EP3452586A1 - Mutants du facteur x - Google Patents

Mutants du facteur x

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Publication number
EP3452586A1
EP3452586A1 EP17727638.3A EP17727638A EP3452586A1 EP 3452586 A1 EP3452586 A1 EP 3452586A1 EP 17727638 A EP17727638 A EP 17727638A EP 3452586 A1 EP3452586 A1 EP 3452586A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
seq
sequence
factor
propeptide
protein according
Prior art date
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Withdrawn
Application number
EP17727638.3A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Abdessatar Sami Chtourou
Jean-Luc Plantier
Toufik ABACHE
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
LFB SA
Original Assignee
LFB SA
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Filing date
Publication date
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Publication of EP3452586A1 publication Critical patent/EP3452586A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
    • C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
    • C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
    • C12N9/6432—Coagulation factor Xa (3.4.21.6)
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
    • A61K38/16—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
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    • A61K38/46—Hydrolases (3)
    • A61K38/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
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    • A61P7/04—Antihaemorrhagics; Procoagulants; Haemostatic agents; Antifibrinolytic agents
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    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/62—DNA sequences coding for fusion proteins
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    • C12N2015/8518—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic expressing industrially exogenous proteins, e.g. for pharmaceutical use, human insulin, blood factors, immunoglobulins, pseudoparticles

Definitions

  • the present invention relates to factor X mutants, and their use for the treatment of blood coagulation disorders.
  • Factor X is a protein found in the blood. This protein plays an important role in the coagulation cascade. Blood clotting is a complex process that prevents the flow of blood through damaged vessels. As soon as a vessel is broken, the elements responsible for coagulation interact with each other to form a plug, the platelet nail, where the vessel is broken. Coagulation factors are required to hold the platelet nail in place and stabilize the clot.
  • Step 1 The blood vessel is damaged.
  • Step 2 The blood vessel contracts to restrict blood supply to the injured area.
  • Step 3 Platelets adhere to the subendothelial space exposed during vessel injury and to the walls of the stimulated blood vessels. Platelets spread out, this is called platelet adhesion. These spread platelets release substances that activate other nearby platelets to agglomerate at the lesion site to form the platelet nail. This is called platelet aggregation.
  • Step 4 The surface of the activated platelets thus constitutes a surface on which blood coagulation can take place.
  • Coagulation proteins circulating in the blood (including factor X) are activated on the surface of platelets and form a fibrin clot.
  • coagulation proteins i.e., factors I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII and XIII, as well as von Willebrand factor
  • Factor X in activated form (Xa) intervenes more particularly in the activation of prothrombin (factor II) in thrombin (factor Ha), in particular when it is complexed with activated c-factor V to form the prothrombinase complex.
  • This factor is an essential element in the coagulation cascade.
  • Factor X deficiency is extremely rare. Its transmission is autosomal recessive, and its prevalence is 1: 1,000,000.
  • the first 42 amino acids of the factor X light chain represent the "Gla” domain, phospholipid binding domain.
  • the "Gla” domain contains 11 residues of glutamic acid (Glu) all or partially post-translational (gamma-carboxylated) to give ⁇ -carboxyglutamic acid (Gla).
  • Glu glutamic acid
  • Gla ⁇ -carboxyglutamic acid
  • Factor X is thus a coagulation protein whose biological activity depends on the degree of gamma-carboxylation of its "Gla” domain.
  • Gla proteins or Gla domain proteins are vitamin K-dependent.
  • Vitamin K is a fat-soluble vitamin implicated in gamma carboxylation of protein residues of glutamates to form gamma-carboxyglutamate residues.
  • Gamma-carboxyglutamate residues are essential for the biological activity of all proteins possessing Gla domains, in particular via a high affinity binding to calcium ions.
  • gamma-carboxylated Glu residues also referred to as Gla residues
  • Gla residues gamma-carboxylated Glu residues
  • the presence of Glu residues on factor X and their level of gamma-carboxylation is essential to the functional activity of activated factor X.
  • a modified thrombin-activated factor X having a gamma-carboxylation level which would allow effective coagulation in the absence of factor VIII and / or factor IX by direct use. traces of thrombin generated during the initiation of coagulation.
  • factor X-specific mutants also called X variant factors
  • factor X-specific mutants identified by the inventors can also restore coagulation in the absence of factor X.
  • these factor X mutants can be activated by thrombin, and allow efficient coagulation. even in the absence of factor VIII and / or factor IX and / or endogenous factor X.
  • factor X mutants advantageously have a high level of gamma-carboxylation.
  • high degree of gamma-carboxylation is meant a gamma-carboxylation level of at least 20%, preferably at least 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%.
  • 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% of gamma-carboxylation of plasma factor X considered 100%.
  • the present invention relates to a protein which is a variant of factor X comprising a mutated sequence of SEQ ID NO: 1, said protein comprising at its N-terminus the natural signal peptide of factor X represented by the sequence SEQ ID NO: 7 , and a propeptide different from the natural propeptide of factor X.
  • the present invention relates to a protein comprising a mutated sequence of SEQ ID NO: 1, said mutated sequence of SEQ ID NO: 1 comprising an A, A ', B, C or C mutation, wherein:
  • mutation A consists in the substitution of amino acids 43 to 52 of the sequence SEQ ID NO: 1 by a sequence chosen from DFLAEGLTPR, KATN * ATLSPR and KATXATLSPR,
  • mutation A consists of the substitution of amino acids 47 to 52 of the sequence SEQ ID NO: 1 by a sequence chosen from TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR and LSCGQR,
  • mutation B consists of the insertion of a sequence chosen from DFLAEGLTPR, KATN * ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR and LSCGQR, between amino acids 52 and 53 of the sequence SEQ ID NO: 1,
  • mutation C consists in the insertion of a sequence chosen from DFLAEGLTPR, KATN * ATLSPR and KATXATLSPR, between amino acids 52 and 53 of the sequence SEQ ID NO: 1, and in the deletion of amino acids 4 to 13 of the sequence SEQ ID NO: 1, mutation C consists in the insertion of a sequence selected from TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR and LSCGQR, between amino acids 52 and 53 of the sequence SEQ ID NO: 1, and in the deletion of amino acids 4 to 9 of the sequence SEQ ID NO: 1,
  • N * is an optionally glycosylated asparagine
  • the present invention relates to a protein comprising a mutated sequence of SEQ ID NO: 1 , said mutated sequence of SEQ ID NO: 1 comprising a mutation consisting of the insertion of a sequence selected from DFLAEGLTPR, KATN * ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR and LSCGQR, between amino acids 52 and 53 of the sequence SEQ ID NO: 1 (ie mutation B above),
  • N * is an optionally glycosylated asparagine, and said protein comprising at its N-terminal end the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 7 fused to a propeptide of a coagulation factor different from factor X.
  • a protein according to the invention is a mutated factor X, which is effective in the treatment of coagulation disorders.
  • sequence coding for a mutated factor X comprising a combination of sequences from the N-terminus to the C-terminus, namely:
  • a mutated sequence of SEQ ID NO: 1 according to the invention makes it possible to directly impact the gamma-carboxylation of the expressed factor X, increased with respect to a factor X comprising a mutated sequence of SEQ ID NO: 1 according to the invention, but not comprising at the N-terminal end the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 7 fused to a propeptide of a coagulation factor different from factor X.
  • such factor X mutants have a gamma carboxylation of at least 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% of gamma-carboxylation of plasma factor X, considered 100%.
  • Another subject of the invention is a polynucleotide encoding said protein.
  • Another subject of the invention is an expression vector comprising said polynucleotide.
  • Another subject of the invention is a host cell comprising said expression vector or said polynucleotide.
  • said protein may be used for the treatment of blood coagulation disorders, in particular hemorrhagic disorders, such as haemophilia A, B and C (factor XI deficiency), or even deficits in factor X, or even the need for emergency coagulation to replace Factor VIIa.
  • hemorrhagic disorders such as haemophilia A, B and C (factor XI deficiency), or even deficits in factor X, or even the need for emergency coagulation to replace Factor VIIa.
  • said protein can be used in combination with other hemostatic molecules, such as factor VIIa and / or fibrinogen, or even in combination with procoagulant compounds (platelet transfusion, procoagulant mixture such as FEIBA, Kaskadil, Kanokad etc.), which may enhance the effectiveness of treatment .
  • protein refers to an amino acid sequence having more than 100 amino acids.
  • the protein consists of an amino acid sequence having between 100 and 1000 amino acids, preferably between 120 and 600 amino acids.
  • a factor X variant according to the invention advantageously has a high level of gamma carboxylation.
  • high gamma-carboxylation level is meant a gamma-carboxylation level of at least 20%, preferably at least 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%. 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% of gamma-carboxylation of plasma factor X, considered 100%.
  • the calculation of said gamma-carboxylation level can be carried out by any conventional technique for detecting and then quantifying Gla residues, such as the ELISA technique using an anti-Gla antibody for the capture of gamma-carboxylated X factors.
  • the optical density measurement obtained for a factor X varying according to the invention can be related to the measurement of optical density obtained for the same amount of plasma factor X obtained according to the same production method, considered as the reference measurement. gamma-carboxylation rate at 100%.
  • a factor X variant according to the invention comprises at least 2 gamma-carboxylated Glu residues (Le, Gla residues) among 1 1 Glu, at least 3 gamma-carboxylated residues among 11 Glu, at least 4 gamma-carboxylated residues.
  • a variant of factor X according to the invention comprises at least 10 of the 11 gamma-carboxylic acid residues mentioned above, present on the Gla domain of the light chain factor X, gamma-carboxylated.
  • a factor X variant according to the invention comprises 10 gamma-carboxylated Glu residues (10 Gla residues). More preferentially, a factor X variant according to the invention comprises 11 gamma-carboxylated Glu residues (11 residues). Gla)
  • the invention relates to a composition of factor X variants according to the invention, advantageously having a high level of gamma-carboxylation within the composition.
  • High level of gamma-carboxylation within the composition means a gamma-carboxylation level of at least 20%, preferably at least 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%. %, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% of gamma carboxylation in a plasma factor X composition, considered 100%.
  • a factor X variant composition according to the invention may comprise a homogeneous gamma-carboxylated factor X population for the number of Gla residues.
  • a factor X variant composition according to the invention comprises a population of gamma-carboxylated X-factors each comprising 10 Gla residues.
  • a factor X variant composition according to the invention comprises a population of gamma-carboxylated X-factors each comprising 11 Gla residues.
  • a factor X variant composition according to the invention may comprise a heterogeneous gamma-carboxylated factor X population, comprising at least two gamma-carboxylated factor X populations not comprising the same number of gamma-carboxylated Gla residues.
  • a factor X variant composition according to the invention may comprise 50% variants comprising 10 Gla residues and 50% variants comprising 11 Gla residues.
  • Factor X also called Stuart-Power factor, is encoded by the F10 gene and refers to serine protease EC3.4.21.6.
  • Factor X is composed of a heavy chain, 306 amino acids, and a light chain, 139 amino acids.
  • Factor X is a 488 amino acid protein consisting of a signal peptide, a propeptide, and light and heavy chains. Human X factor can be found in UniProtKB under accession number P00742. Its primary structure is illustrated in Figure 1.
  • the protein is translated as a prepropeptide. After cleavage of the signal peptide, the propeptide is finally cleaved, resulting in a light chain and a heavy chain (142 and 306 amino acids respectively) (zymogen). Following the onset of coagulation, the heavy chain is finally activated by cleavage of the activation peptide, to contain only 254 amino amino acids (the first 52 amino acids are cleaved during treatment): it is the heavy chain of the factor Xa (SEQ ID NO: 6).
  • the human factor X prepropeptide corresponds to SEQ ID NO: 4.
  • the unactivated human factor X heavy chain corresponds to SEQ ID NO: 1, and the light chain corresponds to SEQ ID NO: 5.
  • heavy chain corresponds to SEQ ID NO: 3, and comprises 52 amino acids.
  • the signal peptide corresponds to SEQ ID NO: 7, and comprises 31 amino acids.
  • the natural propeptide of factor X corresponds to SEQ ID NO: 8, and comprises 9 amino acids.
  • SEQ ID NO: 2 is identical to amino acids 1 to 182 of SEQ ID NO: 4.
  • SEQ ID NO: 1 is identical to amino acids 183 to 488 of SEQ ID NO: 4.
  • the factor Xa heavy chain corresponds to SEQ ID NO: 1, in which the activation peptide represented by SEQ ID NO: 3 was cleaved.
  • natural propeptide of factor X preferably refers to a variant of the natural propeptide of human factor X represented by the sequence SEQ ID NO: 9 which comprises 9 amino acids.
  • the protein according to the invention is a mutant (or variant) factor X.
  • the preferred mutation according to the invention consists in the insertion of a sequence chosen from DFLAEGLTPR, KATN * ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR and LSCGQR, between amino acids 52 and 53 of the sequence SEQ ID NO: 1 ("mutation B"), where N * is an optionally glycosylated asparagine.
  • the mutation according to the invention consists of the insertion of the sequence DFLAEGLTPR between amino acids 52 and 53 of the sequence SEQ ID NO: 1.
  • sequence SEQ ID NO: 1 comprising a mutation according to the invention is also called "mutated sequence of SEQ ID NO: 1".
  • sequence SEQ ID NO: 1 comprising a mutation according to the invention consists of the sequence SEQ ID NO: 3, fused at its C-terminal end to a sequence chosen from DFLAEGLTPR, KATN * ATLSPR , KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR and LSCGQR ("mutation B"), where N * is an optionally glycosylated asparagine, itself fused at its C-terminus to the sequence SEQ ID NO: 6.
  • the mutated sequence of SEQ ID NO: 1 corresponds to SEQ ID NO: 11.
  • the propeptide used in the protein according to the invention is different from the natural propeptide of factor X.
  • the propeptide used in the protein according to the invention is that of a vitamin K dependent protein.
  • the propeptide used in the protein according to the invention is chosen from the propeptide of the protein S, the propeptide of the protein Z, the propeptide of FIX, the propeptide of one of the proteins GAS6, BGP, MGP, and PRGP1, PRGP2, TMG3 and TMG4, the propeptide of thrombin, the propeptide of factor VII, the propeptide of protein C, including their natural isoforms or modified versions thereof.
  • modified version is meant that the propeptide used is truncated, and optionally comprises the insertion of one or more amino acids, for example at its N-terminus.
  • the propeptide used in the protein according to the invention is that of a coagulation factor different from factor X.
  • the propeptide used in the protein according to the invention is preferably the natural propeptide of a different coagulation factor.
  • the propeptide is selected from the propeptide of thrombin, the propeptide of factor VII, the propeptide of protein C, their natural isoforms or modified versions thereof.
  • the propeptide of factor VII according to the invention corresponds to isoform A of the propeptide of factor VII (or "FVIIvl") and has for sequence SEQ ID NO: 14.
  • the propeptide of factor VII according to the invention corresponds to to the isoform B of the factor VII propeptide (or "FVIIv2") and has the sequence SEQ ID NO: 15.
  • the propeptide is chosen from the sequences SEQ ID NO: 13, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO: 15 and SEQ ID NO: 16. More preferably, the propeptide has the sequence SEQ ID NO: 14.
  • the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 7 fused to a propeptide different from the natural propeptide of factor X is chosen from the sequences SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20 and SEQ ID NO: 21 . More preferably, the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 7 fused to a propeptide different from the natural propeptide of factor X is represented by the sequence SEQ ID NO: 19.
  • sequence SEQ ID NO: 19 makes it possible to directly impact the gamma-carboxylation of the mutated factor X comprising such a combination, with respect to a mutated factor X comprising a mutated sequence of SEQ ID NO: 1 according to the invention, but not comprising at its N-terminal end the sequence SEQ ID NO: 19.
  • the protein according to the invention preferably comprises an intermediate sequence, between the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 7 fused to a propeptide different from the natural propeptide of factor X and the mutated sequence of SEQ ID NO: 1.
  • intermediate sequence is fused at its N-terminus, to the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 7 fused to a propeptide different from the natural propeptide of factor X, and at its C-terminus, to the mutated sequence of SEQ ID NO: 1.
  • said intermediate sequence is the sequence of the light chain of factor X, preferably the sequence SEQ ID NO: 5.
  • the protein according to the invention thus preferably comprises, from the N-terminus to the C-terminus:
  • the protein according to the invention comprises, in the N- to C-terminal direction, the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 7 fused to a propeptide different from the natural propeptide of factor X, then the sequence SEQ ID NO: 5, then the mutated sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the protein according to the invention preferably comprises, from the N-terminal to the C-terminal end:
  • the protein according to the invention preferably comprises, from the N-terminus to the C-terminal end: the signal peptide of sequence SEQ ID NO: 7 fused to a propeptide different from the natural propeptide of factor X, fused to the sequence SEQ ID NO: 17.
  • the protein according to the invention comprises, preferably consists of, a sequence chosen from SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 24 and SEQ ID NO: 25. More preferably, the protein according to the invention comprises, preferably consists of, the sequence SEQ ID NO: 23.
  • the mutated sequence of SEQ ID NO: 1 comprising an A, A ', B, C or C mutation may further comprise at least one mutation of at least one amino acid that does not alter the functional activity of the protein according to invention.
  • the mutated sequence of SEQ ID NO: 1 comprising an A, A ', B, C or C mutation and further comprising at least one additional mutation of at least one amino acid that does not impair the functional activity has at least 80% identity, at least 81% at least 82%, at least 83%, at least 84%, at least 85%, at least 86%, at least 87%, at least 88%, at least 89%, at least 90%, at least 91%, at least 92%, at least 93%, at least 94%, at least 95%, at least 96%, at least 97%, at least 98%, at least 99% identity with the mutated sequence of SEQ ID NO: 1 comprising only an A, A ', B, C or C mutation.
  • the protein according to the invention may also be fused at the C-terminal to at least one wild-type immunoglobulin fragment, optionally mutated.
  • wild-type immunoglobulin fragment is meant a fragment selected from wild-type Fc fragments and wild-type scFc fragments, optionally mutated.
  • Fc fragment is meant the constant region of a full length immunoglobulin excluding the first immunoglobulin constant region domain (i.e. CH1-CL).
  • the Fc fragment refers to a homodimer, each monomer comprising the last two constant domains of IgA, IgD, IgG (ie CH2 and CH3), or the last three constant domains of IgE and IgM (ie CH2, CH3 and CH4), and the flexible N-terminal hinge region of these domains.
  • the Fc fragment when it is derived from IgA or IgM, may comprise the J chain.
  • the Fc region of an IgG1 is composed of the flexible N-terminal hinge and the CH2-CH3 domains. that is, the portion from amino acid C226 to the C-terminus, the numbering being indicated according to the EU number or equivalent in Kabat.
  • scFc fragment ("single chain Fc) is meant a single chain Fc fragment, obtained by genetic fusion of two Fc monomers linked by a polypeptide linker.
  • the linker may be - (GGGGS) n-, where n is an integer of 1 to 3.
  • the scFc folds naturally into a functional dimeric Fc region.
  • the scFc fragment preferably has the sequence SEQ ID NO: 42 (which corresponds to SEQ ID NO: 36 fused to C-terminal at -GGGGS- fused at C-terminal to SEQ ID NO: 37) optionally followed by a lysine .
  • the fusion of the protein according to the invention with at least one fragment of wild-type immunoglobulin (in particular a Fc or scFc fragment) at the C-terminal makes it possible to improve the stability and the retention of the protein in the body, and thus its bioavailability; it also improves its half-life in the body.
  • the wild-type Fc fragment is chosen from the sequence SEQ ID NO: 36 and the sequence SEQ ID NO: 37 optionally followed by a C-terminal lysine (226 or 227 amino acids respectively for SEQ ID NO: 36, 231 or 232 amino acids respectively for SEQ ID NO: 37).
  • the Fc fragment corresponding to the sequence SEQ ID NO: 36 comprises the constant domains CH2 and CH3 of a wild type IgG and the partial hinge region in N-terminal (DKTHTCPPCP, SEQ ID NO: 38).
  • the fragment corresponding to the sequence SEQ ID NO: 37 comprises the constant domains CH2 and CH3 of a wild type IgG and the entire hinge region at the N-terminal (sequence EPKSSDKTHTCPPCP, SEQ ID NO: 39, variant of the present natural sequence on a wild-type IgG, sequence EPKSCDKTHTCPPCP, SEQ ID NO: 81).
  • the protein according to the invention fused to a C-terminal wild type Fc fragment has the sequence SEQ ID NO: 40 optionally followed by a C-terminal lysine.
  • Its corresponding nucleic acid has the sequence SEQ ID NO: 41 optionally followed by a codon coding for a C-terminal lysine.
  • nucleic acid was obtained by gene synthesis with codon optimization for Homo sapiens and has the sequence SEQ ID NO: 82.
  • the protein according to the invention fused to a C-terminal wild type scFc fragment has the sequence SEQ ID NO: 43 optionally followed by a C-terminal lysine.
  • Its corresponding nucleic acid has the sequence SEQ ID NO: 44 optionally followed by a codon coding for a C-terminal lysine.
  • the wild-type Fc fragment or the wild-type scFc fragment used according to the invention can be mutated according to the "knobs-into-holes" technology.
  • This technology is described in the application WO96 / 27011 of Genentech: it consists in obtaining heterodimers, which comprise and preferably pair at a constant CH3 domain of antibodies.
  • These heterodimers preferably 2 Fc fragments or one scFc, comprise various point mutations, which induce a "protuberance-in-cavity" (knobs-into-holes) interface.
  • a first mutation on the first monomer induces a protuberance
  • a second mutation on the second monomer induces a cavity, so that the heterodimer pairs preferentially.
  • the first monomer ie an Fc fragment or Fc monomer of the scFc fragment
  • the second monomer ie an Fc fragment or Fc monomer of the scFc fragment
  • Nucleic acid encoding the protein SEQ ID NO: 40 optionally followed by a codon encoding a lysine 42 Wild scFc fragment, possibly followed by lysine
  • Nucleic acid encoding the protein SEQ ID NO: 43 optionally followed by a codon encoding a lysine
  • nucleic acid polynucleotide
  • the nucleic acid is chosen from the sequences SEQ ID NO: 32 to 35.
  • the expression vectors suitable for use according to the invention may comprise at least one expression control element operably linked to the nucleic acid sequence.
  • the expression control elements are inserted into the vector and make it possible to regulate the expression of the nucleic acid sequence.
  • expression control elements include lac systems, lambda phage promoter, yeast promoters or viral promoters.
  • Other operational elements may be incorporated, as a leader sequence, termination codons, polyadenylation signals and sequences necessary for transcription and subsequent translation of the nucleic acid sequence into the host system. It will be understood by those skilled in the art that the correct combination of expression control elements depends on the chosen host system. It will also be understood that the expression vector should contain the additional elements necessary for the subsequent transfer and replication of the expression vector containing the nucleic acid sequence in the host system.
  • the expression vector used is a polycistronic vector comprising a polynucleotide encoding a protein according to the invention, a polynucleotide encoding the enzyme VKOR, preferably for subunit 1 of the vitamin K epoxide reductase complex ( VKORC1) wild-type human, and optionally a polynucleotide encoding furin, and / or a polynucleotide encoding an Fc fragment in the context of the production of variants according to the invention fused to an Fc fragment.
  • VKORC1 vitamin K epoxide reductase complex
  • the co-expression of furin optimizes the natural cleavage within the cell at the natural cleavage sites present on factor X (RRKR).
  • the expression vector used is a bicistronic comprising a polynucleotide encoding a protein according to the invention, and a polynucleotide encoding the enzyme VKOR, preferably for subunit 1 of the vitamin K epoxide reductase complex ( VKORC1) wild human.
  • Subunit 1 of the wild-type human vitamin K epoxide reductase (VKORC1) complex is the catalytic subunit of the complex; it is a protein of 163 amino acids.
  • the sequence of this wild-type human subunit can be found in UniProt under accession number Q9BQB6 (SEQ ID NO: 45).
  • the nucleic acid encoding this protein has the sequence SEQ ID NO: 46.
  • This protein is present in the endoplasmic reticulum of the cells.
  • the polynucleotide encoding the VKOR enzyme may also be a polynucleotide encoding a mutated VKOR.
  • the expression vectors used are as many vectors as polynucleotides to be expressed, one comprising a polynucleotide encoding a protein according to the invention, another comprising a polynucleotide encoding the VKOR enzyme mentioned above, optionally another comprising a polynucleotide encoding furin, and / or another comprising a polynucleotide encoding an Fc or scFc fragment; in the context of the production of variants according to the invention fused to an Fc or scFc fragment.
  • Another subject of the invention is a recombinant cell comprising an expression vector as described above, or a polynucleotide as described above.
  • host cells that can be used are eukaryotic cells, such as animal, plant, insect and yeast cells; and prokaryotic cells, such as E. coli.
  • the means by which the vector carrying the gene can be introduced into the cells include microinjection, electroporation, transduction or transfection using DEAE-dextran, lipofection, calcium phosphate or other procedures. known to those skilled in the art.
  • expression vectors for expression in eukaryotic cells are used.
  • vectors examples include viral vectors such as retroviruses, adenovirus, herpes virus, vaccinia virus, variola virus, poliovirus, lentivirus, bacterial expression vectors or plasmids such as pcDNA5.
  • Preferred eukaryotic cell lines include COS cells, CHO cells, HEK cells including HEK293 (ATCC # CRL1573), YB2 / 0 cells, BHK cells, PerC6 cells, HeLa cells, NIH / 3T3 cells, T2 cells, dendritic cells or monocytes.
  • the cells used are HEK cells. More preferably, the cells used are YB2 / 0 cells. More preferably, the cells used are CHO cells.
  • Another subject of the invention is a method for producing a protein according to the invention, said protein comprising a light chain (preferably SEQ ID NO: 5), comprising:
  • a polycistronic vector preferably bicistronic, in a host cell, preferably an HEK cell, more preferably YB2 / 0, even more preferably a CHO cell, said vector comprising a polynucleotide encoding a protein according to the invention, and a polynucleotide encoding the enzyme VKOR, preferably for subunit 1 of the wild-type human vitamin K epoxide reductase (VKORC1) complex, preferably in the presence of vitamin K;
  • concentration of the supernatant optionally carried out in step d) can be carried out by any well-known technique, such as by passing on concentration cassettes, by tangential filtration, or by using chromatography columns to concentrate the product.
  • Another subject of the invention is a method for producing a protein according to the invention, said protein comprising a light chain (preferably SEQ ID NO: 5), comprising:
  • aptamers used in the methods described above are in particular those described in the patent application WO2011 / 012831.
  • the aptamer used has the following sequence:
  • this aptamer specifically binds to the biologically active forms of factor X.
  • the methods for producing a protein according to the invention comprising a purification step using an aptamer column described above, make it possible to obtaining biologically active forms of factor X.
  • the protein according to the invention can be produced in the milk of transgenic animals.
  • the expression of the polynucleotide encoding the protein according to the invention is controlled by a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter, said promoter not naturally controlling the transcription of said gene, and the polynucleotide further containing a secretion sequence of the protein.
  • the secretion sequence comprises a secretion signal interposed between the gene and the promoter.
  • the transgenic animal used is capable not only of producing the desired protein, but also of transmitting this ability to its offspring.
  • the secretion of the protein in the milk facilitates purification and avoids the use of blood products.
  • the animal can thus be chosen from the mouse, the goat, the rabbit, the sheep or the cow.
  • the protein according to the invention can be used as a medicament. Therefore, the protein according to the invention can be introduced into a pharmaceutical composition.
  • the protein according to the invention can be used for the treatment of coagulation disorders, in particular hemorrhagic disorders.
  • the pharmaceutical composition of the invention may be combined with pharmaceutically acceptable excipients, and optionally extended release matrices, such as biodegradable polymers, to form a therapeutic composition.
  • the pharmaceutical composition of the present invention may be administered orally, sublingually, subcutaneously, intramuscularly, intravenously, intraarterially, intrathecally, intraocularly, intracerebrally, transdermally, locally or rectally.
  • the active ingredient, alone or in combination with another active ingredient can then be administered in unit dosage form, in admixture with conventional pharmaceutical carriers.
  • Unit dosage forms include oral forms such as tablets, capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual and oral forms of administration, aerosols, subcutaneous implants, transdermal, topical, intraperitoneal, intramuscular, intravenous, subcutaneous, intrathecal, intranasal administration forms and rectal administration forms.
  • the pharmaceutical composition contains a pharmaceutically acceptable carrier for a formulation that can be injected.
  • a pharmaceutically acceptable carrier for a formulation that can be injected.
  • It may be in particular isotonic, sterile, saline solutions (with monosodium or disodium phosphate, sodium chloride, potassium chloride, calcium or magnesium chloride and the like, or mixtures of such salts), or freeze-dried compositions which, when adding sterilized water or physiological saline as appropriate, allow the constitution of injectable solutions.
  • Suitable dosage forms for injectable use include sterile aqueous solutions or dispersions, oily formulations, including sesame oil, peanut oil, and sterile powders for the preparation extemporaneous sterile injectable solutions or dispersions.
  • the form must be sterile and must be fluid to the extent that it must be injected by syringe. It must be stable under the conditions of manufacture and storage and must be preserved against the contaminating action of microorganisms, such as bacteria and fungi.
  • the dispersions according to the invention can be prepared in glycerol, liquid polyethylene glycols or mixtures thereof, or in oils. Under normal conditions of storage and use, these preparations contain a preservative to prevent the growth of microorganisms.
  • the pharmaceutically acceptable carrier may be a solvent or dispersion medium containing, for example, water, ethanol, a polyol (eg, glycerine, propylene glycol, polyethylene glycol, and the like), suitable mixtures of these, and / or vegetable oils.
  • a surfactant such as lecithin.
  • Prevention of the action of microorganisms can be caused by various antibacterial and antifungal agents, for example, parabens, chlorobutanol, phenol, sorbic acid or thimerosal. In many cases, it will be preferable to include isotonic agents, for example, sugars or sodium chloride.
  • Prolonged absorption of the injectable compositions may be caused by the use in the compositions of agents delaying absorption, for example, aluminum monostearate or gelatin.
  • Sterile injectable solutions are prepared by incorporating the active ingredients in the required amount in the appropriate solvent with several of the other ingredients listed above, if appropriate, followed by sterilization by filtration.
  • the dispersions are prepared by incorporating the various sterilized active ingredients into a sterile vehicle that contains the basic dispersion medium and the other required ingredients from those enumerated above.
  • the preferred methods of preparation are vacuum drying and lyophilization.
  • the solutions will be administered in a manner compatible with the dosage formulation and in a therapeutically effective amount.
  • the formulations are easily administered in a variety of dosage forms, such as the injectable solutions described above, but drug release capsules and the like can also be used.
  • parenteral administration in an aqueous solution for example, the solution should be suitably buffered and the liquid diluent rendered isotonic with sufficient saline or glucose.
  • aqueous solutions are particularly suitable for intravenous, intramuscular, subcutaneous and intraperitoneal administration.
  • sterile aqueous media that can be used are known to those skilled in the art.
  • a dose may be dissolved in 1 ml of isotonic NaCl solution and then added to 1000 ml of appropriate liquid, or injected at the proposed site of the infusion. Certain dosage variations will necessarily occur depending on the condition of the subject being treated.
  • the pharmaceutical composition of the invention can be formulated in a therapeutic mixture comprising about 0.0001 to 1.0 milligrams, about 0.001 to 0.1 milligrams, about 0.1 to 1.0 milligrams, or about 10 milligrams per dose or more. Multiple doses may also be administered.
  • the level of therapeutically effective dose specific for a particular patient will depend on a variety of factors, including the disorder being treated and the severity of the disease, the activity of the specific compound employed, the specific composition used, the age, the body weight, general health, sex and diet of the patient, the time of administration, the route of administration, the rate of excretion of the specific compound used, the duration of treatment, or the drugs used in parallel.
  • the protein according to the invention can also be used as a product of a gene or cell therapy.
  • the present invention also relates to an expression vector comprising a polynucleotide encoding a protein according to the invention, said polynucleotide being as described above.
  • This expression vector can be used as a drug, preferably as a gene therapy drug.
  • This expression vector can also be used as a cell therapy drug: in this case, it is intended to be injected ex vivo to a sample of patient cells, before their reinjection.
  • a cell therapy drug in this case, it is intended to be injected ex vivo to a sample of patient cells, before their reinjection.
  • Figure 1 Primary structure of human factor X
  • Figure 2 OptiHEK-VKOR-FX-IIa bicistronic vector
  • Figure 3 Final vector FVIIvl-psFX-IIa-F2
  • lane 2 SDS-PAGE of the plasma FX (lane 2) and FX-IIa-F2 of aptamopurified HEK (lane 3).
  • lane 1 molecular weight markers or MW (values in kDa are indicated on the left of the figure).
  • NR unreduced products;
  • DTT-R products reduced to DTT.
  • Plasma (?), Plasma FX (?), FVIIv1-psFX-IIa-F2 derived from aptamopurified HEK (o), FVIIv1-psFX-IIa-F2-VKOR from aptamopurified HEK ( ⁇ ), FVIIvl- psFX-IIa-F2 from aptamopurified HEK ( ⁇ ).
  • FIG. 7 Activation of FVIIa Complex FX / Tissue Factor (FT) FXa Plasma Factor ( ⁇ ), Plasma FX (B), FVIIv1-psFX-IIa-F2-VKOR Aptamopurified FX from HEK ( ⁇ ), FVIIv1-psFX- IIa-F2 aptamopurified from HEK ( ⁇ ).
  • Figure 8 Generation of thrombin by FVIII deficient plasma modified FX
  • lanes 1 and 10 molecular weight markers or MW (values in kDa are indicated on the left of the figure).
  • NR unreduced products;
  • DTT-R products reduced to DTT.
  • Plasma FX (x), FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc YB2 / 0 supernatant (o) or aptamopurified ( ⁇ ), FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc from HEK supernatant ( ⁇ ) or aptamopurified ( ⁇ ), CHO-F supernatant ( ⁇ ) or aptamopurified (A) FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc.
  • Thrombin generation was monitored over time in normal or factor VIII deficient plasma stimulated by 0.5 ⁇ M tissue factor in the presence of phospholipids.
  • Signal obtained with a normal plasma ( ⁇ ); in the presence of 0.1 U / ml of Recombinant FVIII ( ⁇ ); in the presence of 1 U / ml of recombinant FVIII ( ⁇ ); in the presence of 4 ⁇ g / ml of aptamopurified FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc of YB2 / 0 ( ⁇ ); in the presence of 4 ⁇ g / ml of aptamopurified FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc of HEK (A); in the presence of 4 ⁇ g / ml of aptamopurified FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc of CHO ( ⁇ ).
  • Example 1 Generation of expression vectors containing modified propeptides
  • a non-commercial expression vector (OptiCHO) was used to insert, by In fusion ligation at the NheI-SwaI restriction sites, a polynucleotide encoding the modified FX. Briefly, the OptiCHO expression vector was digested with the NheI-SwaI restriction enzymes and then gel-purified using the Nucleospin extract II kit (Macherey Nagel).
  • the modified FX polynucleotide was obtained by assembly PCR using as template a vector containing a polynucleotide encoding the wild-type FX.
  • the primers used are:
  • the fragment of interest obtained by PCR was then cloned by ligation In Fusion into the OptiCHO vector digested beforehand at the NheI and Swal restriction sites.
  • the polynucleotide sequence encoding human VKOR obtained by gene synthesis with codon optimization for Homo sapiens. It was extracted from a parental vector (OptiHEK-v3-VKOR) with the whole of the promoter unit (CMV enhancer, RSV promoter, polynucleotide, BGH poly A termination signal by Ascl-SpeI digestion. It was introduced into the vector previously constructed by ligation on the same Ascl-SpeI restriction sites. Human VKOR contained in the C-terminal position a hexahistidine tag.
  • the final vector obtained containing 2 transcription units was named OptiHEK-VKOR-FXIIa (FIG. 2).
  • the optiHEK-VKOR-FXIIa bicistronic vector which contains the transcription unit (UT) coding for FX-modified on the one hand and for human VKOR on the other hand was digested with Spel-SwaI restriction enzymes allowing obtain 2 fragments of 6904 and 3510 bp respectively.
  • the 6904bp fragment (digested vector) was gel purified using the Nucleospin extract II kit (Macherey Nagel).
  • the FX promoter unit was amplified by PCR using the primers:
  • 5UTFX CCTTGGGCAATAAATACTAGTGGCGTTAC (SEQ ID NO: 55).
  • the amplicon obtained with the Kappa Hifi polymerase was then digested with the restriction enzymes NheI and Spel to obtain a final fragment of 1983bp.
  • the fragment was purified on agarose gel and extracted using the Nucleospin extract II kit (Macherey
  • the signal peptide and the propeptide of interest were obtained by PCR from a vector containing the corresponding nucleotide sequences using respectively the following primers:
  • 5PSth primers AAGCTTGCCGCCACCATGGCTCACGTCCGAGGGCTG (SEQ ID NO: 56) and
  • CTTCATTTCCTCCAGGAAAGAGTTGGCTCTCCGCACCCGCTGCAGC (SEQ ID NO: 57)
  • primers 5PSFVII AAGCTTGCCGCCACCATGGTGTCTCAGGCTCTGCGGC (SEQ ID NO: 58) and
  • primers 5PSFVII AAGCTTGCCGCCACCATGGTGTCTCAGGCTCTGCGGC (SEQ ID NO: 60) and
  • 3FVIIv2 GTCACGAACACAGCAGCCAGACATCCCTGCAGTC (SEQ ID NO: 61)
  • Protein 1 AAGCTTGCCGCCACCATGTGGCAGCTGACCAGCCTGCTGCTGTTC GTGGCCACATG (SEQ ID NO: 62),
  • Protein3 TTCAGCAGCTCTGAGCGGGCCCACCAGGTGCTGCGGATCAGAAAG AGAGCCAACTCTTTC (SEQ ID NO: 64)
  • the sequence of the modified FX without the signal peptide and without the FX-WT propeptide was obtained by PCR with primers 5FX: GCCAACTCTTTCCTGGAGGAAATGAAG (SEQ ID NO: 65) and 3FXIIa: AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO: 66) (1142bp amplicon) .
  • a recombination ligation (ligation In Fusion) was performed between this assembly PCR product, the promoter UT and the digested final vector, previously prepared. Cloning efficiency was verified by colony PCR with primers 5'EFla: GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO: 67) and 2BGHpA and sequencing with 5'EFla primer:
  • GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO: 68) and 5FXseq: GGAGGCACTATCCTGAGCGAG (SEQ ID NO: 69).
  • FVIIv2-FX-IIa-F2 PS + propeptide FVII isoform v2-FX modified + human VKOR WT
  • protc-FX-IIa-F2 PS + propeptide protein C-FX modified + human VKOR WT
  • a recombination ligation (ligation In Fusion) was performed between these assembly PCR products, the promoter UT and the digested final vector, previously prepared. The cloning efficiency was verified by PCR on colonies with the primers:
  • 5'EF1A GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO: 79) and 5FXSEQ: GGAGGCACTATCCTGAGCGAG (SEQ ID NO: 80).
  • proth-psFX-IIa-F2 PS FXwt + prothrombin propeptide-modified FX + human VKOR WT
  • FVIIv1-psFX-IIa-F2 PS FXwt + propeptide FVII modified A-FX isoform + human VKOR WT (FIG. 3)
  • protc-psFX-IIa-F2 PS FXwt + propeptide modified protein C-FX + human VKOR WT.
  • Wild type factor X and modified FX were produced in HEK-293-Feestyle eukaryotic cells (HEK 293F) in transient expression.
  • HEK 293F were cultured in F17 medium, supplemented with 8 mM L-glutamine, under stirring conditions at 135 rpm in a controlled atmosphere (8% CO 2 ) at 37 ° C.
  • the cells were seeded at a density of 7 ⁇ 10 5 cells / ml.
  • the DNA (30 ⁇ g) and 60 ⁇ l of transfection agent (AT) were preincubated separately in Opti-MEM medium for 5 minutes and then mixed and incubated for 20 minutes to allow the formation of the DNA / AT complex. The whole was added to a cell preparation of 1.10 6 cells / ml in a volume of 30 ml.
  • the 2 vectors were added at different ratios to obtain a total amount of DNA of 20-30 ⁇ g.
  • vitamin K1 (5 ⁇ g / ml) was added to the medium.
  • Transfection rates were assessed the day after transfection with a control plasmid expressing GFP (Green Fluorescent Protein). The productions were made in "batch" mode for 7 days. At the end of production, the cells and the supernatant were separated by centrifugation. The cells were removed and the supernatant was harvested, supplemented with 2mM PMSF and 10mM benzamidine, filtered in 0.22 ⁇ , concentrated 10X and frozen.
  • CHO-S cell transfection medium Opti-Pro S FM
  • Wild-type factor X and modified FX were produced in CHO-S (Invitrogen) eukaryotic cells in transient expression.
  • the CHO-S were cultured in proCH04 medium, supplemented with 4 mM L-glutamine, under stirring conditions at 135 rpm in a controlled atmosphere (8% CO 2 ) at 37 ° C. On the day before transfection, the cells were seeded at a density of 6.10 5 cells / ml.
  • the DNA 37.5 ⁇ g
  • 37.5 ⁇ of transfection agent AT
  • the whole was added to a cell preparation of 1.10 6 cells / ml in a volume of 30 ml.
  • the 2 vectors were added at different ratios to obtain a total amount of DNA of 20-45 ⁇ g.
  • vitamin K1 (5 ⁇ g / ml) was added to the medium.
  • Transfection rates were assessed the day after transfection with a control plasmid expressing GFP.
  • the productions were made in "batch" mode for 7 days.
  • the cells and the supernatant were separated by centrifugation. The cells were removed and the supernatant was harvested, supplemented with 2mM PMSF and 10mM benzamidine, filtered in 0.22 ⁇ , concentrated 10X and frozen.
  • Factor X concentration was measured using the commercial ELISA Zymutest Factor X (HYPHEN BioMed ref RK033A) following the recommendations from the manufacturer. The concentrations were measured in duplicate using antigen values located in the linear detection zone of the assay. To ensure that the introduced mutations do not interfere with the measurement of the concentration, the FX were deposited in identical quantities and revealed by immunoblotting with a polyclonal antibody different from that used in ELISA (Polyclonal anti-human antibody FX (CRYOPEP cat n ° PAHFX-S) or staining after SDS-PAGE (data not shown).
  • FX variant concentrations present in supernatants of transfected HEK cells were measured to deposit the same amount of FX on the anti-Gla ELISA.
  • the gamma-carboxylation rate was measured using a laboratory-based ELISA using the ELISA assay antibody Zymutest Factor X (Hyphen) and the anti-Gla antibody (Sekisui) as the capture antibody.
  • the anti-Gla antibody (200 ⁇ l at 5 ⁇ g / ml) was incubated overnight at room temperature (RT). After incubation, the plate was saturated with PBS + 1% BSA (250 ⁇ l / well) for 2 h at RT. After washing, 200 ⁇ l of sample at 0.2 ⁇ g / ml or standards (consisting of a mixture of different ratios of plasma FX and factor X produced in CHO (non-gamma-carboxylated) were deposited for 2 hours at RT.
  • the anti-FX antibody coupled to the peroxidase 200 ⁇ l of the ZYMUTEST kit
  • the revelation was made by adding 200 ⁇ l of TMB for 8 minutes.
  • revelation was stopped by 50 ⁇ ⁇ of 0.45 M sulfuric acid and the optical density was read at 450 nm.
  • HEK cells naturally produce ectopic FX in a non-gamma carboxylated form (not shown).
  • the FX was co-transfected in the presence of VKOR. This co-transfection can be done either by treating the cells with two vectors (Opti-HEK-FX-IIa-F2) or by using a bicistronic vector carrying the two cDNAs (Opti-HEK-VKOR-IIa). In both cases, the gamma-carboxylation rate was 11.55% and 10.20% plasma FX respectively (Table 2).
  • Integral substitution of the signal peptide of FX and propeptide with those of FVII (v1 and v2), prothrombin or protein C did not significantly increase the level of gamma-carboxylation (6.7 to 24.5%).
  • the combination with FVIIv1 is the most effective of the 4 to 24.5%.
  • the concentrated culture supernatant from HEK or CHO was thawed at 37 ° C. It was then diluted to 1 ⁇ 2 in equilibration buffer (50 mM Tris HCl, 10 mM CaCl 2 , pH 7.5) and then purified on an anti-Gla aptamer column which had been previously equilibrated in the same buffer. The column was washed with 12 column volumes in equilibration buffer. FX was then eluted with 50 mM Tris-HCl buffer, 10 mM EDTA, pH 7.5. The column was returned to equilibration buffer (25 column volumes) before storage at 4 ° C. FX was treated with 2mM PMSF, concentrated, and stored at -80 ° C. 2. Results
  • FX-FIIa-F2 produced from CHO or HEK were purified on an aptamer recognizing the gamma-carboxyl domain.
  • the CHO product was purified according to a standard immunopurification protocol or by aptamopurification.
  • the purified products were controlled by SDS-PAGE 4-10% (Figure 5A).
  • the two recombinant products showed a similar profile following acrylamide separation with or without DTT reduction ( Figure 5 A, lane 4 and 3). Not reduced, the products appeared as a single band at around 60-65 kDa. Their migration was a little slower than that of plasma FX ( Figure 5 A, lane 2) because the products have 10 additional amino acids.
  • the product reduction completely separates the heavy chain (48 kDa) from the light chain (17 kDa).
  • the recombinant FX showed a similar profile irrespective of their mode of purification.
  • the light chain of the three purified X factors migrated in the same way, as expected.
  • the aptamopurified HEK product was compared to plasma FX ( Figure 5B).
  • the product was pure with homogeneity and appeared as a single migrating band at a molecular weight slightly higher than that of plasma FX as previously seen ( Figure 5B, lane 3).
  • the reduction of the product shows that the migration difference is carried by the heavy chain.
  • Activation of FX variants produced by HEK cells was measured following the incubation of aptamopurified X factors in the presence of the anti-factor X fraction of venom of the Russell's viper (RVV-X).
  • Activated control factor X, venom X moiety (RVV-X) and pNAPEP 1065 substrate were commercially available (e.g. Haematologic Technologies).
  • Purified factor X variants were incubated with RVV-X.
  • the generation of FXa was measured following this treatment from different concentrations of FX.
  • the presence of FXa was quantified by the rate of appearance of the pNAPEP 1065 product in solution (in mUDO / min). This generation is a reflection of the recognition and cleavage of FX by the RVV-X as well as the FXa's ability to recognize the FX substrate.
  • the average onset rates were made for the different initial FX concentrations and this value was reduced as a percentage of the FX-WT value.
  • Activation of variant FX produced by HEK cells was measured following incubation of the aptamopurified product in the presence of 50 ⁇ M FVIIa and tissue factor.
  • FVIIa complex 100 ⁇ to 100 ⁇ M
  • tissue factor 50 ⁇ M FVIIa and tissue factor.
  • the FVIIa complex 100 ⁇ to 100 ⁇ M
  • FT tissue factor
  • the mixture (20 ⁇ l) was removed and deposited in 180 ⁇ l of STOP buffer (50 mM Tris, 9 mM EDTA, 475 mM NaCl, pH 8.8).
  • the PNAPEP substrate diluted 1 ⁇ 2 in PPI water 50 ⁇ l was added and an immediate reading in kinetic mode every 25 seconds was made for 10 min at 405 nm.
  • Plasma FXa control was considered 100%.
  • the two variant X factor constructs were activated at 27% FXa for Opti-HEK-VKOR-IIa and 36% for FVIIv1-psFX-IIa-F2. This activity is sensitive to the rate of gamma-carboxylation. Modification of the propeptide allowed FVIIv1-psFX-IIa-F2 to have an activity of 142% of that of the molecule containing the wild-type propeptide.
  • Thrombin calibrator PPP reagent low, CK-Perst, Fluca Kit (Fluo-buffer + Fluo- substrate) and PNP were commercially available, for example at Stago.
  • FVIII-deficient plasma e.g. Siemens Healthcare
  • recombinant human factor VIII control comes from Baxter (Advate).
  • the thrombin generation test consists in activating ex vivo coagulation using a mixture of tissue factor and phospholipids (activation of the extrinsic coagulation pathway) and then measuring the thrombin concentration generated over time. .
  • the thrombin generation tests were performed on 80 ⁇ l of a pool of plasma containing purified product or controls, in the presence of 20 ⁇ l of PPP reagent containing in the end 1 ⁇ M of Tissue Factor (TF) and 4 ⁇ l of phospholipids. (PL).
  • PPP reagent containing in the end 1 ⁇ M of Tissue Factor (TF) and 4 ⁇ l of phospholipids. (PL).
  • Different plasmas can be used: normal plasma, deficient factor X, deficient factor VIII, deficient plasma factor IX or deficient plasma FXI
  • the reaction was started by the addition of 20 ⁇ ⁇ Fluca-kit (substrate + CaCl 2 ) which constitutes the beginning of the measurement of the appearance of thrombin.
  • the appearance of fluorescence was measured on a Fluoroskan Ascent fluorimeter (ThermoLabsystems) at an excitation wavelength of 390 nm and at an emission wavelength of 460 nm.
  • Thrombinograms curves representing the fluorescence intensity versus time
  • Thrombinoscope TM software which converts the fluorescence value into nM thrombin by comparative calculation.
  • the aptamopurified FVIIv1-psFX-IIa-F2 was used at 10 and 20 ⁇ g / ml.
  • the FVIII deficient plasma gave the weakest signal, corresponding to the background noise of the experiment ( Figure 8).
  • Plasma Unicalibrator provided a weaker signal than FVIII deficient plasma reconstituted by FVIII concentrations (0.1 or 1 U / ml).
  • Variant FX with a modified propeptide has the ability to correct a FVIII deficient plasma as effectively as FVIII.
  • a dose response was observed with a lag time that is shortened as the dose increases and an amplitude increases. The amplitude of the signal, however, did not completely reach reconstitution with 1 U / ml of FVIII but was much higher than that of normal plasma.
  • the modified FX FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc was cloned into a bicistronic vector optimized for expression in the YB2 / 0 line in which a nucleic sequence coding for human furine at the level of the second was introduced. transcription unit. The amount of vector required for transfection was then prepared and linearized at the EcoRV restriction site. After centrifugation, the YB2 / 0 cells were taken up in a volume making it possible to obtain a cell density of 1.10 cells / ml.
  • the transfection was carried out by electroporation using a specific kit (ref: EB110, Ozyme) at 5 ⁇ 10 6 cell / ml in the presence of 61 ⁇ g of bicistronic vector containing the sequence FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc. and the sequence of human furin. After transfection, the cells were resuspended in 75 cm 2 flasks. Selection pressure was added three days after transfection by adding G418 at 0.6 g / l. The selection pressure was maintained for 14 days and then the cells were frozen.
  • a specific kit ref: EB110, Ozyme
  • Productions of the FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc molecule were initiated by seeding the selected YB2 / 0 cells at a density of 3.10 5 cells / ml in Emabprol medium containing 4 mM glutamine. For production, a fed-batch mode was applied for 12 days by adding glucose and glutamine based on pre-determined cell density.
  • the cells and the supernatant were separated by centrifugation.
  • the cells were removed and the supernatant was harvested, supplemented with 2mM PMSF and 10mM benzamidine, 5X concentrate, filtered in 0.22 ⁇ , and then frozen.
  • FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc was produced in HEK293F, CHO-S and YB2 / 0 as described in Examples 2, 3 and 9.
  • the concentrated culture supernatant from HEK, YB2 / 0 or CHO-S was thawed at 37 ° C. and then filtered on Nalgene 0.2 ⁇ unit (aPES).
  • aPES Nalgene 0.2 ⁇ unit
  • QAE Sephadex A50 gel (0.25% w / v; GE Healthcare) was added and the whole was stirred for one hour at + 4 ° C. The gel was loaded into a column body, washed with the equilibration buffer and the molecules of interest were eluted with 50 mM Tris-HCl buffer pH7.5 500 mM NaCl.
  • the eluate was then frozen at -80 ° C before aptamopurification.
  • the thawed eluate was diluted 1 ⁇ 2 in equilibration buffer (50 mM Tris HCl, 10 mM CaCl 2 , pH 7.5) and then purified on an anti-Gla aptamer column which had been previously equilibrated in the same buffer. .
  • the column was washed with 12 column volumes in equilibration buffer.
  • FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc was then eluted with 50 mM Tris-HCl buffer, 10 mM EDTA, pH 7.5.
  • FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc produced from CHO-S, YB2 / 0 or HEK were purified on an aptamer recognizing the gamma-carboxyl domain.
  • the purified products from CHO-S or HEK were controlled by SDS-PAGE 4-10% (Figure 9). They showed a similar profile following acrylamide separation with or without DTT reduction ( Figure 9, lanes 3-5, 7-9). Not reduced, the products appeared in the form of a majority band at about 250 kDa migrating very differently from that of the plasma FX (67 kDa, Figure 9, lane 1) because the products are grafted to an Fc fragment.
  • the phopholipids were diluted to 12.5 ⁇ in absolute ethanol and then loaded into 96-wells. They were incubated overnight at room temperature without a lid. The wells were then saturated for 2 h with 50 mM Tris buffer, 150 mM NaCl, CaCl 2.
  • Plasma factor X control (x) binds as expected to phospholipids depending on the starting concentration. The signal tends to saturation. Unpurified FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc present in the supernatants of CHO-S, HEK293 and YB2 / 0 and the same aptamopurified products were evaluated. All supernatant, non-purified forms are less well-bound to phospholipids than aptamopurified forms. This signal difference may be due either to the presence of inhibitory molecules or binding competitors in the supernatants or, most likely, that the supernatants contain a fraction of the weakly gamma-carboxylated product and that they bind therefore less well with phospholipids.
  • the product from CHO is the one for which the signal has been the most improved, then comes the product YB2 / 0 and then the HEK293.
  • all the products bound to the phospholipids giving a signal at least as strong as that of the plasma FX or even higher for the products HEK293 and
  • the experiments and dilutions were conducted in the following reaction buffer: 25 mM Hepes, 175 mM NaCl, 5 mg / ml BSA, 5 mM CaCl 2 pH 7.4.
  • the standard range was prepared as follows: in a flat-bottomed plate, 100 ⁇ r-Hirudine at 50 nM + 100 ⁇ of each dilution of FXa + 50 ⁇ of PNAPEP substrate diluted 1 ⁇ 2 in PPL water Immediate reading in kinetic mode all 25 seconds for 10 min at 405 nm was performed.
  • the tests were carried out by adding to 100 ⁇ l of sample at 200 nM, 100 ⁇ l thrombin at 20 nM final concentrations 100 nM FX / 10 nM Ha.
  • the mixture was then incubated at 37 ° C. and then at different times 0, 0.5, 1, 2, 3.5, 6 and 8 h, a 20 ⁇ aliquot was taken and placed in a well of a flat-bottom microplate containing 180 ⁇ l of r-Hirudine at 50 nM.
  • the pNAPEP 1065 substrate (50 ⁇ l) diluted 1 ⁇ 2 in PPI water was added and an immediate kinetic reading every 25 seconds was carried out for 10 min at 405 nm.
  • factor VIII-deficient plasma reconstituted with 0.1 U / ml of factor VIII ( ⁇ ) or 1 U / ml of factor VIII ( ⁇ ) allow thrombin generation which increases with the level of FVIII.
  • Normal plasma gives a median signal between these two conditions ( ⁇ ).
  • the presence of the FVIIv1-psFX-IIa-F2-Fc molecule (4 ⁇ g / ml) makes it possible to correct the deficiency of FVIII.
  • the factor produced in HEK293 gives a stronger signal than that of normal plasma with identical lagtime. It is, however, a little higher than that of deficient plasma + 1 U / ml factor VIII.
  • the product from YB2 / 0 also gives a powerful signal but with an increased lagtime.
  • the product from CHO gives a more moderate signal with a lagtime still increased but able to correct the deficiency in FVIII.

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Abstract

La présente invention concerne une protéine qui est un variant du facteur X comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO :1, ladite protéine comprenant à son extrémité N- terminale, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7, et un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X.

Description

Mutants du facteur X
La présente invention concerne des mutants du facteur X, et leur utilisation pour le traitement des troubles de la coagulation sanguine.
Le facteur X est une protéine présente dans le sang. Cette protéine joue un rôle important dans la cascade de la coagulation. La coagulation du sang est un processus complexe qui permet d'éviter l'écoulement du sang par les vaisseaux endommagés. Aussitôt qu'un vaisseau est brisé, les éléments responsables de la coagulation interagissent entre eux pour former un bouchon, le clou plaquettaire, à l'endroit où le vaisseau est brisé. Les facteurs de la coagulation sont requis pour tenir le clou plaquettaire en place et stabiliser le caillot.
La formation d'un caillot normal s'effectue en quatre étapes :
Étape 1 Le vaisseau sanguin est endommagé.
Étape 2 Le vaisseau sanguin se contracte de façon à restreindre l'apport de sang vers la zone lésée.
Étape 3 Les plaquettes adhèrent à l'espace sous-endothélial exposé lors de la lésion du vaisseau ainsi qu'aux parois des vaisseaux sanguins stimulées. Les plaquettes s'étalent, c'est ce que l'on appelle « l'adhésion plaquettaire ». Ces plaquettes étalées libèrent des substances qui activent d'autres plaquettes avoisinantes de sorte qu'elles s'agglomèrent au siège de la lésion afin de former le clou plaquettaire. C'est ce que l'on appelle « l'agrégation plaquettaire ».
Étape 4 La surface des plaquettes activées constitue ainsi une surface sur laquelle la coagulation du sang peut s'effectuer. Les protéines de la coagulation qui circulent dans le sang (dont le facteur X) sont activées à la surface des plaquettes et forment un caillot de fibrine.
Ces protéines de la coagulation (c'est-à-dire, les facteurs I, II, V, VIII, IX, X, XI, XII et XIII, ainsi que le facteur de Von Willebrand) fonctionnent en une réaction en chaîne, Le. la cascade de la coagulation. Le facteur X sous forme activée (Xa) intervient plus particulièrement dans l'activation de la prothrombine (facteur II) en thrombine (facteur Ha), notamment lorsqu'il est complexé avec le co-facteur V activé pour former le complexe prothrombinase. Ce facteur est un élément essentiel dans la cascade de la coagulation.
Lorsque ce facteur fait défaut, des saignements se manifestent, comme une épistaxis (saignements de nez), une hémarthrose (épanchement de sang dans une cavité articulaire) ou des saignements gastro-intestinaux. La déficience en facteur X est extrêmement rare. Sa transmission est autosomique récessive, et sa prévalence est de 1/1 000 000.
L'activation du FX intervient :
- soit très précocement lors de l'étape d'initiation de la cascade de la coagulation par le complexe facteur VIIa/f acteur tissulaire, dans une réaction peu efficace qui conduit à la formation de trace de thrombine ;
- soit lors de l'étape d'amplification de la cascade de la coagulation issue d'un rétrocontrôle positif effectué par les traces de thrombine conduisant à l'activation des facteurs VIII et IX.
Ces deux derniers facteurs sont manquants chez les hémophiles A et B, causant ainsi un trouble hémorragique qui peut être fatal sans traitement. L'absence de ces facteurs ne permet pas de générer des quantités suffisantes de facteur X activé, pour juguler l'hémorragie.
Les 42 premiers acides aminés de la chaîne légère du facteur X (résidus 1-42 de SEQ ID NO :5) représentent le domaine « Gla », domaine de liaison aux phospholipides. Le domaine « Gla » contient 11 résidus d'acide glutamique (Glu) tous ou en partie modifiés de façon post-traductionnelle (gamma-carboxylés) pour donner des acides γ- carboxyglutamique (Gla). Le facteur X est ainsi une protéine de la coagulation dont l'activité biologique dépend du degré de la gamma-carboxylation de son domaine « Gla ».
L'ensemble des protéines « Gla » ou protéines à domaine Gla sont dépendantes de la vitamine K. La vitamine K est une vitamine liposoluble impliquée dans la gamma- carboxylation des résidus protéiques de glutamates pour former des résidus de gamma- carboxyglutamate. Les résidus de gamma-carboxyglutamate sont essentiels pour l'activité biologique de toutes les protéines possédant des domaines Gla, notamment via une haute affinité de liaison aux ions calcium.
La présence des résidus Glu gamma-carboxylés (également appelés résidus Gla) dans les protéines dépendantes de la vitamine K s'est ainsi avérée essentielle pour leur activité fonctionnelle. Ainsi, la présence de résidus Glu sur le facteur X et leur niveau de gamma-carboxylation est essentiel à l'activité fonctionnelle du facteur X activé. Ainsi il existe un besoin pour un facteur X modifié pouvant être activé par la thrombine, et possédant un taux de gamma-carboxylation qui permettrait d'avoir une coagulation efficace en absence de facteur VIII et/ou de facteur IX, par l'utilisation directe des traces de thrombine générées lors de l'initiation de la coagulation. Les inventeurs ont identifié des mutants spécifiques du facteur X (appelés également facteurs X variants), qui sont efficacement activés par la thrombine, permettant ainsi de restaurer la coagulation en absence de facteur VIII, de facteur IX. De préférence, les mutants spécifiques du facteur X identifiés par les inventeurs peuvent également restaurer la coagulation en absence de facteur X. En effet, comme démontré en exemples, ces mutants du facteur X peuvent être activés par la thrombine, et permettent une coagulation efficace, et ce, même en absence de facteur VIII et/ou de facteur IX et/ou, de facteur X endogène.
Ces mutants du facteur X présentent avantageusement un fort taux de gamma- carboxylation. Par fort taux de gamma-carboxylation, on entend un taux de gamma- carboxylation au moins égal à 20%, de préférence au moins égal à 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la gamma- carboxylation du facteur X plasmatique, considérée à 100 %.
La présente invention concerne une protéine qui est un variant du facteur X comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO : 1, ladite protéine comprenant à son extrémité N- terminale, le peptide signal naturel du facteur X représenté par la séquence SEQ ID NO :7, et un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. La présente invention concerne une protéine comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO : 1, ladite séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprenant une mutation A, A', B, C ou C, dans laquelle :
la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ ID NO : l par une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR,
la mutation A' consiste en la substitution des acides aminés 47 à 52 de la séquence SEQ ID NO : 1 par une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR,
la mutation B consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1,
la mutation C consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO : 1, la mutation C consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1, et en la délétion des acides aminés 4 à 9 de la séquence SEQ ID NO : l,
où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et
ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X. De préférence, la présente invention concerne une protéine comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO : 1, ladite séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprenant une mutation consistant en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1 (i.e. la mutation B ci-dessus),
où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide d'un facteur de coagulation différent du facteur X. Une telle protéine selon l'invention est un facteur X muté, qui est efficace dans le traitement de troubles de la coagulation.
Notamment, une séquence codant pour un facteur X muté selon l'invention et comprenant une combinaison de séquences de l'extrémité N-terminale à C-terminale, à savoir :
- un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X
- le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7
-une séquence mutée de SEQ ID NO : 1 selon l'invention permet d'impacter directement la gamma-carboxylation du facteur X exprimé, augmentée par rapport à un facteur X comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO : l selon l'invention, mais ne comprenant pas à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide d'un facteur de coagulation différent du facteur X. De préférence, de tels mutants du facteur X présentent un taux de gamma-carboxylation au moins égal à 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la gamma- carboxylation du facteur X plasmatique, considérée à 100 %.
Un autre objet de l'invention est un polynucléotide codant pour ladite protéine.
Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant ledit polynucléotide.
Un autre objet de l'invention est une cellule hôte comprenant ledit vecteur d'expression ou ledit polynucléotide.
Un autre objet de l'invention est l'utilisation de ladite protéine comme médicament. En particulier, ladite protéine peut être utilisée pour le traitement des troubles de la coagulation sanguine, notamment les troubles hémorragiques, tels que les hémophilies A, B et C (déficit en facteur XI), voire les déficits en facteur X voire encore des besoins en coagulation d'urgence pour se substituer au Facteur Vlla. Lorsqu'une réponse procoagulante puissante et rapide est requise, ladite protéine peut être utilisée en combinaison avec d'autres molécules hémostatiques, telles que le facteur Vlla et/ou le fibrinogène, voire en association avec des composés procoagulants (transfusion de plaquettes, mélange procoagulant comme FEIBA, Kaskadil, Kanokad etc), qui pourront renforcer l'efficacité du traitement.
Le terme «protéine» se réfère à une séquence d'acides aminés ayant plus de 100 acides aminés. De préférence, la protéine consiste en une séquence d'acides aminés ayant entre 100 et 1000 acides aminés, de préférence entre 120 et 600 acides aminés. Un variant du facteur X selon l'invention présente avantageusement un fort taux de gamma-carboxylation. Par fort taux de gamma-carboxylation, on entend un taux de gamma-carboxylation au moins égal à 20%,de préférence au moins égal à 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la gamma-carboxylation du facteur X plasmatique, considérée à 100 %.
Le calcul dudit taux de gamma-carboxylation peut être réalisé par toute technique classique permettant de détecter puis quantifier les résidus Gla, telle que la technique ELISA utilisant un anticorps anti-Gla pour la capture des facteurs X gamma-carboxylés. Par exemple, la mesure de densité optique obtenue pour un facteur X variant selon l'invention peut être rapportée à la mesure de densité optique obtenue pour une même quantité de facteur X plasmatique obtenu selon le même procédé de production, considérée comme la mesure de référence du taux de gamma-carboxylation à 100%.
De préférence, un variant de facteur X selon l'invention comprend au moins 2 résidus Glu gamma-carboxylés (Le, résidus Gla) parmi 1 1 Glu, au moins 3 résidus gamma- carboxylés parmi 11 Glu, au moins 4 résidus gamma-carboxylés parmi 11 Glu, au moins 5 résidus gamma-carboxylés parmi 11 Glu, au moins 6 résidus gamma- carboxylés parmi 1 1 Glu, au moins 7 résidus gamma-carboxylés parmi 1 1 Glu, au moins 8 résidus gamma-carboxylés parmi 11 Glu, au moins 9 résidus gamma- carboxylés parmi 11 Glu, au moins 10 résidus gamma-carboxylés parmi 1 1 Glu, ou 11 résidus gamma-carboxylés. Préférentiellement, un variant de facteur X selon l'invention comprend au moins 10 des 11 résidus gamma-carboxylabl.es susmentionnés, présents sur le domaine Gla de la chaîne légère du facteur X, gamma-carboxylés . Ainsi, de préférence, un variant de facteur X selon l'invention comprend 10 résidus Glu gamma- carboxylés (10 résidus Gla), Plus préférentiellement, un variant de facteur X selon l'invention comprend 1 1 résidus Glu gamma-carboxylés (11 résidus Gla),
Selon un aspect particulier, l'invention concerne une composition de variants du facteur X selon l'invention, présentant avantageusement un fort taux de gamma-carboxylation au sein de la composition. Par fort taux de gamma-carboxylation au sein de la composition, on entend un taux de gamma-carboxylation au moins égal à 20%, de préférence au moins égal à 25%, 30%, 35%, 40%, 45%, 50%, 55%, 60%, 65%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95% de la gamma-carboxylation au sein d'une composition de facteur X plasmatique, considérée à 100 %.
Dans ce cas, une composition de variants du facteur X selon l'invention peut comprendre une population de facteur X gamma-carboxylés homogène pour le nombre de résidus Gla. De préférence, une composition de variants du facteur X selon l'invention comprend une population de facteurs X gamma-carboxylés chacun comprenant 10 résidus Gla. De préférence, une composition de variants du facteur X selon l'invention comprend une population de facteurs X gamma-carboxylés chacun comprenant 11 résidus Gla. Alternativement, une composition de variants du facteur X selon l'invention peut comprendre une population hétérogène de facteur X gamma- carboxylés, comprenant au moins deux populations de facteur X gamma-carboxylés ne comprenant pas le même nombre de résidus gamma-carboxylés Gla. Par exemple, une composition de variants du facteur X selon l'invention peut comprendre 50 % de variants comprenant 10 résidus Gla et 50 % de variants comprenant 11 résidus Gla.
Le facteur X, appelé également facteur de Stuart-Power, est codé par le gène F10 et se réfère à la sérine protéase EC3.4.21.6. Le facteur X est composé d'une chaîne lourde, de 306 acides aminés, et d'une chaîne légère, de 139 acides aminés.
Le facteur X est une protéine de 488 acides aminés, constitué d'un peptide signal, d'un propeptide, et des chaînes légère et lourde. Le facteur X humain peut être trouvé dans UniProtKB sous le numéro d'accession P00742. Sa structure primaire est illustrée en figure 1.
La protéine est traduite sous forme de prépropeptide. Après clivage du peptide signal, le propeptide est finalement coupé, résultant en une chaîne légère et une chaîne lourde (respectivement de 142 et 306 acides aminés) (zymogène). Suite au déclenchement de la coagulation, la chaîne lourde est finalement activée par clivage du peptide d'activation, pour ne contenir que 254 acides aminés aminés (les 52 premiers acides aminés sont clivés lors du traitement): c'est la chaîne lourde du facteur Xa (SEQ ID NO :6).
Le prépropeptide de facteur X humain correspond à SEQ ID NO: 4. La chaîne lourde du facteur X humain non activé correspond à SEQ ID NO: 1, et la chaîne légère correspond à SEQ ID NO: 5. Le peptide d'activation de la chaîne lourde correspond à SEQ ID NO :3, et comprend 52 acides aminés. Le peptide signal correspond à SEQ ID NO :7, et comprend 31 acides aminés. Le propeptide naturel du facteur X correspond à SEQ ID NO : 8, et comprend 9 acides aminés.
SEQ ID NO: 2 est identique aux acides aminés 1 à 182 de SEQ ID NO: 4.
SEQ ID NO: 1 est identique aux acides aminés 183 à 488 de SEQ ID NO: 4.
La chaîne lourde du facteur Xa (SEQ ID NO :6) correspond à la SEQ ID NO : 1, dans laquelle le peptide d'activation représenté par la SEQ ID NO :3 a été clivé.
Dans le cadre de l'invention, par « propeptide naturel du facteur X », on entend de préférence un variant du propeptide naturel du facteur X humain représenté par la séquence SEQ ID NO :9 qui comprend 9 acides aminés.
La protéine selon l'invention est un mutant (ou variant) de facteur X.
La mutation préférée selon l'invention consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1 (« mutation B »), où N* est une asparagine éventuellement glycosylée. De préférence, la mutation selon l'invention consiste en l'insertion de la séquence DFLAEGLTPR entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1.
La séquence SEQ ID NO : 1 comprenant une mutation selon l'invention est également appelée « séquence mutée de SEQ ID NO : 1 ». En d'autres termes, de préférence, la séquence SEQ ID NO : 1 comprenant une mutation selon l'invention consiste en la séquence SEQ ID NO :3, fusionnée à son extrémité C- terminale à une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR (« mutation B »), où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, elle-même fusionnée à son extrémité C-terminale à la séquence SEQ ID NO :6.
Lorsque la mutation consiste en l'insertion de la séquence DFLAEGLTPR, la séquence mutée de SEQ ID NO : 1 correspond à SEQ ID NO : 11. Le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est différent du propeptide naturel du facteur X. De préférence, le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est celui d'une protéine vitamine K dépendante. De préférence, le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est choisi parmi le propeptide de la protéine S, le propeptide de la protéine Z, le propeptide du FIX, le propeptide de l'une des protéines GAS6, BGP, MGP, et PRGP1, PRGP2, TMG3 et TMG4, le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, incluant leurs isoformes naturelles ou leurs versions modifiées. Par « version modifiée », on entend que le propeptide utilisé est tronqué, et comprend éventuellement l'insertion d'un ou plusieurs acides aminés, par exemple à son extrémité N-terminale. De préférence, le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est celui d'un facteur de coagulation différent du facteur X. Ainsi, le propeptide utilisé dans la protéine selon l'invention est préférentiellement le propeptide naturel d'un facteur de coagulation différent du facteur X. De préférence, le propeptide est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, leurs isoformes naturelles ou leurs versions modifiées. De préférence, le propeptide du facteur VII selon l'invention correspond à isoforme A du propeptide du facteur VII (ou « FVIIvl ») et a pour séquence SEQ ID NO : 14. De préférence, le propeptide du facteur VII selon l'invention correspond à l'isoforme B du propeptide du facteur VII (ou « FVIIv2 ») et a pour séquence SEQ ID NO : 15. Plus préférentiellement, le propeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16. Plus préférentiellement, le propeptide a pour séquence SEQ ID NO : 14. De préférence, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :2l. Plus préférentiellement, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est représenté par la séquence SEQ ID NO : 19.
La combinaison particulière de la séquence SEQ ID NO : 19 à une séquence mutée de SEQ ID NO : l selon l'invention permet d'impacter directement la gamma- carboxylation du facteur X muté comprenant une telle combinaison, par rapport à un facteur X muté comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO : 1 selon l'invention, mais ne comprenant pas à son extrémité N-terminale la séquence SEQ ID NO : 19.
La protéine selon l'invention comprend de préférence une séquence intermédiaire, entre le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X et la séquence mutée de SEQ ID NO : 1. De préférence, ladite séquence intermédiaire est fusionnée à son extrémité N-terminale, au peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et à son extrémité C-terminale, à la séquence mutée de SEQ ID NO : 1. De préférence, ladite séquence intermédiaire est la séquence de la chaîne légère du facteur X, de préférence la séquence SEQ ID NO :5.
La protéine selon l'invention comprend ainsi de préférence, de l'extrémité N-terminale à C-terminale :
- le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis
- la séquence SEQ ID NO :5, puis
- ladite séquence mutée de SEQ ID NO : 1. Plus particulièrement, la protéine selon l'invention comprend, dans le sens N- à C- terminal, le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis la séquence SEQ ID NO :5, puis la séquence mutée de SEQ ID NO : 1.
La protéine selon l'invention comprend de préférence, de l'extrémité N-terminale à C- terminale :
- le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis
- la séquence SEQ ID NO :5, puis
- la séquence SEQ ID NO : 11.
Ainsi, la protéine selon l'invention comprend de préférence, de l'extrémité N-terminale à C-terminale : le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, fusionné à la séquence SEQ ID NO : 17.
De préférence, la protéine selon l'invention comprend, de préférence consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO : 22, SEQ ID NO : 23, SEQ ID NO : 24 et SEQ ID NO :25. Plus préférentiellement, la protéine selon l'invention comprend, de préférence consiste en, la séquence SEQ ID NO :23.
La séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprenant une mutation A, A', B, C ou C, peut comprendre en outre au moins une mutation d'au moins un acide aminé n'altérant pas l'activité fonctionnelle de la protéine selon l'invention. De préférence, la séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprenant une mutation A, A', B, C ou C et comprenant en outre au moins une mutation additionnelle d'au moins un acide aminé n'altérant pas l'activité fonctionnelle, présente au moins 80% d'identité, au moins 81% au moins 82%, au moins 83%, au moins 84%, au moins 85%, au moins 86%, au moins 87%, au moins 88%, au moins 89%, au moins 90%, au moins 91%, au moins 92%, au moins 93%, au moins 94%, au moins 95%, au moins 96%, au moins 97%, au moins 98%, au moins 99% d'identité avec la séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprenant uniquement une mutation A, A', B, C ou C. La protéine selon l'invention peut également être fusionnée en C-terminal à au moins un fragment d'immunoglobuline de type sauvage, optionnellement muté. On entend, par fragment d'immunoglobuline de type sauvage, un fragment choisi parmi les fragments Fc de type sauvage et les fragments scFc de type sauvage, optionnellement mutés.
Par "fragment Fc", on entend la région constante d'une immunoglobuline de longueur totale à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (i.e. CH1-CL). Ainsi le fragment Fc fait référence à un homodimère, chaque monomère comprenant les deux derniers domaines constants des IgA, IgD, IgG (i.e. CH2 et CH3), ou les trois derniers domaines constants des IgE et IgM (i.e. CH2, CH3 et CH4), et la région charnière flexible N-terminale de ces domaines. Le fragment Fc, lorsqu'il est issu d'IgA ou d'IgM, peut comprendre la chaîne J. De préférence, la région Fc d'une IgGl se compose de la charnière flexible N-terminale et des domaines CH2-CH3, c'est-à-dire la portion à partir de l'acide aminé C226 jusqu'à l'extrémité C-terminale, la numérotation étant indiquée selon l'indice EU ou équivalent dans Kabat.
Par « fragment scFc » (« single chain Fc »), on entend un fragment Fc simple chaîne, obtenu par fusion génétique de deux monomères Fc reliés par un linker polypeptidique. Le linker peut notamment être -(GGGGS)n-, où n est un entier de 1 à 3. Le scFc se replie naturellement en une région Fc dimérique fonctionnelle. Le fragment scFc a de préférence la séquence SEQ ID NO :42 (ce qui correspond à SEQ ID NO :36 fusionnée en C-terminal à -GGGGS- fusionnée en C-terminal à SEQ ID NO :37) éventuellement suivie d'une lysine. La fusion de la protéine selon l'invention à au moins un fragment d'immunoglobuline de type sauvage (notamment un fragment Fc ou scFc) en C- terminal, permet d'améliorer la stabilité et la rétention de la protéine dans l'organisme, et ainsi sa biodisponibilité ; elle permet également d'améliorer sa demi-vie dans l'organisme. En outre, elle peut permettre de simplifier la purification de la molécule obtenue par le ciblage ou par l'utilisation du fragment Fc lors d'une des étapes de la purification. De préférence, le fragment Fc de type sauvage est choisi parmi la séquence SEQ ID NO :36 et la séquence SEQ ID NO :37 éventuellement suivie d'une lysine en C-terminal (226 ou 227 acides aminés respectivement pour la SEQ ID NO :36 ; 231 ou 232 acides aminés respectivement pour la SEQ ID NO : 37). Le fragment Fc correspondant à la séquence SEQ ID NO :36 comprend les domaines constants CH2 et CH3 d'une IgG de type sauvage et la région charnière partielle en N-terminal (DKTHTCPPCP, SEQ ID NO :38). Le fragment correspondant à la séquence SEQ ID NO :37 comprend les domaines constants CH2 et CH3 d'une IgG de type sauvage et la région charnière entière en N-terminal (séquence EPKSSDKTHTCPPCP, SEQ ID NO :39, variante de la séquence naturelle présente sur une IgG de type sauvage, de séquence EPKSCDKTHTCPPCP, SEQ ID NO :81). De préférence, la protéine selon l'invention fusionnée à un fragment Fc de type sauvage en C-terminal a pour séquence SEQ ID NO :40 éventuellement suivie d'une lysine en C-terminal. Son acide nucléique correspondant a pour séquence SEQ ID NO :41 éventuellement suivie d'un codon codant pour une lysine en C-terminal. Alternativement et de préférence, son acide nucléique a été obtenu par synthèse de gènes avec optimisation de codons pour Homo Sapiens et a pour séquence SEQ ID NO :82. De préférence, la protéine selon l'invention fusionnée à un fragment scFc de type sauvage en C-terminal a pour séquence SEQ ID NO :43 éventuellement suivie d'une lysine en C-terminal. Son acide nucléique correspondant a pour séquence SEQ ID NO :44 éventuellement suivie d'un codon codant pour une lysine en C-terminal.
Le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage utilisé selon l'invention peut être muté selon la technologie « knobs-into-holes ». Cette technologie est décrite dans la demande WO96/27011 de Genentech : elle consiste en l'obtention d'hétérodimères, qui comprennent et s'apparient de préférence au niveau d'un domaine constant CH3 d'anticorps. Ces hétérodimères, de préférence 2 fragments Fc ou un scFc, comprennent différentes mutations ponctuelles, qui induisent une interface « protubérance-dans-cavité » (en anglais « knobs-into-holes »). Une première mutation sur le premier monomère induit une protubérance, et une seconde mutation sur le second monomère induit une cavité, de sorte que l'hétérodimère s'apparie de façon préférentielle.
De préférence, le premier monomère (i.e. un fragment Fc ou un monomère Fc du fragment scFc) comprend la mutation T366Y, et le second monomère (i.e. un fragment Fc ou un monomère Fc du fragment scFc) comprend la mutation Y407T. Les séquences décrites dans la présente demande peuvent être résumées comme suit: SEQ ID NO : Protéine
1 Chaîne lourde de facteur X humain (306 acides aminés), comprenant le peptide d'activation
2 Peptide signal, propeptide, et chaîne légère de facteur X humain (182 acides aminés)
3 Peptide d'activation de la chaîne lourde (52 acides aminés)
4 Prépropeptide de facteur X humain (488 acides aminés)
5 Chaîne légère de facteur X humain (142 acides aminés)
6 Chaîne lourde du Facteur X humain activé (FXa) (254 acides aminés)
7 Peptide signal du facteur X humain (31 acides aminés)
8 Propeptide du facteur X humain (9 acides aminés)
9 Variant du propeptide du facteur X humain (9 acides aminés)
10 FX-WT (488 acides aminés)
11 Séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprenant l'insertion de DFLAEGLTPR entre les acides aminés 52 et 53
(mutation selon l'invention)
12 Aptamère anti-Gla
13 Propeptide de la thrombine (19 acides aminés)
14 Propeptide du facteur VII version 1 (« FVIIvl ») (40 acides aminés)
15 Propeptide du facteur VII version 2 (« FVIIv2 ») (18 acides aminés)
16 Propeptide de la protéine C (24 acides aminés)
17 FX-IIa (458 acides aminés)
18 Peptide signal du facteur X humain fusionné au propeptide de la thrombine
19 Peptide signal du facteur X humain fusionné à FVIIvl
20 Peptide signal du facteur X humain fusionné à FVIIv2 21 Peptide signal du facteur X humain fusionné au propeptide de la protéine C
22 Protéine selon l'invention (SEQ ID NO : 18 fusionnée à
SEQ ID NO : 17)
23 Protéine selon l'invention (SEQ ID NO : 19 fusionnée à
SEQ ID NO : 17)
24 Protéine selon l'invention (SEQ ID NO :20 fusionnée à
SEQ ID NO : 17)
25 Protéine selon l'invention (SEQ ID NO :21 fusionnée à
SEQ ID NO : 17)
26 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :7
27 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 13
28 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 14
29 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 15
30 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 16
31 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO : 17
32 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :22
33 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :23
34 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :24
35 Séquence nucléique codant pour SEQ ID NO :25
36 Fragment Fc sauvage, éventuellement suivi d'une lysine
37 SEQ ID NO :36 comprenant la région charnière entière en
N-terminal, éventuellement suivie d'une lysine
38 Région charnière partielle en N-terminal
39 Région charnière entière en N-terminal
40 Protéine SEQ ID NO :23 fusionnée au fragment Fc sauvage SEQ ID NO :36, éventuellement suivie d'une lysine
41 Acide nucléique codant pour la protéine SEQ ID NO :40, éventuellement suivi d'un codon codant pour une lysine 42 Fragment scFc sauvage, éventuellement suivie d'une lysine
43 Protéine SEQ ID NO :23 fusionnée au fragment scFc sauvage SEQ ID NO :42, éventuellement suivie d'une lysine
44 Acide nucléique codant pour la protéine SEQ ID NO :43 éventuellement suivi d'un codon codant pour une lysine
45 VKORC1 humaine sauvage
46 Acide nucléique codant pour la sous-unité SEQ ID
NO :45
47 Peptide signal de la prothrombine
48 Peptide signal du facteur VII
49 Peptide signal de la protéine C
50 à 80 Amorces des exemples
81 Région charnière entière native en N-terminal
82 Séquence d'acide nucléique optimisée codant pour la protéine SEQ ID NO :40, éventuellement suivi d'un codon codant pour une lysine
Un autre objet de l'invention est un acide nucléique (polynucléotide) codant pour ladite protéine. De préférence, l'acide nucléique est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :32 à 35.
Un autre objet de l'invention est un vecteur d'expression comprenant ledit polynucléotide codant pour ladite protéine, ou une cassette d'expression comprenant ledit polynucléotide. Selon l'invention, les vecteurs d'expression appropriés pour une utilisation selon l'invention peuvent comprendre au moins un élément de contrôle d'expression fonctionnellement lié à la séquence d'acide nucléique. Les éléments de contrôle d'expression sont insérés dans le vecteur et permettent de réguler l'expression de la séquence d'acide nucléique. Des exemples d'éléments de contrôle d'expression incluent notamment des systèmes lac, le promoteur du phage lambda, les promoteurs de levure ou les promoteurs viraux. D'autres éléments opérationnels peuvent être incorporés, comme une séquence de tête, des codons de terminaison, des signaux de polyadénylation et des séquences nécessaires pour la transcription et la traduction ultérieure de la séquence d'acide nucléique dans le système hôte. Il sera compris par l'homme de l'art que la combinaison correcte des éléments de contrôle d'expression dépend du système hôte choisi. Il sera également entendu que le vecteur d'expression doit contenir les éléments supplémentaires nécessaires pour le transfert et la réplication ultérieure du vecteur d'expression contenant la séquence d'acide nucléique dans le système hôte.
De tels vecteurs sont facilement construits en utilisant des méthodes conventionnelles ou disponibles dans le commerce.
De préférence, le vecteur d'expression utilisé est un vecteur polycistronique comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, et optionnellement un polynucléotide codant pour la furine, et/ou un polynucléotide codant pour un fragment Fc dans le cadre de la production de variants selon l'invention fusionnés à un fragment Fc. La co- expression de la furine permet d'optimiser le clivage naturel à l'intérieur de la cellule au niveau des sites naturels de clivage présents sur le facteur X (RRKR). De préférence, le vecteur d'expression utilisé est un bicistronique comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, et un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage.
La sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage est la sous-unité catalytique du complexe ; c'est une protéine de 163 acides aminés. La séquence de cette sous-unité humaine sauvage peut être trouvée dans UniProt sous le numéro d'accession Q9BQB6 (SEQ ID NO :45). L'acide nucléique codant pour cette protéine a pour séquence SEQ ID NO :46. Cette protéine est présente dans le réticulum endoplasmique des cellules. Le polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR peut également être un polynucléotide codant pour une VKOR mutée.
De préférence, alternativement, les vecteurs d'expression utilisés sont autant de vecteurs que de polynucléotides à exprimer, l'un comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, un autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR citée ci-dessus, optionnellement un autre encore comprenant un polynucléotide codant pour la furine, et/ou un autre encore comprenant un polynucléotide codant pour un fragment Fc ou scFc dans le cadre de la production de variants selon l'invention fusionnés à un fragment Fc ou scFc.
Un autre objet de l'invention est une cellule recombinante comprenant un vecteur d'expression tel que décrit ci-dessus, ou un polynucléotide tel que décrit ci-dessus. Selon l'invention, des exemples de cellules hôtes qui peuvent être utilisées sont des cellules eucaryotes, comme les cellules animales, végétales, d'insectes et de levure ; et des cellules procaryotes, comme E. coli. Les moyens par lesquels le vecteur portant le gène peut être introduit dans les cellules comprennent notamment la microinjection, l'électroporation, la transduction ou la transfection à l'aide de DEAE-dextran, la lipofection, le phosphate de calcium ou d'autres procédures connues de l'homme de l'art. Dans un mode de réalisation préféré, les vecteurs d'expression permettant une expression dans les cellules eucaryotes sont utilisés. Des exemples de tels vecteurs comprennent les vecteurs viraux tels que les rétrovirus, adénovirus, virus de l'herpès, virus de la vaccine, virus de la variole, le poliovirus, lentivirus, les vecteurs d'expression bactériens ou des plasmides tels que pcDNA5. Les lignées cellulaires eucaryotes préférées comprennent les cellules COS, les cellules CHO, les cellules HEK notamment HEK293 (ATCC # CRL1573), les cellules YB2/0, les cellules BHK, les cellules PerC6, les cellules HeLa, les cellules NIH/3T3, des cellules T2, les cellules dendritiques ou les monocytes. De préférence, les cellules utilisées sont des cellules HEK. De préférence encore, les cellules utilisées sont des cellules YB2/0. De préférence encore, les cellules utilisées sont des cellules CHO.
Un autre objet de l'invention est un procédé de production d'une protéine selon l'invention, ladite protéine comprenant une chaîne légère (de préférence SEQ ID NO :5), comprenant :
a) l'expression d'un vecteur polycistronique, de préférence bicistronique, dans une cellule hôte, de préférence une cellule HEK, de préférence encore YB2/0, encore plus préférentiellement une cellule CHO, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, et un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, de préférence en présence de vitamine K ;
b) la culture de ladite cellule hôte ;
c) la récupération du surnageant cellulaire ;
d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi :
-la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, -la concentration du surnageant,
-la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine selon l'invention par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d'aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X. Toutes conditions de culture bien connues de l'homme du métier peuvent être utilisées pour la culture de la cellule hôte à l'étape b). Par exemple, tout mode de production peut être choisi, la culture pouvant être ainsi réalisée en mode de production type batch, fedbatch, perfusion continue ou XD process, sans être limitatif. La concentration du surnageant optionnellement réalisée à l'étape d) peut être réalisée par toute technique bien connue, telle que par passage sur des cassettes de concentration, par filtration tangentielle, ou par utilisation de colonnes de chromatographies permettant de concentrer le produit. Un autre objet de l'invention est un procédé de production d'une protéine selon l'invention, ladite protéine comprenant une chaîne légère (de préférence SEQ ID NO :5), comprenant :
a) l'expression de deux vecteurs d'expression, l'un comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, et l'autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR citée ci-dessus, dans une cellule- hôte, de préférence une cellule CHO, de préférence en présence de vitamine K ; b) la culture de ladite cellule hôte ; c) la récupération du surnageant cellulaire ;
d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi :
-la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, -la concentration du surnageant,
-la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine selon l'invention par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d'aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X. Les deux procédés cités ci-dessus permettent avantageusement l'obtention de mutants de facteur X selon l'invention présentant un taux de gamma-carboxylation identique à celui du facteur X plasmatique, avoisinant les 100%.
Les aptamères utilisés dans les procédés décrits ci-dessus sont notamment ceux décrits dans la demande de brevet WO2011/012831. En particulier, l'aptamère utilisé a la séquence suivante :
5' CCACGACCTCGCACATGACTTGAAGTAAAACGCGAATTAC 3' (SEQ ID NO: 12).
De façon avantageuse, cet aptamère se lie spécifiquement aux formes biologiquement actives de facteur X. Ainsi, les procédés de production d'une protéine selon l'invention, comprenant une étape de purification utilisant une colonne d'aptamères décrits ci- dessus, permettent l'obtention de formes biologiquement actives de facteur X.
La protéine selon l'invention peut être produite dans le lait d'animaux transgéniques.
Dans ce cas, selon un premier aspect, l'expression du polynucléotide codant pour la protéine selon l'invention est contrôlée par un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, ledit promoteur ne contrôlant pas naturellement la transcription dudit gène, et le polynucléotide contenant en outre une séquence de sécrétion de la protéine. La séquence de sécrétion comprend un signal de sécrétion interposé entre le gène et le promoteur.
L'animal transgénique utilisé est capable non seulement de produire la protéine désirée, mais également de transmettre cette capacité à sa descendance. La sécrétion de la protéine dans le lait facilite la purification et évite l'utilisation de produits sanguins. L'animal peut ainsi être choisi parmi la souris, la chèvre, la lapine, la brebis ou la vache.
La protéine selon l'invention peut être utilisée en tant que médicament. Par conséquent, la protéine selon l'invention peut être introduite dans une composition pharmaceutique. En particulier, la protéine selon l'invention peut être utilisée pour le traitement des troubles de la coagulation, notamment des troubles hémorragiques.
La composition pharmaceutique de l'invention peut être combinée avec des excipients pharmaceutiquement acceptables, et éventuellement des matrices à libération prolongée, comme des polymères biodégradables, pour former une composition thérapeutique. La composition pharmaceutique de la présente invention peut être administrée par voie orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intraveineuse, intra-artérielle, intrathécale, intraoculaire, intracérébrale, transdermique, locale ou rectale. Le principe actif, seul ou en association avec un autre principe actif, peut alors être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des supports pharmaceutiques classiques. Des formes unitaires d'administration comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale et buccale, les aérosols, les implants sous-cutanés, transdermique, topique, intrapéritonéale, intramusculaire, intraveineuse, sous-cutanée, intrathécale, les formes d'administration par voie intranasale et les formes d'administration rectale.
De préférence, la composition pharmaceutique contient un véhicule pharmaceutiquement acceptable pour une formulation susceptible d'être injectée. Il peut s'agir en particulier de formules isotoniques, stériles, de solutions salines (avec phosphate monosodique ou disodique, chlorure de sodium, de potassium, de calcium ou de magnésium et analogues, ou des mélanges de tels sels), ou de compositions lyophilisées, qui, lors de l'addition d'eau stérilisée ou de sérum physiologique selon les cas, permettent la constitution de solutés injectables.
Les formes pharmaceutiques appropriées pour une utilisation injectable comprennent des solutions aqueuses stériles ou des dispersions, des formulations huileuses, y compris l'huile de sésame, l'huile d'arachide, et des poudres stériles pour la préparation extemporanée de solutions injectables stériles ou de dispersions. Dans tous les cas, la forme doit être stérile et doit être fluide dans la mesure où elle doit être injectée par seringue. Elle doit être stable dans les conditions de fabrication et de stockage et doit être préservée contre l'action contaminante de micro-organismes, comme les bactéries et les champignons.
Les dispersions selon l'invention peuvent être préparées dans du glycérol, des polyéthylèneglycols liquides ou leurs mélanges, ou dans des huiles. Dans des conditions normales de stockage et d'utilisation, ces préparations contiennent un conservateur pour empêcher la croissance des micro-organismes.
Le véhicule pharmaceutiquement acceptable peut être un solvant ou milieu de dispersion contenant, par exemple, l'eau, l'éthanol, un polyol (par exemple, la glycérine, le propylène glycol, le polyéthylène glycol, et analogues), des mélanges appropriés de ceux-ci, et/ou les huiles végétales. La fluidité convenable peut être maintenue, par exemple, par l'utilisation d'un tensioactif, tel que la lécithine. La prévention de l'action de micro-organismes peut être provoquée par divers agents antibactériens et antifongiques, par exemple, des parabènes, le chlorobutanol, le phénol, l'acide sorbique ou encore le thimérosal. Dans de nombreux cas, il sera préférable d'inclure des agents isotoniques, par exemple, des sucres ou du chlorure de sodium. L'absorption prolongée des compositions injectables peut être provoquée par l'utilisation dans les compositions d'agents retardant l'absorption, par exemple, le monostéarate d'aluminium ou la gélatine. Les solutions injectables stériles sont préparées en incorporant les substances actives en quantité requise dans le solvant approprié avec plusieurs des autres ingrédients énumérés ci-dessus, le cas échéant, suivie d'une stérilisation par filtration. En règle générale, les dispersions sont préparées en incorporant les divers ingrédients actifs stérilisés dans un véhicule stérile qui contient le milieu de dispersion basique et les autres ingrédients requis parmi ceux énumérés ci-dessus. Dans le cas de poudres stériles pour la préparation de solutions injectables stériles, les procédés de préparation préférés sont le séchage sous vide et la lyophilisation. Lors de la formulation, les solutions seront administrées d'une manière compatible avec la formulation posologique et en une quantité thérapeutiquement efficace. Les formulations sont facilement administrées dans une variété de formes galéniques, telles que les solutions injectables décrites ci-dessus, mais les capsules de libération de médicament et similaires peuvent également être utilisés. Pour l'administration parentérale dans une solution aqueuse par exemple, la solution doit être convenablement tamponnée et le diluant liquide rendu isotonique avec suffisamment de solution saline ou de glucose. Ces solutions aqueuses particulières conviennent particulièrement pour une administration intraveineuse, intramusculaire, sous-cutanée et intrapéritonéale. À cet égard, les milieux aqueux stériles qui peuvent être utilisés sont connus de l'homme de l'art. Par exemple, une dose peut être dissoute dans 1 ml de solution de NaCl isotonique puis ajoutée à 1000 ml de liquide approprié, ou injectée sur le site proposé de la perfusion. Certaines variations de posologie devront nécessairement se produire en fonction de l'état du sujet traité.
La composition pharmaceutique de l'invention peut être formulée dans un mélange thérapeutique comprenant environ 0.0001 à 1.0 milligrammes, soit environ 0.001 à 0.1 milligrammes, soit environ de 0.1 à 1.0 milligrammes, voire environ 10 milligrammes par dose ou plus. Des doses multiples peuvent également être administrées. Le niveau de dose thérapeutiquement efficace spécifique pour un patient particulier dépendra d'une variété de facteurs, y compris le trouble qui est traité et la gravité de la maladie, l'activité du composé spécifique employé, la composition spécifique utilisée, l'âge, le poids corporel, la santé générale, le sexe et le régime alimentaire du patient, le moment de l'administration, la voie d'administration, le taux d'excrétion du composé spécifique utilisé, la durée du traitement, ou encore les médicaments utilisés en parallèle.
La protéine selon l'invention peut également être utilisée comme produit d'une thérapie génique ou cellulaire.
A cet effet, la présente invention concerne également un vecteur d'expression comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, ledit polynucléotide étant tel que décrit ci-dessus. Ce vecteur d'expression peut être utilisé comme médicament, de préférence comme médicament de thérapie génique.
Ce vecteur d'expression peut également être utilisé comme médicament de thérapie cellulaire : dans ce cas, il est destiné à être injecté ex vivo à un échantillon de cellules de patient, avant leur réinjection. Les exemples suivants sont donnés en vue d'illustrer divers modes de réalisation de l'invention.
Légende des figures
Figure 1 : Structure primaire du facteur X humain
Figure 2 : Vecteur bicistronique OptiHEK-VKOR-FX-IIa Figure 3 : Vecteur final FVIIvl-psFX-IIa-F2
Figure 4: Evaluation du niveau de gamma-carboxylation des différents FX variants Figure 5 : Evaluation des FX après purification
2 μg de produit/piste ont été déposés.
A, SDS-PAGE des FX plasmatiques (piste 2), FX-IIa-F2 de CHO immunopurifié (piste 4) et FX-IIa-F2 de CHO aptamopurifié (piste 3).
B, SDS-PAGE des FX plasmatiques (piste 2) et FX-IIa-F2 de HEK aptamopurifié (piste 3). En piste 1 : marqueurs de poids moléculaires ou MW (les valeurs en kDa sont indiquées sur la gauche de la figure). NR : produits non réduits; DTT-R : produits réduits au DTT.
Figure 6 : Activation des FX variants par la fraction RVV-X
FX activé (FXa) plasmatique (·), FX plasmatique (■), FVIIvl-psFX-IIa-F2 issu de HEK aptamopurifié (o),FVIIvl-psFX-IIa-F2-VKOR issu de HEK aptamopurifié (□), FVIIvl-psFX-IIa-F2 issu de HEK aptamopurifié (Δ).
Figure 7: Activation des FX variants par le complexe FVIIa/Facteur tissulaire (FT) FXa plasmatique (·), FX plasmatique (B),FVIIvl-psFX-IIa-F2-VKOR aptamopurifié issu de HEK (□), FVIIvl-psFX-IIa-F2 aptamopurifié issu de HEK (Δ). Figure 8 : Génération de thrombine par les FX modifiés en plasma déficient en FVIII
La génération de thrombine a été suivie au cours du temps dans un plasma normal ou déficient en facteur VIII stimulé par 0,5 pM de facteur tissulaire en présence de phospholipides. Signal obtenu avec un plasma normal (·); signal obtenu en plasma déficient en FVIII (o) ; en présence de 0, 1 U/ml de FVIII recombinant (□); en présence de 1 U/ml de FVIII recombinant (■); en présence de 10 μ§/ι 1 (Δ) ou 20 μg/ml ( A ) de FVIIvl-psFX-IIa-F2 aptamopurifié issu de HEK. Figure 9 : Evaluation des FX-Fc après purification
400 ng de produit/piste ont été déposés.
SDS-PAGE des FX plasmatiques (pistes 2/6), FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc de CHO aptamopurifié (piste 3/4/7/8) et FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc de HEK (piste 5/9).
En pistes 1 et 10 : marqueurs de poids moléculaires ou MW (les valeurs en kDa sont indiquées sur la gauche de la figure). NR : produits non réduits; DTT-R : produits réduits au DTT.
Figure 10 : Evaluation de la liaison des FX-Fc aux phospholipides
FX plasmatique (x), FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc de YB2/0 surnageant (o) ou aptamopurifié (·), FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc de HEK surnageant (□) ou aptamopurifié (■), FVIIvl- psFX-IIa-F2-Fc de CHO-F surnageant (Δ) ou aptamopurifié ( A ).
Figure 11 : Activation des FX-Fc variants par la thrombine
FX plasmatique (x), FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc de YB2/0 aptamopurifié (« FVIIvl-psFX- IIa-F2-Fc de HEK aptamopurifié (■), FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc de CHO-F aptamopurifié ( A ).
Figure 12 : Génération de thrombine par les FX-Fc modifiés en plasma déficient en FVIII
La génération de thrombine a été suivie au cours du temps dans un plasma normal ou déficient en facteur VIII stimulé par 0,5 pM de facteur tissulaire en présence de phospholipides. Signal obtenu avec un plasma normal (·) ; en présence de 0,1 U/ml de FVIII recombinant (□); en présence de 1 U/ml de FVIII recombinant (■); en présence de 4 μg/ml de FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc aptamopurifié de YB2/0 (Δ) ; en présence de 4 μg/ml de FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc aptamopurifié de HEK ( A) ; en présence de 4 μg/ml de FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc aptamopurifié de CHO (♦).
Exemple 1 : Génération des vecteurs d'expressions contenant les propeptides modifiés
Construction d'un vecteur d'expression bicistronique exprimant un FX modifié et la VKOR humaine
Un vecteur d'expression non commercial (OptiCHO) a été utilisé pour insérer, par ligation In Fusion au niveau des sites de restriction Nhel-SwaI un polynucléotide codant pour le FX modifié. Brièvement, le vecteur d'expression OptiCHO a été digéré par les enzymes de restriction Nhel-SwaI puis purifié sur gel à l'aide du kit Nucleospin extract II (Macherey Nagel).
Le polynucléotide FX modifié a été obtenu par PCR d'assemblage en utilisant comme matrice un vecteur contenant un polynucleotide codant pour le FX sauvage. Les amorces utilisées sont:
-5'FXWT : ACCAGCTGCTAGCAAGCTTGCCG (SEQ ID NO :50) et
-3'FX-2b :
GTCAGGCCCTCGGCCAGGAAGTCCCTAGTCAGATTGTTATCGCCTCTTTCAG GC (SEQ ID NO :51) pour la première PCR, et
-5'FX- lb AGGGCCTGACCCCTAGGATCGTGGGAGGACAGGAGTGCAAGGA (SEQ ID NO :52) et
-3'FX-SwaI GAAACTATTTAAATGGATCCTCACTTGCCGTCAATCAGC (SEQ ID NO :53) pour la seconde PCR.
Le fragment d'intérêt obtenu par PCR a ensuite été cloné par ligation In Fusion dans le vecteur OptiCHO digéré au préalable au niveau des sites de restriction Nhel et Swal. La séquence polynucleotidique codant pour la VKOR humaine obtenue par synthèse de gène avec optimisation de codon pour Homo sapiens. Elle a été extraite d'un vecteur parental (OptiHEK-v3-VKOR) avec l'ensemble de l'unité promotrice (enhancer CMV, promoteur RSV, polynucleotide, signal de terminaison BGH poly A) par digestion Ascl - Spel. Elle a été introduite dans le vecteur construit précédemment par ligation sur les mêmes sites de restriction Ascl - Spel. La VKOR humaine contenait en position C- terminale un tag hexahistidine.
Le vecteur final obtenu contenant 2 unités de transcription (vecteur bicistronique codant pour le FX-modifié d'une part et la VKOR humaine d'autre part) a été nommé OptiHEK-VKOR-FXIIa (Figure 2).
Construction des vecteurs d'expression bicistronique exprimant la VKOR humaine et un FX modifié contenant un peptide signal et/ou un propeptide différent de celui du FX wt
Préparation du vecteur d' expression final pour la ligation
Le vecteur bicistronique optiHEK-VKOR-FXIIa qui contient l'unité de transcription (UT) codant pour le FX-modifié d'une part et pour la VKOR humaine d'autre part a été digéré par les enzymes de restriction Spel-SwaI permettant d'obtenir 2 fragments de 6904 et 3510 pb respectivement. Le fragment de 6904pb (vecteur digéré) a été purifié sur gel à l'aide du kit Nucleospin extract II (Macherey Nagel).
Préparation d'une UT promotrice permettant l'expression du FX modifié
A partir d'un vecteur contenant un polynucleotide codant pour le FX modifié, l'unité promotrice du FX a été amplifiée par PCR en utilisant les amorces :
3UTFX : GGTGGCGGCAAGCTTGCTAGC (SEQ ID NO :54) et
5UTFX : CCTTGGGCAATAAATACTAGTGGCGTTAC (SEQ ID NO :55).
L'amplicon obtenu avec la polymérase Kappa Hifi a ensuite été digéré par les enzymes de restriction Nhel et Spel pour obtenir un fragment final de 1983pb. Le fragment a été purifié sur gel d'agarose et extrait à l'aide du kit Nucleospin extract II (Macherey
Nagel).
Préparation des inserts peptide signal et propeptide pour l'expression des FX variants Le peptide signal (PS) et le propeptide du FX-WT ont été remplacés par ceux de la prothrombine ou du FVII Isoforme vl(A) ou du FVII Isoforme v2(B) ou de la protéine C. Pour cela la même stratégie a été appliquée à chaque fois (dans le cas de la protéine C, 3 amorces ont été utilisées pour réaliser la PCR d'assemblage):
le peptide signal et le propeptide d'intérêt ont été obtenus par PCR à partir d'un vecteur contenant les séquences nucléotidiques correspondantes en utilisant respectivement les amorces suivantes :
■ prothrombine :
amorces 5PSth : AAGCTTGCCGCCACCATGGCTCACGTCCGAGGGCTG (SEQ ID NO :56) et
3PSth :
CTTCATTTCCTCCAGGAAAGAGTTGGCTCTCCGCACCCGCTGCAGC(SEQ ID NO :57)
■ FVII isoforme vl(A) :
amorces 5PSFVII : AAGCTTGCCGCCACCATGGTGTCTCAGGCTCTGCGGC (SEQ ID NO :58) et
3PSFVII :
CAGGAAAGAGTTGGCCCTTCTCCTTCTATGCAGCACTCCATG(SEQ ID NO :59) ■ FVII isoforme v2(B) :
amorces 5PSFVII : AAGCTTGCCGCCACCATGGTGTCTCAGGCTCTGCGGC (SEQ ID NO :60) et
3FVIIv2 : GTCACGAACACAGCAGCCAGACATCCCTGCAGTC(SEQ ID NO :61)
■ Protéine C : amorces
Protéine 1 : AAGCTTGCCGCCACCATGTGGCAGCTGACCAGCCTGCTGCTGTTC GTGGCCACATG (SEQ ID NO :62),
Proteine2 :GAGCTGCTGAACACGCTATCCAGAGGGGCGGGTGTGCCAGAGAT GCCCCATGTGGCCACG (SEQ ID NO :63),
Proteine3 :TTCAGCAGCTCTGAGCGGGCCCACCAGGTGCTGCGGATCAGAAAG AGAGCCAACTCTTTC (SEQ ID NO :64) La séquence du FX modifié sans le peptide signal et sans le propeptide FX-WT a été obtenu par PCR avec les amorces 5FX : GCCAACTCTTTCCTGGAGGAAATGAAG (SEQ ID NO :65) et 3FXIIa : AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :66) (amplicon de 1142pb).
Une PCR d'assemblage a été réalisée entre ces 2 produits de PCR
Une ligation par recombinaison (ligation In Fusion) a été réalisée entre ce produit de PCR d'assemblage, l'UT promotrice et le vecteur final digéré, précédemment préparés. L'efficacité de clonage a été vérifiée par PCR sur colonies avec les amorces 5'EFla : GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO :67) et 2BGHpA et séquençage avec l'amorce 5'EFla :
GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO :68) et 5FXseq : GGAGGCACTATCCTGAGCGAG (SEQ ID NO :69).
Les vecteurs bicistroniques suivants ont ainsi été obtenus :
• proth-FX-IIa-F2 : PS+ propeptide prothrombine- FX modifié + VKOR humaine WT
• FVIIvl-FX-IIa-F2 : PS+ propeptide FVII isoforme vl- FX modifié + VKOR humaine WT
• FVIIv2-FX-IIa-F2 : PS+ propeptide FVII isoforme v2- FX modifié + VKOR humaine WT
• protc-FX-IIa-F2 : PS+ propeptide protéine C- FX modifié + VKOR humaine WT
Remplacement du PS par le PS du FX-WT :
A partir des 4 vecteurs finaux obtenus, la stratégie suivante a été mise en œuvre afin de remplacer uniquement le peptide signal par celui du FX-WT :
1) A partir d'un vecteur contenant la séquence nucléotidique du FX modifié, nous avons obtenu par PCR la séquence correspondant au PS du FX-WT avec les amorces PSlfxWT et PS2fxWT. 2) Sur chacun des 4 vecteurs finaux nous avons obtenu par PCR la séquence correspondant à celle du FX modifié sans peptide signal en utilisant les amorces suivantes :
• proth-FX-IIa-F2 : amorces 3FXIIA :
AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :70)
ET PSWT-P TH :
GACGGGAGCAGGCCCAGCATGTCTTCCTGGCACCACAG (SEQ ID NO :71)
• FVIIvl-FX-IIa-F2 : amorces 3FXIIA :
AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :72)
ET PSWT-FVII vl :
CGGGAGCAGGCCGCTGGCGGCGTCGCTAAGGC (SEQ ID NO :73)
• FVIIv2-FX-IIa-F2 : amorces 3FXIIA :
AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :74) ET PSWT-FVII v2 :
CGGGAGCAGGCCGCTGTGTTCGTGACCCAGGAAGAG (SEQ ID NO :75)
• protc-FX-IIa-F2 : amorces 3FXIIA :
AGCTCTAGACAATTGATTTAAATGGATCCTCAC (SEQ ID NO :76) ET PSWT-PROT :
CGGGAGCAGGCCACACCCGCCCCTCTGGATAGCG (SEQ ID NO :77)
Une PCR d'assemblage a ensuite été réalisée entre amplicon obtenu à l'étape 1 (PS du FX WT) et chacun de ceux obtenu à l'étape 2 (FX modifié sans peptide signal).
Une ligation par recombinaison (ligation In Fusion) a été réalisée entre ces produits de PCR d'assemblage, l'UT promotrice et le vecteur final digéré, précédemment préparés. L'efficacité de clonage a été vérifiée par PCR sur colonies avec les amorces :
3) 5'EFla : GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO :78) et
4) 2BGHpA et séquençage avec les amorces
5'EF1A : GTGGAGACTGAAGTTAGGCCAG (SEQ ID NO :79) et 5FXSEQ : GGAGGCACTATCCTGAGCGAG (SEQ ID NO :80). Nous avons ainsi obtenu les vecteurs bicistroniques finaux suivants :
• proth-psFX-IIa-F2 : PS FXwt + propeptide prothrombine- FX modifié + VKOR humaine WT
• FVIIvl-psFX-IIa-F2 : PS FXwt + propeptide FVII isoforme A- FX modifié + VKOR humaine WT (figure 3)
• FVIIv2-psFX-IIa-F2 : PS FXwt + propeptide FVII isoforme B- FX modifié + VKOR humaine WT
• protc-psFX-IIa-F2 : PS FXwt + propeptide protéine C- FX modifié + VKOR humaine WT.
Les différentes séquences utilisées dans les exemples sont représentées dans le tableau 1 suivant:
Proth- psFX- QHVFLAPQQARS
LLQRVRR ANSFLEEMKKGHLERECMEETCSYEEARE
Ila*
(SEQ ID (SEQ ID NO : 13) VFEDSDKTNEFWNKYKDGDQCETSPCQN
QGKCKDGLGEYTCTCLEGFEGKNCELFTR
NO:21)
KLCSLDNGDCDQFCHEEQNSVVCSCARGY
FVIIvl- AGGVAKASGGET
TLADNGKACIPTGPYPCGKQTLERRKRSV
psFX- RDMPWKPGPHR
AQATSSSGEAPDSITWKPYDAADLDPTENP
IIa*(SEQ MGRPLHL VFVTQEEAHGVL
FDLLDFNQTQPERGDNNLTRDFLAEGLTPR
ID VLLSASLA HRRRR IVGGQECKDGECPWQALLINEENEGFCGG
NO:22) GLLLLGES (SEQ ID NO : 14)
TILSEFYILTAAHCLYQAKRFKVRVGDRNT
FVIIv2- LFIRREQA
EQEEGGEAVHEVEVVIKHNRFTKETYDFDI
psFX- (SEQ ID AVFVTQEEAHGV
AVLRLKTPITFRMNVAPACLPERDWAEST
Ila* NO :7) LHRRRR
LMTQKTGIVSGFGRTHEKGRQSTRLKMLE
(SEQ ID (SEQ ID NO : 15)
VPYVDRNSCKLSSSFIITQNMFCAGYDTKQ
NO:23)
EDACQGDSGGPHVTRFKDTYFVTGIVSWG
ProtC- EGCARKGKYGIYTKVTAFLKWIDRSMKTR psFX- TPAPLDSVFSSSE GLPKAKSHAPEVITSSPLK
Ila* RAHQVLRIRKR (SEQ ID NO : 17)
(SEQ ID (SEQ ID NO : 16)
NO:24)
mutant selon l'invention
Exemple 2 : Production des FX contenant des propeptides modifiés dans la lignée de production HEK 293 Freestyle
1. Réactifs
Milieu de culture Freestyle™ F17
L-glutamine
Milieu de transfection des cellules HEK : Opti-MEM
Vitamine Kl 2. Protocole
Le facteur X de type sauvage et les FX modifiés ont été produits dans des cellules eucaryotes HEK-293 -Freestyle (HEK 293F) en expression transitoire.
Les HEK 293F ont été cultivées en milieu F17, supplémenté de 8 mM de L-glutamine, en conditions agitées à 135 rpm en atmosphère contrôlée (8% C02) à 37°C. La veille du jour de transfection, les cellules ont été ensemencées à une densité de 7.105 cellules/ml. Le jour de la transfection, l'ADN (30 μg) et 60 μΐ d'agent de transfection (AT) ont été pré-incubés séparément en milieu Opti-MEM durant 5 minutes puis mélangés et incubés durant 20 minutes pour permettre la formation du complexe ADN/ AT. L'ensemble a été ajouté à une préparation cellulaire de 1.106 cellules/ml dans un volume de 30 ml.
Dans le cas des co-transfections, les 2 vecteurs ont été ajoutés à différents ratios pour obtenir une quantité totale d'ADN de 20-30 μg. Immédiatement après la transfection, la vitamine Kl (5 μg/ml) a été ajoutée dans le milieu. Les taux de transfections ont été évalués le lendemain de la transfection à l'aide d'un plasmide contrôle exprimant la GFP (Green Fluorescent Protein). Les productions ont été réalisées en mode « batch » durant 7 jours. En fin de production, les cellules et le surnageant ont été séparés par centrifugation. Les cellules ont été éliminées et le surnageant a été récolté, supplémenté par 2 mM PMSF et 10 mM benzamidine, filtré en 0.22μιη, concentré 10X puis congelé.
Exemple 3 : Production des FX contenant des propeptides modifiés dans la lignée de production CHO-S 1. Réactifs
Milieu de culture proCH04
L-glutamine
Milieu de transfection des cellules CHO-S : Opti-Pro S FM
Vitamine Kl
2. Protocole
Le facteur X de type sauvage et les FX modifiés ont été produits dans des cellules eucaryotes CHO-S (Invitrogen) en expression transitoire.
Les CHO-S ont été cultivées en milieu proCH04, supplémenté de 4 mM de L- glutamine, en conditions agitées à 135 rpm en atmosphère contrôlée (8% C02) à 37°C. La veille du jour de transfection, les cellules ont été ensemencées à une densité de 6.105 cellules/ml.
Le jour de la transfection, l'ADN (37.5 μg) et 37.5 μΐ d'agent de transfection (AT) ont été pré-incubés séparément en milieu Opti-Pro SFM durant 5 minutes puis mélangés et incubés durant 20 minutes pour permettre la formation du complexe ADN/AT. L'ensemble a été ajouté à une préparation cellulaire de 1.106 cellules/ml dans un volume de 30 ml.
Dans le cas des co-transfections, les 2 vecteurs ont été ajoutés à différents ratios pour obtenir une quantité totale d'ADN de 20-45 μg. Immédiatement après la transfection, la vitamine Kl (5 μg/ml) a été ajoutée dans le milieu. Les taux de transfections ont été évalués le lendemain de la transfection à l'aide d'un plasmide contrôle exprimant la GFP. Les productions ont été réalisées en mode « batch » durant 7 jours. En fin de production, les cellules et le surnageant ont été séparés par centrifugation. Les cellules ont été éliminées et le surnageant a été récolté, supplémenté par 2 mM PMSF et 10 mM benzamidine, filtré en 0.22μιη, concentré 10X puis congelé.
Exemple 4 : Quantification de la gamma-carboxylation des facteurs X produits 1- Protocole expérimental : Mesure de la concentration en facteur X
La concentration en facteur X a été mesurée par l'intermédiaire de l'ELISA commercial Zymutest Factor X (HYPHEN BioMed réf RK033A) en suivant les recommandations du fabricant. Les concentrations ont été mesurées en duplicat en utilisant des valeurs d'antigène situées dans la zone linéaire de détection de l'essai. Pour s'assurer que les mutations introduites ne perturbent pas la mesure de la concentration, les FX ont été déposés en quantité identique et révélés par immunoblotting avec un anticorps polyclonal différent de celui utilisé en ELISA (Polyclonal antibody anti-human FX (CRYOPEP cat n°PAHFX-S) ou par coloration après SDS-PAGE (données non montrées).
Les concentrations des FX variants présents dans les surnageants des cellules HEK transfectées ont été mesurées afin de déposer la même quantité de FX sur l'ELISA anti- Gla.
2- Protocole expérimental : Mesure du taux de Gamma-carboxylation
Le taux de gamma-carboxylation a été mesuré grâce à un ELISA établi au laboratoire qui utilise l'anticorps de révélation du kit ELISA assay Zymutest Factor X (Hyphen) et l'anticorps anti-Gla (Sekisui) comme anticorps de capture.
L'anticorps anti-Gla (200 μΐ à 5 μg/ml) a été incubé sur la nuit à température ambiante (TA). Après incubation, la plaque a été saturée avec du PBS + 1% BSA (250 μΐ/puits) pendant 2 h à TA. Après lavage, 200 μΐ d'échantillon à 0.2 μg/ml ou de standards (consistant en un mélange à différents ratios de FX plasmatique et de facteur X produit dans CHO (non gamma-carboxylés) ont été déposés 2 h à TA. Après lavages, l'anticorps anti-FX couplé à la peroxydase (200 μΐ du kit ZYMUTEST) a été dilué dans le tampon fourni et incubé lh à TA. Après lavages, la révélation a été faite en ajoutant 200 μΐ de TMB pendant 8 minutes. La révélation a été stoppée par 50 μΐ^ d'acide sulfurique à 0.45 M et la densité optique a été lue à 450 nm.
3- Résultats
Les cellules HEK produisent naturellement le FX ectopique sous forme non gamma- carboxylé (non montré). Pour augmenter avantageusement le taux de gamma- carboxylation, le FX a été co-transfecté en présence de VKOR. Cette co-transfection peut se faire soit en traitant les cellules avec deux vecteurs (Opti-HEK-FX-IIa-F2) soit en utilisant un vecteur bicistronique portant les deux ADNc (Opti-HEK-VKOR-IIa). Dans les deux cas, le taux de gamma-carboxylation était identique à 11,55 % et 10,20 % du FX plasmatique respectivement (tableau 2). La substitution intégrale du peptide signal du FX et du propeptide par ceux du FVII (vl et v2), de la prothrombine ou de la protéine C n'a pas augmenté significativement le taux de gamma-carboxylation (6,7 à 24,5 %). La combinaison avec le FVIIvl (FVIIvl-FX-IIa-F2) est toutefois la plus efficace des 4 à 24,5%.
Des constructions chimériques ont ensuite été construites en conservant le peptide signal du FX et en insérant les propeptides utilisés précédemment. Les nouvelles constructions ainsi générées s'avèrent de façon surprenante avantageuses en terme de gamma-carboxylation, surtout celle avec le propeptide FVIIvl (FVIIvl- psFX-IIa-F2) pour laquelle un taux de 52 % a été observé.
Ainsi cette dernière construction permet d'accroître de 4,7 fois le taux de gamma- carboxylation. L'ensemble des mesures individuelles a été présenté en figure 4 qui montre la supériorité de l'utilisation de la combinaison FX et du propeptide FVIIvl.
Tableau 2 : Evaluation de la gamma-carboxylation des différents mutants
Exemple 5 : Purification des FX contenant des propeptides modifiés sur une colonne d'aptamères capable de fixer le domaine Gla du facteur X 1. Protocole
Le surnageant de culture concentré issu de HEK ou CHO a été décongelé à 37 °C. Il a ensuite été dilué au ½ en tampon d'équilibration (Tris HC1 50 mM, CaCl2 10 mM, pH 7,5) puis purifié sur une colonne d'aptamère anti-Gla qui a été préalablement équilibrée dans le même tampon. La colonne a été lavée par 12 volumes de colonne en tampon d'équilibration. Le FX a ensuite été élué par un tampon Tris HC1 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5. La colonne a été replacée en tampon d'équilibration (25 volumes de colonne) avant stockage à 4°C. Le FX a été traité par 2 mM de PMSF, concentré, et stocké à -80°C. 2. Résultats
Les FX-FIIa-F2 produits à partir de CHO ou HEK ont été purifiés sur un aptamère reconnaissant le domaine gamma-carboxylé. Le produit de CHO a été purifié suivant un protocole classique d'immunopurification ou par aptamopurification. Les produits purifiés ont été contrôlés par SDS-PAGE 4-10 % (Figure 5A). Les deux produits recombinants ont montré un profil similaire suite à la séparation en acrylamide avec ou sans réduction au DTT (Figure 5 A, piste 4 et 3). Non réduit, les produits sont apparus sous forme d'une bande unique à environ 60-65 kDa. Leur migration a été un peu plus lente que celle du FX plasmatique (Figure 5 A, piste 2) car les produits ont 10 acides aminés supplémentaires. La réduction des produits sépare complètement la chaîne lourde (48 kDa) de la chaîne légère (17 kDa). Les FX recombinants ont montré un profil similaire quel que soit leur mode de purification. La chaîne légère des trois facteurs X purifiés a migré de la même manière, comme attendu.
Le produit de HEK aptamopurifié a été comparé au FX plasmatique (Figure 5B). Le produit était pur à homogénéité et est apparu sous la forme d'une seule bande migrant à un poids moléculaire légèrement supérieur à celui du FX plasmatique comme vu précédemment (Figure 5B, piste 3). La réduction du produit montre que la différence de migration est portée par la chaîne lourde. Ces données montrent que l'aptamopurification, par exemple du FX-IIa-F2, permet d'obtenir un produit pur à homogénéité après une seule étape de purification.
Exemple 6: Mesure de l'activation des facteurs X variants produits dans HEK par la fraction de venin RVV-X
1. Protocole expérimental
L'activation des FX variants produits par les cellules HEK a été mesurée suite à l'incubation des facteurs X aptamopurifiés en présence de la fraction anti-facteur X du venin de la vipère de Russell (RVV-X). Le facteur X activé de contrôle, la fraction X du venin (RVV-X) et le substrat pNAPEP 1065 étaient disponibles dans le commerce (e.g. Haematologic Technologies).
L'activation a été étudiée à 37°C dans le tampon suivant : 25 mM HEPES, pH 7.4, 0.175 M NaCl, 5 mM CaCl2, 5 mg/ml BSA. Pour des concentrations de 0 à 100 nM de FX, une concentration de 200 mU/ml de RVV-X a été utilisée. Après 5 min d'incubation, la réaction a été arrêtée dans le tampon 50 mM Tris, pH 8.8, 0.475 M NaCl, 9 mM EDTA. La quantité de FXa générée a été suivie en mesurant la vitesse d'hydrolyse du substrat pNAPEP 1065 (250 μΜ) à 405 nm. 2. Résultats
Les variants de facteur X purifiés ont été incubés avec le RVV-X. La génération de FXa a été mesurée suite à ce traitement à partir de différentes concentrations en FX. La présence de FXa a été quantifiée par la vitesse d'apparition du produit du pNAPEP 1065 en solution (en mUDO/min). Cette génération est le reflet de la reconnaissance et du clivage des FX par le RVV-X ainsi que de la capacité du FXa généré à reconnaître le substrat du FX. La moyenne des vitesses d'apparition a été faite pour les différentes concentrations initiales de FX et cette valeur a été ramenée en pourcentage de la valeur du FX-WT.
Les contrôles du FX déjà activé et du FX traité par le RVV-X donnaient tous deux un signal positif et du même ordre de grandeur (Figure 6). Le contrôle FXa a été considéré comme le 100 %. Les deux constructions de facteur X variant ont été activées à environ 60 % du FXa (54 % pour Opti-HEK-VKOR-IIa et 63 % pour FVIIvl-psFX-IIa-F2). Ce résultat n'était pas surprenant car l'activation par le RVV-X n'est pas sensible au taux de gamma-carboxylation. Ce résultat a montré en revanche avantageusement que la modification du propeptide n'entraine pas de perte de l'activité chromogénique du FXa.
Exemple 7: Mesure de l'activation des facteurs X variants produits dans HEK par le complexe facteur VIIa/Facteur Tissulaire (FT)
1. Protocole expérimental
L'activation des FX variant produits par les cellules HEK a été mesurée suite à l'incubation du produit aptamopurifié en présence de 50 pM de FVIIa et de facteur tissulaire. En plaque à fond plat, le complexe FVIIa (100 μΐ à 100 pM) - FT a été ajouté aux différentes dilutions de FX (100 μΐ). Au bout de 10 min, le mélange (20 μΐ) a été prélevé et déposé dans 180 μΐ de tampon STOP (Tris 50 mM, EDTA 9 mM, NaCl 475 mM, pH 8,8). Le substrat PNAPEP dilué au ½ en eau PPI (50 μΐ) a été ajouté et une lecture immédiate en mode cinétique toutes les 25 secondes a été faite pendant 10 min à 405 nm.
2. Résultats
Les contrôles représentés par le FX plasmatique déjà activé et le FX plasmatique traité par le FVIIa/TF ont donné tous deux un signal positif et du même ordre de grandeur (Figure 7). Le contrôle FXa plasmatique a été considéré comme le 100 %. Les deux constructions de facteur X variant ont été activées à 27 % du FXa pour Opti-HEK- VKOR-IIa et à 36 % pour FVIIvl-psFX-IIa-F2. Cette activité est sensible au taux de gamma-carboxylation. La modification du propeptide a permis au FVIIvl-psFX-IIa-F2 d'avoir une activité de 142 % de celle de la molécule contenant le propeptide de type sauvage. Ces résultats indiquent que l'augmentation du taux de gamma-carboxylation permet d'augmenter l'activité procoagulante du FXa variant par rapport à la molécule contrôle. Exemple 8 : Mesure en temps de génération de thrombine (TGT) de la capacité procoagulante des facteurs X variants: Activation de la voie extrinsèque de la coagulation (FT 1 pM/PL 4 uM) en plasma déficient en FVIII 1. Protocole expérimental
1.1. Réactifs
Thrombin calibrator, PPP reagent low, CK-Prest, Fluca Kit (Fluo-buffer + Fluo- substrat) et le PNP étaient disponibles dans le commerce, par exemple chez Stago. Le plasma déficient en FVIII (e.g. Siemens Healthcare) et le Facteur VIII recombinant humain de contrôle provient de chez Baxter (Advate).
1.2. Protocole
Le test de génération de thrombine consiste à activer la coagulation ex vivo à l'aide d'un mélange de facteur tissulaire et de phospholipides (activation de la voie extrinsèque de la coagulation) et à mesurer ensuite la concentration de thrombine générée au cours du temps.
Les tests de génération de thrombine ont été réalisés sur 80 μΐ d'un pool de plasma contenant du produit purifié ou les contrôles, en présence de 20 μΐ de réactif PPP contenant au final 1 pM de Facteur Tissulaire (FT) et 4 μΜ de phospholipides (PL). Différents plasmas peuvent être utilisés : plasma normal, déficient en facteur X, déficient en facteur VIII, plasma déficient en facteur IX ou plasma déficient en FXI La réaction a été démarrée par l'ajout de 20 μΐ^ de Fluca-kit (substrat + CaCl2) qui constitue le début de la mesure de l'apparition de thrombine. L'apparition de fluorescence a été mesurée sur un fluorimètre de type Fluoroskan Ascent (ThermoLabsystems) à une longueur d'onde d'excitation de 390 nm et à une longueur d'onde d'émission de 460 nm. Les thrombinogrammes (courbes représentant l'intensité de fluorescence en fonction du temps) ont ensuite été analysés grâce au logiciel Thrombinoscope™ qui transforme la valeur de fluorescence en nM de thrombine par calcul comparatif.
2. Résultats Les plasmas Unicalibrator, ainsi que les plasmas déficients en FVIII reconstitués par 0, 0.1 ou 1 U/ml de FVIII recombinant ont été utilisés comme témoins. Le FVIIvl-psFX- IIa-F2 aptamopurifié a été utilisé à 10 et 20 μg/ml.
Comme attendu suite à l'activation de la coagulation par le facteur tissulaire, le plasma déficient en FVIII a donné le signal le plus faible, correspondant au bruit de fond de l'expérience (Figure 8). Le plasma Unicalibrator a fourni un signal plus faible que le plasma déficient en FVIII reconstitué par les concentrations de FVIII (0.1 ou 1 U/ml). Le FX variant possédant un propeptide modifié a la capacité de corriger un plasma déficient en FVIII aussi efficacement que le FVIII. Une réponse en fonction de la dose a été observée avec un temps de latence qui se raccourcit lorsque la dose augmente et une amplitude qui augmente. L'amplitude du signal n'a toutefois pas atteint complètement la reconstitution par 1 U/ml de FVIII mais elle était bien supérieure à celle d'un plasma normal. En conséquence l'augmentation de la gamma-carboxylation obtenue pour un facteur X variant selon l'invention, avantageusement couplée à une aptamopurification, a permis d'obtenir un facteur X variant parfaitement actif et qui se substitue efficacement au FVIII.
Exemple 9 : Production des FX-Fc contenant un propeptide modifié dans la lignée de production YB2/0
1. Réactifs
Milieu de culture : EMabprol
L-glutamine 200mM
Geneticin 50 mg/ml
LSI 00
Vitamine Kl
2. Protocole
Le FX modifié FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc a été cloné dans un vecteur bicistronique optimisé pour l'expression dans la lignée YB2/0 dans lequel a été introduite au préalable une séquence nucléique codant pour la furine humaine au niveau de la seconde unité de transcription. La quantité de vecteur nécessaire à la transfection a ensuite été préparée et linéarisée au niveau du site de restriction EcoRV. Après centrifugation, les cellules YB2/0 ont été reprises dans un volume permettant d'obtenir une densité cellulaire de 1.10 cellule/ml. La transfection a été réalisée par électroporation à l'aide d'un kit spécifique (réf : EB110, Ozyme) à 5.106cell/ml en présence de 61^g de vecteur bicistronique contenant la séquence FVIIvl-psFX-IIa- F2-Fc et la séquence de la furine humaine. Après transfection, les cellules ont été remises en suspension dans des flacons de 75cm2. Une pression de sélection a été ajoutée trois jours après la transfection par l'ajout de G418 à 0,6 g/1. La pression de sélection a été maintenue durant 14 jours, puis les cellules ont été congelées. Des productions de la molécule FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc ont été lancées par ensemencement des cellules YB2/0 sélectionnées à une densité de 3.105cellules/ml dans du milieu Emabprol contenant 4 mM de glutamine. Pour la production, un mode « fedbatch » a été appliqué durant 12 jours en ajoutant du glucose et de la glutamine en fonction de la densité cellulaire déterminée au préalable.
En fin de production, les cellules et le surnageant ont été séparés par centrifugation. Les cellules ont été éliminées et le surnageant a été récolté, supplémenté par 2 mM PMSF et 10 mM benzamidine, concentré 5X, filtré en 0.22μιη, puis congelé.
Exemple 10 : Purification des FX-Fc contenant des propeptides modifiés sur une colonne d'aptamères capable de fixer le domaine Gla du facteur X
1. Protocole
Le FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc a été produit en HEK293F, CHO-S et YB2/0 comme décrit dans les exemples 2, 3 et 9.
Le surnageant de culture concentré issu de HEK, YB2/0 ou CHO-S a été décongelé à 37°C puis filtré sur unité Nalgène 0.2 μιη (aPES). Pour un volume de surnageant après filtration, un volume de tampon Tris-HCl 50 mM pH 7.5 a été ajouté. Du gel de QAE Sephadex A50 (0.25% poids/vol ; GE Healthcare) a été ajouté puis le tout a été mis sous agitation pendant une heure à +4°C. Le gel a été chargé dans un corps de colonne, lavé par le tampon d'équilibration et les molécules d'intérêt ont été éluées par un tampon Tris-HCl 50 mM pH7,5 NaCl 500 mM. L'éluat a ensuite été congélé à -80°C avant aptamopurification. L'éluat décongelé a été dilué au ½ en tampon d'équilibration (Tris HC1 50 mM, CaCl2 10 mM, pH 7,5) puis purifié sur une colonne d'aptamère anti-Gla qui a été préalablement équilibrée dans le même tampon. La colonne a été lavée par 12 volumes de colonne en tampon d'équilibration. Le FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc a ensuite été élué par un tampon Tris HC1 50 mM, EDTA 10 mM, pH 7,5. La colonne a été replacée en tampon d'équilibration (25 volumes de colonne + 0,01 % azide de sodium) avant stockage à 4°C. Le FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc a été traité par 0,01 mM de l'inhibiteur GGACK (Cryopep), dialysé contre du NaCl 0,9%, concentré, et stocké à -80°C. 2. Résultats
Les FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc produits à partir de CHO-S, YB2/0 ou HEK ont été purifiés sur un aptamère reconnaissant le domaine gamma-carboxylé. Les produits purifiés issus de CHO-S ou HEK ont été contrôlés par SDS-PAGE 4-10 % (Figure 9). Ils ont montré un profil similaire suite à la séparation en acrylamide avec ou sans réduction au DTT (Figure 9, pistes 3-5 ; 7-9). Non réduit, les produits sont apparus sous forme d'une bande majoritaire à environ 250 kDa migrant de manière très différente de celle du FX plasmatique (67 kDa ; Figure 9, piste 1) car les produits sont greffés à un fragment Fc. Une bande minoritaire à 135 kDa a aussi été détectée seulement dans les produits issus de CHO. La réduction des produits sépare complètement la chaîne lourde greffée au Fc (81 kDa) de la chaîne légère (17 kDa). Les FX-Fc variants ont montré un profil similaire quel que soit leur mode de production. La chaîne légère des trois facteurs X purifiés a migré de la même manière, comme attendu, avec toutefois une hétérogénéité plus forte dans le produit issu de CHO. A noter, un profil similaire à celui de HEK a été obtenu avec le produit issu de YB2/0 (non montré).
Ces données montrent que l'aptamopurification, par exemple du FVIIvl-psFX-IIa-F2- Fc, permet d'obtenir un produit pur à homogénéité après une seule étape de purification même si ce matériel est produit à partir de différentes lignées cellulaires. La présence d'un propeptide modifié n'affecte pas la capacité du produit à être purifié par cette méthode.
Exemple 11 : Liaison des FX-Fc produits dans différentes lignées cellulaires aux phospholipides 1. Protocole
Les phopholipides ont été dilués à 12,5 μΜ en éthanol absolu puis chargés dans des 96-puits. Ils ont été incubés une nuit à température ambiante sans couvercle. Les puits ont ensuite été saturés 2 h par du tampon Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2
10 mM, 1% BSA, pH 7,5. Après saturation, les puits ont été lavés 5 fois par le tampon de lavage/dilution (Tris 50 mM, NaCl 150 mM, CaCl2 10 mM, 0,1% BSA, pH 7,5) puis les échantillons ont été déposés à différentes dilutions et incubés 2h00 à température ambiante. Ils ont ensuite été lavés 5 fois avant incubation avec l'anticorps anti-FX couplé à la peroxydase. Les puits ont été lavés 5 fois avant révélation : 3 minutes à température ambiante par du TMB (kit Zymutest FX). La réaction a été stoppée par l'ajout de 50 μΐ d'acide sulfurique 0,45 M. Les DO à 450 nm ont été lues après avoir agité légèrement la plaque. 2. Résultats
Le facteur X plasmatique contrôle (x) se lie comme attendu aux phospholipides en fonction de la concentration de départ. Le signal tend vers la saturation. Les FVIIvl- psFX-IIa-F2-Fc non purifiés présents dans les surnageants de CHO-S, HEK293 et YB2/0 et les mêmes produits aptamopurifiés ont été évalués. Toutes les formes en surnageant, non purifiées, se sont moins bien liées aux phospholipides que les formes aptamopurifiées. Cette différence de signal peut provenir soit de la présence de molécules inhibitrices ou de compétiteurs de la liaison dans les surnageants soit, et c'est le plus probable, que les surnageants contenaient une fraction du produit faiblement gamma-carboxylé et qu'ils se liaient donc moins bien aux phospholipides. Le passage sur la colonne d'aptamopurification a augmenté de manière variable les capacités des trois produits à se lier aux phospholipides: le produit issu de CHO est celui pour lequel le signal a été le plus amélioré, vient ensuite le produit YB2/0 puis celui HEK293. Après aptamopurification, tous les produits se sont liés aux phospholipides en donnant un signal au moins aussi fort que celui du FX plasmatique voire même supérieur pour les produits HEK293 et
YB2/0. Ces données montrent que les FX-IIa-F2-Fc produits en présence d'un propeptide modifié (e.g. FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc) ont une excellente capacité à se lier aux phospholipides, liaison connue pour être médiée par les différents sites de gamma- carboxylation.
Exemple 12 : Activation des FX-Fc produits dans différentes lignées cellulaires par la thrombine
1. Protocole
Les expériences et les dilutions ont été conduites dans le tampon réactionnel suivant: Hepes 25 mM, NaCl 175 mM, BSA 5 mg/ml, CaCl2 5 mM pH 7,4. La gamme étalon a été préparée comme suit : en plaque à fond plat, 100 μΐ r-Hirudine à 50 nM + 100 μΐ de chaque dilution de FXa + 50 μΐ de substrat PNAPEP dilué au ½ en eau PPL Une lecture immédiate en mode cinétique toutes les 25 secondes pendant 10 min à 405 nm a été réalisée. Les essais ont été réalisés en ajoutant à 100 μΐ d'échantillon à 200 nM, 100 μΐ de thrombine à 20 nM concentrations finales 100 nM FX / 10 nM Ha.
Le mélange a ensuite été incubé à 37°C puis à différents temps 0, 0.5, 1, 2, 3.5, 6 et 8 h, un aliquot de 20 μΐ a été prélevé et déposé dans un puits d'une microplaque à fonds plat contenant 180 μΐ de r-Hirudine à 50 nM. Le substrat pNAPEP 1065 (50 μΐ) dilué au ½ en eau PPI a été ajouté et une lecture immédiate en mode cinétique toutes les 25 secondes a été réalisée pendant 10 min à 405 nm.
2. Résultats
L'incubation du facteur X plasmatique en présence de thrombine n'a pas conduit à l'apparition d'activité FXa confirmant que cette molécule n'est pas activable par la thrombine.
En revanche, la molécule FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc produite dans trois lignées cellulaires HEK293, CHO-S et YB2/0 a été sensible à cette activation et a fait apparaître du FXa de manière linéaire au cours du temps. La quantité de FXa générée était légèrement supérieure avec le produit issu d'YB2/0.
Ces données indiquent que la présence d'un propreptide différent de celui du facteur X n'altère pas la capacité de la molécule à être activée par la thrombine. Exemple 13 : Mesure en temps de génération de thrombine (TGT) de la capacité procoagulante des FX-IIa-F2-Fc: Activation de la voie extrinsèque de la coagulation (FT 1 pM/PL 4 uM) en plasma déficient en FVIII
1. Protocole
Un protocole identique à celui décrit dans l'exemple 8 a été appliqué.
2. Résultats
Les témoins, plasma déficient en facteur VIII reconstitué par 0.1 U/ml de facteur VIII (□) ou 1 U/ml de facteur VIII (■) permettent une génération de thrombine qui croit en fonction du taux de FVIII. Un plasma normal donne un signal médian entre ces deux conditions (·). La présence de la molécule FVIIvl-psFX- IIa-F2-Fc (4 μg/ml) permet de corriger la déficience en FVIII. Le facteur produit en HEK293 donne un signal plus puissant que celui du plasma normal avec un lagtime identique. Il est toutefois un peu supérieur à celui du plasma déficient + 1 U/ml de facteur VIII.
Le produit issu de YB2/0 donne lui aussi un signal puissant mais avec un lagtime encore augmenté. Le produit issu de CHO donne un signal plus modéré avec un lagtime encore augmenté mais capable de corriger la déficience en FVIII.
Ces données montrent que le FVIIvl-psFX-IIa-F2-Fc possédant le propeptide comme décrit dans la séquence SEQ ID NO : 14 et produit dans différentes lignées cellulaires a la capacité de restaurer une déficience en facteur VIII.

Claims

REVENDICATIONS
1. Protéine qui est un variant du facteur X comprenant une séquence mutée de SEQ ID NO : 1, caractérisée en ce que ladite séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprend une mutation A, A', B, C ou C, dans laquelle :
la mutation A consiste en la substitution des acides aminés 43 à 52 de la séquence SEQ ID NO : l par une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR,
la mutation A' consiste en la substitution des acides aminés 47 à 52 de la séquence SEQ ID NO : 1 par une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR,
la mutation B consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR, KATXATLSPR, TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1,
la mutation C consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi DFLAEGLTPR, KATN*ATLSPR et KATXATLSPR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1, et en la délétion des acides aminés 4 à 13 de la séquence SEQ ID NO : 1, la mutation C consiste en l'insertion d'une séquence choisie parmi TSKLTR, FNDFTR, LSSMTR, PPSLTR et LSCGQR, entre les acides aminés 52 et 53 de la séquence SEQ ID NO : 1, et en la délétion des acides aminés 4 à 9 de la séquence SEQ ID NO : 1,
où N* est une asparagine éventuellement glycosylée, et
ladite protéine comprenant à son extrémité N-terminale le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X.
2. Protéine selon la revendication 1, caractérisée en ce que la séquence mutée de SEQ ID NO : 1 comprend la mutation B.
3. Protéine selon l'une des revendications 1 à 2, caractérisée en ce que le propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi le propeptide de la thrombine, le propeptide du facteur VII, le propeptide de la protéine C, et leurs versions modifiées.
4. Protéine selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisée en ce que le propeptide est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 13, SEQ ID NO : 14, SEQ ID NO : 15 et SEQ ID NO : 16.
5. Protéine selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisée en ce que le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X est choisi parmi les séquences SEQ ID NO : 18, SEQ ID NO : 19, SEQ ID NO :20 et SEQ ID NO :2l.
6. Protéine selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisée en ce qu'elle comprend, entre le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, et la séquence mutée de SEQ ID NO : 1, une séquence intermédiaire.
7. Protéine selon la revendication 6, caractérisée en ce que la séquence intermédiaire est la séquence de la chaîne légère du facteur X, de préférence la séquence SEQ ID NO :5.
8. Protéine selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisée en ce qu'elle comprend, de l'extrémité N-terminale à C-terminale :
- le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis
- la séquence SEQ ID NO :5, puis
- ladite séquence mutée de SEQ ID NO : 1.
9. Protéine selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisée en ce qu'elle comprend, de l'extrémité N-terminale à C-terminale :
- le peptide signal de séquence SEQ ID NO :7 fusionné à un propeptide différent du propeptide naturel du facteur X, puis
- la séquence SEQ ID NO :5, puis
- la séquence SEQ ID NO : 11.
10. Protéine selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisée en ce qu'elle comprend, de préférence consiste en, une séquence choisie parmi SEQ ID NO :22, SEQ ID NO :23, SEQ ID NO :24 et SEQ ID NO :25.
11. Protéine selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisée en ce qu'elle est fusionnée au niveau de l'extrémité C-terminale à au moins un fragment Fc de type sauvage ou à au moins un fragment scFc de type sauvage, optionnellement muté.
12. Protéine selon la revendication 11, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage a la séquence SEQ ID NO :36 ou SEQ ID NO :37, éventuellement suivie d'une lysine en C-terminal.
13. Protéine selon la revendication 12, caractérisée en ce que le fragment scFc de type sauvage a la séquence SEQ ID NO :42.
14. Protéine selon l'une des revendications 11 à 13, caractérisée en ce qu'elle a la séquence SEQ ID NO :40 ou SEQ ID NO :43.
15. Protéine selon l'une des revendications 11 à 14, caractérisée en ce que le fragment Fc de type sauvage ou le fragment scFc de type sauvage est muté pour comprendre la mutation T366Y ou Y407T.
16. Acide nucléique caractérisé en ce qu'il code pour la protéine selon l'une des revendications 1 à 15.
17. Acide nucléique selon la revendication 16, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi les séquences SEQ ID NO :32, SEQ ID NO :33, SEQ ID NO :34 et SEQ ID NO :35.
18. Cassette d'expression comprenant l'acide nucléique selon la revendication 16 ou 17.
19. Vecteur d'expression, caractérisé en ce qu'il comprend la cassette d'expression selon la revendication 18.
20. Vecteur d'expression selon la revendication 19, pour son utilisation comme médicament, de préférence comme médicament de thérapie génique.
21. Cellule recombinante comprenant l'acide nucléique selon la revendication 16 ou 17, ledit acide nucléique étant préférentiellement compris dans le vecteur selon la revendication 19.
22. Protéine selon l'une des revendications 1 à 15 pour son utilisation en tant que médicament.
23. Protéine selon l'une des revendications 1 à 15 pour son utilisation pour traiter les troubles hémorragiques.
24. Procédé de production d'une protéine selon l'une des revendications 7 à 15, comprenant :
a) l'expression d'un vecteur polycistronique, de préférence bicistronique, dans une cellule hôte, de préférence une cellule CHO, ledit vecteur comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, et un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR, de préférence pour la sous-unité 1 du complexe de vitamine K époxyde réductase (VKORC1) humaine sauvage, de préférence en présence de vitamine K ;
b) la culture de ladite cellule hôte ;
c) la récupération du surnageant cellulaire ;
d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi :
-la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, -la concentration du surnageant,
-la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine selon l'invention par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d'aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X.
25. Procédé de production d'une protéine selon l'une des revendications 7 à 15, comprenant :
a) l'expression de deux vecteurs d'expression, l'un comprenant un polynucléotide codant pour une protéine selon l'invention, et l'autre comprenant un polynucléotide codant pour l'enzyme VKOR citée ci-dessus, dans une cellule- hôte, de préférence une cellule CHO, de préférence en présence de vitamine K ; b) la culture de ladite cellule hôte ;
c) la récupération du surnageant cellulaire ;
d) optionnellement au moins une des étapes choisies parmi :
-la clarification du surnageant, suivi optionnellement d'une étape de filtration, -la concentration du surnageant,
-la neutralisation des protéases activées par l'ajout d'inhibiteurs de protéases ; e) la purification de la protéine selon l'invention par passage du surnageant de production obtenu en c) ou d) sur une colonne d'aptamères capable de se fixer au domaine Gla du facteur X.
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