EP3189058A1 - Procede de preparation de la marmycine a et de ses analogues ainsi que leurs utilisations - Google Patents

Procede de preparation de la marmycine a et de ses analogues ainsi que leurs utilisations

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Publication number
EP3189058A1
EP3189058A1 EP15759724.6A EP15759724A EP3189058A1 EP 3189058 A1 EP3189058 A1 EP 3189058A1 EP 15759724 A EP15759724 A EP 15759724A EP 3189058 A1 EP3189058 A1 EP 3189058A1
Authority
EP
European Patent Office
Prior art keywords
alkyl
formula
compound
group
radicals
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Withdrawn
Application number
EP15759724.6A
Other languages
German (de)
English (en)
Inventor
Raphaël RODRIGUEZ
Tatiana CANEQUE
Filipe GOMES DA CRUZ
Trang MAI
Max Malacria
Giovanni Maestri
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Pierre et Marie Curie
Original Assignee
Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Universite Pierre et Marie Curie
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Centre National de la Recherche Scientifique CNRS, Universite Pierre et Marie Curie filed Critical Centre National de la Recherche Scientifique CNRS
Publication of EP3189058A1 publication Critical patent/EP3189058A1/fr
Withdrawn legal-status Critical Current

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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D519/00—Heterocyclic compounds containing more than one system of two or more relevant hetero rings condensed among themselves or condensed with a common carbocyclic ring system not provided for in groups C07D453/00 or C07D455/00
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P31/00—Antiinfectives, i.e. antibiotics, antiseptics, chemotherapeutics
    • A61P31/04—Antibacterial agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P33/00—Antiparasitic agents
    • A61P33/02—Antiprotozoals, e.g. for leishmaniasis, trichomoniasis, toxoplasmosis
    • A61P33/06—Antimalarials
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
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    • C07D309/00—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings
    • C07D309/02—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D309/08—Heterocyclic compounds containing six-membered rings having one oxygen atom as the only ring hetero atom, not condensed with other rings having no double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D309/14—Nitrogen atoms not forming part of a nitro radical
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D491/00—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00
    • C07D491/02—Heterocyclic compounds containing in the condensed ring system both one or more rings having oxygen atoms as the only ring hetero atoms and one or more rings having nitrogen atoms as the only ring hetero atoms, not provided for by groups C07D451/00 - C07D459/00, C07D463/00, C07D477/00 or C07D489/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D491/08—Bridged systems
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
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    • C07H15/20—Carbocyclic rings
    • C07H15/24—Condensed ring systems having three or more rings
    • C07H15/244—Anthraquinone radicals, e.g. sennosides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/5005—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells
    • G01N33/5091—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving human or animal cells for testing the pathological state of an organism

Definitions

  • the present invention relates to a process for the preparation of marmycin A and its analogs, novel analogs of marmycin A, as well as their uses as biomarkers, and especially as markers of organelles, and in pharmacy, especially as a antibiotics, anticancer drugs and antimalarials.
  • Marmycin A belongs to the family of angucyclines, with antibacterial and cytotoxic properties. It is characterized by a polyaromatic structure, including an anthraquinone unit fused to an aminopyranose ring via a C-glycoside bond and an N-glycoside bond on the same saccharide group. Marmycin A therefore has a unique hexacyclic structure.
  • the object of the present invention is to provide a process for the chemical synthesis preparation of marmycin A and its analogs. It is particularly necessary to provide from commercial compounds a total synthesis of marmycin A and its analogues.
  • the present invention also aims to provide novel analogs of marmycin A.
  • the present invention aims to provide compounds useful in pharmacy, particularly in the treatment of cancers, bacterial infections and / or malaria.
  • the present invention also aims to provide compounds useful as biomarkers, and in particular as markers of organelles, in particular as markers of lysosomes.
  • the present invention relates to a process for the preparation of a compound of formula (II):
  • R 1; R 2 , R 3 , R 4 , R 5 , R 6 , Ra, Rb, Rc, Rd and Re are independently of each other an atom or a group of atoms; n represent the number of radicals Ra, Rb, Rd and Re and are equal to 2;
  • said method comprising a step B of coupling a compound of formula (III):
  • radicals R 1 to R 6 are as defined for the compound of formula (II) and R 8 is a group reactive with the NH 2 group of the compound of formula (IV), in particular a triflate group,
  • the present invention relates to a process for preparing a compound of formula (II):
  • RR 2 , R 3 , R 4 , R 5 and R 6 are independently of each other selected from the group consisting of:
  • n represent the number of radicals Ra, Rb, Rd and Re and are equal to 2;
  • index n of the compounds of the invention emphasizes that the radicals Ra, Rb, Rd and Re present may be identical or different.
  • the present inventors have unexpectedly discovered a novel process for the total synthesis of marmycin A and the like.
  • the inventors have discovered that the coupling B of the anthraquinone nucleus with aminopyranose by the formation of a glycosidic CN bond could be carried out in the presence of copper, for example according to the Ullmann coupling principle.
  • This reaction is very surprising because the usual Buchwald-Hartwig type coupling for this type of reaction (see Org Synth 2002, 78, 23 DOI: 10.15227 / orgsyn.078.0023), carried out in the presence of palladium, does not permit to obtain the glycoside bond CN in the present case.
  • Coupling B according to the invention makes it possible in particular to obtain a good yield, preferably at least 30%, of compound of formula (II) according to the invention.
  • the inventors have unexpectedly developed a cyclization step C to obtain a pentacyclic structure.
  • This cyclization step may in particular be carried out according to two alternatives.
  • a glycosidic C-C bond is formed with intramolecular cyclization. Surprisingly, this cyclization is possible in particular in the presence of tetrafluoroboric acid.
  • This first alternative is particularly suitable for the preparation of marmycin A and its analogs, in particular the compounds according to the invention of formula (Ia).
  • a fourth addition step making it possible to form new analogs of marmycin A, and in particular the compounds according to the invention of formulas (laD), has also been developed by the inventors.
  • the present invention therefore has the particular advantage of allowing the total synthesis of marmycin A or analogues, starting from commercially available starting reagents. Since this process can be implemented on an industrial scale, it makes it possible to obtain marmycin A and its analogs in sufficient quantity for their pharmaceutical development and marketing. The process according to the invention makes it possible in particular to obtain a sufficient yield of marmycin A or the like.
  • New analogues in particular oxamarmycin A and its derivatives, have also been discovered.
  • the inventors have also demonstrated the labeling properties of organelles present in particular in the cytosol, such as, for example, lysosomes, by the compounds of the invention, and thus the anticancer, antibiotic and antimalarial properties of the compounds according to the invention. .
  • the inventors have discovered that the compounds according to the invention do not accumulate in the nucleus of cells but in cellular organelles such as lysosomes.
  • the inventors have discovered that the covalent grafting between marmycin A and its analogs and a heterocyclic compound precursor of free radicals makes it possible to obtain an anti-proliferative action of the synergistic type of the compounds obtained, in particular compounds of formula (laD) according to the invention. Indeed, the antiproliferative activity of these compounds is greater than the activity of marmycin A and heterocyclic compounds taken alone, and the anti-proliferative activity of their combination.
  • the present invention relates to pharmaceutical compositions comprising compounds of the invention, and the compounds of the invention for their therapeutic uses or as a medicament.
  • the present invention relates to a method of therapeutic treatment. These applications are described in more detail in the applications of the compounds of the invention.
  • (CrCi O ) alkyl denotes saturated aliphatic hydrocarbon radicals, in straight or branched chain, comprising from 1 to 10 carbon atoms, preferably from 1 to 5 carbon atoms.
  • a branched chain means that one or more lower alkyl groups, such as methyl, ethyl or propyl, are linked to the main linear alkyl chain.
  • the preferred alkyl groups are methyl, ethyl, propyl or isopropyl, in particular methyl.
  • alkyl includes substituted alkyl groups in which one or more hydrogen atoms are substituted by another atom or a group of atoms.
  • (CrCio) alkylene denotes a divalent (CrCi 0 ) alkyl radical as defined above.
  • (C 2 -C 10 ) alkenyl denotes an alkyl group comprising from 2 to 10 carbon atoms, preferably from 2 to 5 carbon atoms, unsaturated, that is to say comprising at least one double bond carbon-carbon, and which can be linear or branched.
  • alkenyl groups that may be mentioned include ethenyl, propenyl, n-butenyl, n-butenyl, 3-methylbut-2-enyl or n-pentenyl.
  • alkenyl includes substituted alkenyl groups in which one or more hydrogen atoms are substituted by another atom or a group of atoms.
  • (C 3 -C 10 ) cycloalkyl means a mono- or multi-cyclic non-aromatic ring system of 3 to 10 carbon atoms, preferably 5 to 6 carbon atoms in which each ring substitutable atom is optionally substituted.
  • monocyclic cycloalkyl there may be mentioned in particular cyclopentyl, cyclohexyl or cycloheptyl.
  • cycloalkyl includes substituted cycloalkyl groups in which one or more hydrogen atoms are substituted by another atom or a group of atoms.
  • aryl refers to a monocyclic or multicyclic aromatic ring system of 6 to 10 carbon atoms in which each ring substitutable atom is optionally substituted by another atom or group of atoms.
  • aryl groups mention may be made in particular of phenyl, naphthalene and anthracene.
  • (C 3 -C 20 ) heterocycle refers to a non-aromatic, mono- or multicyclic ring system of 3 to 20 carbon atoms, in which each ring substitutable atom is optionally substituted and in which at least one carbon atoms is replaced by a heteroatom, preferably an oxygen atom.
  • the heterocycle is a multicyclic, for example quadricyclic, non-aromatic ring system comprising at least one organic peroxide function (-C-O-O-C).
  • ose refers to a carbohydrate monomer.
  • the monosaccharides have at least 3 carbon atoms and include trioses, tetroses, pentoses, hexoses, deoxy-hexoses (fucose or rhamnose), heptoses and nonoses.
  • the preferred oses according to the invention are hexoses such as pyranose, allose, altrose, galactose, glucose, gulose, idose, mannose, talose, fructose, sorbose and tagatose, preferably pyranose.
  • the term "ose” means the compounds of formula (IV) according to the invention.
  • epoxy refers to groups of the following formula:
  • R and R ' are independently of each other selected from (C 1 -C 10 ) alkyl, O (C 1 -C 10 ) alkyl, OC (O) (C 1 -C 10 ) alkyl, (C 2 -C 10 ) groups alkenyl, C (0) 0 (Ci-Cio) alkyl, NH (Ci-C 10) alkyl and N [(C 1 -C 10) alkyl] 2, wherein said alkyl may be substituted.
  • halogen refers to a chlorine, bromine, iodine or fluorine atom.
  • heteroatom refers to an atom selected from O, N, S or P, preferably O or N.
  • reactive group with an NH 2 group of the compound of formula (IV) is meant any group allowing the formation of a CN bond between the compound of formula (III) and the compound of formula (IV) according to the invention , in particular a triflate group.
  • reactive group with an OH group of the compound of formula (Ic) is meant any group allowing the formation of a covalent bond, for example of OC type, between the compound of formula (Ia) and the spacer group L, in particular a group C (O) OH or OH.
  • protecting group denotes a group protecting functional chemical groups, in particular the alcohol functional groups, against undesirable reactions during the synthesis reactions. Examples of protecting groups are given in TW Greene and PGM Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd Edition, John Wiley & Sons, New York (1999), and are known to those skilled in the art. In particular, mention may be made of CH 3 -C (O).
  • ester function is meant a group CC (O) -O-C.
  • ether function is meant a COC group.
  • carbonate function is meant a CO-C (O) -O-C group.
  • carbamate function means a C-NH-C (O) -O-C group.
  • the process for preparing a compound of formula (II) according to the invention is characterized in that the coupling step B is carried out in the presence of a compound comprising copper, of formula C X, X being selected from the group consisting of Cl, Br, I, SO 4 and OAc, preferably of formula Cu-I.
  • the coupling step B is carried out in the presence of 5 mol% to 25 mol%, preferably between 10 mol% and 20 mol%, of compound comprising copper.
  • the coupling step B is carried out in the presence of 10 mol% or 20 mol% of Cu-X.
  • said coupling step B is performed in the presence of 1 to 6 eq. of the compound of formula (IV) as defined above, preferably 2, 3, 4 or 5 eq.
  • said coupling B is carried out in the presence of a base, for example K 2 CO 3 , preferably in the presence of a solvent, for example benzene, xylene, toluene or acetonitrile.
  • a base for example K 2 CO 3
  • a solvent for example benzene, xylene, toluene or acetonitrile.
  • said coupling step B is performed in the presence of a base, for example K 2 CO 3, in an amount of between 1 eq. and 4 eq., preferably 2 eq.
  • a base for example K 2 CO 3
  • said coupling step B is carried out in the presence of a solvent such as toluene or acetonitrile, preferably in the presence of toluene.
  • said coupling step B is carried out in the presence of Cu-I as a catalyst, K 2 CO 3 as a base and toluene as a solvent, preferably under reflux.
  • said coupling step B is carried out at a temperature of between 75 ° C. and 170 ° C., preferably between 130 ° C. and 170 ° C., more preferably between 140 ° C. and 160 ° C. According to one embodiment, said coupling step B is carried out at a temperature of 140 ° C., 150 ° C. or 160 ° C.
  • said coupling step B is performed for at least 24 hours, preferably between 24 and 72 hours.
  • the reaction is carried out in the presence of 20 mole% Cu-I, 2 eq. K 2 CO 3 and toluene at 160 ° C.
  • the method according to the invention further comprises the coupling step A of a compound of formula (V):
  • R 1 and R 2 are as defined for formula (II)
  • Y being a group reactive with the carbon atom carrying the R 3 group of the compound of formula (VI)
  • Rh being a protective group, preferably a CH 3 -C (0) group
  • an organic solvent preferably toluene or xylene, preferably in the presence of toluene.
  • Y is chosen by F, Cl, Br and I, preferably Br. According to one embodiment, the reaction is carried out under reflux.
  • said coupling step A is carried out at a temperature of between 80 ° C. and 120 ° C.
  • the coupling step A comprises the following steps:
  • evaporation of the medium preferably in a bath at a temperature between 50 ° C and 70 ° C, for example 60 ° C;
  • step iii) is carried out with stirring for at least 1 hour.
  • all the steps i) to iv) of the coupling step A is carried out in a single reactor ("one pot").
  • the method according to the invention also comprises an additional step of activating the compound of formula ( ⁇ ) by substitution of the hydrogen atom of the alcohol with a group Rg reactive with the group NH 2.
  • of the compound of formula (IV) according to the invention for example -SO 2 -CF 3 obtained typically by reaction with triflic anhydride, of formula F 3 C-SO 2 -O-SO 2 -CF 3 , to obtain a compound of formula (III) below:
  • this additional activation step is carried out in the presence of a base, in particular an aminated base such as, for example, triethylamine, preferably in the presence of an apolar solvent such as, for example, dichloromethane.
  • a base in particular an aminated base such as, for example, triethylamine
  • an apolar solvent such as, for example, dichloromethane.
  • said activation reaction is conducted at a temperature between -65 ° C and -85 ° C.
  • the method according to the invention further comprises a cyclization step C of said compound of formula (II), to form a pentacyclic structure.
  • the process according to the invention is a process for preparing a compound of formula (Ia) below:
  • the cyclization step Ca is carried out in the presence of HBF 4 OEt 2 or HBF 4, for example at 50% m / m in aqueous solution.
  • the cyclization step Ca is carried out with a quantity of between 0.5 eq. and 5 eq of HBF 4 OEt 2 and more particularly 1, 2 or 3 eq. of HBF 4 OEt 2 .
  • the cyclization step Ca is carried out in the presence of 50% to 70% w / w in aqueous solution of H BF 4 , preferably 60% w / w in aqueous solution of HBF 4
  • the reaction is carried out in the presence of acetonitrile, preferably under reflux.
  • the reaction is conducted for at least 3 hours, preferably between 4 hours and 24 hours.
  • the cyclization step Ca is carried out indirectly by reacting a compound of formula (II) as defined above with HBF 4 , then reacting the reaction product in the presence of HBF 4 and acetonitrile, preferably under reflux, in order to obtain a compound of formula (Ia) according to the invention.
  • the cyclization step Ca is carried out directly, by reacting a compound of formula (II) in the presence of HBF 4 or HCl and acetonitrile, preferably under reflux.
  • the process according to the invention is a process for the preparation of compounds of formula (Ib) below:
  • radicals R 1 to R 6 and Ra to Re are as defined for the compounds of formula (II), and comprising a cyclization step Cb by forming an OC bond of a compound of formula (II) as obtained according to the invention, in a basic medium, preferably in the presence of NaH, to form the compound of formula (Ib).
  • a basic medium preferably in the presence of NaH
  • NaH is preferably used.
  • the cyclization step Cb is carried out in the presence of dichloromethane. According to another embodiment, the cyclization reaction Cb is carried out at a temperature between -20 ° C and 0 ° C, preferably between -5 ° C and 0 ° C, more preferably at 0 ° C.
  • the process for preparing the compounds of formula (Ia) according to the invention comprises the following steps:
  • the process for preparing the compounds of formula (Ib) according to the invention comprises the following steps:
  • the method according to the invention further comprises an addition step D.
  • the addition step D is selected from the group consisting of esterification, etherification, carbonate formation and carbamate formation steps. These steps are known to those skilled in the art who can determine the appropriate operating conditions.
  • the addition step D is an esterification.
  • the esterification is carried out at ambient temperature, for example between 20 ° C. and 25 ° C.
  • the esterification is conducted in the presence of a solvent, and for example in dichloromethane.
  • the esterification reaction is carried out in the presence of 4-dimethylaminopyridine and / or ⁇ , ⁇ '-dicyclohexylcarbodiimide.
  • the product of the reaction of formula (laD) is purified under reduced pressure, for example between 5 mmHg and 15 mmHg, for example 10 mmHg.
  • the process according to the invention is a process for the preparation of a compound of formula (laD) as defined below, said process comprising a step D of adding a compound of formula ( the) :
  • radicals R 1 to R 6 , Ra to Re and n are as defined according to the invention and in which at least one of the radicals Ra to Re is an OH group, preferably an Rd radical;
  • Rx is a reactive group for reacting with an OH function, preferably a C (O) OH or OH group;
  • L is a group of atoms called "spacer group"
  • Rz is a (C 3 -C 20 ) optionally substituted heterocycle; said adding step D resulting in the formation of a compound of the following formula (laD):
  • radicals R 1 to R 6 and n are as defined according to the invention and in which the radicals Ra 1 to Re 1 have the same definitions as the radicals Ra to Re defined for the formula (la) respectively,
  • Ra1 to Re1 represents the group resulting from the reaction between OH and Rx, covalently bound to L-Rz.
  • Rx is a C (O) OH group.
  • the spacer group L is a (CrCio) alkylene which may be substituted and / or comprise one or more heteroatoms chosen from O, N and S, and / or one or more ester, ether, carbonate and carbamate functions.
  • the spacer group L is a (CrCio) alkylene which may be substituted and / or comprise at least one functional group selected from the group consisting of secondary amines, tertiary amines, esters, etheroxides, carbonates and carbamates, preferably the esters.
  • the spacer group L is a polyethylene glycol.
  • the spacer group L bonded to the group resulting from the reaction between the OH group and Rx is selected from the group consisting of:
  • the spacer group L bonded to the group resulting from the reaction between the OH group and Rx represents a group -O-C (O) - (d-
  • Rz is an optionally substituted fused multicyclic heterocycle, preferably an optionally substituted fused quadricycle.
  • Rz is a heterocycle of the following formula, optionally substituted:
  • Rz is artemisinin, of formula:
  • the addition step D is a step of esterification of marmycin A:
  • the process for preparing the compounds of formula (laD) according to the invention comprises the following steps:
  • the reactive groups making it possible to form a glycosidic CC bond are chosen from OH and O (C 10 -C 10) alkyl groups, preferably OH and OMe.
  • Ra and Ra1 are OH or O (CrC 4 ) alkyl, for example methoxy.
  • Rb and Rb1 are H.
  • Rc and Rc1 are a (Ci-C 10) alkyl, preferably a
  • Rc and Rc1 are methyl.
  • Rd and Rd1 are OH or methoxymethyloxygen. According to one embodiment, Rd and Rd1 are not an AcO group. According to one embodiment, Rd and Rd1 are not an OH group.
  • Rb and Rb1 are H and Rc and Rc1 are methyl.
  • Rb is H
  • Rc is methyl
  • Re is methyl
  • Rb1 is H
  • Rc1 is methyl
  • Re1 is methyl
  • R 1; R 2 , R 5 and R 6 are H. According to one embodiment, R 1; R 5 and R 6 are H and R 2 is halogen, preferably Cl, or H.
  • R 3 and R 4 form, with the carbon atoms to which they are attached, a (C 6 -C 10 ) aryl group, preferably an optionally substituted phenyl group;
  • radicals, cycloalkyls and aryls of radicals are independently selected from the radicals, cycloalkyls and aryls of radicals.
  • a substituent chosen from the group consisting of CH 3 , OH, O, COOH, COMe and NMe 2.
  • the present invention also relates to a compound of formula (II), obtainable by the process according to the invention.
  • the present invention also relates to a compound of formula (Ia) obtainable by the process according to the invention.
  • the present invention also relates to a compound of formula (Ib) obtainable by the process according to the invention.
  • the present invention also relates to a compound of formula (laD) obtainable by the process according to the invention.
  • the present invention relates to a compound of formula (II) below:
  • Rc is a (CrCi 0 ) alkyl, preferably a methyl.
  • the invention relates to a compound of formula (II) as defined above, with the exception of compounds for which R 3 and R 4 form, with the carbon atoms to which they are attached, a phenyl group.
  • the present invention relates to a compound of formula (Ia) below:
  • radicals R 1 to R 6 , Ra to Re and n are as defined according to the invention, with the exception of the compounds for which R 3 and R 4 form, with the carbon atoms to which they are attached, phenyl group, and
  • the present invention relates to a compound of formula (Ib) below:
  • the compounds of formulas (Ia) and / or (Ib) have the following configuration:
  • the present invention also relates to the following specific compounds:
  • said compounds have the following formulas:
  • the present invention relates to a compound of formula (laD) below:
  • the present invention relates to a compound of formula (laD) of the following formula:
  • the invention relates to non-natural synthetic compounds of formula (Ia), (Ib) or (laD).
  • the invention relates to compounds of formulas (Ia) and (Ib) in crystalline form, and more particularly marmycin A in the crystalline form referenced under the number CCDC1015494 (Cambridge Cristallography Data Center).
  • the present invention also relates to the following specific unnatural synthetic compound:
  • the present invention also relates to a compound of formula (Ia), (Ib), (laD) or (II) for use in the treatment and / or prevention of cancer, bacterial infection and / or malaria.
  • Marmycin A is particularly known to have cytotoxic properties on human breast, prostate, lung, colon, ovarian and leukemia cancer lines (W. Fenical, J. Nat Prod 2007, 70, 1406 -1409).
  • Marmycin A and its analogues accumulate in organelles such as lysosomes and produce reactive oxygen species (also called ROS - Reactive Oxygen Species) in the latter. These reactive oxygen species induce permeabilization of the organelle membrane. This permeabilization would then induce cell apoptosis (see Oncogene (2008) 27, 6434-6451).
  • the permeabilization of the lysosomal membrane in particular is a disturbed process in cancer cells.
  • the compounds according to the invention are therefore particularly useful in the treatment of cancers.
  • cancers solid or “malignant” malignant tumors (also called hematological cancers) and / or their metastases.
  • metastasis is meant the secondary malignant tumors formed by the migration of cancer cells to a location other than that of the starting malignancy.
  • Hematologic cancers include myeloma, lymphoma and leukemia.
  • the compounds of formula (Ia), (Ib), (laD) or (II) according to the invention are useful in the treatment and / or prevention of a cancer chosen from leukemias, a cancer of the colon, ovaries, breast, prostate, uterus (including cervix), lung, bladder, brain, stomach, pancreas, liver, intestine, head and neck and skin, preferably breast, prostate, lung, colon, ovarian and leukemias.
  • a cancer chosen from leukemias, a cancer of the colon, ovaries, breast, prostate, uterus (including cervix), lung, bladder, brain, stomach, pancreas, liver, intestine, head and neck and skin, preferably breast, prostate, lung, colon, ovarian and leukemias.
  • one or more compounds of formula (Ia), (Ib), (laD) or (II) according to the invention are used in a method of treatment and / or the prevention of a resistant cancer, and in particular of cancer with cancer stem cells.
  • resistant cancers is meant especially cancers resistant to conventional therapies (such as taxol for example). This is for example a treatment of breast cancer resistant to conventional therapies.
  • the invention relates to a treatment of a resistant cancer stem cell breast cancer expressing the CD44 and CD24 sub-expressing markers (CD44 hi9h / CD24 10W ).
  • the invention relates to a treatment of cancer resistant cancer cells expressing for example the "Human telomerase reverse transcriptase" (hTERT).
  • the invention relates to a treatment of a cancer with resistant cancer stem cells expressing the markers CD133 and / or ALGH (CD133 + and / or ALGH + ) (for example a glioblastoma multiforme, "Glioblastoma multiforme (GBM)) .
  • the compounds (Ia), (Ib), (LaD) or (II) according to the invention are used in the therapeutic treatment of a second-line treatment cancer.
  • one or more compounds of formula (Ia), (Ib), (laD) or (II) according to the invention are used in a method of treatment and / or the prevention of cancer presenting cancer stem cells.
  • the invention relates to a treatment of a tumor of the hematopoietic system presenting cancer stem cells expressing the CD34 and CD38 sub-expressing markers (CD347CD38).
  • bacteria infections means the pathologies due to the contamination of the body by bacteria.
  • Malaria, or malaria is the life-threatening infectious disease caused by a parasite of the genus Plasmodium, such as Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, and Plasmodium malariae, spread by the bite of certain species of Anopheles mosquitoes.
  • Plasmodium such as Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, and Plasmodium malariae, spread by the bite of certain species of Anopheles mosquitoes.
  • the compounds of formula (Ib) and (laD) are useful in the treatment and / or prevention of cancers, bacterial infections and / or malaria.
  • the compounds of formula (Ia) and (laD) are useful in the treatment and / or prevention of malaria.
  • the present invention also relates to a compound of formula (Ia), (Ib), (laD) or
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (Ia), (Ib), (La) or (II) for the preparation of a medicament for use in the treatment and / or prevention of cancer, bacterial infection and / or malaria.
  • the present invention also relates to a method for treating and / or preventing cancers, bacterial infections and / or malaria comprising administering to a patient at least one compound of formula (Ia), (Ib), (laD ) and / or (II).
  • the present invention also provides compositions, preferably pharmaceutical, comprising at least one compound of formula (Ia), (Ib), (La) and / or (II).
  • the present invention therefore relates to pharmaceutical compositions comprising, as active ingredient, at least one compound of formula (Ia), (Ib) and / or (II) according to the invention.
  • These pharmaceutical compositions contain an effective dose of at least one compound of formula (Ia), (Ib), (LaD) and / or (II) according to the invention, or a pharmaceutically acceptable salt, as well as at least one excipient.
  • pharmaceutically acceptable Said excipients are chosen according to the pharmaceutical form and the desired mode of administration, from the usual excipients which are known to those skilled in the art.
  • the pharmaceutical compositions may contain other active compounds.
  • compositions of the present invention for oral, sublingual, subcutaneous, intramuscular, intravenous, topical, local, intratracheal, intranasal, transdermal or rectal administration, the active ingredient of formula (Ia), (Ib) , (laD) and / or (II) as defined according to the invention, or a salt thereof, may be administered in unit dosage form, in admixture with conventional pharmaceutical excipients, to animals and humans for the treatment and / or prevention of the diseases mentioned above.
  • Suitable unit dosage forms include oral forms such as tablets, soft or hard capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual, oral, intratracheal, intraocular, intranasal forms of administration by inhalation, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration forms, rectal administration forms and implants.
  • oral forms such as tablets, soft or hard capsules, powders, granules and oral solutions or suspensions, sublingual, oral, intratracheal, intraocular, intranasal forms of administration by inhalation, topical, transdermal, subcutaneous, intramuscular or intravenous administration forms, rectal administration forms and implants.
  • the compounds according to the invention can be used in solutions, emulsions, creams, gels, ointments or lotions, without particular limitation in this respect.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (Ia), (Ib), (La) or (II) for the labeling of an organelle, preferably the lysosome.
  • the present invention also relates to the use of a compound of formula (Ia), (Ib), (laD) or (II) as a marker or biomarker, for example of at least one organelle, preferably the lysosome.
  • the present invention also relates to a method for detecting at least one lysosome comprising contacting at least one cell, preferably of the eukaryotic type, with a compound of formula (Ia), (Ib), (laD) or (II).
  • the present invention also relates to a method for labeling at least one lysosome comprising contacting at least one preferably eukaryotic cell with a compound of formula (Ia), (Ib), (laD) or ( II).
  • said detection method further comprises the following steps:
  • the detection method comprises the detection of the possible presence of the compounds of the invention by means of recording the fluorescence.
  • the detection method comprises the detection of the possible presence of the compounds of the invention by immunodetection.
  • the detection method comprises the detection of lysosomes and compounds of the invention.
  • the invention relates to a method for evaluating cell proliferation using a detection method according to the invention.
  • the invention also relates to a biological labeling kit comprising at least one compound of formula (Ia), (Ib), (laD) or (II).
  • this kit also comprises at least one detectable compound by imaging, such as for example a fluorophore compound or at least one antibody.
  • Figures 1, 2 and 3 show the cytotoxic activity of marmycin A and doxorubicin (intercalating agent used in the treatment of cancer).
  • Figure 1 shows the percentage of cell viability as a function of ⁇ concentration concentration of marmycin A (solid line) or doxorubicin (dotted line) of U20S cells (osteosarcoma cancer line).
  • Figure 2 shows the percentage of cell viability as a function of ⁇ concentration concentration of marmycin A (solid line) or doxorubicin (dashed line) of A2780 cells (ovarian cancer line).
  • the IC 50 values obtained are 9.8 ⁇ for marmycin A and 0.06 ⁇ for doxorubicin.
  • FIG. 3 shows the percentage of cell viability as a function of the concentration in ⁇ of compound 33 (thick solid line), doxorubicin (dotted line) or etoposide (thin line) of HT1080 cells (fibrosarcoma line). .
  • FIG. 4 represents photographs obtained by fluorescence in which: "DAPI” represents the labeling at the level of the cell nucleus by DAPI (4 ', 6'-diamidino-2-phenylindole);"Doxorubicin” represents the marking of the doxorubicin at the cellular nucleus; "DAPI / Marmycin A” represents cell level labeling by DAPI and Marmycin A labeling of lysosomes.
  • FIG. 5 represents photographs obtained by fluorescence in which: "Marmycin A” represents the marking and the localization of Marmycin A,
  • DND-22 represents the labeling and localization of lysosomes
  • Merge represents the colocalization of Marmycin A and lysosomes
  • ZOOM represents a photograph with a magnification on a particular area of the photograph
  • FIG. 6 represents fluorescence-obtained photographs in which: "DAPI" represents the labeling at the level of the cell nucleus by the DAPI;
  • GFP-Lamp1 represents the labeling of lysosomes by the anti-LAMP1 antibody
  • Marmycin A represents the marking and location of Marmycin A
  • MERGE represents the colocalization of Marmycin A and lysosomal proteins GFP-Lamp1 at the level of lysosomes, and DAPI at the level of the cell nucleus.
  • Figure 7 shows a Western Blot analysis in which "4! Represents Doxorubicin and "1! »Marmycin A.
  • FIG. 8 represents fluorescence-obtained photographs in which: "DAPI” represents the labeling at the cellular nucleus by the DAPI; "GFP-Lamp1" represents the labeling of lysosomes by the anti-LAMP1 antibody;
  • MERGE represents the colocalization of artesumycin and lysosomal proteins
  • GFP-Lamp1 at the level of lysosomes
  • DAPI at the level of the cellular nucleus
  • FIG. 9 represents the percentage of viable MDA-MB-231 cells after 72 hours of treatment with doxorubicin (DXR) (round, fine dashed), marmycin A (squares, in points), artesunate (round, dashed) thick), artesumycin (round, solid line) and a combination of marmycin A and artesunate (round, dots and dashes).
  • DXR doxorubicin
  • Figure 10 shows a cytotoxic activity of artesumycin (TC5) on a HMLER CD24- tumor strain cell line.
  • Figure 11 shows a cytotoxic activity of artesumycin (TC5) on a HMLER ID2 cancer cell line.
  • EXAMPLE 1 Synthesis of the compounds of formulas (V) and (VI) according to the invention
  • the synthesis of the dienophile 5 is carried out according to scheme 1.
  • Compound 8 (supplier AIdrich) is protected under standard conditions as diacetylated naphthalene 9 which is then brominated in an acid medium (see Kitani, Y. Morita, A. Kumamoto, T. Ishikawa, T. Helvetica Chimica Acta Carreno, MC et al Chem Eur Eur J 2000, 6, 906 Shis, C, Swenton, JSJ Org Chem 1982, 47, 2825).
  • the diene (compound of formula (VI)) is prepared from commercially available compound (AIdrich supplier) according to Scheme 2.
  • a first bromination step is first performed.
  • Compound 11 is protected in acetal 12 in the presence of ethylene glycol and a catalytic amount of acid.
  • the reaction is carried out at a concentration of 0.4 M in less than 2 hours under reflux of benzene.
  • Compound 12 is converted to 13 by a palladium-catalyzed coupling step in order to graft the vinyl chain.
  • the compounds 5 and 15 are refluxed with toluene for 16 hours, the medium then undergoes a slow evaporation of about 1 hour on a rotary evaporator in a bath at 60 ° C.
  • the medium is taken up in MeOH and remains stirring in the dark for 4 hours. 3 equivalents of potassium carbonate are then added in order to obtain the desired product after treatment.
  • Coupling B according to the invention was carried out a first time according to the following scheme:
  • Coupling B is carried out in the presence of K 2 CO 3 in refluxing toluene with 20 mol% Cu-I, 2 eq. of K 2 C0 3 , 3 eq. of 4 in toluene at 160 ° C for 72 hours. A yield of 33% is obtained.
  • Coupling B according to the invention was also performed according to the following scheme 6.
  • the coupling B according to the invention makes it possible to obtain a yield of at least 30% of compound of formula (II), which is definitely greater than the yield obtained with a Buchwald-Hartwig type coupling.
  • Comparative Example 8 Cyclization Test in the Presence of an Acid
  • the intramolecular C-glycosylation pathway favored by a Lewis or Bronsted acid was tested.
  • a large study was conducted by varying the acid (BF 3 Et 2 0, TMSOTf, ScOTf, InOTf, PPTS, APTS, Cp 2 HfCI 2 / AgCI0 4) without significant results. Only deprotection of compound 27 at 28, and formation of amino anthraquinone 29 were observed.
  • N-Acetyl Cysteine (NAC, A9165 Sigma) or Pan-caspase inhibitor zVAD-FMK (pharmingen BD 550377) were pretreated for 1 hour or 30 minutes prior to treatment with Marmycin A, respectively.
  • the reagent "CelITiter-Blue® Reagent” (20 l / well) was added after 24, 48, or 72 hours of treatment, and the cells were incubated for one hour prior to fluorescence detection (560 (20) Ex / 590 (10) Em) using a device "Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Reader".
  • IC 50 values are 10.3 ⁇ M for marmycin A and 0.1 ⁇ M for doxorubicin at 72 hours.
  • the IC 50 values obtained are 75 ⁇ M for oxamethoxymarmycin, 0.035 ⁇ M for doxorubicin, and 0.5 ⁇ M for etoposide, at 72 hours.
  • Example 10 Cellular localization of the compounds according to the invention
  • U20S cells cultured with less than 40% confluency were treated for 24 hours with 10 ⁇ l of compound unless otherwise indicated.
  • the LysoTracker® Blue DND-22 marker (L7525, Molecular Probes®) was added 30 minutes before fixation.
  • GFP-Lamp1 was transiently transfected according to commercial instructions.
  • 5 mL of CelILighl® Lysosomes-GFP BacMam 2.0 (C10596, Life Technologies) were mixed with 200 ⁇ L of U20S culture medium and added to each well of a 24-well plate. After incubation overnight (16 hours), the cells were washed and treated with Marmycin A as indicated in Example 9.
  • Marmycin A indicated in Example 9.
  • cells were fixed for 12 minutes in 2% formaldehyde / PBS.
  • the coverslips were washed as described above and mounted with VectaShield® mounting medium for fluorescence analysis with or without DAPI (Vector Laboratories Ltd).
  • the images obtained were taken with a Leica microscope (Zeiss) and analyzed with the ImageJ software.
  • Figure 5 illustrates the colocalization of Marmycin A with lysosomes. Marmycin A is present and accumulates in lysosomes.
  • Figure 6 also illustrates that Marmycin A accumulates in lysosomes.
  • Cells with the treatment indicated according to Example 10 were washed twice in PBS and lysed with 2X Laemmli buffer. The cell extracts were boiled for five minutes at 100 ° C and quantified with the Nanodrop 2000 device (Thermal Scientific). 100 ug protein lysate was separated using a 4-20% gel Mini PROTEAN ® TGX Stain-Free TM (BioRad) and transferred to nitrocellulose membrane (Amersham).
  • anti-3-actin (ab8226, Abcam), anti-p62 (610833, BD Transduction Laboratories TM), anti-H2AX (PA1 - 14198, Thermal Scientific), anti-gH2AX ( Ser139) (# 2577, Cell Signaling), anti-p21, anti-p53 (1C12) (# 2524, Cell Signaling), anti-p-p53, anti-LC3B (# 2775, Cell Signaling), diluted anti-BID at 1/1000 in 5% BSA, 0.1% Tween-20 / TBS.
  • the crude product is purified by thin-layer chromatography (heptane / AcOEt,
  • U20S cells cultured with less than 40% confluency were treated for 24 hours with 10 ⁇ l of artesumycin.
  • the LysoTracker® Blue DND-22 marker (L7525, Molecular Probes®) was added 30 minutes before fixation.
  • GFP-Lamp1 was transiently transfected according to commercial instructions.
  • 5 mL of CelILight® Lysosomes-GFP BacMam 2.0 (C10596, Life Technologies) were mixed with 200 ⁇ l of U20S culture medium and added to each well of a 24-well plate. After incubation overnight (16 hours), the cells were washed and treated with artesiimycin as indicated in Example 9. The immunofluorescence analysis was performed in the same way as in Example 10.
  • Figure 8 shows photographs obtained by fluorescence and illustrates the colocalization of artesumycin with lysosomes. Artesumycin is present and accumulates in lysosomes.
  • MDA-MB-231 cells human breast cancer cells purchased from ATCC were maintained in McCoy's 5A medium supplemented with 10% bovine serum (FBS) serum. and 1 X Antibiotic-Antimycotic (all from Gibco®) at 37 ° C with 5% C0 2 .
  • the cell viability measurement was carried out by plating 2000 cells per well in a 96-well plate. N-Acetyl Cysteine (NAC, A9165 Sigma) or Pan-caspase inhibitor zVAD-FMK (pharmingen BD 550377) were pretreated for 1 hour or 30 minutes prior to treatment with the test compounds, respectively.
  • the reagent "CelITiter-Blue® Reagent” (20Ml / well) was added after 24, 48, or 72 hours of treatment, and the cells were incubated for one hour before fluorescence detection (560 (20) Ex / 590 (10) Em) using a "Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Reader” device.
  • test compounds are doxorubicin, marmycin A, artesunate, artesumycin and a combination of marmycin A and artesunate (see Figure 9).
  • Figure 9 shows cytotoxic activity on a cancer cell line of marmycin A and artesumycin.
  • Artesumycin at a concentration of 0.9 ⁇ makes it possible to obtain a cell viability of less than 50%.
  • the cytotoxic activity of artesumycin is greater than that of marmycin A and also greater than that of the combination of marmycin A with artesunate.
  • the IC50 for artesumycin is 0.9 ⁇ .
  • the IC50 of the combination artesunate with marmycin A is 10 ⁇ .
  • Cell viability was evaluated by the following protocol:
  • the "human mammary epithelial cell line” human mammary epithelial cell line was infected with a retrovirus carrying hTERT, SV40 and the oncogenetic HrasV12 allele, called CD44high / CD24low HMLER cells, not expressing E-cadherin and Vimentin (reference HMLER CD24low or HMLER CD44 + / CD24-), generously offered by A. Incieux (INSERM).
  • the line referenced HMLER ID2 is a line transformed hTert, SV40, HRasV12 isogenic but not strain.
  • HMLER CD44 / 1i9 / 1 / CD24 cells olv (cancer stem cells; "Cancer stem cell”; CSCs), HMLER CD44 / ⁇ / 7CD24 / 1 "(non-CSCs) were cultured in DMEM / F12 medium. supplemented with 10% FBS, 10 ⁇ g / mL insulin, 0.5 ⁇ g / mL hydrocortisone, 10 ng / mL hEGF, and 0.5 ⁇ g / mL puromycin.
  • a mycoplasma test was performed using a PCR mycoplasma detection kit (G238, 470 Applied Biological Materials) confirming the absence of cell contamination.
  • the test compounds are doxorubicin, artesunate, and artesumycin (TC5) (see Figures 10 and 11).
  • Figure 10 shows a cytotoxic activity of artesumycin on a HMLER CD24- tumor strain cell line.
  • Artesumycin at a concentration of 1 ⁇ makes it possible to obtain a cell viability well below 50% (approximately 18%).
  • the cytotoxic activity of artesumycin is greater than that of artesunate.
  • the IC50 of artesumycin is 10OnM.
  • Figure 11 shows a cytotoxic activity of artesumycin on a HMLER ID2 cancer cell line.
  • Artesumycin at a concentration of 0.1 ⁇ makes it possible to obtain a cell viability well below 50% (approximately 44%).
  • the cytotoxic activity of artesumycin is greater than that of artesunate.
  • the IC50 of artesumycin is 98nM.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de préparation de la marmycine A et de ses analogues, de nouveaux analogues de la marmycine A, ainsi que l'utilisation en tant que marqueur d'organites et en pharmacie de ces composés, notamment en tant qu'antibiotiques, anticancéreux et antipaludiques.

Description

Procédé de préparation de la marmycine A et de ses analogues ainsi que leurs utilisations
La présente invention concerne un procédé de préparation de la marmycine A et de ses analogues, de nouveaux analogues de la marmycine A, ainsi que leurs utilisations en tant que biomarqueurs, et notamment comme marqueurs d'organites, et en pharmacie, notamment en tant qu'antibiotiques, anticancéreux et antipaludiques.
La marmycine A appartient à la famille des angucyclines, aux propriétés antibactérienne et cytotoxique. Elle est caractérisée par une structure polyaromatique, incluant un motif anthraquinone fusionné à un cycle aminopyranose par une liaison C- glycoside ainsi qu'une liaison N-glycoside sur ce même groupement osidique. La marmycine A possède donc une structure hexacyclique unique.
Cette molécule naturelle a été isolée pour la première fois par Fenical et al. (W. Fenical, J. Nat. Prod. 2007, 70, 1406-1409) à partir de cultures d'un actinomycète issu de sédiments marins du genre Streptomyces. Ce produit naturel n'est donc que très peu disponible dans la nature et n'est actuellement plus disponible commercialement. De plus, la synthèse totale de cette molécule, qui permettrait son développement pharmaceutique, n'a pas encore été réalisée jusqu'à ce jour.
Il existe donc un besoin pour un procédé de préparation de la marmycine A et de ses analogues, y compris pour de nouveaux analogues de la marmycine A.
La présente invention a pour but de fournir un procédé de préparation par synthèse chimique de la marmycine A et de ses analogues. Il s'agit en particulier de fournir à partir de composés commerciaux une synthèse totale de la marmycine A et de ses analogues. La présente invention a également pour but de fournir de nouveaux analogues de la marmycine A. La présente invention a pour but de fournir des composés utiles en pharmacie, notamment dans le traitement des cancers, d'infections bactériennes et/ou du paludisme. La présente invention a également pour but de fournir des composés utiles en tant que biomarqueurs, et notamment comme marqueurs d'organites, en particulier en tant que marqueurs des lysosomes.
La présente invention concerne un procédé pour la préparation d'un composé de formule (II) :
dans laquelle R1 ; R2, R3, R4, R5, R6, Ra, Rb, Rc, Rd et Re sont indépendamment les uns des autres un atome ou un groupe d'atomes ; n représentent le nombre de radicaux Ra, Rb, Rd et Re et valent 2 ;
ledit procédé comprenant une étape de couplage B d'un composé de formule (III) :
dans laquelle les radicaux R-\ à R6 sont tels que définis pour le composé de formule (II) et Rg est un groupe réactif avec le groupement NH2 du composé de formule (IV), en particulier un groupe triflate,
avec un composé de formule (IV) :
(IV)
dans laquelle les radicaux Ra à Re et n sont tels que définis pour le composé de formule (II), ladite étape de couplage étant réalisée en présence d'un composé comprenant du cuivre.
La présente invention concerne selon une variante un procédé de préparation d'un composé de formule (II) :
dans laquelle :
- R R2, R3, R4, R5 et R6 sont indépendamment les uns des autres choisis parmi le groupe constitué de :
H, OH, halogène, C(0)OH, =0 (=0 représente un atome d'oxygène lié par une double liaison covalente et la représentation des doubles liaisons aromatiques des composés est modifiée en conséquence), (CrCio)alkyle, O(CrCi0)alkyle, OC(0)(CrCio)alkyle, (C2-Ci0)alcényle, C(O)O(Ci-Ci0)alkyle, NH2, NH(C Cio)alkyle, N[(Ci-Ci0)alkyle]2, NHC(O)(Ci-Ci0)alkyle, N(Ci-Ci0)alkyle-C(O)(Ci- Cio)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(Ci-Ci0)alkyle, C(O)N[(Ci-Ci0)alkyle]2,les oses et les groupes époxy, dans lesquels lesdits alkyles et/ou lesdits oses peuvent être substitués ; ou
Ri avec R2 et/ou R3 avec R4 et/ou R4 avec R5 et/ou R5 avec R6 forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement (C3-Ci0)cycloalkyle ou (C6-C10)aryle, lesdits groupements cycloalkyles ou aryles étant éventuellement substitués et dans lesquels au moins l'un des atomes de carbone peut éventuellement être remplacé par un hétéroatome, de préférence par un atome d'oxygène ; les radicaux Ra sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(0)(Ci-Cio)alkyle, (C2-C10)alcényle, C(O)O(CrC10)alkyle, NH2, NH(C Cio)alkyle, N[(CrC10)alkyle]2, NHC(O)(CrC10)alkyle, N(C1-C10)alkyle-C(O)(C1- Cio)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(Ci-Ci0)alkyle, C(O)N[(Ci-Ci0)alkyle]2, et les groupements réactifs permettant de former une liaison C-C glycosidique, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués ; - les radicaux Rb, Rc et Re sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrCi0)alkyle, 0(d- Cio)alkyle, OC(O)(CrCi0)alkyle, (C2-Ci0)alcényle, C(O)O(CrCi0)alkyle, NH2, NH(C Cio)alkyle N[(Ci-Ci0)alkyle]2, NHC(O)(CrCi0)alkyle, N(C Cio)alkyle- C(0)(CrCio)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(CrCi0)alkyle, et C(O)N[(Ci-Ci0)alkyle]2,dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués ;
- les radicaux Rd sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(O)(CrC10)alkyle, (C2-C10)alcényle, C(O)O(CrC10)alkyle, NH2, NH(C C10)alkyle, N[(CrC10)alkyle]2, NHC(O)(CrC10)alkyle, N(C1-C10)alkyle-C(O)(C1- C10)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(CrC10)alkyle, C(O)N[(C1-C10)alkyle]2, (CrC10)alkyle- COO", le méthoxyméthyloxygène, et les groupements réactifs permettant de former une liaison 0-C tel que AcO , dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués ;
- n représentent le nombre de radicaux Ra, Rb, Rd et Re et valent 2 ;
L'indice n des composés de l'invention souligne que les radicaux Ra, Rb, Rd et Re présents peuvent être identiques ou différents.
Plusieurs tentatives de synthèse totale de la marmycine A ont été effectuées. Cependant, la synthèse totale de ce produit naturel n'a jamais été à ce jour décrite, seule la C-3-desméthyl-marmycine A ayant été synthétisée de façon totale (N. Maugel et B.B. Snider, Organic Letters, 2009, vol.1 1 , n°21 , 4926-4929 et A. Zhang et al., J. Org. Chem. 2009, 74, 61 1 1 -61 19). Cependant, la C-3-desméthyl-marmycine A ne présente pas les mêmes difficultés de synthèse car cette dernière ne comprend pas d'amine néopentylique contrairement à la marmycine A. En effet, la C-3-desméthyl-marmycine A ne comprend pas le groupement méthyle en position 3 sur l'ose. Or, les composés comprenant des alcools ou des aminés néopentyliques tels que la marmycine A sont connus pour avoir une faible réactivité.
Les présents inventeurs ont découvert de manière totalement inattendue un nouveau procédé permettant la synthèse totale de la marmycine A et d'analogues.
En particulier et de façon surprenante, les inventeurs ont découverts que le couplage B du noyau anthraquinone avec l'aminopyranose par la formation d'une liaison C-N glycosidique pouvait être réalisé en présence de cuivre, par exemple selon le principe du couplage d'Ullmann. Cette réaction est très surprenante car le couplage de type Buchwald-Hartwig usuel pour ce type de réaction (cf. Org. Synth. 2002, 78, 23 DOI: 10.15227/orgsyn.078.0023), effectué en présence de palladium, ne permet pas d'obtenir la liaison glycosidique C-N dans le présent cas.
Le couplage B selon l'invention permet notamment d'obtenir un bon rendement, de préférence au moins 30 % en composé de formule (II) selon l'invention.
De plus, pour la formation de l'anthraquinone, les inventeurs ont réalisé un couplage A de type Diels-Alder de façon surprenante en un seul réacteur. En effet, la réaction de Diels-Alder s'effectue normalement dans plusieurs réacteurs (J. Org. Chem., 2007, 72 (16), pp 61 16-6126). Le procédé selon l'invention est donc simplifié par rapport aux réactions de Diels-Alder classiques.
En troisième étape du procédé selon l'invention, les inventeurs ont mis au point de façon inattendue une étape de cyclisation C permettant d'aboutir à une structure pentacyclique. Cette étape de cyclisation peut notamment être réalisée selon deux alternatives.
Selon une première alternative de cyclisation Ca, une liaison C-C glycosidique est formée avec cyclisation intramoléculaire. De façon surprenante, cette cyclisation est notamment possible en présence d'acide tétrafluoroborique. Cette première alternative est particulièrement adaptée à la préparation de la marmycine A et de ses analogues, en particulier les composés selon l'invention de formule (la).
Selon une seconde alternative de cyclisation Cb, une liaison O-C est formée avec cyclisation intramoléculaire. De façon surprenante, cette cyclisation est notamment possible en présence d'une base pour la préparation de l'oxamarmycine A et de ses dérivés, en particulier pour obtenir les composés selon l'invention de formule (Ib).
Une quatrième étape d'addition, permettant de former de nouveaux analogues de la marmycine A, et en particulier les composés selon l'invention de formules (laD), a également été mise au point par les inventeurs.
La présente invention a donc notamment pour avantage de permettre la synthèse totale de la marmycine A ou d'analogues, à partir de réactifs de départ disponibles commercialement. Ce procédé pouvant être mis en place à l'échelle industrielle, il permet donc d'obtenir la marmycine A et ses analogues en quantité suffisante pour leur développement pharmaceutique et leur commercialisation. Le procédé selon l'invention permet notamment d'obtenir un rendement suffisant en marmycine A ou analogues.
De nouveaux analogues, en particulier l'oxamarmycine A et ses dérivés, ont également ainsi pu être découverts. Les inventeurs ont également mis en évidence les propriétés de marquage d'organites présents notamment dans le cytosol, tels que par exemple les lysosomes, par les composés de l'invention, et ainsi les propriétés anticancéreuse, antibiotique et antipaludique des composés selon l'invention.
Les inventeurs ont découvert que les composés selon l'invention ne s'accumulaient pas dans le noyau des cellules mais dans les organites cellulaires tels que les lysosomes.
En particulier et sans vouloir être lié par une théorie, il semble que la marmycine A et ses analogues s'accumulent dans les organites tels que par exemple les lysosomes et produisent des espèces réactives de l'oxygène (également appelées ROS - Reactive Oxygen Species). Ces espèces réactives de l'oxygène induiraient la perméabilisation des organites, en particulier de la membrane lysosomale, pouvant conduire à la libération de catepsines et d'autres hydrolases dans le cytosol. Cette perméabilisation pourrait dans certains cas également conduire à la perméabilisation de la membrane externe des mitochondries. La perméabilisation des membranes de ces organites induirait alors l'apoptose des cellules (cf. Oncogene (2008) 27, 6434-6451 ).
De façon surprenante, les inventeurs ont découvert que les composés de formule (laD) présentent une activité anti-proliférative supérieure à l'activité de la marmycine A.
De façon encore plus surprenante, les inventeurs ont découvert que le greffage covalent entre la marmycine A et ses analogues et un composé hétérocyclique précurseur de radicaux libres permet d'obtenir une action anti-proliférative de type synergique des composés obtenus, en particulier des composés de formule (laD) selon l'invention. En effet, l'activité anti-proliférative de ces composés est supérieure à l'activité de la marmycine A et des composés hétérocycliques pris isolément, ainsi qu'à l'activité anti- proliférative de leur combinaison.
Ainsi la présente invention concerne des compositions pharmaceutiques comprenant des composés de l'invention, et les composés de l'invention pour leurs utilisations thérapeutiques ou comme médicament.
Ainsi la présente invention concerne une méthode de traitement thérapeutique. Ces applications sont décrites plus en détails dans les applications des composés de l'invention.
Définitions
Dans le cadre de la présente invention, le terme « (CrCi0)alkyle » désigne des radicaux hydrocarbonés aliphatiques saturés, en chaîne droite ou ramifiée, comprenant de 1 à 10 atomes de carbone, de préférence de 1 à 5 atomes de carbone. Une chaîne ramifiée signifie qu'un ou plusieurs groupes alkyles inférieurs, tels que le méthyle, l'éthyle ou le propyle, sont liés à la chaîne alkyle linéaire principale. Les groupements alkyles préférés sont le méthyle, l'éthyle, le propyle ou l'isopropyle, en particulier le méthyle. Le terme « alkyle » comprend les groupes alkyles substitués dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont substitués par un autre atome ou un groupe d'atomes.
Le terme « (CrCio)alkylène » désigne un radical (CrCi0)alkyle divalent tel que défini ci-dessus.
Le terme « (C2-C10)alcényle » désigne un groupe alkyle comprenant de 2 à 10 atomes de carbone, de préférence de 2 à 5 atomes de carbone, insaturé, c'est-à-dire comprenant au moins une double liaison carbone-carbone, et qui peut être linéaire ou ramifié. Comme exemple de groupe alcényle, on peut citer notamment l'éthényle, le propényle, le n-butényle, l'/-butényle, le 3-méthylbut-2-ényle, ou le n-pentényle. Le terme « alcényle » comprend les groupes alcényles substitués dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont substitués par un autre atome ou un groupe d'atomes.
Le terme « (C3-C10)cycloalkyle » signifie un système de cycle non aromatique mono- ou multicyclique de 3 à 10 atomes de carbone, de préférence de 5 à 6 atomes de carbone dans lequel chaque atome substituable du cycle est éventuellement substitué. A titre d'exemple de cycloalkyle monocyclique, on peut citer notamment le cyclopentyle, le cyclohexyle ou le cycloheptyle. Le terme « cycloalkyle » comprend les groupes cycloalkyles substitués dans lesquels un ou plusieurs atomes d'hydrogène sont substitués par un autre atome ou un groupe d'atomes.
Le terme « aryle » désigne un système cyclique monocyclique ou multicyclique aromatique de 6 à 10 atomes de carbone dans lequel chaque atome substituable du cycle est éventuellement substitué par un autre atome ou un groupe d'atomes. Comme exemple de groupes aryle, on peut citer notamment le phényle, le naphtalène et l'anthracène.
Le terme « (C3-C20)hétérocycle » désigne un système de cycle non aromatique, mono- ou multicyclique de 3 à 20 atomes de carbone, dans lequel chaque atome substituable du cycle est éventuellement substitué et dans lesquels au moins l'un des atomes de carbone est remplacé par un hétéroatome, de préférence par un atome d'oxygène. De préférence, l'hétérocycle est un système de cycle non aromatique multicyclique, par exemple quadricyclique, comprenant au moins une fonction peroxyde organique (-C-0-0-C).
Le terme « ose » (ou monosaccharide) désigne un monomère de glucides. Les oses possèdent au moins 3 atomes de carbone et comprennent notamment les trioses, tétroses, pentoses, hexoses, désoxy-hexoses (fucose ou rhamnose), heptoses et nonoses. Les oses préférés selon l'invention sont les hexoses tels que pyranose, allose, altrose, galactose, glucose, gulose, idose, mannose, talose, fructose, sorbose et tagatose, de préférence le pyranose. Selon un mode particulier de réalisation, on entend par « ose » les composés de formule (IV) selon l'invention.
Le terme « époxy » désigne des groupements de formule suivante :
, dans laquelle R et R' sont indépendamment l'un de l'autre choisis parmi les groupements (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(O)(CrC10)alkyle, (C2-C10)alcényle, C(0)0(Ci-Cio)alkyle, NH(CrC10)alkyle et N[(C1-C10)alkyle]2, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués.
Le terme « halogène » désigne un atome de chlore, brome, iode ou fluor.
Le terme « hétéroatome » désigne un atome choisi parmi O, N, S ou P, de préférence O ou N.
Par « groupe réactif avec un groupement NH2 du composé de formule (IV) », on entend tout groupement permettant la formation d'une liaison C-N entre le composé de formule (III) et le composé de formule (IV) selon l'invention, en particulier un groupe triflate.
Par « groupe réactif avec un groupement OH » du composé de formule (le), on entend tout groupement permettant la formation d'une liaison covalente, par exemple de type O-C, entre le composé de formule (la) et le groupement espaceur L, en particulier un groupement C(0)OH ou OH.
Le terme « groupement protecteur » désigne un groupement protégeant des groupements chimiques fonctionnels, en particulier les fonctions alcools, contre des réactions indésirables durant les réactions de synthèse. Des exemples de groupements protecteurs sont donnés dans T.W. Greene and P. G. M. Wuts, Protective Groups in Organic Synthesis, 3rd édition, John Wiley & Sons, New York (1999), et sont connus de l'homme du métier. On peut notamment citer CH3-C(0).
Par fonction ester, on entend un groupement C-C(0)-0-C. Par fonction étheroxyde, on entend un groupement C-O-C. Par fonction carbonate, on entend un groupement C-O- C(0)-0-C. Par fonction carbamate, on entend un groupement C-NH-C(0)-0-C. Procédé de préparation des composés de formule (II)
Etape de couplage B
Selon un mode de réalisation, le procédé de préparation d'un composé de formule (II) selon l'invention est caractérisé en ce que l'étape de couplage B est effectuée en présence d'un composé comprenant du cuivre, de formule Cu-X, X étant choisi parmi le groupe constitué de Cl, Br, I, S04 et OAc, de préférence de formule Cu-I.
Selon un mode de réalisation l'étape de couplage B est effectuée en présence de 5 mol% à 25 mol%, de préférence entre 10 mol% et 20 mol%, de composé comprenant du cuivre. De préférence, l'étape de couplage B est effectuée en présence de 10 mol% ou 20 mol% de Cu-X. Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée en présence de 1 à 6 eq. du composé de formule (IV) tel que défini ci-dessus, de préférence 2, 3, 4 ou 5 eq.
Selon un mode de réalisation, ledit couplage B est effectué en présence d'une base, par exemple K2C03, de préférence en présence d'un solvant, par exemple le benzène, le xylène, le toluène ou l'acétonitrile.
Selon un mode réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée en présence d'une base, par exemple de K2C03, en quantité comprise entre 1 eq. et 4 eq., de préférence 2 eq.
Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée en présence d'un solvant tel que le toluène ou l'acétonitrile, de préférence en présence de toluène.
Selon un autre mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée en présence de Cu-I en tant que catalyseur, de K2C03 en tant que base et de toluène en tant que solvant, de préférence en reflux.
Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée à une température comprise entre 75°C et 170°C, de préférence entre 130°C et 170°C, plus préférentiellement entre 140°C et 160°C. Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée à une température de 140°C, 150°C ou 160°C.
Selon un autre mode de réalisation, ladite étape de couplage B est réalisée pendant au moins 24h, de préférence entre 24h et 72h.
Selon un mode de réalisation particulier, la réaction est effectuée en présence de 20 mo% de Cu-I, 2 eq. de K2C03 et de toluène, à 160°C.
Etape de couplage A
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre l'étape de couplage A d'un composé de formule (V) :
dans laquelle Ri et R2 sont tels que définis pour la formule (II), Y étant un groupe réactif avec l'atome de carbone porteur du groupement R3 du composé de formule (VI) et Rh étant un groupement protecteur, de préférence un groupement CH3-C(0),
avec un composé de formule (VI) :
pour obtenir un composé de form
(NO
en présence d'un solvant organique de préférence de toluène ou de xylène, de préférence en présence de toluène.
Selon un mode de réalisation, Y est choisi par F, Cl, Br et I, de préférence Br. Selon un mode de réalisation, la réaction est réalisée en reflux.
Selon un mode de réalisation, ladite étape de couplage A est réalisée à une température comprise entre 80°C et 120°C.
Selon un mode de réalisation particulier, l'étape de couplage A comprend les étapes suivantes :
i) étape de couplage A telle que décrite ci-dessus ;
ii) évaporation du milieu, de préférence dans un bain à une température comprise entre 50°C et 70°C, par exemple 60 °C ;
iii) ajout d'au moins un alcool, de préférence le méthanol ou l'éthanol, de préférence le méthanol ;
iv) ajout d'une base, par exemple le carbonate de potassium et déprotection de la fonction alcool avec départ du groupement Rh ; et
v) obtention du composé de formule (ΙΙΓ) tel que défini ci-dessus. De préférence l'étape iii) est réalisée sous agitation pendant au moins 1 h. Selon un mode de réalisation, l'ensemble des étapes i) à iv) de l'étape de couplage A est effectué dans un seul réacteur (« one pot »).
Selon un mode réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape supplémentaire d'activation du composé de formule (ΙΙΓ) par substitution de l'atome d'hydrogène de l'alcool par un groupement Rg réactif avec le groupement NH2 du composé de formule (IV) selon l'invention, par exemple -S02-CF3 obtenu typiquement par réaction avec l'anhydride triflique, de formule F3C-SO2-O-SO2-CF3, pour obtenir un composé de formule (III) suivante :
Selon un mode de réalisation, cette étape supplémentaire d'activation est réalisée en présence d'une base, notamment une base aminée comme par exemple la triéthylamine, de préférence en présence de d'un solvant apolaire tel que par exemple le dichlorométhane.
Selon un mode de réalisation, ladite réaction d'activation est conduite à une température comprise entre -65°C et -85°C.
Procédé de préparation des composés de formules (la) et (Ib)
Etape de cyclisation C
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape de cyclisation C dudit composé de formule (II), pour former une structure pentacyclique.
Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est un procédé de préparation d'un composé de formule (la) suivante :
dans laquelle les radicaux Ri à R6 et Ra à Re sont tels que définis pour les composés de formule (I I), ledit procédé comprenant une étape de cyclisation Ca par glycosylation C-C d'un composé de formule (I I) tel qu'obtenu selon l'invention, par exemple en présence d'HBF4 pour former le composé de formule (la).
Selon un mode de réalisation particulier, l'étape de cyclisation Ca est réalisée en présence d'HBF4 OEt2 ou HBF4 par exemple à 50% m/m en solution aqueuse. Selon un mode particulier de réalisation, l'étape de cyclisation Ca est réalisée avec une quantité comprise entre 0,5 eq. et 5 eq d'HBF4 OEt2 et plus particulièrement 1 , 2 ou 3 eq. d'HBF4 OEt2.
Selon un autre mode de réalisation, l'étape de cyclisation Ca est réalisée en présence de 50 % à 70 % m/m en solution aqueuse d'H BF4, de préférence 60% m/m en solution aqueuse d'HBF4
Selon un mode de réalisation, la réaction est réalisée en présence d'acétonitrile, de préférence en reflux. De préférence, la réaction est conduite pendant au moins 3h, de préférence entre 4h et 24h.
Selon un mode de réalisation, l'étape de cyclisation Ca est réalisée de façon indirecte en faisant réagir un composé de formule (I I) tel que défini ci-dessus avec HBF4, puis en faisant réagir le produit de la réaction en présence d'HBF4 et d'acétonitrile, de préférence en reflux, afin d'obtenir un composé de formule (la) selon l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, l'étape de cyclisation Ca est réalisée de façon directe, en faisant réagir un composé de formule (I I) en présence d'HBF4 ou d'HCI et d'acétonitrile, de préférence en reflux.
Selon un autre mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est un procédé de préparation de composés de formule (Ib) suivante :
dans laquelle les radicaux R-\ à R6 et Ra à Re sont tels que définis pour les composés de formule (II), et comprenant une étape de cyclisation Cb par formation d'une liaison O-C d'un composé de formule (I I) tel qu'obtenu selon l'invention, en milieu basique, de préférence en présence de NaH par former le composé de formule (Ib). Selon un mode de réalisation, on utilise au moins une base pouvant déprotoner un alcool. On utilise de préférence NaH.
Selon un mode de réalisation, l'étape de cyclisation Cb est effectuée en présence de dichlorométhane. Selon un autre mode de réalisation, la réaction de cyclisation Cb est réalisée à une température comprise entre -20°C et 0°C, de préférence entre -5°C et 0°C, plus préférentiellement à 0°C.
Selon un mode particulier de réalisation, le procédé de préparation des composés de formule (la) selon l'invention comprend les étapes suivantes :
i) étape de couplage A selon l'invention,
ii) étape de couplage B selon l'invention, et
iii) étape de cyclisation Ca selon l'invention.
Selon un autre mode particulier de réalisation, le procédé de préparation des composés de formule (Ib) selon l'invention comprend les étapes suivantes :
i) étape de couplage A selon l'invention,
ii) étape de couplage B selon l'invention, et
iii) étape de cyclisation Cb selon l'invention.
Procédé de préparation des composés de formule (laD)
Etape d'addition D
Selon un mode de réalisation, le procédé selon l'invention comprend en outre une étape d'addition D.
Selon un mode de réalisation, l'étape d'addition D est choisie parmi le groupe constitué des étapes d'estérification, d'éthérification, de formation de carbonate et de formation de carbamate. Ces étapes sont connues de l'homme du métier qui peut déterminer les conditions opératoires adéquates. De préférence, l'étape d'addition D est une estérification.
Selon un mode de réalisation particulier, l'estérification est conduite à température ambiante, par exemple entre 20°C et 25°C. De préférence, l'estérification est conduite en présence d'un solvant, et par exemple dans du dichlorométhane. Selon un mode de réalisation particulier, la réaction d'estérification est conduite en présence de 4- diméthylaminopyridine et/ou de Ν,Ν'-dicyclohexylcarbodiimide. Selon un mode de réalisation, le produit de la réaction de formule (laD) est purifié à pression réduite, par exemple entre 5 mmHg et 15 mmHg, par exemple 10 mmHg. Selon un mode de réalisation particulier, le procédé selon l'invention est un procédé de préparation d'un composé de formule (laD) telle que définie ci-dessous, ledit procédé comprenant une étape d'addition D d'un composé de formule (la) :
dans laquelle les radicaux R-\ à R6, Ra à Re et n sont tels que définis selon l'invention et dans laquelle l'un au moins des radicaux Ra à Re est un groupement OH, de préférence un radical Rd ;
avec un composé de formule (le) suivante : Rx-L-Rz (le) dans laquelle,
Rx est un groupe réactif permettant de réagir avec une fonction OH, de préférence un groupe C(0)OH ou OH ;
L est un groupe d'atomes dit «groupe espaceur » ; et
Rz est un (C3-C20)hétérocycle éventuellement substitué ; ladite étape d'addition D résultant en la formation d'un composé de formule (laD) suivante :
dans laquelle les radicaux R-\ à R6 et n sont tels que définis selon l'invention et dans laquelle les radicaux Ra1 à Re1 ont les mêmes définitions que les radicaux Ra à Re définis pour la formule (la) respectivement,
parmi lesquels l'un au moins des radicaux Ra1 à Re1 , de préférence Rd1 , représente le groupe résultant de la réaction entre le groupe OH et Rx, lié de façon covalente à L-Rz. Selon un mode de réalisation, Rx est un groupement C(0)OH.
Selon un mode de réalisation, le groupe espaceur L est un (CrCio)alkylène pouvant être substitué et/ou comprendre un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et/ou une ou plusieurs fonctions ester, éther, carbonate et carbamate.
Selon un mode de réalisation, le groupe espaceur L est un (CrCio)alkylène pouvant être substitué et/ou comprendre au moins une fonction choisie parmi le groupe constitué des aminés secondaires, des aminés tertiaires, des esters, des étheroxydes, des carbonates et des carbamates, de préférence les esters. Selon un mode de réalisation particulier, le groupement espaceur L est un polyéthylene glycol.
Selon un mode de réalisation particulier, le groupe espaceur L lié au groupe résultant de la réaction entre le groupe OH et Rx est sélectionné parmi le groupe constitué de :
-0-C(0)-(Ci-Cio)alkylène-, -O-CH2-(C1-C10)alkylène-, -O-C(O)-O(C1-C10)alkylène- et -O-
C(O)-NH-(CrC10)alkyl0ne, dans lesquels les (CrC10)alkylènes peuvent être substitués et/ou comprendre un ou plusieurs hétéroatomes choisis parmi O, N et S, et/ou une ou plusieurs fonctions ester, éther, carbonate et carbamate.
Selon un mode de réalisation, le ou les éventuel(s) substituant(s) envisagé(s) pour les groupes (CrCio)alkylènes ci-dessus sont choisis parmi le groupe constitué de OH, halogène, C(0)OH, =0, (C Cio)alkyle, 0(C Cio)alkyle, OC(O)(CrCi0)alkyle, (C2- Cio)alcényle, C(O)O(CrCi0)alkyle, NH2, NH(C Cio)alkyle et N[(Ci-Ci0)alkyle]2.
Selon un mode de réalisation particulier, le groupe espaceur L lié au groupe résultant de la réaction entre le groupe OH et Rx représente un groupe -0-C(0)-(d-
C5)alkylène-C(0)0-.
Selon un mode de réalisation, Rz est un hétérocycle multicyclique fusionné éventuellement substitué, de préférence un quadricycle fusionné éventuellement substitué. Selon un mode de réalisation particulier, Rz est un hétérocycle de formule suivante, éventuellement substitué:
De préférence, Rz est l'artemisinine, de formule :
où représente la liaison au groupe espaceur L.
Selon un mode de réalisation, Rz est un (C3-C20)hétérocycle éventuellement substitué par au moins un substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, halogène, C(0)OH, =0, (Ci-Cio)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(O)(CrC10)alkyle, (C2-C10)alcényle, C(0)0(CrCio)alkyle, NH2, NH(C Cio)alkyle et N[(Ci-Ci0)alkyle]2, de préférence par au moins substituant choisi parmi =0 et les (CrCi0)alkyles tels que le méthyle.
Selon un mode de réalisation particulier, l'étape d'addition D est une étape d'estérification de la marmycine A :
avec l'artesunate de formule suiva
pour former le composé de formule (laD) suivante
Selon un mode particulier de réalisation, le procédé de préparation des composés de formule (laD) selon l'invention comprend les étapes suivantes :
i) étape de couplage A selon l'invention,
ii) étape de couplage B selon l'invention,
iii) étape de cyclisation Ca selon l'invention, et
iv) étape d'addition D selon l'invention.
Composés de formules (la), (Ib), (laD), (II), (III), (ΙΙΙ'), (IV), (V) et (VI)
Les modes de réalisation particuliers ci-dessous s'appliquent aux composés de formules (la), (Ib), (laD), (II), (III), (ΙΙΙ'), (IV), (V) et (VI) selon l'invention.
Selon une variante, lorsqu'au moins un des radicaux Ra est choisi parmi les groupements réactifs permettant de former une liaison C-C glycosidique, les radicaux Rd sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(O)(CrC10)alkyle, (C2- C10)alcényle, C(O)O(CrC10)alkyle, NH2, NH(CrC10)alkyle, N[(CrC10)alkyle]2, (C C10)alkyle-COO" et le méthoxyméthyloxygène, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués.
Selon une seconde variante, lorsqu'au moins un des radicaux Rd est choisi parmi les groupements réactifs permettant de former une liaison O-C tel que AcO, les radicaux Ra sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(O)(CrC10)alkyle, (C C10)alkenyle, C(O)O(CrC10)alkyle, NH2, NH(CrC10)alkyle et N[(CrC10)alkyle]2, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués. Selon un mode de réalisation particulier, les groupements réactifs permettant de former une liaison C-C glycosidique sont choisis parmi OH et les groupements 0(C Cio)alkyle, de préférence OH et OMe.
Les modes de réalisation ci-dessous s'entendent pour les groupements Ra à Re des composés de formules (la), (Ib), (II) et (IV), et Ra1 à Re1 lorsque ces derniers sont présents, c'est-à-dire lorsqu'il s'agit des composés de formule (laD).
Selon un mode de réalisation, Ra et Ra1 sont OH ou 0(CrC4)alkyle, par exemple méthoxy.
Selon un mode de réalisation, Rb et Rb1 sont H.
Selon un mode de réalisation, Rc et Rc1 sont un (CrC10)alkyle, de préférence un
(CrC4)alkyle. Selon un mode de réalisation, Rc et Rc1 sont un méthyle.
Selon un mode de réalisation, Rd et Rd1 sont OH ou un méthoxyméthyloxygène. Selon un mode de réalisation, Rd et Rd1 ne sont pas un groupement AcO. Selon un mode de réalisation, Rd et Rd1 ne sont pas un groupement OH.
Selon un mode de réalisation, Rb et Rb1 sont H et Rc et Rc1 sont un méthyle.
Selon un mode de réalisation, Rb est H, Rc est un méthyle et Re est un méthyle.
Selon un mode de réalisation, Rb1 est H, Rc1 est un méthyle et Re1 est un méthyle.
Selon un mode de réalisation, R1 ; R2, R5 et R6 sont H. Selon un mode de réalisation, R1 ; R5 et R6 sont H et R2 est un halogène, de préférence Cl, ou H.
Selon un mode de réalisation, R3 et R4 forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement (C6-Ci0)aryle, de préférence un phényle, éventuellement substitué;
Selon un mode réalisation, R3 et R4 forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un phényle ou un cyclohexyle substitué par au moins substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, méthyle, =0.
De préférence, ledit phényle ou cyclohexyle est substitué par un, deux ou trois substituants indépendamment choisis les uns des autres parmi OH, CH3 et =0.
Selon un mode de réalisation, lorsque R3 et R4 forment ensemble un phényle, ledit phényle n'est pas substitué par un méthyle.
Selon un mode de réalisation, les oses, les cycloalkyles et les aryles des radicaux
Ri à R6 peuvent être substitués au moins une fois par un substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(O)(CrC10)alkyle, (C2-C10)alcényle, C(O)O(CrC10)alkyle, NH2, NH(CrC10)alkyle, N[(CrC10)alkyle]2, et
les alkyles compris dans les radicaux Ra, Rb, Rc, Rd et Re et Ra1 , Rb1 , Rc1 , Rd1 et Re1 sont substitués par au moins un substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, halogène, C(0)OH, =0, O(Ci-Ci0)alkyle, OC(O)(Ci-Ci0)alkyle, (C2-Ci0)alcényle, C(0)0(Ci-Cio)alkyle, NH2, NH(Ci-Ci0)alkyle, N[(Ci-Ci0)alkyle]2.
Selon un mode de réalisation, les oses, les cycloalkyles et les aryles des radicaux Ri à R6 peuvent être substitués au moins une fois par un substituant choisi parmi le groupe constitué de CH3, OH, =0, COOH, COMe et NMe2, de préférence par Me, et les alkyles compris dans les radicaux Ra, Rb, Rc, Rd et Re et Ra1 , Rb1 , Rc1 , Rd1 et Re1 sont substitués par un au moins un substituant choisi parmi le groupe constitué de OH, =0, COOH, COMe, NMe2.
La présente invention concerne également un composé de formule (II), susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
La présente invention concerne également un composé de formule (la) susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
La présente invention concerne également un composé de formule (Ib) susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
La présente invention concerne également un composé de formule (laD) susceptible d'être obtenu par le procédé selon l'invention.
La présente invention concerne un composé de formule (II) suivante :
dans laquelle, les radicaux Ri à R6, Ra à Re et n sont tels que définis selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, Rc est un (CrCi0)alkyle, de préférence un méthyle.
Selon un mode de réalisation, l'invention concerne un composé de formule (II) telle que définie ci-dessus, à l'exception des composés pour lesquels R3 et R4 forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement phényle. La présente invention concerne un composé de formule (la) suivante :
dans laquelle, les radicaux R-\ à R6, Ra à Re et n sont tels que définis selon l'invention, à l'exception des composés pour lesquels R3 et R4 forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement phényle, et
à l'exception des composés suivants :
La présente invention concerne un composé de formule (Ib) suivante :
dans laquelle, les radicaux Ri à R6, Ra à Re et n sont tels que définis selon l'invention.
Selon un mode de réalisation, les composés de formules (la) et/ou (Ib) sont de configuration suivante :
La présente invention concerne également les composés spécifiques suivants :
Selon un mode de réalisation, lesdits composés sont de formules suivantes :
La présente invention concerne un composé de formule (laD) suivante :
dans laquelle les radicaux Ri à R6, Ra1 à Re1 et n sont tels que définis selon l'invention.
La présente invention concerne un composé de formule (laD) de formule suivante :
Selon un aspect particulier, l'invention concerne les composés synthétiques non naturels de formule (la), (Ib) ou (laD). Selon un autre aspect, l'invention concerne les composés de formules (la) et (Ib) sous forme cristalline, et plus particulièrement la marmycine A sous la forme cristalline référencée sous le numéro CCDC1015494 (Cambridge Cristallography Data Center).
La présente invention concerne également le composé synthétique non naturel spécifique suivant :
Marmycine A
Utilisations des composés de formule (la), (Ib), (laD) et (II)
La présente invention concerne également un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un cancer, d'une infection bactérienne et/ou du paludisme. La marmycine A est notamment connue comme ayant des propriétés cytotoxiques sur des lignées cancéreuses humaines du sein, de la prostate, du poumon, du colon, des ovaires et des leucémies (W. Fenical, J. Nat. Prod. 2007, 70, 1406-1409). La marmycine A et ses analogues s'accumulent dans les organites tels que les lysosomes et produisent des espèces réactives de l'oxygène (également appelées ROS - Reactive Oxygen Species) dans ces derniers. Ces espèces réactives de l'oxygène induiraient la perméabilisation de la membrane des organites. Cette perméabilisation induirait alors l'apoptose des cellules (cf. Oncogene (2008) 27, 6434-6451 ). Or, la perméabilisation de la membrane lysosomale en particulier est un processus perturbé dans les cellules cancéreuses. Les composés selon l'invention sont donc utiles notamment dans le traitement des cancers.
On entend par « cancers », des tumeurs malignes solides ou "liquides" (également appelés cancers hématologiques) et/ou leurs métastases. Par "métastase" on entend les tumeurs malignes secondaires formées par la migration de cellules cancéreuses à une autre localisation que celle de la tumeur maligne de départ. Les cancers hématologiques comprennent notamment les myélomes, les lymphomes et les leucémies.
Plus particulièrement, les composés de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) selon l'invention sont utiles dans le traitement et/ou la prévention d'un cancer choisi parmi les leucémies, un cancer du colon, des ovaires, du sein, de la prostate, de l'utérus (notamment col de l'utérus), du poumon, de la vessie, du cerveau, de l'estomac, du pancréas, du foie, de l'intestin, de la tête et du cou et de la peau, de préférence un cancer du sein, de la prostate, du poumon, du colon, des ovaires et des leucémies.
Avantageusement, un ou plusieurs composés de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) selon l'invention sont utilisés dans une méthode de traitement et/ou la prévention d'un cancer résistant, et en particulier d'un cancer présentant des cellules souches cancéreuses. Par « cancers résistants » on entend notamment les cancers résistants aux thérapies conventionnelles (comme par exemple au taxol). Il s'agit par exemple d'un traitement du cancer du sein résistant aux thérapies conventionnelles. Selon une variante, l'invention concerne un traitement d'un cancer du sein à cellules souches cancéreuses résistantes exprimant les marqueurs CD44 et sous-exprimant CD24 (CD44hi9h/CD24l0W)- Selon une variante, l'invention concerne un traitement d'un cancer à cellules cancéreuses résistantes exprimant par exemple la « Human telomerase reverse transcriptase » (hTERT). Selon une variante, l'invention concerne un traitement d'un cancer à cellules souches cancéreuses résistantes exprimant les marqueurs CD133 et/ou ALGH (CD133+ et/ou ALGH+) (par exemple un glioblastome multiforme ; « Glioblastoma multiforme (GBM)). Selon une variante, les composés (la), (Ib), (laD) ou (II) selon l'invention sont utilisés en traitement thérapeutique d'un cancer en seconde ligne de traitement (second- line treatment »). Avantageusement, un ou plusieurs composés de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) selon l'invention sont utilisés dans une méthode de traitement et/ou la prévention d'un cancer présentant des cellules souches cancéreuses.
Le tableau suivant illustre des types de tumeurs malignes solides et de façon non exhaustive, des marqueurs de surface cellulaire de leurs cellules souches cancéreuses (Laurie E Ailles and Irving L Weissman, Cancer stem cells in solid tumors. Current Opinion in Biotechnology 2007, 18:460-466 ; Tirino V, Desiderio V, Paino F, De Rosa A, Papaccio F, La Noce M, Laino L, De Francesco F, Papaccio G. Cancer stem cells in solid tumors: an overview and new approaches for their isolation and characterization. FASEB J. 2013 Jan;27(1): 13-24) :
Type de tumeur Phénotype de surface CSC
Cancer du sein/
CD44+CD24- |0W
Breast cancer
Glioblastome/
CD133+
Glioblastoma
Mélanome/
CD20+
Melanoma
Cancer de la prostate/
CD447a231 hi/CD133+
Prostate cancer
Cancer ovarien/
CD44+
Ovarian cancer
Cancer gastrique/
CD44+
Gastric cancer
Pancreatic cancer/
CD44+ EpCAIVT CD24+
Cancer du pancréas
Cancer du poumon/
CD133+'
Lung cancer
CD133+
Cancer du colon
CD44+ EpCAIVT CD166+
Cancer colorectal héréditaire
sans polypose/ CD44+
HNSCC Osteosarcome/
CD133+, CD1 17+ , Stro-1 +
Osteosarcoma
Chondrosarcome/
CD133+
Chondrosarcoma
Sarcome Synovial /
CD133+
Synovial sarcoma
Sarcome d'Ewing/
CD133+
Ewing's sarcoma
Rhabdomyosarcome/
CD133+
Rhabdomyosarcoma
Myélome multiple/
CD138"
Multiple myeloma
Selon une variante, l'invention concerne un traitement d'une tumeur du système hématopoïétique présentant des cellules souches cancéreuses exprimant les marqueurs CD34 et sous-exprimant CD38 (CD347CD38 ).
On entend par « infections bactériennes » les pathologies dues à la contamination de l'organisme par des bactéries.
On entend par « paludisme » ou malaria, la maladie infectieuse potentiellement mortelle due à un parasite du genre Plasmodium tels que Plasmodium falciparum, Plasmodium vivax, Plasmodium ovale, et Plasmodium malariae, propagée par la piqûre de certaines espèces de moustiques anophèles.
De préférence, les composés de formule (Ib) et (laD) sont utiles dans le traitement et/ou la prévention des cancers, d'infections bactériennes et/ou du paludisme.
De préférence, les composés de formule (la) et (laD) sont utiles dans le traitement et/ou la prévention du paludisme.
La présente invention vise également un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou
(II) telle que définie selon l'invention pour son utilisation en tant que médicament, de préférence un composé de formule (Ib) pour son utilisation en tant que médicament.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) pour la préparation d'un médicament pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un cancer, d'une infection bactérienne et/ou du paludisme.
La présente invention concerne également une méthode de traitement et/ou prévention des cancers, d'infections bactériennes et/ou du paludisme comprenant l'administration à un patient d'un moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) et/ou (II). La présente invention vise également des compositions, de préférence pharmaceutiques, comprenant au moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) et/ou (II).
La présente invention concerne donc des compositions pharmaceutiques comprenant, en tant que principe actif, au moins un composé de formule (la), (Ib) et/ou (II) selon l'invention. Ces compositions pharmaceutiques contiennent une dose efficace d'au moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) et/ou (II) selon l'invention, ou un sel pharmaceutiquement acceptable, ainsi qu'au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. Lesdits excipients sont choisis selon la forme pharmaceutique et le mode d'administration souhaité, parmi les excipients habituels qui sont connus de l'homme du métier. Les compositions pharmaceutiques peuvent contenir d'autres composés actifs.
Dans les compositions pharmaceutiques de la présente invention pour l'administration orale, sublinguale, sous-cutanée, intramusculaire, intra-veineuse, topique, locale, intratrachéale, intranasale, transdermique ou rectale, le principe actif de formule (la), (Ib), (laD) et/ou (II) tel que défini selon l'invention, ou un sel de celui-ci, peut être administré sous forme unitaire d'administration, en mélange avec des excipients pharmaceutiques classiques, aux animaux et aux êtres humains pour le traitement et/ou la prévention des maladies mentionnées ci-dessus.
Les formes unitaires d'administration appropriées comprennent les formes par voie orale telles que les comprimés, les gélules molles ou dures, les poudres, les granules et les solutions ou suspensions orales, les formes d'administration sublinguale, buccale, intratrachéale, intraoculaire, intranasale, par inhalation, les formes d'administration topique, transdermique, sous-cutanée, intramusculaire ou intraveineuse, les formes d'administration rectale et les implants. Pour l'application topique, on peut utiliser les composés selon l'invention dans des solutions, émulsions, crèmes, gels, pommades ou lotions, sans limitation particulière à cet égard.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) pour le marquage d'un organite, de préférence le lysosome.
La présente invention concerne également l'utilisation d'un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) en tant que marqueur ou biomarqueur, par exemple d'au moins un organite, de préférence le lysosome.
La présente invention concerne également un procédé de détection d'au moins un lysosome comprenant la mise en contact d'au moins une cellule, de préférence de type eucaryote, avec un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II).
La présente invention concerne également un procédé de marquage d'au moins un lysosome comprenant la mise en contact d'au moins une cellule de préférence de type eucaryote, avec un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II). Selon un mode de réalisation particulier, ledit procédé de détection comprend en outre les étapes suivantes :
- mise en contact de cellules vivantes avec au moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) ;
- détection de la présence éventuelle des composés de l'invention dans le cytosol, et plus particulièrement dans les lysosomes.
Selon une variante, le procédé de détection comprend la détection de la présence éventuelle des composés de l'invention par des moyens d'enregistrement de la fluorescence.
Selon une variante, le procédé de détection comprend la détection de la présence éventuelle des composés de l'invention par immunodétection.
Selon une variante, le procédé de détection comprend la détection des lysosomes et des composés de l'invention.
Avantageusement, l'invention concerne une méthode d'évaluation de la prolifération cellulaire mettant en œuvre un procédé de détection selon l'invention.
L'invention concerne également un kit de marquage biologique comprenant au moins un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (I I). Avantageusement ce kit comprend également au moins un composé détectable par imagerie, comme par exemple un composé fluorophore ou au moins un anticorps.
Description des figures
Les figures 1 , 2 et 3 montrent l'activité cytotoxique de la marmycine A et de la doxorubicine (agent intercalant utilisé dans le traitement du cancer).
La figure 1 montre le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de la concentration en μΜ de la marmycine A (trait plein) ou de la doxorubicine (trait en pointillés) des cellules U20S (lignée cancéreuse ostéosarcome).
La figure 2 montre le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de la concentration en μΜ de la marmycine A (trait plein) ou de la doxorubicine (trait en pointillés) des cellules A2780 (lignée cancéreuse ovarienne). Les IC50 obtenus sont de 9,8 μΜ pour la marmycine A et 0,06 μΜ pour la doxorubicine.
La figure 3 montre le pourcentage de viabilité cellulaire en fonction de la concentration en μΜ du composé 33 (trait plein épais), de la doxorubicine (trait en pointillés) ou d'étoposide (trait plein fin) des cellules HT1080 (lignée de fibrosarcome).
La figure 4 représente des photographies obtenues par la fluorescence dans lesquelles : « DAPI » représente le marquage au niveau du noyau cellulaire par le DAPI (4',6'-diamidino-2-phénylindole) ; «Doxorubicin » représente le marquage de la doxorubicine au niveau du noyau cellulaire; «DAPI/Marmycin A » représente le marquage au niveau cellulaire par le DAPI et le marquage de la Marmycine A au niveau des lysosomes.
La figure 5 représente des photographies obtenues par fluorescence dans lesquelles : « Marmycin A » représente le marquage et la localisation de la Marmycine A,
« DND-22 » représente le marquage et la localisation des lysosomes ; « Merge » représente la colocalisation de la Marmycine A et des lysosomes ; « ZOOM » représente une photographie avec un grossissement sur une zone particulière de la photographie
« Merge » montrant la colocalisation de la Marmycine A et des lysosomes.
La figure 6 représente des photographies obtenues par fluorescence dans lesquelles : « DAPI » représente le marquage au niveau du noyau cellulaire par le DAPI ;
« GFP-Lamp1 » représente le marquage des lysosomes par l'anticorps anti-LAMP1 ;
« Marmycin A » représente le marquage et la localisation de la Marmycine A ;
« MERGE » représente la colocalisation de la Marmycine A et des protéines lysosomales GFP-Lamp1 au niveau des lysosomes, et de DAPI au niveau du noyau cellulaire.
La figure 7 représente une analyse par Western Blot dans laquelle « 4 ! » représente la Doxorubicine et « 1 ! » la Marmycine A.
La figure 8 représente des photographies obtenues par fluorescence dans lesquelles : « DAPI » représente le marquage au niveau du noyau cellulaire par le DAPI ; « GFP-Lamp1 » représente le marquage des lysosomes par l'anticorps anti-LAMP1 ;
« Artesumycine» représente le marquage et la localisation de l'artesumycine ;
« MERGE » représente la colocalisation de l'artesumycine et des protéines lysosomales
GFP-Lamp1 au niveau des lysosomes, et de DAPI au niveau du noyau cellulaire (échelle
10 μπι).
La figure 9 représente le pourcentage de cellules MDA-MB-231 viables après 72h de traitement avec la doxorubicine (DXR) (ronds, en pointillés fins), la marmycine A (carrés, en points), l'artesunate (ronds, en pointillés épais), l'artesumycine (ronds, trait plein) et une combinaison de marmycine A et d'artesunate (ronds, en points et tirets).
La figure 10 montre une activité cytotoxique de l'artésumycine (TC5) sur une lignée cellulaire souche cancéreuse HMLER CD24-.
La figure 1 1 montre une activité cytotoxique de l'artésumycine (TC5) sur une lignée cellulaire cancéreuse HMLER ID2. EXEMPLES
Exemple 1 : Synthèse des composés de formules (V) et (VI) selon l'invention La synthèse du diénophile 5 (composé de formule (V)) est réalisée selon le schéma 1 . Le composé 8 (fournisseur AIdrich) est protégé dans des conditions classiques sous forme de naphthalène diacétylé 9 qui est ensuite bromé en milieu acide (voir Kitani, Y.; Morita, A.; Kumamoto, T.; Ishikawa, T. Helvetica Chimica Acta 2002, 85, 1 186 Carreno, M.C. et al Chem. Eur. J. 2000, 6, 906 Shis, C; Swenton, J.S. J. Org. Chem. 1982, 47, 2825).
Schéma 1 : Préparation d'un composé de formule (V)
Le diène 15 (composé de formule (VI)) est préparé à partir du composé 10 commercialement disponible (fournisseur AIdrich) selon le schéma 2. Une première étape de bromation est d'abord réalisée. Le composé 11 est protégé en acétale 12 en présence d'éthylène glycol et d'une quantité catalytique d'acide. La réaction est réalisée à une concentration de 0,4 M en moins de 2 heures au reflux du benzène. Le composé 12 est transformé en 13 par une étape de couplage pallado-catalysée afin d'y greffer la chaîne vinylique.
La déprotection de 13 en 14 se fait en milieu acide doux pour éviter l'isomérisation de la double liaison et la formation d'une cétone α-β insaturée. L'action de bromure de méthylmagnésium en présence de chlorure de cérium à froid permet la formation du diène désiré 15 de manière racémique. Schéma 2 : Préparation d'un composé de formule (VI) :
Exemple 2 : Etape de couplage A et préparation d'un composé de formule (III) selon l'invention
Le composé 16 (composé de formule ( I II')) est préparé selon le schéma 3 suivant :
Schéma 3 : Etape de couplage A et préparation d'un composé de formule (III)
Les composés 5 et 15 sont portés au reflux du toluène pendant 16 heures, le milieu subit ensuite une évaporation lente d'environ 1 heure à l'évaporateur rotatif dans un bain à 60 °C. Le milieu est repris dans le MeOH et reste sous agitation dans le noir pendant 4 heures. 3 équivalents de carbonate de potassium sont ensuite ajoutés afin d'obtenir après traitement le produit désiré 16.
Une étape d'activation de l'alcool 16 par l'anydride triflique en présence de triéthylamine dans le dichlorométhane à basse température permet d'obtenir le composé 3 (composé de formule (III)). Exemple 3 : Synthèse de l'aminopyranose
Suivant la procédure décrite dans la littérature, (cf. Raymond N. Russell, Theresa M. Weigel, Oksoo Han, Hung-wen Liu. Carbohydrate Research, Volume 201, Issue 1, 15 June 1990, Pages 95- 114 (b)Brimacombe, J. S.; Hanna, R.; Saeed, M. S.; Tucker, L. C. N. J. Chem. Soc, Perkin Trans. 1 1982, 2583-2587.) le composé 4 est préparé à partir du L-rhamnopyranose 7 (fournisseur Alfa Aeser).
Après la protection dans des conditions standard par le benzylidène en position 2 et 3, le composé 17 subit une nouvelle protection par action du MOMCI (ou méthyle chlorométhyle éther) en position 4. L'utilisation d'une base forte sur le composé 18 permet une déprotection sélective pour former la cétone 19 en position 3. Le composé 19 réagit avec l'O-benzylhydroxylamine en présence d'acétate de sodium pour former l'intermédiaire 20. En présence de chlorure de cérium et de méthyllithium le composé 20 est sélectivement méthylé en 21 qui subit une hydrogénolyse pour obtenir le produit désiré 4, selon le schéma 4 ci-dessous.
Schéma 4 : Synthèse de l'aminopyranose
Exemple 4 : Etape de couplage B, préparation des composés de formule (II) selon l'invention
Exemple 4.1 :
Le couplage B selon l'invention a été réalisé une première fois selon le schéma 5 suivant :
Schéma 5 : Etape de couplage B
Le couplage B est réalisé en présence de K2C03 dans le toluène à reflux avec 20 mol% Cu-I, 2 éq. de K2C03, 3 éq. de 4 dans le toluène à 160 °C pendant 72 heures. Un rendement de 33% est obtenu.
Des conditions opératoires différentes ont également été testées, comme le montre le tableau 1 ci-dessous.
Tableau 1
Exemple 4.2 :
Le couplage B selon l'invention a été réalisé également selon le schéma 6 suivant.
Schéma 6 : Etape de couplage B
Un rendement de 33% est également obtenu.
Dans un tube sec avec septum ont été mélangés sous argon, le triflate 3 (34.00 mg, 0.081 mmol), le catalyseur Cul (3.08 mg, 0.016 mmol, 20% mol), et K2C03 (22.3 mg, 0.162 mmol, 2 equiv.), puis l'aminé 4 a été ajoutée (88.64 mg, 0.405 mmol, 5 equiv.) dissoute dans 4 mL de toluène sec. Puis le septum a été replacé sur le bouchon sous argon et la reaction s'est faite à 160 5C pendant 72 h. Ensuite, le milieu a été refroidi, lavé avec une solution saturée de NaHC03 (5 ml_), et extrait avec du DCM (3x5 ml_). Les couches organiques ont été séchées sur du Na2S04 et le solvant a été éliminé sous vide. Une purification par flash- chromatographie sur gel de silice (heptane/AcOEt, 8 :2) a été ensuite effectuée.
13.05 mg du composé 27 (33%, 8-(((2S,3fî,4fî,6fî)-6-methoxy-3- (methoxymethoxy)-2,4-dimethyltetrahydro-2/- -pyran-4-yl)amino)-3-methyltetraphene-7,12- dione) ont été obtenus sous forme de solide violet.
1 H RMN (300 MHz, CDCI3) δ 10.56 (s, 1 H), 8.35 (d, J = 7.5 Hz, 1 H), 8.29 - 8.17 (m, 1 H), 7.81 - 7.62 (m, 2H), 7.57 (d, J = 7.1 Hz, 1 H), 7.46 (t, J = 8.0 Hz, 1 H), 7.35 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 4.89 (q, J = 6.8 Hz, 2H), 4.63 (d, J = 3.2 Hz, 1 H), 4.31 (dq, J = 9.4, 6.2 Hz, 1 H), 3.48 (s, 3H), 3.28 (d, J = 9.4 Hz, 1 H), 3.14 (s, 3H), 2.77 (d, J = 14.7 Hz, 1 H), 1 .82 (dd, J = 14.8, 4.2 Hz, 1 H), 1 .65 (s, 3H), 1 .39 (d, J = 6.3 Hz, 3H).13C NMR (126 MHz, CDCI3) δ 187.33, 185.15, 151 .03, 138.46, 137.16, 136.42, 135.50, 134.22, 134.20, 131 .96, 128.82, 128.58, 128.45, 127.74, 123.06, 120.54, 1 15.62, 1 13.84, 99.09, 97.56, 87.49, 64.48, 56.81 , 55.75, 54.90, 38.38, 26.54, 21 .73, 18.70. HRMS (ESI-TOF) calculé pour C29H32N06 [M+H]+ 490.2224, trouvé : 490,2225.
Exemple 5 : Etape de cyclisation Ca, préparation des composés de formule (la) selon l'invention
Exemple 5.1 :
Les composés 30 et 31 sont mis en présence d'1 .5 éq de HBF4 (50% w/w en solution aqueuse) au reflux de CH3CN. Le produit de cyclisation 1 est obtenu avec un rendement de 17%.
Ainsi, en une seule étape, la cyclisation mais également la déprotection du MOM sont réalisées, afin d'obtenir le produit naturel (schéma 7).
Schéma 7 : Etape de cyclisation Ca
Plusieurs essais ont été réalisés, comme le montre le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2:
En particulier, avec 60% en mol de HBF4 au reflux de l'acétonitrile, le produit 1 est obtenu avec un rendement de 13%.
Exemple 5.2 :
Une solution du composé 27 (21 .00 mg, 0.0429 mmol) et de HBF4 (5 μΙ_, 0.0429 mmol, 1 equiv.) dans 2 mL de CH3CN a été mise sous reflux pendant 8h.
Le mélange a été ensuite refroidi, dilué dans du dichlorométhane (5 mL) et lavé avec une solution saturée de NaHC03 (3x5 mL). La phase organique a été séchée sur Na2S04 et le solvant a été évaporé sous vide. Une chromatographie préparative sur couche mince utilisant de l'heptane/AcOEt (1 :1 ) en tant qu'éluant a permis d'obtenir 2.3 mg de Marmycine A avec un rendement de 13%
La recristallisation par évaporation d'un mélange CH2CI2:Heptane a permis d'obtenir des aiguilles de cristal rouges.
1 H RMN (950 MHz, CDCI3) δ 9.59 (s, 1 H), 9.55 (d, J = 8.8 Hz, 1 H), 8.31 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 8.08 (d, J = 8.5 Hz, 1 H), 7.67 (s, 1 H), 7.60 (d, J = 7.3 Hz, 1 H), 7.57 (dd, J = 8.8, 1 .7 Hz, 1 H), 7.53 (d, J = 7.4 Hz, 1 H), 4.85 - 4.80 (m, 1 H), 3.22 (t, J = 9.4 Hz, 1 H), 3.17 (dq, J = 9.2, 6.0 Hz, 1 H), 2.56 (s, 1 H), 2.19 (ddd, J = 13.2, 3.2, 1 .2 Hz, 1 H), 1 .87 (dd, J = 13.2, 1 .8 Hz, 1 H), 1 .55 (s, 1 H), 1 .27 (d, J = 6.0 Hz, 1 H). 13C NMR (239 MHz, CDCI3) δ 186.53, 185.77, 148.75, 138.81 , 136.56, 136.47, 136.15, 134.72, 134.65, 132.21 , 128.82, 128.54, 128.31 , 127.80, 127.42, 122.34, 1 16.13, 1 1 1 .35, 79.16, 69.36, 69.33, 51 .76, 35.05, 25.03, 21 .73, 18.43. HRMS (ESI-TOF) calculé pour C26H24N04 [M+H]+ 414.1700, trouvé 414.1703. Exemple 6 : Etape de cyclisation Cb, préparation des composés de formule (Ib) selon l'invention
Des composés de formule (Ib) ont également été obtenus à partir des composés 28 et 32. En milieu basique fort, les produits 33 (oxamarmycine) et 34 sont obtenus, avec des rendements respectifs de 52% et 65%, comme montré par le schéma 8 ci- dessous.
Schéma 8 : Etape de cyclisation Cb
Une solution du composé 28 (5.00 mg, 0.01 12 mmol) dans 2ml_ de DMF sec a été refroidie à 05C et a été ajoutée à NaH (2.70 mg, 0.1 123 mmol, 10 equiv.):
après 2h à cette température, la réaction a été stoppée avec MeOH. Le solvant a été évaporé sous vide et une chromatographie préparative sur couche mince utilisant de éther de pétrole/AcOEt (8:2) en tant qu'éluant a permis d'obteni 2.54 mg d'O-Marmycine avec un rendement de 52 % (solide violet). 1 H NMR (300 MHz, CDCI3) δ 9.65 (d, J = 8.9 Hz, 1 H), 9.40 (s, 1 H), 8.37 (d, J = 8.6 Hz, 1 H), 8.07 (d, J = 8.7 Hz, 1 H), 7.66 (s, 1 H), 7.58 (m, 2H), 7.06 (d, J = 8.4 Hz, 1 H), 4.72 (d, J = 4.3 Hz, 1 H), 3.94 (dq, J = 12.1 , 6.1 Hz, 1 H), 3.81 (dd, J = 9.8, 1 .3 Hz, 1 H), 3.28 (s, 3H), 2.55 (s, 3H), 2.28 (d, J = 14.8 Hz, 1 H), 2.06 (dd, J = 14.6, 4.7 Hz, 1 H), 1 .38 (s, 3H), 1 .31 (d, J = 6.2 Hz, 3H). 13C NMR (126 MHz, CDCI3) δ 186.01 , 185.61 , 145.39, 138.58, 136.73, 136.58, 135.08, 134.08, 131 .92, 129.62, 129.38, 128.90, 128.72, 127.77, 122.59, 1 19.66, 1 17.69, 1 12.88, 97.52, 79.61 , 62.13, 55.58, 48.38, 41 .89, 28.49, 21 .72, 17.45. HRMS (ESI-TOF) calculé pour C^H^NOs [M+H]+ 444.1805, trouvé 444.1826.
Exemple comparatif 7 : Couplage effectué selon la réaction de Buchwald-Hartwig Exemple 7.1 :
Le composé 22 est obtenu dans les conditions décrites dans le schéma 3 à partir de l'alcool commercialement disponible, et l'aminé 23 est également commerciale (fournisseur AIdrich). La réaction est effectuée selon le schéma suivant : Schéma 9 : Couplage effectué selon la réaction de Buchwald-Hartwig.
Différents catalyseurs, ligands et solvants ainsi que différentes bases et températures ont été testés (cf. Tableau 3). Dans le meilleur des cas, seulement 13% du produit 24 a été observé. Le reste est du produit d'hydrolyse 25 et du réactif 22 qui n'a pas réagi.
Tableau 3
a) 5% Pd, 5% L, 1.4 eq base, 1.2 eq LiCI ;
b) 10%Pd, 15% L, 2 eq. Base, 2 eq. LiCI ;
c) 5%Pd, 10%L, 2 eq. Base, 2 eq. LiCI ;
d) 5% Pd, 10% L, 1 eq base, 1 eq LiCI ;
e) 15%Pd, 15% L, 1.2 eq base ;
f) 15%Pd, 15% L, 1.2 eq base, 1.4 eq LiCI.
Exemple 7.2 :
Le couplage a également été réalisé entre le triflate 22 et l'aminopyranose 4. Le rendement a chuté à 3% et beaucoup de produit d'hydrolyse 25 a été observé (schéma 10). Schéma 10 : Couplage effectué selon la réaction de Buchwald-Hartwig.
Par conséquent, le couplage B selon l'invention permet d'obtenir un rendement d'au moins 30 % en composé de formule (II), nettement supérieur au rendement obtenu avec un couplage de type Buchwald-Hartwig.
Exemple comparatif 8 : Essai de cyclisation effectué en présence d'un acide La voie de la C-glycosylation intramoléculaire favorisée par un acide de Lewis ou de Bronsted a été testée. Une large étude a été menée en faisant varier l'acide (BF3 Et20, TMSOTf, ScOTf, InOTf, PPTS, APTS, Cp2HfCI2/AgCI04 ) sans résultats probants. Seules la déprotection du composé 27 en 28, et la formation de l'amino- anthraquinone 29 ont été été observés.
Schéma 11 : Cyclisation en présence d'un acide
Contrairement aux conditions opératoires de cyclisation Ca et Cb selon l'invention, la cyclisation en présence d'un acide n'a pas permis d'obtenir les composés souhaités.
Exemple 9 : Activité cytotoxique des composés selon l'invention Des essais de prolifération cellulaire ont été réalisés de la manière suivante pour démontrer l'activité cytotoxique des composés de l'invention : Des cellules U20S et A2780 achetées auprès de l'ATCC, ont été maintenues dans des milieux de McCoy's 5A ou RPMI 1640, respectivement, supplémentés avec 10% de sérum bovin (« fetal bovine sérum » (FBS)), et de 1 X Antibiotic-Antimycotic (tous de Gibco®) à 37 °C avec 5% de C02. La mesure de viabilité cellulaire a été mise en œuvre en étalant 2000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits. La N-Acétyl Cystéine (NAC, A9165 Sigma) ou l'inhibiteur de Pan-caspase zVAD-FMK (550377 de BD pharmingen) ont été prétraités pendant 1 heure ou 30 minutes avant le traitement avec la Marmycine A, respectivement. Le réactif « CelITiter-Blue® Reagent» (20 l/puits) a été ajouté après 24, 48, ou 72 heures de traitement, et les cellules ont été incubées pendant une heure avant la détection par fluorescence (560(20)Ex/590(10)Em) en utilisant un dispositif « Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Reader ».
Le même protocole est utilisé pour évaluer la viabilité cellulaire des cellules HT1080 en présence du composé 33 de l'exemple 6 (dénommé Oxaméthoxymarmycine ou « Oxamethoxymarmycin » en anglais), de la doxorubicine, ou d'étoposide.
Les résultats sont représentés sur les figures 1 à 3.
Sur la figure 1 , les IC50 (« IC50 » représentant la concentration inhibitrice médiane des cellules par le composé évalué) obtenues sont de 10,3 μΜ pour la marmycine A et 0,1 μΜ pour la doxorubicine, à 72 heures.
Sur la figure 2, les IC5o obtenues sont de 9,8 μΜ pour la marmycine A et 0,06 μΜ pour la doxorubicine, à 72 heures.
Sur la figure 3, les IC50 obtenues sont de 75 μΜ pour l'Oxaméthoxymarmycine, de 0,035 μΜ pour la doxorubicine, et de 0.5 μΜ pour l'étoposide, à 72 heures.
Exemple 10 : Localisation cellulaire des composés selon l'invention
Des cellules U20S cultivées avec moins de 40% de confluence ont été traitées pendant 24 heures avec 10 μΜ de composé sauf indication contraire. Le marqueur LysoTracker® Blue DND-22 (L7525, Molecular Probes®) a été ajouté 30 minutes avant fixation. GFP-Lamp1 a été transfecté de manière transitoire selon les instructions commerciales. Pour résumer, 5 mL of CelILighl® Lysosomes-GFP BacMam 2.0 (C10596, Life Technologies) ont été mélangés avec 200 μΜ de milieu de culture U20S et ajoutés à chaque puits d'une plaque de 24 puits. Après incubation toute la nuit (16 heures), les cellules ont été lavées et traitées avec la Marmycine A comme indiqué à l'exemple 9. Pour l'analyse par immunofluorescence, les cellules ont été fixées 12 minutes dans 2% de formaldehyde/PBS, perméabilisées 10 min avec 0.1 % Triton X/PBS et fixées pendant 1 h avec 5% BSA, 0.2% Tween-20/PBS (tampon fixateur ou « blocking buffer »). Des lamelles couvre-objet ont été incubées avec des anticorps anti-LAMP1 , p62, dilués à 1/100 dans le tampon fixateur toute la nuit à 4 °C. Les cellules ont été ensuite lavées 3 fois avec 0.2% Tween-20/PBS, et incubées comme décrit ci-dessus avec un anticorps secondaire conjugué Alexa 488 anti-souris « anti-mouse Alexa 488-conjugated secondary antibody » (A1 1029, Invitrogen) dilué à 1/500 dans le tampon fixateur. Les lamelles couvre-objet ont été lavées comme décrit ci-dessus et montées avec un milieu de montage VectaShield® pour analyse par fluorescence avec ou sans DAPI (Vector Laboratories Ltd). Les images obtenues ont été prises avec un microscope Leica (Zeiss) et analysées avec le logiciel ImageJ.
La figure 4 à 6 représente des photographies obtenues par fluorescence. La figure
4 illustre par la comparaison des différentes photographies que la Marmycine A n'est pas localisée au niveau du noyau cellulaire, mais à l'emplacement des lysosomes.
La figure 5 illustre la colocalisation de la Marmycine A avec les lysosomes. La Marmycine A est donc présente et s'accumule dans les lysosomes.
La figure 6 illustre également que la Marmycine A s'accumule dans les lysosomes.
Exemple 11 : Western blot
Les cellules avec le traitement indiqué selon l'exemple 10 ont été lavées deux fois dans du PBS et lysées avec un tampon Laemmli 2X. Les extraits cellulaires ont été portés à ébullition pendant cinq minutes à 100 °C et quantifiés avec le dispositif Nanodrop 2000 (Thermal Scientific). 100 μg de lysat de protéines ont été séparés avec un gel 4-20% Mini- PROTEAN® TGX Stain-Free™ (BioRad) et transférés sur membrane nitrocellulose (Amersham). Les tâches ont été détectées avec différents anticorps, tels que anti-3-actin (ab8226, Abcam), anti-p62 (610833, BD Transduction Laboratories™), anti-H2AX (PA1 - 14198, Thermal Scientific), anti-gH2AX (Ser139) (#2577, Cell Signaling), anti-p21 , anti- p53 (1 C12) (#2524, Cell Signaling), anti-p-p53, anti-LC3B (#2775, Cell Signaling), anti- BID dilués à 1/1000 dans 5% BSA, 0.1 % Tween-20/TBS. L'analyse par western Blot montre précisément que la Marmycine A (« 1 ! ») induit une réponse n'endommageant que légèrement l'ADN qui est dépendante de la caspase, ce qui est en accord avec l'absence de marquage direct du génome, alors que la Doxorubicine (« 4 ! ») engendre une réponse endommageant l'ADN (phosphorylation de H2AX sur la ser139, phosphorylation de P53, induction de P21 ). Exemple 12 : Préparation des composés de formule (laD), étape d'addition D selon l'invention
A un mélange de marmycine A (2.3 mg, 0.0055 mmol), d'artesunate (2.1 mg, 0.0056 mmol) et de 4-diméthylaminopyridine (DMAP) (0.7 mg, 0.0006 mmol, 10 mol%) dans du dichlorométhane sec (0.3 mL) est ajoutée une solution de Ν,Ν'- dicyclohexylcarbodiimide (1.1 mg, 0.0055 mmol) dans du dichlorométhane (0.2 mL) à 0° C. La solution en résultant est mélangée toute la nuit à température ambiante et ensuite concentrée jusqu'à obtenir un résidu sec.
Le produit brut est purifié par chromatographie à couches minces (heptane/AcOEt,
1 :1) pour obtenir un solide rouge dénommée artesumycine (1.8 mg, 42%).
1H NMR (500 MHz, CDCI3) δ 9.65 (s, 1H), 9.59 (d, J= 9.0 Hz, 1H), 8.39 (d, J= 8.5 Hz, 1 H), 8.11 (d, J=9.0 Hz, 1 H), 7.69 (s, 1 H), 7.63-7.56 (m, 2H), 7.50 (d, J=7.5 Hz, 1H), 5.80 (d, J= 9.5 Hz, 1H), 5.41 (s, 1H), 4.83 (s, 1H), 4.79 (d, J= 9.5 Hz, 1H), 3.44 (dq, J = 12.0, 6.0 Hz, 1H), 2.79-2.74 (m, 4H), 2.58-2.54 (m, 4H), 2.36 (td, J= 14.0, 4.0 Hz, 1H), 2.25 (dd, J= 13.0, 2.0 Hz, 1H), 2.02 (ddd, J= 7.5, 4.0, 3.0 Hz, 1H), 1.89-1.86 (m, 2H), 1.75 (dd, J= 13.5, 4.0 Hz, 2H), 1.67 (dd, J= 13.0, 3.0 Hz, 1H), 1.62-1.58 (m, 2H), 1.44- 1.41 (m, 4H), 1.42 (s, 3H), 1.35 (dd, J= 13.0, 3.0 Hz, 1H), 1.09 (d, J= 6.0 Hz, 3H), 1.95- 1.02 (m, 1H), 0.93 (d, J= 6.0 Hz, 3H), 0.86 (d, J= 7.0 Hz, 3H). 13C NMR (151 MHz, CDCI3) δ 186.6, 185.6, 172.1, 171.2, 148.6, 138.7, 136.5, 135.9, 134.9, 134.6, 132.2, 128.8, 128.6, 128.3, 127.8, 126.7, 122.5, 115.9, 111.0, 104.6, 92.3, 91.5, 80.2, 79.6, 69.3, 66.4, 51.5, 51.1, 45.2, 37.3, 36.2, 35.0, 34.1, 31.9, 29.8, 29.1, 28.9, 26.1 , 25.1 , 24.6, 22.1, 21.7, 20.3, 18.0, 12.2. HRMS (ESI-TOF) calculé pour [M+Na]+ 802.3198, trouvé à 802.3204. W +253 (c 0.015, tetrahydrofurane).
Exemple 13 : Localisation cellulaire des composés de formule (laD) selon l'invention
Des cellules U20S cultivées avec moins de 40% de confluence ont été traitées pendant 24 heures avec 10 μΜ d'artesumycine. Le marqueur LysoTracker® Blue DND-22 (L7525, Molecular Probes®) a été ajouté 30 minutes avant fixation. GFP-Lamp1 a été transfecté de manière transitoire selon les instructions commerciales. Pour résumer, 5 mL of CelILight® Lysosomes-GFP BacMam 2.0 (C10596, Life Technologies) ont été mélangés avec 200 μΜ de milieu de culture U20S et ajoutés à chaque puits d'une plaque de 24 puits. Après incubation toute la nuit (16 heures), les cellules ont été lavées et traitées avec de l'artesiimycine comme indiqué à l'exemple 9. L'analyse par immunofluorescence a été réalisée de la même façon qu'à l'exemple 10.
La figure 8 représente des photographies obtenues par fluorescence et illustre la colocalisation de l'artesumycine avec les lysosomes. L'artesumycine est donc présente et s'accumule dans les lysosomes.
Exemple 14 : Activité cytotoxique des composés de formule (laD) selon l'invention Des essais de prolifération cellulaire ont été réalisés de la même manière que présenté à l'exemple 9 pour démontrer l'activité cytotoxique des composés de formule (laD) selon l'invention.
Des cellules MDA-MB-231 (cellules cancéreuses humaines provenant du sein) achetées auprès de l'ATCC, ont été maintenues dans un milieu de McCoy's 5A, supplémenté avec 10% de sérum bovin (« fetal bovine sérum » (FBS)), et de 1 X Antibiotic-Antimycotic (tous de Gibco®) à 37 °C avec 5% de C02.
La mesure de viabilité cellulaire a été mise en œuvre en étalant 2000 cellules par puits dans une plaque de 96 puits. La N-Acétyl Cystéine (NAC, A9165 Sigma) ou l'inhibiteur de Pan-caspase zVAD-FMK (550377 de BD pharmingen) ont été prétraités pendant 1 heure ou 30 minutes avant le traitement avec les composés testés, respectivement. Le réactif « CelITiter-Blue® Reagent» (20Ml/puits) a été ajouté après 24, 48, ou 72 heures de traitement, et les cellules ont été incubées pendant une heure avant la détection par fluorescence (560(20)Ex/590(10)Em) en utilisant un dispositif « Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Reader ».
Les composés testés sont la doxorubicine, la marmycine A, l'artesunate, l'artesumycine et une combinaison de la marmycine A et de l'artesunate (cf. Figure 9).
La figure 9 montre une activité cytotoxique sur une lignée cellulaire cancéreuse de la marmycine A et de l'artesumycine. L'artesumycine à une concentration de 0,9 μηι permet d'obtenir une viabilité cellulaire inférieure à 50 %. L'activité cytotoxique de l'artesumycine est supérieure à celle de la marmycine A et également supérieure à celle de la combinaison de la marmycine A avec l'artesunate. L'IC50 de l'artesumycine est de 0,9 μΜ. L'IC50 de la combinaison artesunate avec la marmycine A est de 10 μΜ.
On observe donc un effet synergique obtenu avec l'artesumycine comparé à l'activité de la combinaison marmycine A et artesunate. Exemple 15 : Activité cytotoxique des composés de formule (laD) selon l'invention
Viabilité cellulaire: la viabilité cellulaire a été évaluée par le protocole suivant:
Etalement sur une plaque de 96 puits de 1000 cellules/puits. Les céllules ont été traitées pendant 72 heures. Après 72 heures de traitement en a ajouté le réactif CelITiter- Blue® Reagent (G8081 , Promega) et les cellules ont été incubées pendant une heure avant enregistrement des intensités de fluorescence (Excitation, 560/20 nm; Emission, 590/10 nm) en utilisant un appareillage Perkin Elmer Wallac 1420 Victor2 Microplate Reader.
Les résultats sont présentés sur les figures 10 et 1 1 avec différentes cultures cellulaires.
Culture cellulaire : le matériel suivant a été utilisé : tampon salin « Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline » (14190-094, 500 mL, Gibco), DMEM/F12 (31331 -028, 500 mL, Gibco), DMEM haut glucose avec UltraGlutamine (BE12- 604F/U1 , BioWhittaker, Lonza), milieu McCoy's 5A (Modifié) (26600-023, Gibco), RPMI 1640 avec L-glutamine (BE12-702F/U1 , BioWhittaker, Lonza), sérum bovin (« Fetal Bovine Sérum » FBS, 10270- 106, Gibco), Hydrocortisone (H0888, Sigma), Insuline (10516, Sigma or I9278, Sigma), facteur de croissance « BD Epidermal growth factor human recombinant » (hEGF, 354052, BD Biosciences), PEN-STREP (DE17-602E, BioWhittaker, Lonza), dihydrochlorure de Puromycin (A1 1 138-02, 460 Life Technologies).
La lignée cellulaire épithéliale mammaire humaine « human mammary epithelial cell line" a été infectée avec un rétrovirus portant hTERT, SV40 et l'allele oncogénétique HrasV12, dénommé cellules HMLER CD44high/CD24low, n'exprimant pas E-cadherin et Vimentin (référence HMLER CD24low ou HMLER CD44+/CD24-), offerte généreusement par A. Puisieux (INSERM).
La lignée référencée HMLER ID2 est une lignée transformée hTert, SV40, HRasV12 isogénique mais non souche.
Les cellules HMLER CD44/1i9/1/CD24,olv (cellules souches cancéreuses ; « Cancer stem cell » ; CSCs), HMLER CD44/^/7CD24/1'^ (non-CSCs) ont été cultivées dans un milieu DMEM/F12 supplémenté avec 10% de FBS, 10 μg/mL d'insuline, 0.5 μg/mL d'hydrocortisone, 10 ng/mL hEGF, et 0.5 μg/mL de puromycine.
Un test de mycoplasme a été réalisé en utilisant un kit PCR de détection de mycoplasme (G238, 470 Applied Biological Materials) confirmant l'absence de contamination des cellules. Les composés testés sont la doxorubicine, l'artésunate, et l'artésumycine (TC5) (cf. Figures 10 et 1 1 ).
La figure 10 montre une activité cytotoxique de l'artésumycine sur une lignée cellulaire souche cancéreuse HMLER CD24-. L'artésumycine à une concentration de 1 μηι permet d'obtenir une viabilité cellulaire bien inférieure à 50 % (environ 18%). L'activité cytotoxique de l'artésumycine est supérieure à celle de l'artésunate. L'IC50 de l'artésumycine est de 10OnM.
La figure 1 1 montre une activité cytotoxique de l'artésumycine sur une lignée cellulaire cancéreuse HMLER ID2. L'artésumycine à une concentration de 0,1 μηι permet d'obtenir une viabilité cellulaire bien inférieure à 50 % (environ 44%). L'activité cytotoxique de l'artésumycine est supérieure à celle de l'artésunate. L'IC50 de l'artésumycine est de 98nM.
Ces résultats illustrent l'efficacité de l'artésumycine sur des lignées cellulaires malignes humaines résistantes aux thérapies conventionnelles comme le taxol, tant souches que non souches.

Claims

REVENDICATIONS Procédé pour la préparation d'un composé de formule (II) :
dans laquelle R1 ; R2, R3, R4, R5, R6, Ra, Rb, Rc, Rd et Re sont indépendamment les uns des autres un atome ou un groupe d'atomes, n représentent le nombre de radicaux Ra, Rb, Rd et Re et valent 2 ; ledit procédé comprenant une étape de couplage B d'un composé de formule
dans laquelle les radicaux R-\ à R6 sont tels que définis pour le composé de formule (II) et Rg est un groupe réactif avec le groupement NH2 du composé de formule (IV), en particulier un groupe triflate,
avec un composé de formule (IV) :
(IV)
dans laquelle les radicaux Ra à Re et n sont tels que définis pour le composé de formule (II), ladite étape de couplage étant réalisée en présence d'un composé comprenant du cuivre.
2. Procédé selon la revendication 1 , caractérisé en ce que l'étape de couplage B est effectuée en présence d'un composé comprenant du cuivre, de formule Cu-X, X étant choisi parmi le groupe constitué de Cl, Br, I, S04 et OAc, de préférence de formule Cu-I.
3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que l'étape de couplage B est effectuée en présence de 5 mol% à 25 mol%, de préférence entre 1 0 mol% et 20 mol%, de composé comprenant du cuivre.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le couplage est effectué en présence d'une base, par exemple K2C03, de préférence en présence d'un solvant, par exemple le toluène ou l'acétonitrile.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, comprenant en outre l'étape de couplage A d'un composé de formule (V) :
dans laquelle Ri et R2 sont tels que définis à la revendication 1 , Y étant un groupe réactif avec l'atome de carbone porteur du groupement R3 du composé de formule (VI) et Rh étant un groupement protecteur, de préférence un groupement CH3- C(O),
avec un composé de formule (VI) :
pour obtenir un composé de formule (Ι Ι Γ) :
(NI') dans lesquelles les radicaux Ri à R6 sont tels que définis dans la revendication 1 , en présence de toluène ou de xylène.
Procédé de préparation d'une structure pentacyclique comprenant :
la préparation d'un composé de formule (II) selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, et
une étape de cyclisation C dudit composé de formule (II).
7. Procédé de préparation d'un composé de formule (la) suivante :
dans laquelle les radicaux Ri à R6 et Ra à Re et n sont tels que définis à la revendication 1 , ledit procédé comprenant une étape de cyclisation Ca par glycosylation C-C d'un composé de formule (II) tel qu'obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en présence d'HBF4 pour former le composé de formule (la).
8. Procédé de préparation d'un composé de formule (Ib) suivante :
dans laquelle les radicaux Ri à R6 et Ra à Re et n sont tels que définis à la revendication 1 , ledit procédé comprenant une étape de cyclisation Cb par formation d'une liaison O-C d'un composé de formule (II) tel qu'obtenu selon l'une quelconque des revendications 1 à 5, en milieu basique, de préférence en présence de NaH par former le composé de formule (Ib).
9. Procédé de préparation d'un composé de formule (laD) telle que définie ci- dessous, ledit procédé comprenant une étape d'addition D d'un composé de formule (la) :
dans laquelle les radicaux R-\ à R6, Ra à Re et n sont tels que définis à la revendication 1 et dans laquelle l'un au moins des radicaux Ra à Re est un groupement OH,
avec un composé de formule (le) suivante :
Rx-L-Rz (le) dans laquelle,
Rx est un groupe réactif permettant de réagir avec une fonction OH, de préférence un groupe C(0)OH ou OH ;
L est un groupe d'atomes dit «groupe espaceur » ; et
Rz est un (C3-C2o)hétérocycle éventuellement substitué ; ladite étape d'addition D résultant en la formation d'un composé de formule (laD) suivante :
dans laquelle les radicaux Ri à R6 et n sont tels que définis à la revendication 1 et dans laquelle les radicaux Ra1 à Re1 ont les mêmes définitions que les radicaux Ra à Re définis pour la formule (la) respectivement,
parmi lesquels l'un au moins des radicaux Ra1 à Re1 représente le groupe résultant de la réaction entre le groupe OH et Rx, lié de façon covalente à L-Rz.
10. Procédé, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, dans lequel :
Ru R2, R3, R4, R5 et R6 sont indépendamment les uns des autres choisis parmi le groupe constitué de :H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(0)(C Cio)alkyle, (C2-C10)alcényle, C(O)O(CrC10)alkyle, NH2, NH(CrC10)alkyle, N[(C Cio)alkyle]2, NHC(O)(Ci-Ci0)alkyle, N(Ci-Ci0)alkyle-C(O)(Ci-Ci0)alkyle, C(0)NH2, C(0)N(CrCio)alkyle, C(O)N[(Ci-Ci0)alkyle]2, les oses et les groupes époxy, dans lesquels lesdits alkyles et/ou lesdits oses peuvent être substitués ; ou
Ri avec R2 et/ou R3 avec R4 et/ou R4 avec R5 et/ou R5 avec R6 forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement (C3-Ci0)cycloalkyle ou (C6-Ci0)aryle, lesdits groupements cycloalkyles ou aryles étant éventuellement substitués et dans lesquels au moins l'un des atomes de carbone peut éventuellement être remplacé par un hétéroatome, de préférence par un atome d'oxygène ; les radicaux Ra sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(0)(C Cio)alkyle, (C2-C10)alcényle, C(O)O(CrC10)alkyle, NH2, NH(CrC10)alkyle, N[(C C10)alkyle]2 NHC(O)(CrC10)alkyle, N(C1-C10)alkyle-C(O)(C1-C10)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(CrC10)alkyle, C(O)N[(CrC10)alkyle]2, et les groupements réactifs permettant de former une liaison C-C glycosidique, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués
les radicaux Rb, Rc et Re sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrCi0)alkyle, O(CrCi0)alkyle, OC(0)(CrCio)alkyle, (C2-Ci0)alcényle, C(O)O(CrCi0)alkyle, NH2, NH(C Cio)alkyle, N[(C Cio)alkyle]2, NHC(O)(CrCi0)alkyle, N(Ci-Ci0)alkyle-C(O)(Ci-Ci0)alkyle, C(0)NH2, C(0)N(CrCio)alkyle, et C(O)N[(CrCi0)alkyle]2, dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués ; les radicaux Rd sont indépendamment choisis les uns des autres parmi le groupe constitué de : H, OH, halogène, C(0)OH, =0, (CrC10)alkyle, O(CrC10)alkyle, OC(0)(C C10)alkyle, (C2-C10)alcényle, C(O)O(CrC10)alkyle, NH2, NH(CrC10)alkyle, N[(C C10)alkyle]2, NHC(O)(CrC10)alkyle, N(C1-C10)alkyle-C(O)(C1-C10)alkyle, C(0)NH2, C(O)N(CrC10)alkyle, C(O)N[(C1-C10)alkyle]2, (CrC10)alkyle-COO-, le méthoxyméthyloxygène, et les groupements réactifs permettant de former une liaison 0-C tel que AcO , dans lesquels lesdits alkyles peuvent être substitués.
1 1 . Composé de formule (la) suivante
dans laquelle, les radicaux R-\ à R6 et Ra à Re et n sont tels que définis à la revendication 1 ou 9, à l'exception des composés pour lesquels R3 et R4 forment avec les atomes de carbone auxquels ils se rattachent un groupement phényle, et
à l'exception des composés suivants :
12. Composé de formule (Ib) suivante :
dans laquelle, les radicaux Ri à R6 et Ra à Re et n sont tels que définis à la revendication 1 ou 9.
13. Composé de formule (laD) suivante
dans laquelle les radicaux Ri à R6 et n sont tels que définis à la revendication 1 ou 10 et les radicaux Ra1 à Re1 sont tels que définis à la revendication 9.
15. Composition pharmaceutique comprenant un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (I I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 , 9, 1 1 , 12, 13 ou 14. 1 6. Composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 , 9, 1 1 , 1 2, 1 3 ou 14, pour son utilisation dans le traitement et/ou la prévention d'un cancer, d'une infection bactérienne et/ou du paludisme.
17. Composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (II) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 , 9, 1 1 , 1 2, 13 ou 14, pour son utilisation comme biomarqueur ou dans le marquage d'un organite cellulaire, de préférence un lysosome.
18. Composition pharmaceutique comprenant un composé de formule (la), (Ib), (laD) ou (I I) tel que défini à l'une quelconque des revendications 1 , 9, 1 1 , 1 2, 13 ou 14, pour son utilisation dans une méthode de traitement et/ou la prévention d'un cancer résistant, et en particulier un cancer présentant des cellules souches cancéreuses.
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