FR2965273A1 - Procede de preparation d'une structure chimique presentant une partition de phases, apte a generer un spectre de fluorescence specifique et ses applications - Google Patents

Abstract

Résumé : L'invention a pour objet un procédé de préparation d'une structure chimique assemblée ou un mélange de telles structures, cette structure présentant une partition de phases, notamment de nature hydrophobe et hydrophile, comme une particule composite/ synthétique ou un liposome, et étant apte à générer un spectre de fluorescence original. L'invention a également pour objet lesdites structures assemblées et leur mélange ainsi que les compositions ou kit les comprenant. L'invention concerne aussi l'utilisation de ces structures assemblées et leur mélange, notamment pour l'imagerie médicale in vivo ou pour diagnostic in vitro de pathologie, mais également pour le marquage d'un échantillon, d'un objet ou d'une composition liquide ou pour leur authentification. L'invention comprend également les objets ou liquides marqués par les structures assemblées, leur mélange ou par les compositions selon l'invention.

Description

L'invention a pour objet un procédé de préparation en partition de phases d'une structure chimique assemblée fluorescente, spécifique en ce que chaque phase de la partition solubilise et sépare physiquement des molécules fluorescentes dans des compartiments distincts comme pour une particule ou un liposome. L'invention a également pour objet lesdites structures assemblées et leur mélange ainsi que les compositions ou kit les comprenant. L'invention concerne aussi l'utilisation de ces structures assemblées et leur mélange, notamment pour l'imagerie médicale in vivo ou pour diagnostic in vitro de pathologie, mais également pour le marquage d'un échantillon, d'un objet ou d'une composition liquide ou pour leur authentification.

L'invention comprend également les objets ou liquides marqués par les structures assemblées, leur mélange ou par les compositions selon l'invention.

La fluorescence est la propriété que possèdent certains corps d'émettre de la lumière après avoir absorbé des photons de plus haute énergie. Une molécule fluorescente (fluorophore ou fluorochrome) possède la propriété d'absorber de l'énergie lumineuse (lumière d'excitation) et de la restituer rapidement sous forme de lumière fluorescente (lumière d'émission). La lumière réémise par la molécule excitée peut être de même longueur d'onde (fluorescence de résonance) ou de longueur d'onde plus 2 0 grande (dans les milieux liquides) ou plus petite. Ce déplacement du spectre d'émission vers des longueurs d'onde plus élevées, facilite grandement la séparation et la détection de la lumière de fluorescence. Il existe un grand choix de fluorochromes organiques, naturels ou synthétiques (la fluorescéine) ; chaque fluorochrome pouvant être caractérisé par ses spectres d'excitation et d'émission. Le marquage biologique pour le 25 diagnostic médical ou l'imagerie a largement développé l'utilisation de ces molécules fluorescentes. La microscopie en fluorescence repose sur la formation d'une image par détection de cette lumière émise (Huang B et al, 2009). De nombreuses techniques de marquage sont utilisées : - le marquage simple se fait par affinité entre un fluorochrome et la molécule à marquer, - l'immunomarquage qui fait intervenir un anticorps marqué par un fluorochrome, - la technique FISH qui sert à marquer des séquences nucléotidiques, - l'utilisation de protéines de fusion (typiquement la GFP (« GFP » pour green fluorescent protein) consiste à introduire dans la cellule à observer un gène codant une protéine recombinante fluorescente, - le FLIP et le FRAP consistent à irradier une zone dont la fluorescence va disparaitre.

Ces techniques permettent d'étudier la diffusion des molécules marquées, - le FRET (Fluorescent Resonance Energy Transfert) utilise deux fluorochromes, un donneur qui va transmettre son énergie à un autre fluorochrome accepteur. Elle permet d'étudier des interactions entre deux molécules, - le BRET (Bioluminescence Resonance Energy Transfer) est un phénomène similaire au FRET à la différence prés que le donneur est bioluminescent (luciférase). Pour mettre en évidence des substances ou molécules non fluorescentes dans des structures du vivant, il est possible de réaliser un marquage direct par ces fluorochromes, comme par exemple le DAPI qui marque l'ADN mais souvent le marquage est indirect, c'est à dire que la molécule fluorescente est elle-même fixée à la 2 0 molécule qui révélera la cible recherchée tels que des anticorps spécifiques par exemple. Les molécules fluorescentes sont aussi utilisées dans d'autres applications, tels que le marquage d'objet, le marquage d'une encre, etc...Ce sont des outils puissants d'identification grâce à leurs propriétés physiques spécifiques. Il existe pourtant de nombreuses limites à l'utilisation de ces molécules 25 fluorescentes. Leur grande instabilité par exemple, et leur photo-blanchiment (photobleaching) où le fluorochrome perd ces propriétés de fluorescence. Plus récemment des molécules fluorescentes sont utilisées en mélange par encapsulation dans des particules de polymère(s) (Fornùsek L and Vétvicka V, 1986). Une nouvelle génération de minéraux (nanocristaux) fluorescents souvent appelés "quantum dot" très stables et avec 30 un photo-blanchiment très faible par rapport aux molécules précédentes font désormais parties d'une nouvelle génération de marqueurs moléculaires (Sukhanovaa A et al, 2004). Bien d'autres applications sont maintenant développées tel que les LED (Light- Emitting Diode) par exemple (Burroughes JH et al, 1990). Cependant, l'arsenal actuel ne permet pas encore de répondre à l'ensemble des problématiques de marquage. Ainsi, il reste de pouvoir disposer de nouveaux marqueurs aptes à générer un spectre de fluorescence original.

Ceci est justement l'objet de la présente invention. Les inventeurs ont mis en évidence qu'il est possible de combiner dans des structures assemblées en partition de phases différentes molécules fluorescentes dont les propriétés physico-chimiques ne permettent pas leur miscibilité dans un même solvant. Lesdites structures présentent des compartiments distincts dans lesquels se répartissent les molécules fluorescentes combinées selon leur miscibilité ce qui a pour effet de générer une fluorescence résultante spécifique et inattendue, notamment en ce que cette fluorescence résultante n'est pas la simple résultante du mélange des molécules fluorescentes. Ces structures assemblées ou un mélange de telles structures sont aptes à générer un spectre de fluorescence spécifique et inattendu Cet effet étant maintenant révélé, le procédé objet de la présente invention permet d'obtenir des structures chimiques assemblées en partition de phase aptes à générer des fluorescences spécifiques telles que des particules composites ou liposomes permettant deux niveaux de lecture: - soit la lecture combinée des deux molécules fluorescentes générant une 2 0 réémission de fluorescence unique ; ou - soit lorsqu'il s'agit par exemple de particules, une lecture séparée et simultanée avec une fluorescence propre à la coque ou paroi de la particule et une fluorescence propre au contenu. Ceci conduit à une diversité énorme de marquage et de combinaison possible pour la traçabilité des objets. 25 Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation en partition de phases d'une structure chimique assemblée apte à générer un signal spécifique en fluorescence, ladite partition de phases entre une première phase et une deuxième phase non miscibles entre elles structurant un premier 30 compartiment et un deuxième compartiment, lesdits compartiments n'étant pas miscibles entre eux, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) la préparation de ladite première phase et de ladite deuxième phase non miscible à la première; b) la formation de ladite structure chimique assemblée présentant comme résultant de la partition de phases un premier compartiment et un deuxième compartiment non miscibles entre eux, caractérisé en ce que ledit premier compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible apte à générer une fluorescence et ledit deuxième compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible apte à générer une fluorescence. Sous un aspect particulier, l'invention comprend également un procédé de préparation en partition de phases d'une structure chimique assemblée présentant une compartimentation apte à générer un signal spécifique en fluorescence en partition de phases, ladite partition de phases délimitant un premier compartiment et un deuxième compartiment, ledit premier compartiment et ledit deuxième compartiment n'étant pas miscible entre eux, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) la préparation de la première phase et de la deuxième phase non miscibles; et b) la formation de ladite structure chimique assemblée présentant comme résultant de la partition de phases un premier compartiment et un deuxième compartiment non miscibles entre eux, caractérisé en ce que ledit premier compartiment contient une composition comprenant 2 0 au moins un composé miscible dans cette première phase apte à générer une fluorescence et le deuxième compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible dans cette deuxième phase apte à générer une fluorescence, et dans lequel procédé, lesdites première et deuxième phases ont été mélangées à une troisième phase contenant des composés fluorescents soit pour les uns miscibles à la 25 première phase, ou bien pour les autres miscibles à la deuxième phase. Dans le procédé selon l'invention, à l'étape a) la préparation de ladite première phase et de ladite deuxième phase sera effectuée par les procédés bien connus de l'homme de l'art en fonction des structures chimiques choisies et de la structure chimique assemblée en partition de phase que l'on souhaite obtenir à partir de ces deux 30 structures chimiques. En générale cette structure chimique assemblée est choisie parmi toute structure assemblée en partition ou séparation de phases entre au moins deux phases non miscibles entre elles. Par exemple de structure chimique assemblée, mais sans s'y limiter, on peut citer l'émulsion (en particulier eau/huile ou huile/eau), les structures assemblées à l'aide de macromolécules amphiphiles, les films stratifiés, les gels, les liposomes ou encore les micro- ou nanoparticules. Parmi les émulsions, on peut citer en particulier les émulsions de type squalenepluronic L35-Phosphatidylcholine-surfactant ou encore lécithine-phospholipidessurfactant (Watrobska-Swietlikowska D and Sznitowska M, 2006). Ce sont là des mélanges proposés pour la délivrance de médicaments de nature hydrophobe. Un ensemble de méthodes d'obtention d'émulsion sont proposées dans la revue de He C.X., He Z.G and Gao J.Q. Expert Opin Drug Deliv, Apr 7(4): 445-60 (2010) Microemulsions as drug delivery systems to improve the solubility and the bioavailability of poorly watersoluble drugs. Parmi les macromolécules amphiphiles, on peut citer en particulier les macromolécules amphiphiles de type Sodium dodecyl sulfate, poly(gamma-glutamic acid) (Akao T et al, 2010) , le poly(propylénimine) dendrimer (Chooi KW et al, 2010). Parmi les gels, on peut citer en particulier les gels de type hydrogel tel que les copolymères de (méth)acrylates d'alkyle (Black JK et al, 2010 ) ou encore les copolymères de polyéthylène-oxyde et éthylène-oxyde (PEO-b-PPO) (Sakai T et al, 2 0 2010). Parmi les films stratifiés, on peut citer en particulier les films stratifiés de type « scaffolds », c'est-à-dire couches superposées, faites de monocouches fabriquées à partir de matériaux inorganiques (Hench and Polak, 2002) comme le phosphate de calcium ou de matériaux organiques comme les polymères naturels ou synthétiques Q. Parmi les 25 polymères naturels, les hydrogels à base de biopolyméres, comme l'alginate et le chitosan sont largement préconisés. Il y a les films de « Langmuir-Blodgett » qui consistent à construire un film monocouche par le dépôt de molécules tensioactives ou amphiphiles, à une interface air/eau. Cette monocouche est ensuite transférée sur un support solide par trempage de celui-ci dans la sous-phase L'adsorption est basée sur 30 des interactions de type hydrophile/hydrophobe. Une deuxième immersion de la lame conduit à l'adsorption d'une seconde couche puis réitérée plusieurs fois de suite. Il y a également la fabrication des films multicouches par l'usage de polycations (Hoogeveen et al., 1996). Bon nombre de techniques pour l'obtention de ces films stratifiés sont décrites par H. Mjahed H. (Thèse de doctorat, Université de Strasbourg. Soutenue en Octobre 2009. Caractérisation physico-chimique des films multicouches de polyélectrolytes à base de polysaccharides et de polypeptides en vue d'applications dans le domaine des biomatériaux). Notamment, l'auteur cite les films multicouches à croissance linéaire, plus durs et plus denses qui ne permettent pas la diffusion des molécules jouant donc le rôle d'une barrière. Ils peuvent jouer le rôle de réservoir permettant la réalisation des films à compartiments. De telles architectures ont été réalisées en déposant par exemple des films poly(allylamine)/poly(styréne sulfonate) sur d'autres films de type poly(L-lysine)/ acide hyaluronique.

Les étapes suivantes du procédé de l'invention seront déterminées et adaptées 15 en fonction de la structure chimique assemblée que l'on souhaite obtenir et présentant cette partition de phases : a) la préparation de ladite première phase et de ladite deuxième phase; et b) la formation de ladite structure chimique présentant une partition de phases générée préalablement par mélange ou auto-structurée. 2 0 Une fois la structure chimique assemblée sélectionnée, la méthode ou procédé visant à l'obtenir sera choisie parmi les méthodes ou procédés standards pour obtenir ces structures qui sont bien connus de l'homme de l'art. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une structure chimique assemblée selon la présente 25 invention, caractérisé en ce que ladite partition de phases délimite une première phase de nature hydrophobe (phase hydrophobe) et une deuxième phase de nature hydrophile (phase hydrophile), ledit procédé comprenant alors les étapes suivantes : a) la préparation de la première phase de nature hydrophobe non miscible à l'eau et de la deuxième phase de nature hydrophile; et 30 b) la formation de ladite structure chimique assemblée en partition de phases préalablement obtenue par mélange ou auto-structurée, caractérisé en ce que : - ladite phase hydrophobe contient une composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophobe) et ladite phase hydrophile contient une composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophile) - lesdites première et deuxième phases sont mélangées à une troisième phase amphiphile, miscible au deux premières phases, contenant des composés fluorescents miscibles soit à la première phase, où bien à la deuxième phase. Dans un mode de réalisation plus particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'une structure chimique assemblée selon la présente invention, caractérisé en ce que ledit procédé est un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal spécifique en fluorescence, lesdites microparticules ou nanoparticules comprenant une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire, ladite paroi étant de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution aqueuse, ou, inversement ladite paroi étant de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution de nature hydrophobe, ledit procédé mettant en oeuvre un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules comprenant les étapes suivantes : a) la préparation d'une solution organique non miscible à l'eau (nommée 2 0 solution hydrophobe) et d'une solution aqueuse ; b) la formation de la partition de phase par mélange et émulsification de la solution hydrophobe avec la solution aqueuse ; et c) la formation desdites particules, caractérisé en ce que : 25 - ladite solution hydrophobe contient une composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophobe) et la solution hydrophile contient une composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophile) ; ou 30 - Lesdites solution hydrophobe et solution hydrophile sont mélangées à une troisième amphiphile contenant une composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe et au moins un composé fluorescent hydrophile tel que le mélange des trois solutions génère une partition de phases entre une phase hydrophile contenant au moins un composé fluorescent hydrophile et une phase hydrophobe contenant au moins un composé fluorescent hydrophobe. Par microparticules ou nanoparticules, on entend désigner en particulier toute particule, qu'elle soit de type composite ou synthétique ou encore de type liposome, de préférence cylindrique, de forme ovoïde ou sphérique, de diamètre compris entre 10 nm et 1µm pour les nanoparticules et 1 à 500 µm pour les microparticules, de préférence de diamètre compris entre 30 nm pour les nanoparticules et 50 µm pour les microparticules. Il existe un grand nombre de type différent de microparticules ou nanoparticules comprenant en général une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire. Parmi ces microparticules ou nanoparticules, on peut citer en particulier mais sans s'y limiter les microparticules ou nanoparticules suivantes : - polycaprolactone, le polyméthacrylate de méthyle (l'Eudragit ou le Pluronic® 15 tel que le Pluronic®P6100 ou L92 - nanoparticules de latex (Cartier R et al, 2007), viscose, cellulose et chitosan, - nanoparticules de protéines, - nanoparticules à coeur métallique, -nanoparticules faites d'un mélange des différents polymères précités 2 0 (polyméthacrylate, polystyrène par exemple) Les articles de Caldorera-Moore M et al., Expert Opin Drug Deliv. Apr;7(4):479-95 (2010) Designer nanoparticles: incorporating size, shape and triggered release into nanoscale drug carriers., de Giouroudi I and Kosel J. Recent Pat Nanotechnol. Jun;4(2):111-8 (2010) Recent progress in biomedical applications of magnetic 2 5 nanoparticles ou encore Freitas S et al. dans Journal of Controlled Release vol. 102, Issue 2, pp 313-332 (2005) Microencapsulation by solvent extraction/evaporation: reviewing the state of the art of microsphere preparation process technology décrivent ces technologies d'obtention de particules composites. Parmi celles dans lesquelles la paroi (ou coque), est de nature hydrophobe et 30 ledit espace intra-particulaire peut être occupé par une solution aqueuse, on peut citer en particulier mais sans s'y limiter les microparticules ou nanoparticules suivantes : - polycaprolactone, le polyméthacrylate de méthyle, l'Eudragit ou le Pluronic® Pluronic®P6100 ou L92 Selon un mode de réalisation préférée de l'invention, ladite nano- ou microparticule peut être composée d'au moins un polymère qui peut être choisi dans le groupe comprenant le polycaprolactone, le polyméthacrylate de méthyle, l'Eudragit ou le Pluronic® tel que le Pluronic®P6100 ou L92, de préférence le polyméthacrylate de méthyle, un mélange de polyméthacrylate de méthyle et de polycaprolactone, un mélange de polyméthacrylate de méthyle et de Pluronic* et encore plus préférentiellement le polyméthacrylate de méthyle. Parmi les polymères naturels préférés, nous pouvons citer le latex, le chitosan, cellulose et viscose.

Parmi celles dans lesquelles la paroi (ou coque), est de nature hydrophile et ledit espace infra-particulaire peut être occupé par une solution lipidique, on peut citer en particulier mais sans s'y limiter les microparticules ou nanoparticules de latex, de viscose, de cellulose et de chitosan De tels supports sont bien connus de l'Homme du Métier et peuvent être obtenus à l'aide de procédés d'encapsulation par évaporation de solvant (émulsion/précipitation), par coacervation, par polymérisation interfaciale, par nébulisation, par séchage par pulvérisation, par enrobage en lit fluidisé, par gélification par congélation de gouttes, de manière préférée par évaporation de solvant. Ces procédés sont décrits notamment dans les articles suivants : Abrant A et al., Eur.polym. J .,37, 955-963, (2001) Microencapsulation 2 0 par évaporation de solvant ; Taverdet J .L . et al., Ann. Fais. Exp. Chim. , 94, 955, 103-113 (2001) Microencapsulation de matière active par coacervation complexe : influence de certains facteurs sur la vitesse de libération ; Fugit J .L . et al., Polyrner Int., 52, 670-675, (2003) Treatment of a plasticized PVC to reduce plasticizer/solvent migration : optimization with an experiment design ; Ponsart S et al. Eur.J.Sci. 4 Suppl. S75-S76, 996 (2004) Ces 25 procédés sont décrits également dans les ouvrages suivants: The Science and Engineering of Thermal Spray Coatings de Lech Pawlowski et al., Journal of Thermal Spray Technology, ASM International, vol. 13, n° 1, march Ainsi, selon un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon l'invention, caractérisé en ce que les 30 microparticules ou nanoparticules sont des particules composites/synthétiques et en ce que le procédé mis en oeuvre pour la préparation de ces microparticules ou nanoparticules est choisi parmi : - le procédé de précipitation de polymères comme par exemple par désolvatation ou encore de simple émulsion-évaporation de solvant; - le procédé de polymérisation radiale à partir d'un coeur métallique avec des ramifications aléatoires ou ordonnées (le dendrimère), ces procédés permettant la synthèse de particules pleines (billes) parfois bipôlaires (avec une surface hydrophobe et un coeur hydrophile) chargées dudit au moins composé fluorescent hydrophobes, et - le procédé d'émulsion double-évaporation de solvant ; - le procédé de réticulation chimique de macromolécules naturelles ; - le procédé de polymérisation interfaciale, ces procédés permettant l'encapsulation dans ces particules dudit au moins composé fluorescent hydrophobe ou dudit au moins composé hydrophile, ou bien encore desdits composés hydrophobe et hydrophile. Selon un mode également préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules, caractérisé en ce le procédé mis en oeuvre pour la préparation de microparticules ou nanoparticules est le procédé de double émulsion-évaporation de solvant, et en ce la dite solution hydrophobe est constituée d'une solution choisi parmi : - une solution de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) dissout dans du dichlorométhane ; 2 0 - le pluronic® dissout dans de l'éthanol; - le polycaprolactone dissout dans de l'acétone; ou - le polystyrène dissout dans du limonène ou chloroforme. Dans un mode de réalisation particulièrement préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon l'invention, caractérisé 2 5 en ce la dite solution hydrophobe est constituée d'une solution choisie parmi : - une solution de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) dissout dans du dichlorométhane ; - un solvant contenant pure ou en mélange au moins une substance fluorescente hydrophobe; - une solution aqueuse contenant pure ou en mélange au moins une substance fluorescente hydrophile 3 0 Dans ces conditions, deux sonications successives sont réalisées, la première par mélange du solvant et de la solution aqueuse puis la seconde en mélangeant la première émulsion avec une solution aqueuse/PVA à 0,1. Cette dernière est alors versée dans 200 mL d'une solution PVA à 1% et le mélange est placé immédiatement sous une forte agitation qui permettra l'évaporation du dichlorométhane. Sous un autre aspect, l'invention a pour objet un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon l'invention, caractérisé en ce que lesdites microparticules ou nanoparticules sont des liposomes et le procédé mis en oeuvre pour la préparation de microparticules ou nanoparticules est un procédé de préparation de liposomes, en particulier mettant en oeuvre comme solution hydrophobe un concentré de phospholipides. Là encore, les procédés standards de préparation de liposomes sont bien connus de l'homme de l'art et ne seront pas explicités ci de manière exhaustive. On peut néanmoins citer en particulier, mais sans s'y limiter, les procédés standards de préparation de liposomes tels que : - injection éthanol dans de l'eau - préparation par sonication -préparation par exclusion de membrane - préparation par lyophilisation - préparation par congélation décongélation - préparation par évaporation en phase reverse - solubilisation de détergents... 2 0 Ces méthodes produisant des vésicules soient multi lamellaire, ou unilamellaires aux tailles très variées (50 à 1090 nanométres) Ces technologies sont discutées dans l'article de revue de Walde P et al, Chembiochem May 3;11(7):848-65 (2010) Giant vesicles: preparations and applications. Dans un mode de réalisation préféré, l'invention a pour objet un procédé de 25 préparation de structure chimique assemblée ou, de préférence, de microparticules ou nanoparticules, selon l'invention, caractérisé en ce que : - ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la première structure apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la deuxième structure apte à générer une 3 0 fluorescence ; ou - ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence, est choisie parmi le groupe constitué par un extrait synthétique ou naturel, végétal ou animal, ou un mélange d'extraits synthétiques et/ou naturels, un composé isolé ou purifié hydrophobe ou hydrophile apte à générer une fluorescence, ou encore un mélange de ces composés isolés ou purifiés. On entend par exemple par extrait naturel, végétal ou animal, apte à générer une fluorescence, toute structure, substance, ou leur mélange, présent dans un organisme appartenant au régne animal ou végétal et dans lequel extrait ou mélange est contenu au moins un composé naturel apte à générer une fluorescence, notamment sous ultraviolets On entend par ou extrait synthétique, toute structure ou substance présente dans un organisme appartenant au régne animal ou végétal mais dont la synthèse a été réalisée par synthèse chimique. À titre d'exemples d'extrait naturel d'origine végétale, on peut citer des extraits 15 de plantes, de graines, de grains de pollen ou de spores végétales. Dans un mode de réalisation encore préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de structure chimique assemblée ou, de préférence, de microparticules ou nanoparticules, selon l'invention, caractérisé en ce que en ce que en ce ladite composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe est constituée 2 0 essentiellement de la partie hydrophobe d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange, et en ce que ladite composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophile est constituée essentiellement de que la partie hydrophile d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange. Par composé fluorescent, on entend désigner ici en particulier les composés 25 aptes à générer une fluorescence après soumission à un rayonnement, notamment de type ultraviolet. Dans un mode de réalisation encore préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation de structure chimique assemblée ou, de préférence, de microparticules ou nanoparticules, selon l'invention, caractérisé en ce que en ce que en ce ladite partie 3 0 hydrophobe et ladite partie hydrophile sont tirées du même extrait ou de deux extraits distincts. Sous un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de préparation d'un mélange d'au moins deux structures chimiques assemblées et de façon préférée un mélange d'au moins deux microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal original en fluorescence significativement différent (capable d'être distingué l'un de l'autre), chacune desdites structures chimiques assemblée ou desdites microparticules ou nanoparticules étant obtenues par un procédé de préparation de structure chimique assemblée ou de microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, caractérisé en ce que : - l'un au moins des composés apte à générer une fluorescence et miscibles dans la première phase, et l'un au moins des composés aptes à générer une fluorescence et miscibles dans la deuxième phase est différent entre ces deux structures assemblées; ou - l'un au moins des composés fluorescents hydrophobes ou hydrophiles contenu dans ladite particule est différent entre ces deux particules.

Dans un mode particulier de réalisation, selon un mode préféré, l'invention a pour objet un procédé de préparation d'un mélange d'au moins n structures chimiques assemblées ou de préparation d'un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules (n désignant le nombre de types de structures assemblées ou nano- et microparticules) aptes à générer un signal original en fluorescence significativement différent entre ces n structures assemblées ou particules, chacune desdites structures 2 0 assemblées ou microparticules ou nanoparticules étant obtenues par un procédé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre pour chacune de ces structures assemblées ou particules une composition en composé apte à générer une fluorescence différente pour chacune de ces structures assemblées ou particules, et en ce que n est supérieur ou égal à 2, de préférence à 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. 25 Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet les structures chimiques assemblées ou microparticules ou nanoparticules, ou mélange de structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence ou un spectre original de fluorescence, obtenu(es) ou susceptibles d'être 3 0 obtenu(es) par un procédé selon la présente invention.

Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence différent entre chacune desdites particules, caractérisé en ce que chacune desdites particules comprend : - une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire, ladite paroi étant de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution aqueuse, ou, inversement ladite paroi étant de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution de nature hydrophobe ; - i) lorsque ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophile, ladite paroi comprend au moins un composé fluorescent hydrophobe et ledit espace intra-particulaire comprend au moins un composé fluorescent hydrophile, - ii) lorsque ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophobe, ladite paroi comprend au moins un composé fluorescent hydrophile et ledit espace intra-particulaire comprend au moins un composé fluorescent hydrophobe ; et en ce que : pour chacune de ces n microparticules ou nanoparticules, l'un au moins des composés fluorescents hydrophobe ou hydrophile contenu dans ladite paroi rigide ou fluide et/ou dans ledit espace intra-particulaire est différent entre ces n particules, n étant supérieur ou égal à 2, de préférence à 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10. 2 0 De manière préférée, lorsqu'il s'agit de particules, lesdites particules sont choisies parmi les particules composites/synthétiques ou parmi les liposomes, notamment comme décrits pour les procédés ci-avant selon la présente invention. De manière également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, lesdites particules étant aptes à générer un 25 signal spécifique en fluorescence selon la présente invention, caractérisé en ce que lesdites particules de ce mélange sont des particules dont la paroi rigide ou fluide est de nature hydrophobe et l'espace intra-particulaire est de nature hydrophile. De manière également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en 30 fluorescence selon la présente invention, dans lequel mélange lesdites particules sont des particules synthétiques dont la paroi est constituée essentiellement de polymères choisis parmi le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polystyrène, le latex, le chitosan, la cellulose et viscose. De manière également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence selon la présente invention, caractérisé en ce que - ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la première phase apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la deuxième phase apte à générer une fluorescence ; ou - ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à 10 générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence, est choisie parmi le groupe constitué par un extrait synthétique ou naturel, végétal ou animal, ou un mélange d'extraits synthétiques naturels, un composé isolé ou purifié hydrophobe ou hydrophile apte à générer une fluorescence, ou encore un 15 mélange de ces composés isolés ou purifiés. Dans un mode de réalisation également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence selon la présente invention, dans lequel mélange, caractérisé en ce que ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer 2 0 une fluorescence est constituée essentiellement de la partie hydrophobe d'un extrait végétal ou animal, naturel ou synthétique, ou un de leur mélange, et en ce que ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence est constitué essentiellement de la partie hydrophile dudit extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange. 25 Dans un mode de réalisation également préférée, l'invention a pour objet un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, caractérisé en ce que ladite partie hydrophobe et ladite partie hydrophile au sein d'une même particule sont tirées du même extrait ou de deux extraits distincts. 30 Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet une composition pour le diagnostic in vivo ou pour l'imagerie médicale in vivo, caractérisée en ce qu'en comprend un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention. Dans un mode de réalisation préférée, la composition selon l'invention est caractérisée en ce que, lorsqu'il s'agit notamment de particules, la paroi externe de ladite particule est marquée à l'aide d'un marqueur spécifique du tissu biologique ou de la cellule, ou l'un de leur élément que l'on cherche à observer ou à mettre en évidence, chacune des n particules étant marquée à l'aide d'un marqueur différent entre chacune des particules. Parmi les marqueurs spécifiques du tissu biologique ou de la cellule, on peut citer mais sans s'y limiter tout composé capable de reconnaître spécifiquement une structure particulière ou un composé dudit tissu ou de ladite cellule ciblé, comme notamment un antigène ou un récepteur exprimé à la surface externe de ces cellules, le marqueur spécifique pouvant être alors mais sans s'y limiter un anticorps dirigé contre cet antigène ou un ligand spécifique dudit récepteur.

Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un kit ou nécessaire pour le diagnostic in vivo ou pour l'imagerie médicale in vivo, caractérisé en ce que ledit kit comprend un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, chacune des structures 2 0 assemblées ou particules étant de préférence marquée par un marqueur différent. De préférence, ledit marqueur est un marqueur biologique capable de se fixer spécifiquement sur l'élément que l'on souhaite mettre en évidence ou observer, en particulier un anticorps dirigé spécifiquement contre cet élément.

25 Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de marquage d'un échantillon ou d'un objet caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon ou objet avec un mélange n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention. Dans le procédé de marquage d'un échantillon ou d'un objet selon l'invention, 30 de préférence, l'objet est compris dans le groupe d'objet constitué d'une oeuvre d'art, de pièces technique de haute valeur ajoutée, d'objets manufacturés. A titre d'exemples d'objet, on peut encore citer les flacons de parfums, les bouteilles telles que les bouteilles de vin, les emballages, les billets de banque, les vêtements, les montres, les produits électriques, les livres, les passeports, les médicaments, les formulations chimiques, les produits alimentaires tels que les viandes, les parfums, les vins, les articles à base de toile, de papier, de plastique, d'encres, de peinture. Le marquage d'objet, de composition ou d'échantillon selon l'invention peut se faire de toute manière appropriée qui ne provoque pas de modification des caractéristiques desdits objets, compositions ou échantillon telles que les caractéristiques morphologiques ou biologiques (s'il s'agit de matériaux biologiques). À titre d'exemple, le marquage peut se faire par collage ou vernissage si le support de la composition utilisé est respectivement une colle ou un vernis De préférence ici, les colles ou vernis seront choisis parmi les colles ou vernis peu ou pas du tout fluorescent, ou encore en ce que le lesdites colles ou vernis ne gênent pas l'interprétation du signal essentiel comme par exemple la cellulose, le polyméthyl méthacrylate (PMMA), le latex, Lorsque le support de la composition est une particule et que l'objet ou composition à marquer est un fluide, le marquage peut être réalisé par une opération de mélange. Lorsque le support de la composition est une particule et que l'objet est une pâte ou un solide, le marquage peut être réalisé en incluant le mélange desdites 2 0 particules lors de la fabrication du solide, comme une pâte, un tissu, une toile (pour un tableau), du verre ou pour toute matière utile pour la manufacture d'un objet. De préférence ici, lesdits solides seront de préférence choisis parmi les solides neutres en terme d'émission de fluorescence, c'est-à-dire parmi des matières peu ou pas du tout fluorescentes, ou encore en ce que lesdites matières ne gênent pas 25 l'interprétation du signal essentiel de fluorescence résultant de la partition de phases. A titre d'exemples, lorsque le support de la composition est une particule, la le marquage peut être réalisé par : - le mélange d'une composition selon l'invention avec une encre ou une composition de véhicule d'encre ou avec de l'eau ou une combinaison d'eau et de solvant organique et 30 l'impression directement sur un produit, ou - l'immersion d'au moins une partie de la surface de l'objet à marquer dans une solution comprenant une composition selon l'invention pour fixer, par exemple par adsorption ladite composition sur le produit, ou - le mélange d'au moins une composition selon l'invention avec une matière colorante ou une peinture destinée à être utilisée avec un produit, ou - l'addition d'une composition selon l'invention directement à des solutions ou 5 formulations de produits chimiques tels que des médicaments ou des produits alimentaires. Avantageusement, le marquage selon l'invention peut être réalisé par pulvérisation. La pulvérisation peut se faire par exemple à l'aide d'un appareil à buse pour le marquage de nombreux produits ou à l'aide d'un appareil de type « aérosol ». 10 Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de marquage d'une composition liquide caractérisé en ce que l'on incorpore dans ladite composition un mélange de structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, en particulier ladite composition étant 15 choisie parmi une encre, un liquide injectable ou une solution nutritive.

Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé de diagnostic, notamment de pathologie ou d'un stade d'avancement ou de régression d'une pathologie, à partir d'un échantillon biologique échantillon, caractérisé en ce qu'il 2 0 met en oeuvre une étape dans laquelle on met en contact un mélange de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention avec ledit échantillon et ce que l'observe ou analyse le spectre de fluorescence émis par l'échantillon ainsi marqué, en particulier au niveau de certains éléments de l'échantillon, de préférence à partir d'une biopsie. 25 Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet un procédé d'authentification d'un échantillon ou d'un objet susceptible d'avoir été marqué par un mélange ou combinaison particulière de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes 30 suivantes : - l'observation ou analyse du spectre de fluorescence émis par l'échantillon ou l'objet susceptible d'être ainsi marqué ; et - la comparaison du spectre ainsi obtenu avec le spectre de fluorescence spécifique associé à ce mélange ou combinaison, - l'échantillon ou l'objet étant déterminé comme authentique si les deux spectres ainsi comparés sont identiques. Sous encore un nouvel aspect, la présente invention comprend un objet ou liquide caractérisé en ce qu'il est marqué par un mélange ou combinaison spécifique de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'invention.

10 Sous encore un nouvel aspect, la présente invention a pour objet l'utilisation d'un mélange ou combinaison spécifique de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon la présente invention comme biomarqueur, notamment pour l'analyse protéomique, l'analyse génomique, le diagnostic en chimie de synthèse, le diagnostic environnemental, la traçabilité ou l'authentification d'objet, 15 ou pour la lutte contre la contrefaçon. Enfin, la présente invention a pour objet un procédé d'analyse ou de détection de la présence d'au moins une structure assemblée ou microparticule ou nanoparticule, ou d'un mélange de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal original en fluorescence obtenu(es) selon l'invention ou 2 0 susceptibles d'être obtenu(es) par un procédé selon la présente invention, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une lecture du spectre de fluorescence résultant de la séparation de la phase hydrophobe et hydrophile de la particule par microscopie confocale laser afin de permettre l'identification de chaque composante spectrale de ces deux phases, ces spectres de fluorescence de chacune des composantes étant spécifique de la particule 25 analysée.

Les applications des particules fluorescentes peuvent être également nombreuses dans la santé publique, et les secteurs industriels tels que l'agroalimentaire, le management environnemental, ou la chimie. 30 On peut encore citer comme application leur utilisation en cytométrie de flux, en immuno-dosage, en imagerie cellulaire et microscopie, Cette technologie permet de générer de manière avantageuse des combinatoires5 spécifiques et uniques de ces structures chimiques assemblées telles que des combinaisons uniques de particules. Ces mélanges de particules génèrent un code couleur infalsifiable analysables en lecture par fluorescence. De manière également avantageuse, le marquage est invisible à l'oeil et spécifique (combinatoire moléculaire unique), naturel et aisément détectable par un lecteur en fluorescence qui peut être portatif.

La présente invention a également comme avantage de pouvoir encapsuler des substances fluorescentes multiplexées de manière innovante par compartimentation grâce aux propriétés d'hydrophilie ou d'hydrophobicité de ces dernières. Cette nouvelle méthode d'encapsulation de substances fluorescentes permet de proposer l'utilisation de nombreuses substances naturelles végétales ce qui constitue un avantage de cette invention.

Les figures dont les légendes sont ci-après, ainsi que les exemples qui suivent sont destinés à illustrer l'invention sans pour autant en limiter la portée.

Légendes des figures 2 0 Figures 1A-1C : Observation sous lampe ultra-violette de solutions d'extrait B1, de fluorescéine (F) et d'un mélange extrait B1/fluorescéine (M), Figure lA : Solution d'extrait B1, de fluorescéine (F) et mélange extrait B1/fluorescéine (M), lv/lv et mis sous l'éclairage d'une lampe ultra-violette. Figure 1B : Après synthèse des particules, les solutions sont centrifugées afin 25 de séparer les billes du surnageant contenant les substances en excès. Les surnageant sont récupérés et observés sous une lampe ultra-violette. Figure 1C : Les particules après synthèse sont culotées par centrifugation puis remises en suspension dans une solution de PVA à 0,1 %. Ce type de rinçage est réitéré deux fois avant de réaliser une dernière centrifugation et d'observer le culot de 30 particules et le reste de particules en suspension sous une lampe ultra-violette. Figures 2A-2B : Observation de particules composites sur lames sur microscope à fluorescence Figure 2A : Particules composites de PMMA enrichies d'extrait B1 contenant des substances végétales fluorescentes hydrophobes observées à un grossissement 40 X sous un microscope à fluorescence. L'émission de fluorescence est analysée sous un filtre B2A (excitation > 410 nm, filtre d'arrêt : 515 à 560 nm).

Figure 2B : Particules composites de PMMA enrichies de fluorescéine après synthèse des particules, les solutions sont centrifugées afin de séparer les billes du surnageant contenant les substances en excès. Les surnageant sont récupérés et observés sous une lampe ultra-violette. Figures 3A-3B : Observation sous lampe ultra-violette de solutions colloïdales de différentes préparations de liposomes Figure 3A : Solutions colloïdales de différentes préparations de liposomes : liposomes non marqués (V), liposomes contenant l'extrait B1 (Bl), liposomes contenant une solution de fluorescéine (F) et liposomes contenant à la fois l'extrait B1 et une solution de fluorescéine (M).

Figure 3B : Solutions colloïdales de différentes préparations de liposomes précisées en A après dialyse. S est une fraction de dialysat de M. Figures 4A-4B : Images confocales des capsules PF (voie verte uniquement : 500-620 nm, barre d'échelle : 101um). (A) trois capsules typiques, (B) zoom sur une capsule d'environ 101um de diamètre. 2 0 Figure 5 : Image confocale des capsules PA (voie verte : 500-620 nm, voie verte : 630-800 nm, barre d'échelle : 101um) Figures 6A-6B : Images confocales des capsules APF (barre d'échelle : 10 µm). (A) voie verte uniquement : 500-620 nm, (B) voie rouge uniquement : 630-800 nm Figure 7 : Spectres d'émission typiques des différents types de capsules sous 25 excitation à 488 nm

EXEMPLES

EXEMPLE 1 : Observations de particules composites constituées de PMMA et 30 enrichies en fluorescéine (molécule hydrophile) et en extrait B1 (molécule hydrophobe)

La méthode d'obtention des particules de polyméthyl méthacrylate (PMMA) est décrite par Alonso (1996). Le PMMA préalablement solubilisé dans un solvant comme le dichlorométhane est mélangé à un extrait végétal composés à 98 % de chlorophylles a et b (molécules hydrophobes) obtenues par un traitement au chloroforme d'un extrait éthanolique 70° permettant Ce mélange (extrait B1) constitue la phase que nous nommons solvant/PMMA/extrait. Un soluté (phase aqueuse) contenant des molécules fluorescentes hydrophiles comme la fluorescéine en mélange avec la première (solvant/PMMA) permet par sonication de créer une émulsion de fines particules aqueuses. Cette émulsion mélangée à de l'eau puis émulsifiée une seconde fois par sonication conduit alors de fines particules en suspension dans l'eau (de 50 nm à 10 µm). Ces dernières sont constituées d'une coque de PMMA/extrait B1 renfermant de petit(s) globule(s) de soluté(s). Le solvant est évaporé par agitation créant ainsi des particules solides.

La poudre de PMMA (250 mg) est dissoute dans 5 ml de dichlorométhane pur. Si les particules sont enrichies en extrait B1, alors 1ml d'extrait B1 à 25 mg/ml 2 0 (chloroforme) est versé dans la solution de PMMA. A cette dernière solution est ajoutée 1 ml d'eau ou d'une solution de fluorescéine (3 mM/ml). Le tout est passé au sonicateur afin d'obtenir une émulsion très fine. L'émulsion est alors versée dans un grand volume d'une solution PVA 0,1 % (500 ml). L'ensemble est mis sous agitation pendant 16 h sous une hotte aspirante afin d'évaporer totalement le solvant. Ensuite, les particules 25 sont récupérées par centrifugation à 6000 rpm (« rpm » pour tours par minutes) durant 20 minutes. Le surnageant est éliminé et le culot repris par une solution PVA 0,1%. Deux centrifugations sont répétées afin d'éliminer toute trace d'extrait B1 ou de fluorescéine dans le tampon de reprise des particules.

3 0 EXEMPLE 2: Observation en épi-fluorescence sur un microscope à fluorescence et sous une lumière d'excitation ultra-violette des particules composites présentées dans l'exemple 1.

Les particules sont placées entre lame et lamelle. Chaque montage est scellé à l'aide de paraffine. Les lames sont alors observées sur un microscope à fluorescence.

Les observations rapportées dans l'exemple 1 montrent que des particules de PMMA renfermant une solution d'eau ne génèrent qu'une très faible fluorescence sous ultra-violet (V en partie C de l'exemple 1). Lorsque l'eau est enrichie par une substance hydrophile fluorescente, la fluorescéine, alors les particules de PMMA produisent sous ultra-violet une émission de fluorescence dont la couleur jaune-vert est caractéristique de cette dernière (voir Figures 1A-1C, tube «F »). Lorsque la phase organique contenant le PMMA est enrichie par l'extrait B1 (riche en substance(s) hydrophobe(s) comme la chlorophylle), les particules ainsi produites émettent sous ultra-violet une fluorescence de couleur rouge caractéristique de l'extrait B1 ((voir Figures 1A-1C, tube « B1 »). Enfin, lorsque les deux types de substances fluorescentes sont utilisées pour générer des particules, alors ces dernières ont une émission de fluorescence originale et spécifique à cette compartimentation dont la couleur résultante est orangée ((voir Figures 1A-1C, tube « M »). Pour démontrer l'originalité de cette émission résultante, nous avons mis seules ou en mélange les deux types de substances fluorescentes. Sous ultra-violet nous avons observé la couleur jaune-verte de la fluorescéine (« F « ) Figure 2 0 1A), rouge de l'extrait B1 (« B1 », figure 1A) et vert jade du mélange émulsifié (« M », Figure 1A). Nous confirmons l'émission vert jade du mélange lorsque nous observons les différents milieux après synthèse des particules (Figure 1B). L'excès de substances non encapsulées dans les particules génère la couleur vert jade du mélange (« M », figure 1B). 25 L'effet de compartimentation est démontré par des observations en épifluorescence des particules. Les substances hydrophobes de l'extrait B1 se trouve préférentiellement réparties à la périphérie des particules (dans la coque) (voir Figure 2A) tandis que la substance hydrophile, la fluorescéine est uniquement observée dans les cavités des particules (voir Figure 2B). 30 EXEMPLE 3: Observations de liposomes chargées en fluorescéine (molécule hydrophile) et/ou en extrait B1 (molécule(s) hydrophobe(s))

Le même type d'observations indiquées aux exemples 1 et 2 a été recueilli en utilisant la fabrication de liposomes. Les liposomes sont des vésicules qui se forment naturellement ou synthétiquement à partir de phospholipides concentrés mis en présence d'un excès d'eau. L'auto-assemblage des phospholipides en bicouche forme une membrane compartimentant un espace intra-vésiculaire aqueux. De la sorte, la membrane lipidique peut être enrichie de composé(s) hydrophobe(s) tels que l'extrait B1 et le contenu enrichi en composé(s) hydrophile(s).

La méthode d'obtention des liposomes est l'injection dans l'éthanol similaire à celle décrite par Thierry et al. (Thierry, A.R., Lunardi-Iskandar, Y, Bryant, J.L., Rabinovitch, P., Gallo, R.C., and Mahan, L.C.: Systemic gene therapy : biodistribution and long-term expression of a transgene in mice. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 92, 9742-9746, 1995).

Pour cette expérience une solution des lipides suivant, phosphatidylcholine, dimyristoyl-phosphatidylglycérol et cholestérol a été préparée dans l'éthanol avec le rapport massique 16,5/4,3/9,2, respectivement. 120 µl (3 mg lipides total) de cette solution ont été injectés dans 1080 µl d'eau stérile. Les liposomes marqués sont obtenus 2 0 en ajoutant avant le mélange par injection des phases éthanolique et aqueuse: - soit une quantité de la fraction végétale B1 (5 mg/ml) dans la phase éthanolique - soit une quantité de la solution de FITC (3mmole/ml) dans la phase aqueuse - soit une quantité de la fraction végétale B1 (5 mg/ml) dans la phase 25 éthanolique et une quantité de la solution de FITC (3 mM/ml) dans la phase aqueuse Les différentes préparations de liposomes marqués et contrôles sont- soumis après incubation de 1 heure à 25 °C à une première dialyse de 2 heures dans des sacs à porosité de 160 000 d (Spectra) dans de l'eau distillé à 25 °C. Puis les sacs à dialyse sont soumis à une deuxième dialyse de 12 heures à 25 °C. Les préparations sont 30 récupérées dans des tubes Eppendorf puis placés sous UV pour évaluer leur couleur émise (Voir Figures 3A-3B) Cet exemple confirme clairement les observations précédentes. La fabrication d'un autre type de particule que sont les liposomes a conduit aux mêmes résultats. Ces derniers structurent deux compartiments; la couche hydrophobe constituée de lipides d'une part et le contenu aqueux (substances hydrophiles) d'autre part. Les liposomes préparés à l'aide des deux substances exhibent sous ultra-violet une émission de fluorescence orangée (Voir Figure 3B, tube « M » et exemple 3) très différente de la couleur rouge ou vert jaune émise par les particules obtenues respectivement avec l'extrait végétal Bl seul (voir Figures 3A et 3B, tube «B1 » et de l'exemple 3) ou la fluorescéine seule (voir Figures 3A et 3B, tube « F » et de l'exemple 3). De façon remarquable cette couleur orangée résultante est clairement différente de la couleur vert jade du mélange avant dialyse (voir Figures 3A, tube « M » et de l'exemple 3)).

A la lumière des résultats obtenus avec les particules de PMMA et/ou les liposomes, les inventeurs ont mis en évident et clairement montrés que le procédé de et ses applications pouvait être généralisés à toute structure assemblée présentant une partition de phases, tel que tout environnement naturel ou synthétique permettant d'obtenir la compartimentation d'un espace hydrophile et d'un espace hydrophobe, comme une particule composite ou un liposome. On peut citer par exemple, mais sans s'y limiter l'utilisation de réseaux 2 0 tridimensionnels polymériques tels que les triblocs polymériques (matériaux solides ou en forme de gel) renfermant de par leur composition une partie hydrophile et une partie hydrophobe.

EXEMPLE 4 : Spectres d'émission de ces différents mélanges 25 A) Matériel et méthode Les expériences de microscopie confocale spectrale présentées dans cette section ont été réalisées à l'aide d'un système de microscopie à balayage laser LEICA TCS-SP2 (bâti droit). L'excitation a été réalisée à l'aide d'un laser Argon à la longueur d'onde de 488nm avec une puissance de l'ordre de celle utilisé habituellement lors de 30 l'observation de marquages immunohistochimiques classiquement rencontrés en biologie (à titre indicatif : laser au quart de sa puissance maximale et filtre acousto- optique laissant passer moins de 20 % de la raie laser). L'objectif utilisé était un objectif de grande ouverture numérique à immersion à huile spécialement étudié pour la microscopie confocale de fluorescence (HCX PL APO CS 40.0 x 1.25 01 L). Il permet un travail entre lame et lamelle de 170 µm. La séparation entre excitation et émission (fluorescence) est réalisée à l'aide d'un miroir dichroïque interférentiel de type RSP500 (possédant une longueur d'onde de coupure à 500 nm). Grâce à ce miroir, le laser incident à 488 nm est réfléchi vers l'échantillon, mais la lumière retour (de longueur d'onde supérieure à 488 nm) passe majoritairement à travers le miroir. Ce système LEICA permet de collecter une bande spécifique de fluorescence. Ainsi, ce système permet une résolution spectrale et un balayage en longueur d'onde de la fluorescence collectée. Dans les images qui seront présentées, la voie verte correspondra à une collection de fluorescence entre 500 nm et 620 nm et la voie rouge à une collecte de fluorescence entre 630 nm et 800 nm. Les spectres présentés, quant à eux, correspondront à une acquisition par balayage en longueur d'onde de 500 nm à 800nm avec une fenêtre de collecte de 10 nm. Chaque image présentée est obtenue par balayage du faisceau d'excitation à une cadence de 400 lignes par seconde et correspond à une moyenne sur plusieurs balayages d'une même zone. Ces images sont également des coupes confocales (coupes virtuelles) et sont donc obtenues par collection de la fluorescence issue principalement d'un plan axial d'épaisseur réduite (de l'ordre du micron). A la longueur d'onde de travail choisie et avec l'objectif utilisé, 2 0 la résolution théorique donnée par le constructeur est de l'ordre de 0,1601um en latéral et 0,91um en axial. La préparation des échantillons s'est faite à partir de capsules en solution aqueuse (avec 0,1 % d'additif tensio-actif pour éviter l'agrégation). Après centrifugation de ces solutions, environ 1µl de solution était prélevée au fond des tubes et mélangée à une goutte de milieu de montage pour microscopie de fluorescence 25 (Vectashield), puis placé entre lame et lamelle de microscopie.

B) Résultats Pour chaque lot de capsule fourni, plusieurs lames ont été réalisées et observées sous microscope confocal. Aucune fluorescence mesurable n'a pu être détectée sur des 30 échantillons contenant le polymère seul (sans substance végétale ni fluorescéine). Les images présentées dans cette partie sont une compilation des résultats les plus représentatifs.

1) Echantillon de type PF (fluorescéine) : Les figures 4A et 4B présentent les capsules typiquement observées sur les échantillons PF. Seule la voie verte est présentée car aucune fluorescence significative n'a pu être observée au delà de 630 nm. Dans les résultats de l'étude spectrale illustrée à la figure 7, on retrouve une fluorescence typique de la fluorescéine avec un maximum autour de 530 nm. L'élément remarquable sur ces échantillons est la répartition inhomogéne de la substance fluorescente dans les particules de polymère correspondant aux cavités de ces dernières. Le zoom sur une grosse particule d'environ 10 µm de diamètre et présenté à la figure 1B illustre cette inhomogénéité. Sur cette particule, la fluorescence apparaît dans des zones de l'ordre ou inférieure au micron (voir flèches sur la figure 1B).

2) Echantillon de type PA (substance végétale hydrophobe) : Les figures 5A et 5B présentent trois particules typiquement observées sur les échantillons de type PA. On constate la présence de particules pleine ou creuses, avec des cavités plus ou moins étendues. L'image est une superposition de la voie rouge et de la voie verte. Cette fois-ci, la répartition de la fluorescence est homogène au sein du polymère correspondant à la coque de ces dernières. Une faible fluorescence est 2 0 constatée dans la voie verte et une plus importante dans la voie rouge. En jouant sur les sensibilités des détecteurs de ces deux voies, on arrive à équilibrer la luminosité des images et on obtient donc des capsules qui apparaissent en jaune.

Plus précisément, on retrouve le spectre d'émission de ces capsules sur la figure 25 7. On constate effectivement deux bandes de fluorescence de niveaux différents: une bande faiblement intense et assez large qui s'étend du vert à l'orange (entre 500 nm et 625 nm), puis une bande plus intense et plus étroite dans le rouge de 625 à 725 nm correspondant au spectre attendu des chlorophylles.

30 3) Echantillon de type APF (mélange substance végétale et fluorescéine) : Les figures 6A et 6B représentent enfin les particules obtenues suite à un mélange des deux substances évoquées précédemment (fluorescéine et substance végétale). Par souci de clarté, les deux voies rouge et vertes n'ont pas été superposées ici. On constate une compartimentation des deux substances hydrophile (fluorescéine) et hydrophobe (substance végétale). La substance hydrophobe s'insère dans la coque de la particule indiquée par une flèche sur la voie rouge de la figure 6. La substance hydrophile occupe quant à elle l'intérieur de la particule (voie verte). Les deux courbes spectrales présentées sur la figure 7 corroborent cette affirmation. En effet, les spectres ont été tracés en choisissant comme région d'intérêt sur les séries d'images spectrales, soit un anneau de 15 pixels de large intégrant les pixels de la coque, soit un disque intégrant les pixels intérieurs. Pour la région d'intérêt intérieure, on retrouve presque exclusivement le spectre obtenus avec les capsules PF (fluorescéine) et pour la région extérieure, un spectre très similaire au spectre obtenu pour les particules PA. Par ailleurs, il faut noter que cette compartimentation n'est pas observée pour toutes les particules. Comme pour l'échantillon PA, on retrouve des particules plus ou moins vide, mais où seule la fluorescence mesurée sur les échantillons PA (caractéristique de la substance végétale) apparaît. Il semble donc que ces particules ne contiennent pas de fluorescéine.

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Claims (32)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de préparation en partition de phases d'une structure chimique assemblée présentant une compartimentation apte à générer un signal spécifique en fluorescence en partition de phases, ladite partition de phases délimitant un premier compartiment et un deuxième compartiment, ledit premier compartiment et ledit deuxième compartiment n'étant pas miscible entre eux, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) la préparation de la première phase et de la deuxième phase non miscibles; et b) la formation de ladite structure chimique assemblée présentant comme résultant de la partition de phases un premier compartiment et un deuxième 10 compartiment non miscibles entre eux, caractérisé en ce que ledit premier compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible dans cette première phase apte à générer une fluorescence et le deuxième compartiment contient une composition comprenant au moins un composé miscible dans cette deuxième phase apte à générer une fluorescence. 15
2. 2. Procédé de préparation d'une structure chimique assemblée selon la revendication 1, caractérisé en ce que ladite partition de phases délimite un premier compartiment de nature hydrophobe et un deuxième compartiment de nature hydrophile, ledit procédé comprenant les étapes suivantes : a) la préparation de la phase de nature hydrophobe non miscible à l'eau et de la 2 0 phase de nature hydrophile, et b) la formation de ladite structure chimique assemblée présentant comme résultant de la partition de phases un compartiment hydrophobe et un compartiment hydrophile, caractérisé en ce que : 25 - ladite phase hydrophobe contient une composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophobe) et la phase hydrophile contient une composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence (dénommée composé fluorescent hydrophile) ; ou 30 - lesdites phases hydrophobe et hydrophile sont mélangées à une troisièmeamphiphile contenant une composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe et au moins un composé fluorescent hydrophile
3. 3. Procédé de préparation d'une structure chimique assemblée selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ledit procédé est un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal spécifique en fluorescence, lesdites microparticules ou nanoparticules comprenant une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire, ladite paroi étant de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution aqueuse, ou, inversement ladite paroi étant de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution de nature hydrophobe, ledit procédé mettant en oeuvre un procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules comprenant les étapes suivantes : a) la préparation d'une solution organique non miscible à l'eau (nommée solution hydrophobe) et d'une solution aqueuse ; b) la mise en contact de la solution hydrophobe avec la solution aqueuse ; et c) la formation desdites particules, caractérisé en ce que : - ladite solution hydrophobe contient une composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence (dénommé composé fluorescent 2 0 hydrophobe) et la solution hydrophile contient une composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence (dénommé composé fluorescent hydrophile) ; ou - lesdites solutions hydrophobe et hydrophile sont mélangées à une troisième contenant une composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe et 25 au moins un composé fluorescent hydrophile
4. 4. Procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon la revendication 3, caractérisé en ce que les microparticules ou nanoparticules sont des particules composites/synthétiques et en ce que le procédé mis en oeuvre pour la préparation de ces microparticules ou nanoparticules est le procédé de double 30 émulsion-évaporation de solvant permettant l'encapsulation dans ces particules dudit au moins composé fluorescent hydrophile et hydrophobes et le procédé d'émulsion simple-évaporation de solvant permet l'encapsulation dans ces particules dudit au moins composé fluorescent hydrophobe.
5. 5. Procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon la revendication 4, caractérisé en ce le procédé mis en oeuvre pour la préparation de microparticules ou nanoparticules est le procédé de double émulsion-évaporation de solvant.
6. 6. Procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon la revendication 5, caractérisé en ce la dite solution hydrophobe est constituée d'une solution choisi parmi : - une solution de polyméthacrylate de méthyle (PMMA) dissout dans du 10 dichlorométhane ; - le polycaprolactone dissout dans de l'acétone; ou - le polystyrène dissout dans du limonène ou chloroforme.
7. 7. Procédé de préparation de liposomes selon la revendication 2, caractérisé en ce que le procédé mis en oeuvre pour leur préparation met en oeuvre comme solution 15 hydrophobe un concentré de phospholipides.
8. 8. Procédé selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que : - ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la première phase apte à générer une fluorescence et ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la deuxième phase apte à générer une fluorescence ; 2 0 ou - ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence et ladite composition comprend au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence, est choisie parmi le groupe constitué par un extrait synthétique ou naturel, végétal ou 2 5 animal, un mélange d'extraits synthétiques et/ou naturels, un composé isolé ou purifié hydrophobe ou hydrophile apte à générer une fluorescence, et un mélange de ces composés isolés ou purifiés.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que ladite composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophobe est constituée 3 0 essentiellement de la partie hydrophobe d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange, et en ce que ladite composition comprenant au moins un composé fluorescent hydrophile est constituée essentiellement de la partie hydrophile d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange.
10. 10. Procédé de préparation de microparticules ou nanoparticules selon la revendication 9, caractérisé en ce que en ce ladite partie hydrophobe et ladite partie hydrophile sont tirées du même extrait ou de deux extraits distincts.
11. 11. Procédé de préparation d'un mélange d'au moins deux structures chimiques assemblées ou de préparation d'un mélange d'au moins deux microparticules ou nanoparticules aptes à générer un signal spécifique en fluorescence significativement différent (capable d'être distingué l'un de l'autre), chacune desdites structures chimiques assemblée ou desdites microparticules ou nanoparticules étant obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que : - l'un au moins des composés apte à générer une fluorescence et miscibles dans la première phase, et l'un au moins des composés aptes à générer une fluorescence et miscibles dans la deuxième phase contenu dans ladite structure assemblée est différent entre ces deux structures assemblées; ou - l'un au moins des composés fluorescents hydrophobes ou hydrophiles contenu dans ladite particule est différent entre ces deux micro- ou nanoparticules.
12. 12. Procédé de préparation d'un mélange d'au moins n structures chimiques assemblées ou de préparation d'un mélange d'au moins n microparticules ou 2 0 nanoparticules aptes à générer un signal spécifique en fluorescence significativement différent entre ces n structures assemblées ou particules ou liposomes, chacune desdites structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules étant obtenues par un procédé selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre pour chacune de ces structures assemblées ou particules ou liposomes une composition en 2 5 composés apte à générer une fluorescence différente pour chacune de ces structures assemblées ou particules ou liposomes, et en ce que n est supérieur ou égal à 2.
13. 13. Structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules, ou mélange de structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal spécifique en fluorescence obtenu(es) par un procédé selon l'une des 3 0 revendications 1 à 12.
14. 14. Mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules, aptes à générer un signal spécifique en fluorescence différent entre chacune desdites particules, caractérisé en ce que chacune desdites particules comprend : - une paroi rigide ou fluide délimitant au moins un espace intra-particulaire, ladite paroi étant de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution aqueuse, ou, inversement ladite paroi étant de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire étant occupé par une solution de nature hydrophobe ; - i) lorsque ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophile, ladite paroi comprend au moins un composé fluorescent hydrophobe et ledit espace intra-particulaire comprend au moins un composé fluorescent hydrophile, - ii) lorsque ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophile et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophobe, ladite paroi comprend au moins un composé fluorescent hydrophile et ledit espace intra-particulaire comprend au moins un composé fluorescent hydrophobe ; et en ce que : - pour chacune de ces n microparticules ou nanoparticules, l'un au moins des composés fluorescents hydrophobe ou hydrophile contenu dans ladite paroi rigide ou fluide et/ou dans ledit espace intra-particulaire est différent entre ces n particules, et - n étant supérieur ou égal à 2.
15. 15. Mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules selon la revendication 13 ou 14, caractérisé en ce que lesdites particules sont choisies parmi les 2 0 particules composites/synthétiques.
16. 16. Mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 14 à 15, caractérisé en ce que lesdites particules sont des particules dont ladite paroi rigide ou fluide est de nature hydrophobe et ledit espace intra-particulaire est de nature hydrophile. 2 5
17. 17. Mélange d'au moins n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 14 à 16, caractérisé en ce que lesdites particules sont des particules synthétiques dont la paroi est constituée essentiellement de polymères choisis parmi le polyméthacrylate de méthyle (PMMA), le polycaprolactone, le polystyrène le latex, la cellulose, le chitosan, la viscose. 30
18. 18. Mélange d'au moins deux structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 17, caractérisé en ce que - ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans lapremière phase apte à générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé miscible dans la deuxième phase apte à générer une fluorescence ; ou - ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à 5 générer une fluorescence ou ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence, est choisie parmi le groupe constitué par un extrait synthétique ou naturel, végétal ou animal, ou un mélange d'extraits synthétiques naturels, un composé isolé ou purifié hydrophobe ou hydrophile apte à générer une fluorescence, ou encore un 10 mélange de ces composés isolés ou purifiés.
19. 19. Mélange d'au moins deux structures assemblées ou microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 18, caractérisé en ce que ladite composition comprenant au moins un composé hydrophobe apte à générer une fluorescence est constituée essentiellement de la partie hydrophobe d'un extrait végétal 15 ou animal, ou un de leur mélange, et en ce que ladite composition comprenant au moins un composé hydrophile apte à générer une fluorescence est constitué essentiellement de que la partie hydrophile d'un extrait végétal ou animal, ou un de leur mélange.
20. 20. Mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 19, caractérisé en ce que ladite partie 2 0 hydrophobe et ladite partie hydrophile au sein d'une même particule sont tirées du même extrait ou de deux extraits distincts.
21. 21. Composition pour le diagnostic in vivo ou pour l'imagerie médicale in vivo, caractérisée en ce qu'en comprend un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20. 2 5
22. 22. Composition selon la revendication 21, caractérisée en ce que la paroi externe de ladite particule est marquée à l'aide d'un marqueur spécifique du tissu biologique ou de la cellule, ou l'un de leur élément que l'on cherche à observer ou à mettre en évidence, chacune des n particules étant marquée à l'aide d'un marqueur différent entre chacune des particules. 30
23. 23. Kit pour le diagnostic in vitro, caractérisé en ce que le kit comprend un mélange d'au moins n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20, chacune des structures assemblées ou particules étant de préférence marquée par un marqueur différent.
24. 24. Composition selon la revendication 22 ou kit selon la revendication 23, caractérisée en ce que ledit marqueur est un par un marqueur biologique capable de se fixer spécifiquement sur l'élément que l'on souhaite mettre en évidence ou observer, en particulier un anticorps dirigé spécifiquement contre cet élément.
25. 25. Procédé de marquage d'un échantillon ou d'un objet caractérisé en ce que l'on met en contact ledit échantillon ou objet avec un mélange n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20.
26. 26. Procédé de marquage d'un échantillon ou d'un objet selon la revendication 25, caractérisé en ce que l'objet est compris dans le groupe d'objet constitué d'une oeuvre d'art, de pièces techniques de haute valeur ajoutée, d'objets manufacturés.
27. 27. Procédé de marquage d'une composition liquide caractérisé en ce que l'on incorpore dans ladite composition un mélange de structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20, en particulier ladite composition étant choisie parmi une encre, un liquide injectable ou une solution nutritive.
28. 28. Procédé de diagnostic, notamment de pathologie ou d'un stade d'avancement ou de régression d'une pathologie, à partir d'un échantillon biologique échantillon, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une étape dans laquelle on met en contact un mélange de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20 avec ledit échantillon et ce que l'observe ou analyse le spectre de fluorescence émis par l'échantillon ainsi marqué, en particulier au niveau de certains éléments de l'échantillon, de préférence à partir d'une biopsie.
29. 29. Procédé d'authentification d'un échantillon ou d'un objet susceptible d'avoir été marqué par un mélange ou combinaison particulière de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : - l'observation ou analyse du spectre de fluorescence émis par l'échantillon ou l'objet susceptible d'être ainsi marqué ; et - la comparaison du spectre ainsi obtenu avec le spectre de fluorescence spécifique associé à ce mélange ou combinaison,- l'échantillon ou l'objet étant déterminé comme authentique si les deux spectres ainsi comparés sont identiques.
30. 30. Objet ou liquide caractérisé en ce qu'il est marqué par un mélange ou combinaison spécifique de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20.
31. 31. Utilisation d'un mélange ou combinaison spécifique de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules selon l'une des revendications 13 à 20 comme biomarqueur, pour l'analyse protéomique, l'analyse génomique, diagnostic en chimie de synthèse, le diagnostic environnemental, la traçabilité ou l'authentification d'objet, ou pour la lutte contre la contrefaçon.
32. 32. Procédé d'analyse ou de détection de la présence d'au moins une structure assemblée ou microparticule ou nanoparticule, ou d'un mélange de n structures assemblées ou n microparticules ou nanoparticules, selon l'une des revendications 13 à 20, ladite structure assemblée ou ladite particule étant apte à générer un signal original en fluorescence, caractérisé en ce qu'il met en oeuvre une lecture du spectre de fluorescence résultant de la séparation de la phase hydrophobe et hydrophile de la particule par microscopie confocale laser afin de permettre l'identification de chaque composante spectrale de ces deux phases, ces spectres de fluorescence de chacune des composantes étant spécifique de la particule analysée.