WO2020208311A1 - Dispositif de culture microbiologique - Google Patents

Dispositif de culture microbiologique Download PDF

Info

Publication number
WO2020208311A1
WO2020208311A1 PCT/FR2020/000095 FR2020000095W WO2020208311A1 WO 2020208311 A1 WO2020208311 A1 WO 2020208311A1 FR 2020000095 W FR2020000095 W FR 2020000095W WO 2020208311 A1 WO2020208311 A1 WO 2020208311A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
microbiological
microbiological culture
culture device
culture medium
dehydrated
Prior art date
Application number
PCT/FR2020/000095
Other languages
English (en)
Inventor
Marie Pierre MONTET
Christine ROZAND
Original Assignee
bioMérieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by bioMérieux filed Critical bioMérieux
Publication of WO2020208311A1 publication Critical patent/WO2020208311A1/fr

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M25/00—Means for supporting, enclosing or fixing the microorganisms, e.g. immunocoatings
    • C12M25/02—Membranes; Filters
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M41/00—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation
    • C12M41/30—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration
    • C12M41/36—Means for regulation, monitoring, measurement or control, e.g. flow regulation of concentration of biomass, e.g. colony counters or by turbidity measurements

Definitions

  • the present invention belongs to the field of microbiology and relates more particularly to the culture, detection and / or G identification of microorganisms possibly present in a sample to be analyzed, to be controlled.
  • the present invention relates more specifically to the alternative solutions proposed to traditional agar culture media, intended in particular for the culture, detection and / or identification of microorganisms present in a sample to be analyzed.
  • agar culture media have some major drawbacks. Indeed, when agar culture media in a Petri dish are produced in an artisanal way, they require time (at least one hour) and numerous operations (weighing of ingredients, dissolutions, autoclaving, pouring, distribution in Petri dishes) . In particular, in small-sized biological analysis laboratories, the preparation of these culture media is a time-consuming and low-value post. In addition, these solid or semi-solid media are extremely sensitive to any form of biological contamination. Finally, because of the great difficulty in ensuring sterility, “artisanal” agar media must be prepared extemporaneously or almost extemporaneously.
  • Petrifilm TM industrial microbiological culture devices
  • These devices are formed of two waterproof films, affixed one on the other. At the interface, the internal face of each of the two films is covered with an adhesive composition making it possible to adhere thereto a thin layer of water-soluble powder (s) when cold. Either each side is covered with a different powder, one corresponding to a composition of dehydrated and micronized culture medium and the other corresponding to a gelling agent also micronized. Either the two faces are covered with the same powder formed by a mixture between a composition of dehydrated culture medium and a gelling agent, both micronized.
  • the rehydration of the medium is done by the sample, or its decimal dilutions, or by suitable diluents (EPT, Tryptone-salt, Letheen, ...) for the surface controls.
  • this device requires for its manufacture a step of adhesion of the dehydrated nutrients on the films which had to be glued beforehand. Thus a low surface layer of medium is available. The volume of the liquid sample required for the microbiological analysis cannot then exceed 1 or 2 mL, which impacts the detection sensitivity threshold. Then, due to its packaging, Petrifilm TM does not allow you to have several different culture media on the same device. In addition, this device remains limited in its applications and cannot, for example, be used as swabs or dressings. And finally, the Petrifilm TM necessarily requires the help of an outside operator bringing the aqueous sample.
  • the 3M Company has also filed patent application WO2017 / 019345 which describes a microbial detection device.
  • This device comprises a waterproof pocket which comprises two compartments and a porous filtration membrane disposed in the pocket between the two compartments.
  • a gelling agent soluble in water, dry, is stuck to the bag in the first compartment and an absorbent pad is placed in the second compartment under the filtration membrane.
  • An orifice which can be hermetically sealed allows the sample to be analyzed to pass into the first compartment. Once introduced into the first compartment of the device, the sample to be analyzed diffuses into the second compartment of the device, passing through the filtration membrane and then through the absorbent pad.
  • the filtration membrane allows the passage of liquid from the first compartment to the second compartment and prevents the passage of particles of a predetermined size, in particular microorganisms.
  • the gelling agent allows the microorganisms present in the sample to develop at the level of the filtration membrane during incubation, which will subsequently enable them to be counted. In one embodiment of this invention, it is intended to add nutrients to the gelling agent in the device to promote the cultivation of the microorganisms.
  • the purpose of the absorbent pad is to absorb most of the liquid in the sample so that the gelling agent is only hydrated by a fraction of the liquid sample. The liquid sample is kept in the second compartment during incubation.
  • the device has many drawbacks. First of all, as indicated in this application, the device is not suitable for the analysis of volumes greater than 150 mL. The fact that the sample is stored in the second compartment limits the volume of sample to be analyzed. However, according to European Directive n ° 98/83 / CE of 03/11/98 relating to the quality of water intended for human consumption, the quantities of sample to be analyzed are greater than 150 mL. By way of example, this volume is 250 ml for bacteria such as Ksche ri chia coli, Enterococci or even Pseudomonas aeruginosa. This device also has the disadvantage of not controlling the residual liquid present on the membrane in the event of too large a sample volume.
  • the microbiological culture support is formed by a sheet of absorbent fibrous material, integrating in its mass a dehydrated nutrient composition, optionally also selective and / or discriminating (cf. for example, EPI 179586).
  • an alcoholic suspension is prepared by mixing, in ethanol, a composition of culture medium, an adhesive soluble both in water and in ethanol (for example, poly [oxide of ethylene] and hydroxypropylcellulose) and a gelling agent soluble in water but insoluble in ethanol (eg locust bean gum, guar gum, carrageenan, hydroxyethylcellulose).
  • a composition of culture medium for example, poly [oxide of ethylene] and hydroxypropylcellulose
  • a gelling agent soluble in water but insoluble in ethanol eg locust bean gum, guar gum, carrageenan, hydroxyethylcellulose.
  • the Applicant proposes ready-to-use microbiological culture devices dedicated to the detection, identification and / or enumeration of microorganisms.
  • These devices are based on a culture support made of fibrous and absorbent material, incorporating in its thickness a composition of culture medium.
  • a dehydrated culture medium in powder form is spread over the support homogeneously then the support is placed between two electrodes by applying a certain voltage for a few seconds at relative humidity. Then the support is calendered by applying pressure. The support is thus crossed by culture medium in powder form.
  • the object of the present invention is thus to provide a microbiological culture device which, while offering a long shelf life, including at room temperature, provides a real alternative to traditional agar culture media.
  • Another objective of the present invention is to be able to provide a microbiological culture device which is compatible with the constraints of industrial and commercial exploitation, in particular in terms of production cost and therefore of profitability.
  • the present invention makes it possible to control the amount of culture medium used according to need and to simplify the implementation of the protocol.
  • the present invention aims to provide a microbiological culture device of design and manufacture adapted to the installations and means of production currently used in the industry of microbiological culture media and devices.
  • the present invention therefore provides a microbiological culture device comprising all or part of a dehydrated microbiological culture medium in powder form, characterized in that:
  • said device comprises at least two parts of hydrophilic and absorbent material having an upper face at least substantially planar, and comprising between two contiguous parts said dehydrated microbiological culture medium in powder form, and
  • said dehydrated microbiological culture medium comprises at least one gelling agent in powder form.
  • Another object of the invention relates to a microbiological culture device comprising all or part of a dehydrated microbiological culture medium in powder form, characterized in that: said device consists of at least two pieces of hydrophilic and absorbent material having an at least substantially planar upper face, and consists of, between two adjoining pieces, said dehydrated microbiological culture medium in powder form, and
  • said dehydrated microbiological culture medium comprises at least one gelling agent in powder form.
  • the microbiological culture device When in use, the microbiological culture device according to the invention must be hydrated in order to be activated. To do this, the microbiological culture device is hydrated by a liquid sample which happens to be the sample to be analyzed. It is also possible to hydrate the microbiological culture device, firstly, with a liquid to activate it and then to put it in contact with the sample to be analyzed in a second step. Thus, the culture medium composition comprising the gelling agent, both initially present in a dry state, are thus solubilized and activated.
  • the microbiological culture medium and the solubilized gelling agent (s) will give a gel-like consistency to the microbiological culture device, which will allow the distribution of the nutritive ingredients and the active agents of the culture medium as close as possible to the microorganisms. , thus promoting their establishment and, where appropriate, their growth and detection.
  • a microbiological culture medium refers to a nutrient composition allowing the growth and development of cells, more particularly bacteria, molds and / or yeasts. These media make it possible to meet the nutritional needs of the microorganisms to be cultivated.
  • sterile water usually distilled or deionized water
  • at least one carbohydrate as a carbon and energy source
  • other nutrients including amino acids, growth factors, vitamins, minerals, trace elements, iron salts, sodium citrate, sodium chloride, etc.
  • compositions chemically complex such as mixtures of peptones (from milk, meat and / or potato starch, corn, etc.), yeast extracts, serum, and / or tissue extracts of animal origin or vegetable ...
  • a microbiological culture medium within the meaning of the present invention can optionally demonstrate a certain selectivity with regard to target microorganisms, that is to say it promotes the development of these target microorganisms rather than that of the ancillary flora, and / or that it inhibits and / or slows down the development of the ancillary flora.
  • This selective effect can in particular be obtained by means of the use of agents with an inhibiting effect for the ancillary flora or of agents with an activating effect for the target microorganisms.
  • a culture medium within the meaning of the present invention can optionally demonstrate discriminating abilities making it possible to differentiate, to visually distinguish the different categories of microorganisms growing on this same culture medium.
  • the culture medium advantageously incorporates a chromogenic and / or fluorogenic component allowing visual observation of the microorganisms as a function of the particular metabolic activities that they express.
  • composition and formulation of numerous culture media are described in particular in 1 st HANDBOOK OF MICROBIOLOGICAL MEDIA (2010; 4 th Edition).
  • the culture medium is dehydrated and in powder form.
  • the term “powder” is understood to mean particles having a particle size of 1 to 200 ⁇ m. Micronization of minority compounds such as substrates, antibiotics, is possible to improve the homogenization of the powder.
  • the dehydrated culture medium is directly in contact with the two parts made of hydrophilic and absorbent material.
  • the amount of dehydrated culture medium in powder form is between 0.009 g.cm 3 and 0.050 g.cm 3 , preferably between 0.020 g. cm 3 and 0.036 g.cm 3 , more preferably between 0.018 g.cm 3 and 0.022 g.cm 3
  • the present invention has the advantage of allowing optimized growth in particular due to the optimum amount of culture medium without requiring the culture medium to be in excess to allow growth of the microorganisms. This thus overcomes one of the drawbacks of the prior art, in fact an excess of nutrients which make up the culture medium can be toxic to bacteria, preventing their growth and detection. Furthermore, this excess addition of the culture medium also constitutes a drawback in terms of production cost.
  • the culture medium further comprises at least one gelling agent also in powder form.
  • the gelling agent (s) Once activated, rehydrated, with an aqueous sample or with a liquid, the gelling agent (s) will make it possible to create an assembly exhibiting a certain structural integrity and mechanical coherence.
  • the gelling agent (s) due to their presence in contact with the culture medium, the gelling agent (s) will give the microbiological device according to the invention a gel-like consistency thus promoting the implantation of microorganisms and will also allow the constituent elements of the culture medium. , such as nutritive ingredients or active agents, to be found as close as possible to microorganisms.
  • the gelling agent is chosen from: a xanthan gum, alginate, a gellan gum, a galactomannan gum, locust bean gum, starch, and a mixture of these.
  • the culture medium of the device according to the invention comprises at least one gelling agent, the amount of which is between 0.0030 g.cm 3 and 0.020 g.cm 3 .
  • a sample means a sample, or a small part or a small amount of this sample, taken for the purpose of analysis.
  • the sample may be a sample of biological origin containing or suspected of containing microorganisms to be detected, enumerated, identified and / or characterized. These biological samples can be of human, animal, plant or environmental origin.
  • the sample can also have an industrial origin and come from samples taken from a manufactured product (for example a food product) or a product in process, or from instruments, installations encountered in an industrial environment.
  • the industrial sectors targeted here are more particularly the agro-food, pharmaceutical, cosmetics and veterinary industries, medical devices, the microbiology of environmental controls (water, air, surfaces).
  • the sample is liquid and will allow the rehydration of the microbiological culture device, in particular the rehydration of the culture medium and of the parts made of hydrophilic and absorbent material. This will keep the device moist and thus allow the migration of nutrients in this device.
  • an appropriate volume of liquid is added to the sample and / or to the microbiological culture device in order to rehydrate the culture medium, when the sample is not liquid or insufficiently liquid.
  • the appropriate volume of liquid or of the aqueous sample will choose the appropriate volume of liquid or of the aqueous sample as a function of its viscosity, of the diameter, of the porosity and of the absorption capacity of the porous support, of the quantity of powder (medium culture and gelling agent) this in order to rehydrate the device and allow the growth of microorganisms.
  • the rehydration of the microbiological culture device requires a volume of liquid or aqueous sample greater than 1 mL, preferably greater than 3 mL, even more preferably greater than 4 mL, which makes it possible to improve the sensitivity of detection when the microorganisms are in low concentration in the sample.
  • the sample can comprise a preliminary step of preparation, concentration or dilution of the sample.
  • microorganism covers Gram-positive or Gram-negative bacteria, yeasts, molds, amoebae and more generally, unicellular organisms, invisible to the naked eye, which can be manipulated and multiplied by laboratory.
  • the microorganism is a bacterium, Gram positive or negative, a yeast or a mold.
  • Gram-positive bacteria examples include bacteria of the following genera: Enterococcus, Streptococcus, Lactobacillus, Bifidobacterium, Staphylococcus, Bacillus, Listeria, Clostridium, Mycobacteria, Nocardia, Corynebacteria, Micrococcus and Deinococcus.
  • Gram-negative bacteria examples include bacteria of the following genera: Salmonella, Escherichia coli and Pseudomonas.
  • yeasts As examples of yeasts, mention may be made of yeasts of the following genera: Candida, Cryptococcus, Saccharomyces and Trichosporon.
  • the microbiological culture device comprises or consists of at least two parts made of hydrophilic and absorbent material.
  • Numerous absorbent materials hydrophilic and non-water-soluble, can be used to produce the part made of absorbent material for a microbiological culture device according to the invention. These materials are mainly chosen for their absorbency, their capacity to retain aqueous liquids and their ability to let aqueous liquids pass through them in all directions.
  • said piece of absorbent material is made from a substrate of short nonwoven fibers, constituting an assembly having structural integrity and mechanical consistency.
  • substrates are natural cellulosic fiber (such as cotton) or synthetic (such as rayon), modified cellulosic fiber (eg carboxymethylcellulose, nitrocellulose), fiber of absorbent chemical polymers (such as polyacrylate salts , acrylate / acrylamide copolymers).
  • said piece of absorbent material is of nonwoven fabric made of cellulose fibers.
  • the parts made of hydrophilic and absorbent material of the same device may have the same density or have a different density.
  • the parts made of hydrophilic and absorbent material of the same microbiological culture device according to the invention may have the same or different thickness.
  • the part made of hydrophilic and absorbent material will have a density of between 0.045 g.cm 3 and 0.10 g. cm 3 , preferably between 0.05 g.cm 3 and 0.07 g.cm 3 .
  • the parts made of hydrophilic and absorbent material of the same microbiological culture device according to the invention can have a thickness of between 0.5 mm and 2 mm.
  • the part made of hydrophilic and absorbent material has a thickness of 0.8 mm to 1.8 mm, more preferably from 1 to 1.5 mm.
  • the surface of the part made of hydrophilic and absorbent material is between 1 cm 2 and 40 cm 2, preferably between 10 cm 2 and 30 cm 2 , more preferably between 15 cm 2 and 25 cm 2 .
  • the part made of hydrophilic and absorbent material is able to retain a volume of water greater than 2 mL, preferably greater than 3 mL.
  • a porous support of 25 cm 2 of surface area and a thickness of 1 mm after calendering will have the capacity to retain a volume of water of 3 mL.
  • the microbiological culture device has undergone a calendering operation. Calendering, by the pressure and the heating temperature generated, allows the retention and maintenance stable over time of the dehydrated reaction medium comprising the gelling agent (s) in the microbiological culture device, ensuring the retention of the various elements such as nutrients between the pieces of hydrophilic and absorbent material. It also makes it possible to obtain a strictly smooth and flat upper surface of the microbiological culture device.
  • calendering is carried out at a temperature above ambient temperature, preferably at a temperature between 30 ° C and 60 ° C.
  • a temperature below 60 ° C makes it possible not to denature the thermolabile compounds of the culture medium.
  • Calendering allows, in addition to accelerating the rehydration of the microbiological culture device with respect to an uncalendered microbiological culture device, compression of the fibers constituting the microbiological culture device. This compression, associated with the presence of the dehydrated medium within the device allows simultaneous rehydration in all the zones of the device placed horizontally and thus preserves the distribution of the substances.
  • Calendering thus makes it possible to maintain the reaction medium inside the microbiological culture device and makes it easy to handle.
  • the device comprises at least one protective upper layer.
  • the protective layer or layers are placed on the face of the part made of hydrophilic and absorbent material which is not in contact with the culture medium. In this embodiment, no other layer is placed between the protective layer and the face of the part (s) made of hydrophilic and absorbent material.
  • the protective layer is placed directly on the microbiological culture device. A person skilled in the art will know how to define a sufficient space between the protective layer and the culture device to have sufficient oxygen to allow microbial growth.
  • the protective layer can be translucent or transparent allowing visibility of the colonies through this layer.
  • the latter must be compatible with microbial physiology. It allows in particular to avoid contaminations during incubation. It is impermeable to bacteria and limits the loss of water vapor.
  • the device is incubated for a predetermined time and at a predetermined temperature allowing the growth of the microorganisms independently of the ambient humidity conditions.
  • the nature of the upper layer is chosen so as to allow the gas exchanges necessary for the growth of microorganisms while allowing local hydration.
  • the device comprises a microbiological filtration membrane which covers at least one of the upper parts of hydrophilic and absorbent material of the device.
  • a microbiological filtration membrane covers the face of at least one of the parts made of hydrophilic and absorbent material which is not in contact with the culture medium.
  • a microbiological filtration membrane is a filter which is permeable to water and which retains microorganisms, in particular at its surface.
  • This membrane is also permeable to the nutrients of the culture medium and to any additive elements included in this culture medium located between two parts under the microbiological filtration membrane.
  • This membrane can comprise a porous body which can be constituted by a material which by its nature, its size, its steric arrangement has these properties. This porous body can have these properties by the arrangement of pores.
  • the microbiological filtration membrane can for example be based on one or more materials, or derivatives of these materials, among latex, polytetrafluoroethylene, poly (vinylidene) fluoride, polycarbonate, polystyrene, polyamide, polysulphone, polyethersulfone, cellulose, a mixture of celluloses and nitrocellulose.
  • the microbiological filtration membrane is produced in the form of a porous membrane permeable to nutrients and any additive elements included in the culture medium, and capable of retaining microorganisms at its surface.
  • the microbiological filtration membrane covers the entire upper surface of the microbiological culture device.
  • microfiltration membranes of water and in general of liquids
  • They generally exhibit the properties required for use as a microbiological filtration membrane. They make it possible to obtain very good resistance to tearing during handling, controlled porosity, a smooth surface, a thin thickness and most of the time a high hydrophilicity.
  • Their color generally white, but can also be black, makes it possible to optimize the differentiation of colored colonies on their surface.
  • the filtration capacity and hydrophilicity of such filtration membrane are used to allow and optimize the passage of nutrients and any additive elements present in the culture medium (possibly after its rehydration) to an upper surface of the microbiological filtration membrane while preventing or limiting the reverse migration of microorganisms filtered to the upper surface of the microbiological filtration membrane.
  • filtration membranes are indifferently designated filtration membranes, microfiltration membranes or even filter membranes, these expressions being synonymous with one another.
  • These filtration membranes are included in the group consisting of porous membranes.
  • the microbiological filtration membrane allows the passage of nutrient medium elements and selective or reactive agents while preventing or limiting the migration of microorganisms to the underlying layers, especially in parts made of hydrophilic and absorbent material.
  • the microbiological filtration membrane comprises pores the diameter of which is between 0.01 and 0.8 ⁇ m, preferably between 0.2 ⁇ m and 0.6 ⁇ m so as to retain the microorganisms on its surface.
  • the microbiological filtration membrane comprises pores whose diameter is between 0.25 ⁇ m and 0.5 ⁇ m, for example between 0.3 ⁇ m and 0.45 ⁇ m, or else between 0.35 ⁇ m. pm and 0.4 pm.
  • it may be a layer having no measurable pores such as a dialysis membrane.
  • the microbiological filtration membrane may be a Fisherbrand TM General Filtration Membrane Filters marketed by Fisher Scientific Company LLC, 300 Industry Drive, Pittsburgh, PA 15275, USA, or alternatively a Nitocellulose Membrane filtration membrane, manufactured by Zefon International, Inc., 5350 SW St Lane, Ocala, FL 34474, USA, or similar membranes.
  • the device comprises a microbiological filtration membrane which covers at least one of the pieces of hydrophilic and absorbent material
  • said device does not include a protective top layer.
  • the part of the upper hydrophilic and absorbent material of the device is covered by a surface layer.
  • the surface layer covers the face of at least one of the parts made of hydrophilic and absorbent material which is not in contact with the culture medium.
  • This surface layer has the function of blocking the diffusion microorganisms to the underlying layers but also for certain applications to allow the operations of isolation and spreading of the cells. This surface layer is also dehydrated.
  • a dehydrated surface layer according to the invention can in particular be as described in applications WO2014 / 013089, WO 2015/107228 or else WO2018 / 197805.
  • this dehydrated surface layer is a (micro) filtration membrane with narrow pores, made of latex, polytetrafluoroethylene, poly (vinylidene) fluoride, polycarbonate, polystyrene, polyamide, polysulfone, polyethersulfone, cellulose and / or nitrocellulose.
  • the surface layer is obtained from a mixture of kaolin pigments, talc, titanium dioxide, and / or calcium carbonate, and a binder of the styrene butadiene latex type , styrene acrylic latex or carboxyl methyl cellulose.
  • the surface layer consists of a dehydrated polysaccharide hydrogel having the particularity of being rehydratable at room temperature.
  • the dehydrated surface layer according to the invention provides the surface of the microbiological culture device with a lubricating effect which facilitates the mechanical operations of spreading and dispersing the cells. Also, by its gel-like consistency, it promotes the implantation of microorganisms as close as possible to the nutritive ingredients and the active agents of the culture medium.
  • the underlying microbiological device in addition to its role in the conservation and distribution of the culture medium composition, its structure contributes to the overall rigidity and firmness of the surface of the microbiological culture device, ensuring its compatibility with the considering the pressure and friction forces exerted by the tools and instrumentation used to spread and disperse cells.
  • the microbiological culture device comprises a microbiological filtration membrane or a surface layer which covers the face of at least one of the parts made of hydrophilic and absorbent material of the microbiological device
  • the latter can also include a permeable membrane interposed between the part made of hydrophilic and absorbent material and the microbiological filtration membrane or the surface layer.
  • this permeable interlayer membrane are chosen so that the latter hinders the passage of aqueous sample as little as possible through the various layers of the microbiological culture device.
  • it can be made from a substrate of natural cellulosic fiber (like cotton) or synthetic (like rayon), modified cellulose fiber (for example, carboxymethylcellulose, nitrocellulose), polymer fiber.
  • absorbent chemicals such as polyacrylate salts, acrylate / acrylamide copolymers
  • stable protein fibers such as silk, wool.
  • this permeable membrane can be used for very diverse purposes, such as for example:
  • said intermediate permeable membrane is used in order to improve the contrast and the observation of the colonies growing on the surface of the microbiological culture device.
  • it is chosen to be sufficiently opaque to light and of great whiteness (for example, a CIE whiteness of at least 65).
  • microbiological culture devices according to the invention and the methods of use thereof allow the main constituent elements, such as in particular:
  • the at least two pieces of hydrophilic and absorbent material comprising between them a dehydrated microbiological culture medium in powder form, and optionally
  • microbiological culture device can be packaged and marketed in different forms, in particular:
  • a composite microbiological culture device pre-assembled and assembled, in which it is surmounted by a microbiological filtration membrane with or without a permeable interlayer membrane;
  • a pre-assembled and assembled microbiological culture device, composite in which it is surmounted by a dehydrated surface layer with or without a permeable interlayer membrane;
  • kits comprises at least one microbiological culture device according to the invention, optionally with at least one permeable intermediate membrane and / or at least one microbiological filtration membrane or at least one dehydrated surface layer.
  • the microbiological culture device according to the invention is used as a hydrating support comprising a reaction medium in an analysis device for hydrating, with a liquid sample, this hydrating support.
  • a hydrating support comprising a reaction medium in an analysis device for hydrating, with a liquid sample, this hydrating support.
  • the microbiological culture device according to the invention is used in a microbiological control device, to control a liquid.
  • a microbiological control device to control a liquid.
  • Such a device is described, for example, in application WO2018 / 189478 or also in application PCT / FR2020 / 000076.
  • the microbiological control device can be coupled to a filtration membrane, as described above, in the microbiological control device.
  • This microbiological control device makes it possible to carry out simplified control operations of a liquid to be analyzed which may contain at least one microorganism, even outside a microbiological laboratory, including in an industrial environment.
  • the invention also relates to a method for the detection and / or identification and / or enumeration of at least one target microorganism in an aqueous sample liable to contain it, comprising the following steps:
  • microbiological culture device for the detection and / or identification and / or enumeration of microorganisms according to the invention, b. bringing said aqueous sample into contact with said microbiological culture device according to the invention,
  • microorganism colony (s) within the microbiological culture device, when the desired microorganisms are present in the sample.
  • the microbiological culture device is brought into contact with the sample.
  • the aqueous sample can be added manually using a pipette, syringe or automatically into the device. It can also be contained in at least one reservoir integrated into the device and / or channels allowing rehydration of the microbiological culture device. It then spreads in the microbiological culture device by simply pressing the reservoir.
  • the aqueous sample comes directly from an area producing the liquid to be tested. It may be, for example, an exuding wound, foodstuffs releasing liquids during their storage. The sample, by its nature, will release some of its constituent liquids which over time will soak up the microbiological culture device.
  • the producing area of the test sample can also be a perineal area of humans or animals excreting urine.
  • the microbiological culture device is then placed near this zone and is gradually impregnated with the aqueous sample produced.
  • the sample is brought into contact with the microbiological culture device by taking the sample using the microbiological culture device.
  • the microbiological culture device is then used as a swab and the operator should place the swab in a tube containing the appropriate amount of liquid if the sample is not aqueous or insufficiently aqueous.
  • the device is then incubated in situ (in the case of dressings, diapers, etc.) or in an incubator for a sufficient period of time to allow the detection of the microbial colonies within the microbiological culture device.
  • the method according to the invention is a detection method which can be implemented by visual or optical reading of the microbiological culture device.
  • the invention also relates to the use of a microbiological culture device according to the invention, to detect and / or identify and / or enumerate at least one target microorganism in a sample likely to contain it.
  • the invention relates to the use of a device comprising a rod at the end of which said porous support is fixed, as a swab.
  • the invention relates to the use of a device according to the invention as a dressing.
  • the invention also relates to the use of a device according to the invention as a diaper.
  • the invention relates to the use of a device according to the invention as packaging for foodstuffs.
  • FIG. l is a schematic representation of a microbiological culture device according to the invention.
  • FIG.2 is a schematic representation of a microbiological culture device according to the invention further comprising a microbiological filtration membrane;
  • FIG.3 is a schematic representation of a microbiological culture device according to the invention further comprising a surface layer
  • FIG.4 is a schematic representation of a microbiological culture device according to the invention further comprising a microbiological filtration membrane and a permeable intermediate membrane
  • FIG.5 is a schematic representation of a microbiological culture device according to the invention further comprising a surface layer and a permeable intermediate membrane;
  • FIG. 6 is a schematic representation of an IA microbiological culture device according to the invention before and after hydration by the aqueous sample;
  • FIG. 7 is a schematic representation of an IB or 1D microbiological culture device according to the invention before and after hydration by the aqueous sample;
  • FIG. 8 is a schematic representation of an IC or 1E microbiological culture device according to the invention before and after hydration with water;
  • FIG.9 is a schematic exploded perspective representation of a microbiological control device for controlling a liquid comprising a microbiological culture device according to the invention and a microbiological filtration membrane;
  • FIG.10 is a schematic perspective representation of the assembled microbiological control device
  • FIG. 11 photographs of Escherichia coli cultures taken on the 1 A microbiological culture device, according to the invention.
  • FIG. 12 photographs of cultures of Escherichia coli taken on the microbiological culture device 1 A, according to the invention.
  • FIG. 13 photographs of cultures and isolates of Escherichia coli and interococcus faecalis carried out on the IC microbiological culture device according to the invention.
  • a microbiological culture device 1 A consists, first of all, two parts of hydrophilic and absorbent material 2 and 2 ', more or less thick and a microbiological culture medium dehydrated 3 in powder form comprising at least one gelling agent 4 also in powder form.
  • these pieces of absorbent material 2 and 2 ’ are substantially circular in shape.
  • the parts made of absorbent material 2 and 2 ′ comprise between two adjacent parts a composition of dehydrated culture medium 3 in powder form.
  • This culture medium composition comprises at least one gelling agent 4 in powder form.
  • the microbiological culture device IB comprises two parts of absorbent material 2 and 2 ', a culture medium 3 in powder form itself comprising at least one gelling agent 4 in powder form and a microbiological filtration membrane 5.
  • the microbiological filtration membrane is produced in the form of a porous membrane permeable to nutrients and any additive elements included in the culture medium, and capable of retaining microorganisms on its surface.
  • the microbiological culture device IC comprises two parts made of absorbent material 2 and 2 ', a culture medium 3 in powder form itself comprising at least one gelling agent. 4 in powder form and a dehydrated surface layer 6.
  • the dehydrated surface layer 6 is a dehydrated polysaccharide hydrogel sheet. It is formed by drying / dehydrating a layer of polysaccharide hydrogel, and its mechanical structure can be reinforced by means of a fibrous reinforcement, for example a woven.
  • the 1D microbiological culture device comprises two parts made of hydrophilic and absorbent material 2 and 2 ', a culture medium 3 in powder form itself comprising at least a gelling agent 4 in powder form, a microbiological filtration membrane 5 and an intermediate permeable membrane 7.
  • the latter has a CIE whiteness at least equal to 65.
  • the microbiological culture device 1E according to yet another embodiment of the invention comprises two parts made of hydrophilic and absorbent material 2 and 2 ', a culture medium 3 in powder form itself comprising at least a gelling agent 4 in powder form, a dehydrated surface layer 6 and an intermediate permeable membrane 7.
  • the dehydrated surface layer 6 is a dehydrated polysaccharide hydrogel sheet and the intermediate permeable membrane 7 has a CIE whiteness of at least 65.
  • microbiological culture devices IA, IB, IC, 1D and 1E according to the invention can be supplied already pre-assembled, joined together, or else in the form of distinct and independent elements: the parts made of hydrophilic and absorbent material, the membrane filtration, the surface layer, the permeable interlayer membrane and powders of culture media and gelling agents.
  • a receptacle 8 ( Figures 6, 7 or 8) is associated with the microbiological culture device to facilitate handling, in particular for the stage of rehydration and activation of the device, and for any movement (for example, transfer from the bench to the incubator).
  • the use of a microbiological culture device according to the invention requires activation of the device by virtue of hydration by an aqueous sample 9.
  • the microbiological culture device IA is placed inside the receptacle 8, with one of the two pieces of hydrophilic and absorbent material 2 or 2 "facing upwards.
  • the sample 9 is poured onto the microbiological device in the receptacle 8.
  • the volume of water used is more or less calibrated in order to be able to sufficiently humidify the device IA and to dissolve. the composition of the culture medium it contains.
  • the microbiological culture device IB or 1D is placed inside the receptacle 8, with the microbiological filtration membrane 5 facing upwards.
  • sample 9 is poured onto this filtration membrane microbiological 5 positioned on the microbiological device in the receptacle 8.
  • the volume of water used is more or less calibrated to be able to sufficiently humidify the device and dissolve the composition of culture medium that it contains.
  • the hydration of the various microbiological culture devices makes it possible to solubilize the composition of culture medium 3 as well as the gelling agent. 4 contained between two pieces of hydrophilic and absorbent material.
  • the microbiological culture device IC or 1E, according to the invention is placed inside the receptacle 8, with the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 6 facing upwards. Then the water 9 'is poured into the receptacle 9, taking care not to pour it directly on the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 6.
  • the volume of water used is more or less calibrated to be able to sufficiently humidify the piece of material. absorbent 1 and solubilize the culture medium composition that it contains.
  • Another way of operating consists in pouring the appropriate volume of water into the bottom of receptacle 8, then depositing therein the microbiological culture device surmounted by the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 6. Care will be taken not to place the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 6 directly in contact with free water, so that the device is effectively hydrated only by the piece of absorbent material 2
  • the hydration step can then be carried out with a third way the microbiological culture device, without the sheet, is then placed inside the receptacle 8.
  • a quantity of water 9 ' is poured sufficient to thoroughly soak the microbiological culture device. The surface is then covered with the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 6
  • the hydration by the parts made of hydrophilic and absorbent material 2 and 2 ' make it possible, initially, to dissolve the composition of culture medium contained between these two pieces.
  • this activation continues with the hydration of the sheet dehydrated polysaccharide hydrogel 6, positioned on the surface of the microbiological culture device.
  • This rehydration of the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 6 causes a layer of rehydrated and swollen polysaccharide hydrogel to appear on the surface of the part made of hydrophilic and absorbent material 2, not simply by water coming from the part made of absorbent material. 2 but rather by a solution of culture medium between the two pieces of hydrophilic and absorbent material 2 and 2 '.
  • the microbiological culture device makes it possible to create a culture surface, both lubricated and adherent to the cells, capable of receiving microorganisms and allowing, if necessary their isolation by operations and mechanical means usually used to spread the cells on the surface of a conventional agar medium.
  • this device due to its high exposure to gas exchange and drying out phenomena and its hyper-absorbent properties, this device will be able to be self-sufficient, throughout the incubation period and continuously, of the culture medium solution.
  • the assembly is incubated at a temperature and for a period established, before the results are read.
  • the microbiological device according to the invention comprises a surface layer, such as a dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 6, operations for spreading and dispersing the cells can be carried out by means of a loop, for example.
  • a surface layer such as a dehydrated polysaccharide hydrogel sheet 6
  • absorbent material 2 and 2 'entering into the constitution of a microbiological culture device according to the invention are shaped from a three-dimensional support, of open structure, porous, suitable for receiving within it, both a liquid (in particular, an aqueous sample) and solid particles of suitable particle size.
  • the microbiological culture devices tested comprise two parts of hydrophilic and absorbent material, made from the nonwoven Airlaid SCA95NN81, from the company SCA (Sweden). he It is a two-component PET / CoPET (Polyester / coPolyester) non-woven fabric. Two pieces of hydrophilic and absorbent material of different basis weight and thickness were used. The first is characterized by a basis weight of the order of 95 gm 2 for a thickness of 2 mm. The second has a basis weight of the order of 50 gm 2 for a thickness of 0.76 mm. From these nonwovens, circular pieces approximately 45 mm in diameter were cut.
  • an agar culture medium distributed by the company bioMérieux (France) was used. It is more particularly a midpoint of the chromID ® range, the chromID ® CPS Elite. This medium is used for the isolation, enumeration and direct identification of Escherichia coli, Enterococci, Proteus and the KESC group (Klebsiella, Enterobacter, Serratia, Citrobacter)
  • microbiological culture devices according to the invention could then be tested for the detection, isolation, counting or even identification of bacteria such as Escherichia coli and Enterococcus faecalis.
  • the microbiological filtration membrane 5 forms part of the composition of the microbiological culture devices IB and 1D according to certain embodiments of the invention. It is also used in the context of a microbiological control device 10 according to the invention.
  • This microbiological filtration membrane 5 is a filter which is permeable to water and which retains microorganisms, in particular on its surface. This membrane is also permeable to the nutrients of the culture medium and to any additive elements included in this culture medium located, between the two pieces of hydrophilic and absorbent material 2 and 2 ', under the microbiological filtration membrane.
  • the microbiological filtration membrane 5 has the shape of a substantially flat disk and consists of a mixture of cellulose esters (nitrate and acetate). This is the Nitocellulose Membrane Filters, manufactured by Zefon International, Inc., 5350 SW I st Lane, Ocala, FL 34474, USA.
  • the polysaccharide hydrogel sheet is designed above all in such a way that, once rehydrated, it can offer microorganisms a support suitable for their growth and development.
  • the composition and consistency of these dehydrated polysaccharide hydrogel sheets have also been specifically studied to obtain surfaces suitable for the isolation and spreading operations of cells, whether these polysaccharide hydrogel sheets are in a rehydrated or dehydrated state.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheets of a microbiological culture device can be declined in different versions, by varying, in particular:
  • polysaccharide gelling agent eg, gellan gum, xanthan gum, galactomannan gums, starch, sodium alginate, pectin, methylcellulose and hydroxymethylcellulose
  • a membrane opaque to light and of great whiteness (for example, a CIE whiteness of at least 65) can be interposed between either the part of upper hydrophilic material and absorbent and the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet or between the part of upper hydrophilic material and the microbiological filtration membrane.
  • This permeable interlayer membrane 7 can consist of a sheet of absorbent paper, of cellulose composition.
  • Microbiological culture devices according to the invention in a microbiological control device in a microbiological control device
  • microbiological control device 10 makes it possible to carry out simplified control operations of a liquid to be analyzed which may contain at least one microorganism, even outside a microbiological laboratory, including in an industrial environment.
  • This microbiological control device 10 comprises at least a main body 11 and a cover 12.
  • the main body 11 and the cover 12 are formed of separate parts which are assembled together to form the enclosure of the control device. microbiological.
  • the cover 12 closes the main body 11 to define the closed internal space 13 of the microbiological control device 10.
  • the cover 12 therefore has a shape complementary to that of the main body 11 to ensure the closure of the latter.
  • This microbiological control device 10 corresponds to the device as described in application WO2018 / 189478 filed by the applicant and this for all the embodiments described in this same application.
  • the microbiological control device 10 in the context of the present invention comprises a microbiological filtration membrane 5 which is arranged in the closed internal space 13 and which separates the space internal closed in two compartments.
  • the microbiological filtration membrane 5 extends into the closed internal space 12 substantially transversely, along the entire section of the closed internal space.
  • the microbiological filtration membrane 5 has a substantially planar shape, here the shape of a disc. It is preferably arranged perpendicular to the central axis of the main body 11.
  • the microbiological control device comprises, inside the closed internal space 13, an IA microbiological culture device according to the invention, the IA microbiological device being in contact with the microbiological filtration membrane 5.
  • the microbiological culture device IA is a separate element from the microbiological filtration membrane 5, while being in contact with the microbiological filtration membrane 5.
  • the microbiological culture device IA and the microbiological filtration membrane 5 are brought into contact with each other within the microbiological control device once it has been assembled.
  • the microbiological culture device 1A is preferably located below the microbiological filtration membrane 5.
  • the microbiological culture device IA advantageously comprises at least one chromogenic and / or fluorogenic substrate capable of allowing direct or indirect detection of an enzymatic or metabolic activity of the target microorganisms. The visual signal generated by said at least one substrate is then visible through at least part of the thickness of the microbiological culture device IA.
  • the microbiological control device comprises, inside the closed internal space 13, the microbiological culture device IA and the microbiological filtration membrane 5 already assembled beforehand, which corresponds to a microbiological culture device IB according to the invention as described above and in Figure 2.
  • the microbiological culture device IA has a substantially planar shape, here the shape of a disc.
  • the microbiological culture device 1A has a peripheral edge which, preferably, coincides with the peripheral edge of the microbiological filtration membrane 5.
  • the microbiological culture device IA and the microbiological filtration membrane 5 have the same shape.
  • the microbiological control device 10 comprises an inlet port 14 for the liquid to be analyzed.
  • the inlet port 14 allows, when the microbiological control device 10 is assembled so that the enclosure delimits the closed internal space 13, for example when the cover 12 is assembled with the main body 11, to introduce the liquid to be analyzed inside the closed internal space delimited by the enclosure, coming from outside the closed internal space 13.
  • the input port 14 comprises
  • an internal portion 15 which opens into the closed internal space 13; an external portion 16 for connection to a container of liquid to be analyzed, the container possibly being for example a syringe, a tubing, a bag, a funnel, etc.; and a shutter 17 which, in this exemplary embodiment, is interposed between the internal portion 15 and the external portion 16 of the input port, so as to close the input port 14, preventing, in a closed state of the shutter 17, any gas circulation between the closed internal space 13 of the microbiological control device 10 and the outside through the inlet port 14.
  • the inlet port 14 is arranged along the central axis, vertically.
  • the inlet port is advantageously arranged on the cover 12.
  • Tests were carried out with a view to evaluating the capacity of the 1 A microbiological culture device according to the invention to be able to constitute a high-performance support allowing the culture, detection and / or identification of microorganisms possibly present in a sample to be analyzed. , to control.
  • a microbial culture was performed with a strain of Escherichia coli.
  • the composition of dehydrated culture medium must be chosen to allow the growth and development of bacteria of interest, and must integrate chromogenic components facilitating visual identification of these bacteria of interest.
  • the chromID ® CPS Elite culture medium is used. This culture medium, marketed by bioMérieux, can be used for the isolation, enumeration and direct identification of the bacterium Escherichia coli.
  • microbiological culture device 1 A in the context of this example, consists of:
  • chromID ® CPS Elite culture medium comprising Mataxan xanthan gum 25pm (Alliance gums & industries, ref. M14015)
  • the devices are then calendered at XX ° C by applying a pressure of XX kg. cm 2 for a period of XX seconds.
  • the microbiological culture device 1 comprises 32 g of culture medium chromID Elite ® CPS and 40 g of xanthan gum. And Figure 12, 32 g of culture medium chromID Elite ® CPS and 20 g of xanthan gum.
  • this IA microbiological culture device constitutes a high-performance microbiological culture support allowing the culture, detection and identification of microorganisms present in a sample to be analyzed.
  • the IC microbiological culture device comprises, in addition to the device 1A, a surface layer, which is a dehydrated polysaccharide hydrogel sheet.
  • This dehydrated polysaccharide hydrogel sheet should have a solid surface, structural integrity and satisfactory mechanical strength.
  • Tests have been carried out with a view to evaluating the capacity of such devices to be able to constitute microbiological culture supports which are both efficient and compatible with the operations and the mechanical means of spreading and dispersing the cells.
  • Bacterial cultures were carried out in particular with strains of Escherichia coli and of Enterococcus faecalis.
  • the microbiological culture device comprises a particular composition of dehydrated culture medium.
  • the particularity of this composition of dehydrated culture medium lies in the fact that it has been chosen to be able to be adapted to the growth and development of the bacteria of interest, and that they integrate chromogenic components facilitating the visual identification of these bacteria of interest.
  • the same culture medium as previously is used, namely the chromID ® CPS Elite culture medium.
  • This medium allows isolation, enumeration and direct identification of E. coli, and presumptive of! Enterococci.
  • the IC microbiological culture device in this example, consists of:
  • chromID ® CPS Elite culture medium comprising xanthan gum
  • chromID culture medium is used Elite ® CPS and 20 g of xanthan gum.
  • This device as described above, is calendered at 60 ° C by applying a pressure of 0.4 kg. cm 2 for a period of 60 seconds.
  • the dehydrated polysaccharide hydrogel sheet was prepared as described above (cf. II Constituent elements of a microbiological culture device according to the invention, 5. Dehydrated surface layer).
  • This IC device as described above, is placed in Petri dishes 90 mm in diameter, then moistened with 7-8 mL of sterile distilled water. Once the piece of absorbent material has been hydrated, the culture medium activated and the polysaccharide hydrogel layer regenerated, the microbiological culture device is inoculated with 100 ⁇ L with a suspension comprising 10.10 4 CFU / mL of Escherichia coli. and 10.10 4 CFU / mL of Enterococcus faecalis. This suspension is deposited by means of a first loop on the first dial of the hydrogel surface. The second dial is seeded with a new o ⁇ se by stretching several ridges from the first dial. The third dial is seeded like the second without changing o ⁇ se. The fourth dial is seeded with unstretched streaks from the second dial.
  • the dishes are placed in a jar with a little water so that the microbiological culture devices do not dry out. The whole is then incubated at 37 ° C. for 24 hours.
  • Figures 13 and 14 show photographs of cultures and isolates of Escherichia coli and Enterococcus faecalis carried out on the IC microbiological culture device, the characteristics of which are described above.
  • Microbiological culture devices according to the invention in a microbiological control device are described in detail below.
  • microbiological culture device according to the invention integrated into a microbiological control device was studied.
  • the IA microbiological culture device and a microbiological filtration membrane are included in a microbiological control device.
  • This microbiological control device makes it possible to carry out simplified control operations of a liquid to be analyzed which may contain at least one microorganism, even outside a microbiological laboratory, including in an industrial environment.
  • the microbiological culture device is not the seat of growth but allows growth on the microbiological filtration membrane positioned on one of the parts made of absorbent material.
  • the device according to the invention has these properties, it was verified the effective growth of bacteria on the filtration membrane positioned on the device and this after the passage of a sample of water inoculated with a known quantity. of target bacteria.
  • the culture medium will be chromID ® CPS Elite, marketed by bioMérieux.
  • the devices are calendered at 50 ° C. by applying a pressure of 10 kg.cm 2 for a period of 30 seconds.
  • the filtration membrane used is made up of a mixture of cellulose esters (nitrate and acetate). This is the Fisherbrand TM General Filtration Membrane Filters marketed by Fisher Scientific Company L.L.C, 300 Industry Drive, Pittsburgh, PA 15275, USA.
  • the liquid to be analyzed is a solution of mineral water of the brand EVIAN in which a bacterial culture consisting of a strain of Escherichia coli and a strain ⁇ 'Enter ococcus faecalis has been inoculated.
  • 100 mL of the inoculated mineral water solution comprising either 25 CFU / 100mL or 50 CFU / 100mL for each bacterium are analyzed.
  • the introduction of the solution to be analyzed into the microbiological control device according to the invention, through the inlet port, allows the solution to be first introduced into the closed internal space, the solution to be analyzed then coming naturally into contact with the microbiological filtration membrane.
  • the solution to be analyzed is therefore filtered through the microbiological filtration membrane, so that at least some of the possible microorganisms, in particular those targeted for the control envisaged, are retained by the microbiological filtration membrane.
  • the liquid part of the solution to be analyzed migrates towards the bottom of the closed internal space.
  • the liquid to be analyzed allows the rehydration of the microbiological culture device according to the invention.
  • the nutrients and any additive elements thereof can migrate towards the microorganisms which are retained by the microbiological filtration membrane.
  • the microbiological control device is placed in an environment, in particular of temperature, favorable, to obtain incubation of the microorganisms inside the microbiological control device itself, without it being necessary to open the device. here and without it being necessary to remove the microbiological filtration membrane from the enclosure of the microbiological control device.
  • the use of a microbiological control device according to the invention after the step of introducing the solution to be analyzed inside the closed internal space of the microbiological control device, comprises the subsequent steps consisting of at :
  • any microorganism initially contained in the solution to be analyzed incubate at 37 ° C for 18-24 hours, in the microbiological control device, any microorganism initially contained in the solution to be analyzed.
  • control step consisting in detecting, counting, identifying and characterizing a possible microorganism initially contained in the solution to be analyzed is carried out by vision through a transparent portion of the enclosure of the control device. microbiological.
  • this control step can be carried out without it being necessary to open the microbiological control device, the microbiological filtration membrane, on which the possible microorganisms are located, therefore remaining inside the internal space. closed of the microbiological control device.
  • microbiological culture device according to the invention in a microbiological control device, this use was compared with use of microbiological culture device according to the invention in a filtration system Milliflex ®.
  • the Milliflex ® filtration system marketed by Merck, consists of a Milliflex ® vacuum pump and a Milliflex ® filtration funnel. This is a classic filtration solution.
  • Table 1 the quantification results for a microbiological culture device according to the invention included in the microbiological control device.
  • the two parts of hydrophilic and absorbent material have an identical thickness of 2 mm.
  • the quantification results for a microbiological culture device according to the invention included in the microbiological control device In this microbiological culture device the two pieces of hydrophilic and absorbent material have a different thickness, the upper piece, which will be the first in contact with the solution to be analyzed and which in contact with the filtration membrane, has a thickness of 0, 76 mm, the lower part has a thickness of 2 mm.
  • Table 3 the quantification results for a microbiological culture device according to the invention including a filtration system Milliflex ®.
  • Each piece of hydrophilic and absorbent material has a thickness of 2 mm per piece.
  • the device comprises an amount of xanthan gum of 20 g.
  • results obtained with the microbiological culture device integrated into a microbiological control device show first of all that in the absence of xanthan gum there is no growth of bacteria on the filtration membrane. This demonstrates that xanthan gum firstly allows the culture medium to be retained during the passage of a large volume of solution to be analyzed, thus resistant to leaching of this culture medium and then secondly allows, when of incubation, to provide nutrients and active agents from the culture medium to the microorganisms captured on the filter.
  • Table 3 shows that the integrated microbiological culture device in a microbiological control device according to the invention has similar or better performance than integrated microbiological culture device a filtration system Milliflex ®.
  • the device according to the present invention allows retention of the culture medium during the passage of a large volume of liquid to be analyzed while allowing the release of nutrients and active agents from the culture medium solubilized during incubation. Consequently, the inventors have demonstrated that the microbiological culture device integrated into a microbiological control device makes it possible to detect, enumerate, identify and / or characterize a possible microorganism contained in a liquid to be analyzed, thus allowing its control.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Sustainable Development (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)

Abstract

Dispositif de culture microbiologique comprenant tout ou partie d'un milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, caractérisé en ce que : - ledit dispositif comprend au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane, et comprenant entre deux pièces contiguës ledit milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, et - ledit milieu de culture microbiologique comprend au moins un agent gélifiant sous forme de poudre.

Description

DESCRIPTION
Titre : DISPOSITIF DE CULTURE MICROBIOLOGIQUE
La présente invention appartient au domaine de la microbiologie et concerne, plus particulièrement, la culture, la détection et/ou G identification de microorganismes possiblement présents dans un échantillon à analyser, à contrôler.
La présente invention a trait plus spécifiquement aux solutions alternatives proposées aux milieux de culture gélosés traditionnels, destinés notamment à la culture, la détection et/ou l'identification de microorganismes présents dans un échantillon à analyser.
Dans les domaines du diagnostic clinique et du contrôle microbiologique industriel tel que dans les industries agroalimentaire, pharmaceutique ou cosmétique, les milieux de culture gélosés en boite de Pétri, constituent depuis la fin du 19e siècle un outil indispensable à la détection et à l'identification des microorganismes pathogènes.
Les milieux de culture gélosés connaissent cependant quelques inconvénients majeurs. En effet, lorsque les milieux de culture gélosés en boite de Pétri sont produits de manière artisanale, ils requièrent du temps (au moins une heure) et de nombreuses opérations (pesage des ingrédients, dissolutions, autoclavage, coulage, répartition en boîtes de Pétri). En particulier, dans les laboratoires d'analyse biologique de petite taille, la préparation de ces milieux de culture est un poste chronophage et à faible valeur ajoutée. De plus, ces milieux solides ou semi-solides sont extrêmement sensibles à toute forme de contamination biologique. Enfin, du fait de la grande difficulté pour en assurer la stérilité, les milieux gélosés « artisanaux » doivent être préparés de façon extemporanée ou quasi-extemporanée.
Il existe également des milieux gélosés produits industriellement. Ces milieux gélosés prêts à l'emploi ont des durées de péremption courtes, qui ne dépassent guère quelques mois. Cette durée de péremption limitée peut notamment s'expliquer pour partie par la présence d'eau dans les milieux. Par ailleurs, pour en garantir une stérilité optimale et un niveau de performances acceptable, ils sont soumis à des mesures draconiennes en termes de conditionnement (traitement stérilisant aux UV, double emballage...), d'acheminement et de conservation (un stockage entre 2°C et 8°C, à l'abri de la lumière). Ces nombreuses contraintes impactent sur les coûts de vente et d'utilisation des milieux gélosés industriels.
Pour remédier aux inconvénients précités, des alternatives aux milieux de culture gélosés ont été proposées. Il s'agit en particulier de dispositifs de culture microbiologique prêts à l'emploi, qui ont la particularité d'intégrer des compositions nutritives, éventuellement sélectives et/ou discriminantes, déshydratées et activables par simple (ré)hydratation. De ce fait, outre des modalités de conservation et/ou stockage peu contraignantes (à l'abri de l'humidité et des fortes températures), leur durée de péremption peut atteindre plusieurs années.
A ce titre, la société 3M Company propose une gamme de dispositifs de culture microbiologique industriels dénommée Petrifilm™. Ces dispositifs, notamment décrits dans EP0070310, EP0620844 ou encore EP0832180, sont formés de deux films étanches à l'eau, apposés l'un sur l'autre. A l'interface, la face interne de chacun des deux films est recouverte d'une composition adhésive permettant d'y faire adhérer une fine couche de poudre(s) hydrosoluble(s) à froid. Soit chaque face est recouverte d’une poudre différente, l’une correspondant à une composition de milieu de culture déshydratée et micronisée et l’autre correspondant à un agent gélifiant également micronisé. Soit les deux faces sont recouvertes d’une même poudre formée par un mélange entre une composition de milieu de culture déshydratée et un agent gélifiant, tous deux micronisés.
La réhydratation du milieu se fait par l'échantillon, ou ses dilutions décimales, ou par diluants appropriés (EPT, Tryptone-sel, Letheen, ...) pour les contrôles de surfaces.
Si ces dispositifs Petrifilm™ permettent effectivement une bonne fixation des cellules, ils présentent, par ailleurs, plusieurs inconvénients.
Tout d'abord, ce dispositif nécessite pour sa fabrication d’une étape d'adhésion des nutriments déshydratés sur les films qui ont dû être préalablement encollés. Ainsi une faible couche superficielle de milieu est disponible. Le volume de l'échantillon liquide nécessaire à l'analyse microbiologique ne peut alors excéder 1 ou 2 mL ce qui impacte le seuil de sensibilité de détection. Ensuite, de par son packaging, le Petrifilm™ ne permet pas non plus, d'avoir sur un même dispositif plusieurs milieux de cultures différents. De plus, ce dispositif reste limité dans ses applications et ne peut, par exemple, être utilisé en tant qu'écouvillonnages ou pansements. Et enfin, le Petrifilm™ nécessite obligatoirement l'aide d'un opérateur extérieur apportant l'échantillon aqueux.
La société 3M Company a également déposé la demande de brevet WO2017/019345 qui décrit un dispositif de détection microbienne. Ce dispositif comprend une poche étanche à l'eau qui comprend deux compartiments et une membrane poreuse de filtration disposée dans la poche entre les deux compartiments. Un agent gélifiant soluble dans l'eau, sec, est collé à la poche dans le premier compartiment et un pad absorbant est disposé dans le second compartiment sous la membrane de filtration. Un orifice pouvant être hermétiquement fermé permet de faire passer l'échantillon à analyser dans le premier compartiment. Une fois introduit dans le premier compartiment du dispositif, l'échantillon à analyser diffuse dans le second compartiment du dispositif en passant par la membrane de filtration puis par le pad absorbant. La membrane de filtration permet le passage du liquide du premier compartiment au deuxième compartiment et empêche le passage de particules d'une taille prédéterminée, notamment des microorganismes. L’agent gélifiant permet aux microorganismes présents dans l'échantillon de se développer au niveau de la membrane de filtration lors de l’incubation ce qui permettra par la suite de les dénombrer. Dans un mode de réalisation de cette invention, il est prévu de rajouter des nutriments à l’agent gélifiant dans le dispositif pour favoriser la culture des microorganismes. Le pad absorbant a pour rôle d’absorber la plupart du liquide de l'échantillon afin que l'agent gélifiant ne soit hydraté que par une fraction de l'échantillon liquide. L’échantillon liquide est conservé dans le second compartiment lors de l’incubation.
Ce dispositif présente de nombreux inconvénients. Tout d'abord, comme indiqué de cette demande, le dispositif n’est pas adapté pour l’analyse des volumes supérieurs à 150 mL. Le fait que l’échantillon soit conservé dans le second compartiment limite le volume d’échantillon à analyser. Or selon la Directive européenne n° 98/83/CE du 03/11/98 relative à la qualité des eaux destinées à la consommation humaine, les quantités d’échantillon à analyser sont supérieurs à 150 mL. A titre d’exemple, ce volume est de 250 mL pour des bactéries telles qu Ksche ri chia coli , les Entérocoques ou encore Pseudomonas aeruginosa. Ce dispositif présente également le désavantage de ne pas maîtriser le liquide résiduel présent sur la membrane en cas de volume d’échantillon trop important. Ceci ayant pour effet de générer des nappes de liquide et de provoquer ainsi une diffusion des microorganismes ce qui gênera la détection. A contrario un volume trop faible en échantillon risquerait de créer des bulles d’air dans le dispositif ce qui aura pour conséquence de gêner la mise en contact de l’agent gélifiant et des nutriments avec les microorganismes présents sur la membrane de filtration. Ces bulles d’air pourront également gêner la détection des microorganismes. Enfin ce dispositif présente également des inconvénients dans la gestion des déchets une fois utilisé et de par sa constitution présente également un risque de fuite, si les différents éléments de ce dispositifs sont mal scellés, d’un échantillon à haut risque d’être contaminé. La société japonaise Nissui Pharmaceutical CO., LTD, quant à elle, propose les dispositifs de culture Compact Dry™. Dans ces dispositifs le support de culture microbiologique est formé par une feuille en matériau fibreux absorbant, intégrant dans sa masse une composition nutritive déshydratée, éventuellement également sélective et/ou discriminante (cf. par exemple, EPI 179586).
Pour ce faire, une suspension alcoolique est préparée en mélangeant, dans de l'éthanol, une composition de milieu de culture, un adhésif soluble à la fois dans l'eau et dans l'éthanol (par exemple, le poly[oxyde d'éthylène] et l'hydroxypropylcellulose) et un agent gélifiant soluble dans l'eau mais insoluble dans l'éthanol (par exemple, la gomme de caroube, la gomme de guar, la carragénine, Phydroxyéthylcellulose). Cette suspension alcoolique est utilisée pour imprégner la feuille en matériau fibreux absorbant. Après séchage, ladite feuille forme un support de culture déshydraté, prêt à l'emploi, de longue conservation, activable par simple réhydratation.
Néanmoins, cette méthode, par la mise en solution dans l'eau ou dans un solvant, impacte négativement la durée de conservation du milieu de culture réhydratable. En effet, la mise en suspension de certains produits fragiles, tels que les enzymes, les substrats enzymatiques ou métaboliques, les antibiotiques, peut impacter sévèrement leur stabilité globale. Le chauffage nécessaire au séchage du milieu de culture peut également dénaturer et rendre inefficace les composants thermosensibles du milieu réactionnel. Cette méthode en phase aqueuse ne permet pas non plus de pouvoir maîtriser et faire varier la localisation du milieu réactionnel et/ou des différents additifs nécessaires à la révélation bactérienne.
Ainsi ces milieux de culture qui consistent soit à coller le milieu de culture sous forme déshydratée à un support, afin d'obtenir d'emblée un milieu de culture réhydratable, soit à apporter le milieu de culture sous une forme liquide dans le support puis à sécher l'ensemble, présentent des inconvénients. Afin d’y remédier la Demanderesse a proposé, dans la demande W02015/104501, des dispositifs de culture microbiologique imprégnés à sec par un milieu de culture déshydraté.
Ainsi dans la demande WO2015/104501 la Demanderesse propose des dispositifs de culture microbiologique prêts à l'emploi, dédiés à la détection, à l'identification et/ou à l'énumération de microorganismes. Ces dispositifs sont basés sur un support de culture en matériau fibreux et absorbant, incorporant dans son épaisseur une composition de milieu de culture. Ainsi un milieu de culture déshydratée sous forme de poudre est répandu sur le support de façon homogène puis le support est placé entre deux électrodes en appliquant un certain voltage pendant quelques secondes à une humidité relative. Ensuite le support est calandré en appliquant une pression. Le support est ainsi traversé par de milieu de culture sous forme de poudre.
Malgré des résultats biologiques probants, de tels supports de culture ont été jugés commercialement peu viables à l'heure actuelle, compte tenu, notamment, de la difficulté de mise en œuvre du protocole et du coût de fabrication encore élevé.
La présente invention a ainsi pour objet de proposer un dispositif de culture microbiologique qui, tout en offrant une durée de péremption longue, y compris à température ambiante, procure une réelle alternative aux milieux de culture gélosés traditionnels.
Un autre objectif de la présente invention est de pouvoir proposer un dispositif de culture microbiologique qui soit compatible avec les contraintes d'une exploitation industrielle et commerciale, notamment en termes de coût de production et donc de rentabilité. En effet, en plus d’offrir une durée de péremption longue, la présente invention permet de contrôler la quantité de milieu de culture utilisée en fonction du besoin et de simplifier la mise en œuvre du protocole. En particulier, la présente invention vise à proposer un dispositif de culture microbiologique de conception et de fabrication adaptées aux installations et moyens de production actuellement utilisés dans l'industrie des milieux et dispositifs de culture microbiologique.
La présente invention propose donc un dispositif de culture microbiologique comprenant tout ou partie d’un milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, caractérisé en ce que :
ledit dispositif comprend au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane, et comprenant entre deux pièces contigües ledit milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, et
ledit milieu de culture microbiologique déshydraté comprend au moins un agent gélifiant sous forme de poudre.
Un autre objet de l’invention concerne un dispositif de culture microbiologique comprenant tout ou partie d’un milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, caractérisé en ce que : ledit dispositif consiste en au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane, et consiste en entre deux pièces contigües ledit milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, et
ledit milieu de culture microbiologique déshydraté comprend au moins un agent gélifiant sous forme de poudre.
Lors de son utilisation, le dispositif de culture microbiologique selon l’invention doit être hydraté pour être activé. Pour ce faire, le dispositif de culture microbiologique est hydraté par un échantillon liquide qui se trouve être l’échantillon à analyser. Il est également possible d’hydrater le dispositif de culture microbiologique, dans un premier temps, avec un liquide pour l’activer puis de le mettre en contact avec l’échantillon à analyser dans un second temps. Ainsi la composition de milieu de culture comprenant l’agent gélifiant, tous deux initialement présents dans un état sec, sont ainsi solubilisés et activés.
Dans un système réhydraté, le milieu de culture microbiologique et le ou les agents gélifiant solubilisés, vont donner une consistance gélosée au dispositif de culture microbiologique, qui va permettre la distribution des ingrédients nutritifs et des agents actifs du milieu de culture au plus près des microorganismes, favorisant ainsi leur implantation et le cas échéant leur croissance et leur détection.
Avant d’aller plus loin dans la description de l’invention, les définitions ci- après sont données afin de faciliter la compréhension de l’exposé de l’invention.
Dans la présente invention, un milieu de culture microbiologique fait référence à une composition nutritive permettant la croissance et le développement de cellules, plus particulièrement des bactéries, des moisissures et/ou des levures. Ces milieux permettent de répondre aux besoins nutritionnels des microorganismes à cultiver.
Schématiquement, on trouve dans la composition de ces milieux de culture microbiologique :
de l’eau (généralement de l’eau distillée ou déionisée) stérile, au moins un glucide, à titre de source carbonée et d’énergie, ainsi que d’autres éléments nutritifs (notamment, acides aminés, facteurs de croissance, vitamines, minéraux, oligo-éléments, sels de fer, citrate de sodium, chlorure de sodium...) apportés sous la forme de compositions chimiquement complexes telles que des mélanges de peptones (de lait, de viande et/ou de fécules de pomme de terre, de maïs...), des extraits de levures, de sérum, et/ou des extraits de tissus d’origine animale ou végétale...
également divers sels, permettant d’établir une osmolarité adéquate au milieu, et de tamponner le pH.
Un milieu de culture microbiologique au sens de la présente invention peut éventuellement démontrer une certaine sélectivité à l’égard de microorganismes cibles, c’est- à-dire qu’il favorise le développement de ces microorganismes cibles plutôt que celui de la flore annexe, et/ou qu’il inhibe et/ou ralentit le développement de la flore annexe. Cet effet sélectif peut notamment être obtenu grâce à l’emploi d’agents à effet inhibiteur pour la flore annexe ou d’agents à effet activateur pour les microorganismes cibles. Egalement, un milieu de culture au sens de la présente invention peut éventuellement démontrer des aptitudes de discrimination permettant de différencier, de distinguer visuellement les différentes catégories de microorganismes poussant sur ce même milieu de culture. A cet effet, le milieu de culture intègre avantageusement une composante chromogénique et/ou fluorogénique permettant une observation visuelle des microorganismes en fonction d’activités métaboliques particulières qu’ils expriment.
La composition et la formulation de nombreux milieux de culture sont décrites notamment dans 1 e HANDBOOK OF MICROBIOLOGICAL MEDIA (2010 ; 4eme Edition).
Dans le cadre de la présente invention, le milieu de culture est déshydraté et sous forme de poudre. On entend par poudre, des particules ayant une granulométrie de 1 à 200 pm. Une micronisation des composés minoritaires tels que les substrats, antibiotiques, est possible pour parfaire l'homogénéisation de la poudre.
Dans le cadre de la présente invention, le milieu de culture déshydraté est directement en contact avec les deux pièces en matériau hydrophile et absorbant.
Avantageusement, la quantité de milieu de culture déshydratée sous forme de poudre est comprise entre 0.009 g.cm 3 et 0.050 g.cm 3 de préférence entre 0.020 g. cm 3 et 0.036 g.cm 3, plus préférentiellement entre 0.018 g.cm 3 et 0.022 g.cm 3
Ainsi la présente invention a pour avantage de permettre une croissance optimisée notamment due à la quantité optimale de milieu culture sans nécessiter de mettre le milieu de culture en excès pour permettre une croissance des microorganismes. Ceci pallie ainsi à l’un des inconvénients de l’art antérieur, en effet, un excès de nutriments qui composent le milieu de culture peut se révéler toxique pour les bactéries, empêchant ainsi leur croissance et leur détection. De plus cet ajout en excès du milieu de culture constitue également un inconvénient en termes de coût de production.
Dans le cadre de la présente invention, le milieu de culture comprend en outre au moins un agent gélifiant également sous forme de poudre. Une fois activé, réhydraté, par un échantillon aqueux ou par un liquide, le ou les agents gélifiants vont permettre de créer un ensemble présentant une certaine intégrité structurelle et cohérence mécanique. De plus, du fait de leur présence au contact du milieu de culture, le ou les agents gélifiants vont donner au dispositif microbiologique selon l’invention une consistance gélosée favorisant ainsi l’implantation des microorganismes et vont également permettre aux éléments constituants le milieu de culture, tels que les ingrédients nutritifs ou les agents actifs, de se retrouver au plus près des microorganismes.
Avantageusement, l’agent gélifiant est choisi parmi : une gomme de xanthane, l’alginate, une gomme de gellane, une gomme de galactomannane, de gomme de graine de caroube, l’amidon, et un mélange de ceux-ci.
Préférentiellement, le milieu de culture du dispositif selon l'invention comprend au moins un gélifiant dont la quantité est comprise entre 0.0030 g.cm 3 et 0.020 g.cm 3.
On entend par échantillon un prélèvement, ou une petite partie ou petite quantité de ce prélèvement, effectué à des fins d’analyse. L’échantillon peut être un échantillon d’origine biologique contenant ou suspecté de contenir des microorganismes à détecter, dénombrer, identifier et/ou caractériser. Ces échantillons biologiques peuvent être d’origine humaine, animale, végétale ou environnementale. L’échantillon peut également avoir une origine industrielle et provenir de prélèvements opérés sur un produit manufacturé (par exemple un produit alimentaire) ou un produit en cours de fabrication, ou sur des instruments, des installations rencontrés dans un environnement industriel. Les secteurs industriels visés ici sont plus particulièrement les industries agroalimentaire, pharmaceutique, cosmétique et vétérinaire, les dispositifs médicaux, la microbiologie des contrôles environnementaux (eaux, air, surfaces).
Comme indiqué précédemment, dans le cadre de l’invention, l'échantillon est liquide et va permettre la réhydratation du dispositif de culture microbiologique, notamment la réhydratation du milieu de culture et des pièces en matériau hydrophile et absorbant. Ceci va permettre de conserver le dispositif humide et permettre ainsi la migration des nutriments dans ce dispositif.
Selon un autre mode de réalisation, un volume approprié de liquide est ajouté à l'échantillon et/ou au dispositif de culture microbiologique afin de réhydrater le milieu de culture, lorsque l'échantillon n'est pas liquide ou insuffisamment liquide. En pratique, l'homme du métier choisira le volume approprié de liquide ou de l'échantillon aqueux en fonction de sa viscosité, du diamètre, de la porosité et de la capacité d’absorption du support poreux, de la quantité de poudre (milieu de culture et agent gélifiant) ceci afin de réhydrater le dispositif et permettre la croissance des microorganismes.
Avantageusement, la réhydratation du dispositif de culture microbiologique nécessite un volume de liquide ou d'échantillon aqueux supérieur à 1 mL, préférentiellement supérieur à 3 mL, encore préférentiellement supérieur à 4 mL, ce qui permet d'améliorer la sensibilité de détection lorsque les microorganismes sont en faible concentration dans l'échantillon.
Selon la présente invention, l'échantillon peut comprendre une étape préalable de préparation, concentration ou dilution de l'échantillon.
Au sens de la présente invention, le terme microorganisme recouvre les bactéries à Gram positif ou Gram négatif, les levures, les moisissures, les amibes et plus généralement, les organismes unicellulaires, invisibles à l'œil nu, qui peuvent être manipulés et multipliés en laboratoire.
Selon un mode préféré de réalisation de l'invention, le microorganisme est une bactérie, à Gram positif ou négatif, une levure ou une moisissure.
A titre d’exemples de bactéries à Gram positif, on peut citer les bactéries des genres suivants : Enterococcus , Streptococcus, Lactobacillus , Bifidobacterium , Staphylococcus, Bacillus , Listeria , Clostridium , Mycobacteria , Nocardia , Corynebacteria , Micrococcus et Deinococcus.
A titre d’exemples de bactéries à Gram négatif on peut citer les bactéries des genres suivants : Salmonella , Escherichia coli et Pseudomonas.
A titre d’exemples de levures, on peut citer les levures des genres suivants : Candida , Cryptococcus , Saccharomyces et Trichosporon.
A titre d’exemples de moisissures, on peut citer les moisissures des genres suivants : Aspergillus, Pénicillium , Cladosporium. Selon la présente invention, le dispositif de culture microbiologique comprend ou consiste en au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant.
De nombreux matériaux absorbants, hydrophiles et non hydrosolubles, peuvent être utilisés pour réaliser la pièce en matériau absorbant d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention. Ces matériaux sont principalement choisis pour leur pouvoir absorbant, leur capacité de rétention des liquides aqueux et leur faculté à laisser les liquides aqueux les traverser dans tous les sens .
Avantageusement et selon l'invention, ladite pièce en matériau absorbant est réalisée à partir d'un substrat de fibres courtes non-tissées, constituant un ensemble ayant une intégrité structurelle et une cohérence mécanique. Les substrats particulièrement adaptés sont en fibre cellulosique naturelle (comme le coton) ou synthétique (comme la rayonne), en fibre cellulosique modifiée (par exemple, la carboxyméthylcellulose, la nitrocellulose), en fibre de polymères chimiques absorbants (tels que les sels de polyacrylate, les copolymères acrylate/acrylamide). Selon un mode de réalisation préféré, ladite pièce en matériau absorbant est en textile non-tissé réalisé en fibres de cellulose.
Dans le cadre de la présente invention, les pièces en matériau hydrophile et absorbant d’un même dispositif peuvent avoir la même masse volumique ou avoir une masse volumique différente. De même, les pièces en matériau hydrophile et absorbant d’un même dispositif de culture microbiologique selon l’invention peuvent présenter une épaisseur identique ou différente.
Avantageusement, la pièce en matériau hydrophile et absorbant aura une masse volumique comprise entre comprise entre 0,045 g.cm 3 et 0, 10 g. cm 3, préférentiellement entre 0,05 g.cm 3 et 0,07 g.cm 3.
Les pièces en matériau hydrophile et absorbant d’un même dispositif de culture microbiologique selon l’invention peuvent présenter une épaisseur comprise entre 0,5 mm et 2 mm. Préférentiellement, la pièce en matériau hydrophile et absorbant a une épaisseur de 0,8 mm à 1,8 mm, encore préférentiellement de 1 à 1,5 mm. La surface de la pièce en matériau hydrophile et absorbant est comprise entre 1 cm2 et 40 cm2 préférentiellement entre 10 cm2 et 30 cm2, plus préférentiellement entre 15 cm2 et 25 cm2.
La pièce en matériau hydrophile et absorbant est apte à retenir un volume d'eau supérieur à 2 mL, préférentiellement supérieur à 3 mL. Ainsi, un support poreux de 25 cm2 de surface et une épaisseur de 1 mm après calandrage aura la capacité à retenir un volume d'eau de 3 mL.
Avantageusement, et selon l’invention, le dispositif de culture microbiologique a subi une opération de calandrage. Le calandrage, par la pression et la température de chauffe générées, permet la rétention et le maintien stable dans le temps du milieu réactionnel déshydraté comprenant le ou les agents gélifiants dans le dispositif de culture microbiologique, en assurant la rétention des différents éléments tels que les éléments nutritifs entre les pièces en matériau hydrophile et absorbant. Il permet également l'obtention d'une surface supérieure rigoureusement lisse et plane du dispositif de culture microbiologique.
Préférentiellement le calandrage se fait à une température supérieure à la température ambiante, préférentiellement à une température comprise entre 30°C et 60°C. Une température inférieure à 60°C permet de ne pas dénaturer les composés thermolabiles du milieu de culture. Le calandrage permet, outre l'accélération de la réhydratation du dispositif de culture microbiologique par rapport à un dispositif de culture microbiologique non- calandré, une compression des fibres constituant le dispositif de culture microbiologique. Cette compression, associée à la présence du milieu déshydraté au sein du dispositif permet une rehydratation simultanée dans toutes les zones du dispositif placées horizontalement et préserve ainsi la répartition des substances.
Le calandrage permet ainsi de maintenir le milieu réactionnel à l'intérieur du dispositif de culture microbiologique et rend sa manipulation aisée.
De façon préférentielle, le dispositif comprend au moins une couche supérieure protectrice. Préférentiellement, la ou les couches protectrices sont disposées sur la face de la pièce en matériau hydrophile et absorbant qui n’est pas en contact avec le milieu de culture. Dans ce mode de réalisation, aucune autre couche n'est disposée entre couche protectrice et la face de la ou des pièces en matériau hydrophile et absorbant. De préférence la couche protectrice est placée directement sur le dispositif de culture microbiologique. L’Homme du métier saura définir un espace suffisant entre la couche protectrice et le dispositif de culture pour avoir suffisamment d’oxygène pour permettre la croissance microbienne.
La couche protectrice peut être translucide ou transparente permettant la visibilité des colonies au travers de cette couche. Cette dernière doit être compatible avec la physiologie microbienne. Elle permet notament d'éviter les contaminations au cours de l'incubation. Elle est imperméable aux bactéries et limite la perte de vapeur d'eau. En effet, le dispositif est incubé pendant un temps et à une température prédéterminés permettant la croissance des microorganismes indépendamment des conditions d'humidité ambiante. Ainsi, la nature de la couche supérieure est choisie de façon à permettre les échanges gazeux nécessaires à la croissance des microorganismes tout en permettant une hydratation locale.
Selon un autre mode de réalisation préférentielle de l’invention, le dispositif comprend une membrane de filtration microbiologique qui recouvre au moins l’une des pièce en matériau hydrophile et absorbant supérieure du dispositif. Autrement dit la une membrane de filtration microbiologique recouvre la face d’un moins une des pièces en matériau hydrophile et absorbant qui n’est pas en contact avec le milieu de culture.
Selon la présente invention une membrane de filtration microbiologique est un filtre qui est perméable à l'eau et qui retient les microorganismes, notamment à sa surface. Cette membrane est également perméable aux éléments nutritifs du milieu de culture et aux éventuels éléments additifs compris dans ce milieu de culture situé, entre deux pièces sous la membrane de filtration microbiologique. Cette membrane peut comprendre un corps poreux qui peut être constitué par un matériau qui par sa nature, sa taille, son arrangement stérique possède ces propriétés. Ce corps poreux peut avoir ces propriétés par l'aménagement de pores. La membrane de filtration microbiologique peut par exemple être à base de un ou plusieurs matériaux, ou dérivés de ces matériaux, parmi le latex, le polytetrafluoroethylene, le poly(vinylidene) fluoride, le polycarbonate, le polystyrène, le polyamide, le polysulphone, le polyethersulfone, la cellulose, un mélange de celluloses et nitrocellulose. Préférentiellement la membrane de filtration microbiologique est réalisée sous la forme d'une membrane poreuse perméable aux éléments nutritifs et des éventuels éléments additifs compris dans le milieu de culture, et apte à retenir les microorganismes à sa surface. De préférence, la membrane de filtration microbiologique recouvre toute la surface supérieure du dispositif de culture microbiologique. Les membranes de microfiltration de l'eau (et d'une manière générale des liquides) actuellement commercialisées présentent généralement les propriétés requises pour être utilisées comme membrane de filtration microbiologique. Elles permettent d'obtenir une très bonne résistance au déchirement lors de la manipulation, une porosité maîtrisée, une surface lisse, une fine épaisseur et la plupart du temps une forte hydrophilie. Leur couleur, généralement blanche, mais peut également être noire, permet d'optimiser la différentiation de colonies colorées sur leur surface. La capacité de filtration et l'hydrophilie d'une telle membrane de filtration, quant à elles, sont mises à profit pour permettre et optimiser le passage des éléments nutritifs et des éventuels éléments additifs présents dans le milieu de culture (éventuellement après sa réhydratation) vers une surface supérieure de la membrane de filtration microbiologique tout en empêchant ou limitant la migration en sens inverse des microorganismes filtrés à la surface supérieure de la membrane de filtration microbiologique.
Aux fins de la présente demande, les susdites membranes de filtration sont indifféremment désignées membranes de filtration, membranes de microfiltration ou encore membranes filtrantes, ces expressions étant synonymes les unes des autres. Ces membranes de filtration sont comprises dans le groupe constitué par les membranes poreuses.
La membrane de filtration microbiologique permet le passage des éléments du milieu nutritif et des agents sélectifs ou réactifs tout en empêchant ou limitant la migration des microorganismes vers les couches sous-jacentes, notamment dans les pièces en matériau hydrophile et absorbant. Avantageusement, la membrane de filtration microbiologique comporte des pores dont le diamètre est compris entre 0,01 et 0,8 pm préférentiellement entre 0,2 pm et 0,6 pm de manière à retenir les microorganismes sur sa surface. Selon un mode de réalisation particulier, la membrane de filtration microbiologique comporte des pores dont le diamètre est compris entre 0,25 pm et 0,5 pm, par exemple entre 0,3 pm et 0,45 pm, ou encore entre 0,35 pm et 0,4 pm. Alternativement, il peut s'agir d'une couche ne présentant pas de pores mesurables comme une membrane de dialyse.
Par exemple, la membrane de filtration microbiologique peut être une membrane de filtration Fisherbrand™ General Filtration Membrane Filters commercialisées par Fisher Scientific Company L.L.C, 300 Industry Drive, Pittsburgh, PA 15275, USA, ou encore une membrane de filtration Nitocellulose Membrane Filters, fabriquée par Zefon International, Inc., 5350 SW Ist Lane, Ocala, FL 34474, USA, ou des membranes analogues.
Dans le mode de réalisation de l’invention où le dispositif comprend une membrane de filtration microbiologique qui recouvre au moins l’une des pièce en matériau hydrophile et absorbant, ledit dispositif ne comprend pas une couche supérieure protectrice.
Selon un mode de réalisation préférentielle de l’invention, la pièce en matériau hydrophile et absorbant supérieure du dispositif est recouverte par une couche superficielle. Tout comme pour la membrane de filtration microbiologique, la couche superficielle recouvre la face d’au moins une des pièces en matériau hydrophile et absorbant qui n’est pas en contact avec le milieu de culture. Cette couche superficielle a pour fonction de bloquer la diffusion des microorganismes vers les couches sous-jacentes mais également pour certaines applications de permettre les opérations d’isolement et d’étalement des cellules. Cette couche superficielle est également déshydratée.
Une couche superficielle déshydratée selon l’invention peut notamment être telle que décrite dans les demandes W02014/013089, WO 2015/107228 ou encore WO2018/197805.
Dans la demande W02014/013089, cette couche superficielle déshydratée est une membrane de (micro)filtration aux pores étroites, réalisée en latex, en polytétrafluoroéthylène, en poly(vinylidène) fluoride, en polycarbonate, en polystyrène, en polyamide, en polysulfone, en polyéthersulfone, cellulose et/ou en nitrocellulose. Dans le cas de WO2015/107228, la couche superficielle est obtenue à partir d’un mélange de pigments de kaolin, de talc, de dioxyde de titane, et/ou de carbonate de calcium, et d’un liant de type latex styrène butadiène, latex styrène acrylique ou carboxyle méthyle cellulose. Dans le cas de WO2018/197805, la couche superficielle consiste en un hydrogel polysaccharidique déshydraté ayant la particularité d’être réhydratable à température ambiante.
Ces couches superficielles déshydratées ainsi décrites peuvent donc être reprises telles quelles pour être utilisées dans la conception des dispositifs de culture microbiologique selon la présente invention.
La couche superficielle déshydratée selon l’invention, procure à la surface du dispositif de culture microbiologique un effet de lubrification qui facilite les opérations mécaniques d'étalement et de dispersion des cellules. Egalement, par sa consistance gélosée, elle favorise l'implantation des microorganismes au plus près des ingrédients nutritifs et des agents actifs du milieu de culture. Quant au dispositif microbiologique sous-jacent, outre son rôle dans la conservation et la distribution de la composition de milieu de culture, sa structure participe à la rigidité et la fermeté globales de la surface du dispositif de culture microbiologique, assurant sa compatibilité à l'égard des forces de pression et de friction qu'exercent les outils et instrumentations utilisés pour étaler et disperser les cellules.
Selon un autre mode de réalisation particulier de l’invention, lorsque le dispositif de culture microbiologique comprend une membrane de filtration microbiologique ou une couche superficielle qui recouvre la face d’au moins une des pièces en matériau hydrophile et absorbant du dispositif microbiologique, ce dernier peut également comprendre une membrane perméable intercalaire entre la pièce en matériau hydrophile et absorbant et la membrane de filtration microbiologique ou la couche superficielle.
La composition, la conception et l'épaisseur de cette membrane perméable intercalaire sont choisies de sorte que cette dernière entrave le moins possible le passage de G échantillon aqueux à travers les différentes couches du dispositif de culture microbiologique. A cet égard, elle peut être réalisée à partir d'un substrat en fibre cellulosique naturelle (comme le coton) ou synthétique (comme la rayonne), en fibre cellulosique modifiée (par exemple, la carboxyméthylcellulose, la nitrocellulose), en fibre de polymères chimiques absorbants (tels que les sels de polyacrylate, les copolymères acrylate/acrylamide) ou en fibres protéiques stables (comme la soie, la laine).
Dans le cadre de la présente invention, cette membrane perméable, optionnelle, peut être utilisée à des fins très diverses, comme par exemple :
pour apporter un renfort mécanique et/ou une rigidité supplémentaire à l'ensemble du système,
pour faire office de couche réservoir pour la conservation de composés particuliers, destinés à être mélangés à la composition de milieu de culture solubilisée en provenance du dispositif de culture microbiologique, ou
pour améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique.
Selon un mode particulier de réalisation, ladite membrane perméable intercalaire est utilisée en vue d'améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique. A cet effet, elle est choisie suffisamment opaque à la lumière et d'une grande blancheur (par exemple, une blancheur CIE au moins égale à 65).
La conception des dispositifs de culture microbiologique selon l'invention et les modalités d'utilisation de ceux-ci permettent aux principaux éléments constitutifs, tels que notamment :
les au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant comprenant entres elles un milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, et optionnellement
la membrane perméable intercalaire et/ou
la membrane de filtration, ou la couche superficielle déshydratée,
de pouvoir avantageusement être fabriqués, conditionnés et stockés séparément et de manière totalement indépendante. Ceci représente un réel atout industriel, tant d'un point de vue commercial que logistique. Ceci représente également un avantage significatif pour l'utilisateur qui dispose de la possibilité de combiner à dessein les différents éléments constitutifs du dispositif de culture microbiologique selon l'invention, et d'adapter par lui- même le dispositif de culture microbiologique aux microorganismes auxquels il porte un intérêt tout particulier.
De façon similaire, un dispositif de culture microbiologique selon l'invention peut être conditionné et commercialisé sous différentes formes, notamment :
un dispositif de culture microbiologique, composite, préalablement monté et assemblé, dans lequel il est surmontée d’une membrane de filtration microbiologique avec ou non une membrane perméable intercalaire ;
un dispositif de culture microbiologique, composite, préalablement monté et assemblé, dans lequel il est surmontée d’une couche superficielle déshydratée avec ou non une membrane perméable intercalaire ;
un dispositif de culture microbiologique en kit, que l'utilisateur assemblera par lui-même ; un tel kit comprend au moins un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, avec optionnellement au moins une membrane perméable intercalaire et/ou au moins une membrane de filtration microbiologique ou au moins une couche superficielle déshydratée.
Dans un mode de réalisation particulier, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention est utilisé en tant que support hydratant comprenant un milieu réactionnel dans un dispositif d’analyse pour hydrater, par un échantillon liquide, ce support hydratant. Un tel dispositif est décrit, par exemple, dans la demande WO2016/193647.
Dans un autre mode de réalisation particulier, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention est utilisé dans un dispositif de contrôle microbiologique, pour contrôler un liquide. Un tel dispositif est décrit, par exemple, dans la demande WO2018/189478 ou encore dans la demande PCT/FR2020/000076.
Dans ce dernier mode de réalisation, le dispositif de contrôle microbiologique peut être couplé à une membrane de filtration, telle que décrite ci-dessus, dans le dispositif de contrôle microbiologique. Ce dispositif de contrôle microbiologique permet de réaliser des opérations de contrôle simplifiées d’un liquide à analyser susceptible de contenir au moins un microorganisme, et ce même en dehors d’un laboratoire microbiologique, y compris dans une environnement industriel.
L’invention concerne également un procédé de détection et/ou d’identification et/ou d’énumération, d'au moins un microorganisme cible dans un échantillon aqueux susceptible de le contenir, comprenant les étapes suivantes :
a. fournir un dispositif de culture microbiologique pour la détection et/ou l'identification et/ou l'énumération de microorganismes selon l’invention, b. mettre en contact ledit échantillon aqueux avec ledit dispositif de culture microbiologique selon l’invention,
c. incuber le dispositif de culture microbiologique,
d. détecter et/ou identifier et/ou énumérer la ou les colonies de microorganismes au sein du dispositif de culture microbiologique, lorsque les microorganismes recherchés sont présents dans l'échantillon.
Selon l'invention, le dispositif de culture microbiologique est mis en contact avec l'échantillon.
L'échantillon aqueux peut être ajouté manuellement à l'aide d'une pipette, d’une seringue ou automatiquement dans le dispositif. Il peut également être contenu dans au moins un réservoir intégré au dispositif et/ou des canaux permettant la réhydratation du dispositif de culture microbiologique. Il se répand alors dans le dispositif de culture microbiologique par simple pression du réservoir.
Dans un mode de réalisation, il n'y a pas d'intervention humaine et l'échantillon aqueux provient directement d'une zone productrice du liquide à tester. Il peut s'agir par exemple d'une plaie exsudative, de denrées alimentaires relarguant des liquides pendant leur stockage. L'échantillon, de par sa nature, va libérer une partie de ses liquides constitutifs qui vont au cours du temps imbiber le dispositif de culture microbiologique. La zone productrice de l’échantillon à tester peut également être une zone périnéale des humains ou animaux excrétant de l'urine. Le dispositif de culture microbiologique est alors mis à proximité de cette zone et est imprégné progressivement par l'échantillon aqueux produit.
Dans un autre mode de réalisation, la mise en contact de l'échantillon avec le dispositif de culture microbiologique se fait par prélèvement de l'échantillon à l'aide du dispositif de culture microbiologique. Le dispositif de culture microbiologique est alors utilisé comme écouvillon et l'opérateur devra placer ce dernier dans un tube contenant la quantité adéquat de liquide si l'échantillon n'est pas aqueux ou insuffisamment aqueux.
Le dispositif est ensuite incubé in situ (cas du pansements, de la couche culotte..) ou en incubateur durant un laps de temps suffisant pour permettre la détection des colonies microbiennes au sein de du dispositif de culture microbiologique.
Selon un mode de réalisation préféré, le procédé selon l'invention est un procédé de détection qui peut être mis en œuvre par lecture visuelle ou optique du dispositif de culture microbiologique.
L’invention concerne également l’utilisation d'un dispositif de culture microbiologique selon l’invention, pour détecter et/ou identifier et/ou énumérer au moins un microorganisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir.
Avantageusement, l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif comprenant une tige à l'extrémité de laquelle ledit support poreux est fixé, en tant qu'écouvillon.
Dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif selon l'invention en tant que pansement.
Suivant un autre mode de réalisation, l'invention concerne également l'utilisation d'un dispositif selon l'invention en tant que couche culotte.
Encore dans un autre mode de réalisation, l'invention concerne l'utilisation d'un dispositif selon l'invention en tant que conditionnement de denrées alimentaires.
D'autres buts, caractéristiques et avantages de l'invention apparaîtront au vu de la description qui va suivre et des exemples développés ci-après, qui se réfèrent aux figures annexées et dans lesquelles :
[Fig. l] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention ;
[Fig.2] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention comprenant en outre une membrane de filtration microbiologique ;
[Fig.3] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention comprenant en outre une couche superficielle ; [Fig.4] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention comprenant en outre une membrane de filtration microbiologique et une membrane intercalaire perméable ;
[Fig.5] est une représentation schématisée d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention comprenant en outre une couche superficielle et une membrane intercalaire perméable ;
[Fig.6] est une représentation schématisée d’un dispositif de culture microbiologique IA selon l'invention avant et après hydratation par l’échantillon aqueux ;
[Fig.7] est une représentation schématisée d’un dispositif de culture microbiologique IB ou 1D selon l'invention avant et après hydratation par l’échantillon aqueux ;
[Fig.8] est une représentation schématisée d’un dispositif de culture microbiologique IC ou 1E selon l'invention avant et après hydratation par l’eau ;
[Fig.9] est une représentation schématisée en perspective éclatée d’un dispositif de contrôle microbiologique pour contrôler un liquide comprenant un dispositif de culture microbiologique selon l'invention et une membrane de filtration microbiologique ;
[Fig.10] est une représentation schématisée en perspective du dispositif de contrôle microbiologique, assemblé ;
[Fig.11], photographies de cultures d'Escherichia coli effectuées sur le dispositif de culture microbiologique 1 A, selon l’invention.
[Fig.12], photographies de cultures d Escherichia coli effectuées sur le dispositif de culture microbiologique 1 A, selon l’invention.
[Fig.13], photographies de cultures et d’isolements d Escherichia coli et d nterococcus faecalis effectués sur le dispositif de culture microbiologique IC selon l’invention.
Ces exemples ont pour but de faciliter la compréhension de l'invention, sa mise en œuvre et son utilisation. Ces exemples sont donnés à titre explicatif et ne sauraient limiter la portée de l'invention. EXEMPLES
I. Dispositifs de culture microbiologique selon l'invention et principe général d'utilisation
Tel que représenté à la Figure 1, un dispositif de culture microbiologique 1 A selon l'invention se compose, en premier lieu, deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’, plus ou moins épaisses et d'un milieu de culture microbiologique déshydratée 3 sous forme de poudre comprenant au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre également. Dans les exemples représentés, ces pièces en matériau absorbant 2 et 2’ sont de forme sensiblement circulaires.
Les pièces en matériau absorbant 2 et 2’, réalisées en matériau hydrophile et non hydrosoluble, comprennent entre deux pièces contiguës une composition de milieu de culture déshydratée 3 sous forme de poudre. Cette composition de milieu de culture comprend au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre.
Sur la Figure 2, le dispositif de culture microbiologique IB selon un mode de réalisation de l’invention comprend deux pièces en matériau absorbant 2 et 2’, un milieu de culture 3 sous forme de poudre comprenant lui-même au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre et une membrane de filtration microbiologique 5.
La membrane de filtration microbiologique est réalisée sous la forme d'une membrane poreuse perméable aux éléments nutritifs et des éventuels éléments additifs compris dans le milieu de culture, et apte à retenir les microorganismes à sa surface.
Sur la figure 3, le dispositif de culture microbiologique IC selon un autre mode de réalisation de l’invention comprend deux pièces en matériau absorbant 2 et 2’, un milieu de culture 3 sous forme de poudre comprenant lui-même au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre et une couche superficielle déshydratée 6.
La couche superficielle déshydratée 6 est un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté. Il est formé par séchage/déshydratation d'une couche d'hydrogel polysaccharidique, et sa structure mécanique peut être renforcée au moyen d'une armature fibreuse, par exemple un tissé.
Sur la figure 4, le dispositif de culture microbiologique 1D selon encore un autre mode de réalisation de l’invention comprend deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’, un milieu de culture 3 sous forme de poudre comprenant lui-même au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre, une membrane de filtration microbiologique 5 et une membrane perméable intercalaire 7. Cette dernière a une blancheur CIE au moins égale à 65.
Sur la figure 5, le dispositif de culture microbiologique 1E selon encore un autre mode de réalisation de l’invention comprend deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’, un milieu de culture 3 sous forme de poudre comprenant lui-même au moins un agent gélifiant 4 sous forme de poudre, une couche superficielle déshydratée 6 et une membrane perméable intercalaire 7.
La couche superficielle déshydratée 6 est un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté et la membrane perméable intercalaire 7 a une blancheur CIE au moins égale à 65.
Les dispositifs de culture microbiologique IA, IB, IC, 1D et 1E selon l’invention, peuvent être fournis déjà préassemblés, solidarisés, ou bien alors sous la forme d’éléments distincts et indépendants : les pièces en matériau hydrophile et absorbant, la membrane de filtration, la couche superficielle, la membrane perméable intercalaire et les poudres de milieux de culture et d’agents gélifiant.
A titre de caractéristique secondaire, un réceptacle 8 (Figures 6, 7 ou 8) est associé au dispositif de culture microbiologique pour en faciliter la manipulation, notamment pour l'étape de réhydratation et activation du dispositif, et pour tout déplacement (par exemple, un transfert de la paillasse à l'incubateur). L'utilisation d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention nécessite une activation du dispositif grâce à une hydratation par un échantillon aqueux 9.
Ainsi sur la Figure 6, le dispositif de culture microbiologique IA selon l'invention est placé à l'intérieur du réceptacle 8, avec l’une des deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 ou 2’ tournée vers le haut. Le réceptacle 8 étant de plus grande surface que celle du dispositif de culture, on verse l’échantillon 9 sur le dispositif microbiologique dans le réceptacle 8. Le volume d'eau utilisé est plus ou moins calibré pour pouvoir humidifier suffisamment le dispositif IA et solubiliser la composition de milieu de culture qu'elle renferme.
Sur la Figure 7, le dispositif de culture microbiologique IB ou 1D est placé à l'intérieur du réceptacle 8, avec la membrane de filtration microbiologique 5 tournée vers le haut. Comme précédemment, on verse l’échantillon 9 sur cette membrane de filtration microbiologique 5 positionnée sur le dispositif microbiologique dans le réceptacle 8. Le volume d'eau utilisé est plus ou moins calibré pour pouvoir humidifier suffisamment le dispositif et solubiliser la composition de milieu de culture qu'elle renferme.
Au cours de l'activation d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, l'hydratation des différents dispositifs de culture microbiologique, décrits ci- dessus, permet, de solubiliser la composition de milieu de culture 3 ainsi que l’agent gélifiant 4 contenus entre deux pièces en matériau hydrophile et absorbant.
Sur la Figure 8, le dispositif de culture microbiologique IC ou 1E, selon l'invention est placé à l'intérieur du réceptacle 8, avec le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6 tourné vers le haut. Puis on verse l'eau 9’ dans le réceptacle 9 en prenant soin de ne pas en verser directement sur le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6. Le volume d'eau utilisé est plus ou moins calibré pour pouvoir humidifier suffisamment la pièce en matériau absorbant 1 et solubiliser la composition de milieu de culture qu'elle renferme.
Une autre façon d'opérer consiste à verser dans le fond du réceptacle 8, le volume d'eau approprié, puis d'y déposer le dispositif de culture microbiologique surmonté du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6. On prendra soin de ne pas placer le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6 directement en contact avec l'eau libre, de façon à ce que le dispositif soit effectivement hydraté uniquement par la pièce en matériau absorbant 2
Lorsque le dispositif de culture microbiologique selon l'invention est fourni avec le dispositif de culture microbiologique et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 2 sous la forme de deux éléments mécaniquement indépendants, l'étape d'hydratation peut alors être réalisée d'une troisième manière le dispositif de culture microbiologique, sans le feuillet, est alors placé à l'intérieur du réceptacle 8. Dans le réceptacle 8 et éventuellement directement sur ce dispositif de culture microbiologique, on verse une quantité d'eau 9’ suffisante pour bien imbiber le dispositif de culture microbiologique. On vient ensuite en recouvrir la surface avec le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6
Au cours de l'activation d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, l'hydratation par les pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’ permettent, dans un premier temps, de solubiliser la composition de milieu de culture contenue entre ces deux pièces. Dans un deuxième temps, cette activation se poursuit par l'hydratation du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6, positionné sur la surface le dispositif de culture microbiologique. Cette réhydratation du feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6 fait apparaître, à la surface de la pièce en matériau hydrophile et absorbant 2, une couche d'hydrogel polysaccharidique réhydraté et gonflé, non pas simplement par l'eau provenant de la pièce en matériau absorbant 2 mais plutôt par une solution de milieu de culture compris entre les deux pièce en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’.
Ainsi activé, par sa consistance et sa texture bien particulières, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention permet de créer une surface de culture, à la fois lubrifiée et adhérente pour les cellules, apte à recevoir les microorganismes et de permettre le cas échéant leur isolement par des opérations et moyens mécaniques habituellement utilisés pour étaler les cellules sur la surface d'un milieu gélosé classique. Par ailleurs, du fait de sa grande exposition aux échanges gazeux et aux phénomènes d'assèchement et à ses propriétés hyper-absorbantes, ce dispositif va pouvoir s'auto-suffire, tout au long de la période d'incubation et de façon continue, de la solution de milieu de culture.
Une fois l'échantillon inoculé sur le dispositif, l'ensemble est incubé à une température et pour une durée établies, avant lecture des résultats.
Lorsque le dispositif microbiologique selon l’invention comprend une couche superficielle, tel qu’un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté 6, des opérations d'étalement et de dispersion des cellules peuvent être réalisées au moyen d'une oese, par exemple.
IL Eléments constitutifs d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention
1. Pièces en matériau hydrophile et absorbant
S'agissant des pièces en matériau absorbant 2 et 2’ entrant dans la constitution d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention, celles-ci sont façonnées à partir d'un support tridimensionnel, de structure ouverte, poreuse, apte à recevoir en son sein, aussi bien un liquide (en particulier, un échantillon aqueux) que des particules solides de granulométrie adaptée.
Pour les exemples et les essais qui vont suivre, les dispositifs de culture microbiologique testés comprennent deux pièces en matériau hydrophile et absorbant, confectionnées à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède). Il s’agit d’un non-tissé bicomposant PET/CoPET (Polyester/coPolyester). Deux pièces en matériau hydrophile et absorbant de masse surfacique et d’épaisseur différentes ont été utilisées. Le premier se caractérise par une masse surfacique de l'ordre de 95 g.m 2 pour une épaisseur de 2 mm. Le second possède une masse surfacique de l'ordre de 50 g.m 2 pour une épaisseur de 0,76 mm. A partir de ces non-tissé, des pièces circulaires d'à peu près 45 mm de diamètre ont été découpées.
2. Milieu de culture formulés sous forme de poudre
En vue de tester les dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, un milieu de culture gélosé distribués par la société bioMérieux (France), a été utilisé. Il s'agit plus particulièrement d’un milieu de la gamme chromID®, le chromID® CPS Elite. Ce milieu est utilisé pour l’isolement, la numération et l’identification directe de Escherichia coli , d'Enterocoques, de Proteus et du groupe KESC ( Klebsiella , Enterobacter , Serratia, Citrobacter )
Les dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, ainsi élaborés, ont alors pu être testés pour la détection, l'isolement, la numération ou encore l’identification de bactéries telles que Escherichia coli et Enterococcus faecalis.
3. Agent gélifiant sous forme de poudre
En vue de tester les dispositifs de culture microbiologique selon l'invention, la gomme de xanthane Mataxan 25 pm (Alliance gums & industries, ref. M14015) a été utilisée en tant qu’ agent gélifiant 4.
4. Membrane de filtration microbiologique
La membrane de filtration microbiologique 5 entre dans la composition des dispositifs de culture microbiologique IB et 1D selon certains modes de réalisation de l’invention. Elle est également utilisée dans le cadre d’un dispositif de contrôle microbiologique 10 selon l’invention. Cette membrane de filtration microbiologique 5 est un filtre qui est perméable à l'eau et qui retient les microorganismes, notamment à sa surface. Cette membrane est également perméable aux éléments nutritifs du milieu de culture et aux éventuels éléments additifs compris dans ce milieu de culture situé, entre les deux pièces en matériau hydrophile et absorbant 2 et 2’, sous la membrane de filtration microbiologique. Dans les exemples qui vont suivre, la membrane de filtration microbiologique 5 présente la forme d’un disque sensiblement plan et constituée d'un mélange d'esters de cellulose (nitrate et acétate). Il s’agit de la membrane de filtration Nitocellulose Membrane Filters, fabriquée par Zefon International, Inc., 5350 SW Ist Lane, Ocala, FL 34474, USA.
5. Couche superficielle déshydratée
La couche superficielle 6, qui sera un d'hydrogel polysaccharidique déshydraté dans les exemples qui vont suivre, entre dans la constitution des dispositifs de culture microbiologique IC ou 1E selon certains modes de réalisation de l’invention. Le feuillet d'hydrogel polysaccharidique est conçu avant tout de telle façon que, une fois réhydratés, il puisse offrir aux microorganismes un support adapté à leur croissance et développement. La composition et la consistance de ces feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté ont également été spécifiquement étudiées pour obtenir des surfaces adaptées aux opérations d'isolement et d'étalement des cellules, que ces feuillets d'hydrogel polysaccharidique soient dans un état réhydraté ou déshydraté.
Voici par exemple un procédé de préparation d’un hydrogel pouvant être utilisé dans le cadre de la présente invention :
a. Préparation des hydrogels polysaccharidiques :
faire chauffer 500 mL d'eau distillée stérile dans un flacon en verre sur plaque chauffante ;
rajouter le(s) gélifîant(s) en quantité définie et attendre que le mélange soit homogène et translucide en continuant de chauffer (porter à ébullition ou proche de Pébulition) ;
après dissolution complète, rajouter le glycérol, homogénéiser et ajouter le(s) sel(s) de cation divalent servant de liant et d'agent durcisseur, homogénéiser et porter à ébullition ;
répartir 5 à 15 mL (selon l'épaisseur souhaitée pour le feuillet) du mélange encore chaud dans des boîtes de Pétri de 47 mm de diamètre ;
laisser refroidir et durcir sur la paillasse, jusqu'à reprise en masse du gélifiant. Démouler les pièces d'hydrogel, à l'aide d'un scalpel si nécessaire. b. Déshydratation des hydrogels polysaccharidiques : enserrer les pièces d'hydrogels entre deux feuilles de papier absorbant ; placer l'ensemble au four, à une température de l'ordre de 40°C, pendant 1 à 6 heures ; l'opération peut également être effectuée pendant au moins une nuit, dans une étuve à chaleur sèche, portée à 32°C.
Dans le cadre de la présente invention, les feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté d'un dispositif de culture de microbiologique peuvent être déclinés sous différentes versions, en faisant varier, notamment :
la nature du gélifiant polysaccharidique (par exemple, gomme de gellane, gomme de xanthane, gommes de galactomannane, amidon, alginate de sodium, pectine, méthylcellulose et hydroxyméthylcellulose) ;
la proportion entre l'eau et le gélifiant, utilisée lors de l'étape de préparation des hydrogels polysaccharidiques ;
la nature et la quantité des éventuels agents durcisseurs utilisés dans la préparation des hydrogels polysaccharidiques ;
la nature et la quantité des additifs éventuellement utilisés pour améliorer les propriétés physico-chimiques des hydrogels polysaccharidiques (hydratés) et/ou des feuillets d'hydrogel polysaccharidique déshydraté.
6. Membrane perméable intercalaire
En vue d'améliorer le contraste et l'observation des colonies poussant à la surface du dispositif de culture microbiologique, une membrane opaque à la lumière et d'une grande blancheur (par exemple, une blancheur CIE au moins égale à 65) peut être intercalée entre soit la pièce en matériau hydrophile supérieure et absorbant et le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté soit entre la pièce en matériau hydrophile supérieure et la membrane de filtration microbiologique. Cette membrane perméable intercalaire 7 peut consister en une feuille de papier absorbant, de composition cellulosique.
III. Dispositifs de culture microbiologique selon l'invention dans un dispositif de contrôle microbiologique
Sur la Figure 9, un mode de réalisation de l’invention dans lequel le dispositif de culture microbiologique 1 A et une membrane de filtration 5 sont compris dans un dispositif de contrôle microbiologique 10. Ce dispositif de contrôle microbiologique permet de réaliser des opérations de contrôle simplifiées d’un liquide à analyser susceptible de contenir au moins un microorganisme, et ce même en dehors d’un laboratoire microbiologique, y compris dans un environnement industriel.
Ce dispositif de contrôle microbiologique 10 comporte au moins un corps principal 11 et un couvercle 12. Le corps principal 11 et le couvercle 12 sont formés de pièces distinctes qui sont assemblées l'une à l'autre pour former l'enceinte du dispositif de contrôle microbiologique. Le couvercle 12 vient refermer le corps principal 11 pour délimiter l’espace interne fermé 13 du dispositif de contrôle microbiologique 10. Le couvercle 12 présente donc une forme complémentaire de celle du corps principal 11 pour assurer la fermeture de ce dernier.
Ce dispositif de contrôle microbiologique 10 correspond au dispositif tel que décrit dans la demande WO2018/189478 déposée par la demanderesse et ce pour tous les modes de réalisation décrit dans cette même demande.
Ainsi, tout comme le dispositif décrit dans la demande WO2018/189478, le dispositif de contrôle microbiologique 10 dans le cadre de la présente invention comporte une membrane de filtration microbiologique 5 qui est disposée dans l'espace interne fermé 13 et qui sépare l'espace interne fermé en deux compartiments.
La membrane de filtration microbiologique 5 s'étend dans l'espace interne fermé 12 sensiblement transversalement, selon toute la section de l'espace interne fermé. Dans l'exemple, la membrane de filtration microbiologique 5 présente une forme sensiblement plane, ici la forme d'un disque. Il est de préférence agencé perpendiculairement à l'axe central du corps principal 11.
Le dispositif de contrôle microbiologique comporte, à l'intérieur de l'espace interne fermé 13, un dispositif de culture microbiologique IA selon l’invention, le dispositif microbiologique IA étant en contact avec la membrane de filtration microbiologique 5.
Dans ce mode de réalisation illustré, le dispositif de culture microbiologique IA est un élément distinct de la membrane de filtration microbiologique 5, tout en étant en contact avec la membrane de filtration microbiologique 5. Le dispositif de culture microbiologique IA et la membrane de filtration microbiologique 5 sont mis en contact l'un avec l'autre au sein du dispositif de contrôle microbiologique une fois celui-ci assemblé. Dans ce cas, le dispositif de culture microbiologique 1 A est situé de préférence, en-dessous la membrane de filtration microbiologique 5. Cependant, rien n'empêche de prévoir que le dispositif de culture microbiologique IA soit situé au-dessus de la membrane de filtration microbiologique 5. Dans ce cas particulier, le dispositif de culture microbiologique IA comprend avantageusement au moins un substrat chromogénique et/ou fluorogénique apte à permettre une détection directe ou indirecte d'une activité enzymatique ou métabolique des micro-organismes cibles. Le signal visuel généré par ledit au moins un substrat est alors visible au travers d'au moins une partie de l'épaisseur du dispositif de culture microbiologique IA.
Dans un autre mode réalisation le dispositif de contrôle microbiologique comporte, à l'intérieur de l'espace interne fermé 13, le dispositif de culture microbiologique IA et la membrane de filtration microbiologique 5 déjà assemblés préalablement ce qui correspond à un dispositif de culture microbiologique IB selon l’invention tel que décrit plus haut et sur la Figure 2.
Dans l’exemple illustré, le dispositif de culture microbiologique IA présente une forme sensiblement plane, ici la forme d'un disque. Le dispositif de culture microbiologique 1 A présente un bord périphérique qui, de préférence, coïncide avec le bord périphérique de la membrane de filtration microbiologique 5. Ainsi, le dispositif de culture microbiologique IA et la membrane de filtration microbiologique 5 présentent la même forme.
Le dispositif de contrôle microbiologique 10 selon l'invention comporte un port d'entrée 14 pour le liquide à analyser. Le port d'entrée 14 permet, lorsque le dispositif de contrôle microbiologique 10 est assemblé de telle sorte que l'enceinte délimite l'espace interne fermé 13, par exemple lorsque le couvercle 12 est assemblé avec corps principal 11, d'introduire le liquide à analyser à l'intérieur de l'espace interne fermé délimité par l'enceinte, en provenance de l'extérieur de l'espace interne fermé 13.
Dans cet exemple de réalisation illustré, le port d'entrée 14 comprend
une portion interne 15 qui débouche dans l'espace interne fermé 13 ; une portion externe 16 de raccordement à un contenant de liquide à analyser, le contenant pouvant être par exemple une seringue, une tubulure, une poche, un entonnoir etc.. ; et un obturateur 17 qui, dans cet exemple de réalisation, est interposé entre la portion interne 15 et la portion externe 16 du port d'entrée, de manière à obturer le port d'entrée 14, empêchant, dans un état fermé de l'obturateur 17, toute circulation gazeuse entre l'espace interne fermé 13 du dispositif de contrôle microbiologique 10 et l'extérieur au travers du port d'entrée 14.
Dans cet exemple illustré, le port d'entrée 14 est agencé selon l'axe central, verticalement. Le port d'entrée est avantageusement agencé sur le couvercle 12.
IV. Evaluation des dispositifs de culture microbiologique selon l'invention
1. Dispositif de culture microbiologique 1 A
Des essais ont été menés en vue d'évaluer la capacité du dispositif de culture microbiologique 1 A selon l’invention à pouvoir constituer un support performant permettant la culture, la détection et/ou l’identification de microorganismes possiblement présents dans un échantillon à analyser, à contrôler.
Dans ce contexte, une culture microbienne a été réalisée avec une souche d’ Escherichia coli. La composition de milieu de culture déshydratée doit être choisie pour permettre à la croissance et le développement des bactéries d'intérêt, et doit intégrer des composantes chromogéniques facilitant l'identification visuelle de ces bactéries d'intérêt.
Pour ce faire, le milieu de culture chromID® CPS Elite est utilisé. Ce milieu de culture, commercialisé par la société bioMérieux, peut-être utilisé pour l’isolement, la numération et l’identification directe de la bactérie Escherichia coli.
Ainsi le dispositif de culture microbiologique 1 A, dans le cadre de cet exemple, se compose de :
deux pièces en matériau hydrophile et absorbant, chaque pièce ayant une épaisseur de 2 mm, confectionnées à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède), et
un milieu de culture chromID® CPS Elite comprenant de la gomme xanthane Mataxan 25pm (Alliance gums & industries, ref. M14015)
Dans le cadre de cet exemple, deux conditions expérimentales sont étudiées. Dans la première, on utilise 32 g de milieu de culture chromID® CPS Elite et 40 g de gomme xanthane.Dans la seconde, on utilise 32 g de milieu de culture chromID® CPS Elite et 20 g de gomme xanthane.
Les dispositifs sont, ensuite, calandrés à XX°C en appliquant une pression de XX kg. cm 2 pendant une durée de XX secondes.
Puis ces dispositifs sont placés dans une boîte de Pétri de 90 mm de diamètre, puis humidifiés avec 1 mL d’une suspension d’ Escherichia coli ayant une charge bactérienne théorique 1.107 UFC/mL. L’ensemble est alors incubé à 37°C pendant 24 heures.
Pour chaque condition expérimentale, l’expérience a été réalisée trois fois.
Aux Figures 11 et 12, sont exposées des photographies de cultures d Escherichia coli effectués sur le dispositif de culture microbiologique IA dont les caractéristiques sont décrites ci-dessus.
A la Figure 11, le dispositif de culture microbiologique 1 A comprend 32 g de milieu de culture chromID® CPS Elite et 40 g de gomme xanthane. Et à la Figure 12, 32 g de milieu de culture chromID® CPS Elite et 20 g de gomme xanthane.
Dans les conditions deux conditions expérimentales, les résultats obtenus sont très similaires. Les colonies d Έ. coli poussent à l’intérieur des deux pièces en matériau hydrophile et absorbant. Elles présentent une très belle taille et une très belle coloration. Leur morphotype correspond à celle des colonies d Έ. coli poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromID® CPS Elite.
Ainsi ce dispositif de culture microbiologique IA selon l’invention constitue un support de culture microbiologique performant permettant la culture, la détection et l’identification de microorganismes présents dans un échantillon à analyser.
2. Dispositif de culture microbiologique IC
Le dispositif de culture microbiologique IC selon l’invention comprend, en plus du dispositif 1 A, une couche superficielle, qui est un feuillet hydrogel polysaccharidique déshydraté. Ce feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté doit présenter une surface pleine, une intégrité structurelle et la tenue mécanique satisfaisante.
Des essais ont été menés en vue d'évaluer la capacité de tels dispositifs à pouvoir constituer des supports de culture microbiologique à la fois performants et compatibles avec les opérations et les moyens mécaniques d'étalement et de dispersion des cellules. Des cultures bactériennes ont été réalisées notamment avec des souches d 'Escherichia coli et d 'Enterococcus faecalis. En fonction des bactéries d'intérêt à cultiver, le dispositif de culture microbiologique comprend une composition de milieu de culture déshydratée particulière. La particularité de cette composition de milieu de culture déshydratée réside dans le fait qu'elle a été choisie pour pouvoir être adaptée à la croissance et au développement des bactéries d'intérêt, et qu'elles intègrent des composantes chromogéniques facilitant l'identification visuelle de ces bactéries d'intérêt.
Pour ce faire, le même milieu de culture que précédemment est utilisé, à savoir le milieu de culture chromID® CPS Elite. Ce milieu permet risolement, la numération et G identification directe de E. coli , et présomptive d! Entérocoques.
Ainsi, le dispositif de culture microbiologique IC, dans cet exemple, se compose de :
deux pièces en matériau hydrophile et absorbant, chaque pièce ayant une épaisseur de 2 mm, confectionnées à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède),
un milieu de culture chromID® CPS Elite comprenant de la gomme xanthane, et
un feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté.
Dans le cadre de cet exemple, on utilise 32 g de milieu de culture chromID® CPS Elite et 20 g de gomme xanthane.
Ce dispositif, tel que décrit ci-dessus, est calandré à 60°C en appliquant une pression de0,4 kg. cm 2 pendant une durée de 60 secondes.
Le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté a été préparé comme décrit précédemment (cf. II Eléments constitutifs d'un dispositif de culture microbiologique selon l'invention , 5. Couche superficielle déshydratée).
Ce dispositif IC, tel que décrit ci-dessus, est placé dans des boîtes de Pétri de 90 mm de diamètre, puis humidifiées avec 7-8 mL d'eau distillée stérile. Une fois l'hydratation de la pièce en matériau absorbant réalisée, le milieu de culture activé et la couche d'hydrogel polysaccharidique régénérée, le dispositif de culture microbiologique est ensemencé par 100 pL avec une suspension comprenant 10.104 UFC/mL d 'Escherichia coli et 10.104 UFC/mL d Enterococcus faecalis. Cette suspension est déposée au moyen d'une première oëse sur le premier cadran de la surface d'hydrogel. Le deuxième cadran est ensemencé avec une nouvelle oëse en étirant plusieurs stries à partir du premier cadran. Le troisième cadran est ensemencé comme le deuxième sans changer d'oëse. Le quatrième cadran est ensemencé par des stries non étirées à partir du second cadran.
Les boîtes sont placées dans une jarre avec un peu d'eau de façon à ce que les dispositifs de culture microbiologique ne se dessèchent pas. L'ensemble est alors incubé à 37°C pendant, 24 heures.
Aux Figures 13 et 14, sont exposées des photographies de cultures et d’isolements d 'Escherichia coli et d 'Enterococcus faecalis effectuées sur le dispositif de culture microbiologique IC dont les caractéristiques sont décrites ci-dessus.
Les résultats obtenus sont très similaires. Les colonies d 'Escherichia coli et d' Enterococcus faecalis poussent à la surface du feuillet d'hydrogel. Elles présentent une très belle taille et une très belle coloration. Leur morphotype correspond à celle des colonies d 'Escherichia coli et d' Enterococcus faecalis poussant sur une gélose chromogénique de référence telle que le chromID® CPS Elite.
De plus, ces expérimentations ont permis de montrer que le feuillet d'hydrogel polysaccharidique déshydraté présentait une surface pleine, une intégrité structurelle et la tenue mécanique satisfaisante (non représenté).
3. Dispositifs de culture microbiologique selon l'invention dans un dispositif de contrôle microbiologique
Pour finir, le dispositif de culture microbiologique selon l'invention intégré dans un dispositif de contrôle microbiologique a été étudié.
Ainsi, selon un mode de réalisation de l’invention, le dispositif de culture microbiologique IA et une membrane de filtration microbiologique sont compris dans un dispositif de contrôle microbiologique.
Ce dispositif de contrôle microbiologique permet de réaliser des opérations de contrôle simplifiées d’un liquide à analyser susceptible de contenir au moins un microorganisme, et ce même en dehors d’un laboratoire microbiologique, y compris dans une environnement industriel. Dans le cas présent, le dispositif de culture microbiologique n’est pas le siège de la croissance mais permet la croissance sur la membrane de filtration microbiologique positionnée sur l’une des pièces en matériau absorbant.
Les essais, ci-dessous, ont été menés en vue d'évaluer la capacité du dispositif de culture microbiologique à :
pouvoir retenir le milieu de culture lors du passage du liquide à analyser, résistant ainsi, au lessivage de ce milieu de culture, et
permettre la mise à disposition des ingrédients nutritifs et des agents actifs du milieu de culture aux microorganismes capturés sur le filtre et permettre ainsi la croissance de ces microorganismes capturés.
Ainsi afin de démontrer que le dispositif selon l’invention possède ces propriétés, il a été vérifié la croissance effective de bactéries sur la membrane de filtration positionné sur le dispositif et ce après le passage d’un échantillon d’eau ensemencée avec une quantité connue de bactéries cibles.
Différentes conditions expérimentales ont été étudiées, en faisant varier la quantité de gomme de xanthane et l’épaisseur des pièces en matériau hydrophile et absorbant, confectionnées à partir du non-tissé Airlaid SCA95NN81, de la compagnie SCA (Suède).
Tout comme précédemment, le milieu de culture sera le chromID® CPS Elite, commercialisé par la société bioMérieux.
Les dispositifs sont calandrés à 50°C en appliquant une pression de 10 kg.cm 2 pendant une durée de 30 secondes.
La membrane de filtration utilisée est membrane constituée d'un mélange d'esters de cellulose (nitrate et acétate). Il s’agit de la membrane de filtration Fisherbrand™ General Filtration Membrane Filters commercialisées par Fisher Scientific Company L.L.C, 300 Industry Drive, Pittsburgh, PA 15275, USA.
Dans le cadre de cet exemple, le liquide à analyser est une solution d’eau minérale de la marque EVIAN dans laquelle a été inoculée une culture bactérienne constituée d’une souche d 'Escherichia coli et d’une souche ά' Enter ococcus faecalis. Ainsi, 100 mL de la solution d’eau minérale inoculée comprenant soit 25 UFC/100mL soit 50 UFC/100mL pour chaque bactérie sont analysés.
Ainsi, l'introduction de la solution à analyser dans le dispositif de contrôle microbiologique selon l'invention, au travers du port d'entrée, permet à la solution d'être introduite tout d'abord dans l'espace interne fermé, la solution à analyser venant alors naturellement au contact de la membrane de filtration microbiologique. La solution à analyser est donc filtrée au travers de la membrane de filtration microbiologique, de sorte que certains au moins des éventuels microorganismes, notamment ceux ciblés pour le contrôle envisagé, sont retenus par la membrane de filtration microbiologique. Au contraire, la partie liquide de la solution à analyser migre en direction vers le fond de l'espace interne fermé. Le liquide à analyser permet la réhydratation du dispositif de culture microbiologique selon l’invention.
Comme le dispositif de culture microbiologique est au contact de la membrane de filtration, les éléments nutritifs et les éventuels éléments additifs de celle-ci peuvent migrer en direction des microorganismes qui sont retenus par la membrane de filtration microbiologique.
Par la suite, le dispositif de contrôle microbiologique est mis dans un environnement, notamment de température, favorable, pour obtenir une incubation des microorganismes à l'intérieur du dispositif de contrôle microbiologique lui- même, sans qu'il soit nécessaire d'ouvrir celui-ci et sans qu'il soit nécessaire de retirer la membrane de filtration microbiologique de l'enceinte du dispositif de contrôle microbiologique.
Ainsi, l'utilisation d'un dispositif de contrôle microbiologique selon l'invention, après l'étape d'introduction de la solution à analyser à l'intérieur de l'espace interne fermé du dispositif de contrôle microbiologique, comprend les étapes ultérieures consistant à :
refermer l'obturateur du port d'entrée ;
faire incuber à 37°C pendant 18-24 heures, dans le dispositif de contrôle microbiologique, un éventuel microorganisme contenu initialement dans la solution à analyser.
Après cette période d'incubation, l’étape de contrôle consistant à détecter, dénombrer, identifier et caractériser un éventuel microorganisme contenu initialement dans la solution à analyser se fait par vision au travers d'une portion transparente de l'enceinte du dispositif de contrôle microbiologique. Là encore, cette étape de contrôle peut être réalisée sans qu'il soit nécessaire d'ouvrir le dispositif de contrôle microbiologique, la membrane de filtration microbiologique, sur laquelle se trouvent les éventuels microorganismes, restant donc à l'intérieur de l'espace interne fermé du dispositif de contrôle microbiologique.
Afin de valider l’utilisation d’un dispositif de culture microbiologique selon l'invention dans un dispositif de contrôle microbiologique, cette utilisation a été comparée à utilisation du dispositif de culture microbiologique selon l'invention dans un système de filtration Milliflex®. Le système de filtration Milliflex®, commercialisé par Merck, est composé d'une pompe à vide Milliflex® et d’un entonnoir de filtration Milliflex®. Il s’agit d’une solution de filtration classique.
Résultats :
Dans le tableau 1 ci-dessous les résultats de quantification pour un dispositif de culture microbiologique selon l’invention compris dans le dispositif de contrôle microbiologique. Dans ce dispositif de culture microbiologique les deux pièces en matériau hydrophile et absorbant présentent une épaisseur identique de 2 mm.
[Tableau 1] :
Figure imgf000036_0001
Dans le tableau 2 ci-dessous les résultats de quantification pour un dispositif de culture microbiologique selon l’invention compris dans le dispositif de contrôle microbiologique. Dans ce dispositif de culture microbiologique les deux pièces en matériau hydrophile et absorbant présentent une épaisseur différente, la pièce supérieure, qui sera la première en contact avec la solution à analyser et qui en contact avec la membrane de filtration, présente une épaisseur de 0,76 mm, la pièce inférieure présente une épaisseur de 2 mm.
[Tableau 2] :
Figure imgf000036_0002
Figure imgf000037_0001
Dans le tableau 3 ci-dessous les résultats de quantification pour un dispositif de culture microbiologique selon l’invention compris un système de filtration Milliflex®. Chaque pièce en matérieau hydrophile et absorbant présente une épaisseur de 2 mm par pièce. Le dispositif comprend une quantité de gomme de xanthane de 20 g.
[Tableau 3] :
Figure imgf000037_0002
Conclusions :
Les résultats obtenus avec le dispositif de culture microbiologique intégré dans un dispositif de contrôle microbiologique, montrent tout d’abord qu’en absence de gomme de xanthane il n’y a pas de croissance des bactéries sur la membrane de filtration. Ceci démontre que la gomme de xanthane permet dans un premier temps de retenir le milieu de culture lors du passage d’un grand volume de solution à analyser, résistant ainsi, au lessivage de ce milieu de culture et puis dans un second temps permet, lors de l’incubation, de mettre à disposition les éléments nutritifs et des agents actifs du milieu de culture aux microorganismes capturés sur le filtre.
Ensuite, ces résultats montrent que même en faisait varier l’épaisseur des pièces en matériau hydrophile et absorbant, il y a croissance microbiologique.
Enfin, le tableau 3 montre que le dispositif de culture microbiologique intégré dans un dispositif de contrôle microbiologique selon l’invention présente des performances similaires voire meilleurs que dispositif de culture microbiologique intégré un système de filtration Milliflex®.
Ainsi contre toute attente, le dispositif selon la présente invention permet une rétention du milieu de culture lors du passage d’un grand volume de liquide à analyser tout en permettant le relargage des nutriments et des agents actifs du milieu de culture solubilisés pendant l’incubation. Par conséquent, les inventeurs ont démontré que le dispositif de culture microbiologique intégré à un dispositif de contrôle microbiologique permet de détecter, dénombrer, identifier et/ou caractériser un éventuel microorganisme contenu dans un liquide à analyser, permettant, ainsi son contrôle.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de culture microbiologique comprenant tout ou partie d’un milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, caractérisé en ce que :
ledit dispositif comprend au moins deux pièces en matériau hydrophile et absorbant ayant une face supérieure au moins sensiblement plane, et comprenant entre deux pièces contigües ledit milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre, et
ledit milieu de culture microbiologique comprend au moins un agent gélifiant sous forme de poudre.
2. Dispositif de culture microbiologique selon la revendication 1, dans lequel lesdites pièces en matériau hydrophile et absorbant présentent une masse volumique identique ou différente comprise entre 0,045 g. cm 3 et 0,10 g. cm 3.
3. Dispositif de culture microbiologique selon l’une des revendications précédentes, dans lequel lesdites pièces en matériau hydrophile et absorbant présentent une épaisseur identique ou différente comprise entre 0,8 mm et 2 mm.
4. Dispositif de culture microbiologique selon l’une des revendications précédentes, dans lequel ledit au moins un agent gélifiant est choisi parmi : une gomme de xanthane, l’alginate, une gomme de gellane, une gomme de galactomannane, de gomme de graine de caroube, l’amidon et un mélange de ceux-ci.
5. Dispositif de culture microbiologique selon l’une des revendications précédentes, dans lequel le milieu de culture microbiologique déshydratée sous forme de poudre présente une quantité comprise entre 0.009 g. cm 3 et 0.050 g. cm 3.
6. Dispositif de culture microbiologique selon l’une des revendications précédentes, dans lequel une membrane de filtration microbiologique recouvre la face d’un moins une des pièces en matériau hydrophile et absorbant qui n’est pas en contact avec le milieu de culture.
7. Dispositif de culture microbiologique selon l’une des revendications 1 à 5, dans lequel couche superficielle déshydratée recouvre la face d’un moins une des pièces en matériau hydrophile et absorbant qui n’est pas en contact avec le milieu de culture.
8. Dispositif de culture microbiologique selon la revendications précédente 7, dans lequel ladite couche superficielle déshydratée est un feuillet d’hydrogel.
9. Procédé de détection et/ou d’identification et/ou d’énumération, d'au moins un microorganisme cible dans un échantillon aqueux susceptible de le contenir, comprenant les étapes suivantes :
a. fournir un dispositif de culture microbiologique pour la détection et/ou l'identification et/ou l'énumération de microorganismes selon l’une des revendications 1 à 8,
b. mettre en contact un échantillon aqueux avec ledit dispositif de culture microbiologique selon l’une des revendications 1 à 8,
c. incuber le dispositif de culture microbiologique,
d. détecter et/ou identifier et/ou énumérer la ou les colonies de microorganismes au sein du dispositif de culture microbiologique, lorsque les microorganismes recherchés sont présents dans l'échantillon.
10. Utilisation d'un dispositif de culture microbiologique selon l’une des revendications 1 à 8, pour détecter et/ou identifier et/ou énumérer au moins un microorganisme cible dans un échantillon susceptible de le contenir.
PCT/FR2020/000095 2019-04-08 2020-04-07 Dispositif de culture microbiologique WO2020208311A1 (fr)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
FR1903751 2019-04-08
FR1903751A FR3094722B1 (fr) 2019-04-08 2019-04-08 Dispositif de culture microbiologique

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2020208311A1 true WO2020208311A1 (fr) 2020-10-15

Family

ID=67875559

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/FR2020/000095 WO2020208311A1 (fr) 2019-04-08 2020-04-07 Dispositif de culture microbiologique

Country Status (2)

Country Link
FR (1) FR3094722B1 (fr)
WO (1) WO2020208311A1 (fr)

Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0070310A1 (fr) 1981-01-27 1983-01-26 Minnesota Mining & Mfg Milieu de culture a sec.
EP0620844A1 (fr) 1991-12-09 1994-10-26 Minnesota Mining & Mfg Dispositif a milieu de culture.
EP0832180A1 (fr) 1995-06-02 1998-04-01 Minnesota Mining And Manufacturing Company Dispositif de comptage de colonie de surface et procede d'utilisation
WO2014013089A1 (fr) 2012-07-20 2014-01-23 bioMérieux Procede d'isolement de micro-organismes sur un milieu de culture et dispositif associe
WO2015104501A1 (fr) 2014-01-09 2015-07-16 bioMérieux Procédé de détection, identification et énumération de micro-organismes dans un support poreux imprégné à sec par un milieu réactionnel déshydraté
WO2015107228A1 (fr) 2014-01-20 2015-07-23 bioMérieux Dispositif pour la culture de microorganismes et procede associe
WO2016193647A1 (fr) 2015-06-05 2016-12-08 bioMérieux Procede et dispositif pour hydrater par un echantillon liquide un support hydratant
WO2017019345A1 (fr) 2015-07-24 2017-02-02 3M Innovative Properties Company Dispositif de culture à film mince pour la numération de micro-organismes
WO2018189478A1 (fr) 2017-04-13 2018-10-18 bioMérieux Dispositif de controle microbiologique, procede de mise a disposition et utilisation d'un tel dispositif
WO2018197805A1 (fr) 2017-04-26 2018-11-01 bioMérieux Dispositif de culture microbiologique comprenant un feuillet d'hydrogel polysaccharidique deshydrate

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP4143219B2 (ja) 1999-05-19 2008-09-03 日水製薬株式会社 簡易培地及びその製造方法

Patent Citations (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0070310A1 (fr) 1981-01-27 1983-01-26 Minnesota Mining & Mfg Milieu de culture a sec.
EP0620844A1 (fr) 1991-12-09 1994-10-26 Minnesota Mining & Mfg Dispositif a milieu de culture.
EP0832180A1 (fr) 1995-06-02 1998-04-01 Minnesota Mining And Manufacturing Company Dispositif de comptage de colonie de surface et procede d'utilisation
WO2014013089A1 (fr) 2012-07-20 2014-01-23 bioMérieux Procede d'isolement de micro-organismes sur un milieu de culture et dispositif associe
WO2015104501A1 (fr) 2014-01-09 2015-07-16 bioMérieux Procédé de détection, identification et énumération de micro-organismes dans un support poreux imprégné à sec par un milieu réactionnel déshydraté
WO2015107228A1 (fr) 2014-01-20 2015-07-23 bioMérieux Dispositif pour la culture de microorganismes et procede associe
WO2016193647A1 (fr) 2015-06-05 2016-12-08 bioMérieux Procede et dispositif pour hydrater par un echantillon liquide un support hydratant
WO2017019345A1 (fr) 2015-07-24 2017-02-02 3M Innovative Properties Company Dispositif de culture à film mince pour la numération de micro-organismes
WO2018189478A1 (fr) 2017-04-13 2018-10-18 bioMérieux Dispositif de controle microbiologique, procede de mise a disposition et utilisation d'un tel dispositif
WO2018197805A1 (fr) 2017-04-26 2018-11-01 bioMérieux Dispositif de culture microbiologique comprenant un feuillet d'hydrogel polysaccharidique deshydrate

Also Published As

Publication number Publication date
FR3094722B1 (fr) 2024-01-19
FR3094722A1 (fr) 2020-10-09

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP3148250B2 (ja) 微生物培養器材および培地
WO2018197805A1 (fr) Dispositif de culture microbiologique comprenant un feuillet d'hydrogel polysaccharidique deshydrate
CN110121551A (zh) 微生物检测装置及其使用方法
EP2875117B1 (fr) Procédé d'isolement de micro-organismes sur un milieu de culture et dispositif associé
CN110168070A (zh) 包含粘合剂掩盖的营养物质的微生物检测装置以及这些装置的使用方法
JP3115002B2 (ja) 微生物培地
EP3097179B1 (fr) Dispositif pour la culture de microorganismes et procede associe
US10144947B2 (en) Method for detecting, identifying and enumerating micro-organisms in a porous support dry-impregnated with a dehydrated reaction medium
WO2020208311A1 (fr) Dispositif de culture microbiologique
EP3717626B1 (fr) Dispositifs medicaux non-implantables integrant un dispositif de detection et/ou d'identification d'infections microbiologiques
EP3717658B1 (fr) Appareils de détection et/ou d'identification des infections microbiologiques pour dispositifs médicaux non implantables et composition de poudres
EP3953040B1 (fr) Dispositif de détermination d'une contamination bactériologique dans un fluide
CN108699584A (zh) 用于检测微生物的具有两个层的培养基
CN109996861A (zh) 微生物的培养设备以及利用所述设备对微生物数量进行计数的方法
FR3094987A1 (fr) Dispositif de détermination d’une contamination bactériologique dans un fluide
US11851643B2 (en) Selective thin-film culture device for enumerating microorganisms
US20210114017A1 (en) Device for enumerating microorganisms
JP2001169772A (ja) シート状培養器及びこれを用いたシート状培地
FR2550546A1 (fr) Application en biologie des pro- et des eucaryotes, en particulier en microbiologie, et en virologie, d'une nouvelle membrane de micro et d'ultrafiltration de type ecran

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 20724181

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1

NENP Non-entry into the national phase

Ref country code: DE

122 Ep: pct application non-entry in european phase

Ref document number: 20724181

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1