WO2014132012A1 - Particules de type cœur-ecorce a base de polydopamine et d'huile vegetale - Google Patents

Particules de type cœur-ecorce a base de polydopamine et d'huile vegetale Download PDF

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WO2014132012A1
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advantageously
emulsion
polymer
oil
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Jacques Fattaccioli
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Centre National De La Recherche Scientifique
Ecole Normale Superieure
Universite Pierre Et Marie Curie (Paris 6)
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Definitions

  • emulsions are the material that potentially has the range applications in these areas [1].
  • the emulsions can be made from almost any mixture of two immiscible liquids, synthetic or natural; their stability can be adjusted to last several years; the drops are capable of solubilizing and transporting hydrophilic or hydrophobic molecules with high charge rates; and the size of the drops may vary between a few tens of nanometers and several tens of microns with good monodispersity and for large sample volumes.
  • Smart colloids capable of targeting specific organs of an organism through their surface functionalization and delivering an active ingredient following the application of a remote stimulus such as a variation of pH, temperature or wave luminous [4].
  • the polymer formed by the condensation of polydopamine under these conditions has a structure similar to that of polymers of the melanin family [9], composed of dihydroxyindole groups connected to each other in various orientations. These polydopamine layers have redox [7], light absorption [9] and are sensitive to pH [10].
  • this type of emulsion is stabilized by the presence of OH " at the oil / water interface, so it is necessary to use oils which do not react too much with these ions and therefore which do not need to be protected at their interface by surfactants
  • alkanes such as for example hexadecane are used in "pristine" emulsions
  • Vegetable oils can not be used in this type of emulsion in addition to the fact that they have a surface activity due to the presence of triglycerides and free acids (about 0.1% by weight) they contain, they would tend to saponify at the interface with water.
  • the oil / water interface of the oil-in-water emulsions obtained with vegetable oils is therefore different from that obtained with the alkanes as disclosed herein.
  • the teaching of this document can not therefore be extrapolated to vegetable oils.
  • the "pristine" emulsions are therefore limited to oils having no molecule that may have an effect on the surface tension, such as alkanes or silicones.
  • the "pristine” emulsions destabilize when the pH decreases and when the ionic strength of the solution increases because the effect of the charges is screened and the latter no longer allow the stability of the colloid. These emulsions therefore have a very restricted field of application.
  • the present invention therefore relates to a method of manufacturing coral-type particles, the core comprising a vegetable oil and the bark comprising a polydopamine polymer, the method comprising the following steps:
  • R 1 represents a hydrogen atom or a -COOH group
  • R 2 represents a hydrogen atom or a -OH group
  • R 3 represents a hydrogen atom or a C 1 -C 6 alkyl group
  • R 4 represents a hydrogen atom. hydrogen or a -OH group so as to polycondense a polymer on the surface of the drops of the emulsion; c - recovery of the core - bark particles obtained in step b).
  • the term "vegetable oil” means any oil that is not a mineral oil.
  • the vegetable oils according to the invention are rich in triglycerides.
  • they contain free acids, advantageously up to 1% by weight relative to the total weight of the oil, more preferably up to 0.5% by weight relative to the total weight of the oil, even more advantageously up to 0.1% by weight relative to the total weight of the oil, in particular between 0.03 and 0.1% by weight, particularly between 0.05 and 0.1% by weight, more particularly between 0.05 and 0.09% by weight.
  • the vegetable oil according to the present invention is soybean oil or olive oil, advantageously soybean oil, in particular containing by weight relative to the total weight of the oil.
  • alpha-linolenic acid between 5 and 10% of alpha-linolenic acid, advantageously between 7 and 10% of alpha-linolenic acid;
  • Soybean oil is commercially available from Sigma-Aldrich under the reference S7381.
  • the olive oil that can be used according to the invention can contain
  • alpha-linolenic acid advantageously between 0.7 and 0.8%;
  • palmitoleic acid advantageously between 1 and 2%.
  • C 1 -C 6 alkyl group means any alkyl group of 1 to 6 carbon atoms, linear or branched, in particular the methyl, ethyl, n-propyl or isopropyl groups.
  • it is a methyl group.
  • the potassium permanganate / dopamine molar ratio is between 0.2 and 1, in particular between 0.4 and 0.8, more particularly between 0 and 0.8. , 4 and 0.6, still more particularly it is about 0.5.
  • the present invention further relates to a pharmaceutical, cosmetic or diagnostic composition
  • a pharmaceutical, cosmetic or diagnostic composition comprising particles according to the invention and a pharmaceutically, cosmetically or diagnostically acceptable excipient.
  • this composition is intended for topical administration, advantageously it is sensitive to UV-A.
  • FIG. 1 represents the UV-Visible absorption spectrum of a cover-glass covered with a melanin layer deposited under experimental conditions similar to those of Example 1
  • FIG. 2 represents the evolution of the intensity profile of a particle obtained according to example 1 along one of its diameters over time, before illumination by UV-A and after illumination.
  • Figure 5 shows the schematic representation of the manufacture of particles according to the invention covered with a silver layer.
  • Figure 5a shows a drop of uncoated soybean oil having a diameter of 7 microns.
  • FIG. 5b shows the particle obtained according to the invention after coating the drop of oil with polydopamine.
  • Figure 5c shows the particle after seeding with silver nitrate: the silver ions are absorbed on the polydopamine layer.
  • Figure 5d shows the particle coated with a silver layer on the polydopamine layer.
  • FIG. 6 shows the images obtained by optical microscopy with a scale of 10 ⁇ of the particles obtained during the coating process. with silver according to example 10.
  • Figures 6a, 6b, 6c and 6d correspond to the steps shown diagrammatically respectively in Figures 5a, 5b, 5c and 5d.
  • Example 1 Implementation of the process according to the present invention
  • Soybean oil (Ref S7381), Sodium alginate (Ref 180947), Olive oil (Ref 75343), Dopamine hydrochloride (2- (3-hydrochloride), 4-Dihydroxyphenyl) ethylamine, Ref H8502), potassium permanganate (KMnO 4 ), sodium borate, surfactant Tween 20 (Polysorbate 20), polyvinylpyrrolidone (PVP), silver nitrate (AgNOs), sodium borohydride, sodium citrate, ascorbic acid come from Sigma-Aldrich.
  • the manufacture of the drops is carried out in two stages: the first consists in the manufacture of a polydispersed emulsion by adding little by little while shearing soya oil until a mass fraction of 74% w / w in an aqueous solution containing 15% w / w of surfactant Poloxamer 188 and 2% w / w of sodium alginate dissolved beforehand used as a thickener.
  • the second step is carried out to have a dispersion in monodisperse size: the emulsion previously prepared is sheared in a Couette cell under a constant shear of 5000 s -1 , following the method developed by Mason et al. [14] .
  • the epi-illumination is performed with a mercury vapor lamp (Osram HBO 100W) and three filter cubes for fluorescence observation (Semrock, Rochester, NY, USA) corresponding to DAPI fluorophores (Exc: 360 ⁇ 40 nm, Em .: 461 nm), FITC (GFP) (Exc: 488 ⁇ 40 nm, Em .: 515 nm) and Texas Red (DsRED) (Exc: 560 ⁇ 40 nm, Em .: 620 nm).
  • the temperature of the samples was kept constant and equal to 21 ° C in the experiments using a PE-100 thermoelectric microscope stage (Linkam, Tadworth, UK) to avoid an increase in the temperature of the suspension when using epi-illumination.
  • the output power of the epi-illumination system was calibrated using a power meter specifically developed for microscope measurements (X-Cite Optical Powermeter, Lumen Dynamics, Canada).
  • UV-Visible Absorbance Spectrometry of Melanin Deposits on Glass Slides Characterization by UV-Visible spectrometry of the melanin layers is not directly carried out on the drops because of too great elastic diffusion which prevents the measurement, but after deposition of the melanin on transparent glass substrates. 22x22mm coverslips are rinsed with ethanol and demineralized water and incubated for more than 12 hours at room temperature, in the dark and with stirring, in a similar dopamine condensation solution. to her used for the drops (dopamine hydrochloride [10 mmol / L] and KMn0 4 [5 mmol / L] in a buffer BT).
  • the absorption spectrum of the polydopamine layer deposited on a glass substrate was measured (see Figure 1).
  • the UV-Visible absorption spectrum shows an absorption maximum around 320 nm, ie in the UV-A range, and decreasing wavelength absorbance to near-infrared, with a near-flat absorption spectrum up to 700 nm which explains the black color of the deposit.
  • This spectrum is similar to those obtained for molecules belonging to the melanin family, such as eumelanin, which is biologically formed from tyrosine [9].
  • the centrifugation of the solution does not show any black precipitate at the bottom of the tube proving that the polycondensation reaction of dopamine is carried out only on the surface of the drops under these experimental conditions.
  • the emulsion drops in a dopamine solution retain their white color for several days.
  • Appearance of the drops and colloidal stability The soy emulsion drops have a spherical shape in their native state, thanks to the existence of a surface tension of a few mN / m.
  • Example 2 The same process as in Example 1 is carried out except that the amount of borate buffer is modified to provide an example with a pH of 7.5 and an example with a pH of 9.5.
  • Example 2 The same process as in Example 1 is carried out except that the KMnO 4 content varies so as to have a molar ratio KMnO 4 / dopamine of 0, 0.1, 0.2, 0.4, 0.6, 0. , 8 and 1. It should be noted that no particle is obtained in the case where the molar ratio KMnO 4 / dopamine and 0 or 0.1. From 0.2, particles as in Example 1 are obtained. It is the same when the molar ratio is 0.2, 0.4, 0.6, 0.8 or 1.
  • the emulsion is destabilized even before dopamine is added.
  • Example 6 Effect of Dopamine Concentration on Condensation
  • Example 7 Effect of the Nonionic Surfactant Type on the Condensation
  • Example 2 Under the same conditions as in Example 1, Tween 20 was replaced by Poloxamer 188 at a content of 0.3%. Particles as in Example 1 are obtained. Thus, the type of nonionic surfactant does not seem to have any influence on obtaining the particles according to the invention.
  • the condensation step in the presence of dopamine at 10 mM and KMnC at 5 mM was performed by illuminating the reaction for the duration of the deposition (artificial light at night and natural day) . Particles as in Example 1 are obtained. So the reaction can take place in darkness as well as in light.
  • Example 10 Coating the particles with a thin layer of silver
  • the particles were dispersed in a TrisHCI buffer (fraction equal to 5% by weight of oil) containing Tween 20 surfactant (0.2% by weight) and AgNO 3 (0.176M) for 90 days. minutes at room temperature in the dark.
  • the negatively charged polydopamine layer promotes the electrostatically induced absorption of Ag + cations at the surface of the particles.
  • the suspension turns brownish-red and centrifugation shows that only the emulsion has changed color, leaving the reaction medium completely clear.
  • the brown color of the emulsion is the consequence of the presence of a small amount of silver nanoparticles on the surface of the particles.
  • the reduction of the silver of some absorbed cations is possible thanks to the intrinsic redox behavior of the polydopamine layer.
  • the metallized particles obtained in this example are perfectly round and opaque to light (FIG. 6d). As their density is greater than the density of water, they agglomerate at the bottom of the tube containing them. After drying by lyophilization, the metallized particles observed by cryo-SEM show a regular spherical shape. The thickness of the metal layer on the particles is estimated to be between 50-100 nm.
  • the process does not induce the appearance of a larger particle population, which shows that there is no coalescence or irreversible aggregation of the smaller particles, a phenomenon which is generally observed when handling liquid colloids.
  • the size distribution of the particles therefore remains identical between the beginning of the process (before metallization) and the end of the process (after metallization) (FIG. 7).
  • the exceptional stability of the emulsion during this process has two different origins: first, the presence of a polydopamine layer provides a strong negative potential at the particle interface which induces electrostatic stabilization of the suspension and reduces the occurrence of coalescence.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de fabrication de particules de type cœur - écorce, le cœur comprenant une huile végétale et l'écorce comprenant un polymère de polydopamine, le procédé comprenant les étapes suivantes : a - préparation d'une émulsion monodispersée d'une huile végétale dans une solution aqueuse; b - mise en contact dans des conditions oxydantes de l'émulsion obtenue à l'étape a) avec une solution tamponnée ayant un pH supérieur à 7 et comprenant un tensioactif non lonique et un composé de formule I suivante: (I) dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -COOH, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C3 et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH de façon à polycondenser un polymère à la surface des gouttes de l'émulsion; c - récupération des particules de type cœur - écorce obtenues à l'étape b). Elle concerne en outre les particules susceptibles d'être obtenues par ce procédé et leur utilisation en particulier en cosmétique dans des crèmes sensibles aux UV- A.

Description

PARTICULES DE TYPE CŒUR-ECORCE A BASE DE POLYDOPAMINE ET D'HUILE VEGETALE
Parmi les particules colloïdales à haute valeur ajoutée développées pour des application biotechnologiques et médicales, comme par exemple des particules de polymère, d'hydrogel ou des capsules artificielles (polymersomes) et naturelles (liposomes), les émulsions sont le matériau qui a potentiellement la gamme d'applications la plus large dans ces domaines [1]. En effet, les émulsions peuvent être réalisées à partir d'à peu près n'importe quel mélange de deux liquides immiscibles, synthétiques ou naturels ; leur stabilité peut être ajustée pour pouvoir durer plusieurs années ; les gouttes sont capables de solubiliser et transporter des molécules hydrophiles ou hydrophobes avec des taux de charge importants ; et la taille des gouttes peut varier entre quelques dizaines de nanomètres et plusieurs dizaines de microns avec une bonne monodispersité et pour des volumes d'échantillons importants. Toutefois, peut-être à cause de la difficulté que représente leur nature liquide et leur relative instabilité associée, peu de travaux [2-4] ont été réalisés jusqu'à aujourd'hui pour tenter de faire appartenir les émulsions à la grande famille des «colloïdes intelligents», capables de cibler des organes spécifiques d'un organisme grâce à leur fonctionnalisation de surface et de délivrer un principe actif suite à l'application d'un stimulus à distance comme une variation de pH, de température ou d'onde lumineuse [4]. Prenant inspiration de la séquence peptidique des protéines adhésives entrant dans la composition du byssus qui permet à la moule, Mytilus Edulis, d'adhérer sur une grande variété de substrats, de nombreux travaux ont récemment montré que la condensation de molécules de catécholamines dans des conditions faiblement alcalines et oxydantes peut être utilisée pour recouvrir à peu près n'importe quel type de surface solide [5] d'une couche de polymère qui peut être utilisée comme couche intermédiaire de fonctionnalisation par des biomolécules [6, 15, 16] ou du métal [7, 8, 15, 16].
Le polymère formé par la condensation de polydopamine dans ces conditions a une structure similaire à celle des polymères de la famille de la mélanine [9], composé de groupes dihydroxyindole connectés entre eux dans des orientations variées. Ces couches de polydopamine ont des propriétés rédox [7], d'absorption lumineuse [9] et sont sensibles au pH [10].
Jusqu'à aujourd'hui, la condensation de polydopamine a été réalisée avec succès à la surface d'émulsions dans le but de fabriquer des capsules polymériques du type cœur - écorce sensibles aux variations de pH [10- 12]. Toutefois, soit les capsules obtenues avaient un cœur en diméthyldiéthoxysilane (DMDES) qui sert de gabarit sur lequel se polymérise la dopamine, ce gabarit pouvant être ultérieurement éliminé pour donner des capsules de polydopamine creuses [12], soit les émulsions utilisées étaient très particulières puisqu'elles étaient stabilisées seulement par des interactions électrostatiques répulsives sans l'aide d'aucun agent tensioactif. Il s'agit d'émulsions appelées « pristine ». Ces émulsions nécessitent l'utilisation d'huiles ne présentant aucune activité de surface (telles que par exemple des huiles ne contenant pas de triglycérides ou d'acides libres). En outre ce type d'émulsion est stabilisé par la présence d'OH" à l'interface huile/eau. Donc, il est nécessaire d'utiliser des huiles qui ne réagissent pas trop avec ces ions et donc qui n'ont pas besoin d'être protégées à leur interface par des tensioactifs. Ainsi, en général seuls les alcanes tels que par exemple l'hexadécane sont utilisés dans les émulsions « pristine ». Les huiles végétales en revanche ne peuvent pas être utilisées dans ce type d'émulsion car outre le fait qu'elles ont une activité de surface due à la présence des triglycérides et des acides libres (environ 0,1% en poids) qu'elles contiennent, elles auraient tendance à saponifier à l'interface avec l'eau. L'interface huile/eau des émulsions huile-dans-eau obtenues avec des huiles végétales est donc différente de celle obtenue avec les alcanes comme divulgués dans ce document. L'enseignement de ce document ne peut donc pas être extrapolé aux huiles végétales. Les émulsions « pristine » sont donc limitées aux huiles ne présentant aucune molécule susceptible d'avoir un effet sur la tension de surface, comme des alcanes ou des silicones. Les émulsions « pristine » se déstabilisent quand le pH diminue et quand la force ionique de la solution augmente car l'effet des charges est écranté et ces dernières ne permettent plus la stabilité du colloïde. Ces émulsions ont donc un domaine d'application très restreint.
L'unique résultat trouvé dans la littérature qui fait état de l'utilisation de tensioactifs dans la phase continue n'a pas permis de maintenir la stabilité colloïdale de la suspension de gouttes et a donné lieu à la formation d'un solide macroporeux. Les tensioactifs utilisés étaient le SDS (dodécylsulfate de sodium) et le CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium) qui sont respectivement des tensioactifs anioniques et cationiques, et l'huile utilisée était de l'hexadécane, une huile minérale [11]. Certes dans ce document l'auteur semble suggérer la possibilité d'utiliser des tensioactifs non- ioniques pour stabiliser des émulsions à base d'hexadécane, mais il indique que tous les tensioactifs non ioniques ne sont pas utilisables, puisque seuls ceux pouvant adsorber et enrichir sélectivement en ions OH" la surface des gouttes d'huile devraient être utilisés, ce qui dépend donc fortement de la nature chimique des groupes hydrophiles des tensioactifs par exemple de leur affinité avec les protons. Or si ces remarques sont peut être justifiées dans le cas des huiles minérales telles que les alcanes comme l'hexadécane (même si aucun test ne prouve la véracité de cette affirmation et qu'il ne s'agit donc que d'une hypothèse non vérifiée), elles ne peuvent être extrapolées à des huiles végétales car l'interface huile/eau est totalement différente en raison de la présence de triglycérides et d'acides libres dans ces huiles. Or il serait intéressant de pouvoir utiliser des huiles végétales pour obtenir des particules du type cceur-écorce dans lequel le cœur contiendrait ces huiles. En effet ces huiles sont intéressantes au niveau écologique car elles proviennent de végétaux, produits renouvelables. En outre la majorité d'entre elles sont tout à fait acceptables au niveau cosmétique et pharmaceutique, c'est-à-dire qu'elles n'ont pas d'effets secondaires, et peuvent incorporer de nombreux actifs liposolubles. Elles peuvent même, comme l'huile de soja, être administrées par voie intraveineuse. Il s'agit en outre en général des huiles qui sont ingérables par voie orale.
Or l'inventeur a découvert de façon surprenante qu'il était possible d'arriver à polycondenser la dopamine sur des gouttelettes d'huile végétale en émulsion dans de l'eau, sans utilisation de gabarit, avec un mode de dépôt similaire à ce qui a déjà été montré pour les dépôts de polydopamine sur des supports solides [7] et à maintenir la stabilité colloïdale des particules de type cœur - écorce obtenues en utilisant un tensioactif non ionique. Le procédé obtenu est donc simple à mettre en œuvre puisqu'il ne nécessite pas l'utilisation d'un gabarit et donc la suppression du gabarit une fois la polycondensation obtenue (ceci permet d'éviter une étape de procédé supplémentaire). Par ailleurs la suspension colloïdale obtenue reste stable et la taille des gouttes n'est pas affectée par le procédé. En outre les huiles végétales ont l'avantage de provenir de végétaux et donc de matériaux renouvelables. En outre sont en général acceptable niveau cosmétique et pharmaceutique, c'est-à-dire qu'elles n'ont pas d'effets secondaires et peuvent incorporer de nombreux actifs liposolubles. Elles sont de plus en général administrables par voie orale. Enfin n'importe quel tensioactif non ionique peut être utilisé dans le cadre du procédé selon la présente invention.
La présente invention concerne donc un procédé de fabrication de particules de type c ur - écorce, le cœur comprenant une huile végétale et l'écorce comprenant un polymère de polydopamine, le procédé comprenant les étapes suivantes :
a - préparation d'une émulsion monodispersée d'une huile végétale dans une solution aqueuse ;
b - mise en contact dans des conditions oxydantes de l'émulsion obtenue à l'étape a) avec une solution tamponnée ayant un pH supérieur à 7 et comprenant un tensioactif non ionique et un composé de formule I suivante :
Figure imgf000007_0001
dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -COOH, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en C1-C6 et R4 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH de façon à polycondenser un polymère à la surface des gouttes de l'émulsion; c - récupération des particules de type cœur - écorce obtenues à l'étape b).
Au sens de la présente invention on entend par « polymère de polydopamine » tout polymère obtenu par polycondensation du composé de formule (I) selon l'invention dans des conditions oxydantes avec un pH > 7. Avantageusement dans le composé de formule (I), au moins l'un des groupes Ri et R4 représente un atome d'hydrogène. Encore plus avantageusement, le groupe R2 représente un groupe -OH. De façon avantageuse il est choisi parmi la dopamine, la L-DOPA, l'épinéphrine et la norépinéphrine. De façon encore plus avantageuse il s'agit de la dopamine (Ri, R3 et R4 représentent un atome d'hydrogène et R2 représente un groupe -OH).
Ainsi la polymérisation de la dopamine de formule 1 suivante :
Figure imgf000008_0001
donne la polydopamine de formule (2) suivante :
Figure imgf000008_0002
Dans le cas où le composé de formule (I) est tel que R2 représente un atome d'hydrogène, comme par exemple la L-tyrosine, le composé s'oxyde en composé de formule (I) dans laquelle R2 représente un groupe -OH, avant sa polymérisation.
Au sens de la présente invention on entend par « huile végétale », toute huile qui n'est pas une huile minérale. En particulier les huiles végétales selon l'invention sont riches en triglycérides. Avantageusement elles contiennent des acides libres, de façon avantageuse pouvant aller jusqu'à 1% en poids par rapport au poids total de l'huile, plus avantageusement jusqu'à 0,5 % en poids par rapport au poids total de l'huile, encore plus avantageusement jusqu'à 0,1% en poids par rapport au poids total de l'huile, en particulier compris entre 0,03 et 0,1% en poids, particulièrement entre 0,05 et 0,1% en poids, de façon plus particulière entre 0,05 et 0,09% en poids. De façon avantageuse l'huile végétale selon la présente invention est de l'huile de soja ou de l'huile d'olive, avantageusement de l'huile de soja, en particulier contenant en poids par rapport au poids total de l'huile
- entre 5 et 10 % d'acide alpha linolénique, avantageusement entre 7 et 10 % d'acide alpha linolénique;
- entre 50 et 57 % d'acide linoléique, avantageusement entre 50 et 54 % d'acide linoléique ;
- entre 17 et 26 % d'acide oléique, avantageusement entre 23 et 24 % d'acide oléique ;
- entre 9 et 13 % d'acide palmitique, avantageusement entre 10 et 11 % d'acide palmitique ;
- entre 3 et 6 % d'acide stéarique, avantageusement 4 % d'acide stéarique. L'huile de soja est disponible commercialement chez la société Sigma- Aldrich sous la référence S7381.
En particulier l'huile d'olive utilisable selon l'invention peut contenir
- entre 7,5 et 20 % d'acide palmitique, avantageusement entre 11 et 12% ;
- entre 0,5 et 5% d'acide stéarique, avantageusement entre 1 et 3 % ;
- entre 55 et 83% d'acide oléique, avantageusement entre 70 et 72% ;
- entre 3,5 et 21% d'acide linoléique, avantageusement entre 9 et 10% ;
- moins de 1,5% d'acide alpha-linolénique, avantageusement entre 0,7 et 0,8% ;
- entre 0,3 et 3,5% d'acide palmitoléique, avantageusement entre 1 et 2%.
L'huile d'olive est disponible commercialement chez la société Sigma- Aldrich sous la référence 75343.
Au sens de la présente invention on entend par « groupe alkyle en en Ci- Ce », tout groupe alkyle de 1 à 6 atomes de carbones, linéaires ou ramifiés, en particulier, les groupes méthyle, éthyle, n-propyle, iso- propyle, n-butyle, iso-butyle, sec-butyle, t-butyle, n-pentyle, n-hexyle. Avantageusement il s'agit d'un groupe méthyle.
Avantageusement la solution aqueuse de l'étape a) du procédé selon la présente invention contient un tensioactif pour stabiliser l'émulsion, de façon avantageuse il s'agit du poloxamer tel que le Poloxamer 188 de formule (HO(C2H40)79-(C3H60)28-(C2H40)79H) commercialisé par la société Croda France SAS. De façon encore plus avantageuse la teneur en tensioactif est comprise entre 1 et 30 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, de façon particulièrement avantageuse elle est d'environ 15 % en poids. La solution aqueuse de l'étape a) du procédé selon la présente invention peut également comprendre un épaississant, tel que par exemple de l'alginate de sodium. De façon avantageuse l'épaississant est présent en une teneur comprise entre 0,5 et 5 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, de façon avantageuse elle est d'environ 2 % en poids.
Avantageusement la teneur en huile végétale de l'émulsion obtenue à l'étape a) est comprise entre 50 et 90 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, avantageusement entre 60 et 85 % en poids, de façon encore plus avantageuse entre 70 et 80 % en poids, en particulier entre 72 et 77 % en poids, par exemple entre environ 74 et 75% en poids.
Dans un mode de réalisation particulier les gouttes de l'émulsion obtenue à l'étape a) ont un diamètre moyen compris entre 20 nm et 500 pm, en particulier compris entre 400nm et 50 pm, de façon avantageuse comprise entre 900 nm et 20 pm, en particulier entre 1 et 15 pm, de façon particulière d'environ 8±2 pm ou d'environ 6,8±1,3 pm.
Au sens de la présente invention, on entend par « diamètre moyen » la moyenne des diamètres de la population de gouttes ou de particules. Puisque les gouttes de l'émulsion sont monodispersées, la moyenne et la médiane sont quasi-identiques, avantageusement elles ont un diamètre moyen dont le coefficient de variation (CV) est inférieur ou égal à 30%, avantageusement inférieur ou égal à 20%. Le diamètre de la population de gouttes ou de particules est caractérisé par vidéomicroscopie, avantageusement à l'aide d'un microscope inversé Zeiss AxioObserver Dl équipé d'une caméra CCD de modèle Andor Clara E. Les images sont avantageusement acquises à l'aide du logiciel open-source Micro-Manager (Vale Lab, UCSB). L'étape a) du procédé selon la présente invention peut être tel que décrit dans la demande de brevet FR2747321 [17]. Elle peut ainsi comprendre les deux sous étapes suivantes :
- Etape aa) de fabrication d'une émulsion polydispersée de l'huile végétale dans une solution aqueuse, avantageusement par ajout de l'huile végétale dans la solution aqueuse sous agitation, de façon avantageuse la solution aqueuse contenant un tensioactif, en particulier non ionique, tel que décrit ci-dessus et éventuellement un épaississant tel que décrit ci-dessus, en particulier dans les proportions indiquées ci-dessus ;
- Etape bb) de fabrication d'une émulsion monodispersée à partir de l'émulsion polydispersée obtenue à l'étape aa), avantageusement par utilisation d'un cisaillement constant de 5000 s"1, en particulier dans une cellule de Couette, de façon particulière en utilisant la méthode développée par Mason et al [14].
Dans un autre mode de réalisation particulier, une étape supplémentaire ce) peut être ajoutée après l'étape bb) qui consiste en la dilution de l'émulsion monodispersée obtenue à l'étape bb) dans une solution aqueuse, avantageusement contenant un tensioactif, en particulier non ionique, particulièrement du poloxamer tels que le Poloxamer 188 de formule (HO(C2H40)79-(C3H60)28-(C2H40)79H) commercialisé par la société Croda France SAS. De façon encore plus avantageuse la teneur en tensioactif est comprise entre eux 0,1 et 5 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, de façon particulièrement avantageuse elle est d'environ 1 % en poids. De façon avantageuse la dilution est mise en œuvre de façon à obtenir une émulsion contenant 5% en poids d'huile végétale par rapport au poids total de la solution. Après cette dilution, en général seule la crème qui contient 64% d'huile st récupéré, le sous- nageant étant jeté car il ne contient que de toutes petites gouttes et de la solution de tensioactif, et c'est la crème qui est ensuite utilisée à l'étape b) du procédé selon la présente invention.
Dans un mode de réalisation particulier de la présente invention, les conditions oxydantes de l'étape b) consistent en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium ou en l'utilisation d'un tampon tris HCI ou d'un tampon phosphate, avantageusement en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium. En effet l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium permet d'obtenir la plus forte fluorescence des particules obtenues.
De façon avantageuse dans le cas où le composé de formule (I) est la dopamine, le ratio molaire permanganate de potassium / dopamine est compris entre 0,2 et 1, en particulier entre 0,4 et 0,8, plus particulièrement entre 0,4 et 0,6, encore plus particulièrement il est d'environ 0,5.
De façon avantageuse à l'étape b) le pH est compris entre 7,5 et 9,5, avantageusement il est de 8,5. Le pH est maintenu constant pendant toute la réaction de polymérisation grâce à l'utilisation du tampon.
De façon encore plus avantageuse, le tensioactif non ionique de l'étape b) est un polysorbate tel que par exemple le Tween 20 commercialisée par la société Sigma-AIdrich ou un polymère tribloc, avantageusement dont la chaîne centrale est hydrophobe (par exemple il s'agit d'une chaîne polyoxypropylène) et les deux chaînes latérales sont hydrophiles (par exemple il s'agit de chaînes polyoxyéthylène), tel qu'un poloxamer comme le Poloxamer 188 de formule
Figure imgf000013_0001
commercialisé par la société Croda France SAS. Avantageusement le tensioactif non ionique est présent en une teneur comprise entre sa CMC et 1 % en poids par rapport au poids total de la solution tamponnée, de façon avantageuse comprise entre 0,1 et 0,5% en poids par rapport au poids total de la solution tamponnée, en particulier entre 0,2 et 0,3% en poids par rapport au poids total de la solution tamponnée.
En particulier, la teneur en huile végétale de l'étape b) est comprise entre 10 et 30 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion, avantageusement entre 15 et 20 % en poids par rapport au poids total de l'émulsion.
Avantageusement, la teneur en composé de formule I dans l'étape b) est comprise entre 5 et 18mM, en particulier lorsque le composé de formule (I) est de la dopamine, l'épaisseur du film augmentant avec la teneur en composé de formule (I).
Dans un mode de réalisation particulier, l'étape b) consiste en la dilution de l'émulsion obtenue à l'étape a) dans la solution tamponnée dans des conditions oxydantes. De façon avantageuse la solution tamponnée est obtenue par dissolution du composé de formule (I) dans de l'eau tamponnée contenant le tensioactif non ionique dans des conditions oxydantes. En particulier, après dilution, l'émulsion diluée obtenue est mise à incuber de façon à ce que le polymère se forme à la surface des gouttes de l'émulsion, de façon avantageuse à température ambiante, de façon particulièrement avantageuse pendant au moins 30 minutes, de façon encore plus particulièrement avantageuse sous agitation.
Dans un autre mode de réalisation particulier, l'étape c) consiste en une centrifugation. En effet les particules ont une densité plus faible que celle de la solution aqueuse tamponnée et les particules remontent à la surface. Il est donc possible de les prélever et/ou de prélever la phase sousnageante et de la remplacer par un autre tampon aux caractéristiques physico-chimiques différentes. Les particules peuvent éventuellement être lavées avant ou après avoir été récupérées.
De façon avantageuse les particules obtenues par le procédé selon la présente invention sont des microparticules ou des nanoparticules, avantageusement ayant un diamètre moyen compris entre 20 nm et 500pm, en particulier compris entre 400nm et à 50 pm, de façon avantageuse comprise entre 900 nm et 20 μιτι, en particulier comprise entre 1 et 15 pm, de façon particulière d'environ 8±2 μιτι. Les particules selon l'invention sont des particules de type cœur - écorce. Il s'agit donc de capsules dont l'intérieur est liquide. Dans un mode de réalisation particulièrement avantageux, le procédé selon la présente invention comprend une étape supplémentaire d) de greffage d'une couche fonctionnelle sur la peau des particules, avantageusement la couche fonctionnelle est une couche de métallisation, une couche nucléophile telle que des protéines, des acides nucléiques, des molécules fluorescentes ou de l'acide hyaluronique ou une couche polymérique, et de récupération des particules fonctionnalisés obtenues. Il existe différents procédés pour greffer la couche fonctionnelle. En particulier ils sont décrits dans les demandes de brevet WO2008/049108 et WO2012/160120 et dans l'article de Lee et al. [7]. Il peut ainsi s'agir d'une métallisation non galvanique pour ajouter une couche de métal sur la peau des particules, d'une réaction de la peau des particules avec des thiols ou des aminés par addition de Michael ou réaction avec une base de Schiff, par exemple pour former une couche d'alcanethiol ou pour former une couche PEG à partir de PEG greffé par des aminés ou des thiols ou pour former une couche d'acide hyaluronique à partir d'acide hyaluronique partiellement thiolaté ou encore pour former une couche de molécules fluorescente en utilisant une molécule fluorescente aminée (par exemple la fluoresceinamine) en particulier à une concentration de ImM dans un tampon phosphate ou un tampon Tris à un pH de 8.0.
Dans un autre mode de réalisation particulièrement avantageux, l'étape d) est une étape de greffage d'une couche de métallisation par un procédé de métallisation non galvanique et comprend l'ensemencement de la peau des particules avec du métal, avantageusement de l'argent, du fer, du cuivre, du nickel ou leur alliages, en particulier de l'argent, plus particulièrement sous forme de nitrate d'argent, suivi par l'ajout d'un agent réducteur, avantageusement choisi parmi le borohydrure de sodium, le citrate de sodium et l'acide ascorbique, plus avantageusement il s'agit de l'acide ascorbique, et d'un polymère stabilisant, le polymère étant avantageusement du polyvinylpyrrolidone. (PVP) En particulier la teneur en polyvinylpyrrolidone est d'environ 0,02 % en poids. De façon avantageuse la couche de métallisation a une épaisseur comprise entre 50 et 100 nm. La distribution de taille des particules revêtues de cette couche de métallisation reste inchangée. Il n'y a donc pas de phénomène de coalescence ou d'agrégation irréversible des particules. Les particules métallisées obtenues lors de cette étape ont une forme sphérique et sont opaques à la lumière. Dans un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon la présente invention comprend une étape supplémentaire e) d'induction de fluorescence par illumination des particules obtenues à l'étape c) ou d) avec une lumière UV, avantageusement à une longueur d'onde dans la gamme des UV-A ( 365 nm par exemple), da façon avantageuse pendant au moins 250s, en particulier pendant au moins 300s, plus particulièrement pendant au moins 400s.
Dans un autre mode de réalisation avantageux, le procédé selon l'invention comprend une étape préalable al) avant l'étape a) de mélange de l'huile végétale avec un composé hydrophobe, avantageusement un principe actif pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable tel que la vitamine E ou la lidocaine, en particulier la vitamine E. Ce qui est remarquable grâce au procédé selon la présente invention, est que la taille des gouttes obtenues à l'étape a) n'est pas affectée lors de la polymérisation de l'étape b). En outre lors de l'étape b), la stabilité colloïdale de la suspension est préservée: les gouttes revêtues de polymères restent individuelles et aucun agrégat adhésif n'apparaît. Toutefois la forme des gouttes peut évoluer de façon importante lors du dépôt de polymère, surtout au cours du vieillissement de la suspension des particules et en cas d'oxydation de l'huile de soja ou de l'huile d'olive au stockage par l'oxygène de l'air. Cependant, la forme sphérique des particules peut être retrouvée par simple illumination dans les gammes de l'UV - visible des particules obtenues à l'étape b) ou à l'étape c). Il semble que cette reprise de forme soit irréversible. La température n'a pas d'influence sur la forme des gouttes et finalement seul l'effet d'absorption lumineuse est en jeu. Bien que l'inventeur ne comprenne pas les détails de ce phénomène, les polymères comme la mélanine sont connus pour être de bons convertisseurs d'absorption lumineuse en chaleur et aussi pour changer de structure par formation et recombinaison de radicaux sous illumination UV [9]. L'inventeur pense donc que l'absorption lumineuse et la dissipation de chaleur sont suffisantes pour ramollir le film de polymère et laisser la tension de surface du cœur redonner sa forme sphérique à la particule
La présente invention concerne en outre des particules susceptibles d'être obtenues par le procédé selon la présente invention. Les particules selon l'invention sont des particules de type c ur - écorce. Il s'agit donc de capsules dont l'intérieur est liquide et est constitué par une huile végétale, éventuellement comprenant un composé hydrophobe, avantageusement un principe actif pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable tel que la vitamine E. L'écorce des particules est quant à elle constituée par un polymère de polydopamine, avantageusement de la polydopamine, éventuellement greffée avec une couche fonctionnelle telle que décrite ci- dessus par des procédés bien connus de l'homme du métier. De façon avantageuse les particules selon la présente invention sont des microparticules ou des nanoparticules, avantageusement ayant un diamètre moyen compris entre 20 nm et 500pm, en particulier compris entre 400nm et 50 pm, de façon particulièrement avantageuse comprise entre 900 nm et 20 pm, en particulier comprise entre 1 et 15 pm, de façon particulière d'environ 8±2 pm.
Les inventeurs se sont aperçus de façon surprenante que la couche de polymère présente à la surface des particules est photosensible. Une fluorescence des particules dans un domaine très large de longueurs d'onde peut être induite par illumination prolongée dans l'UV A (365 nm), par exemple par une illumination de 100mW/cm2. Il semble par ailleurs que les particules absorbent fortement la lumière, en particulier dans la gamme des UV.
En outre, dans le cas où lors du procédé de fabrication les particules deviennent rugueuses, il est possible de leur faire retrouver leur forme sphérique par simple illumination dans l'UV - visible avec une cinétique qui dépend de la longueur d'onde.
La présente invention concerne en outre l'utilisation des particules selon l'invention pour encapsuler des principes actifs hydrophobes pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptables et/ou en tant que traceurs fluorescents, par exemple pour la biologie, et/ou pour le relargage contrôlé par la lumière ou par des conditions physico-chimiques telles que le pH, de principes actifs hydrophobes et/ou en tant que traceur pour mesure de vélocimétrie par image de particules, en particulier de microvélocimétrie par images de particules, et/ou en tant que catalyseur colloïdal pour l'ozonolyse, avantageusement lorsque les particules selon l'invention sont métallisées, et/ou en tant que matériau de stockage de chaleur latente .
Avantageusement, les particules selon l'invention sont utilisables en tant que traceurs pour mesure de vélocimétrie par image de particules (PIV), en particulier de microvélocimétrie par images de particules (μΡΐν). En effet, les particules selon l'invention peuvent remplacer les particules de verre ou d'autres matériaux actuellement utilisés dans le domaine. L'avantage des particules selon la présente invention dans cette application est leur faible coût de fabrication, leur procédé de fabrication en phase aqueuse, leur taille variable à volonté avec une faible polydispersité, leur couplage fluorescence et opacité ajustable en relation avec leur densité, l'absence de photoblanchiment de la fluorescence de surface et leur possibilité d'encapsulation de matériaux magnétiques ou de fluorochromes.
Dans le cas de traceurs fluorescents pour la biologie, il est possible de rendre les particules fluorescentes grâce à une stimulation lumineuse externe. Cette fluorescence peut être améliorée en utilisant un tampon borate et le permanganate de potassium lors du procédé de fabrication des particules selon l'invention (étape b) et/ou en ajoutant des molécules captant les espèces réactives de l'oxygène (ROS) dans le milieu tampon contenant les particules, tel que par exemple le Trolox ou le pyruvate. De façon avantageuse les particules selon la présente invention, en particulier lorsqu'elles sont métallisées, c'est-à-dire recouvertes d'une couche de métal, plus particulièrement d'argent, peuvent être utilisées en tant que catalyseur colloïdal pour l'ozonolyse, en particulier dans le traitement par ozonoiyse des eaux usées contenant des composés aromatiques dissous et/ou des matières organiques naturelles et/ou de l'acide pyruvique. En effet durant l'ozonolyse des eaux contenant des composés aromatiques dissous ou des matières organiques naturelles, il y a formation d'acide pyruvique en tant que sous-produit non volatil majeur. Or l'acide pyruvique ne peut pas réagir directement avec l'ozone. La présence d'un catalyseur est donc nécessaire.
Dans un mode de réalisation particulier, les particules selon la présente invention, métallisées ou non, peuvent être utilisées en tant que matériau de stockage de chaleur latente. En effet, il est possible d'encapsuler dans les particules selon la présente invention des matériaux organiques à changements de phase (PCM) avec une température de transition de phase proche de la température ambiante, tels que par exemple la paraffine, l'acide caprylique ou les triglycérides d'acides gras saturés en Cs-Cie commercialisé par GATTEFOSSE sous la dénomination commerciale Suppocire®, pour permettre de stocker l'énergie thermique.
La présente invention concerne de plus une composition pharmaceutique, cosmétique ou de diagnostique comprenant des particules selon l'invention et un excipient pharmaceutiquement, cosmétiquement ou diagnostiquement acceptable. De façon avantageuse cette composition est destinée à l'administration par voie topique, avantageusement elle est sensible aux UV-A.
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples et au vu des figures qui suivent qui sont donnés de façon indicative.
La figure 1 représente le spectre d'absorption UV-Visible d'une lamelle couvre-objet recouverte d'une couche de mélanine déposée dans des conditions expérimentales similaires à celles de l'exemple 1
La figure 2 représente l'évolution du profil d'intensité d'une particule obtenue selon l'exemple 1 le long d'un de ses diamètres au cours du temps, avant illumination par des UV-A et après illumination.
La figure 3 représente la cinétique d'induction de la fluorescence du polymère de polydopamine déposée sur les particules selon l'exemple 1. La figure 4 représente le temps moyen nécessaire à la remise en forme des particules obtenues à l'exemple 1 en fonction de la longueur d'onde utilisée (360 nm, 488nm et 560 nm), à une intensité d'illumination constante.
La figure 5 représente la représentation schématique de la fabrication de particules selon l'invention recouvertes d'une couche d'argent. La figure 5a montre une goutte d'huile de soja non enrobée ayant un diamètre de 7 micromètres. La figure 5b montre la particule obtenue selon l'invention après enrobage de la goutte d'huile par de la polydopamine. La figure 5c montre la particule après ensemencement avec du nitrate d'argent : les ions argent sont absorbés sur la couche de polydopamine. La figure 5d montre la particule enrobée par une couche d'argent sur la couche de polydopamine.
La figure 6 montre les images obtenues par microscopie optique avec une échelle de 10 μιτι des particules obtenues au cours du procédé d'enrobage avec de l'argent selon l'exemple 10. Les figures 6a, 6b, 6c et 6d correspondent aux étapes schématisées respectivement par les figures 5a, 5b, 5c et 5d.
La figure 7 représente l'histogramme de distribution de taille des particules de l'émulsion après chaque étape de la fabrication de l'exemple 10. La ligne rouge correspond à la gaussienne pour la distribution de taille des gouttes nues, c'est-à-dire non enrobées. Le diamètre moyen des particules est caractérisé par vidéomicroscopie à l'aide d'un microscope inversé Zeiss AxioObserver Dl équipé d'une caméra CCD de modèle Andor Clara E. Les images sont acquises à l'aide du logiciel open-source Micro-Manager (Vale Lab, UCSB)
Exemple 1 : mise en œuyre du procédé selon la présente invention
Produits chimiques utilisés : L'huile de soja (Réf. S7381), l'alginate de sodium (Réf. 180947), l'huile d'olive (Réf. 75343), le chlorhydrate de dopamine (chlorhydrate de 2-(3,4-Dihydroxyphenyl)éthylamine, Réf. H8502), le permanganate de potassium (KMnO4), le borate de sodium, le tensioactif Tween 20 (Polysorbate 20), la polyvinylpyrrolidone (PVP), le nitrate d'argent (AgNOs), le borohydrure de sodium, le citrate de sodium, l'acide ascorbique proviennent de la société Sigma-AIdrich. Le tensioactif copolymère tribloc Poloxamer 188 (HO(C2H4O)79-(C3H6O)28-(C2H4O)79H) a été fourni par Croda France SAS. Tous les produits chimiques ont été utilisés tels que livrés, sans aucun traitement ni purification ultérieure. Dans toutes les expériences, de l'eau milliQ doublement déminéralisée a été utilisée (Millipore, 18,2 ΜΩ.ατι-1).
Fabrication des émulsions. La fabrication des gouttes s'effectue en deux étapes : la première consiste en la fabrication d'une émulsion polydispersée en ajoutant peu à peu en cisaillant de l'huile de soja jusqu'à une fraction massique de 74%w/w dans une solution aqueuse contenant 15%w/w de tensioactif Poloxamer 188 et 2%w/w d'alginate de sodium préalablement dissous utilisé comme épaississant. La seconde étape est mise en œuvre pour avoir une dispersion en taille monodispersée : l'émulsion préalablement préparée est cisaillée dans une cellule de Couette sous un cisaillement constant de 5000 s"1, en suivant la méthode développée par Mason et al. [14].
Caractérisation de la distribution de taille des gouttes : En sortie de l'appareil de fragmentation et après dilution de la suspension dans une solution aqueuse contenant l%w/w de Poloxamer 188 pour la stabilité, la distribution en taille des gouttes a été caractérisé par vidéomicroscopie et leur diamètre moyen final est de 8 ± 2 microns.
Condensation de la mélanine à la surface des gouttes. La solution réactive est réalisée en dissolvant du chlorhydrate de dopamine à une concentration de 2 mg/mL (10 mmol/L) en présence d'une concentration de 5 mmol/L de permanganate de potassium (soit un ratio molaire permanganate de potassium/dopamine de 0,5) dans une solution tampon de borate de sodium (pH=8.5, 20mM) contenant 0,2 %w/w de tensioactif Tween 20 pour aider à la stabilisation des gouttes. Les gouttes d'émulsions sont ensuite lavées plusieurs fois avec le tampon borate et Tween 20 (noté dans la suite tampon BT) puis mélangées à une fraction massique en huile de 20%w/w dans le tampon de réaction. La suspension est mise à incuber à température ambiante et dans l'obscurité sur un mélangeur rotatif pendant 12h au moins. A la fin de la réaction, la suspension de gouttes est rincée plusieurs fois (au moins deux) avec le tampon BT par aspiration et remplacement du sous-nageant dans le tube pour enlever les réactifs qui n'auraient pas réagi de la solution.
Observation par microscopie: Les images en microscopie optique ont été réalisées à l'aide d'un microscope inversé Zeiss AxioObserver Dl équipé d'une caméra CCD de modèle Andor Clara E. Les images sont acquises à l'aide du logiciel open-source Micro-Manager (Vale Lab, UCSB). L'épi-illumination est effectuée avec une lampe à vapeur de mercure (Osram HBO 100W) et trois cubes de filtres pour l'observation en fluorescence (Semrock, Rochester, NY, USA) correspondant à des fluorophores DAPI (Exc: 360 ± 40 nm, Em.: 461 nm), FITC (GFP) (Exc: 488 ± 40 nm, Em.: 515 nm) et Texas Red (DsRED) (Exc: 560 ± 40 nm, Em.: 620 nm).
La température des échantillons a été maintenue constante et égale à 21°C dans les expériences en utilisant une platine de microscope thermoélectrique PE-100 (Linkam, Tadworth, UK) pour éviter une augmentation de la température de la suspension lors de l'utilisation de l'épi-illumination.
La puissance de sortie du système d'épi-illumination a été calibrée à l'aide d'un puissancemètre spécifiquement développé pour des mesures sous microscope (X-Cite Optical Powermeter, Lumen Dynamics, Canada).
Dans les expériences de remise en forme sphérique des gouttes, des filtres à densité neutre ont été utilisés sur le chemin optique d'épi- illumination pour étudier l'effet de la longueur d'onde sur le phénomène, indépendamment de la puissance émise.
Spectrométrie d'absorbance UV-Visible des dépôts de mélanine sur des lamelles de verre. La caractérisation par spectrométrie UV- Visible des couches de mélanine n'est pas directement réalisée sur les gouttes à cause d'une trop grande diffusion élastique qui empêche la mesure, mais après dépôt de la mélanine sur des substrats de verre transparents. Des lamelles couvre-objet de dimension 22x22mm sont, rincées à l'éthanol et dans l'eau déminéralisée, puis incubées pendant un temps supérieur à 12h à température ambiante, dans l'obscurité et sous agitation, dans une solution de condensation de dopamine similaire à celle utilisée pour les gouttes (chlorhydrate de dopamine [10 mmol/L] et KMn04 [5 mmol/L] dans un tampon BT). A la fin de la réaction, les lamelles sont rincées délicatement avec de l'eau déminéralisée et séchée à l'aide d'un papier non peluchant de type papier joseph. Les spectres UV-Visible sont réalisés avec un spectrophotomètre à double faisceau Perkin Elmer Lambda 45.
Résultats
Dans ces conditions expérimentales, un lot de gouttes d'huile de soja monodispersées ayant un diamètre moyen de 8 ± 2 microns enrobées par de la polydopamine a été obtenu. Les molécules de dopamine sont donc capables de polycondenser pour former une fine couche de polymère à la surface des gouttes, avec un mode de dépôt similaire à ce qui a été montré pour les dépôts de polydopamine sur des supports solides [8]. Il a été choisi d'utiliser un tampon borate plutôt que le tampon TrisHCI habituellement utilisé dans la littérature car celui-ci n'a pas d'activité rédox connue et qu'il a un effet protecteur pour les groupes catécholamines vis- à-vis de leur oxydation par l'oxygène dissous dans l'eau.
Evolution de la couleur de la solution de réaction en l'absence de gouttes: La réaction de condensation des molécules de dopamine dans des conditions aqueuses, alcalines et oxydantes se caractérise par des changements de la coloration de la solution au cours du temps. Lorsque la dopamine et le permanganate de potassium sont mélangés, la solution a une couleur rouge caractéristique, la solution de dopamine étant incolore. Au cours du temps, la solution devient peu à peu marron, grise puis noire pendant la longue incubation. La couleur noire est caractéristique de l'apparition de pigments de mélanine dans la solution.
Le spectre d'absorption de la couche de polydopamine déposée sur un substrat de verre a été mesuré (cf. figure 1). Le spectre d'absorption UV- Visible montre un maximum d'absorption aux alentours de 320 nm, soit dans la gamme des UV-A, et une absorbance décroissante en fonction de la longueur d'onde jusqu'à l'infrarouge proche, avec un spectre d'absorption quasi-plat jusqu'à 700 nm qui explique la couleur noire du dépôt. Ce spectre est semblable à ceux obtenus pour des molécules appartenant à la famille de la mélanine, comme l'eumélanine qui est formée biologiquement à partir de la tyrosine [9].
Après une centrifugation douce de la solution réactionnelle, un précipité noir apparaît au fond du tube qui correspond à des particules de mélanine formées par la polycondensation de la dopamine. En absence de permanganate de potassium, la solution de dopamine reste parfaitement incolore pendant plusieurs jours grâce à l'effet stabilisant du tampon borate sur les catécholamines.
Evolution de la couleur de la suspension au cours de la condensation: Simplement diluée dans un tampon borate, une suspension de gouttes d'émulsion d'huile de soja a une couleur blanche conséquence de la diffusion de la lumière par les gouttes. Après ajout de dopamine et de permanganate de potassium et plusieurs heures d'incubation, la suspension de gouttes obtenues par le procédé selon l'invention prend une couleur gris sombre qui ne varie plus avec le temps. Une centrifugation légère de la suspension fait crémer les gouttes en haut du tube, laissant apparaître une solution légèrement grise due à la présence de petites gouttes insensibles aux trop faibles vitesses de centrifugation. En revanche, la centrifugation de la solution ne fait apparaître aucun précipité noir en bas du tube prouvant que la réaction de polycondensation de la dopamine s'effectue uniquement à la surface des gouttes dans ces conditions expérimentales. En l'absence de permanganate de potassium, les gouttes d'émulsion dans une solution de dopamine conservent leur couleur blanche pendant plusieurs jours. Aspect des gouttes et stabilité colloïdale : Les gouttes d'émulsion de soja ont une forme sphérique dans leur état natif, grâce à l'existence d'une tension de surface de quelques mN/m. Après dépôt de polydopamine selon l'invention, plusieurs remarques peuvent être faites. Tout d'abord, la distribution de taille des gouttes n'est en aucun cas modifiée par le dépôt de mélanine et la stabilité colloïdale est complètement maintenue puisque les gouttes restent individuelles et ne font apparaître aucun agrégat adhésif.
Si la forme des gouttes est observée, il est visible que le dépôt de mélanine à leur surface peut induire des changements de forme assez importants, et notamment de leur rugosité de surface. Suivant l'âge de l'émulsion, et possiblement la modification de la tension de surface après oxydation de l'huile de soja au stockage par l'oxygène de l'air, les gouttes peuvent voir leur surface déformée par la formation du film de polymère. Induction de la fluorescence de la couche de mélanine par illumination UV : Observées par épifluorescence à différentes longueurs d'ondes d'émission et d'excitation, les gouttes ne sont pas fluorescentes avec ce système d'observation. Si l'échantillon est illuminé par épi- illumination à une longueur d'onde dans la gamme UV-A (365 nm), il est à remarquer que le contour des gouttes devient peu à peu fluorescent, comme le montre la Figure 2. La cinétique de cette augmentation de cette fluorescence suit une courbe en S représentée sur la Figure 3 qui peut être correctement ajusté par un modèle de Hill à trois paramètres.
Reprise de forme sphérique des gouttes rugueuses : Sans rentrer dans les détails moléculaires difficiles à expliquer, le système d'épi- illumination peut être utilisé pour redonner aux gouttes présentant un aspect déformé et rugueux leur forme sphérique correspondant aux gouttes d'huiles nues d'origine. Cette reprise de forme est irréversible et s'observe pour des longueurs d'onde d'illumination différentes dans le visible, avec toutefois une cinétique très différente suivant si l'illumination est effectuée dans l'UV ou dans le visible, comme le montre la Figure 4, puisque la reprise de forme est deux ordres de grandeurs plus rapide entre une illumination à 365nm par rapport à une illumination dans le vert, à 535 nm. Il a été confirmé que la température de l'échantillon n'a pas d'influence sur la forme des gouttes, et que finalement seul l'effet d'absorption lumineuse est en jeu. Bien que les détails de ce phénomène ne soient pas compréhensibles, les polymères comme la mélanine sont connus pour être de très bon convertisseurs d'absorption lumineuse en chaleur et aussi pour changer de structure par formation et recombinaison de radicaux sous illumination UV [9]. Il est possible que l'absorption lumineuse et la dissipation de chaleur soient suffisantes pour ramollir le film de polymère et laisser la tension de surface redonner sa forme sphérique à la goutte.
Exemple 2 : Effet du pH sur la condensation
Le même procédé que dans l'exemple 1 est mis en uvre sauf que la quantité de tampon borate est modifiée de façon à réaliser un exemple avec un pH de 7,5 et un exemple avec un pH de 9,5.
Quel que soit le pH utilisé, presqu'aucune différence n'est observé dans les particules obtenues, l'aspect de la suspension étant légèrement meilleure pour un pH de 8,5. Exemple 3 : Effet du ratio dopamine/KMn04 sur la condensation
Le même procédé que dans l'exemple 1 est mis en œuvre sauf que la teneur en KMn04 varie de façon à avoir ratio molaire KMn04/dopamine de 0, 0,1, 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 et 1. Il est à remarquer qu'aucune particule n'est obtenue dans le cas où le ratio molaire KMn04/dopamine et de 0 ou 0,1. À partir de 0,2, des particules comme dans l'exemple 1 sont obtenues. Il en est de même lorsque le ratio molaire est de 0,2, 0,4, 0,6, 0,8 ou 1.
Exemple 4 : Effet du tensioactif sur la condensation
Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, tensioactif anionique (SDS : dodécylsulfate de sodium) en une teneur de 0,2 % en poids ou un tensioactif cationique (CTAB : bromure de cétyltriméthylammonium) en une teneur de 0,1 % en poids ont été testés à la place du tensioactif non ionique Tween 20.
Dans le cas de l'utilisation du tensioactif anionique une déstabilisation totale de l'émulsion et la formation d'agrégats solides de polydopamine sont observés.
Dans le cas de l'utilisation du tensioactif cationique, l'émulsion est déstabilisée avant même ajout de dopamine.
Les tensioactifs anioniques et cationiques ne semblent donc pas pouvoir être utilisés dans le cadre du procédé de la présente invention Exemple 5 : Effet du tampon sur la condensation
Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, le tampon TrisHCI à un pH de 8,5 avec ou sans KMn04 et le tampon phosphate (sel de phosphate de sodium) avec ou sans KMn04 ont été testés. Dans les quatre cas il est possible d'obtenir des particules comme dans l'exemple 1. Ainsi dans le cas où le tampon TrisHCI ou le tampon phosphate sont utilisés, il n'est pas nécessaire d'utiliser un même temps du KMn04. En effet, le tampon TrisHCI et le tampon phosphate n'étant pas capables de complexer le noyau catéchol de la dopamine, celui-ci est donc disponible pour une oxydation par le dioxygène dissous dans le tampon. Exemple 6 : Effet de la concentration en dopamine sur la condensation
Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, en gardant un ratio permanganate/dopamine = 0,5, différentes concentration de dopamine HCI (entre 5 et 18mM) ont été testées. La formation de particules comme dans l'exemple 1 est observée dans tous les cas, la couleur variant du gris clair au gris foncé. La teneur en dopamine semble donc avoir une influence sur l'épaisseur de la peau des particules ainsi formées. Exemple 7 : Effet du type tensioactif non ionique sur la condensation
Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, le Tween 20 a été remplacé par le Poloxamer 188 à une teneur de 0,3%. Des particules comme dans l'exemple 1 sont obtenues. Ainsi donc le type de tensioactif non ionique ne semble pas avoir d'influence sur l'obtention des particules selon l'invention.
Exemple 8 : Effet des conditions réactionnelles (lumière ou obscurité) sur la condensation
Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, l'étape de condensation en présence de dopamine à lOmM et de KMnC à 5mM a été réalisée en éclairant la réaction pendant toute la durée du dépôt (lumière artificielle la nuit et naturelle le jour). Des particules comme dans l'exemple 1 sont obtenues. Ainsi donc la réaction peut avoir lieu aussi bien dans l'obscurité qu'à la lumière.
Exemple 9 : Effet du type d'huile végétale sur la condensation
Dans les mêmes conditions que dans l'exemple 1, de l'huile d'olive a été utilisée à la place de l'huile de soja. Des particules comme dans l'exemple 1 sont obtenues avec une taille inchangée. Ainsi donc le type d'huile végétale ne semble pas avoir d'influence sur l'obtention des particules selon l'invention. Exemple 10 : Enrobage des particules par une fine couche d'argent:
Les différentes étapes sont représentées à la figure 5 et les particules sont visualisées comme indiqué à la figure 6.
Les particules (figures 5b et 6b) sont obtenues dans les conditions de l'exemple 1 à l'exception des différences suivantes :
- le tampon TrisHCI a été utilisé à la place du tampon borate de sodium ;
- le temps de réaction est de 2 heures à température ambiante. Afin de recouvrir la surface de ces particules avec une couche d'argent, un procédé de métallisation non galvanique a été utilisé comprenant une étape d'ensemencement (figures 5c et 6c) et une étape de réduction (figures 5d et 6d).
Ainsi, tout d'abord les particules ont été dispersées dans un tampon TrisHCI (fraction égale à 5% en poids d'huile) contenant le tensioactif Tween 20 (0,2% en poids) et du AgN03 (0,176 M) pendant 90 minutes à température ambiante dans le noir. Durant cette étape d'ensemencement, la couche de polydopamine chargée négativement favorise l'absorption induite électrostatiquement des cations Ag+ à la surface des particules. Pendant la réaction, la suspension prend une couleur marron - rouge et une centrifugation montre que seule l'émulsion a changé de couleur, laissant le milieu réactionnel tampon totalement clair. La couleur marron de l'émulsion est la conséquence de la présence d'une faible quantité de nanoparticules d'argent à la surface des particules. La réduction de l'argent de certains cations absorbés est possible grâce au comportement redox intrinsèque de la couche de polydopamine.
Pour compléter la formation de la couche d'argent, 1,5 équivalents d'un agent réducteur et d'un polymère stabilisant (PVP, 0,02 % en poids par rapport au poids total de la solution) communément utilisé pour la synthèse de nanoparticules d'argent ont été ajoutés au milieu réactionnel contenant les particules. Après un temps de réaction court, c'est-à-dire environ une minute, la suspension a été rincée avec une solution de tampon TrisHCI contenant le tensioactif Tween 20 avant les observations par microscopie optique. Trois agents réducteurs ont été testés : le borohydrure de sodium, le citrate de sodium et l'acide ascorbique. L'acide ascorbique donne les meilleurs résultats. En absence de PVP, l'argent enrobe la paroi interne du tube contenant l'émulsion et existe à peine à la surface des particules. Les particules métallisées obtenues dans cet exemple sont parfaitement rondes et opaques à la lumière (figure 6d). Comme leur densité est supérieure à la densité de l'eau, elles s'agglomèrent au bas du tube les contenant. Après séchage par lyophilisation, les particules métallisées observées par cryo-SEM montrent une forme régulière sphérique. L'épaisseur de la couche de métal sur les particules est estimée à entre 50 - 100 nm.
Comme illustré à la figure 7, le procédé n'induit pas l'apparition d'une population de particules plus larges ce qui montre bien qu'il n'y a pas de coalescence ou d'agrégation irréversible des plus petites particules, phénomène qui est en général observé lorsqu'on manipule des colloïdes liquides. La distribution de taille des particules reste donc identique entre le début du procédé (avant métallisation) et la fin du procédé (après métallisation)(figure 7). La stabilité exceptionnelle de l'émulsion lors de ce procédé a deux origines différentes : premièrement la présence d'une couche de polydopamine fournit un potentiel négatif fort à l'interface des particules ce qui induit une stabilisation électrostatique de la suspension et réduit la survenance de la coalescence. Deuxièmement la couche de polydopamine agit comme une peau de polymère à la surface des gouttes qui est plus difficile à perturber qu'une simple interface huile/eau stabilisée pas un tensioactif. Observées par microscopie épifluorescence, les particules métallisées montrent une forte et large gamme de fluorescence observée avec les filtres DAPI, GFP et DsRED. La fluorescence des particules ne montre pas de photoblanchiment à la fin de la période de 10 minutes d'illumination continue que l'on observe en général avec les fluorophores moléculaires. Quelle que soit la longueur d'onde d'illumination, on obtient la même dynamique d'accroissement de fluorescence avec le temps.
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[15] WO2008/049108.
[16] WO2012/160120.
[17] FR2747321.

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de fabrication de particules de type cœur - écorce, le cœur comprenant une huile végétale et l'écorce comprenant un polymère de polydopamine, le procédé comprenant les étapes suivantes :
a - préparation d'une émulsion monodispersée d'une huile végétale dans une solution aqueuse ;
b - mise en contact dans des conditions oxydantes de l'émulsion obtenue à l'étape a) avec une solution tamponnée ayant un pH supérieur à 7 et comprenant un tensioactif non ionique et un composé de formule I suivante :
Figure imgf000035_0001
dans laquelle Ri représente un atome d'hydrogène ou un groupe -COOH, R2 représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH, R3 représente un atome d'hydrogène ou un groupe alkyle en Ci-C3 et R* représente un atome d'hydrogène ou un groupe -OH de façon à polycondenser un polymère à la surface des gouttes de l'émulsion;
c - récupération des particules de type cœur - écorce obtenues à l'étape b).
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que les conditions oxydantes de l'étape b) consistent en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium ou en l'utilisation d'un tampon tris HCI ou d'un tampon phosphate, avantageusement en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium.
3. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce qu'à l'étape b) le pH est compris entre 7,5 et 9,5, avantageusement il est de 8,5.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que Ri, R3 et R4 représentent un atome d'hydrogène et R2 représente un groupe -OH.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que les particules sont des microparticules ou des nanoparticules, avantageusement ayant un diamètre moyen compris entre 400 nm et 20 pm.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le tensioactif non ionique de l'étape b) est un polysorbate ou un polymère tribloc, avantageusement présent en une teneur comprise entre 0,2 et 0,3% en poids par rapport au poids total de la solution tamponnée.
7. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6, caractérisé en ce que l'huile végétale est de l'huile de soja ou de l'huile d'olive, avantageusement de l'huile de soja contenant en poids par rapport au poids total de l'huile
- entre 7 et 10 % d'acide alpha linolénique ;
- entre 50 et 54 % d'acide linoléique ;
- entre 23 et 24 % d'acide oléique ;
- entre 10 et 11 % d'acide palmitique ; - 4 % d'acide stéarique.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 7, caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire d) de greffage d'une couche fonctionnelle sur la peau des particules, avantageusement la couche fonctionnelle est une couche de métallisation, une couche nucléophile telle que des protéines, des acides nucléiques, des molécules fluorescentes ou de l'acide hyaluronique ou une couche polymérique, et récupération des particules fonctionnalisés obtenues.
9. Procédé selon la revendication 8 caractérisé en ce que l'étape d) est une étape de greffage d'une couche de métallisation par un procédé de métallisation non galvanique et en ce qu'elle comprend l'ensemencement de la peau des particules avec du métal, avantageusement de l'argent, du fer, du cuivre, du nickel ou leur alliages, suivi par l'ajout d'un agent réducteur et d'un polymère stabilisant, le polymère étant avantageusement du polyvinylpyrrolidone.
10. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 9 caractérisé en ce qu'il comprend une étape préalable al) avant l'étape a) de mélange de l'huile végétale avec un composé hydrophobe, avantageusement un principe actif pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptable tel que la vitamine E.
11. Procédé selon l'une quelconque des revendications 4 à 10 caractérisé en ce que les conditions oxydantes de l'étape b) consistent en l'utilisation d'un tampon borate et de permanganate de potassium et en ce que le ratio molaire permanganate de potassium /dopamine est compris entre 0,2 et 1.
12. Procédé selon l'une quelconque des revendications 10 à 11 caractérisé en ce qu'il comprend une étape supplémentaire e) d'induction de fluorescence par illumination des particules obtenues à l'étape c) ou d) avec une lumière UV.
13. Particules susceptibles d'être obtenues par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 12.
14. Utilisation des particules selon la revendication 13 pour encapsuler des principes actifs hydrophobes pharmaceutiquement ou cosmétiquement acceptables et/ou en tant que traceurs fluorescents et/ou pour le relargage contrôlé par la lumière ou par des conditions physico-chimiques telles que le pH, de principes actifs hydrophobes et/ou en tant que traceur pour mesure de vélocimétrie par image de particules, en particulier de microvélocimétrie par images de particules, et/ou en tant que catalyseur colloïdal pour l'ozonolyse et/ou en tant que matériau de stockage de chaleur latente .
15. Composition pharmaceutique, cosmétique ou de diagnostique comprenant des particules selon la revendication 13 et un excipient pharmaceutiquement, cosmétiquement ou diagnostiquement acceptable.
16. Composition selon la revendication 15 caractérisée en ce qu'elle est destinée à l'administration par voie topique, avantageusement en ce qu'elle est sensible aux UV-A.
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