EP3519092A1 - Procede microfluidique de manipulation de microgouttes - Google Patents

Procede microfluidique de manipulation de microgouttes

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Publication number
EP3519092A1
EP3519092A1 EP17777052.6A EP17777052A EP3519092A1 EP 3519092 A1 EP3519092 A1 EP 3519092A1 EP 17777052 A EP17777052 A EP 17777052A EP 3519092 A1 EP3519092 A1 EP 3519092A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
trapping
microdrop
area
microdroplets
microdrops
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
EP17777052.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Charles Baroud
Raphaël TOMASI
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Polytechnique
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Ecole Polytechnique
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Ecole Polytechnique filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3519092A1 publication Critical patent/EP3519092A1/fr
Pending legal-status Critical Current

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    • B01L—CHEMICAL OR PHYSICAL LABORATORY APPARATUS FOR GENERAL USE
    • B01L3/00—Containers or dishes for laboratory use, e.g. laboratory glassware; Droppers
    • B01L3/50—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes
    • B01L3/502—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures
    • B01L3/5027—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip
    • B01L3/502761—Containers for the purpose of retaining a material to be analysed, e.g. test tubes with fluid transport, e.g. in multi-compartment structures by integrated microfluidic structures, i.e. dimensions of channels and chambers are such that surface tension forces are important, e.g. lab-on-a-chip specially adapted for handling suspended solids or molecules independently from the bulk fluid flow, e.g. for trapping or sorting beads, for physically stretching molecules
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
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    • B01F33/302—Micromixers the materials to be mixed flowing in the form of droplets
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    • B01F—MIXING, e.g. DISSOLVING, EMULSIFYING OR DISPERSING
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    • B01L2400/06—Valves, specific forms thereof
    • B01L2400/0688—Valves, specific forms thereof surface tension valves, capillary stop, capillary break

Definitions

  • the present invention relates to a microfluidic process for handling several microdroplets in at least one capillary trap of a microfluidic system.
  • the invention also relates to a microfluidic device for implementing such a method.
  • Such traps do not allow precise manipulation and / or control of the trapped microdroplets, in particular to adapt the traps to microdrops of different sizes, nor trapping the microdroplets in a predefined manner spatially.
  • the application WO 2016/059302 describes a method of handling microdroplets in a microfluidic system comprising the step of trapping the microdroplets in a capillary trap and at least partially gel microdrops or their environment.
  • the capillary trap can receive several microdrops in its depth, which is greater than the diameter of the trapped microdroplets.
  • the handling of microdrops, in particular those trapped, in depth is limited.
  • a microfluidic circuit is disclosed therein, which can return microdrops, one by one, into cavities serving as capillary traps.
  • Two microdroplets of different volumes can be brought into contact and received in a cavity in the form of 8.
  • the dimensions of the two trapping zones, each trapping area corresponding to a loop of 8, correspond to the dimensions of the microdrops which must be housed therein. .
  • the application US 2010/0190263 describes a droplet actuator having recessed regions separating two substrates. These substrates include electrodes for transporting the droplets to the recessed regions.
  • the actuator targets the formation and retention of a gas bubble in these recessed regions.
  • the trapping force can result from the shape and size of the trap, the depth of the micro-channel, the size of the microdrops, the physical and physicochemical properties of the fluids present, such as the viscosity, the tension of area, ...
  • the invention proposes, according to a first of its aspects, a method of handling at least a first microdrop and at least a second microdrop in a microfluidic system comprising a capillary trap having a first trapping zone and a second trapping area, the method comprising the steps of:
  • first and second trapping zones being arranged so that the first and the second microdrop are in contact with each other
  • the first and second trapping zones being shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • microfluidic system refers to a system involving the transport of at least one product and which comprises, on at least one of its portions, a section of which at least one dimension measured in a straight line from an edge to an edge opposite is less than one millimeter.
  • microdrop it is understood a drop having a volume less than or equal to 1 ⁇ , better than or equal to 10 ni.
  • the microdrop may be liquid, gaseous or solid.
  • capillary trap is meant a spatial zone of the microfluidic system allowing the temporary or permanent immobilization of one or more microdrops circulating in the microfluidic system.
  • the capillary trap may be formed by one or more reliefs, in particular recessed reliefs, and / or by one or more local modifications of the surface in contact with the microdroplets, in particular one or more local modifications of the affinity of the surface with at least a part of the contents of the microdrop.
  • the trapping force of a trapping area depends in particular on its shape, its surfaces in contact with the microdrop and / or properties, including dimensions, trapping microdroplets.
  • the capillary trap has two zones having different trapping forces brought back to one of the microdroplets makes it possible to have both a selectivity of the trapped microdroplets and a spatial selectivity, in particular to prevent the first microdrop from occupying the second trapping zone thus preventing the second microdrop from getting trapped in this second trapping area. This is particularly interesting when a plurality of first and second microdroplets are introduced into the microfluidic system.
  • first and second microdroplets are in contact allows them to interact or coalesce.
  • the first microdrop is trapped in the first trapping area with a trapping force which is greater than that which the second trapping area would exert on the first microdrop.
  • the first microdrop is preferably trapped by the first trapping area.
  • the second microdrop is trapped in the second trapping area with a trapping force that is smaller than that the first trapping area would exert on the second microdrop.
  • the first and second microdroplets are preferably introduced and trapped in the microfluidic system sequentially.
  • the first microdrop is trapped by the first trapping area in the microfluidic system before the second microdrop is trapped by the second trapping area in the microfluidic system.
  • the second microdrop when introduced, it can not occupy the first trapping area because it is already occupied by the first microdrop.
  • a driving force greater than the trapping force of the second trapping area and less than or equal to the trapping force of the first trapping area trapping can be exerted in step (i) on the first microdrop.
  • the shape of the second trapping area is chosen so that the trapping force of the second area is less than the driving force.
  • the microdrop is subjected to hydrodynamic forces due to its training that oppose its capture by the second trapping zone.
  • the drag force exerted by the fluid that carries the microdroplets may depend on the size and the instantaneous shape of the microdrops, the physical and physicochemical properties of the fluids (viscosity, surface tension, etc.) and the speed of the microdroplets. flow.
  • the first drop is then trapped only in the first trapping areas.
  • the driving force can be exerted at least partially by
  • the microdroplets may be driven in displacement in the microfluidic system by an oriented flow of a fluid, in which the microdrops are preferably immiscible, the fluid flow being such that, especially having a flow rate and a orientation such that the first microdrop is only trapped by the first trapping area.
  • the force that the moving fluid exerts on the first drop prevents it from trapping in the second trapping area;
  • the first microdrop being driven along a slope of the microfluidic system by its own weight.
  • the first microdrop is or is not retained the first trapping area;
  • the microfluidic system may comprise reliefs that cause the first microdrop in displacement, including a groove widening towards the capillary trap.
  • the second microdrop is subjected to a driving force as described in relation to the first microdrop, less than or equal to the trapping force of the second trapping area.
  • the driving force on the second microdrop is exerted by an oriented fluid flow
  • the force exerted by the fluid flow on the first microdrop trapped in the first trapping zone is preferably insufficient to extract the first microdrop from the first trapping area.
  • the latter can be oriented so that the second microdrop can be trapped only in the second trapping zones having a particular orientation relative to the orientation of the flow, in particular disposed upstream of the first trapping area with respect to the direction of the fluid flow.
  • microdroplets being conveyed by a flow of fluid to a plurality of trapping zones, they are preferably brought into these randomly and naturally occupy the most advantageous place, from an energy point of view, the area of trapping. They lodge themselves in the trapping areas. This random placement of the microdroplets makes it possible to have a large number of microgoutts trapped simultaneously, and increases the screening capacity.
  • the method comprises the following steps:
  • the trapping force F1 exerted by the first zone on the first microdrop being greater than the force Ft1 of hydrodynamic drag exerted by the flow (ie the oriented flow) of fluid that carries the microdroplets) on the first microdrop, so that the latter remains trapped in the first zone, the drag force Ft1 being between Fl and F2, F2 denoting the trapping force exerted on the first microdrop by the second trapping area of the capillary trap,
  • the hydrodynamic drag force Ft2 exerted on the second microdrop by the flow during loading of the second microdrop in the second zone being between F2 and F3, with F3 preferably lower than F1, F3 being the trapping force exerted by the second zone of the capillary trap on the second microdrop.
  • the trapping force exerted by the first trapping area on the first microdrop is different from the trapping force it would exert on the second microdrop and the trapping force exerted by the second trapping area on the second microdrop is different from the trapping force it would exert on the first microdrop.
  • the trapping force also depends on the shape of the microdrop trapping in relation to the shape of the trapping area. This facilitates the sequential trapping of the first and second microdrops.
  • the first trapping area exerts on the first microdrop a trapping force greater than that which it would exert on the second microdrop. This prevents the second microdrop does not dislodge and takes the place of the first microdrop.
  • the first and the second microdrop may be different, in particular of different sizes, in particular the first microdrop being larger in size and / or larger in volume than the second microdrop, and / or of different contents. This ensures that the first trapping area exerts on the first microdrop a trapping force greater than that which it would exert on the second microdrop; therefore, there will be only one microdrop in the first trapping area.
  • the first trapping area may trap one or more first microdrops.
  • the second trapping area may trap one or more second microdrops.
  • the first and second microdroplets are different by at least one of their properties, in particular their viscosity and / or their interfacial tension and / or their affinity with a particular coating of at least one of their properties. one of the trap areas.
  • the first trapping area traps only a first microdrop and / or the second trapping area traps only a second microdrop.
  • the first trapping area traps only a first microdrop and / or the second trapping area traps only a second microdrop.
  • the largest dimension of the first microdrop when it is trapped in view from above may be greater than or equal to the largest dimension of the first trapping area in top view, and / or
  • the largest dimension of the second microdrop when it is trapped in view from above may be greater than or equal to the largest dimension of the second trapping area in top view, and / or the first microdrop, when trapped, fills at least 70%, better 80%, even better 90%, of the volume of the first trapping area, and / or
  • the second microdrop when trapped, fills at least 70%, better 80%, still better 90%, of the volume of the second trapping zone, and / or
  • the volume of the first microdrop, when trapped is greater than or equal to that of the first trapping area so that the first microdroplet extends partially outside the first trapping area, and / or
  • the volume of the second microdrop, when trapped, is greater than or equal to that of the second trapping area so that the second microdroplet extends partially outside the second trapping area.
  • One of the first (s) or second (s) microdrops can be a microbubble air.
  • the capillary trap may comprise a plurality of second trapping zones, the step (ii) of trapping a second microdrop by a second trapping zone, the first and the second trapping zones being arranged in such a way that each second microdrop is in position. contact with at least one of the first or second microdroplets.
  • the capillary trap may comprise a plurality of first trapping zones, the step (i) of trapping a first microdrop by a first trapping zone, the first and the second trapping zones being arranged in such a way that each first microdrop or in contact with at least one of the second or second microdrops or first microdrops.
  • each second microdrop is connected to the or each first microdrop.
  • each second microdrop is either directly in contact with said first microdrop, or in contact with another second microdrop or a string of second and / or first microdrops itself in contact with said first microdrop.
  • string of microdrops is meant a plurality of microdroplets forming a straight or curved line in contact with each other.
  • the second microdroplets may all be in contact with at least a first microgout trapped in said capillary trap.
  • At least two second trapping zones may be shaped so that their trapping forces brought to one of said second microdrops are different.
  • the second microdroplets trapped by at least two second trapping zones may be different by at least one of their properties, in particular their larger size.
  • all the second trapping areas of the capillary trap are identical.
  • the microfluidic system may comprise a plurality of capillary traps each comprising a first trapping area and a second trapping area, the step (i) of trapping a first microdrop in the first trapping area of each capillary trap, step (ii) of trapping a second microdrop in the second trapping area of each capillary trap, wherein the first and second trap areas of each capillary trap of the plurality of traps are arranged such that the first and second microgout trapped in said capillary trap are in contact with each other in the latter.
  • Each capillary trap may comprise one or more of the features described above.
  • All traps of the microfluidic system may each have a first trapping area and a second trapping area arranged so that the first and second trapping microdrop trapped in said trapping capillary are in contact with each other therein.
  • only a portion of the capillary traps of the microfluidic system each comprise a first trapping area and a second trapping area arranged so that the first and second microdrop trapped in said capillary trap are in contact with each other. other in the latter.
  • the method may comprise the step of trapping a microbubble of gas, in particular air, in one of the first or second trapping zones. This makes the trapping area in question inactive. Indeed, because of the presence of microbubble gas, the first or second microdrops can not be trapped in the trapping area concerned.
  • Step (ii) may comprise the substeps ( ⁇ ') of trapping, under the effect of a first oriented fluid flow, a second microdrop in one or a part of the second trapping zones and (ii " ) trapping, under the effect of a second oriented fluid flow, a second microdrop in another or another part of the second trapping areas, the first and the second fluid stream being of different orientation.
  • the second microdrops of the steps ( ⁇ ') and (ii ") can be different, in particular by at least one of their properties and / or their content,
  • the second trapping zones of the steps (ii') and (ii") can to be identical.
  • microdrops it is possible, by choosing the orientation of the fluid flow, to trap microdrops selectively in one of the two trapping zones, which allows a predefined spatial positioning of the microdroplets in contact with each other. It is then possible to bring a first microdrop into contact with different second microdrops in a controlled manner, particularly in the context of combinatorial chemistry. It is also possible, in the context of microdrops comprising gels to spatially control the arrangement of microdrops of gels in the capillary trap so as to obtain after melting a microdroplet of controlled shape and composition.
  • the method may comprise step (iii) of fusing with the first microdrop the or each of the second microdrop trapped in the or each of the second trapping zones. Such coalescence makes it possible in particular to mix the contents of the two microdrops.
  • Such a coalescence can be selective, that is to say that one can choose the second or microdroplets in contact with the first microdrop that is to be fused with the latter, in particular by the use of a laser infra-red as described, for example, in E. Fradet, P. Abbyad, MH Vos, and CN Baroud, Parallel measurements of reaction kinetics using ultralow-volumes. "Lab Chip, Vol 13, No. 22, pp. 4326-30, Oct. 2013, whose contents are incorporated by reference, with addressable electrodes disposed at the capillary trap or mechanical waves.
  • the coalescence of the microdroplets is non-selective, ie all of the second microdroplets of the capillary trap merge simultaneously with the first microdrop, in particular by adding a product that promotes this coalescence in the microdrop.
  • capillary trap environment or the application of an external physical stimulus such as mechanical waves, pressure waves, a temperature change or an electric field.
  • step (iii) is to evacuate the at least one second microgout trapped in the second trapping area out of the capillary trap.
  • Step (iii ') may consist in applying an oriented fluid flow, configured to exert on a second or more second microdrops a driving force greater than the trapping force of the second trapping area, the fluid flow being configured to exert on the first microdrop or drops a driving force less than or equal to the trapping force of the first trapping area, so that the first microdrop or drops remain trapped in the first trapping area.
  • one or more of the second microdroplets of the second trapping zones can be evacuated, the capillary trap being configured so that, because of its orientation, the fluid flow exerts different driving forces on the second zones of the trapping zone.
  • the method preferably comprising step (iv) of changing the orientation of the fluid stream so as to evacuate at least one or more of the second microdroplets from at least one other trapping area. This allows a selective release of the second microdrops.
  • a first microdrop and one or more second microdroplets can be brought into contact with each other for a sufficient time sufficient so that, particularly because of the interactions between the first microdrop and the second microdrop or microdroplets, the second or second microdroplets microdrops undergo a change, for example a change of content, and then released for analysis.
  • This can also make it possible to change the second microdroplets by other second microdrops in the case of an error in the protocol before the coalescence of microdrops.
  • the method may comprise, after step (iii) or (iii '), step (v) of trapping a third microdrop in the second trapping zone or zones having no second microdrop, so that the first and third microgoutts are in contact with each other.
  • the third microdrop may be the same or different of the second microdrop.
  • the third microdrop may be fused with the microdrop trapped in the first trapping area or released as previously described for the second microdrop.
  • Step (vi) can be repeated several times. This allows for example:
  • the method may comprise the step (vi) of evacuating all the microdroplets present in the capillary trap from the capillary trap, in particular by means of a fluid flow exerting a driving force greater than the trapping forces. exercising on microdrops. Such a step can make it possible to release the microdrops to analyze them.
  • the method may include the step of taking a measurement of the state of the microfluidic system. This measurement can be performed before and / or after melting and / or releasing the drops.
  • the final microduct (s) obtained may comprise a means for identifying their contents, in particular a marking by the presence of beads or particles in number, by the presence of various colors or shapes and / or by a colorimetric signal. or fluorescence proportional to an initial concentration of a compound included in one of the first and second microdrops.
  • the method may include an additional step
  • the observation or measurement step may make it possible to determine the contents of each microdrop before and / or after melting and for example to determine the changes that have occurred following the melting.
  • the observation step is, for example, particularly useful in the context of the use of a library of different microdrops for mapping the various microdrops before melting.
  • the invention also relates to a micro-fluidic device for trapping microdroplets, in particular for implementing the method according to any one of the preceding claims, comprising a capillary trap having a first trapping area and a second trapping area arranged. so that a first microgout trapped in the first trapping area and a second microgout trapped in the second trapping area are in contact with each other in the capillary trap, the first and the second trapping area being shaped so that the trapping forces brought back to one of said microdroplets are different.
  • the capillary trap has two zones having different trapping forces brought back to one of the microdroplets makes it possible to have both a selectivity of the trapped microdroplets and a trapping of the microdroplets in a spatially predefined manner, in particular to avoid that the first micro-droplet occupies the second trapping zone thus preventing the second microdrop from getting trapped in the latter.
  • first and second microdroplets are in contact makes it possible for them to interact, or to be able to easily merge them. Trapping areas
  • the first and second trapping areas are preferably cavities.
  • the use of trapping zones in the form of a cavity facilitates the handling of the microdrops and in particular their entrapment and / or their release.
  • the first and second trapping areas may be disjoint.
  • first and second trapping areas are joined.
  • the capillary trap is devoid of symmetry of revolution, seen from above. This anisotropy makes it possible to trap the microdrops in a spatially predefined manner.
  • the first trapping area and the second trapping area are arranged next to one another, in view from above.
  • the first and second trapping areas are preferably different by at least one of their dimensions.
  • the first and second trapping areas are of different heights, the first trapping area being in particular higher than the second trapping area or the first and second trapping areas are of different shapes, seen from above, the first trapping area having in particular a larger section than the second trapping area.
  • the difference in entrapment force is then at least partially related to the size, in particular the height or the section in view from above, of the trapping zones.
  • height of the trapping area is understood, in cross-section, the average height of the trapping area of the microfluidic system.
  • the second trapping area may expand in at least one direction towards the first trapping area. This guides the second microdrop in the direction of the first microdrop to keep in contact with the latter. Indeed, in order to minimize its surface energy, the second microdrop tends to move along the second trapping area to the larger area.
  • the second trapping area may widen towards the first trapping area, seen from above.
  • the angle of divergence a is such that the second microdrop is always in contact with the two opposite walls defining it.
  • the second trapping zone may widen with an angle of divergence a non-zero, in particular between 10 ° and 120 °.
  • the second trapping area may have a substantially triangular or truncated triangular shape.
  • the second trapping area may have increasing height towards the first trapping area.
  • the height of the second trapping area is less than or equal to the largest dimension of the first trapping area, more preferably at half the largest dimension of the first trapping area.
  • the fact that the height of the second trapping area is limited makes it possible to prevent the fluid flow lines from being disturbed by the second trapping area to the point of preventing the second microdrop from being trapped.
  • the height of the first trapping zone may be such that the volume of the latter is greater than or equal to the volume of the first microdrop. This makes it possible to have a first trapping zone having a high trapping force, in which the first microdrop is slightly deformed, in particular having a concave lower interface, which can facilitate, after sedimentation, the contacting of encapsulated elements. to form a cluster, for example cells to form a spheroid.
  • the capillary trap may comprise a plurality of second trapping zones arranged such that each trapped second microgout is in contact with at least one of the first or second microdrops trapped in the capillary trap.
  • the capillary trap may comprise a plurality of first trapping zones arranged such that each first trapped microgout is in contact with at least one of the second or second microdroplets or first microdroplets trapped in the capillary trap.
  • the first (s) and second (s) trap areas are arranged so that each second microdrop is connected to the or each first microdrop.
  • the first and second trapping zones may be arranged such that the second microdroplets are all in contact with at least a first microdrop trapped in said capillary trap.
  • At least two second or first trapping zones may be shaped so that their trapping forces brought to one of said second microdrops are different.
  • the second microgout trapped by at least two second trapping areas may be different by at least one of their properties, including their largest dimension.
  • all the second trapping areas of the capillary trap are identical.
  • the device comprises a plurality of capillary traps each comprising a first trapping area and a second trapping area, preferably arranged so that the second microdrop trapped in the second trapping area of the capillary trap is in contact with the trapping zone. first microgout trapped in the first trapping area of said capillary trap.
  • Each capillary trap may comprise one or more of the features described above.
  • All capillary traps of the device may each comprise at least a first trapping area and at least a second trapping area.
  • a portion of the capillary traps each comprise at least one first trapping zone and at least one second trapping zone and part of the traps having only one trapping zone that can trap only a single first microdrop .
  • Such capillary traps with a single trapping area can serve as a control during an experiment.
  • the device may comprise at least 10 capillary traps per square centimeter, more preferably at least 100 capillary traps per square centimeter.
  • a large number of capillary traps makes it possible in particular to make combinatorial chemistry, to carry out a drug screening, to study the crystallization of proteins, to carry out a titration of a chemical species, or to customize a treatment, particularly in the case of cancer treatment.
  • At least two capillary traps can be different.
  • the device comprises a first capillary trap having n second trapping zones and a second capillary trap having p second trapping zones, n being different from p.
  • Such capillary traps make it possible to have after coalescence of the second microdroplets with the first microdroplets microdroplets trapped in the first trapping areas having different concentrations and / or drop sizes.
  • the microfluidic system may have more than two capillary traps having different amounts of second trapping zones in order to achieve several concentration and / or size of microdroplets, in particular a concentration gradient. and / or microdrop sizes.
  • microdroplets obtained can form a panel of microdroplets useful in the field of combinatorial chemistry, to study the crystallization of proteins, to perform a titration of a chemical species or to customize a treatment, particularly in the case of cancer.
  • the capillary traps are all identical.
  • the device may comprise a channel having a trapping chamber, the cap or traps being in the trapping chamber.
  • the invention also provides, in a second aspect, a method of handling a plurality of first microdroplets and a plurality of second microdrops in a microfluidic system having a channel having a trapping chamber having a plurality of capillary traps. distributed in at least two different directions, each capillary trap having a first trapping area and a second trapping area, the method comprising the steps of:
  • the first and second trapping areas of the same capillary trap being arranged so that the first and the second microdrop are in contact with each other in the capillary trap, the capillary traps each having an anisotropic shape.
  • capillary traps are anisotropic makes it possible to have a predefined spatial positioning of the microdroplets once they are trapped by the trapping zones.
  • the first and the second trapping area of each capillary trap are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • One or more of the features described above in connection with the method or device according to the preceding aspects of the invention can be applied to the method according to this aspect of the invention.
  • the method can be implemented using a microfluidic microdrop trapping system comprising a channel having a trapping chamber comprising a plurality of capillary traps distributed in at least two different directions, each capillary trap having a first zone of trapping and a second trapping area arranged so that a first microgout trapped in the first trapping area and a second trapping microgout trapped in the second trapping area of the same trapping trap are in contact with each other, capillary traps each having an anisotropic form.
  • the first and the second trapping area of each capillary trap are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • the invention further provides, according to a third aspect, a method of handling at least a first microdrop and at least a second microdrop in a microfluidic system comprising a capillary trap having a first trapping area and a second area trapping zone, the second trapping area widening in at least one dimension towards the first trapping area, the method comprising the steps of:
  • the second trapping area widens in at least one dimension towards the first trapping area makes it possible to guide the second microdrop to the first microdrop during its trapping and to keep it in contact with the first microdrop. Indeed, in order to minimize his Surface energy, the second microdrop tends to move along the second trapping area to the larger area.
  • the second trapping zone widens, preferably, in plan view towards the first trapping area.
  • the second trapping area may widen with a divergence angle ⁇ between 10 ° and 120 °.
  • the second trapping area may have increasing height towards the first trapping area.
  • the first and second trapping zones are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • the method can be implemented using a microfluidic microdrop trapping system having a capillary trap having a first trapping area and a second trapping area arranged so that a first microdrop trapped in the first trapping area. trapping and a second microgout trapped in the second trapping area of the same capillary trap are in contact with each other, the second trapping area widening in at least one dimension towards the first trapping area .
  • the first and second trapping zones are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • the invention further provides, according to a fourth aspect, a method of cell assembly of at least a first microdrop containing first cells and at least a second microdrop containing second cells, in a microfluidic system comprising a trap capillary having a first trapping area and a second trapping area, said method comprising the steps of:
  • Such a method can make it possible to create in vitro microtissues with a controlled architecture to mimic very faithfully the conditions encountered in vivo.
  • the different cell types are often arranged in tissue according to a specific architecture that is important to reproduce at best to recreate a function at an organ.
  • This three-dimensional architecture with controlled architecture can be used for transplantation on a patient. For example, it is possible to culture insulin-producing alpha cells, glucagon producers, and beta cells to create Langerhans islands that can be transplanted into a patient's pancreas to heal. his diabetes. Similarly, hepatocytes and stellate cells may be associated in liver transplantation.
  • Step (ii) can be performed after aggregation of the first cells, in particular after formation of a first spheroid formed by adhesion of the first cells together. If the first microdrop containing the first spheroid is liquid, the second cells will, after fusion of the two microdrops, mix with the contents of the first microdrop and then sediment to reach directly the first spheroid. If step (iii) takes place before the second cells have had time to form a second spheroid, they will be deposited after sedimentation on the surface of the first spheroid initially in the first microdrop.
  • Step (iii) can be performed after aggregation of the second cells, in particular after formation of a second spheroid formed by adhesion of the second cells to each other.
  • the first and second spheroids can be fused together.
  • the architecture of the microtissues obtained therefore depends on the experimental conditions.
  • the process may comprise an additional step of gelation of the first microdrops, such a step taking place before step (iii) and preferably before step (ii).
  • This makes it possible to compartmentalize the cells. Indeed, if the first microdrops, which contain the spheroids are gelled before the arrival of the second microdrops, the second contained cells can no longer, after coalescence, come into direct contact with the first spheroid, for example mammalian cells can not pass through an agarose matrix at 0.9% by weight. The first and second cells can then communicate together only paracrine.
  • the first and second cells may be of different cell types.
  • the first and second trapping zones are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • the method can be implemented using one of the microfluidic systems according to the preceding aspects.
  • the subject of the invention is also a method of cell culture in a microfluidic system of at least a first microdrop containing a cell culture and at least a second microdrop containing a culture medium, the microfluidic system. having a capillary trap having a first trapping area and a second trapping area, the culture method comprising the steps of:
  • (iii) fusing the first microdrop with the second microdrop to renew the culture medium of the cell culture operated in the first microdrop.
  • the sequential injection of the culture medium can be used to renew the latter several times, for example to allow the culture of the cell or cells in the first microdrop.
  • the second microdrop may include an active test to model the intermittent nature of taking a drug.
  • an active test to model the intermittent nature of taking a drug.
  • a drop containing a spheroid of mammalian cells can be fused every 6 hours with a microdrop containing an active agent to be tested, in particular a drug.
  • the method may comprise, after step (iii), step (iv) of repeating steps (ii) and (iii) to further renew the culture medium of the cell culture operated in the first microdrop.
  • the first and second trapping zones are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • the method can be implemented using one of the microfluidic systems according to the preceding aspects.
  • Another object of the invention is, according to a sixth aspect, a method of forming multilayer gelled microdroplets of at least a first microdrop of a first gellable medium and at least one second microdrop of a second gellable medium in liquid form in a microfluidic system comprising a capillary trap having a first trapping area and a second trapping area, said method comprising the steps of:
  • the method may comprise a step (v) occurring before or after step (iv) and comprising gelation of the second gellable medium.
  • step (v) takes place after step (iv)
  • the gelation makes it possible to form an outer layer of the second gel on the first microdrop.
  • This makes it possible to form complex gel microdrops having radially variable mechanical and / or chemical properties.
  • Such gel microdrops could be used with stem cells whose differentiation is, in particular, controlled by the rigidity of the gel.
  • Microdroplets of gels with different hydrogel layers containing different cell types can also make it possible to model the different layers of the skin in the context of cosmetic tests.
  • a microdroplet having a collagen core and an outer layer of agarose with sufficiently small pores can be used to create a spheroid of neurons from which only the axonal projections can be extracted through the pores of the outer layer.
  • step (v) takes place before step (iv)
  • the second gellable medium is gelled in the second trapping zone.
  • the microdrops formed then retain the shape and arrangement of the first and second microdrops before melting.
  • the arrangement, the shape and the number of the different trapping zones thus make it possible to directly control the shape of the final microdrop.
  • Such microdrops can be used to model complex shapes.
  • the controlled forms of the microdrops can also serve as an identifier of the latter.
  • Step (v) can take place before or after step (iii) of trapping in the second trapping area.
  • Step (ii) may take place before or after step (i) of trapping in the first trapping area.
  • the method preferably comprises a step (vi) of repeating steps (iii) to (v).
  • the first and second gellable media may be different.
  • the first and second trapping zones are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • One or more of the features described above in connection with the methods or devices according to the foregoing aspects of the invention can be applied to the method according to this aspect of the invention.
  • the method can be implemented using one of the microfluidic systems according to the preceding aspects.
  • the invention further relates, in a seventh aspect, to a method for encapsulating at least a first microdrop and at least a second microdrop in a microfluidic system comprising a capillary trap having a first trapping area and a second trapping area, one of the first microdrop and the second microdrop comprising a gelling medium and the other comprising a plurality of cells, said method comprising the steps of:
  • This method makes it possible in particular to obtain spheroids encapsulated in biological hydrogels. Indeed, to be able to form spheroids in microdrops in a controlled manner, it must be possible to keep the contents of the liquid drop during the time of formation of the spheroid.
  • Agarose lends itself very well to this protocol because it is a thermosensitive hydrogel. It remains liquid at 37 ° C and then solidifies after 30 min at 4 ° C and remains solidified after returning to 37 ° C. Only mammalian cells can not adhere to agarose and they can not digest it either. This matrix is therefore very different from the extracellular matrix found in the body.
  • hydrogels such as, for example, type I collagen, fibronectin, Matrigel® or gelatin may be preferable to better mimic natural conditions. Only the control of their gelation is more difficult. For example, one can not keep liquid type I collagen for a long time with favorable conditions for culturing cells (low temperature or acidic pH). If one encapsulates cells in a drop of collagen that is made to gel quickly after trapping the cells, rather than adhere to each other and form a spheroid, cells will adhere to collagen and migrate individually along its fibers.
  • This problem can be solved by the method above. Indeed, one can encapsulate cells in the first liquid microdrops within the first trapping area so as to form a spheroid. We can then bring second microdrops that will lodge in the second trapping area and contain one of the biological hydrogels mentioned above, especially in high concentration. Once these trapped second microdroplets are immediately fused first and second microdroplets in contact and the biological hydrogel, still liquid, will mix with the first microdrop that contains the spheroid. The gelation can then take place and will therefore encapsulate the spheroid in an extracellular matrix representative of the biological conditions encountered in vivo.
  • Step (ii) can be carried out after aggregation of the first cells, in particular after formation of a spheroid formed by adhesion of the first cells to one another.
  • the first and second trapping zones are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • the method can be implemented using one of the microfluidic systems according to the preceding aspects.
  • the subject of the invention is also a method of diluting a compound of interest in a microfluidic system comprising a first capillary trap comprising a first trapping zone and n second trapping zones and a second capillary trap. having a first trapping area and p trapping second areas, n being different from p, said method comprising the steps of:
  • a spatial concentration gradient can be obtained after coalescence with the second microdroplets which may for example contain a diluent.
  • Such a method can make it possible to obtain a panel of microdrops with different controlled concentrations, from microdrops of the same concentration. This may be of interest, for example, in forming a panel of microdrops of different concentrations for use in combinatorial chemistry, in the study of protein crystallization, in a subsequent method of titrating a chemical species, or in the personalization of treatment, especially in the case of cancer.
  • the first and the second trapping area of each capillary trap are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • the method can be implemented by the microfluidic microdrop dilution system comprising a first capillary trap having a first trapping area and n second trapping areas and a second capillary trap having a first trapping area and p trapping second areas, n being different from p, the first and second capillary traps being configured so that the second microdrop trapped in each of the second trapping zones are in contact with the first microdrop trapped in the corresponding first trapping area in the first and second capillary traps.
  • the first and the second trapping area of each capillary trap are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • the invention further provides, according to a ninth aspect, a method of screening a plurality of first microdroplets with a plurality of second microdroplets in a microfluidic system having a plurality of capillary traps, each capillary trap having a first trapping and a second trapping zone, the first microdroplets forming a first panel of identical or at least different microdroplets and the second microdroplets forming a second panel of microdroplets at least z are different, the method comprising the steps of:
  • each capillary trap being arranged so that the first and second microgout trapped in said capillary trap are in contact with each other in the latter
  • the fact that the microdroplets are static during the reaction facilitates the obtaining of kinetic data.
  • the first panel of microdrops may include microdrops at least in different content, including their concentration in a first compound of interest.
  • the second panel of microdrops may include microdrops at least different in content, including their concentration in a second compound of interest.
  • the first or second microdrops can be obtained by the method according to the ninth aspect of the invention.
  • the first and second compounds may be compounds that react together and whose initial concentrations are to be optimized. Thus we will be able to perform several reactions in parallel on a small volume to determine the initial compound concentrations giving the best results.
  • the method comprises an additional step (iv) of observation or measurement, in particular by taking an image, by a colorimetric measurement, fluorescence, spectroscopic (UV, Raman) or temperature, before the step (iii).
  • a step of observation or measurement in particular by taking an image, by a colorimetric measurement, fluorescence, spectroscopic (UV, Raman) or temperature, before the step (iii).
  • a colorimetric measurement, fluorescence, spectroscopic (UV, Raman) or temperature before the step (iii).
  • the method comprises an additional step (v) of observation or measurement, in particular by taking an image, by a colorimetric measurement, fluorescence, spectroscopic (UV, Raman) or temperature, after the step (iii).
  • step (v) of observation or measurement in particular by taking an image, by a colorimetric measurement, fluorescence, spectroscopic (UV, Raman) or temperature, after the step (iii).
  • the first panel of microdroplets comprises proteins, the first microdroplets being identical, and the second panel of microdroplets comprises at different concentrations a solution for the crystallization of proteins, including a saline solution.
  • the process can then be used to study the crystallization of proteins as a function of the concentration of crystallization solution. Indeed, the optimal crystallization conditions vary from one protein to another.
  • the first panel of microdroplets comprises a compound, the first microdroplets being identical and the second panel of microdroplets comprises at different concentrations a titrant species.
  • This application can be particularly interesting in the case of the assay of expensive reagents or available in small quantities.
  • the first panel of microdroplets comprises one or more cells and the second microdrops each comprise a drug to be screened at a determined concentration.
  • the liver cells are cultured in the form of spheroids in the first microdrops and the supply in each of the second trapping zones of a second microdrop containing a drug with different concentrations, the aim of which is to evaluate the toxicity.
  • the concentration that kills half of the cell population can be determined.
  • This method can also make it possible to evaluate the interactions between different antibiotics. It is possible to create microdroplets forming a panel of microdrops having different antibiotic A and B concentrations and to fuse them with microdrops containing bacteria. The microdrops containing the bacteria can form a panel of microdrops of concentrations of different bacteria. This makes it possible to vary three different parameters in a single trapping chamber, namely the concentration of antibiotic A, the concentration of antibiotic B and the initial concentration of bacteria.
  • microfluidics also allows the use of very small volumes, which can be very advantageous in the context of rare samples such as cells from a biopsy.
  • the system can for example be used in the context of personalized medicine and cancer treatment. With this system it is possible to culture, for example in the form of spheroids in the first microdrops, tumor cells of a patient who has undergone a biopsy and to subject them to different active agents at multiple concentrations via the addition of the second microdrops. . After fusion of the cell-active microdrop couples, it is possible to determine which active will be the most effective, and in what concentration, for a particular patient, using only one chip and a minimal number of cells from the biopsy.
  • the first and second trapping areas of the same capillary trap are shaped so that the trapping forces brought to one of said microdroplets are different.
  • FIG. 1A illustrates in cross-section a capillary trap according to the invention
  • FIG. 1B is a top view along I of the capillary trap of FIG.
  • FIG. 2 diagrammatically shows a top view of the capillary trap of FIG. 1 after trapping two microdots
  • FIGS. 3 and 4 are, in view from above, variations of capillary trap with microdroplets
  • FIG. 5A represents in cross section a variant of a capillary trap
  • FIG. 5B is a top view along V of the capillary trap of FIG.
  • FIGS. 6 to 44 are variants, seen from above, of capillary traps with microdroplets
  • FIG. 48 represents, in cross-section, a variant of a capillary trap
  • FIG. 49 schematically shows, in plan view, a trapping chamber
  • FIG. 50 is a diagrammatic representation, seen from above, of a trapping chamber
  • FIG. 51 is a cross-sectional view of a capillary trap
  • FIG. 52 is a schematic representation of a method according to the invention.
  • FIG. 53 illustrates an alternative method for handling microdroplets in a capillary trap according to the invention
  • FIGS. 54 to 59 illustrate variants of methods of handling microdroplets in a capillary trap according to the invention
  • FIGS. 60 to 62 illustrate examples of implementation of the invention
  • FIGS. 63 to 65 illustrate, in view from above, variants of capillary traps
  • FIG. 66 illustrates the capture of microdroplets by an example of a capillary trap comprising two zones exerting different trapping forces on first and second microdroplets.
  • the invention relates to a method of handling at least a first and a second microdrop in a microfluidic system.
  • the microfiuidic system 5 comprises an upper wall 7 and a lower wall 8 forming between them a channel 9 for circulating the microdroplets and at least one capillary trap 12.
  • the capillary trap 12 forms, in cross section of the microfiuidic system, a cavity in the lower wall 8 of constant height in which microdrops can be housed. It has, in view from above, a first trapping area 15 of circular shape on which is leaned a second trapping area 18 of triangular shape.
  • the first and second trapping zones 15 and 18 exert different trapping forces on a given microdroplet, in particular because of their difference in shape.
  • the first trapping area 15 exerts a trapping force larger than the second trapping area 18.
  • first microdrop 20 When introducing a first microdrop 20 into the microfluidic system, the latter is trapped in the trapping zone having, for this microdrop, the greatest trapping force, here the first trapping area 15.
  • the second microdrop 25 During the introduction of the second microdrop 25, the latter is trapped in the free trapping zone, here the second trapping zone 18, as illustrated in FIG.
  • first microdrops 20 are shown in black and the second microdrops 25 are shown transparent without this representing a difference in particular content between the two microdrops.
  • the first trapping area 15 has a diameter a substantially equal to the apparent diameter Di, seen from above, the first microdrop 20, once trapped in the first trapping area.
  • the two trapped microgoutlets 20 and 25 are in contact with each other, in particular because of the small distance between the two trapping zones 15 and 18 relative to the diameters of the two microdroplets 20 and 25.
  • the two microdroplets 20 and 25 are kept in contact because of the triangular shape of the second trapping area 18.
  • the second microdrop 25, in contact with two opposite walls 27 and 28 of the second trapping area 18 moving away from each other. from one another towards the first trapping zone 15, is driven, by its natural tendency to always minimize its surface energy, to move in translation between the two opposite walls 27 and 28 towards the widening walls 27 and 28, ie towards the first trapping area 15 and therefore the first microdrop 20.
  • the two walls 27 and 28 form between them an angle of divergence a substantially equal to 45 °.
  • the first microdrop 20 has a diameter Di greater than that D 2 of the second microdrop 25.
  • the second trapping zone 18 exerts on the second microdrop 25 a greater trapping force than it would exert on the first microdrop 20.
  • the diameter of the second microdrop 25 better suits the shape and size of the second trapping zone 18 than that of the first microdrop 20. But it may be otherwise and the second microdrop 25 may be of the same diameter as the first microdrop 20.
  • first and second microdrops 20 and 25 are different from each other by another of their properties, including their surface condition, viscosity or weight.
  • the capillary trap 10 comprises two juxtaposed disjoint cavities respectively forming the first trapping area 15 of circular shape and the second trapping area 18 of triangular shape.
  • the two trapping zones 15 and 18 of the capillary trap are sufficiently close so that the two microdroplets 20 and 25 trapped are in contact with each other.
  • the distance e between the centers of gravity of the trapping areas 15 and 18 is smaller, as illustrated in FIG. 4, or equal, as illustrated in FIG. 3, to the sum SR of the radii of the two microdroplets.
  • the first trapping area may be hexagonal in shape and the first trapping area 15 may have a height hi different from that h 2 of the second trapping zone 18, in particular hi is greater than h 2 .
  • the first trapping area 15 then exerts a trapping force greater than the second trapping area 18.
  • the second trapping area 18 is in the form of a long triangle having a low angle of divergence, here substantially equal to 10 °, making it possible to trap a string of second microdrops 25, here two seconds microdroplets 25a and 25b, in contact with each other. It can then be considered that the second trapping area 18 is in fact composed of two second trapping areas 18a and 18b each for trapping a second microdrop 25a and 25b.
  • the second microdrop 25a is here connected to the first drop 20 via the second microdrop 25b.
  • the trapping forces exerted by the second trapping areas 18a and 18b on the second microdrops 25a and 25b may be different depending on their positions.
  • the second trapping area 18b exerts a stronger trapping force on the second microdrop 25b closest to the first trapping area 15. But it could be otherwise depending on the shape of the second trapping area 18.
  • the two second trapping zones 18a and 18b can exert identical forces on the second trapped microdrops 25a and 25b.
  • the capillary trap may have more than two second trapping zones configured to form a string of second trapped microdrops itself in contact with at least one of the second microdroplets forming it, with the first microdrop trapped in the first trapping area.
  • capillary traps comprising a plurality of entrapment zones configured so that the trapped microdroplets are all interconnected directly or via the other microdroplets.
  • the capillary trap 12 has a plurality of identical second trapping zones 18 distributed around the first trapping area 15 so that each second microdrop trapped by one of the second trapping zones 18 is in contact with the first microdrop 20.
  • the second trapping areas 18 may be evenly distributed around the first trapping area 15 as illustrated. But it can be otherwise.
  • the capillary trap 12 has a plurality of first trapping zones 15 arranged so that the first Microgoutts trapped by the latter are each in contact with at least one other first microdrop and a plurality of second trapping zone 18.
  • the capillary trap 12 has two first contiguous trapping zones 15 and two second trapping zones, one contiguous to each first trapping area.
  • the capillary trap 12 may have a plurality of second trapping areas 18a and 18b of different shapes.
  • the second trapping zones may be intended to receive second microdrops 25a and 25b different.
  • the capillary trap has a second trapping area 18a forming a single cavity with the first trapping area 15 and a second trapping area 18b disjoint from the first trapping area 15.
  • the second trapping areas 18a and 18b exert different trapping forces on the same microdrop.
  • the second trapping area 18a is intended to trap a second microdrop 25a of greater diameter than that of the second microdrop 25b trapped by the second trapping area 18b.
  • the invention is not limited to the shape examples of the capillary trap 12 described above.
  • the capillary trap 12 can take different forms, in particular depending on the desired application. Figures 12 to 45 illustrate possible forms.
  • the first trapping area 15 may be polygonal in shape, including square, and the second trapping area 18 of triangular shape and contiguous to one side of the square.
  • the second trapping area 18 is contiguous at an angle of the square forming the first trapping area 15.
  • the second trapping zone 18 is of rectangular shape, in particular square.
  • the second trapping area 18 can widen towards the first trapping area 15 and have opposite walls 27 and 28 presenting a curved profile in a plan view, the second trapping area 18 being tilting towards its end.
  • the capillary trap 12 may have a heart shape, the lobes of the heart forming two first trapping zones 15 and the tip of the heart forming the second trapping zone 18.
  • the first trapping area 15 may be pentagonal in shape with the second trapping area 18 extending from a corner of the pentagon.
  • the capillary trap 12 may be hexagonal shaped, with the second trapping area 18 extending from one side of the hexagon.
  • the first trapping area 15 may be square in shape, as shown in Fig. 19, or circular in shape, as shown in Fig. 20, and the second trapping area 18 may be circular in shape.
  • the second trapping area 18 is triangular in shape but connected to the trapping first 15 by one of its corners, as shown in Figure 21.
  • the second trapping area 18 thus widens outwardly.
  • the second trapping area 18 is of polygonal shape, in particular hexagonal, as illustrated in FIG. 22.
  • the capillary trap 12 may comprise two second trapping zones 18 contiguous to the first trapping area 15 at opposite angles thereof, as illustrated in FIG. 33.
  • the capillary trap 12 may have a first oval-shaped trapping zone 15 and two second triangular trapping zones 18 contiguous to the first trapping zone and extending facing one of the trapping zones. other side of the latter from the long sides of the oval.
  • the second trapping zones 18 are of the same shape as that of FIG. 34.
  • the capillary trap 12 may have two second trapping zones 18 that are not equidistributed around the first trapping area 15 but forming between them a separation angle ⁇ .
  • the first trapping area 15 may be of rectangular shape and the second square trapping area 18 contiguous to the first trapping area 15 by a small side of the rectangle. Depending on the size of the first microdroplets 20, the first trapping area 15 may then trap a single first microdrop 20, as shown in FIG. 25, or a plurality of first microdrops 20, as shown in FIG.
  • the second trapping area 18 may be contiguous to the first trapping area 15 by one of the long sides of the rectangle.
  • the first trapping area 15 may be oval shaped and the second trapping area 18 attached thereto from its long side as shown in Fig. 28 or its short side as shown in Fig. 29.
  • the capillary trap may comprise a plurality of second trapping zones 18, at least two of which are different, in particular by their sizes, as illustrated in FIG.
  • the capillary trap 12 has a form of gourd squash whose base forms the first trapping zone 15 and the head forms the second trapping zone 18.
  • the capillary trap 12 is of triangular shape, the part near the wider base forming the first trapping zone 15 and the tip forming the second trapping zone 18.
  • the first trapping zone 15 is square in shape and the capillary trap 12 has two second trapping zones 18 of the same square shape each contiguous with one of their corner at one corner of the first zone. trapping 15.
  • the capillary trap 12 has three second trapping zones 18, the first and the second trapping zones 15 and 18 possibly having all the forms described above.
  • the capillary trap 12 has a plurality of second trapping zones that differ in their shapes.
  • one of the second trapping areas 18a is of triangular shape and the other of the second trapping areas 18b is of rectangular shape, the rectangle being long enough to form a plurality of second trapping areas and trapping a second microdrop chain 25, as shown in FIG. 42, where the second trapping zones may have the shapes described above.
  • first trapping area 15 and the second trapping area 18 may be of constant height throughout their width.
  • the first trapping zone 15 has, in cross-section, an edge inclined toward the bottom of the cavity.
  • the second trapping zone 18 has a wall inclined towards the first trapping area. This makes it possible in particular to keep the second microdrop 25 in contact with the first microdrop 20.
  • the first and second trapping zones have at least one inclined wall.
  • the capillary trap 12 is formed at least partially by a cavity of the upper wall 7 of the microfluidic system.
  • the capillary trap 12 is formed at least partially by a cavity of one of the side walls of the microfluidic system.
  • the capillary trap is formed both by a cavity of the lower wall 8 and of the upper wall 7.
  • the capillary trap is anisotropic and comprises a plurality of trapping zones having the same trapping force, so that the capillary trap traps a plurality of identical microdrops in its different zones.
  • the capillary trap 12 may be of substantially triangular shape and trap, depending on the size of the microdroplets, 3 or 4 identical microdrops.
  • the capillary trap 12 has a star shape with five branches and can trap 5 or 6 identical microdrops.
  • the channel 9 for circulating the microdroplets may comprise a plurality of capillary traps 12.
  • the channel 9 may comprise a two-dimensional trapping chamber 30 in which the capillary traps 12 are distributed spatially in two table or matrix spatial directions, as illustrated in FIG. 49.
  • the capillary traps 12 are arranged at equal distances from each other in the form of a plurality of rows, but it may be otherwise. They can be arranged according to any scheme, periodic or not.
  • the number of capillary traps 12 in the trapping chamber 30 can range from one per chamber to several thousand per cm 2 .
  • the distance p defined between the centers of gravity of the capillary traps 12 is preferably greater than or equal to the size of the larger microdroplets intended to be trapped, in particular greater than or equal to the apparent diameter, seen from above, of a first drop. confined in the channel between the walls 7 and 8 outside the capillary traps, for example between 20 ⁇ and 1 cm.
  • the number of capillary traps may be greater than or equal to 200 capillary traps per cm 2 , more preferably 2000 capillary traps per cm 2 . So we can realize the controlled combination of microdroplets in hundreds or even tens of thousands of traps in parallel in the same trapping chamber 30.
  • Capillary traps 12 may be as previously described.
  • the capillary traps 12 can all be identical.
  • At least two capillary traps 12 may be different, in particular by their shapes, sizes, heights or orientations, or by the number, shape, height or orientation of the first (s) and second (s) zones of entrapment 15 and 18. This makes it possible to have different conditions depending on the capillary trap 12.
  • the channel 9 can be one-dimensional and comprise a row of capillary traps 12 distributed along its length.
  • the invention is not limited to the microfluidic system forms described above.
  • the microfluidic system can take different forms, in particular depending on the desired application.
  • the channel 9 is filled with a fluid in which the microdroplets are immiscible.
  • This fluid can be stationary or in motion. When the latter is in motion, the fluid flow is preferably oriented along fluid circulation lines (not shown) and flows from a fluid inlet 31 to a fluid outlet 32.
  • Microdroplets are, for example, aqueous microdroplets in an oily liquid or microdroplets of oil in an aqueous liquid.
  • the first and second microdrops 20 and 25 have diameters Di and Z1 ⁇ 2 of the order of a micrometer, especially between 20 and 5000 ⁇ .
  • the first microdrops 20 are preferably different from the second microdrops 25, in particular by their sizes and / or their compositions.
  • the first microdrops 20, respectively the second microdrops 25, can form a panel of microdrops of which at least a certain number are different.
  • the first and / or second microdrops 20 and 25 may comprise an identification compound allowing their identification before, during and / or after the coalescence of the first (s) and second (s) microdroplets 20 and 25 in contact.
  • This or these identification compounds may be for example beads or particles in a number, compounds of various colors or shapes or compounds emitting a colorimetric or fluorescence signal proportional to their concentration in the microdrop.
  • a panel of first microdrops and / or a panel of second microdrops comprising a compound of interest in different concentrations and / or different compounds of interest, it is thus possible to associate the position of a first and / or second microdrop in the trapping chamber with its composition in order to establish a map of the microdrop trapped in the trapping chamber.
  • the identification compound (s) of the first microdroplets interact with one or more identification compounds of the second microdroplets so as to allow identification of the microdrop obtained after melting.
  • melting microdrops can result in a chemical reaction of which at least one of the products can be identified.
  • the channel 9 is filled with a fluid containing a surfactant.
  • a surfactant allows the stabilization of microdrops and the reproducibility of their formation.
  • the surfactants also make it possible to prevent spontaneous coalescence of the microdroplets in case of contact during their transport from the production device to the capillary traps or in the capillary traps.
  • the surfactant is, for example, aqueous microdroplets one compound selected from the PEG-di-Krytox in a fluorinated oil or SPAN ® 80 in mineral oil.
  • the surfactant is, for example, for microdroplets of sodium dodecyl sulfate oil.
  • the microdroplets are stabilized by other means, in particular the microdrops can be gelled, or stabilized by adsorption of amphiphilic nanoparticles as described in the article by Pan, M., Rosenfeld, L., Kim, M., Xu, M., Lin, E., Derda, R., & Tang, SKY (2014). Fluorinated Pickering Emulsions Impede Interfacial Transport and Rigid Interface for the Growth of Anchorage-Dependent Cells. Applied Materials & Interfaces, 6, 21446-21453, incorporated herein by reference.
  • FIG. 1 An example of a method of handling the first and second microdroplets is illustrated in FIG.
  • step 40 the first microdrops 20 are produced.
  • Numerous methods have already been proposed for forming such first microdrops in a mobile phase. Examples of the process can be cited: a) process known as "flow-focusing” described for example in SX. Anna, N. Bontoux and HA Stone, "Training of dispersions using 'Flow-Focusing' in microchannels," Appl. Phys. Lett. 82, 364 (2003), the content of which is incorporated herein by reference,
  • step emulsification process described for example by R.
  • microdroplets of substantially equal size.
  • the dimensions of the microdroplets obtained can be controlled by modifying the formation parameters of the microdroplets, in particular the speed of circulation of the fluids in the device and / or the shape of the device.
  • the production of the first microdrops can be made on the same microfluidic system as the process or on a different device.
  • the first microdrops 20 can be stored in one or more external containers before being injected into the microfluidic system.
  • These first microdrops 20 may all be identical or some of them may be of different compositions, concentrations and / or sizes.
  • the latter can be conveyed to the capillary trap 12 by entrainment by a flow of a fluid and / or by slopes or reliefs in the form of rails of the channel 9.
  • the addition of rails can make it possible to optimize the filling of the capillary traps 12, selectively, for example in combination with the use of an infra-red laser, as described by E. Fradet, C. McDougall, P. Abbyad, R. Dangla, D. McGloin, and CN Baroud, in "Combining rails and anchors with laser forcing for selective manipulation within 2D droplet arrays.” Lab Chip, vol. 11, no. 24, pp. 4228-34, Dec. 2011.
  • transport of the storage microfluidic system can be done directly via a tube connecting for example the production system and the trapping system or by suction and injection with a syringe.
  • the first microdroplets 20 are entrained in the microfluidic system so that the driving force that they undergo is less than the trapping force of the first trapping zones 15 on the first microdroplets 20.
  • the first microdrops 20 are then trapped in step 42, in the capillary traps 12, in particular in the first trapping areas 15. If the entrainment flow exerts on the first microdroplets 20 a driving force on the first microdrops 20 greater than the trapping force of the traps. second zones of trapping 18, the latter are not trapped in the second trapping areas 18 which remain free.
  • the first microdroplets 20 may be trapped in the second trapping zones 18, in particular if the sizes of the traps and drops are adapted. It is then possible to drive them out of the latter by increasing the driving force applied to all the first microdrops 20, for example by increasing the speed of the fluid flow or, when there is none, by adding a flow of fluid in a step 44.
  • the first microdrops 20 may be formed by a method called "breaking drops in capillary traps" described for example in the international application WO 2016/059302, the content of which is incorporated herein by reference. In this case, the first microdroplets 20 are directly formed in the first trapping zones 15.
  • step 46 the second microdrops 25 are produced. This step is shown after step 44 but could take place before.
  • the second microdrops 25 may be produced and introduced into the microfluidic system as described above in relation to the first microdrops 20.
  • the second microdroplets 25 are entrained in the microfluidic system so that the driving force they undergo is less than the trapping force of the second trapping zones 18 on the second microdroplets 25.
  • the second microdrops 25 are then trapped in step 48, in the second trapping zones 18.
  • the latter exerts on the first microdrop trapped in the first trapping zones 15 a driving force, preferably less than or equal to the trapping force of the first trapping areas 15 on the first microdrops 20 so that the latter remain trapped.
  • the method may comprise a step of first measurement of the state of the system.
  • This measurement can be a simple image, or for example a colorimetric, fluorescence, spectroscopic (UV, Raman) or temperature measurement.
  • This measurement may be particularly useful in the context of the use of different first and / or second microdrop panels comprising an identification compound as described above. When several microdrops are in contact in the same trap, it is possible to merge them in a controlled manner to mix their contents in step 50. This coalescence can be selective or not.
  • the microfluidic system In particular in the trapping chamber 30, the latter is perfused with a fluid free of surfactant.
  • concentration of surfactant in the fluid of the microfluidic system decreases, which makes it possible to shift the surfactant adsorption balance at the interface towards the desorption.
  • Microdroplets lose their stabilizing effect and fuse spontaneously with the microdroplets with which they are in contact.
  • the microfluidic system is perfused with a fluid containing a destabilizing agent.
  • the destabilizing agent is, for example, 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctan-1-ol in a fluorinated oil in the case of aqueous microdots.
  • all the microdroplets in contact in the microfluidic system, in particular in the trapping chamber 30, are fused together by bringing an external physical stimulus, such as mechanical waves, pressure waves, a temperature change or a field. electric.
  • electrodes 35 may be placed on either side of the trapping chamber so as to fuse all the microdroplets in contact therebetween.
  • an infra-red laser can be used, as described by E. Fradet, P. Abbyad, M. H. Vos, and C. N. Baroud, in Parallel measurements of reaction kinetics using ultralow-voizis. Lab Chip, Vol 13, No. 22, pp. 4326-30, Oct. 2013, where localized electrodes 37 at the microdropper interfaces between trapping zones can be activated, as shown in Fig. 51. , or mechanical waves can be focused at one or more points.
  • the invention is not limited to the coalescence examples described above. Any method for destabilizing the interface between two microdrops in contact can be used to fuse the microdrops.
  • the capillary trap (s) 12 have a plurality of second trapping zones 18, the position of the second trapping zone (s) 18 by With respect to the direction and direction of the driving force exerted on the second microdrops 25 may allow selective trapping.
  • second microdroplets 25m are supplied with a driving force oriented along the direction Fi according to a step 48a. If the trapping forces in the second trapping areas 18m and 18v are sufficiently low, a second microdrop 25m is trapped only in the second trapping area 18m upstream of the first trapped microdriple relative to the direction Fi.
  • the trapping forces in the second trapping zones 18m and 18v are sufficiently strong to each trap a second microdrop 25m regardless of the direction of the driving force exerted on the second microdrop 25m in step 48a, the fact that the second microdrop 25m upstream with respect to a drive force oriented in the direction F 3 is retained better than that downstream when such driving force is applied can be used to release s tively the second microdroplet 25m trapped downstream in a step 52.
  • the first microdroplet 25m can deform and press the first microdroplet 20 trapped in the first trapping region 15, so it takes a larger force strong to release it only to release the second microdrop 25m downstream. It is then possible to trap in the second trapped 18v trapping zone a second microgout 25v different from the second microdrop 25m already trapped in step 48b.
  • the method comprises the following steps, for a capillary trap presenting two zones. trapping:
  • the trapping force F1 exerted by the first zone on the first microdrop being greater than the force Ft1 of hydrodynamic drag exerted by the flow on the first microdrop, such that so that the latter remains trapped in the first zone, the drag force Ft1 being between Fl and F2, F2 designating the trapping force exerted on the first microdrop by the second capillary trap area,
  • F3 with F3 preferably lower than F1, F3 being the trapping force exerted by the second trap area on the second microdrop.
  • the drag force Ft2 is less than Fl.
  • the second trapping zones 18 of the different capillary traps 12 in the same microfluidic system may have different properties, especially different sizes. This makes it possible, for example, to trap second different microdroplets in different capillary traps 12 in order to obtain different microdroplets. For example, for a given concentration of an element included in the second microdroplets, the quantity of its elements contained in a second microdrop depends on the size of said second microdrop. Thus, by producing second trapping zones 18, for example, of different sizes in the same chamber 30, it is possible to selectively trap second microdrops 25 of different sizes, at each size of second trapping area 18 corresponding to a second microdrop size 25.
  • Figure 55 illustrates three capillary traps 12a, 12b and 12c having second trapping areas 18a, 18 and 18c of different sizes.
  • the first trapping zones 15 are filled with first microdroplets 20.
  • Second microdrops 25a, 25b and 25c, all of the same concentration but of different sizes are made.
  • the second trapping areas 18a, 18b and 18c each correspond to a second microdrop size, the second microdroplets 25a, 25b and 25c are then trapped in the second trapping area 18a, 18b or 18c which corresponds best to them.
  • the capillary traps 12a, 12b and 12c by trapping forces of the second trapping areas 18a, 18b and 18c with respect to the larger of the second growing microdroplets 18a in the direction of the driving force of the second microdroplets. , especially in the direction of fluid flow, in the microfluidic system.
  • the second microdroplets 25a, 25b and 25c first meet the second trapping areas 18c in which only the second smallest microdroplets 25c are trapped, then the second trapping areas 18b in which only the second microdroplets 25b are trapped and finally the second trapping areas 18a in which the second largest microdroplets 25a are trapped.
  • microdroplets 25a, 25b and 25c are different by another of their parameters, in particular they comprise different elements.
  • Steps 46, 48 and 50 may be repeated as shown in Fig. 56 to effect sequential coalescence.
  • the microdrop obtained after step 50 becomes the new first microdrop 80 having the volume of the sum of the volumes of the first microdrop or microdroplets 20 and the second or microdroplets 25 fused into the capillary trap 12.
  • the second trapping zone or traps 18 are again free, it is possible to bring one or more third microdroplets 58 identical or different to the initial microdrop or second microdroplets to achieve a new coalescence and obtain a new microdrop 90 becoming itself the new first microdrop and so on.
  • the microdrop will grow due to the addition of the different volumes of coalesced microdroplets to be so large that it prevents the trapping of a new microdrop in the second trapping area 18.
  • the maximum number of coalescence achievable in the same capillary trap 12 depends on the volume of successive coalesced microdroplets.
  • coalescing step consists in removing the surfactant from the external phase or destabilizing it chemically
  • a stabilization step may be necessary between the different coalescences.
  • first microdrop trapped in a first trapping area of a capillary trap 12 contains cells (for example, bacteria, yeasts or mammalian cells)
  • sequential coalescence may allow the culture medium to be repeated several times by sequentially fusing.
  • second microdrops 25 containing a culture medium at predetermined times.
  • a first microdrop 20 containing a spheroid of mammalian cells and trapped in a capillary trap 12 is fused every 6 hours with a second drug microdroplet.
  • the capillary traps 12 in the trapping chamber 30 may be different and their locations may be controlled. It is possible, for example, to have capillary traps 12 having a different number of second trapping zones.
  • the trapping chamber 30 may comprise capillary traps 12a, 12b, 12c and 12d having respectively one, two, three and four identical second trapping zones 18 distributed around a first trapping area 15 If the first microdrops 20 are identical and comprise a compound of interest, it is possible to obtain in the microfluidic chamber microdroplets 100, 105, 110 and 115 forming a spatial gradient of four concentrations of compound of interest, represented here by different levels of gray, after coalescence with the second trapped microdroplets which may for example contain a diluent. Panels of microdroplets
  • microdrop panels with different compounds and / or different concentrations in a chamber containing capillary traps 12 as described above allows many applications.
  • the first microdrops 20 form a panel of microdrops containing a first compound in 20 different concentrations.
  • the second microdrops 25 contain a second compound in 10 different concentrations.
  • microdrops are static also facilitates the obtaining of kinetic data.
  • economy in reagents is also obtained by using very small volumes in microdroplets.
  • the trapping chamber 30 may have an area greater than 2 cm 2 which further greatly increases the number of different reactions that can be carried out in parallel in a microfluidic system.
  • the microdrops may then comprise one or more identification means. This allows for example to be able to measure the concentration of the final product, for example by fluorescence or spectroscopy.
  • first and / or second microdrops 20 and / or 25 may contain proteins, enzymes, cells at various concentrations.
  • microfluidic system and the method described above can be used to study the crystallization of proteins. Indeed, obtaining a crystal from a purified solution of protein is an essential step for determining its three-dimensional structure since this makes it possible to obtain an X-ray diffraction pattern.
  • a trapping chamber 30 with several capillary traps 12 each making it possible to trap a first and a second microdrop 20 and 25 makes it possible, for example, to have a first microdrop panel comprising a saline solution in different concentrations and a second microdrop panel comprising a protein of interest in different concentrations.
  • a first microdrop panel comprising a saline solution in different concentrations
  • a second microdrop panel comprising a protein of interest in different concentrations.
  • first microdrops 20 having an element of interest in identical concentration throughout the trapping chamber and merging the latter with second microdrops 25 from a panel of microdrops comprising a titrant species in different concentrations it is possible to perform a titration of the species of interest contained in the first microdrops 20.
  • This application can be particularly interesting in the case of expensive reagents or available in small quantities.
  • cancer cells can be cultured in individualized form or as spheroids in first microguides trapped in each of the first trapping area of the capillary traps 12, and after a few days of culture, it is possible to have them coalesced in each trap with a second microdrop containing a drug to be screened, the second microdrops being from a panel of microdrops containing different drugs.
  • a panel of second microdrops containing one or more antibiotics in different concentrations can be created and fused into the trapping chamber 30 with first microdrops containing bacteria.
  • the first microdrops 20 may have a bacterium in different concentrations. This allows to explore a space with 3 parameters.
  • micro fluidics can be very advantageous in the context of rare samples such as biopsies.
  • the microfluidic system can for example be used in the context of personalized medicine and cancer treatment.
  • tumor cells of a biopsied patient can be cultured, for example as spheroids in first trapped microdroplets, and subjected to different drugs at multiple concentrations via delivery of the drugs.
  • the most effective drug and its concentration for a particular patient can be determined using only one entrapment chamber 30 and a second one. minimal number of cells from the biopsy.
  • the method as described above can be used to fuse microdrops containing cells of different or different cell types to accurately form microtissues.
  • the capillary trap may be as illustrated in Figures 5A and 5B.
  • the first trapping area 15 has a height such that its volume is greater than that of the first microdrop so that the first microdrop trapped in a non-flat bottom, especially convex, as shown in Figure 5A.
  • the cells contained in said first microdrop 20 slide along the interface of the latter during their sedimentation to aggregate at the bottom of the first trapped microgout and form a spheroid, as described in the international application WO 2016/059302, incorporated herein by reference.
  • a first microdrop 20 may contain cells of a first cell type in a liquid medium and be trapped in the first trapping zone 15 of said capillary trap 12, after one day of immobilization, spontaneously forming a first spheroid by sedimentation of the cells .
  • the microfluidic system is free of fluid flow near the capillary trap during the formation of the first spheroid so that the liquid of the first microdrop 20 is not driven in motion.
  • a second microdrop 25 containing cells of a second cell type in a liquid medium can be trapped in the second trapping area 18. After coalescence of the first and second microgoutts, a culture of cells of two different types is obtained, the architecture of which depends in particular on the experimental conditions.
  • the cells of the second microdrop 25 mix, after coalescence, with the contents of the first microdrop 20 and then sediment to directly reach the spheroid of cells of the first cell type.
  • the coalescence of the two microdrops 20 and 25 results in the fusion of the first and second spheroids.
  • the two cell populations are compartmentalized.
  • the cells of the second cell type will no longer be able, after coalescence of microdroplets 20 and 25, to come into direct contact with the first spheroid because of the presence of the gel.
  • mammalian cells can not pass through an agarose matrix at 0.9% by weight. The two groups of cells can then communicate together only paracrine.
  • capillary trap 12 trapping a first and a microdrop 20 and 25 but it is possible to obtain more complex microtissus architectures with a capillary trap 12 for trapping more than two microdrops and / or processes as previously described consisting of sequentially coalescing several microdroplets by varying or not the orientation of the fluid flow. It is also possible to use a plurality of capillary traps as described above to form a plurality of microtissues in parallel.
  • microtissus formation can make it possible to create in vitro microtissus with a controlled architecture to mimic very faithfully the conditions encountered in vivo.
  • the different cell types are often arranged in tissue according to a specific architecture that is important to recreate a function at an organ.
  • the latter can also be used for transplantation on a patient.
  • insulin-producing beta cells, glucagon producers, and beta cells may be combined to create Langerhans islets for transplantation into a patient's pancreas to cure diabetes.
  • hepatocytes and stellate cells could be associated with liver transplantation.
  • the method as described above can also be used to create multilayer gel microdroplets.
  • the capillary trap 12 may be as described above and comprise a first trapping zone 15 and a second trapping zone 18.
  • a first microdrop 20 containing a first gelling medium can be trapped in the first entrapment zone 15, and then the first gelling medium can be gelled to form, as illustrated in step 54, a microdroplet 200 of a first gel.
  • the first gelled microgout 200 can then be fused, according to step 58, with a second microdrop 25 containing a second gellable medium and trapped in step 56 in the second trapping zone 18.
  • the second gellable medium can be gelled to form an outer layer 202 of a second gel on the first gel. This operation can be repeated several times sequentially to form a microdrop with a core of the first gel and a plurality of successive outer layers of the other gels.
  • the second gelling medium contained in the second microdrop 25 is gelled to form a microdrop 204 of a second gel before fusing with the first microdrop.
  • the two microdrops When the two microdrops are fused, they retain their shape and position before melting and form a gelled microgout 210 of shape dependent on the shape, arrangement and number of trapping areas.
  • the method can also make it possible to obtain spheroids encapsulated in biological hydrogels.
  • the capillary trap may be as illustrated in Figures 5A and 5B.
  • the first trapping area 15 has a height such that the first microdrop trapped at a non-flat bottom, in particular a convex bottom, as illustrated in FIG. 5A so that the cells contained in said first microdrop 20 slide along the interface of the latter during their sedimentation to aggregate at the bottom of the first trapped microgout and form a spheroid, as described in the international application WO 2016/059302, incorporated herein by reference.
  • a first microdrop 20 can contain cells of a first cell type in a liquid medium and be trapped in the first trapping zone 15 of said capillary trap 12, after one day of immobilization spontaneously forming a spheroid by sedimentation of the cells.
  • the microfluidic system is free of fluid flow in the vicinity of the capillary trap during spheroid formation so that the liquid of the first microdrop 20 is not driven in motion.
  • a second microdrop containing one of the biological hydrogels mentioned above in high concentration can be trapped in the second trapping zone 18. Once this second microgout is trapped, the two microdroplets are fused immediately so that the biological hydrogel, still liquid, mixes with the first microdrop that contains the spheroid.
  • the gelation then takes place and the spheroid is encapsulated in an extracellular matrix representative of the biological conditions encountered in vivo.
  • This spheroid encapsulation technique can be combined with the microtissue formation technique previously described to provide more complex microtissue architectures.
  • the trapping chamber 30 used is 2 cm 2 and contains 393 identical capillary traps similar to that of FIGS. 1A, 1B and 2 and having the following dimensions:
  • the capillary traps 12 are distributed according to a matrix as illustrated in FIG. 49.
  • Microdots have food coloring. Drops of 1 ⁇ , with five different colors ranging from blue to yellow through green were formed by the technique of "micro-segmented flows". These drops of 1 ⁇ were fractionated into many first monodisperse nanodisperse microdroplets using a slope (method described in point f) above). These first microdrops 20 of different colors were then mixed to form a first panel of microdrops having different colors and then injected into the trapping chamber 30 containing the capillary traps 12. The size of the first microdrops 20 was adjusted to occupy them fully. the first trapping areas 15. The second trapping areas 18 remain empty.
  • a matrix of pairs of first and second microdroplets 20 and 25 as shown in FIG. 60a) is then obtained.
  • the first and second microdroplets 20 and 25 in contact are fused by infusing the entrapment chamber 30 with HFE-7500 containing 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctyl-1-ol at a concentration of 20% by volume.
  • the colors of the two microdrops in contact in each of the capillary traps mix to take one of the possible colors according to the color of the initial microdrops, as can be seen in Figure 60b).
  • a matrix of microdroplets of 25 different colors is then obtained.
  • the microfluidic system comprises a trapping chamber 30 having a matrix of capillary traps as illustrated in FIGS. 5A and 5B having the following dimensions:
  • Rat liver cells (H4IIEC3) were first encapsulated in first microdrops 20.
  • the first microdroplets were trapped in the first trapping areas and, after sedimentation, the cells pooled at the bottom of each drop to form a first spheroid 130.
  • second microdrops 25 were trapped in the second trapping zones 18, as can be seen in FIG. 61 A.
  • These also contain H4IIEC3 cells but, unlike the former, they were stained red with a fluorescent marker (CellTracker Red®).
  • first and second microdroplets 20 and 25 were kept in the state for one day so that the red cells of the second microdroplets 25 gather and form a second spheroid 135 at the bottom of each second microdrop 25.
  • the first and second microdroplets in contact were then fused by infusing the chamber with HFE-7500 (fluorinated oil) containing 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctan-1-ol at a concentration of 20% by volume.
  • HFE-7500 fluorinated oil
  • the second spheroid 135 sediments and contacts the bottom of the first microdrop with the first spheroid 130 in a new first microdrop 140, as can be seen in FIG. 61B.
  • These two spheroids in contact will adhere to each other and merge to form a single new spheroid two parts 130 and 135 clearly identifiable by fluorescence imaging (cells from the second spheroid will continue to appear red in the fused spheroid).
  • the chamber is then infused with oil containing surfactant to restore the stability of the new first microdrops for further experimentation.
  • the first microdroplets were then kept one day in culture to allow the cells to adhere to each other to form a spheroid by first microdrops 20.
  • the first microdrops 20 are then gelled by applying a temperature of 4 ° C. 30 min.
  • acetaminophen has been solubilized at high concentration in culture medium. Fluorescein at high concentration was added to this solution. The solution obtained was diluted in different concentrations with pure culture medium to form drops of ⁇ ⁇ at different concentrations. These drops were then fractionated into second microdrops using a slope and then mixed before being injected into the trapping chamber 30 which contains the first microdroplets 20. These second microdrops 25 were smaller than the first microdrops 20 and were trapped in the second trapping areas 18.
  • the chamber was perfused with HFE-7500 (fluorinated oil) containing 1H, 1H, 2H, 2H-perfluorooctan-1-ol at a concentration of 20% by volume to fuse the microdrops in contact.
  • HFE-7500 fluorinated oil
  • Acetaminophen then diffused through the gelled agarose to act on the cells.
  • the oil that separates the microdroplets from each other is replaced by an aqueous phase as described in the international application WO 2016/059302 for coloring spheroids with fluorescent viability markers present in the aqueous phase.

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Abstract

Procédé de manipulation d'au moins une première microgoutte (20) et d'au moins une deuxième microgoutte (25) dans un système microfluidique comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage (15) et une deuxième zone de piégeage (18), le procédé comportant les étapes consistant à : (i) piéger la première microgoutte (20) dans la première zone de piégeage (15), et (ii) piéger la deuxième microgoutte (25) dans la deuxième zone de piégeage (18), la première et la deuxième zone de piégeage (15) étant agencées pour que la première et la deuxième microgouttes (20; 25) soient en contact l'une avec l'autre, la première et la deuxième zones de piégeage (15; 18) étant conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes (20) soient différentes.

Description

PROCEDE MICROFLUIDIQUE DE MANIPULATION DE MICROGOUTTES
La présente invention concerne un procédé microfluidique de manipulation de plusieurs microgouttes dans au moins un piège capillaire d'un système microfluidique. L'invention se rapporte également à un dispositif microfluidique pour mettre en œuvre un tel procédé.
Art Antérieur
Il est connu de la demande de brevet FR 2 950 544, de piéger des microgouttes circulant dans un ou plusieurs microcanaux dans des pièges de forme sensiblement circulaire ou ovale, chaque zone de piégeage étant dimensionnée pour piéger un nombre prédéfini de microgouttes.
Il est également connu de E. Fradet, C. McDougall, P. Abbyad, R. Dangla, D. McGloin, and C. N. Baroud, "Combining rails and anchors with laser forcing for sélective manipulation within 2D droplet arrays." Lab Chip, vol. 11 , no. 24, pp. 4228-34, Dec. 2011, et J. Tullis, C. L. Park, and P. Abbyad, "Sélective Fusion of Anchored Droplets via Changes in Surfactant Concentration." Lab Chip, 2014, de piéger et fusionner des microgouttes de tailles sensiblement identiques ou différentes dans un piège peu profond de forme sensiblement circulaire d'un système microfluidique, ce dernier étant bidimensionnel et présentant une pluralité de pièges. Les microgouttes piégées dans un même piège sont différentes.
De tels pièges ne permettent pas une manipulation et/ou un contrôle précis des microgouttes piégées, notamment d'adapter les pièges à des microgouttes de tailles différentes, ni un piégeage des microgouttes de façon prédéfinie spatialement.
E. Fradet, P. Abbyad, M. H. Vos, and C. N. Baroud, "Parallel measurements of reaction kinetics using ultralow-volumes." Lab Chip, vol. 13, no. 22, pp. 4326-30, Oct. 2013, décrit un piège peu profond présentant deux zones identiques de forme sensiblement circulaire qui se chevauchent partiellement pour donner au piège une forme de lunette. Chacune des deux zones permet de piéger une microgoutte. La forme du piège permet de maintenir les deux microgouttes piégées en contact l'une avec l'autre pour les fusionner en une seule microgoutte. Un tel piège est limité à la manipulation de deux microgouttes de tailles sensiblement identiques et n'est pas adapté à traiter un grand nombre de microgouttes, ce qui réduit les applications possibles.
Il est encore connu de A. M. Huebner, C. Abell, W. T. S. Huck, C. N. Baroud, and F. Hollfelder, "Monitoring a Reaction at Submillisecond Resolution in Picoliter Volumes. ", Anal Chem. 2011 Feb 15;83(4): 1462-8, un piège en forme de C pour immobiliser deux microgouttes et les fusionner. Le piège est formé par des reliefs en saillie venant bloquer les microgouttes dans leur écoulement. Cependant, la manipulation des microgouttes est limitée du fait notamment de la forme des pièges et le maintien des microgouttes dans les pièges nécessite la présence d'un flux de fluide orienté selon un sens précis.
La demande WO 2016/059302 décrit un procédé de manipulation de microgouttes dans un système micro fluidique comportant l'étape consistant à piéger les microgouttes dans un piège capillaire et à gélifier au moins partiellement les microgouttes ou leur environnement. Le piège capillaire peut recevoir plusieurs microgouttes dans sa profondeur, laquelle est plus grande que le diamètre des microgouttes piégées. Cependant, la manipulation des microgouttes, notamment celles piégées, en profondeur est limitée.
La demande US 2015/0258543 propose un procédé permettant la mise en contact de différents fluides pour obtenir une réaction entre eux et permettre une analyse de la cinétique de cette réaction. Un circuit micro fluidique y est divulgué, pouvant ramener des microgouttes, une à une, dans des cavités servant de pièges capillaires. Deux microgouttes de volumes différents peuvent être ramenées en contact et reçues dans une cavité sous forme de 8. Les dimensions des deux zones de piégeage, chaque zone de piégeage correspondant à une boucle du 8, correspondent aux dimensions des microgouttes qui doivent s'y loger. Il existe une barrière énergétique entre ces différentes zones de piégeage liée à la forme de la cavité. Par exemple, une microgoutte apportée par la droite restera dans la zone de piégeage droite, à cause de la forme en 8 de la cavité.
La demande US 2010/0190263 décrit un actuateur de gouttelettes présentant des régions en creux séparant deux substrats. Ces substrats incluent des électrodes pour le transport des gouttelettes vers les régions en creux. L'actuateur vise la formation et la rétention d'une bulle de gaz dans ces régions en creux.
Les articles Dangla, R Lee, S & Baroud, C.N. Trapping microfluidic drops in wells of surface energy. Phys. Rev. Lett. 107, 124501 (1-4) (2011) et Yamada, A., Lee, S., Bassereau, P. & Baroud, C. N. Trapping and release of giant unilamellar vesicles in microfluidic wells. Soft Matter 10, 26-28 (2014) décrivent la physique associée au piégeage de microgouttes, soumises à un écoulement de fluide, dans un micro-canal. La force de piégeage peut résulter de la forme et de la taille du piège, de la profondeur du micro-canal, de la taille des microgouttes, des propriétés physiques et physico-chimiques des fluides en présence, telles que la viscosité, la tension de surface, ... Il existe donc un besoin pour un procédé de manipulation de microgouttes permettant un contrôle des microgouttes piégées aisé et un piégeage de ces dernières de façon prédéfinie spatialement. Il existe également un besoin pour un procédé permettant une manipulation séquentielle des microgouttes.
Résumé
I. Premier aspect - Procédé de manipulation
A cette fin, l'invention propose, selon un premier de ses aspects, un procédé de manipulation d'au moins une première microgoutte et d'au moins une deuxième microgoutte dans un système microfluidique comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, le procédé comportant les étapes consistant à :
(i) piéger la première microgoutte dans la première zone de piégeage, et
(ii) piéger la deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage,
la première et la deuxième zone de piégeage étant agencées pour que la première et la deuxième microgoutte soient en contact l'une avec l'autre,
la première et la deuxième zone de piégeage étant conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
On désigne par « système microfluidique » un système mettant en jeu le transport d'au moins un produit et qui comporte, sur au moins une de ses portions, une section dont au moins une dimension mesurée en ligne droite d'un bord à un bord opposé est inférieure au millimètre.
Par « microgoutte », on comprend une goutte ayant un volume inférieur ou égale à 1 μΐ, mieux inférieur ou égal à 10 ni. La microgoutte peut être liquide, gazeuse ou solide.
Par « piège capillaire », on comprend une zone spatiale du système microfluidique permettant l'immobilisation provisoire ou permanente d'une ou plusieurs microgouttes circulant dans le système microfluidique. Le piège capillaire peut être formé par un ou plusieurs reliefs, notamment des reliefs en creux, et/ou par une ou plusieurs modifications locales de la surface en contact avec les microgouttes, notamment une ou plusieurs modifications locales de l'affinité de la surface avec au moins une partie du contenu de la microgoutte. Par forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes différentes on comprend que si la première microgoutte est piégée dans la première zone de piégeage seule, elle sera retenue dans cette dernière par capillarité avec une force de piégeage qui est différente de la force de piégeage que la deuxième zone de piège exercerait sur cette même première microgoutte prise seule. Ainsi, il est plus facile de libérer la première microgoutte de la zone de piégeage qui exerce la plus petite force de piégeage. Le même raisonnement peut s'appliquer à la deuxième microgoutte. La force de piégeage d'une zone de piégeage dépend notamment de sa forme, de ses surfaces en contact avec la microgoutte et/ou des propriétés, notamment des dimensions, des microgouttes à piéger.
Le fait que le piège capillaire présente deux zones ayant des forces de piégeage différentes ramenées à l'une des microgouttes, permet d'avoir à la fois une sélectivité des microgouttes piégées et une sélectivité spatiale, notamment d'éviter que la première microgoutte occupe la deuxième zone de piégeage empêchant ainsi la deuxième microgoutte de se piéger dans cette deuxième zone de piégeage. Ceci est particulièrement intéressant lorsqu'une pluralité de premières et deuxièmes microgouttes sont introduites dans le système microfluidique.
Le fait que les première et deuxième microgouttes soient en contact permet soit qu'elles interagissent, soit qu'elles coalescent.
De préférence, la première microgoutte est piégée dans la première zone de piégeage avec une force de piégeage qui est plus grande que celle que la deuxième zone de piégeage exercerait sur la première microgoutte. Ainsi, la première microgoutte est préférentiellement piégée par la première zone de piégeage.
En variante, la deuxième microgoutte est piégée dans la deuxième zone de piégeage avec une force de piégeage qui est plus petite que celle que la première zone de piégeage exercerait sur la deuxième microgoutte. Dans ce cas, les première et deuxième microgouttes sont préférentiellement introduites et piégées dans le système microfluidique de manière séquentielle.
De préférence, la première microgoutte est piégée par la première zone de piégeage dans le système microfluidique avant que la deuxième microgoutte ne soit piégée par la deuxième zone de piégeage dans le système microfluidique. Ainsi, lorsque la deuxième microgoutte est introduite, elle ne peut pas occuper la première zone de piégeage car cette dernière est déjà occupée par la première microgoutte.
Une force d'entraînement supérieure à la force de piégeage de la deuxième zone de piégeage et inférieure ou égale à la force de piégeage de la première zone de piégeage peut être exercée à l'étape (i) sur la première microgoutte. Par exemple, la forme de la deuxième zone de piégeage est choisie de façon à ce que la force de piégeage de la deuxième zone soit inférieure à la force d'entraînement. Autrement dit, la microgoutte est soumise à des forces hydrodynamiques du fait de son entraînement qui s'opposent à sa capture par la deuxième zone de piégeage. La force de traînée exercée par le fluide qui véhicule les microgouttes peut dépendre de la taille et de la forme instantanée des microgouttes, des propriétés physiques et physico-chimiques des fluides (viscosité, tension de surface, ...) et de la vitesse de l'écoulement. La première goutte est alors piégée uniquement dans les premières zones de piégeage.
La force d'entraînement peut être exercée au moins partiellement par
- un flux de fluide orienté s'écoulant dans le système microfluidique.
En particulier, les microgouttes peuvent être entraînées en déplacement dans le système microfluidique par un flux orienté d'un fluide, dans lequel les microgouttes ne sont, de préférence, pas miscibles, le flux de fluide étant tel que, notamment ayant un débit et une orientation tels que, la première microgoutte soit seulement piégée par la première zone de piégeage. La force que le fluide en mouvement exerce sur la première goutte empêche cette dernière de se piéger dans la deuxième zone de piégeage ;
- la gravité, la première microgoutte étant entraînée en déplacement le long d'une pente du système microfluidique par son propre poids. Ainsi, selon la vitesse à laquelle la première microgoutte arrive sur la première zone de piégeage du fait de la pente du système microfluidique, la première microgoutte est ou non retenue pas la première zone de piégeage ;
- la tendance de la première microgoutte à minimiser sa tension de surface. En particulier, le système microfluidique peut comporter des reliefs qui entraînent la première microgoutte en déplacement, notamment une rainure s'élargissant en direction du piège capillaire.
De préférence, la deuxième microgoutte est soumise à une force d'entraînement telle que décrit en relation avec la première microgoutte, inférieure ou égale à la force de piégeage de la deuxième zone de piégeage. Dans le cas où la force d'entraînement sur la deuxième microgoutte est exercée par un flux de fluide orienté, la force qu'exerce le flux de fluide sur la première microgoutte piégée dans la première zone de piégeage est, de préférence, insuffisante pour extraire la première microgoutte de la première zone de piégeage.
Dans le cas où la force d'entraînement sur la deuxième microgoutte est exercée par un flux de fluide orientée, ce dernier peut être orienté de sorte que la deuxième microgoutte ne puisse être piégée que dans les deuxièmes zones de piégeage ayant une orientation particulière par rapport à l'orientation du flux, notamment disposé en amont de la première zone de piégeage par rapport à la direction du flux de fluide.
Les microgouttes étant véhiculées par un flux de fluide vers une pluralité de zones de piégeage, elles sont de préférence amenées dans celles-ci de façon aléatoire et occupent naturellement la place la plus avantageuse, d'un point de vue énergétique, de la zone de piégeage. Elles se logent par elles-mêmes dans les zones de piégeage. Ce placement aléatoire des microgouttes permet d'avoir un grand nombre de microgouttes piégées simultanément, et augmente la capacité de screening.
Dans des exemples de mise en œuvre, le procédé comporte les étapes suivantes :
- piégeage d'une première microgoutte dans une première zone de piégeage du piège capillaire, la force de piégeage Fl exercée par la première zone sur la première microgoutte étant supérieure à la force Ftl de traînée hydrodynamique exercée par l'écoulement ( i.e. le flux orienté de fluide qui véhicule les microgouttes) sur la première microgoutte, de telle sorte que cette dernière reste piégée dans la première zone, la force de traînée Ftl étant comprise entre Fl et F2, F2 désignant la force de piégeage exercée sur la première microgoutte par la deuxième zone de piégeage du piège capillaire,
- ensuite, piégeage d'une deuxième microgoutte dans la deuxième zone du piège capillaire, la force de traînée hydrodynamique Ft2 exercée sur la deuxième microgoutte par l'écoulement durant le chargement de la deuxième microgoutte dans la deuxième zone étant comprise entre F2 et F3, avec F3 de préférence inférieure à Fl, F3 étant la force de piégeage exercée par la deuxième zone du piège capillaire sur la deuxième microgoutte.
Microgouttes
De préférence, la force de piégeage qu'exerce la première zone de piégeage sur la première microgoutte est différente de la force de piégeage qu'elle exercerait sur la deuxième microgoutte et la force de piégeage qu'exerce la deuxième zone de piégeage sur la deuxième microgoutte est différente de la force de piégeage qu'elle exercerait sur la première microgoutte. En effet, la force de piégeage dépend également de la forme de la microgoutte à piéger en relation avec la forme de la zone de piégeage. Ceci facilite le piégeage séquentiel des première et deuxième microgouttes.
De préférence, la première zone de piégeage exerce sur la première microgoutte une force de piégeage supérieure à celle qu'elle exercerait sur la deuxième microgoutte. Ceci permet d'éviter que la deuxième microgoutte ne déloge et prenne la place de la première microgoutte.
La première et la deuxième microgoutte peuvent être différentes, en particulier de tailles différentes, notamment la première microgoutte étant de plus grande dimension et/ou de plus grand volume que la deuxième microgoutte, et/ou de contenus différents. Ceci garantit que la première zone de piégeage exerce sur la première microgoutte une force de piégeage supérieure à celle qu'elle exercerait sur la deuxième microgoutte ; par conséquent, il n'y aura qu'une seule microgoutte dans la première zone de piégeage.
La première zone de piégeage peut piéger une ou plusieurs premières microgouttes.
La deuxième zone de piégeage peut piéger une ou plusieurs deuxièmes microgouttes.
En variante, les première(s) et deuxième(s) microgouttes sont différentes par au moins l'une de leurs propriétés, notamment leur viscosité et/ou leur tension interfaciale et/ou leur affinité avec un revêtement particulier d'au moins l'une des zones de pièges.
De préférence, la première zone de piégeage ne piège qu'une première microgoutte et/ou la deuxième zone de piégeage ne piège qu'une deuxième microgoutte. En particulier :
- la plus grande dimension de la première microgoutte lorsqu'elle est piégée en vue du dessus peut être supérieure ou égale à la plus grande dimension de la première zone de piégeage en vue de dessus, et/ou
- la plus grande dimension de la deuxième microgoutte lorsqu'elle est piégée en vue du dessus peut être supérieure ou égale à la plus grande dimension de la deuxième zone de piégeage en vue de dessus, et/ou - la première microgoutte, lorsqu'elle est piégée, remplit au moins 70%, mieux 80%, encore mieux 90%>, du volume de la première zone de piégeage, et/ou
- la deuxième microgoutte, lorsqu'elle est piégée, remplit au moins 70%), mieux 80%>, encore mieux 90%>, du volume de la deuxième zone de piégeage, et/ou
- le volume de la première microgoutte, lorsqu'elle est piégée, est supérieure ou égale à celui de la première zone de piégeage de sorte que la première microgoutte s'étend partiellement en dehors de la première zone de piégeage, et/ou
- le volume de la deuxième microgoutte, lorsqu'elle est piégée, est supérieure ou égale à celui de la deuxième zone de piégeage de sorte que la deuxième microgoutte s'étend partiellement en dehors de la deuxième zone de piégeage.
Une des première(s) ou deuxième(s) microgouttes peut être une microbulle d'air.
Pluralité de deuxièmes et/ou première zones de piégeage
Le piège capillaire peut comporter une pluralité de deuxièmes zones de piégeage, l'étape (ii) consistant à piéger une deuxième microgoutte par deuxième zone de piégeage, la première et les deuxièmes zones de piégeage étant agencées de telle sorte que chaque deuxième microgoutte soit en contact avec au moins une de la première ou des deuxièmes microgouttes.
Le piège capillaire peut comporter une pluralité de premières zones de piégeage, l'étape (i) consistant à piéger une première microgoutte par première zone de piégeage, les première et la ou les deuxièmes zones de piégeage étant agencées de telle sorte que chaque première microgoutte soit en contact avec au moins une de la ou des deuxièmes microgouttes ou des premières microgouttes.
De préférence, chaque deuxième microgoutte est reliée à la ou chaque première microgoutte.
Par « reliée à », on comprend que chaque deuxième microgoutte est soit directement en contact avec ladite première microgoutte, soit en contact avec une autre deuxième microgoutte ou un chapelet de deuxièmes et/ou premières microgouttes elle- même en contact avec ladite première microgoutte. Par « chapelet de microgouttes », on comprend une pluralité de microgouttes formant une ligne droite ou courbe en contact les unes avec les autres.
Les deuxièmes microgouttes peuvent être toutes en contact avec au moins une première microgoutte piégée dans ledit piège capillaire.
Au moins deux deuxièmes zones de piégeage peuvent être conformées pour que leurs forces de piégeage ramenées à l'une desdites deuxièmes microgouttes soient différentes. Les deuxièmes microgouttes piégées par au moins deux deuxièmes zones de piégeage peuvent être différentes de par au moins l'une de leurs propriétés, notamment leur plus grande dimension.
En variante, toutes les deuxièmes zones de piégeage du piège capillaire sont identiques.
Pluralité de piège capillaire
Le système micro fluidique peut comporter une pluralité de pièges capillaires comportant chacun une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, l'étape (i) consistant à piéger une première microgoutte dans la première zone de piégeage de chaque piège capillaire, l'étape (ii) consistant à piéger une deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage de chaque piège capillaire, la première et la deuxième zone de piégeage de chaque piège capillaire de la pluralité de pièges capillaires étant agencées de telle sorte que la première et la deuxième microgoutte piégée dans ledit piège capillaire soient en contact l'une avec l'autre dans ce dernier.
Chaque piège capillaire peut comporter une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment.
Tous les pièges du système microfluidique peuvent comporter chacun une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage agencées de telle sorte que la première et la deuxième microgoutte piégée dans ledit piège capillaire soient en contact l'une avec l'autre dans ce dernier.
En variante, seules une partie des pièges capillaires du système microfluidique comportent chacun une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage agencées de telle sorte que la première et la deuxième microgoutte piégée dans ledit piège capillaire soient en contact l'une avec l'autre dans ce dernier.
Le procédé peut comporter l'étape consistant à piéger une microbulle de gaz, notamment d'air, dans l'une des premières ou deuxièmes zones de piégeage. Ceci permet de rendre la zone de piégeage en question inactive. En effet, du fait de la présence de la microbulle de gaz, les première ou deuxième microgouttes ne peuvent pas se piéger dans la zone de piégeage concernée.
Flux de fluide orienté
L'étape (ii) peut comporter les sous-étapes (ϋ') consistant à piéger, sous l'effet d'un premier flux de fluide orienté, une deuxième microgoutte dans une ou une partie des deuxièmes zones de piégeage et (ii") consistant à piéger, sous l'effet d'un deuxième flux de fluide orienté, une deuxième microgoutte dans une autre ou une autre partie des deuxième zones de piégeage, le premier et le deuxième flux de fluide étant d'orientation différentes.
Les deuxièmes microgouttes des étapes (ϋ') et (ii") peuvent être différentes notamment par au moins l'une de leurs propriétés et/ou leur contenu. Les deuxièmes zones de piégeage des étapes (ii') et (ii") peuvent être identiques.
Ainsi, il est possible, en choisissant l'orientation du flux de fluide, de piéger des microgouttes sélectivement dans une des deux zones de piégeage, ce qui permet un positionnement spatial prédéfini des microgouttes en contact les unes avec les autres. Il est alors possible de mettre en contact une première microgoutte avec des deuxièmes microgouttes différentes de façon contrôlée, notamment dans le cadre de la chimie combinatoire. Il est également possible, dans le cadre de microgouttes comportant des gels de contrôler spatialement la disposition de microgoutte de gels dans le piège capillaire de sorte à obtenir après fusion une microgoutte de forme et de composition contrôlées.
Coalescence
Le procédé peut comporter l'étape (iii) consistant à fusionner avec la première microgoutte la ou chacune des deuxièmes microgouttes piégées dans la ou chacune des deuxièmes zones de piégeage. Une telle coalescence permet notamment de mélanger le contenu des deux microgouttes.
Une telle coalescence peut être sélective, c'est-à-dire que l'on peut choisir la ou les deuxièmes microgouttes en contact avec la première microgoutte que l'on veut fusionner avec cette dernière, notamment par l'utilisation d'un laser infra-rouge comme cela est par exemple décrit dans le document E. Fradet, P. Abbyad, M. H. Vos, and C. N. Baroud, Parallel measurements of réaction kinetics using ultralow-volumes. " Lab Chip, vol. 13, no. 22, pp. 4326-30, Oct. 2013, dont le contenu est incorporé par référence, d'électrodes adressables disposées au niveau du piège capillaire ou d'ondes mécaniques. En variante, la coalescence des microgouttes est non sélective, c'est-à-dire que l'ensemble des deuxièmes microgouttes du piège capillaire fusionne simultanément avec la première microgoutte, notamment par l'ajout d'un produit favorisant cette coalescence dans l'environnement du piège capillaire ou l'application d'un stimulus physique externe tel que des ondes mécaniques, des ondes de pression, un changement de température ou un champ électrique.
Libération des deuxièmes microgouttes
En variante, l'étape (iii) consiste à évacuer la ou au moins une deuxième microgoutte piégée dans la deuxième zone de piégeage hors du piège capillaire. L'étape (iii') peut consister à appliquer un flux de fluide orienté, configuré pour exercer sur une ou plusieurs deuxièmes microgouttes une force d'entraînement supérieure à la force de piégeage de la deuxième zone de piégeage, le flux de fluide étant configuré pour exercer sur la ou les premières microgouttes une force d'entraînement inférieure ou égale à la force de piégeage de la première zone de piégeage, de sorte que la ou les premières microgouttes restent piégées dans la première zone de piégeage.
A cette étape, on peut évacuer une ou plusieurs des deuxièmes microgouttes des deuxièmes zones de piégeage, le piège capillaire étant configuré de sorte que, du fait de son orientation, le flux de fluide exerce des forces d'entraînement différentes sur les deuxièmes zones de piégeage, le procédé comportant de préférence l'étape (iv) consistant à changer l'orientation du flux de fluide de sorte à évacuer au moins une ou plusieurs des deuxièmes microgouttes d'au moins une autre zone de piégeage. Ceci permet une libération sélective des deuxièmes microgouttes. Ainsi, une première microgoutte et une ou plusieurs deuxièmes microgouttes peuvent être mises en contact les unes avec les autres pendant un temps déterminé suffisant pour que, en particulier du fait des interactions entre la première microgoutte et la ou les deuxièmes microgouttes, la ou les deuxièmes microgouttes subissent un changement, par exemple un changement de contenu, puis libérées pour être analysées. Cela peut également permettre de changer les deuxièmes microgouttes par d'autres deuxièmes microgouttes dans le cas d'une erreur dans le protocole avant la coalescence des microgouttes.
Troisième microgoutte
Le procédé peut comporter, après l'étape (iii) ou (iii'), l'étape (v) consistant à piéger une troisième microgoutte dans la ou les deuxièmes zones de piégeage n'ayant plus de deuxième microgoutte, de sorte que la première et la troisième microgoutte soient en contact l'une avec l'autre. La troisième microgoutte peut être identique ou différente de la deuxième microgoutte. La troisième microgoutte peut être fusionnée avec la microgoutte piégée dans la première zone de piégeage ou libérée comme cela est décrit précédemment pour la deuxième microgoutte. L'étape (vi) peut être répétée plusieurs fois. Ceci permet par exemple de :
- diluer de manière séquentielle le contenu des première(s) ou deuxième(s) microgouttes,
- d'apporter un réactif supplémentaire au contenu de la ou des premières microgouttes piégées dans la première zone de piégeage,
- de renouveler à plusieurs reprises le milieu de culture d'une ou des premières microgouttes contenant des cellules piégées dans la première zone de piégeage,
- d'apporter à plusieurs reprises à une ou plusieurs premières microgouttes contenant un pathogène ou des cellules malades, à des intervalles de temps donnés, un médicament pour évaluer sa posologie pour un traitement, ou
- d'apporter à plusieurs reprises des cellules afin de former un microtissu présentant plusieurs couches cellulaires.
Libération du piège capillaire
Le procédé peut comporter l'étape (vi) consistant à évacuer l'ensemble des microgouttes présentes dans le piège capillaire hors du piège capillaire, notamment à l'aide d'un flux de fluide exerçant une force d'entraînement supérieure aux forces de piégeage s 'exerçant sur les microgouttes. Une telle étape peut permettre de libérer les microgouttes pour les analyser.
Le procédé peut comporter l'étape consistant à prendre une mesure de l'état du système micro fluidique. Cette mesure peut être effectuée avant et/ou après fusion et/ou libération des gouttes.
De préférence, la ou les microgouttes finales obtenues peuvent comporter un moyen d'identification de leur contenu, notamment un marquage par la présence de billes ou de particules en nombre, par la présence de couleurs ou de formes variées et/ou par un signal colorimétrique ou de fluorescence proportionnel à une concentration initiale en un composé compris dans une de la première et de la deuxième microgoutte.
Le procédé décrit ci-dessus peut être réalisé à l'aide du système micro fluidique qui est décrit ci-après. Etapes supplémentaires
Le procédé peut comporter une étape supplémentaire
- d'incubation, et/ou
- d'observation ou de mesure, notamment par la prise d'une image, par une mesure colorimétrique, de fluorescence, spectroscopique (UV,
Raman) ou de température.
Ces étapes peuvent avoir lieu avant et/ou après la coalescence des microgouttes.
L'étape d'observation ou de mesure peut permettre de déterminer le contenu de chaque microgoutte avant et/ou après fusion et par exemple de déterminer les modifications intervenues suite à la fusion.
L'étape d'observation est, par exemple, particulièrement utile dans le cadre de l'utilisation d'une librairie de microgouttes différentes pour faire une cartographie des différentes microgouttes avant fusion.
IL Dispositif mici ofluitlique
L'invention a également trait à un dispositif micro fluidique de piégeage de microgouttes, notamment pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage disposées de sorte qu'une première microgoutte piégée dans la première zone de piégeage et qu'une deuxième microgoutte piégée dans la deuxième zone de piégeage soient en contact l'une avec l'autre dans le piège capillaire, la première et la deuxième zone de piégeage étant conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Le fait que le piège capillaire présente deux zones ayant des forces de piégeage différentes ramenées à l'une des microgouttes, permet d'avoir à la fois une sélectivité des microgouttes piégées et un piégeage des microgouttes de façon prédéfini spatialement, notamment d'éviter que la première microgoutte occupe la deuxième zone de piégeage empêchant ainsi la deuxième microgoutte de se piéger dans cette dernière.
Ceci est particulièrement vrai lorsqu'une pluralité de premières et deuxièmes microgouttes sont introduites dans le système microfluidique.
Le fait que les première et deuxième microgouttes soient en contact permet soit qu'elles interagissent, soit de pouvoir les fusionner facilement. Zones de piégeage
La première et la deuxième zone de piégeage sont, de préférence, des cavités. L'utilisation de zones de piégeage sous forme de cavité facilite la manipulation des microgouttes et notamment leur piégeage et/ou leur libération.
La première et la deuxième zone de piégeage peuvent être disjointes.
En variante, la première et la deuxième zone de piégeage sont jointes.
De préférence, le piège capillaire est dépourvu de symétrie de révolution, en vue de dessus. Cette anisotropie permet d'avoir un piégeage des microgouttes de façon prédéfini spatialement.
De préférence, la première zone de piégeage et la deuxième zone de piégeage sont disposées l'une à côté de l'autre, en vue du dessus.
La première et la deuxième zone de piégeage sont, de préférence, différentes par au moins l'une de leurs dimensions. En particulier, la première et la deuxième zone de piégeage sont de hauteurs différentes, la première zone de piégeage étant notamment plus haute que la deuxième zone de piégeage ou la première et la deuxième zone de piégeage sont de formes différentes, en vue de dessus, la première zone de piégeage présentant notamment une section plus grande que la deuxième zone de piégeage. La différence de force de piégeage est alors liée au moins partiellement à la taille, notamment la hauteur ou la section en vue du dessus, des zones de piégeage.
Par « hauteur de la zone de piégeage », on comprend, en section transversale, la hauteur moyenne de la zone de piégeage du système microfluidique.
La deuxième zone de piégeage peut s'élargir dans au moins une direction en rapprochement de la première zone de piégeage. Ceci permet de guider la deuxième microgoutte en direction de la première microgoutte pour la maintenir en contact avec cette dernière. En effet, afin de minimiser son énergie de surface, la deuxième microgoutte tend à se déplacer le long de la deuxième zone de piégeage vers la zone de plus grande dimension.
La deuxième zone de piégeage peut s'élargir en rapprochement de la première zone de piégeage, en vue de dessus. De préférence, l'angle de divergence a est tel que la deuxième microgoutte soit toujours en contact des deux parois opposées le définissant. La deuxième zone de piégeage peut s'élargir avec un angle de divergence a non nul, notamment compris entre 10° et 120°. La deuxième zone de piégeage peut avoir une forme sensiblement triangulaire ou triangulaire tronquée. La deuxième zone de piégeage peut présenter une hauteur croissante en direction de la première zone de piégeage.
De préférence, la hauteur de la deuxième zone de piégeage est inférieure ou égale à la plus grande dimension de la première zone de piégeage, mieux à la moitié de la plus grande dimension de la première zone de piégeage. Le fait que la hauteur de la deuxième zone de piégeage soit limitée permet d'éviter que les lignes de flux du fluide soient perturbées par la deuxième zone de piégeage au point d'empêcher la deuxième microgoutte d'être piégée.
La hauteur de la première zone de piégeage peut être telle que le volume de cette dernière est supérieur ou égal au volume de la première microgoutte. Ceci permet d'avoir une première zone de piégeage présentant une grande force de piégeage, dans laquelle la première microgoutte est peu déformée, en particulier présentant une interface inférieure concave, ce qui peut faciliter, après sédimentation, la mise en contact d'éléments encapsulés pour former un amas, par exemple des cellules pour former un sphéroïde.
Pluralité de deuxièmes et/ou premières zones de piégeage
Le piège capillaire peut comporter une pluralité de deuxièmes zones de piégeage agencées de telle sorte que chaque deuxième microgoutte piégée soit en contact avec au moins une de la première ou des deuxièmes microgouttes piégées dans le piège capillaire.
Le piège capillaire peut comporter une pluralité de premières zones de piégeage agencées de telle sorte que chaque première microgoutte piégée soit en contact avec au moins une de la ou des deuxièmes microgouttes ou des premières microgouttes piégées dans le piège capillaire.
De préférence, les première(s) et deuxième(s) zones de piégeage sont agencées pour que chaque deuxième microgoutte soit reliée à la ou chaque première microgoutte.
Les première(s) et deuxième(s) zones de piégeage peuvent être agencées de sorte que les deuxièmes microgouttes soient toutes en contact avec au moins une première microgoutte piégée dans ledit piège capillaire.
Au moins deux deuxièmes ou premières zones de piégeage peuvent être conformées pour que leurs forces de piégeage ramenées à l'une desdites deuxièmes microgouttes soient différentes. Les deuxièmes microgouttes piégées par au moins deux deuxièmes zones de piégeage peuvent être différentes de par au moins l'une de leurs propriétés, notamment leur plus grande dimension.
En variante, toutes les deuxièmes zones de piégeage du piège capillaire sont identiques.
Pluralité de pièges capillaires
De préférence, le dispositif comporte une pluralité de pièges capillaires comportant chacun une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, de préférence agencées de telle sorte que la deuxième microgoutte piégée dans la deuxième zone de piégeage du piège capillaire soit en contact avec la première microgoutte piégée dans la première zone de piégeage dudit piège capillaire.
Chaque piège capillaire peut comporter une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment.
Tous les pièges capillaires du dispositif peuvent comporter chacun au moins une première zone de piégeage et au moins une deuxième zone de piégeage.
En variante, une partie des pièges capillaires comporte chacun au moins une première zone de piégeage et au moins une deuxième zone de piégeage et une partie des pièges capillaires ne comporte qu'une seule zone de piégeage ne permettant de piéger qu'une seule première microgoutte. De tels pièges capillaires comportant une seule zone de piégeage peuvent servir de contrôle lors d'une expérience.
Le dispositif peut comporter au moins 10 pièges capillaires par centimètre carré, mieux au moins 100 pièges capillaires par centimètre carré. Un grand nombre de pièges capillaires permet notamment de faire de la chimie combinatoire, d'effectuer un criblage de médicaments, d'étudier la cristallisation des protéines, d'effectuer un titrage d'une espèce chimique, ou de personnaliser un traitement notamment dans le cas du traitement du cancer.
Au moins deux pièges capillaires peuvent être différents. Par exemple, le dispositif comporte un premier piège capillaire comportant n deuxièmes zones de piégeage et un deuxième piège capillaire comportant p deuxièmes zones de piégeage, n étant différent de p. De tels pièges capillaires permettent d'avoir après coalescence des deuxièmes microgouttes avec les premières microgouttes des microgouttes piégées dans les premières zones de piégeage ayant des concentrations et/ou des tailles de gouttes différentes. Le système microfluidique peut présenter plus de deux pièges capillaires ayant des quantités de deuxièmes zones de piégeage différentes afin de réaliser plusieurs concentration et/ou tailles de microgouttes, notamment un gradient de concentrations et/ou de tailles de microgouttes. Les microgouttes obtenues, de concentrations différentes, peuvent former un panel de microgouttes utile dans le domaine de la chimie combinatoire, pour étudier la cristallisation des protéines, effectuer un titrage d'une espèce chimique ou personnaliser un traitement, notamment dans le cas du cancer.
En variante, les pièges capillaires sont tous identiques.
Le dispositif peut comporter un canal présentant une chambre de piégeage, le ou les pièges capillaires étant dans la chambre de piégeage.
III. Deuxième aspect - Procédé de manipulation
L'invention a également pour objet, selon un deuxième aspect, un procédé de manipulation d'une pluralité de premières microgouttes et d'une pluralité de deuxièmes microgouttes dans un système microfluidique comportant un canal présentant une chambre de piégeage comportant un pluralité de pièges capillaires répartis selon au moins deux directions différentes, chaque piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, le procédé comportant les étapes consistant à :
(i) piéger une première microgoutte dans la première zone de piégeage de chaque piège capillaire, et
(ii) piéger une deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage de chaque piège capillaire,
la première et la deuxième zone de piégeage d'un même piège capillaire étant agencées pour que la première et la deuxième microgoutte soient en contact l'une avec l'autre dans le piège capillaire, les pièges capillaires présentant chacun une forme anisotrope.
Le fait qu'il y ait une pluralité de pièges capillaires permet de former une pluralité de paires de première et deuxième microgouttes simultanément. Les différentes paires de première et deuxième microgouttes peuvent alors être différentes ou identiques.
Le fait que les pièges capillaires soient anisotropes permet d'avoir un positionnement spatial prédéfini des microgouttes une fois qu'elles sont piégées par les zones de piégeage.
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage de chaque piège capillaire sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes. Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec le procédé ou le dispositif selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au procédé selon cet aspect de l'invention.
Le procédé peut être mis en œuvre à l'aide d'un système microfluidique de piégeage de microgouttes comportant un canal présentant une chambre de piégeage comportant une pluralité de pièges capillaires répartis selon au moins deux directions différentes, chaque piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage disposées de sorte qu'une première microgoutte piégée dans la première zone de piégeage et qu'une deuxième microgoutte piégée dans la deuxième zone de piégeage du même piège capillaire soient en contact l'une avec l'autre, les pièges capillaires présentant chacun une forme anisotrope.
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage de chaque piège capillaire sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec le système microfluidique selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au système microfluidique selon cet aspect de l'invention.
IV. Troisième aspect - Procédé de manipulation
L'invention a encore pour objet, selon un troisième aspect, un procédé de manipulation d'au moins une première microgoutte et d'au moins une deuxième microgoutte dans un système microfluidique comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, la deuxième zone de piégeage s'élargissant dans au moins une dimension en rapprochement de la première zone de piégeage, le procédé comportant les étapes consistant à :
(i) piéger la première microgoutte dans la première zone de piégeage, et
(ii) piéger la deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage, les première et deuxième zones de piégeage d'un même piège capillaire étant agencées pour que la première et la deuxième microgoutte soient en contact l'une avec l'autre dans le piège capillaire.
Le fait que la deuxième zone de piégeage s'élargisse dans au moins une dimension en rapprochement de la première zone de piégeage permet de guider la deuxième microgoutte vers la première microgoutte lors de son piégeage et de maintenir cette dernière en contact avec la première microgoutte. En effet, afin de minimiser son énergie de surface, la deuxième microgoutte tend à se déplacer le long de la deuxième zone de piégeage vers la zone de plus grande dimension.
La deuxième zone de piégeage s'élargit, de préférence, en vue de dessus en rapprochement de la première zone de piégeage.
La deuxième zone de piégeage peut s'élargir avec un angle de divergence a compris entre 10° et 120°.
La deuxième zone de piégeage peut présenter une hauteur croissante en direction de la première zone de piégeage.)
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les procédés ou les dispositifs selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au procédé selon cet aspect de l'invention.
Le procédé peut être mis en œuvre à l'aide d'un système microfluidique de piégeage de microgouttes comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage disposées de sorte qu'une première microgoutte piégée dans la première zone de piégeage et qu'une deuxième microgoutte piégée dans la deuxième zone de piégeage du même piège capillaire soient en contact l'une avec l'autre, la deuxième zone de piégeage s'élargissant dans au moins une dimension en rapprochement de la première zone de piégeage.
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les systèmes microfluidique selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au système microfluidique selon cet aspect de l'invention.
V. Quatrième aspect - Procédé d'assemblage cellulaire
L'invention a encore pour objet, selon un quatrième aspect, un procédé d'assemblage cellulaire d'au moins une première microgoutte contenant des premières cellules et d'au moins une deuxième microgoutte contenant des deuxièmes cellules, dans un système microfluidique comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, ce procédé comportant les étapes consistant à :
(i) piéger la première microgoutte dans la première zone de piégeage, et
(ii) piéger la deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage, la première et la deuxième zone de piégeage d'un même piège capillaire étant agencées pour que la première et la deuxième microgoutte soient en contact l'une avec l'autre dans le piège capillaire,
(iii) fusionner la première microgoutte avec la deuxième microgoutte pour former un microtissu par adhérence des premières et deuxièmes cellules entre elles.
Un tel procédé peut permettre de créer in vitro des microtissus avec une architecture contrôlée pour mimer de manière très fidèle les conditions rencontrées in vivo. En effet, dans le corps, les différents types cellulaires sont souvent agencés en tissus selon une architecture spécifique qu'il est important de reproduire au mieux pour recréer une fonction au niveau d'un organe. Cette culture tridimensionnelle à architecture contrôlée peut être utilisée en vue d'une transplantation sur un patient. Il est, par exemple, possible de faire une culture de cellules alpha, productrices de glucagon, et de cellules béta, productrices d'insuline, pour créer des ilôts de Langerhans que l'on peut transplanter dans le pancréas d'un patient pour soigner son diabète. De manière similaire des hépatocytes et des cellules stellaires peuvent être associés dans le cadre d'une transplantation du foie.
L'étape (ii) peut être réalisée après agrégation des premières cellules, en particulier après formation d'un premier sphéroïde formé par adhérence des premières cellules entre elles. Si la première microgoutte contenant le premier sphéroïde est liquide, les deuxièmes cellules vont, après fusion des deux microgouttes, se mélanger au contenu de la première microgoutte puis sédimenter pour atteindre directement le premier sphéroïde. Si l'étape (iii) a lieu avant que les deuxièmes cellules aient eu le temps de former un deuxième sphéroïde, celles-ci vont venir se déposer après sédimentation à la surface du premier sphéroïde initialement dans la première microgoutte.
L'étape (iii) peut être réalisée après agrégation des deuxièmes cellules, en particulier après formation d'un deuxième sphéroïde formé par adhérence des deuxièmes cellules entre elles. Ainsi, on peut faire fusionner le premier et le deuxième sphéroïde ensemble.
L'architecture des microtissus obtenus dépend donc des conditions expérimentales.
Le procédé peut comporter une étape additionnelle de gélifïcation des premières microgouttes, une telle étape ayant lieu avant l'étape (iii) et préférentiellement avant l'étape (ii). Ceci permet de compartimenter les cellules. En effet, si les premières microgouttes, qui contiennent les sphéroïdes sont gélifiées avant l'arrivée des deuxièmes microgouttes, les deuxièmes cellules contenues ne pourront plus, après coalescence, entrer directement en contact avec le premier sphéroïde, par exemple des cellules mammifères ne peuvent pas traverser une matrice d'agarose à 0.9 % en masse. Les premières et les deuxièmes cellules ne peuvent alors communiquer ensemble que par voie paracrine.
Les premières et deuxièmes cellules peuvent être de types cellulaires différents.
De préférence, les premières et les deuxièmes zones de piégeage sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les procédés ou les dispositifs selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au procédé selon cet aspect de l'invention.
Le procédé peut être mis en œuvre à l'aide de l'un des systèmes microfluidiques selon les aspects précédents.
VI. Cinquième aspect - Procédé de culture cellulaire
L'invention a encore pour objet, selon un cinquième aspect, un procédé de culture cellulaire dans un système microfluidique d'au moins une première microgoutte contenant une culture cellulaire et d'au moins une deuxième microgoutte contenant un milieu de culture, le système microfluidique comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, le procédé de culture comportant les étapes consistant à :
(i) piéger la première microgoutte dans la première zone de piégeage, et (ii) piéger la deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage, la première et la deuxième zone de piégeage d'un même piège capillaire étant agencées pour que la première et la deuxième microgoutte soient en contact l'une avec l'autre dans le piège capillaire,
(iii) fusionner la première microgoutte avec la deuxième microgoutte pour renouveler le milieu de culture de la culture cellulaire opérée dans la première microgoutte. L'injection séquentielle du milieu de culture peut permettre de renouveler plusieurs fois ce dernier afin par exemple de permettre la culture de la ou des cellules dans la première microgoutte.
La deuxième microgoutte peut comporter un actif à tester afin de modéliser le caractère intermittent de la prise d'un médicament. Par exemple une goutte contenant un sphéroïde de cellules mammifères peut être fusionnée toutes les 6 heures avec une microgoutte contenant un actif à tester, notamment un médicament.
Le procédé peut comporter, après l'étape (iii), l'étape (iv) consistant à répéter les étapes (ii) et (iii) pour renouveler encore le milieu de culture de la culture cellulaire opérée dans la première microgoutte.
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les procédés ou les dispositifs selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au procédé selon cet aspect de l'invention.
Le procédé peut être mis en œuvre à l'aide de l'un des systèmes microfluidiques selon les aspects précédents.
VIL Sixième aspect - Procédé de formation de microgouttes gélifiées L'invention a encore pour objet, selon un sixième aspect, un procédé de formation de microgouttes gélifiées multicouches d'au moins une première microgoutte d'un premier milieu gélifïable et d'au moins une deuxième microgoutte d'un deuxième milieu gélifïable sous forme liquide dans un système microfluidique comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, ce procédé comportant les étapes consistant à :
(i) piéger la première microgoutte dans la première zone de piégeage,
(ii) gélifier le premier milieu gélifïable dans la première zone de piégeage,
(iii) piéger la deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage, la première et la deuxième zone de piégeage d'un même piège capillaire étant agencées pour que la première et la deuxième microgoutte soient en contact l'une avec l'autre dans le piège capillaire,
(iv) fusionner la première microgoutte avec la deuxième microgoutte. Ceci permet de former des microgouttes de gel complexe ayant des formes et/ou des propriétés mécaniques, par exemple une porosité et/ou rigidité, et/ou chimiques, par exemple une composition et/ou une concentration, variables.
Le procédé peut comporter une étape (v) ayant lieu avant ou après l'étape (iv) et consistant à gélifier le deuxième milieu gélifïable.
Lorsque l'étape (v) a lieu après l'étape (iv), la gélifïcation permet de former une couche externe du deuxième gel sur la première microgoutte. Ceci permet de former des microgouttes de gel complexe ayant des propriétés mécaniques et/ou chimiques variables radialement. De telles microgouttes de gels pourraient être utilisées avec des cellules souches dont la différenciation est, notamment, contrôlée par la rigidité du gel. Des microgouttes de gels avec des couches d'hydrogels différents contenants des types cellulaires différents peuvent également permettre de modéliser les différentes couches de la peau dans le cadre de tests cosmétiques. Une microgoutte présentant un cœur de collagène et une couche externe d'agarose avec des pores suffisamment petits peut être utilisée pour créer un sphéroïde de neurones dont seuls les projections axonales peuvent s'extraire par les pores de la couche externe.
Lorsque l'étape (v) a lieu avant l'étape (iv), le deuxième milieu gélifïable est gélifié dans la deuxième zone de piégeage. Ceci permet de former des microgouttes de gel complexe ayant des formes, et/ou propriétés mécaniques et/ou chimiques variables radialement. Les microgouttes formées gardent alors la forme et l'agencement des première et deuxième microgouttes avant fusion. La disposition, la forme et le nombre des différentes zones de piégeage permettent donc de contrôler directement la forme de la microgoutte finale. De telles microgouttes peuvent permettre de modéliser des formes complexes. Les formes contrôlées des microgouttes peuvent également servir d'identifiant de ces dernières.
L'étape (v) peut avoir lieu avant ou après l'étape (iii) de piégeage dans la deuxième zone de piégeage.
L'étape (ii) peut avoir lieu avant ou après l'étape (i) de piégeage dans la première zone de piégeage.
Le procédé comporte, de préférence, une étape (vi) consistant à répéter les opérations (iii) à (v).
Les premier et deuxième milieux gélifiables peuvent être différents.
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes. Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les procédés ou les dispositifs selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au procédé selon cet aspect de l'invention.
Le procédé peut être mis en œuvre à l'aide de l'un des systèmes microfluidiques selon les aspects précédents.
VIII. Septième aspect - Procédé pour encapsuler des cellules
L'invention a encore pour objet, selon un septième aspect, un procédé pour encapsuler au moins une première microgoutte et au moins une deuxième microgoutte dans un système microfluidique comportant un piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, l'une de la première microgoutte et de la deuxième microgoutte comportant un milieu gélifiable et l'autre comportant une pluralité de cellules, ce procédé comportant les étapes consistant à :
(i) piéger la première microgoutte dans la première zone de piégeage,
(ii) piéger la deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage, la première et la deuxième zone de piégeage d'un même piège capillaire étant agencées pour que la première et la deuxième microgoutte soient en contact l'une avec l'autre dans le piège capillaire,
(iii) fusionner la première microgoutte avec la deuxième microgoutte,
(iv) gélifier le milieu gélifiable pour encapsuler la pluralité de cellule dans le gel.
Ce procédé permet notamment d'obtenir des sphéroïdes encapsulés dans des hydrogels biologiques. En effet, pour pouvoir former des sphéroïdes dans des microgouttes de manière contrôlée, il faut pouvoir garder le contenu de la goutte liquide pendant le temps de la formation du sphéroïde. L'agarose se prête très bien à ce protocole car c'est un hydrogel thermosensible. Il reste liquide à 37 °C puis se solidifie après 30 min à 4 °C et demeure solidifié après retour à 37 °C. Seulement, les cellules mammifères ne peuvent pas adhérer sur l'agarose et elles ne peuvent pas non plus le digérer. Cette matrice est donc très différente de la matrice extracellulaire rencontrée dans le corps. L'utilisation d'hydrogels tels que par exemple le collagène de type I, la fîbronectine, le Matrigel® ou la gélatine pourrait être préférable pour mieux mimer les conditions naturelles. Seulement, le contrôle de leur gélifïcation est plus ardu. On ne peut par exemple pas garder du collagène de type I liquide pendant longtemps avec des conditions favorables à la culture de cellules (basse température ou pH acide). Si l'on encapsule des cellules dans une goutte de collagène que l'on fait gélifier rapidement après piégeage les cellules, plutôt qu'adhérer entre elles et former un sphéroïde, les cellules vont adhérer au collagène et migrer individuellement le long de ses fibres.
Ce problème peut être résolu grâce au procédé ci-dessus. En effet, on peut encapsuler des cellules dans les premières microgouttes liquides au sein de la première zone de piégeage de sorte à former un sphéroïde. On peut ensuite apporter des deuxièmes microgouttes qui vont se loger dans la deuxième zone de piégeage et qui contiennent un des hydrogels biologiques mentionné plus haut, notamment en forte concentration. Une fois ces deuxièmes microgouttes piégées on fait immédiatement fusionner première et deuxième microgouttes en contact et l'hydrogel biologique, encore liquide, va se mélanger avec la première microgoutte qui contient le sphéroïde. La gélifïcation peut ensuite avoir lieu et va donc encapsuler le sphéroïde dans une matrice extracellulaire représentative des conditions biologiques rencontrées in vivo.
L'étape (ii) peut être réalisée après agrégation des premières cellules, en particulier après formation d'un sphéroïde formé par adhérence des premières cellules entre elles.
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les procédés ou les dispositifs selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au procédé selon cet aspect de l'invention.
Le procédé peut être mis en œuvre à l'aide de l'un des systèmes microfluidiques selon les aspects précédents.
IX. Huitième aspect - Procédé de dilution
L'invention a encore pour objet, selon un huitième aspect, un procédé de dilution d'un composé d'intérêt dans un système microfluidique comportant un premier piège capillaire comportant une première zone de piégeage et n deuxièmes zones de piégeage et un deuxième piège capillaire comportant une première zone de piégeage et p deuxièmes zones de piégeage, n étant différent de p, ce procédé comportant les étapes consistant à:
(i) piéger une première microgoutte comportant le composé d'intérêt dans chaque première zone de piégeage, les premières microgouttes étant de même concentration en composé d'intérêt, puis à
(ii) piéger une deuxième microgoutte d'un composé de dilution dans chaque deuxième zone de piégeage, la première et les deuxième zones de piégeage d'un même piège capillaire étant agencées pour que chaque deuxième microgoutte soit en contact avec au moins une de la première ou des deuxièmes microgouttes du même premier ou deuxième piège capillaire et pour que, dans chacun du premier et du deuxième piège capillaire, au moins une des deuxièmes microgouttes soit en contact avec la première microgoutte du même premier ou deuxième piège capillaire, puis à
(iii) fusionner les premières et deuxièmes microgouttes en contact entre elles de sorte à obtenir des microgouttes de concentrations différentes dans le premier et le deuxième piège capillaire.
Si les premières gouttes contiennent un composé d'intérêt à concentration constante, on peut obtenir un gradient spatial de concentration après la coalescence avec les deuxièmes microgouttes qui peuvent par exemple contenir un diluant. Un tel procédé peut permettre d'obtenir un panel de microgouttes avec des concentrations contrôlées différentes, à partir de microgouttes de même concentration. Cela peut avoir un intérêt par exemple pour former un panel de microgouttes de concentrations différentes pour être utilisée en la chimie combinatoire, dans l'étude la cristallisation des protéines, dans un procédé ultérieur de titrage d'une espèce chimique, ou dans la personnalisation d'un traitement, notamment dans le cas du cancer.
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage de chaque piège capillaire sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les procédés ou les dispositifs selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au procédé selon cet aspect de l'invention.
Le procédé peut être mis en œuvre par le système microfluidique de dilution de microgouttes comportant un premier piège capillaire comportant une première zone de piégeage et n deuxièmes zones de piégeage et un deuxième piège capillaire comportant une première zone de piégeage et p deuxièmes zones de piégeage, n étant différent de p, le premier et deuxième piège capillaire étant configurés pour que les deuxièmes microgouttes piégées dans chacune des deuxièmes zones de piégeage soient en contact avec la première microgoutte piégée dans la première zone de piégeage correspondante dans le premier et le deuxième piège capillaire. De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage de chaque piège capillaire sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les systèmes micro fluidique selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au système micro fluidique selon cet aspect de l'invention.
X. Neuvième aspect - Procédé de criblage
L'invention a encore pour objet, selon un neuvième aspect, un procédé de criblage d'une pluralité de premières microgouttes avec une pluralité de deuxièmes microgouttes dans un système micro fluidique comportant une pluralité de pièges capillaires, chaque piège capillaire présentant une première zone de piégeage et une deuxième zone de piégeage, les premières microgouttes formant un premier panel de microgouttes identiques ou dont au moins y sont différentes et les deuxièmes microgouttes formant un deuxième panel de microgouttes dont au moins z sont différentes, le procédé comportant les étapes consistant à :
(i) piéger une première microgoutte dans chaque première zone de piégeage, et
(ii) piéger une deuxième microgoutte dans chaque deuxième zone de piégeage,
la première et la deuxième zone de piégeage de chaque piège capillaire étant agencées pour que la première et la deuxième microgoutte piégée dans ledit piège capillaire soient en contact l'une avec l'autre dans ce dernier,
(iii) fusionner chaque première microgoutte avec la deuxième microgoutte à son contact de sorte à obtenir dans le système micro fluidique un panel de microgouttes correspondant chacune à une combinaison parmi les différentes combinaisons de premières et deuxièmes microgouttes possibles.
Un tel procédé permet de cribler un grand nombre de conditions de réactions rapidement dans un seul système micro fluidique
Le fait que les microgouttes soient statiques durant la réaction facilite l'obtention de données cinétiques. On tire aussi partie de l'économie en composés obtenue grâce à l'utilisation de volumes très faibles dans les microgouttes. Le premier panel de microgouttes peut comporter des microgouttes différentes au moins par leur contenu, notamment leur concentration en un premier composé d'intérêt.
Le deuxième panel de microgouttes peut comporter des microgouttes différentes au moins par leur contenu, notamment leur concentration en un deuxième composé d'intérêt.
Les premières ou deuxièmes microgouttes peuvent être obtenues par le procédé selon le neuvième aspect de l'invention.
Les premier et deuxième composés peuvent être des composés qui réagissent ensemble et dont on cherche à optimiser les concentrations initiales. Ainsi on va pouvoir réaliser plusieurs réactions en parallèles sur un petit volume afin de déterminer les concentrations en composés initiales donnant les meilleurs résultats.
De préférence, le procédé comporte une étape supplémentaire (iv) d'observation ou de mesure, notamment par la prise d'une image, par une mesure colorimétrique, de fluorescence, spectroscopique (UV, Raman) ou de température, avant l'étape (iii). Une telle étape permet de faire une cartographie de la disposition des différentes microgouttes.
De préférence, le procédé comporte une étape supplémentaire (v) d'observation ou de mesure, notamment par la prise d'une image, par une mesure colorimétrique, de fluorescence, spectroscopique (UV, Raman) ou de température, après l'étape (iii).
En variante, le premier panel de microgouttes comporte des protéines, les premières microgouttes étant identiques, et le deuxième panel de microgouttes comporte à différentes concentrations une solution permettant la cristallisation des protéines, notamment une solution saline. Le procédé peut alors permettre d'étudier la cristallisation des protéines en fonction de la concentration en solution de cristallisation. En effet, les conditions de cristallisation optimales varient d'une protéine à l'autre.
En variante encore, le premier panel de microgouttes comporte un composé, les premières microgouttes étant identiques et le deuxième panel de microgouttes comporte à différentes concentrations une espèce titrante. Cette application peut être particulièrement intéressante dans le cas du dosage de réactifs chers ou disponibles en faibles quantités. En variante encore, le premier panel de microgouttes comporte une ou plusieurs cellules et les deuxièmes microgouttes comporte chacune un médicament à cribler à une concentration déterminée.
Dans une configuration similaire on réalise la culture de cellules du foie sous forme de sphéroïdes dans les premières microgouttes et l'apport dans chacune des deuxièmes zones de piégeage d'une deuxième microgoutte contenant un médicament avec des concentrations différentes, dont on cherche à évaluer la toxicité.
En analysant les résultats de viabilité quelques jours après la coalescence des microgouttes, la concentration qui tue la moitié de la population cellulaire peut être déterminée.
Ce procédé peut aussi permettre d'évaluer les interactions entre différents antibiotiques. Il est possible de créer des microgouttes formant un panel de microgouttes ayant des concentrations en antibiotique A et B différentes et les faire fusionner avec des microgouttes contenant des bactéries. Les microgouttes contenant les bactéries peuvent former un panel de microgouttes de concentrations en bactéries différentes. Ceci permet de faire varier trois paramètres différents dans une seule chambre de piégeage, à savoir la concentration en antibiotique A, la concentration en antibiotique B et la concentration initiale en bactéries.
L'utilisation de la microfluidique permet en outre l'utilisation de très faibles volumes, ce qui peut être très avantageux dans le cadre d'échantillons rares tels que des cellules issues d'une biopsie. Le système peut par exemple être utilisé dans le cadre de la médecine personnalisée et du traitement du cancer. Grâce à ce système on peut mettre en culture, par exemple sous forme de sphéroïdes dans les premières microgouttes, des cellules tumorales d'un patient qui a subi une biopsie et les soumettre à différents actifs à des concentrations multiples via l'apport des deuxièmes microgouttes. Après fusion des couples de microgouttes cellules-actifs, on peut déterminer quel actif va être le plus efficace, et en quelle concentration, pour un patient en particulier, en n'utilisant qu'une seule puce et un nombre minimal de cellules issues de la biopsie.
De préférence, la première et la deuxième zone de piégeage d'un même piège capillaire sont conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes soient différentes.
Une ou plusieurs des caractéristiques décrites précédemment en lien avec les procédés ou les dispositifs selon les aspects précédents de l'invention peuvent s'appliquer au procédé selon cet aspect de l'invention. Le procédé peut être mis en œuvre à l'aide de l'un des systèmes microfluidiques selon les aspects précédents.
L'invention pourra être mieux comprise à la lecture de la description qui va suivre d'exemples de mise en œuvre non limitatifs de l'invention, en regard du dessin ci- annexé, sur lequel :
- la figure 1A illustre en section transversale un piège capillaire selon l'invention,
- la figure 1B est une vue du dessus selon I du piège capillaire de la figure
1A,
- la figure 2 représente de façon schématique en vue du dessus le piège capillaire de la figure 1 après piégeage de deux microgouttes,
- les figures 3 et 4 sont, en vue du dessus, des variantes de piège capillaire avec des microgouttes,
- la figure 5A représente en section transversale une variante de piège capillaire,
- la figure 5B est une vue du dessus selon V du piège capillaire de la figure
5A,
- les figures 6 à 44 sont des variantes, en vue du dessus, de pièges capillaires avec des microgouttes,
- les figures 45 à 47 sont, en section transversale, des variantes de pièges capillaires avec des microgouttes,
- la figure 48 représente, en section transversale, une variante de piège capillaire,
- la figure 49 représente, de façon schématique, en vue du dessus, une chambre de piégeage,
- la figure 50 représente de façon schématique, en vue du dessus, une chambre de piégeage,
- la figure 51 est une vue, en section transversale, d'un piège capillaire,
- la figure 52 est une représentation schématique d'un procédé selon l'invention,
- la figure 53 illustre une variante de procédé de manipulation des microgouttes dans un piège capillaire selon l'invention,
- les figures 54 à 59 illustrent des variantes de procédés de manipulation de microgouttes dans un piège capillaire selon l'invention, - les figures 60 à 62 illustrent des exemples de mise en œuvre de l'invention,
- les figures 63 à 65 illustrent, en vue du dessus, des variantes de pièges capillaires, et
- la figure 66 illustre la capture de microgouttes par un exemple de piège capillaire comportant deux zones exerçant des forces de piégeage différentes sur des première et deuxième microgouttes.
L'invention se rapporte à un procédé de manipulation d'au moins une première et une deuxième microgoutte dans un système microfiuidique.
Le système microfiuidique 5 comporte une paroi supérieure 7 et une paroi inférieure 8 formant entre elles un canal 9 de circulation des microgouttes et au moins un piège capillaire 12.
Piège capillaire
Dans l'exemple illustré sur les figures 1A et 1B, le piège capillaire 12 forme, en section transversale du système microfiuidique, une cavité dans la paroi inférieure 8 de hauteur constante dans laquelle des microgouttes peuvent se loger. Il présente, en vue du dessus, une première zone de piégeage 15 de forme circulaire sur laquelle est adossée une deuxième zone de piégeage 18 de forme triangulaire.
La première et la deuxième zones de piégeage 15 et 18 exercent des forces de piégeage différentes sur une microgoutte donnée, en particulier du fait de leur différence de forme. Ici, la première zone de piégeage 15 exerce une force de piégeage plus grande que la deuxième zone de piégeage 18.
Lors de l'introduction d'une première microgoutte 20 dans le système microfiuidique, cette dernière est piégée dans la zone de piégeage ayant, pour cette microgoutte, la plus grande force de piégeage, ici la première zone de piégeage 15. Lors de l'introduction de la deuxième microgoutte 25, cette dernière est piégée dans la zone de piégeage libre, ici la deuxième zone de piégeage 18, comme cela est illustré sur la figure
2.
Sur les figures, les premières microgouttes 20 sont représentées en noir et les deuxièmes microgouttes 25 sont représentées transparentes sans pour autant que cela représente une différence de contenu particulière entre les deux microgouttes.
La première zone de piégeage 15 présente un diamètre a sensiblement égal au diamètre apparent Di, en vue du dessus, de la première microgoutte 20, une fois piégée dans la première zone de piégeage. Les deux microgouttes piégées 20 et 25 sont en contact l'une avec l'autre du fait notamment de la faible distance entre les deux zones de piégeage 15 et 18 relativement aux diamètres des deux microgouttes 20 et 25. De plus, les deux microgouttes 20 et 25 sont maintenues en contact du fait de la forme triangulaire de la deuxième zone de piégeage 18. En effet, la deuxième microgoutte 25, en étant en contact avec deux parois opposées 27 et 28 de la deuxième zone de piégeage 18 s'éloignant l'une de l'autre en direction de la première zone de piégeage 15, est entraîné, par sa tendance naturelle à toujours minimiser son énergie de surface, à se déplacer en translation entre les deux parois opposées 27 et 28 en direction de l'élargissement des parois 27 et 28, c'est à dire vers la première zone de piégeage 15 et donc la première microgoutte 20.
Sur les figures 1A et 2, les deux parois 27 et 28 forment entre elles un angle de divergence a sensiblement égal à 45°.
Dans l'exemple illustré sur la figure 2, la première microgoutte 20 présente un diamètre Di plus grand que celui D2 de la deuxième microgoutte 25.
La deuxième zone de piégeage 18 exerce sur la deuxième microgoutte 25 une force de piégeage plus grande que celle qu'elle exercerait sur la première microgoutte 20. En effet, bien que le design de la deuxième zone de piégeage soit le même quel que soit le diamètre de la microgoutte, le diamètre de la deuxième microgoutte 25 s'adapte mieux à la forme et à la taille de la deuxième zone de piégeage 18 que celui de la première microgoutte 20. Mais il peut en être autrement et la deuxième microgoutte 25 peut être de même diamètre que la première microgoutte 20.
En variante, la première et la deuxième microgoutte 20 et 25 sont différentes l'une de l'autre par une autre de leurs propriétés, notamment leur état de surface, leur viscosité ou leur poids.
En variante illustrée sur les figures 3 et 4, le piège capillaire 10 comporte deux cavités disjointes juxtaposées formant respectivement la première zone de piégeage 15 de forme circulaire et la deuxième zone de piégeage 18 de forme triangulaire. Les deux zones de piégeage 15 et 18 du piège capillaire sont suffisamment proches pour que les deux microgouttes 20 et 25 piégées soient en contact l'une avec l'autre. De préférence, la distance e entre les centres de gravité des zones de piégeage 15 et 18 est inférieure, comme illustré sur la figure 4, ou égale, comme illustré sur la figure 3, à la somme SR des rayons des deux microgouttes.
En variante encore illustré sur les figures 5A et 5B, la première zone de piégeage peut être de forme hexagonale et la première zone de piégeage 15 peut présenter une hauteur hi différente de celle h2 de la deuxième zone de piégeage 18, notamment hi est supérieure à h2. La première zone de piégeage 15 exerce alors une force de piégeage plus grande que la deuxième zone de piégeage 18.
En variante illustré sur la figure 6, la deuxième zone de piégeage 18 a la forme d'un long triangle présentant un angle de divergence a faible, ici sensiblement égale à 10°, permettant de piéger un chapelet de deuxièmes microgouttes 25, ici deux deuxièmes microgouttes 25a et 25b, en contact entre elles. On peut alors considérer que la deuxième zone de piégeage 18 est en fait composé de deux deuxièmes zones de piégeage 18a et 18b permettant de piéger chacune une deuxième microgoutte 25a et 25b. La deuxième microgoutte 25a est ici reliée à la première goutte 20 par l'intermédiaire de la deuxième microgoutte 25b. Les forces de piégeage qu'exerce les deuxièmes zones de piégeage 18a et 18b sur les deuxièmes microgouttes 25a et 25b peuvent être différentes en fonction de leurs positions. Ici, la deuxième zone de piégeage 18b exerce une force de piégeage plus forte sur la deuxième microgoutte 25b la plus proche de la première zone de piégeage 15. Mais il pourrait en être autrement selon la forme de la deuxième zone de piégeage 18.
En variante non illustré, les deux deuxièmes zones de piégeage 18a et 18b peuvent exercer des forces identiques sur les deuxièmes microgouttes 25a et 25b piégées.
En variante non illustré, le piège capillaire peut présenter plus de deux deuxièmes zones de piégeages configurées pour former un chapelet de deuxièmes microgouttes piégées lui-même en contact, par au moins une des deuxièmes microgouttes le formant, avec la première microgoutte piégée dans la première zone de piégeage.
Il est ainsi possible d'envisager des formes de pièges capillaires plus complexes comportant une pluralité de zones de piégeage configurées pour que les microgouttes piégées soient toutes reliées entre elles directement ou par l'intermédiaire des autres microgouttes.
En variante illustré sur les figures 7 à 9, le piège capillaire 12 présente une pluralité de deuxièmes zones de piégeage 18 identiques réparties autour de la première zone de piégeage 15 de sorte que chaque deuxième microgoutte 25 piégée par une des deuxièmes zones de piégeage 18 soit en contact avec la première microgoutte 20.
Les deuxièmes zones de piégeage 18 peuvent être équiréparties autour de la première zone de piégeage 15 comme cela est illustré. Mais il peut en être autrement.
En variante illustré sur la figure 10, le piège capillaire 12 présente une pluralité de premières zones de piégeage 15 disposées de sorte que les premières microgouttes piégées par ces dernières sont chacune en contact avec au moins une autre première microgoutte et une pluralité de deuxième zone de piégeage 18. Ici, le piège capillaire 12 présente deux premières zones de piégeage 15 accolées et deux deuxièmes zones de piégeage, une accolée à chaque première zone de piégeage.
En variante illustré sur la figure 11, le piège capillaire 12 peut présenter une pluralité de deuxièmes zones de piégeage 18a et 18b de formes différentes. Les deuxièmes zones de piégeages peuvent être destinées à recevoir des deuxièmes microgouttes 25a et 25b différentes. Par exemple, comme illustré, le piège capillaire présente une deuxième zone de piégeage 18a formant une unique cavité avec la première zone de piégeage 15 et une deuxième zone de piégeage 18b disjointe de la première zone de piégeage 15. Les deuxièmes zones de piégeage 18a et 18b exercent des forces de piégeage différentes sur une même microgoutte. La deuxième zone de piégeage 18a est destinée à piéger une deuxième microgoutte 25a de diamètre plus grand que celui de la deuxième microgoutte 25b piégée par la deuxième zone de piégeage 18b.
L'invention n'est pas limitée aux exemples de forme du piège capillaire 12 décrits ci-dessus. Le piège capillaire 12 peut prendre différentes formes, notamment en fonction de l'application recherchée. Les figures 12 à 45 illustrent des formes envisageables.
Par exemple, comme illustré sur la figure 12, la première zone de piégeage 15 peut être de forme polygonale, notamment carré, et la deuxième zone de piégeage 18 de forme triangulaire et accolée à un côté du carré.
En variante illustré à la figure 13, la deuxième zone de piégeage 18 est accolée à un angle du carré formant la première zone de piégeage 15.
En variante encore illustré sur la figure 14, la deuxième zone de piégeage 18 est de forme rectangulaire, notamment carré.
Comme illustré sur la figure 15, la deuxième zone de piégeage 18 peut s'élargir en direction de la première zone de piégeage 15 et présenter des parois opposées 27 et 28 présentant en vue de dessus un profil courbe, la deuxième zone de piégeage 18 s 'effilant vers son extrémité.
Comme illustré sur la figure 16, le piège capillaire 12 peut présenter une forme de cœur, les lobes du cœur formant deux premières zones de piégeage 15 et la pointe du cœur formant la deuxième zone de piégeage 18. Comme illustré sur la figure 17, la première zone de piégeage 15 peut être de forme pentagonale, la deuxième zone de piégeage 18 s'étendant à partir d'un coin du pentagone.
Comme illustré sur la figure 18, le piège capillaire 12 peut être de forme hexagonale, la deuxième zone de piégeage 18 s'étendant à partir d'un côté de l'hexagone.
La première zone de piégeage 15 peut être de forme carrée, comme illustré sur la figure 19, ou de forme circulaire, comme illustré sur la figure 20, et la deuxième zone de piégeage 18 peut être de forme circulaire.
En variante, la deuxième zone de piégeage 18 est de forme triangulaire mais raccordé à la première de piégeage 15 par un de ses angles, comme illustré sur la figure 21. La deuxième zone de piégeage 18 s'élargit donc vers l'extérieur.
En variante encore, la deuxième zone de piégeage 18 est de forme polygonale, notamment hexagonale, comme illustré sur la figure 22.
En variante encore, le piège capillaire 12 peut comporter deux deuxièmes zones de piégeage 18 accolées à la première zone de piégeage 15à des angles opposés de cette dernière, comme illustré sur la figure 33.
Comme illustré sur la figure 23, le piège capillaire 12 peut présenter une première zone de piégeage 15 de forme ovale et deux deuxièmes zones de piégeage 18 de forme triangulaire accolées à la première zone de piégeage et s'étendant en regard l'une de l'autre de part et d'autre de cette dernière à partir des grands côtés de l'ovale.
En variante illustré sur la figure 34, les deuxièmes zones de piégeage 18 sont de la même forme que celle de la figure 15
Comme illustré sur la figure 24, le piège capillaire 12 peut présenter deux deuxièmes zones de piégeage 18 non équiréparties autour de la première zone de piégeage 15 mais formant entre elles un angle d'écartement β.
La première zone de piégeage 15 peut être de forme rectangle et la deuxième zone de piégeage 18 de forme carré accolée à la première zone de piégeage 15 par un petit côté du rectangle. Selon la taille des premières microgouttes 20, la première zone de piégeage 15 peut alors piéger une unique première microgoutte 20, comme illustré sur la figure 25, ou une pluralité de premières microgouttes 20, comme illustré sur la figure 26
En variante illustré sur la figure 27, la deuxième zone de piégeage 18 peut être accolée à la première zone de piégeage 15 par un des grands côtés du rectangle. La première zone de piégeage 15 peut être de forme ovale et la deuxième zone de piégeage 18 accolé à cette dernière à partir de son grand côté, comme illustré sur la figure 28, ou par son petit côté, comme illustré sur la figure 29.
Le piège capillaire peut comporter une pluralité de deuxièmes zones de piégeage 18, dont au moins deux sont différentes, notamment par leurs tailles, comme cela est illustré sur la figure 30.
Dans l'exemple illustré sur la figure 31, le piège capillaire 12 présente une forme de courge calebasse dont la base forme la première zone de piégeage 15 et la tête forme la deuxième zone de piégeage 18.
En variante illustré sur la figure 32, le piège capillaire 12 est de forme triangulaire, la partie proche de la base plus large formant la première zone de piégeage 15 et la pointe formant la deuxième zone de piégeage 18.
Dans l'exemple illustré sur la figure 35, la première zone de piégeage 15 est de forme carrée et le piège capillaire 12 présente deux deuxièmes zones de piégeage 18 de même forme carrée accolées chacune par un de leur coin à un coin de la première zone de piégeage 15.
Dans les exemples illustrés sur les figures 36 à 41, le piège capillaire 12 présente trois deuxièmes zones de piégeage 18, la première et les deuxièmes zones de piégeage 15 et 18 pouvant avoir chacune toute les formes décrites précédemment.
Dans les exemples illustrés sur les figures 42 à 44, le piège capillaire 12 présente une pluralité de deuxièmes zones de piégeage différentes par leurs formes. Par exemple, une des deuxièmes zones de piégeage 18a est de forme triangulaire et l'autre des deuxièmes zones de piégeage 18b est de forme rectangle, le rectangle étant suffisamment long pour former une pluralité de deuxièmes zones de piégeage et piéger un chapelet de deuxième microgoutte 25, comme cela est illustré sur la figure 42, ou les deuxièmes zones de piégeage peuvent avoir les formes décrites précédemment.
En coupe transversale, la première zone de piégeage 15 et la deuxième zone de piégeage 18 peuvent être de hauteur constante sur toute leur largeur.
En variante illustré sur la figure 45, la première zone de piégeage 15 présente, en coupe transversale, un bord incliné vers le fond de la cavité.
En variante encore illustré sur la figure 46, la deuxième zone de piégeage 18 présente une paroi inclinée vers la première zone de piégeage. Ceci permet notamment de maintenir la deuxième microgoutte 25 en contact avec la première microgoutte 20. En variante encore illustré sur la figure 47, la première et la deuxième zone de piégeage présente au moins une paroi inclinée.
En variante illustré sur la figure 48, le piège capillaire 12 est formé au moins partiellement par une cavité de la paroi supérieure 7 du système micro fluidique.
En variante, le piège capillaire 12 est formé au moins partiellement par une cavité d'une des parois latérales du système micro fluidique.
En variante illustré sur la figure 47, le piège capillaire est formé à la fois par une cavité de la paroi inférieure 8 et de la paroi supérieure 7.
En variante illustré sur les figures 63 à 65, le piège capillaire est anisotrope et il comporte une pluralité de zones de piégeage présentant une même force de piégeage, de sorte que le piège capillaire piège une pluralité de microgouttes identiques dans ses différentes zones. Par exemple, comme illustré sur les figures 61 et 62, le piège capillaire 12 peut être de forme sensiblement triangulaire et piéger, selon la taille des microgouttes, 3 ou 4 microgouttes identiques. En variante illustré sur la figure 63, le piège capillaire 12 présente une forme en étoile à cinq branches et peut piéger 5 ou 6 microgouttes identiques.
Dispositif m ici o fluidique
Le canal 9 de circulation des microgouttes peut comporter une pluralité de pièges capillaires 12.
En particulier, le canal 9 peut comporter une chambre de piégeage 30 bidimensionnelle dans laquelle les pièges capillaires 12 sont répartis spatialement selon deux directions spatiales en tableau ou matrice, comme cela est illustré sur la figure 49. Sur cette figure, les pièges capillaires 12 sont agencés à égale distance les uns des autres sous forme d'une pluralité de rangées, mais il peut en être autrement. Ils peuvent être disposés selon n'importe quel schéma, périodique ou non.
Le nombre de pièges capillaires 12 dans la chambre de piégeage 30 peut aller d'un seul par chambre à plusieurs milliers par cm2.
La distance p définie entre les centres de gravité des pièges capillaires 12 est de préférence supérieure ou égale à la taille des microgouttes les plus grosses destinées à être piégées, notamment supérieure ou égale au diamètre apparent, en vue du dessus, d'une première goutte confinée dans le canal entre les parois 7 et 8 en dehors des pièges capillaires, par exemple compris entre 20 μιη et 1 cm.
Le nombre de pièges capillaires peut être supérieur ou égal à 200 pièges capillaires par cm2, mieux 2000 pièges capillaires par cm2. Ainsi on peut réaliser la combinaison contrôlée de microgouttes dans des centaines, voire des dizaines de milliers de pièges en parallèle dans la même chambre de piégeage 30.
Les pièges capillaires 12 peuvent être tels que décrits précédemment.
Les pièges capillaires 12 peuvent tous être identiques.
En variante, au moins deux pièges capillaires 12 peuvent être différents, notamment par leurs formes, tailles, hauteurs ou orientations, ou par le nombre, la forme, la hauteur ou l'orientation des première(s) et deuxième(s) zones de piégeage 15 et 18. Ceci permet d'avoir des conditions différentes en fonction du piège capillaire 12.
En variante non illustré, le canal 9 peut être unidimensionnel et comporter une rangée de pièges capillaires 12 réparties sur sa longueur.
L'invention n'est pas limitée aux formes de système microfluidique décrits ci-dessus. Le système microfluidique peut prendre différentes formes, notamment en fonction de l'application recherchée.
Microgouttes
De préférence, le canal 9 est rempli d'un fluide dans lequel les microgouttes ne sont pas miscibles. Ce fluide peut être immobile ou en mouvement. Lorsque ce dernier est en mouvement, le flux de fluide est, de préférence, orienté selon des lignes de circulation de fluide (non représentée) et circule d'une entrée de fluide 31 à une sortie de fluide 32.
Les microgouttes sont, par exemple, des microgouttes aqueuses dans un liquide huileux ou des microgouttes d'huile dans un liquide aqueux.
De préférence, les premières et deuxièmes microgouttes 20 et 25 présentent des diamètres Di et Z½ de l'ordre du micromètre, notamment compris entre 20 et 5000 μιη.
Les premières microgouttes 20 sont, de préférence, différentes des deuxièmes microgouttes 25, notamment de par leurs tailles et/ou leurs compositions.
Les premières microgouttes 20, respectivement les deuxièmes microgouttes 25, peuvent former un panel de microgouttes dont au moins un certain nombre sont différentes.
Les premières et/ou les deuxièmes microgouttes 20 et 25 peuvent comporter un composé d'identification permettant leur identification avant, pendant et/ou après la coalescence des première(s) et deuxième(s) microgouttes 20 et 25 en contact. Ce ou ces composés d'identification peuvent être par exemple des billes ou des particules en un certain nombre, des composés de couleurs ou de formes variées ou des composés émettant un signal colorimétrique ou de fluorescence proportionnelle à leur concentration dans la microgoutte. Dans le cas d'un panel de premières microgouttes et/ou d'un panel de deuxièmes microgouttes comportant un composé d'intérêt dans des concentrations différentes et/ou des composés d'intérêt différents, il est ainsi possible d'associer la position d'une première et/ou deuxième microgoutte dans la chambre de piégeage avec sa composition afin d'établir une cartographie des microgouttes piégées dans la chambre de piégeage.
En variante, le ou les composés d'identification des premières microgouttes interagissent avec un ou plusieurs composés d'identification des deuxièmes microgouttes de sorte à permettre l'identification de la microgoutte obtenue après fusion. Par exemple, la fusion des microgouttes peut entraîner une réaction chimique dont au moins un des produits peut être identifié.
De préférence, le canal 9 est rempli d'un fluide contenant un surfactant. Ce dernier permet la stabilisation des microgouttes et la reproductibilité de leur formation. Les surfactants permettent de plus d'empêcher la coalescence spontanée des microgouttes en cas de contact pendant leur acheminement du dispositif de production aux pièges capillaires ou dans les pièges capillaires.
Le surfactant est, par exemple, pour des microgouttes aqueuses un composé choisi parmi le PEG-di-Krytox dans une huile fluorée ou le SPAN®80 dans une huile minérale.
Le surfactant est, par exemple, pour des microgouttes d'huile du sodium dodecyl sulfate.
En variante, les microgouttes sont stabilisées par un autre moyen, notamment les microgouttes peuvent être gélifiées, ou stabilisé par adsorption de nanoparticule amphiphiles comme cela est décrit dans l'article de Pan, M., Rosenfeld, L., Kim, M., Xu, M., Lin, E., Derda, R., & Tang, S. K. Y. (2014). Fluorinated Pickering Emulsions Impede Interfacial Transport and Form Rigid Interface for the Growth of Anchorage-Dependent Cells. Applied Materials & Interfaces, 6, 21446-21453, incorporé ici en référence.
Procédé de manipulation
Un exemple de procédé de manipulation des premières et deuxièmes microgouttes est illustré sur la figure 52.
Dans l'étape 40, les premières microgouttes 20 sont produites. De nombreux procédés ont déjà été proposés pour former de telles premières microgouttes dans une phase mobile. On peut par exemple citer les exemples de procédé : a) procédé dit de « flow-focusing » décrit par exemple dans SX. Anna, N. Bontoux et H.A. Stone, « Formation of dispersions using 'Flow- Focusing' in microchannels », Appl. Phys. Lett. 82, 364 (2003), dont le contenu est intégré ici par référence,
b) procédé dit de « step emulsification » décrit par exemple par R.
Seemann, M. Brinkmann, T. Pfohl, and S. Herminghaus, dans "Droplet based micro fluidics.," Rep. Prog. Phys., vol. 75, no. 1, p. 016601, Jan. 2012, dont le contenu est intégré ici par référence, c) procédé combinant les procédés de « flow-focusing » et de « step emulsification », décrit par exemple par V. Chokkalingam, S. Herminghaus, and R. Seemann, dans "Self-synchronizing pairwise production of monodisperse droplets by microfluidic step emulsification," Appl. Phys. Lett., vol. 93, no. 25, p. 254101, 2008, dont le contenu est intégré ici par référence,
d) procédé dit à « jonction en T » décrit par exemple par G. F.
Christopher and S. L. Anna, dans "Microfluidic methods for generating continuous droplet streams," J. Phys. D. Appl. Phys., vol. 40, no. 19, pp. R319-R336, Oct. 2007, dont le contenu est intégré ici par référence,
e) procédé dit « à gradient de confinement» décrit par exemple par R.
Dangla, S. C. Kayi, and C. N. Baroud, dans "Droplet microfluidics driven by gradients of confinement.," Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 110, no. 3, pp. 853-8, Jan. 2013., dont le contenu est intégré ici par référence, ou
f) Procédé de « micro-segmented flows » décrit par exemple par A.
Funfak, R. Hartung, J. Cao, K. Martin, K. H. Wiesmuller, O. S. Wolfbeis, and J. M. Kôhler, dans "Highly resolved dose-response fonctions for drug-modulated bacteria cultivation obtained by fluorometric and photometric flow-through sensing in microsegmented flow," Sensors Actuators, B Chem., vol. 142, no. 1, pp. 66-72, 2009, dont le contenu est intégré ici par référence, dans lequel deux solutions en proportions différentes et contrôlées sont mélangées au niveau d'une fonction hors du système microfluidique pour former des gouttes microlitriques séparées par une phase immiscible puis procédé de division de ces gouttes en microgouttes en les injectant par exemple dans un système microfluidique contenant une pente.
Ces procédés permettent notamment de former une pluralité de microgouttes de dimensions sensiblement égales. Les dimensions des microgouttes obtenues peuvent être contrôlées en modifiant les paramètres de formation des microgouttes, notamment la vitesse de circulation des fluides dans le dispositif et/ou la forme du dispositif.
La production des premières microgouttes 20 peut être faite sur le même système microfluidique que le procédé ou sur un dispositif différent. Dans ce dernier cas, les premières microgouttes 20 peuvent être stockées dans un ou plusieurs récipients extérieurs avant d'être injectées dans le système microfluidique. Ces premières microgouttes 20 peuvent être toutes identiques ou certaines d'entre elles peuvent être de différentes compositions, concentrations et/ou tailles.
Après formation de ces premières microgouttes 20, ces dernières peuvent être acheminées jusqu'au piège capillaire 12 par entraînement par un flux d'un fluide et/ou par des pentes ou des reliefs en forme de rails du canal 9. Dans les deux cas, l'addition de rails peut permettre d'optimiser le remplissage des pièges capillaires 12, de manière sélective, par exemple en combinaison avec l'utilisation d'un laser infra-rouge, comme cela est décrit par E. Fradet, C. McDougall, P. Abbyad, R. Dangla, D. McGloin, and C. N. Baroud, dans "Combining rails and anchors with laser forcing for sélective manipulation within 2D droplet arrays. " Lab Chip, vol. 11, no. 24, pp. 4228-34, Dec. 2011.
Si la production des microgouttes est réalisée hors du système microfluidique, leur transport du stockage au système microfluidique peut se faire directement via un tube reliant par exemple le système de production et le système de piégeage ou par aspiration et injection avec une seringue.
Les premières microgouttes 20 sont entraînées dans le système microfluidique de sorte que la force d'entraînement qu'elles subissent soit inférieure à la force de piégeage des premières zones de piégeage 15 sur les premières microgouttes 20. Les premières microgouttes 20 sont alors piégées, dans l'étape 42, dans les pièges capillaire 12, en particulier dans les premières zones de piégeage 15. Si le flux d'entraînement exerce sur les premières microgouttes 20 une force d'entraînement sur les premières microgouttes 20 supérieure à la force de piégeage des deuxièmes zones de piégeage 18, ces dernières ne sont pas piégées dans les deuxièmes zones de piégeage 18 qui restent libres.
Dans le cas contraire, les premières microgouttes 20 peuvent être piégées dans les deuxièmes zones de piégeage 18, en particulier si les tailles des pièges et des gouttes sont adaptées. Il est alors possible de les chasser de ces dernières en augmentant la force d'entraînement appliquée à l'ensemble des premières microgouttes 20, par exemple en augmentant la vitesse du flux de fluide ou, lorsqu'il n'y en a pas, en ajoutant un flux de fluide dans une étape 44.
En variante, les premières microgouttes 20 peuvent être formées par un procédé dit de « cassage des gouttes dans des pièges capillaires » décrit par exemple dans la demande internationale WO 2016/059302, dont le contenu est intégré ici par référence. Dans ce cas, les premières microgouttes 20 sont directement formées dans les premières zones de piégeage 15.
Dans l'étape 46, les deuxièmes microgouttes 25 sont produites. Cette étape est représentée après l'étape 44 mais elle pourrait avoir lieu avant. Les deuxièmes microgouttes 25 peuvent être produites et introduites dans le système micro fluidique tel que décrit précédemment en relation avec les premières microgouttes 20.
Les deuxièmes microgouttes 25 sont entraînées dans le système microfluidique de sorte que la force d'entraînement qu'elles subissent soit inférieure à la force de piégeage des deuxièmes zones de piégeage 18 sur les deuxièmes microgouttes 25. Les deuxièmes microgouttes 25 sont alors piégées, dans l'étape 48, dans les deuxièmes zones de piégeage 18. Lorsque les deuxièmes microgouttes 25 sont entraînées par un flux de fluide, ce dernier exerce sur les premières microgouttes 20 piégées dans les premières zones de piégeage 15 une force d'entraînement, de préférence inférieure ou égale à la force de piégeage des premières zones de piégeage 15 sur les premières microgouttes 20 de sorte que ces dernières restent piégées.
A chaque stade, le procédé peut comporter une étape de première mesure de l'état du système. Cette mesure peut être une simple image, ou par exemple une mesure colorimétrique, de fluorescence, spectroscopique (UV, Raman) ou de température. Cette mesure peut être particulièrement utile dans le cadre de l'utilisation de panels de premières et/ou deuxièmes microgouttes 20 différentes comportant un composé d'identification tel que décrit précédemment. Lorsque plusieurs microgouttes sont en contact dans un même piège, il est possible de les fusionner de façon contrôlée pour mélanger leurs contenu dans l'étape 50. Cette coalescence peut être sélective ou non.
Pour fusionner l'ensemble des microgouttes en contact dans le système microfluidique, notamment dans la chambre de piégeage 30, ce dernier est perfusé avec un fluide dépourvu de surfactant. La concentration de surfactant dans le fluide du système microfluidique diminue, ce qui permet de déplacer l'équilibre d'adsorption de surfactant à l'interface vers la désorption. Les microgouttes perdent leur effet stabilisateur et fusionnent spontanément avec les microgouttes avec lesquelles elles sont en contact.
En variante, le système microfluidique est perfusé avec un fluide contenant un agent déstabilisant. L'agent déstabilisant est par exemple le 1H,1H,2H,2H- perfluorooctan-l-ol dans une huile fluorée dans le cas de microgouttes aqueuses.
En variante encore, l'ensemble des microgouttes en contact dans le système microfluidique, notamment dans la chambre de piégeage 30, sont fusionnées en amenant un stimulus physique externe, comme des ondes mécaniques, des ondes de pression, un changement de température ou un champ électrique. Comme cela est illustré sur la figure 50, des électrodes 35 peuvent être placées de part et d'autre de la chambre de piégeage de sorte à fusionner l'ensemble des microgouttes en contact entre ces dernières.
Pour fusionner les microgouttes de manière sélective, un laser infra-rouge peut être utilisé, comme cela est décrit par E. Fradet, P. Abbyad, M. H. Vos, and C. N. Baroud, dans Parallel measurements of réaction kinetics using ultralow-vo lûmes. " Lab Chip, vol. 13, no. 22, pp. 4326-30, Oct. 2013, ou des électrodes localisées 37 au niveau des interfaces de microgouttes entre les zones de piégeage peuvent être activées, comme cela est illustré sur la figure 51 , ou des ondes mécaniques peuvent être focalisées en un ou plusieurs points.
L'invention n'est pas limitée aux exemples de coalescence décrits ci-dessus. Toute méthode permettant de déstabiliser l'interface entre deux microgouttes en contact peut être utilisée pour fusionner les microgouttes.
Il est alors possible d'effectuer une mesure de l'état des microgouttes obtenues et/ou d'observer en temps réel ces dernières. Cela permet par exemple l'étude cinétique de réactions chimiques ou biochimiques.
Piégeage sélectif
Lorsque le ou les pièges capillaires 12 présentent une pluralité de deuxièmes zones de piégeage 18, la position de la ou des deuxièmes zones de piégeage 18 par rapport à la direction et au sens de la force d'entraînement s'exerçant sur les deuxièmes microgouttes 25 peut permettre d'effectuer un piégeage sélectif.
Prenons le cas d'un piège capillaire avec deux deuxièmes zones de piégeage 18m et 18v disposés de part et d'autre d'une première zone de piégeage 15 et aligné selon la direction de la force d'entraînement exercée, comme cela est illustré sur la figure 53. Après le piégeage de la première microgoutte 20 au niveau de la première zone de piégeage 15 selon l'étape 44, on apporte des deuxièmes microgouttes 25m avec une force d'entraînement orientée selon la direction Fi selon une étape 48a. Si les forces de piégeage dans les deuxièmes zones de piégeage 18m et 18v sont suffisamment faibles, une deuxième microgoutte 25m n'est piégée que dans la deuxième zone de piégeage 18m située en amont de la première microgoutte 20 piégée relativement à la direction Fi . Même si la deuxième zone de piégeage 18v en aval est identique, sa situation vis-à-vis des deuxièmes microgouttes 25m est différente car, dans le cas d'un fluide, les lignes de circulation de deuxièmes microgouttes 25, en contournant la première microgoutte 20, évite la deuxième zone de piégeage 18v. De plus, le maintien de la deuxième microgoutte 25m piégée en amont est favorisé par la présence de la première microgoutte 20 piégée sur laquelle elle peut s'appuyer. Après avoir piégé une deuxième microgoutte 25m en amont, il est possible d'exercer une force d'entraînement orientée selon une direction F2 opposée à Fi sur des deuxièmes microgouttes 25v pour piéger une de ces dernières dans la deuxième zone de piégeage 18v encore libre, selon une étape 48b.
Comme cela est illustré sur la figure 54, il est également possible d'utiliser la position de la ou des deuxièmes zones de piégeage 18 par rapport à la direction et au sens de la force d'entraînement s'exerçant sur les deuxièmes microgouttes 25 pour effectuer une libération sélective en vue par exemple de piéger une autre deuxième microgoutte 25 différente dans un ou plusieurs des deuxièmes zones de piégeage 18. Prenons le cas du piège capillaire précédent, si les forces de piégeage dans les deuxièmes zones de piégeage 18m et 18v sont suffisamment fortes pour piéger chacune une deuxième microgoutte 25m quel que soit la direction de la force d'entraînement exercée sur les deuxièmes microgouttes 25m à l'étape 48a, le fait que la deuxième microgoutte 25m en amont par rapport à une force d'entraînement orientée selon la direction F3 est mieux retenue que celle en aval lorsqu'une telle force d'entraînement est appliquée peut être utilisé pour libérer sélectivement la deuxième microgoutte 25m piégée en aval selon une étape 52. En effet, la première microgoutte 25m peut se déformer et s'appuyer sur la première microgoutte 20 piégée dans la première zone de piégeage 15, il faut donc une force plus forte pour la libérer que pour libérer la deuxième microgoutte 25m en aval. Il est alors possible de piéger dans la deuxième zone de piégeage 18v libérée une deuxième microgoutte 25v différente de la deuxième microgoutte 25m déjà piégée dans l'étape 48b.
Exemple de chronologie de piégeage de microgouttes
Dans un exemple de mise en œuvre, illustré à la figure 66, laquelle représente l'intensité des forces de piégeage comparativement aux traînées hydrodynamiques en ordonnées, et le temps en abscisses, le procédé comporte les étapes suivantes, pour un piège capillaire présentant deux zones de piégeage :
- piégeage d'une première microgoutte dans une première zone du piège capillaire, la force de piégeage Fl exercée par la première zone sur la première microgoutte étant supérieure à la force Ftl de traînée hydrodynamique exercée par l'écoulement sur la première microgoutte, de telle sorte que cette dernière reste piégée dans la première zone, la force de traînée Ftl étant comprise entre Fl et F2, F2 désignant la force de piégeage exercée sur la première microgoutte par la deuxième zone du piège capillaire,
- ensuite, piégeage d'une deuxième microgoutte dans la deuxième zone du piège capillaire, la force de traînée hydrodynamique Ft2 exercée sur la deuxième microgoutte par l'écoulement durant le chargement de la deuxième microgoutte dans la deuxième zone étant comprise entre F2 et
F3, avec F3 de préférence inférieure à Fl, F3 étant la force de piégeage exercée par la deuxième zone du piège sur la deuxième microgoutte. La force de traînée Ft2 est inférieure à Fl .
On obtient ainsi un piégeage sélectif des deux microgouttes, dans les deux zones du piège capillaire respectivement.
Piégeage selon la taille des microgouttes
Les deuxièmes zones de piégeage 18 des différents pièges capillaires 12 dans un même système microfluidique peuvent avoir des propriétés différentes, notamment des tailles différentes. Ceci permet, par exemple, de piéger des deuxièmes microgouttes 25 différentes dans les pièges capillaires 12 différents afin d'obtenir des microgouttes différentes. Par exemple, pour une concentration donnée d'un élément compris dans les deuxièmes microgouttes, la quantité de ses éléments contenus dans une deuxième microgoutte dépend de la taille de ladite deuxième microgoutte. Ainsi, en produisant des deuxièmes zones de piégeage 18 par exemple de tailles différentes dans la même chambre de piégeage 30, il est possible de piéger sélectivement des deuxièmes microgouttes 25 de tailles différentes, à chaque taille de deuxième zone de piégeage 18 correspondant une taille de deuxième microgoutte 25.
La Figure 55 illustre trois pièges capillaires 12a, 12b et 12c présentant des deuxièmes zones de piégeage 18a, 18 et 18c de tailles différentes. Les premières zones de piégeage 15 sont remplies avec des premières microgouttes 20. Des deuxièmes microgouttes 25a, 25b et 25c, toutes de même concentration mais de tailles différentes sont apportées. Les deuxième zones de piégeage 18a, 18b et 18c correspondent chacune à une taille de deuxième microgoutte, les deuxièmes microgouttes 25a, 25b et 25c sont alors piégées dans la deuxième zone de piégeage 18a, 18b ou 18c qui leur correspond le mieux.
Il est préférable de placer les pièges capillaires 12a, 12b et 12c par forces de piégeage des deuxièmes zones de piégeage 18a, 18b et 18c par rapport à la plus grande des deuxièmes microgouttes 18a croissantes dans le sens de la force d'entraînement des deuxièmes microgouttes, notamment dans le sens du flux de fluide, dans le système microfluidique. Ainsi les deuxièmes microgouttes 25a, 25b et 25c rencontre d'abord les deuxièmes zones de piégeage 18c dans lesquels seules les deuxièmes microgouttes 25c les plus petites sont piégées, puis les deuxièmes zones de piégeage 18b dans lesquels seules les deuxièmes microgouttes 25b sont piégées et enfin les deuxièmes zones de piégeage 18a dans lesquels les deuxièmes microgouttes 25a les plus grandes sont piégées.
En variante, les microgouttes 25 a, 25b et 25 c sont différentes par un autre de leurs paramètres, notamment comportent des éléments différents.
Ceci permet d'obtenir un panel de microgouttes dont au moins certaines sont différentes, notamment par leur concentration en un composé et/ou par leur composition.
Coalescence séquentielle
Les étapes 46, 48 et 50 peuvent être répétées comme cela est illustré sur la figure 56 pour effectuer une coalescence séquentielle. Dans chaque piège capillaire 12, la microgoutte obtenue après l'étape 50 devient la nouvelle première microgoutte 80 ayant pour volume la somme des volumes de la ou des premières microgouttes 20 et de la ou des deuxièmes microgouttes 25 fusionnées dans le piège capillaire 12. Comme la ou les deuxièmes zones de piégeage 18 sont à nouveau libres, on peut amener une ou plusieurs troisièmes microgouttes 58 identiques ou différentes de la ou des deuxièmes microgouttes 25 initiales pour réaliser une nouvelle coalescence et obtenir un nouvelle microgoutte 90 devenant elle-même la nouvelle première microgoutte et ainsi de suite. Au fur à mesure des coalescences successives, la microgoutte va grossir du fait de l'addition des différents volumes des microgouttes coalescées jusqu'à être tellement grosse qu'elle empêche le piégeage d'une nouvelle microgoutte dans la deuxième zone de piégeage 18. Le nombre maximal de coalescence réalisable dans un même piège capillaire 12 dépend du volume des microgouttes successives coalescées.
A noter que si l'étape de coalescence consiste à enlever le surfactant de la phase externe ou à le déstabiliser par voie chimique, une étape de stabilisation peut être nécessaire entre les différentes coalescences. En pratique, il faut perfuser la chambre de piégeage avec un fluide non miscible avec les microgouttes contenant du surfactant avant d'amener une ou plusieurs nouvelles microgouttes dans le piège capillaire.
La capacité à pouvoir effectuer une coalescence séquentielle a plusieurs applications. Si une première microgoutte 20 piégée dans une première zone de piégeage 15 d'un piège capillaire 12 contient des cellules (par exemple des bactéries, levures ou cellules mammifères), la coalescence séquentielle peut permettre de renouveler plusieurs fois le milieu de culture en fusionnant séquentiellement des deuxièmes microgouttes 25 contenant un milieu de culture à des temps prédéterminés.
Cela peut aussi servir à modéliser le caractère intermittent de la prise d'un médicament. Par exemple, une première microgoutte 20 contenant un sphéroïde de cellules mammifères et piégée dans un piège capillaire 12 est fusionné toutes les 6 heures avec une deuxième microgoutte 25 de médicament.
Gradient de concentrations de goutte
Les pièges capillaires 12 dans la chambre de piégeage 30 peuvent être différents et leurs emplacements peuvent être contrôlés. Il est possible par exemple d'avoir des pièges capillaires 12 présentant un nombre différent de deuxièmes zones de piégeage.
Comme cela est illustré sur la figure 57, la chambre de piégeage 30 peut comporter des pièges capillaires 12a, 12b, 12c et 12d ayant respectivement un, deux trois et quatre deuxièmes zones de piégeage 18 identiques équiréparties autour d'une première zone de piégeage 15. Si les premières microgouttes 20 sont identiques et comporte un composé d'intérêt, il est possible obtenir dans la chambre micro fluidique des microgouttes 100, 105, 110 et 115 formant un gradient spatial de quatre concentrations en composé d'intérêt, représentée ici par différents niveaux de gris, après la coalescence avec les deuxièmes microgouttes 25 piégées qui peuvent par exemple contenir un diluant. Panels de microgouttes
L'injection de panels de microgouttes comportant des composés différents et/ou des concentrations différentes dans une chambre contenant des pièges capillaires 12 tels que décrits précédemment permet de nombreuses applications.
Prenons l'exemple d'une chambre de piégeage de 2 cm2 présentant 1000 pièges capillaires permettant chacun de piéger une première et une deuxième microgoutte 20 et 25. Les premières microgouttes 20 forment un panel de microgouttes contenant un premier composé dans 20 concentrations différentes. Les deuxièmes microgouttes 25 contiennent elles un deuxième composé dans 10 concentrations différentes. En fusionnant les premières et les deuxièmes microgouttes 20 et 25 dans les pièges capillaires 12, il est possible d'obtenir une matrice de microgouttes correspondant chacune statistiquement à une combinaison parmi les 200 combinaisons de premières et deuxièmes microgouttes 20 et 25 possibles.
Le fait que les microgouttes soient statiques facilite également l'obtention de données cinétiques. On tire aussi partie de l'économie en réactifs obtenue grâce à l'utilisation de volumes très faibles dans les microgouttes.
La chambre de piégeage 30 peut avoir une surface plus grande que 2 cm2 ce qui augmente encore largement le nombre de réactions différentes pouvant être menées en parallèle dans un système micro fluidique.
Les composés contenus dans les premières et deuxièmes microgouttes 20 et
25 peuvent être des molécules chimiques qui vont réagir ensemble et dont on cherche à optimiser les concentrations initiales. Le procédé décrit ci-dessus permet d'effectuer de la chimie combinatoire à grande échelle. Les microgouttes peuvent alors comporter un ou plusieurs moyens d'identification. Cela permet par exemple de pouvoir mesurer la concentration du produit final, par exemple par fluorescence ou spectroscopie.
En variante, les premières et/ou deuxièmes microgouttes 20 et/ou 25 peuvent contenir des protéines, des enzymes, des cellules à concentrations variées.
Le système microfluidique et le procédé décrit ci-dessus peuvent permettre l'étude de la cristallisation de protéines. En effet, obtenir un cristal à partir d'une solution purifiée de protéine est une étape essentielle pour la détermination de sa structure tridimensionnelle puisque cela permet d'obtenir une figure de diffraction aux rayons X.
Seulement la protéine est toujours disponible en très faibles quantités et les conditions de cristallisation optimales varient d'une protéine à l'autre. Utiliser une chambre de piégeage 30 de plusieurs pièges capillaires 12 permettant chacun de piéger une première et une deuxième microgoutte 20 et 25 permet par exemple d'avoir un panel de première microgoutte comportant une solution saline dans différentes concentrations et un panel de deuxième microgoutte comportant une protéine d'intérêt dans différentes concentrations. En fusionnant les premières et les deuxièmes microgouttes 20 et 25 dans les pièges capillaires 12, il est possible d'obtenir une matrice de microgouttes représentant des conditions de concentrations en solution saline et protéines différentes de sorte à pouvoir déterminer les concentrations permettant une cristallisation des protéines optimale.
En immobilisant sur les pièges capillaires 12 des premières microgouttes 20 comportant un élément d'intérêt en concentration identique dans toute la chambre de piégeage et en fusionnant ces dernières avec des deuxièmes microgouttes 25 issues d'un panel de microgouttes comportant une espèce titrante dans différentes concentrations, il est possible de réaliser un titrage de l'espèce d'intérêt contenue dans les premières microgouttes 20. Cette application peut être particulièrement intéressante dans le cas de réactifs chers ou disponibles en faibles quantités.
Le procédé présenté ici peut également être très utile pour le criblage de médicaments. Par exemple, des cellules cancéreuses peuvent être mises en culture, sous forme individualisées ou sous forme de sphéroïdes, dans des premières microgouttes 20 piégées dans chacun des première zone de piégeage 15 des pièges capillaires 12, et après quelques jours de culture, il est possible de les faire coalescer dans chaque piège avec une deuxième microgoutte 25 contenant un médicament à cribler, les deuxièmes microgouttes 25 étant issues d'un panel de microgouttes contenant des médicaments différents.
Dans une configuration similaire on peut imaginer la culture de cellules du foie sous forme de sphéroïdes dans des premières microgouttes 20 piégées et l'apport dans chacun des pièges capillaires 12 d'une deuxième microgoutte 25 contenant un médicament dont on cherche à évaluer la toxicité, chaque microgoutte étant issue d'un panel de microgoutte comportant le médicament dans différentes concentrations. En analysant les résultats de viabilité quelques jours après la coalescence, il est possible par exemple de déduire la concentration en ce médicament qui tue la moitié de la population cellulaire.
Ce procédé peut aussi permettre d'évaluer les interactions entre différents antibiotiques. On peut créer un panel de deuxième microgouttes 25 contenant un ou plusieurs antibiotiques dans différentes concentrations et les faire fusionner dans la chambre de piégeage 30 avec des premières microgouttes 20 contenant des bactéries. Les premières microgouttes 20 peuvent comporter une bactérie dans différentes concentrations. Ceci permet d'explorer un espace à 3 paramètres.
L'utilisation de la micro fluidique peut être très avantageuse dans le cadre d'échantillons rares tels que des biopsies. Le système microfluidique peut par exemple être utilisé dans le cadre de la médecine personnalisée et du traitement du cancer. Grâce à ce système on peut mettre en culture, par exemple sous forme de sphéroïdes dans des premières microgouttes 20 piégées, des cellules tumorales d'un patient qui a subi une biopsie et les soumettre à différents médicaments à des concentrations multiples via l'apport des deuxièmes microgouttes 25 dans la chambre de piégeage 30. Après coalescence des couples de microgouttes cellules-médicament, le médicament le plus efficace et sa concentration pour un patient en particulier peuvent être déterminés en n'utilisant qu'une seule chambre de piégeage 30 et un nombre minimal de cellules issues de la biopsie.
Ingénierie tissulaire
Le procédé tel que décrit précédemment peut permettre de fusionner des microgouttes contenant des cellules de types cellulaires différents ou non pour former de manière précise des microtissus.
Le piège capillaire peut être telle qu'illustré sur les figures 5A et 5B. De préférence, la première zone de piégeage 15 présente une hauteur telle que son volume est supérieur à celui de la première microgoutte de sorte que la première microgoutte 20 piégée à un fond non plat, notamment convexe, comme cela est illustré sur la figure 5A. Ainsi, les cellules contenues dans ladite première microgoutte 20 glissent le long de l'interface de cette dernière lors de leur sédimentation pour s'agréger au fond de la première microgoutte 20 piégée et former un sphéroïde, comme cela est décrit dans la demande internationale WO 2016/059302, incorporé ici par référence.
Une première microgoutte 20 peut contenir des cellules d'un premier type cellulaire dans un milieu liquide et être piégée dans la première zone de piégeage 15 dudit piège capillaire 12 pour, après un jour d'immobilisation, former spontanément un premier sphéroïde par sédimentation des cellules. De préférence, le système microfluidique est dépourvu de flux de fluide à proximité du piège capillaire pendant la formation du premier sphéroïde afin que le liquide de la première microgoutte 20 ne soit pas entraîné en mouvement. Une deuxième microgoutte 25 contenant des cellules d'un deuxième type cellulaire dans un milieu liquide peut être piégée dans la deuxième zone de piégeage 18. Après coalescence de la première et de la deuxième microgoutte, on obtient une culture de cellules de deux types différents dont l'architecture dépend en particulier des conditions expérimentales.
Si la première microgoutte 20 est liquide, les cellules de la deuxièmes microgoutte 25 se mélangent, après coalescence, au contenu de la première microgoutte 20 puis sédimentent pour atteindre directement le sphéroïde de cellules du premier type cellulaire.
Si les cellules de la deuxième microgoutte 25 ont eu le temps avant la coalescence de former un deuxième sphéroïde, la coalescence des deux microgouttes 20 et 25 entraîne la fusion du premier et du deuxième sphéroïde.
Si la coalescence a lieu avant que les cellules de la deuxième microgoutte 25 aient eu le temps de former un sphéroïde, ces dernières vont se déposer après sédimentation à la surface du premier sphéroïde.
Si maintenant une des deux microgouttes 20 ou 25 est gélifiée avant l'opération de coalescence, les deux populations cellulaires sont compartimentées. En effet, si la première microgoutte 20, qui contient le premier sphéroïde, est gélifiée avant l'arrivée de la deuxième microgoutte 25, les cellules de deuxième types cellulaire ne pourront plus, après coalescence des microgouttes 20 et 25, entrer directement en contact avec le premier sphéroïde du fait de la présence du gel. Par exemple des cellules mammifères ne peuvent pas traverser une matrice d'agarose à 0.9 % en masse. Les deux groupes de cellules ne peuvent alors communiquer ensemble que par voie paracrine.
L'exemple est ici donnée pour un piège capillaire 12 piégeant un première et une microgoutte 20 et 25 mais il est possible d'obtenir des architectures de microtissus plus complexes avec un piège capillaires 12 permettant de piéger plus de deux microgouttes et/ou des procédés telles que décrits précédemment consistant à coalescer séquentiellement plusieurs microgouttes en faisant varier ou non l'orientation du flux de fluide. Il est également possible d'utiliser une pluralité de pièges capillaires telles que décrits ci-dessus pour former une pluralité de microtissus en parallèle.
Cette technique de formation de microtissus peut permettre de créer in vitro des microtissus avec une architecture contrôlée pour mimer de manière très fidèle les conditions rencontrées in vivo. En effet, dans le corps les différents types cellulaires sont souvent agencés en tissus selon une architecture spécifique qui est importante pour recréer une fonction au niveau d'un organe. Cette dernière peut également être utilisée en vue d'une transplantation sur un patient. Par exemple, des cellules alpha, productrices de glucagon, et de cellules béta, productrice d'insuline peuvent être associées pour créer des ilôts de Langerhans destinés à être transplanté dans le pancréas d'un patient pour soigner son diabète. De manière similaire des hépatocytes et des cellules stellaires pourraient être associés dans le cadre d'une transplantation du foie.
Hydrogels
Le procédé tel que décrit précédemment peut également être utilisé pour créer des microgouttes de gel multicouches.
Le piège capillaire 12 peut être telle que décrit précédemment et comporter une première zone de piégeage 15 et une deuxième zone de piégeage 18.
Comme cela est illustré sur la figure 58, une première microgoutte 20 contenant un premier milieu gélif able peut être piégée dans la première zone de piégeage 15, puis le premier milieu gélifiable peut être gélifié pour former, comme illustré à l'étape 54, une microgoutte 200 d'un premier gel. La première microgoutte 200 gélifiée peut alors fusionner, selon l'étape 58, avec une deuxième microgoutte 25 contenant un deuxième milieu gélifiable et piégée dans l'étape 56 dans la deuxième zone de piégeage 18. Après cette coalescence, le deuxième milieu gélifiable peut être gélifié pour constituer une couche externe 202 d'un deuxième gel sur le premier gel. Cette opération peut être répétée plusieurs fois séquentiellement pour former une microgoutte présentant un cœur du premier gel et une pluralité de couches externes successives des autres gels.
En variante illustré sur la figure 59, le deuxième milieu gélifiable contenu dans la deuxième microgoutte 25 est gélifiée pour former une microgoutte 204 d'un deuxième gel avant de fusionner avec la première microgoutte. Lorsque les deux microgouttes sont fusionnées, elles gardent leur forme et position avant fusion et forme une microgoutte gélifiée 210 de forme dépendante de la forme, de l'agencement et du nombre des zones de piégeage.
Le procédé peut aussi permettre d'obtenir des sphéroïdes encapsulés dans des hydrogels biologiques.
Pour pouvoir former des sphéroïdes dans des microgouttes de manière contrôlée il faut pouvoir garder le contenu de la microgoutte liquide pendant le temps de la formation du sphéroïde. L'agarose se prête très bien à ce protocole car c'est un hydrogel thermosensible. Il reste liquide à 37 °C (agarose ultra-low gelling) puis se solidifie après 30 min à 4 °C et demeure solidifié après retour à 37 °C. Seulement les cellules mammifères ne peuvent pas adhérer sur l'agarose et elles ne peuvent pas non plus le digérer. Cette matrice est donc très différente de la matrice extracellulaire rencontrée dans le corps. L'utilisation d'hydrogels tels que par exemple le collagène de type I, la fibronectine, le Matrigel® ou la gélatine pourrait être préférable pour mieux mimer les conditions naturelles. Seulement le contrôle de leur gélification est plus difficile. On ne peut par exemple pas garder du collagène de type I liquide pendant longtemps avec des conditions favorables à la culture de cellules (basse température ou pH acide). Si on encapsule des cellules dans une microgoutte de collagène que l'on fait gélifier rapidement après son piégeage, les cellules, plutôt qu'adhérer entre elles et former un sphéroïde, vont adhérer au collagène et migrer individuellement le long de ses fibres.
Ce problème peut être résolu grâce au procédé selon l'invention. Le piège capillaire peut être telle qu'illustré sur les figures 5A et 5B. De préférence, la première zone de piégeage 15 présente une hauteur telle que la première microgoutte 20 piégée à un fond non plat, notamment convexe, comme cela est illustré sur la figure 5A de sorte que les cellules contenues dans ladite première microgoutte 20 glissent le long de l'interface de cette dernière lors de leur sédimentation pour s'agréger au fond de la première microgoutte 20 piégée et former un sphéroïde, comme cela est décrit dans la demande internationale WO 2016/059302, incorporé ici par référence.
Une première microgoutte 20 peut contenir des cellules d'un premier type cellulaire dans un milieu liquide et être piégée dans la première zone de piégeage 15 dudit piège capillaire 12 pour, après un jour d'immobilisation, former spontanément un sphéroïde par sédimentation des cellules. De préférence, le système micro fluidique est dépourvu de flux de fluide à proximité du piège capillaire pendant la formation du sphéroïde afin que le liquide de la première microgoutte 20 ne soit pas entraîné en mouvement. Une deuxième microgoutte 25 contenant un des hydrogels biologiques mentionné plus haut en forte concentration peut être piégée dans la deuxième zone de piégeage 18. Une fois cette deuxième microgoutte piégée, les deux microgouttes sont fusionnées immédiatement de sorte que l'hydrogel biologique, encore liquide, se mélange avec la première microgoutte qui contient le sphéroïde. La gélification a ensuite lieu et le sphéroïde se trouve encapsulé dans une matrice extracellulaire représentative des conditions biologiques rencontrées in vivo. Cette technique d'encapsulage de sphéroïde peut être combinée avec la technique de formation des microtissus décrits précédemment pour permettre d'obtenir des architectures de microtissus plus complexe.
Les exemples ci-dessous, non limitatifs décrivent des exemples de mise en œuvre de l'invention telle que décrit ci-dessus.
Exemple 1
Une expérience a été réalisée pour démontrer la faisabilité du procédé.
La chambre de piégeage 30 utilisée fait 2 cm2 et contient 393 pièges capillaires identiques similaires à celui des figures 1A, 1B et 2 et présentant les dimensions suivantes :
a = 250 μιη,
b = c = 150 μιη,
H = 100 μιη, et
h = 50 μιη.
Les pièges capillaires 12 sont répartis selon une matrice telle qu'illustré à la figure 49.
Les microgouttes comportent des colorants alimentaires. Des gouttes de 1 μΐ, avec cinq couleurs différentes allant du bleu au jaune en passant par le vert ont été formées par la technique des « micro-segmented flows ». Ces gouttes de 1 μΐ, ont été fractionnées en de nombreuses premières microgouttes 20 nanolitriques monodisperses en utilisant une pente (procédé décrit au point f) précédemment). Ces premières microgouttes 20 de couleurs différentes ont alors été mélangées pour former un premier panel de microgouttes comportant différentes couleurs puis injectées dans la chambre de piégeage 30 contenant les pièges capillaires 12. La taille des premières microgouttes 20 a été ajustée pour qu'elles occupent pleinement les premières zones de piégeage 15. Les deuxièmes zones de piégeage 18 restent vides.
De la même manière, cinq tons de gouttes de 1 μΐ^ allant du transparent, non coloré au rouge ont été formées puis fractionnés en deuxièmes microgouttes plus petites que les premières microgouttes grâce à une pente au design différent. Ces deuxièmes microgouttes ont été mélangées pour former un deuxième panel de microgouttes comportant différentes couleurs puis injectées dans la chambre micro fluidique où elles sont piégées dans les deuxièmes zones de piégeage 25 libres.
Une matrice de couples de premières et deuxièmes microgouttes 20 et 25 telle qu'illustré à la figure 60a) est alors obtenu. Il y a donc 25 couples différents possibles. Les premières et deuxièmes microgouttes 20 et 25 en contact sont fusionnées par la perfusion de la chambre de piégeage 30 avec du HFE-7500 contenant du 1H,1H,2H,2H- perfluorooctan-l-ol à une concentration de 20 % en volume. Les couleurs des deux microgouttes en contact dans chacun des pièges capillaires se mélangent pour prendre une des 25 couleurs possibles selon la couleur des microgouttes initiales, comme cela est visible sur la figure 60b). Une matrice de microgouttes de 25 couleurs différentes est alors obtenue.
Cette expérience démontre qu'il est possible de combiner différents réactifs en concentrations différentes au sein d'un même piège, de manière parallèle dans une chambre de piégeage 30, après coalescence de doublets de compositions différentes.
Exemple 2
Une expérience a été réalisée pour obtenir des sphéroïdes issus de deux fusions successives de sphéroïdes distincts.
Le système micro fluidique comporte une chambre de piégeage 30 présentant une matrice de pièges capillaires tels qu'illustré sur les figures 5 A et 5B présentant les dimensions suivantes :
H = 165 μιη, et
h2 = 80 μιη,
c = 200 μιη,
a = 400 μπι.
Des cellules hépatiques de rat (H4IIEC3) ont d'abord été encapsulées dans des premières microgouttes 20. Les premières microgouttes 20 ont été piégées dans les premières zones de piégeage 15 et, après sédimentation, les cellules se rassemblent au fond de chaque goutte pour former un premier sphéroïde 130. Après le jour nécessaire à la formation de ces premiers sphéroïdes, des deuxièmes microgouttes 25 ont été piégées dans les deuxièmes zones de piégeage 18, comme cela est visible sur la figure 61 A. Celles-ci contiennent aussi des cellules H4IIEC3 mais, à la différence des premières, elles ont été colorées en rouge avec un marqueur fluorescent (CellTracker Red®). Ces doublets de première et deuxième microgouttes 20 et 25 ont été gardés en l'état pendant un jour pour que les cellules rouges des deuxièmes microgouttes 25 se rassemblent et forment un deuxième sphéroïde 135 au fond de chaque deuxième microgoutte 25. Les première et deuxième microgouttes en contact ont ensuite été fusionné en perfusant la chambre avec du HFE-7500 (huile fluorée) contenant du lH,lH,2H,2H-perfluorooctan-l- ol à une concentration de 20 % en volume.
Après coalescence dans chaque piège, le deuxième sphéroïde 135 sédimente et rentre en contact au fond de la première microgoutte avec le premier sphéroïde 130 dans une nouvelle première microgoutte 140, comme cela est visible sur la figure 61B. Ces deux sphéroïdes en contact vont adhérer l'un à l'autre et fusionner pour ne former qu'un seul nouveau sphéroïde à deux parties 130 et 135 clairement identifiables par imagerie en fluorescence (les cellules issues du deuxième sphéroïde vont continuer à apparaître rouge dans le sphéroïde fusionné). La chambre est ensuite perfusée avec de l'huile contenant du surfactant pour rétablir la stabilité des nouvelles premières microgouttes en vue de la suite de l'expérience.
Cette opération a ensuite été répétée en amenant cette fois des troisièmes microgouttes 85 encapsulant des cellules H4IIEC3 qui avaient été colorées en vert (CellTracker Green®), comme cela est visible sur la figure 61C. Pareillement, les troisièmes sphéroïdes verts 145 sont formés dans les troisièmes microgouttes 85, comme illustré sur la figure 61D, puis les troisièmes microgouttes 25 ont été fusionnées avec les nouvelles premières microgouttes, comme cela est illustré sur la figure 61E. Les troisièmes sphéroïdes verts 145 et le nouveau sphéroïde 140 en contact vont adhérer l'un à l'autre et fusionner pour ne former qu'un seul sphéroïde à trois parties clairement identifiables par imagerie en fluorescence.
On obtient donc au final une matrice de sphéroïdes tricolores, comme illustré sur la figure 62 dans chacune desquels les trois sphéroïdes de couleurs différentes sont identifiables.
Cette expérience démontre le potentiel de la technique pour des applications liées à l'ingénierie tissulaire. En effet, plutôt que fusionner des sphéroïdes d'un même type cellulaire mais de couleurs différentes, on peut facilement imaginer fusionner des sphéroïdes de type cellulaires complémentaires pour créer des microtissus fonctionnels à l'architecture bien déterminée.
Exemple 3
Une expérience a été réalisée pour déterminer sur un seul système micro fluidique la concentration au-delà de laquelle un médicament (l'acétaminophène) devient toxique pour des cellules de foie (hépatome de rat, cellules H4IIEC3).
La chambre microfluidique utilisée contenant sur 2 cm2 252 pièges identiques aux figures 5Ae t 5B. Des premières microgouttes 20 d'agarose liquide à 37 °C (ultra-low gelling), à 0.9 % en masse dilué dans du milieu de culture contenant des cellules H4IIEC3, ont été piégées dans les premières zones de piégeage 15, la deuxième zone de piégeage 18 restant libre. Les premières microgouttes 20 ont ensuite été gardées un jour en culture pour permettre aux cellules d'adhérer les unes aux autres pour former un sphéroïde par premières microgouttes 20. Les premières microgouttes 20 sont ensuite gélifiées par application d'une température de 4 °C pendant 30 min.
Parallèlement, de l'acétaminophène a été solubilisé à haute concentration dans du milieu de culture. De la fluorescéine à concentration élevée a été ajoutée à cette solution. La solution obtenue a été diluée en différentes concentration avec du milieu de culture pure pour former des gouttes de Ι μΙ, à concentrations différentes. Ces gouttes ont ensuite été fractionnées en deuxièmes microgouttes 25 à l'aide d'une pente puis mélangées avant d'être injectées dans la chambre de piégeage 30 qui contient les premières microgouttes 20. Ces deuxièmes microgouttes 25 étaient plus petites que les premières microgouttes 20 et ont été piégées dans les deuxièmes zones de piégeage 18.
En prenant une image en fluorescence avant la fusion, les différents niveaux de fluorescence qui sont corrélés à la concentration en médicament des deuxièmes microgouttes 25 ont pu être identifiés. Même si ces gouttes ont été immobilisées dans des pièges de manière statistique, il est alors possible de faire correspondre à chaque sphéroïde la concentration d'acétaminophène à laquelle il a été associé dans le piège capillaire 12.
La chambre a été perfusé avec du HFE-7500 (huile fluorée) contenant du lH, lH,2H,2H-perfluorooctan-l-ol à une concentration de 20 % en volume pour faire fusionner les microgouttes en contact. L'acétaminophène a alors diffusé à travers l'agarose gélifié pour agir sur les cellules. Après un jour d'exposition à l'acétaminophène, l'huile qui sépare les microgouttes entre elles est remplacée par une phase aqueuse comme cela est décrit dans la demande internationale WO 2016/059302 pour colorer les sphéroïdes avec des marqueurs de viabilité fluorescents présents dans la phase aqueuse. En prenant une image de la matrice finale, les sphéroïdes dont la viabilité a été la plus affectée ont pu être déterminés. Il a été constaté que plus la concentration en acétaminophène est élevée et moins les cellules survivent. Ainsi, en corrélant le résultat de viabilité et la concentration d'acétaminophène dans les deuxièmes microgouttes, on a pu déterminer que la gamme de toxicité de l'acétaminophène sur ces cellules hépatiques est entre 10 et 30 mmol/L pour une exposition statique de 1 jour. Les travaux ayant conduit à cette invention ont reçu un financement du Conseil Européen de la Recherche dans le cadre du septième programme cadre de l'Union (FP7/2007-2013)/ERC convention de subvention n° 278248.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de manipulation d'au moins une première microgoutte liquide (20) et d'au moins une deuxième microgoutte liquide (25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v), de préférence de plus petite dimension et/ou de plus petit volume que la première microgoutte (20), dans un système micro fluidique comportant un piège capillaire (12, 12a, 12b, 12c) présentant une première zone de piégeage (15) et une deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v), le procédé comportant les étapes consistant à :
(i) piéger la première microgoutte (20) dans la première zone de piégeage (15), et
(ii) piéger la deuxième microgoutte (25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) dans la deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v),
la première et la deuxième zones de piégeage (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant agencées pour que la première et la deuxième microgouttes (20 ; 25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) soient en contact l'une avec l'autre,
la première et la deuxième zone de piégeage (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant conformées pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes (20, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) soient différentes,
les microgouttes (20, 25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) étant entraînées en déplacement dans le système microfluidique par un flux orienté (Fi ; F2) d'un fluide.
2. Procédé selon la revendication 1, la première microgoutte (20) étant piégée dans la première zone de piégeage (15) avec une force de piégeage qui est plus grande que celle que la deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) exercerait sur la première microgoutte (20).
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, la première et la deuxième microgoutte (20 ; 25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) étant différentes, en particulier de tailles différentes, notamment la première microgoutte (20) étant de plus grande dimension et/ou de plus grand volume que la deuxième microgoutte (25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v), et/ou de contenus différents.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, le piège capillaire (12, 12a, 12b, 12c) comportant une pluralité de deuxièmes zones de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v), l'étape (ii) consistant à piéger une deuxième microgoutte (25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) par deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v), la première et les deuxièmes zones de piégeage (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant agencées de telle sorte que chaque deuxième microgoutte (25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) soit en contact avec au moins une de la première ou des deuxièmes microgouttes (20, 25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25 v).
5. Procédé selon la revendication 4, l'étape (ii) comportant les sous- étapes (ii') consistant à piéger, sous l'effet d'un premier flux de fluide orienté (Fi), une deuxième microgoutte (25m) dans une ou une partie des deuxième zones de piégeage (18m) et (ii") consistant à piéger, sous l'effet d'un deuxième flux de fluide orienté (F2), une deuxième microgoutte (25v) dans une autre ou une autre partie des deuxième zones de piégeage (18v), le premier et le deuxième flux de fluide étant d'orientation (Fi, F2) différentes.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant l'étape (iii) consistant à fusionner avec la première microgoutte (20) la ou chacune des deuxièmes microgouttes (25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) piégées dans la ou chacune des deuxièmes zones de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v).
7. Procédé selon la revendication 6, comportant, après l'étape (iii), l'étape (v) consistant à piéger une troisième microgoutte (85) dans la ou les deuxièmes zones de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) n'ayant plus de deuxième microgoutte, de sorte que la première et la troisième microgoutte (20 ; 85) soient en contact l'une avec l'autre.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, les microgouttes (20 ; 25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v ; 85) étant amenées dans les zones de piégeage (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) de façon aléatoire.
9. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, la hauteur (hi) de la première zone de piégeage (15) étant telle que le volume de cette dernière est supérieur ou égal au volume de la première microgoutte.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant :
- Le piégeage de la première microgoutte dans la première zone de piégeage du piège capillaire, la force de piégeage Fl exercée par la première zone sur la première microgoutte étant supérieure à la force Ftl de traînée hydrodynamique exercée par le flux orienté sur la première microgoutte, de telle sorte que cette dernière reste piégée dans la première zone, la force de traînée Ftl étant comprise entre Fl et F2, F2 désignant la force de piégeage exercée sur la première microgoutte par la deuxième zone de piégeage du piège capillaire,
- ensuite, le piégeage de la deuxième microgoutte dans la deuxième zone de piégeage du piège capillaire, la force de traînée hydrodynamique Ft2 exercée sur la deuxième microgoutte par le flux orienté durant le chargement de la deuxième microgoutte dans la deuxième zone étant comprise entre F2 et F3, avec F3 de préférence inférieure à Fl , F3 étant la force de piégeage exercée par la deuxième zone du piège capillaire sur la deuxième microgoutte.
11. Dispositif micro fluidique de piégeage de microgouttes, notamment pour la mise en œuvre du procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comportant un piège capillaire (12, 12a, 12b, 12c) présentant une première zone de piégeage (15) et une deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) disposées de sorte qu'une première microgoutte liquide (20) piégée dans la première zone de piégeage (15) et qu'une deuxième microgoutte liquide (25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) piégée dans la deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) soient en contact l'une avec l'autre dans le piège capillaire (12, 12a, 12b, 12c), le premier et le deuxième piège capillaire (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant conformés pour que les forces de piégeage ramenées à l'une desdites microgouttes (20, 25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) soient différentes, les microgouttes (20, 25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) étant entraînées en déplacement dans le dispositif micro fluidique par un flux orienté (Fi ; F2) d'un fluide.
12. Dispositif selon la revendication 11, la première et la deuxième zone de piégeage (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant des cavités.
13. Dispositif selon la revendication 11 ou 12, la première et la deuxième zone de piégeage (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant différentes par au moins l'une de leurs dimensions.
14. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 13, la première et la deuxième zone de piégeage (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant de hauteurs (hi ; h2) différentes, la première zone de piégeage (15) étant notamment plus haute que la deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v).
15. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 14, la première et la deuxième zone de piégeage (15 ; 18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant de formes différentes, en vue de dessus, la première zone de piégeage (15) présentant notamment une section plus grande que la deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v).
16. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 15, la deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) s'élargissant dans au moins une direction en rapprochement de la première zone de piégeage (15).
17. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 16, le piège capillaire (12, 12a, 12b, 12c) comportant une pluralité de deuxièmes zones de piégeage (18a, 18b, 18c, 18m, 18v) agencées de telle sorte que chaque deuxième microgoutte piégée (25a, 25b, 25c, 25m, 25v) soit en contact avec au moins une de la première (20) ou des deuxièmes microgouttes (25a, 25b, 25c, 25m, 25v) piégées dans le piège capillaire.
18. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 17, comportant une pluralité de pièges capillaires (12, 12a, 12b, 12c) comportant chacun une première zone de piégeage (15) et une deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v), de préférence le première zone de piégeage (15) et la deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) étant agencées de telle sorte que la deuxième microgoutte (25, 25a, 25b, 25c, 25m, 25v) piégée dans la deuxième zone de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v) du piège capillaire (12, 12a, 12b, 12c) soit en contact avec la première microgoutte (20) piégée dans la première zone de piégeage (15) dudit piège capillaire (12, 12a, 12b, 12c).
19. Dispositif selon la revendication 18, comportant au moins 10 pièges capillaires (12, 12a, 12b, 12c) par centimètre carré, mieux au moins 100 pièges capillaires (12, 12a, 12b, 12c) par centimètre carré.
20. Dispositif selon la revendication 18 ou 19, comportant un premier piège capillaire (12, 12a, 12b, 12c) comportant n deuxièmes zones de piégeage (18, 18a,
18b, 18c, 18m, 18v) et un deuxième piège capillaire comportant p deuxièmes zones de piégeage (18, 18a, 18b, 18c, 18m, 18v), n étant différent de p.
21. Dispositif selon l'une quelconque des revendications 11 à 20, comportant un canal (9) présentant une chambre de piégeage (30), le ou les pièges capillaires (12, 12a, 12b, 12c) étant dans la chambre de piégeage (30).
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