbant, puis sont mises en vibration, sous l'action d'ondes ultrasonores (cf. par exemple, FR 2 866 578) ou bien sous l'action d'un champ électrique alternatif (cf. par exemple, WO 2015/044605, WO 2010/001043 ou WO 99/22920). Ces particules pénètrent et s'enfoncent alors progressivement dans les cavités du corps poreux.
Pour la fabrication d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, les techniques d'imprégnation à sec mettant en œuvre un champ électrique alternatif se sont révélées particulièrement adaptées pour permettre l'incorporation d'une composition de milieu de culture déshydratée dans l'épaisseur d'un matériau absorbant. De ce fait, les enseignements techniques dispensés par WO 2015/044605, WO 2010/001043 et WO 99/22920 font partie intégrante de la présente description. Selon l'invention, la quantité de solution du milieu de culture activé (hydraté) et la concentration de ses constituants conditionnent, d'une part, le choix du matériau de la pièce en matériau absorbant (notamment au vu de sa capacité de rétention d'eau) et celui des dimensions de cette pièce en matériau absorbant et, d'autre part, la quantité de poudre de milieu de culture à y incorporer, et réciproquement.
Avantageusement, avant calandrage éventuel, ladite pièce en matériau absorbant présente une masse surfacique comprise entre 50 g.m"2 et 150 g.m"2, et préférentiellement entre 90 g.m"2 et 110 g.m"2, pour une épaisseur avantageusement encore comprise entre 0,5 mm et 10 mm, et plus préférentiellement entre 1 mm et 4 mm. Selon un mode de réalisation préféré, une fois l'incorporation de la composition de milieu de culture déshydratée achevée, la pièce en matériau absorbant est avantageusement soumise à une opération de calandrage. Le calandrage, par la pression et la température de chauffe générées, améliore la rétention de la composition du milieu de culture déshydratée dans l'épaisseur de la pièce en matériau absorbant, ainsi que sa stabilité dans le temps. Le calandrage a également pour avantage d'améliorer la planéité de la surface de la pièce en matériau absorbant, et d'accroître le pouvoir capillaire de cette dernière.
Le calandrage se fait avantageusement à une température préconisée comprise entre 30°C et 60°C. Une température inférieure à 60°C permet de ne pas dénaturer les composés thermolabiles.
EP I 179 586, WO 2015/104501, WO 2014/013089 et WO 2015/107228, commentés plus haut dans la présente description, décrivent des supports de culture microbiologique qui intègrent également dans leurs structures des couches en matériau poreux incorporant une composition de milieu de culture déshydratée. Ces couches ainsi décrites peuvent donc être reprises telles quelles pour être utilisées dans la conception des dispositifs de culture microbiologique selon la présente invention.
Selon un mode de réalisation particulièrement préféré de la présente invention, la pièce en matériau absorbant incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée reprend avantageusement les caractéristiques techniques du support poreux imprégné à sec décrit par WO 2015/104501. Avantageusement, la quantité de composition de milieu de culture formulée en poudre et incorporée dans l'épaisseur de la pièce en matériau absorbant est comprise entre 0,01 g.cm"3 et 0,1 g. cm"3, de préférence entre 0,02 g. cm"3 et 0,09 g. cm"3, et plus préférentiellement encore entre 0,03 g.cm"3 et 0,06 g.cm"3. S 'agissant du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté constitutif d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, sa composition et son épaisseur ont été choisies pour créer une structure de surface pleine, de faible épaisseur, ayant une intégrité et une tenue mécaniques suffisantes pour permettre une préhension et des manipulations faciles. Par ailleurs et de manière intrinsèque, ce feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté forme un matériau hyper-absorbant et réhydratable à température ambiante, en particulier à des températures comprises entre 5°C et 40°C, si bien qu'au contact de la pièce en matériau absorbant préalablement imbibée d'eau, il se gorge de la composition de milieu de culture liquide et reforme une couche d'hydrogel monobloc (c'est-à-dire, un ensemble présentant une certaine intégrité structurelle et cohérence mécanique) aux propriétés nutritives, éventuellement sélectives et/ou discriminantes. Sur cette couche d'hydrogel, les cellules inoculées sont ainsi déposées au plus près des constituants de la composition du milieu de culture. Alors que les opérations d'étalement sont souvent traumatisantes pour les cellules, celles-ci étant généralement déplacées en dépit de leur adhérence au support de culture, avec un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, grâce une belle qualité de surface de l'hydrogel (éventuellement des propriétés thixotropiques), les cellules ne sont pas brutalement décrochées de leur support mais sont entraînées en mouvement avec la micro-fraction d'hydrogel qui les entoure.
Selon l'invention, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est avantageusement un feuillet d'hydrogel déshydraté de gellane, de xanthane, de gallactomannane, d'amidon et/ou d'un mélange de ces hydrogels. Ledit feuillet d'hydrogel déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de composition à base d'eau et d'au moins un gélifiant polysaccharidique. Ledit gélifiant polysaccharidique est préférentiellement choisi parmi une gomme de gellane, une gomme de xanthane, une gomme de galactomannane (par exemple, une gomme de graine de caroube ou une gomme de guar), de l'amidon et un mélange de ceux-ci.
Avantageusement et selon l'invention, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel polysaccharidique préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,1 à 30 g d'au moins un gélifiant polysaccharidique.
Selon un premier mode de réalisation préféré, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de gellane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 10 à 20 g de gomme de gellane et, préférentiellement, 13 à 15 g de gomme de gellane.
Selon une variante de réalisation, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de xanthane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,2 à 10 g de gomme de xanthane, de préférence de l'ordre de 0,5 g de gomme de xanthane.
Selon une deuxième variante de réalisation, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de xanthane et de gallactomannane, préalablement préparée à partir d'un mélange de gomme de xanthane et de gomme de graine de caroube. Le ratio pondéral [gomme de xanthane]/[gomme de graine de caroube] est avantageusement compris entre 1 : 2 et 2 : 1 , de préférence de l'ordre de 1 : 1.
Selon une troisième variante de réalisation, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel d'amidon, de préférence d'amidon de pomme de terre, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,5 à 15 g d'amidon.
Selon une quatrième variante de réalisation, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de gellane et d'amidon, de préférence d'amidon de pomme de terre, préalablement préparée à partir d'un mélange de gomme de gellane et d'amidon. Le ratio pondéral [gomme de gellane]/[amidon] est avantageusement compris entre 40 : 1 et 2 : 3.
A partir d'une composition d'hydrogel polysaccharidique, un feuillet polysaccharidique déshydraté peut être préparé de multiples façons. Par exemple, l'hydrogel peut être coulé ou étalé en une couche continue sur une surface non-adhérente. Cette couche continue peut également être obtenue par une méthode de couchage. La couche d'hydrogel est ensuite séchée/déshydratée, puis découpée à la forme et aux dimensions souhaitées.
La préparation du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté peut également être effectuée par une méthode de moulage, suivie d'une étape de déshydratation.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est avantageusement renforcé structurellement par voie chimique au moyen d'un additif de renfort choisi parmi le glycérol, l'éthylène glycol et le polyéthylène glycol. L'ajout dudit additif de renfort est effectué au cours de la préparation de la composition d'hydrogel polysaccharidique. Avantageusement, cet ajout est effectué à l'étape de mélange du gélifiant et de l'eau, préalable à l'étape de déshydratation.
Dans ce contexte, un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté selon l'invention comprend, en outre, au moins un additif de renfort choisi parmi le glycérol, l'éthylène glycol et le polyéthylène glycol.
Avantageusement et selon l'invention, ledit additif de renfort est du glycérol. Selon un mode de réalisation de l'invention particulièrement préféré, ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est un feuillet d'hydrogel de gellane déshydraté comprenant, en outre, du glycérol.
Un tel feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est préparé à partir de gomme de gellane et de glycérol. Le ratio pondéral [gomme de gellane]/glycérol utilisé dans cette préparation est avantageusement compris entre 2 : 1 et 1 : 8, préférentiellement entre 2 : 7 et 2 : 9, et est typiquement de l'ordre de 1 : 4.
Selon un mode de réalisation avantageux de l'invention, ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté comprend, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi les sels de cation divalent. De préférence, l'agent durcisseur est choisi parmi le chlorure de magnésium (MgCl2), le chlorure de calcium (CaCl2), le sulfate de magnésium (MgSC^) et le chlorure de manganèse (MnCl2). Avantageusement et selon l'invention, l'agent durcisseur est MgCl2.
Avantageusement et selon l'invention, ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est un feuillet d'hydrogel de gellane déshydraté comprenant, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi MgCl2, CaCl2, MgSC^ et MnCl2. L'agent durcisseur est avantageusement MgCl2. Le ratio pondéral gellane/MgCl2 est avantageusement compris entre 100 : 1 et 3 : 2, préférentiellement entre 30 : 1 et 1 : 3, et est typiquement de l'ordre de 15 : 1.
Selon un mode de réalisation particulier, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est préparé à partir de gomme de gellane et de MgCl2. Le ratio pondéral [gomme de gellane]/MgCl2 utilisé dans cette préparation est avantageusement compris entre 100 : 1 et 3 : 2, préférentiellement entre 30 : 1 et 1 : 3, et est typiquement de l'ordre de 15 : 1.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est préparé à partir de gomme de gellane et de MgSC Le ratio pondéral [gomme de gellane]/MgS04 utilisé dans cette préparation est avantageusement compris entre 100 : 1 et 3 : 2, préférentiellement entre 30 : 1 et 1 : 3, et est typiquement de l'ordre de 15 : 1.
Selon un mode de réalisation particulier de l'invention, ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est un feuillet d'hydrogel de gellane déshydraté comprenant, en outre, au moins un agent plastifiant comme, par exemple, une huile de silicone. L'utilisation d'un agent plastifiant permet d'obtenir des hydrogels déshydratés de plus grandes souplesse et flexibilité. L'avantage est ainsi de pouvoir préparer de grandes surfaces d'hydrogel déshydraté, par exemple en de longues bandes pouvant être mises en rouleaux et conservées ainsi jusqu'à leur découpe en feuillets aux dimensions appropriées aux dispositifs de culture microbiologique selon l'invention.
L'incorporation de l'agent plastifiant est effectuée au cours de la préparation de la composition d'hydrogel polysaccharidique. Avantageusement, cette incorporation est effectuée à l'étape de mélange du gélifiant et de l'eau, préalablement à l'obtention du feuillet polysaccharidique déshydraté.
Selon un mode particulier de réalisation de l'invention, le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté incorpore dans son épaisseur des composés chromogéniques et/ou fluorogéniques permettant une observation visuelle des microorganismes en fonction d'activités métaboliques particulières qu'ils expriment. Ces composés peuvent être, par exemple, des substrats synthétiques permettant la mise en évidence d'activités enzymatiques définies, des indicateurs colorés de pH.
L'incorporation des composés chromogéniques et/ou fluorogéniques est effectuée au cours de la préparation de la composition d'hydrogel polysaccharidique. Avantageusement, cette incorporation est effectuée à l'étape de mélange du gélifiant et de l'eau, préalablement à l'obtention du feuillet polysaccharidique déshydraté.
Avantageusement et selon l'invention, outre la pièce en matériau absorbant et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté, un dispositif de culture microbiologique selon l'invention peut également comprendre une membrane perméable intercalaire, disposée entre ladite pièce en matériau absorbant et ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté. La composition, la conception et l'épaisseur de cette membrane perméable intercalaire sont choisies de sorte que cette dernière entrave le moins possible le transfert des liquides entre la pièce en matériau absorbant et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ou la couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté. A cet égard, elle peut être réalisée à partir d'un substrat en fibre cellulosique naturelle (comme le coton) ou synthétique (comme la rayonne), en fibre cellulosique modifiée (par exemple, la carboxyméthylcellulose, la nitrocellulose), en fibre de polymères chimiques absorbants (tels que les sels de polyacrylate, les copolymères acrylate/acrylamide) ou en fibres protéiques stables (comme la soie, la laine).
Dans le cadre de la présente invention, cette membrane perméable intercalaire, optionnelle, peut être utilisée à des fins très diverses, comme par exemple :
pour apporter un renfort mécanique et/ou une rigidité supplémentaire à l'ensemble du système, ou uniquement au feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et à la couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté,
- pour améliorer le contact de la pièce en matériau absorbant avec le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et/ou avec la couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté,
- pour faire office de couche réservoir pour la conservation de composés particuliers, destinés à être mélangés à la composition de milieu de culture solubilisée en provenance de la pièce en matériau absorbant avant d'être acheminés vers la couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté,
- pour améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique.
Selon un mode particulier de réalisation, ladite membrane perméable intercalaire est utilisée en vue d'améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique. A cet effet, elle est choisie suffisamment opaque à la lumière et d'une grande blancheur (par exemple, une blancheur CIE au moins égale à 65). La conception des dispositifs de culture biologique selon l'invention et les modalités d'utilisation de ceux-ci permettent aux principaux éléments constitutifs, tels que notamment : la pièce en matériau absorbant,
le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté, et
l'éventuelle membrane perméable intercalaire,
de pouvoir avantageusement être fabriqués, conditionnés et stockés séparément et de manière totalement indépendante. Ceci représente un réel atout industriel, tant d'un point de vue commercial que logistique. Ceci représente également un avantage significatif pour l'utilisateur qui dispose de la possibilité de combiner à dessein les différents éléments constitutifs du dispositif de culture microbiologique selon l'invention, et d'adapter par lui- même le dispositif de culture microbiologique aux microorganismes auxquels il porte un intérêt tout particulier.
De façon similaire, un dispositif de culture microbiologique selon l'invention peut être conditionné et commercialisé sous différentes formes, notamment :
- un dispositif de culture microbiologique, composite, préalablement monté et assemblé, dans lequel la pièce en matériau absorbant est surmontée d'un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté, avec éventuellement une membrane perméable intercalaire ;
- un dispositif de culture microbiologique en kit, que l'utilisateur assemblera par lui- même ; un tel kit comprend au moins une pièce en matériau absorbant, au moins un feuillet d'hydrogel déshydraté, éventuellement au moins une membrane perméable intercalaire.
Que le dispositif de culture microbiologique selon l'invention soit conditionné préassemblé ou conditionné pour pouvoir être assemblé de façon extemporanée par un utilisateur, pour faciliter la manipulation de celui-ci :
- la pièce en matériau absorbant,
le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (ou la couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté), et
l'éventuelle membrane perméable intercalaire,
peuvent avantageusement être maintenus solidaires entre eux par des moyens techniques avantageusement appliqués sur le pourtour de ces différents éléments, tels que :
- un système d'agrafe, d'épingle,
- une composition d'adhésif, appliquée linéairement ou ponctuellement, - un système de blocage disposé à l'intérieur d'un réceptacle (par exemple, le réceptacle d'une boîte de Pétri) spécifiquement conçu pour recevoir ledit dispositif de culture microbiologique ; les différents éléments constitutifs du dispositif de culture microbiologique selon l'invention sont, dans ce cas, de forme et de dimensions adaptées à celles dudit réceptacle, et le rebord dudit réceptacle est muni sur sa(ses) face(s) interne(s) d'organes mécaniques de rétention, de type ergots, faisant saillie hors de la surface.
L'invention concerne également un dispositif de culture microbiologique tel que précédemment décrit, et présenté sous la forme d'un kit à assembler. Un dispositif de culture microbiologique en kit à assembler, selon l'invention, comprend ainsi :
- au moins une pièce en matériau absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée,
- au moins un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à température ambiante, en particulier à des températures comprises entre 5°C et 40°C , et éventuellement
- optionnellement, au moins une membrane perméable intercalaire. Selon un aspect particulier de la présente invention, celle-ci propose également un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à température ambiante, en particulier à des températures comprises entre 5°C et 40°C. Ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable à température ambiante est destiné à être utilisé comme support de culture microbiologique.
Avantageusement, un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et réhydratable selon l'invention est caractérisé par tout ou partie des caractéristiques techniques ci-après listées :
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est un feuillet d'hydrogel déshydraté de gellane, de xanthane, de galactomannane, d'amidon ou un mélange de ceux-ci,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté a été préparé par déshydratation d'une couche d'hydrogel de composition à base d'eau et d'au moins un gélifiant polysaccharidique choisi parmi une gomme de gellane, une gomme de xanthane, une gomme de galactomannane, de l'amidon et un mélange de ceux-ci,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel polysaccharidique préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,1 à 30 g d'au moins un des gélifiants polysaccharidiques précédemment énoncés,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de gellane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 10 à 20 g de gomme de gellane et, préférentiellement, 13 à 15 g de gomme de gellane,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de xanthane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,2 à 10 g de gomme de xanthane,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de xanthane et de gallactomannane, préalablement préparée à partir d'un mélange de gomme de xanthane et de gomme de graine de caroube,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel d'amidon, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,5 à 15 g d'amidon,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de gellane et d'amidon, préparée à partir d'un mélange de gomme de gellane et d'amidon, avec un ratio pondéral [gomme de gellane]/[amidon] compris entre 40 : 1 et 2 : 3,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est renforcé structurellement par voie chimique au moyen d'un additif de renfort choisi parmi le glycérol, Péthylène glycol et le polyéthylène glycol,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté comprend, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi les sels de cation divalent - notamment MgCl2, CaCl2, MgS04 et MnCl2 -,
- ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté comprend, en outre, au moins un agent plastifiant comme, par exemple, une huile de silicone. D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-après, qui se réfèrent aux figures annexées et dans lesquelles :
- la Figure 1 est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, et de son principe général d'utilisation ;
- la Figure 2 est une photographie montrant un exemple de feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté en fin de processus de séchage/déshydratation ;
- les Figures 3 à 13 rassemblent des photographies de cultures et d'isolements de souches bactériennes effectués sur des dispositifs de culture microbiologique selon l'invention.
Ces exemples ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention, sa mise en œuvre et son utilisation. Ces exemples sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention.
EXEMPLES
AI - Dispositif de culture microbiologique selon l'invention, et principe général d'utilisation Tel que représenté à la Figure 1 , un dispositif de culture microbiologique selon l'invention se compose, en premier lieu, d'une pièce en matériau absorbant 1 , plus ou moins épaisse et d'un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2, d'épaisseur moindre. Dans l'exemple représenté, ces deux éléments 1 et 2 sont de forme sensiblement carrée.
La pièce en matériau absorbant 1 , réalisée en matériau hydrophile et non hydrosoluble, incorpore dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée. Le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 est quant à lui formé par séchage/déshydratation d'une couche d'hydrogel polysaccharidique, et sa structure mécanique peut être renforcée au moyen d'une armature fibreuse, par exemple un tissé.
La pièce en matériau absorbant 1 et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 peuvent être fournis déjà préassemblés, solidarisés, ou bien alors sous la forme de deux éléments mécaniquement indépendants. La conception et la fabrication de cette pièce en matériau absorbant 1 et de ce feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 seront décrites plus en détails dans la suite des exemples. A titre de caractéristique secondaire, un réceptacle 4 est associé au dispositif de culture microbiologique pour en faciliter la manipulation, notamment pour l'étape de réhydratation et activation du dispositif, et pour tout déplacement (par exemple, un transfert de la paillasse à l'incubateur). L'utilisation d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention nécessite une activation du dispositif grâce à une hydratation par la pièce en matériau absorbant 1, par de l'eau 4.
Pour ce faire, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention est placé à l'intérieur du réceptacle 4, avec le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 tourné vers le haut. Le réceptacle 4 étant de plus grande surface que celle du dispositif de culture, on verse l'eau 5 dans le réceptacle 4 en prenant soin de ne pas en verser directement sur le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2. Le volume d'eau utilisé est plus ou moins calibré pour pouvoir humidifier suffisamment la pièce en matériau absorbant 1 et solubiliser la composition de milieu de culture qu'elle renferme.
Une autre façon d'opérer consiste à verser dans le fond du réceptacle 4, le volume d'eau approprié, puis d'y déposer la pièce en matériau absorbant 1, surmontée du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2. On prendra soin de ne pas placer le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 directement en contact avec l'eau libre, de façon à ce que le dispositif soit effectivement hydraté uniquement par la pièce en matériau absorbant 1.
Lorsque le dispositif de culture microbiologique selon l'invention est fourni avec la pièce en matériau absorbant 1 et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 sous la forme de deux éléments mécaniquement indépendants, l'étape d'hydratation peut alors être réalisée d'une troisième manière. La pièce en matériau absorbant 1 est alors placée à l'intérieur du réceptacle 4. Dans le réceptacle 4 et éventuellement directement sur cette pièce en matériau absorbant 1, on verse une quantité d'eau 5 suffisante pour bien imbiber la pièce en matériau absorbant 1. On vient ensuite en recouvrir la surface avec le feuille d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2.
Au cours de l'activation d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, l'hydratation par la pièce en matériau absorbant 1 permet, dans un premier temps, de solubiliser la composition de milieu de culture contenue dans l'épaisseur de la pièce en matériau absorbant 1. Dans un deuxième temps, cette activation se poursuit par l'hydratation du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2, appliqué sur la surface de la pièce en matériau absorbant 1. Cette réhydratation du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 fait apparaître, à la surface de la pièce en matériau absorbant 1, une couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté 2' et gonflé, non pas simplement par l'eau provenant de la pièce en matériau absorbant 1 mais plutôt par une solution de milieu de culture en provenance de la pièce en matériau absorbant 1.
Ainsi activé, le dispositif de culture cellulaire est prêt à recevoir l'échantillon à analyser. Une fois l'échantillon inoculé sur le dispositif, notamment par des opérations d'étalement et de dispersion des cellules, par exemple, au moyen d'une oëse 6, l'ensemble est incubé à une température et pour une durée établies, avant lecture des résultats.
Par sa consistance et sa texture bien particulières, la couche/pellicule d'hydrogel polysaccharidique réhydraté 2' d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention permet de créer une surface de culture, à la fois lubrifiée et adhérente pour les cellules, apte à recevoir les microorganismes et permettre leur isolement par des opérations et moyens mécaniques habituellement utilisés pour étaler les cellules sur la surface d'un milieu gélosé classique. Par ailleurs, du fait de sa grande exposition aux échanges gazeux et aux phénomènes d'assèchement et à ses propriétés hyper-absorbantes, cette couche/pellicule d'hydrogel polysaccharidique 2' va pouvoir s 'auto -régénérer, tout au long de la période d'incubation et de façon continue, de la solution de milieu de culture provenant de la pièce en matériau absorbant 1.
Comme également représenté à la Figure 1, le dispositif de culture microbiologique peut également intégrer une membrane perméable intercalaire 3 venant s'intercaler entre la pièce en matériau absorbant 1 et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2. Réalisée dans un matériau perméable, cette membrane perméable intercalaire 3, optionnelle, peut être utilisée à des fins très diverses, comme par exemple : pour apporter un renfort mécanique et/ou une rigidité supplémentaire à l'ensemble du système, ou alors uniquement au feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 et à la couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté 2',
pour améliorer le contact de la pièce en matériau absorbant 1 avec le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 et/ou avec la couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté 2',
- pour faire office de couche réservoir pour la conservation de composés particuliers destinés à être mélangés à la composition de milieu de culture solubilisée en provenance de la pièce en matériau absorbant 1, avant d'atteindre la couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté 2',
- pour améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique.
B/ - Fabrication des différents éléments constitutifs d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention
Bl/ - La pièce en matériau absorbant intégrant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée
S 'agissant de la pièce en matériau absorbant 1 entrant dans la constitution d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, celle-ci est façonnée à partir d'un support tridimensionnel, de structure ouverte, poreuse, apte à recevoir en son sein, aussi bien un liquide (en particulier, un liquide aqueux) que des particules solides de granulométrie adaptée.
Pour les exemples et les essais qui vont suivre, les dispositifs de culture microbiologique testés comprennent une pièce en matériau absorbant intégrant une composition de milieu de culture, sèche ou déshydratée, confectionné à partir du non-tissé Airlaid SCA95 N81, de la compagnie SCA (Suède). Ce non-tissé bicomposant PET/CoPET (Polyester/coPolyester) a été spécialement traité pour pouvoir être adhésivé, par simple pressage à chaud (calandrage), sans ajout de colle. Il se caractérise également par une masse surfacique, avant calandrage (ou non-calandré), de l'ordre de 95 g.m"2 pour une épaisseur de 2 mm. A partir de ce non-tissé, des pièces d'à peu près 6 cm de côté ont été découpées. L'incorporation d'une composition de milieu de culture déshydratée, dans la masse même de ces pièces en matériau fibreux, a été réalisée avec une technique d'imprégnation à sec. A cet effet, environ 0,2 g d'une composition de milieu de culture formulée sous forme de poudre sont saupoudrés sur chaque pièce de non-tissé découpée. L'ensemble est placé entre deux électrodes appliquant un voltage de 3200 V.mm"1, pendant 15 secondes, avec une humidité relative comprise entre 35 % et 45 %.
Une fois l'imprégnation à sec achevée, les pièces de non-tissés sont calandrées à 60°C en appliquant une pression de 3.105 Pa.cm"2.
B2/ - Les milieux de culture formulés en poudre
En vue de tester les dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, différentes compositions de milieu de culture déshydratées ont été utilisées. Celles-ci reprennent la composition des milieux de culture gélosés distribués par la société bioMérieux (France), à l'exception de l'agar agar et autres agents texturants. Il s'agissait plus particulièrement des milieux de la gamme chromlD® (par exemple, chromlD® CPS Elite, chromlD® S. aureus, chromlD® P. aeruginosa, chromlD® VRE, chromlD® Salmonella Elite).
Les dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, ainsi élaborés, ont alors pu être testés pour la détection et l'isolement de bactéries telles que Escherichia coli, Enterococcus faecalis, Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa, Enterobacter cloacae, Clostridium freundii, Streptococcus agalactiae et Serratia marcescens.
Une sélection de résultats obtenus est présentée aux Figures 3 à 13, sous forme de photographies.
B3/ - Les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté
Les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2, qui entrent dans la constitution des dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, sont conçus avant tout de telle façon que, une fois réhydratés, ils puissent offrir aux microorganismes un support adapté à leur croissance et développement. La composition et la consistance de ces feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 ont également été spécifiquement étudiées pour obtenir des surfaces adaptées aux opérations d'isolement et d'étalement des cellules, que ces feuillets d'hydrogel polysaccharidique soient dans un état réhydraté ou déshydraté.
Pour les exemples et les essais qui vont suivre, les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 constitutifs de dispositifs de culture microbiologique selon l'invention ont été préparés en procédant selon la méthode générale ci-après. a) Préparation des hydrogels polysaccharidiques :
Faire chauffer 500 mL d'eau distillée stérile dans un flacon en verre sur plaque chauffante.
Rajouter le(s) gélifîant(s) en quantité définie et attendre que le mélange soit homogène et translucide en continuant de chauffer (porter à ébullition ou proche de Pébulition).
- Après dissolution complète, rajouter le glycérol, homogénéiser et ajouter le(s) sel(s) de cation divalent servant de liant et d'agent durcisseur, homogénéiser et porter à ébullition.
Répartir 5 à 15 mL (selon l'épaisseur souhaitée pour le feuillet) du mélange encore chaud dans des boîtes de Pétri de 47 mm de diamètre.
Laisser refroidir et durcir sur la paillasse, jusqu'à reprise en masse du gélifiant. Démouler les pièces d'hydrogel, à l'aide d'un scalpel si nécessaire.
b) Déshydratation des hydrogels polysaccharidiques :
Enserrer les pièces d'hydrogels entre deux feuilles de papier absorbant. Placer l'ensemble au four, à une température de l'ordre de 40°C, pendant 1 à 6 heures ; l'opération peut également être effectuée pendant au moins une nuit, dans une étuve à chaleur sèche, portée à 32°C.
La Figure 2 est un photographie montrant les feuillets d'hydrogel déshydraté à la sortie du four. A titre indicatif, avec 7 mL de préparation d'hydrogel versés dans les boîtes de Pétri, l'épaisseur des pièces d'hydrogel est de l'ordre de 3 mm, avant leur passage préparation au four ou à l'étuve. Après déshydratation, les feuillets font moins d' 1 mm d'épaisseur.
Les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 d'un dispositif de culture de microbiologique selon l'invention ont été déclinés sous différentes versions, en faisant varier, notamment : la nature du gélifiant polysaccharidique (par exemple, gomme de gellane, gomme de xanthane, gommes de galactomannane, amidon, alginate de sodium, pectine, méthylcellulose et hydroxyméthylcellulose),
la proportion entre l'eau et le gélifiant, utilisée lors de l'étape de préparation des hydrogels polysaccharidiques,
la nature et la quantité des éventuels agents durcisseurs utilisés dans la préparation des hydrogels polysaccharidiques,
la nature et la quantité des additifs éventuellement utilisés pour améliorer les propriétés physico-chimiques des hydrogels polysaccharidiques (hydratés) et/ou des feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté.
B4/ - La membrane perméable intercalaire (optionnelle)
En vue d'améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique, une membrane opaque à la lumière et d'une grande blancheur (par exemple, une blancheur CIE au moins égale à 65) peut être intercalée entre la pièce en matériau absorbant et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté. Cette membrane perméable intercalaire peut consister en une feuille de papier absorbant, de composition cellulosique.
Cl - Evaluation des dispositifs de culture microbiologique selon l'invention
Pour les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté qui présentent une surface pleine, une intégrité structurelle et la tenue mécanique satisfaisante, des essais ont été menés en vue d'évaluer leur capacité à pouvoir constituer des supports de culture microbiologique à la fois performants et compatibles avec les opérations et les moyens mécaniques d'étalement et de dispersion des cellules.
Dans ce contexte, des cultures bactériennes ont été réalisées notamment avec des souches à'Escherichia coli, à'Enterococcus faecalis, de Proteus mirabilis de Staphylococcus aureus, de Serratia marcescens, de Pseudomonas aeruginosa, à'Enterobacter cloacae, Clostridium freundii et de Cronobacter sakazaki. En fonction des bactéries d'intérêt à cultiver, les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté à tester sont associés à des pièces en matériau absorbant incorporant dans leur épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée particulière. La particularité de cette composition de milieu de culture déshydratée réside dans le fait qu'elle a été choisie pour pouvoir être adaptée à la croissance et au développement des bactéries d'intérêt, et qu'elles intègrent des composantes chromogéniques facilitant l'identification visuelle de ces bactéries d'intérêt.
Pour ce faire, les pièces en matériau absorbant, qui incorporent dans leur épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée, sont placées dans des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre, puis humidifiées avec 6-7 mL d'eau distillée stérile. On surmonte alors ces pièces en matériau absorbant d'un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté. Une fois l'hydratation de la pièce en matériau absorbant réalisée, le milieu de culture activé et la couche d'hydrogel polysaccharidique régénérée, le dispositif de culture microbiologique est ensemencé par 10 μΐ^ d'une solution calibrée à une charge bactérienne théorique de 107 ufc/mL. L'échantillon cellulaire est déposé au moyen d'une première oëse sur le premier cadran de la surface d'hydrogel. Le deuxième cadran est ensemencé avec une nouvelle oëse en étirant plusieurs stries à partir du premier cadran. Le troisième cadran est ensemencé comme le deuxième sans changer d'oëse. Le quatrième cadran est ensemencé par des stries non étirées à partir du second cadran.
Les boîtes sont placées dans une jarre avec un peu d'eau de façon à ce que les dispositifs de culture microbiologique ne se dessèchent pas. L'ensemble est alors incubé à 37°C pendant, 24 heures.
Quelques-uns des résultats obtenus ont été compilés et présentés aux Figures 3 à 13, sous la forme de photographies.
A la Figure 3, sont exposées des photographies de cultures et d'isolements d'E. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'hydrogels de gellane 13 g/L (c'est-à- dire 13 g de gomme de gellane pour 1 litre d'eau), de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L (c'est-à-dire 43 mL de glycérol par litre d'eau utilisé dans la préparation de Phydrogel), et durcis avec :
3A : du MgCl2, à raison de 1 g/L (c'est-à-dire 1 g de MgCl2 par litre d'eau utilisé dans la préparation de l'hydrogel) ou
3B : du MgS04, à raison de 1 g/L.
La gomme de gellane utilisée ici pour préparer les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté est du Gelrite®, distribué par la société CARL ROTH GmbH, Allemagne.
Que l'agent durcisseur soit du MgCl2 ou du MgS04, les résultats obtenus sont très similaires. Les colonies d'E. coli poussent à la surface du feuillet d'hydrogel. Elles présentent une très belle taille et une très belle coloration. Leur morphotype correspond à celle des colonies d'E. coli poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromlD® CPS Elite.
A la Figure 4, sont exposées des photographies d'une culture et d'un isolement d'E. coli menés sur un dispositif de culture microbiologique dont le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté a été obtenu à partir d'un hydrogel de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durci avec du CaCl2, à raison de 1 g/L.
La gomme de gellane utilisée ici est du Gelrite®.
Par rapport aux exemples précédents, les colonies d'E. coli apparaissent plus petites, avec une légère diffusion de la coloration en périphérie.
A la Figure 5, est exposée une photographie de cultures et d'isolements d'E. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'hydrogels de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec :
- 5A : du MgCl2, à raison de 1 g/L, ou
5B : du MgCl2, à raison de 5 g/L.
La gomme de gellane utilisée ici est du Gelzan™, distribué par la société CP KELCO, Etats-Unis.
Avec 1 g/L de MgCl2, les colonies d'E. coli poussant à la surface du feuillet d'hydrogel, présentent une très belle taille et une très belle coloration. Leur morphotype correspond à celle des colonies d'E. coli poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromlD® CPS Elite (Figure 5, partie 5C). Avec 5 g/L de MgCl2, les colonies sont plus petites.
Sans MgCl2, les colonies sont très diffuses (Figure 5, partie 5D).
A la Figure 6, sont exposées des photographies de cultures et d'isolements d'E. faecalis menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'hydrogels de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec :
6A : du MgCl2, à raison de 1 g/L,
6B : du MgCl2, à raison de 2 g/L, ou
- 6C : du MgCl2, à raison de 5 g/L.
La gomme de gellane utilisée ici est du Gelzan™.
Les colonies d'E. faecalis poussant à la surface du feuillet d'hydrogel, sont identiques, en taille, en couleur et en morphotype, aux colonies d'E. faecalis poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromlD® CPS Elite.
A la Figure 7, sont exposées des photographies de cultures et d'isolements de P. mirabilis menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'hydrogels de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec :
- 7A : du MgCl2, à raison de 1 g/L,
7B : du MgCl2, à raison de 2 g/L, ou
7C : du MgCl2, à raison de 5 g/L.
La gomme de gellane utilisée ici est du Gelrite®.
Les colonies de P. mirabilis poussant à la surface du feuillet d'hydrogel sont identiques, en taille, en couleur et en morphotype, aux colonies de P. mirabilis poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromlD® CPS Elite.
A la Figure 8, est exposée une photographie de cultures et d'isolements d'E. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'hydrogels de gellane à 13 g/L ou 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec du CaCl2 utilisé à 1 g/L ou 2 g/L : - 8 A, 8 A' : gomme de gellane 13 g/L, CaCl2 1 g/L,
- 8B, 8B' : gomme de gellane 13 g/L, CaCl2 2 g/L,
- 8C, 8C : gomme de gellane 15 g/L, CaCl2 1 g/L,
- 8D, 8D' : gomme de gellane 15 g/L, CaCl2 2 g/L
La gomme de gellane utilisée ici est du Gelzan™.
Les quatre dispositifs de culture microbiologique testés ici donnent des résultats très similaires. Par rapport aux exemples de la Figure 5, dans lesquels MgCl2 est utilisé pour durcir les hydrogels, E. coli forme ici des colonies de taille légèrement plus petites.
A la Figure 9, est exposée une photographie de cultures et d'isolements d'E.faecalis menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'hydrogels de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durcis avec :
- 9A : du CaCl2 1 g/L
- 9B : du CaCl2 2 g/L
- 9C : du CaCl2 3 g/L.
La gomme de gellane utilisée ici est du Gelzan™.
Alors que les exemples précédents correspondant à la Figure 8 laissent présager un certain avantage à utiliser MgCl2 plutôt que CaCl2 pour la culture d'E. coli, ce constat est moins évident pour la culture d'E.faecalis.
A la Figure 10, sont exposées des photographies d'une culture et d'un isolement d'E. coli menés sur un dispositif de culture microbiologique dont le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté a été obtenu à partir d'un hydrogel de gellane 15 g/L, de structure renforcée au glycérol, à raison de 43 mL/L, et durci avec du MnCl2, à raison de 1 g/L.
La gomme de gellane utilisée ici est du Gelrite®.
Par rapport à une culture d'E coli sur le milieu de référence chromlD CPS Elite, les colonies d'E. coli apparaissent ici plus petites, mais leur coloration est notablement intensifiée par le CaCl2. A la Figure 11, sont exposées des photographies de cultures et d'isolements d'E. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'hydrogels polysaccharidiques de compositions variées :
11 A, gomme de gellane 15 g/L (plus précisément du Phytagel , distribué par la société Sigma Aldrich, Etats-Unis), Glycérol 43mL/L, MgCl2 1 g/L,
- 11 A2 : gomme de gellane 30 g/L (Phytagel™), Glycérol 43mL/L, MgCl2 1 g/L,
- 1 lBi : gomme de gellane 25 g/L (Gelrite®), Glycérol 43mL/L, MgCl2 1 g/L,
- 11B2 : gomme de gellane 20 g/L (Gelrite®), Glycérol 43mL/L, MgCl2 1 g/L,
- 11B3 : gomme de gellane 8 g/L (Gelrite®), Glycérol 43mL/L, MgCl2 1 g/L,
- 11B4 : gomme de gellane 6 g/L (Gelrite®), Glycérol 43mL/L, MgCl2 1 g/L,
- 1 lCi : gomme de gellane 20 g/L (Gelzan™), Glycérol 43mL/L, MgCl2 1 g/L,
- 11C2 : gomme de gellane 8 g/L (Gelzan™), Glycérol 43mL/L, MgCl2 1 g/L,
- l lDi : gomme de xanthane 0,5 g/L, distribuée par la société SIGMA ALDRICH,
France,
- 11D2 : gomme de xanthane 10 g/L
- 1 lEi, 1 lEi ' : amidon de pomme de terre 0,5 g/L, distribué par la société CARL ROTH
GmbH, Allemagne.
- 11E2, 11E2' : amidon de pomme de terre 15 g/L
A la Figure 12, sont exposées des photographies de cultures et d'isolements d'E. coli menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'hydrogels de gellane 15 g/L (en l'occurrence, du Gelrite®), durcis avec du MgCl2 à raison de 1 g/L, et dont la structure a été renforcée au glycérol à différentes concentrations :
- 12A : 32 mL/L
- 12B : 52 mL/L
- 12C : 62 mL/L
En augmentant la concentration de glycérol des hydrogels, E. coli forment de plus grosses colonies, qui semblent néanmoins moins bombées et plus étalées sur les hydrogels. A la Figure 13, sont exposées des photographies de cultures et d'isolements de microorganismes menés sur des dispositifs de culture microbiologique dont les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont été obtenus à partir d'un hydrogel de Gelzan™ 15 g/L, durcis avec du MgCl2, à raison de 1 g/L.
Ces dispositifs de culture microbiologique ont été testés également avec succès pour la culture et la détection de Streptococcus agalactiae (13 A), de Serratia marcescens, (13B), et pour la co-culture et la co-détection de S. marcescens et S. aureus (13C).

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de culture microbiologique, comprenant :
- une pièce en matériau absorbant (1) ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée,
- reposant sur ladite pièce en matériau absorbant (1), un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) et réhydratable à des températures comprises entre 5°C et 40°C ; ledit feuillet d'hydrogel déshydraté (2) étant apposé directement sur la face supérieure de ladite pièce en matériau absorbant (1), ou indirectement au travers d'une membrane perméable intercalaire (3).
2. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 1, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est un feuillet d'hydrogel déshydraté de gellane, de xanthane, de galactomannane, d'amidon et/ou d'un mélange de ceux-ci.
3. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 1 ou 2, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) a été préparé par déshydratation d'une couche d'hydrogel de composition à base d'eau et d'au moins un gélifiant polysaccharidique choisi parmi une gomme de gellane, une gomme de xanthane, une gomme de galactomannane, de l'amidon et un mélange de ceux-ci.
4. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 3, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel polysaccharidique préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,1 à 30 g d'au moins un gélifiant polysaccharidique.
5. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de gellane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 10 à 20 g de gomme de gellane et, préférentiellement, 13 à 15 g de gomme de gellane.
6. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de xanthane, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,2 à 10 g de gomme de xanthane.
7. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de xanthane et de gallactomannane, préalablement préparée à partir d'un mélange de gomme de xanthane et de gomme de graine de caroube.
8. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel d'amidon, préalablement préparée en mélangeant à un litre d'eau, 0,5 à 15 g d'amidon.
9. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est obtenu par déshydratation d'une couche d'hydrogel de gellane et d'amidon, préparée à partir d'un mélange de gomme de gellane et d'amidon, avec un ratio pondéral [gomme de gellane]/[amidon] compris entre 40 : 1 et 2 : 3.
10. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 4, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) est renforcé structurellement par voie chimique au moyen d'un additif de renfort choisi parmi le glycérol, l'éthylène glycol et le polyéthylène glycol.
11. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) comprend, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi les sels de cation divalent.
12. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) comprend, en outre, au moins un agent durcisseur choisi parmi le chlorure de magnésium (MgCl2), le chlorure de calcium (CaCl2), le sulfate de magnésium (MgSC^) et le chlorure de manganèse (MnCl2).
13. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, dans lequel ledit feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) comprend, en outre, au moins un agent plastifiant.
14. Dispositif de culture microbiologique selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que, non-calandrée, ladite pièce en matériau absorbant (1) présente une masse surfacique comprise entre 50 g.m"2 et 150 g.m"2, pour une épaisseur comprise entre 0,5 mm et 10 mm.
15. Dispositif de culture microbiologique en kit à assembler, comprenant :
- au moins une pièce en matériau absorbant (1) ayant une face supérieure au moins sensiblement plane et incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture déshydratée,
- au moins un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté (2) et réhydratable à des températures comprises entre 5°C et 40°C, et
- optionnellement, au moins une membrane perméable intercalaire (3).
16. Dispositif de culture microbiologique en kit à assembler selon la revendication 15, permettant le montage d'un dispositif de culture microbiologique tel que défini par l'une quelconque des revendications 1 à 14.
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