JP2013194044A - Ｄｎａポリメラーゼ阻害活性を有する新規化合物 - Google Patents
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Abstract
【課題】ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性および癌細胞増殖抑制活性を有する新規化合物、および該化合物を含有する医薬組成物の提供。
【解決手段】赤クラゲに寄生するカビから単離された下記の化合物、および該化合物を含有する医薬組成物。
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、Ｈ、アルキル基又は保護基を示す。）
【選択図】なし
【解決手段】赤クラゲに寄生するカビから単離された下記の化合物、および該化合物を含有する医薬組成物。
（式中、Ｒ１、Ｒ２及びＲ３は、同一又は異なって、Ｈ、アルキル基又は保護基を示す。）
【選択図】なし
Description
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する新規化合物及び該化合物を含む組成物に関する。
（ＤＮＡポリメラーゼ）
真核生物のＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、σ、ＴｄＴ（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）及びＲｅｖ１の１５種類の分子種が知られている。
これらのＤＮＡポリメラーゼは、細胞の増殖、分裂、分化等に関与している。例えば、α型はＤＮＡ複製、β型、λ型及びＴｄＴは修復と組換え、δ型及びε型は複製と修復の双方、ζ〜κ型は修復を担っている。
真核生物のＤＮＡ合成酵素（ＤＮＡポリメラーゼ）は、これまでα、β、γ、δ、ε、ζ、η、θ、ι、κ、λ、μ、σ、ＴｄＴ（ターミナル・デオキシヌクレオチジル・トランスフェラーゼ）及びＲｅｖ１の１５種類の分子種が知られている。
これらのＤＮＡポリメラーゼは、細胞の増殖、分裂、分化等に関与している。例えば、α型はＤＮＡ複製、β型、λ型及びＴｄＴは修復と組換え、δ型及びε型は複製と修復の双方、ζ〜κ型は修復を担っている。
本発明者らの１人は、ＤＮＡ複製型のＤＮＡポリメラーゼα,δ,ε阻害剤には、ヒト由来癌細胞増殖抑制活性があることを報告している（参照：非特許文献１）。
また、本発明者らの１人は、ＤＮＡ修復・組換え型のＤＮＡポリメラーゼλ阻害活性と起炎剤ＴＰＡで誘導したマウス耳抗炎症活性やＬＰＳで炎症刺激を与えたマクロファージのＴＮＦ−α産生抑制活性には正の相関があることを報告している（参照：非特許文献２）。
以上により、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する化合物は、癌、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に期待されている。
また、本発明者らの１人は、ＤＮＡ修復・組換え型のＤＮＡポリメラーゼλ阻害活性と起炎剤ＴＰＡで誘導したマウス耳抗炎症活性やＬＰＳで炎症刺激を与えたマクロファージのＴＮＦ−α産生抑制活性には正の相関があることを報告している（参照：非特許文献２）。
以上により、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する化合物は、癌、エイズ等のウイルス疾患、免疫疾患の予防・治療に期待されている。
（ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤）
ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、例えば、癌に対して癌細胞の増殖抑制活性を示し、エイズに対してＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害活性を示し、また、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制活性を示すことが知られている。
ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する糖脂質が、制癌剤、ＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤、免疫抑制剤として有用であることが報告されている（参照：特許文献１）。
現在、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤として、ジデオキシＴＴＰ(ｄｄＴＴＰ)、Ｎ-メチルマレイミド、ブチルフェニル-ｄＧＴＰなどが知られている。また植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにもＤＮＡ合成酵素阻害作用が見出されている（参照：特許文献１）。
ＤＮＡポリメラーゼの酵素活性を阻害するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、例えば、癌に対して癌細胞の増殖抑制活性を示し、エイズに対してＨＩＶ由来逆転写酵素に対する阻害活性を示し、また、免疫疾患に対して抗原に対する特異的抗体産生を抑制する免疫抑制活性を示すことが知られている。
ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する糖脂質が、制癌剤、ＨＩＶ由来逆転写酵素阻害剤、免疫抑制剤として有用であることが報告されている（参照：特許文献１）。
現在、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤として、ジデオキシＴＴＰ(ｄｄＴＴＰ)、Ｎ-メチルマレイミド、ブチルフェニル-ｄＧＴＰなどが知られている。また植物由来の糖脂質であるスルホキノボシルアシルグリセリドにもＤＮＡ合成酵素阻害作用が見出されている（参照：特許文献１）。
また、本発明者らの１人は、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤を複数開発して報告している（参照：特許文献２〜４）。
しかし、報告されたＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、本発明のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤と構造が明らかに異なる。
Y.Mizushina (2009) Biosci. Biotechnol. Biochem. 73, 1239-1251
Y.Mizushina (2011) 日本栄養・食糧学会誌. 64,377-384
本発明は、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する新規な化合物を見出すと共に、同化合物を利用した新たな医薬組成物（ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤）を提供することを解決すべき課題とした。
本発明者らは、上記課題を解決するために、C. melanaster（赤クラゲ）に寄生するカビから、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有する新規化合物｛参照：下記式（ＩＩ）、本発明者の一人が「SF226」と命名｝を単離した。
さらに、本発明者らは、該新規化合物がＤＮＡポリメラーゼ阻害活性及び癌細胞増殖抑制活性を有することを確認した。
以上により、本発明を完成した。
さらに、本発明者らは、該新規化合物がＤＮＡポリメラーゼ阻害活性及び癌細胞増殖抑制活性を有することを確認した。
以上により、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
１．以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
（式中、R1、R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル基又は保護基を示す）
２．前記化合物のR1、R2及びR3がHである前項１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
３．前項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する医薬組成物。
４．前項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤。
５．前項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗癌剤。
６．前項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を食品に配合してなる食用組成物。」
１．以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
２．前記化合物のR1、R2及びR3がHである前項１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
３．前項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する医薬組成物。
４．前項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤。
５．前項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗癌剤。
６．前項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を食品に配合してなる食用組成物。」
本発明の新規な化合物であるSF226はＤＮＡポリメラーゼ阻害活性及び癌細胞増殖抑制活性を有する。
（本発明の化合物）
本発明の化合物は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩に関する。
本発明の化合物は、下記の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩に関する。
なお、上記の式中、R1、R2及びR3は、同一又は異なって、H、アルキル基又は保護基を示す。ここで、R1、R2及びR3で示されるアルキル基としては、例えば、鎖状、分岐状又は環状の炭素数１〜１０のアルキル基が挙げられる。具体的には、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｓｅｃ−ブチル、ペンチル、シクロペンチル、ヘキシル、シクロヘキシル等の炭素数１〜６のアルキル基が例示される。
R1、R2及びR3で示される保護基としては、水酸基の保護基であれば特に限定はなく、例えば、アシル基（アセチル、プロパノイル、ベンゾイル基等）、シリル基（トリメチルシリル、トリエチルシリル、トリイソプロピルシリル、ｔｅｒｔ−ブチルジメチルシリル基等）、アルキル基（メチル、エチル、プロピル、ブチル基等）、アルケニル基（アリル、クロチル基等）、アラルキル基（ベンジル、フェネチル基等）、アルコキシメチル基（メトキシメチル基等）、スルホニル基（メタンスルホニル、ベンゼンスルホニル基等）等が挙げられる。
一般式（Ｉ）で表される化合物において、好ましくは、R1、R2及びR3がすべてHである化合物SF226｛参照：下記の式（ＩＩ）｝である。
（薬学的に許容し得る塩）
本発明における「その薬学的に許容し得る塩」の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；アンモニウム塩；１級、２級又は３級アミンの塩；４級アンモニウム塩；アミノ酸塩などが挙げられる。なお、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩は、水等の溶媒和物であってもよい。
本発明における「その薬学的に許容し得る塩」の塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩などのアルカリ金属塩；アンモニウム塩；１級、２級又は３級アミンの塩；４級アンモニウム塩；アミノ酸塩などが挙げられる。なお、一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩は、水等の溶媒和物であってもよい。
（本発明の化合物の単離・精製）
一般式（Ｉ）で表される化合物において、R1、R2及びR3がすべてHである化合物は、赤クラゲ（葛西臨海公園で採取）に寄生するカビを培養して得られる培養物から単離・精製することができる。具体的には、該カビをＰＤＢ培地（ポテトデキストロース液体培地）で静置培養し、培養液から菌体を除去して得られる濾液を溶媒で抽出する。
抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等のグリコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル，テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素等の極性有機溶媒；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の無極性有機溶媒等を用いることができるこれらの溶媒を単独で又は２種以上の混合溶媒として用いることもできる。
一般式（Ｉ）で表される化合物において、R1、R2及びR3がすべてHである化合物は、赤クラゲ（葛西臨海公園で採取）に寄生するカビを培養して得られる培養物から単離・精製することができる。具体的には、該カビをＰＤＢ培地（ポテトデキストロース液体培地）で静置培養し、培養液から菌体を除去して得られる濾液を溶媒で抽出する。
抽出溶媒としては、例えば、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール等のアルコール類、１，３−ブチレングリコール、グリセリン、プロピレングリコール等のグリコール類、酢酸エチル、酢酸ブチル等のエステル類、エチルエーテル、プロピルエーテル、イソプロピルエーテル，テトラヒドロフラン、ジオキサン等のエーテル類、塩化メチレン、クロロホルム等のハロゲン化炭化水素等の極性有機溶媒；ヘキサン、シクロヘキサン、石油エーテル等の無極性有機溶媒等を用いることができるこれらの溶媒を単独で又は２種以上の混合溶媒として用いることもできる。
上記した方法によって抽出物を得た後、メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール、クロロホルム、酢酸エチル、トルエン、ヘキサン、ベンゼン等の有機溶媒を１種又は２種以上用いた溶媒分画操作によって、得られた抽出液から活性画分を分取することができる。
更に、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することもできる。
更に、アルミナカラムクロマトグラフィーやシリカゲルクロマトグラフィー、ゲルろ過クロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水クロマトグラフィー、高速液体クロマトグラフィー等の適当な分離精製手段を１種若しくは２種以上組み合わせて精製することもできる。
さらに、単離されたSF226の水酸基を所定のアルコールを用いて公知の方法でエーテル化することにより、一般式（Ｉ）で表される化合物のうちR1、R2及び／又はR3がアルキルで示される本発明の化合物を得ることができる。
（本発明の化合物の用途）
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有することから、医薬品への利用が可能である。
例えば、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、さらには抗炎症剤等の医薬組成物として有用である。
加えて、本発明の化合物は、さらに、医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することもできる。
なお、ヒトと他の哺乳類のＤＮＡポリメラーゼの構造は殆ど同じであるため、本発明のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、ヒト以外の哺乳類由来のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤としても利用可能である。
本発明の一般式（Ｉ）で表される化合物は、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を有することから、医薬品への利用が可能である。
例えば、ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、さらには抗炎症剤等の医薬組成物として有用である。
加えて、本発明の化合物は、さらに、医薬品開発過程におけるリード化合物として利用することもできる。
なお、ヒトと他の哺乳類のＤＮＡポリメラーゼの構造は殆ど同じであるため、本発明のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤は、ヒト以外の哺乳類由来のＤＮＡポリメラーゼ阻害剤としても利用可能である。
（本発明の化合物を含む医薬組成物）
本発明の化合物を有効成分とする医薬組成物（ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、抗炎症剤等）は、単独又は自体公知の担体と共に医薬組成物となし、動物及びヒトに投与することができる。
医薬組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ、好適には非経口剤を挙げることができる。
本発明の化合物を有効成分とする医薬組成物（ＤＮＡポリメラーゼ阻害剤、抗癌剤、抗炎症剤等）は、単独又は自体公知の担体と共に医薬組成物となし、動物及びヒトに投与することができる。
医薬組成物の剤形としては特に制限されるものではなく必要に応じて適宜選択すればよいが、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、細粒剤、散剤等の経口剤、注射剤、坐剤等の非経口剤が挙げられ、好適には非経口剤を挙げることができる。
非経口剤の医薬組成物の場合には、患者の年齢、体重、疾患の程度により異なるが、通常、成人で本発明の化合物の重量として１日あたり１〜２００ｍｇの静注、点滴静注、皮下注射、筋肉注射が適当である。この非経口投与剤は常法に従って製造され、希釈剤として一般に注射用蒸留水、生理食塩水、ブドウ糖水溶液、注射用植物油、ゴマ油、ラッカセイ油、大豆油、トウモロコシ油、プロピレングリコール等を用いることができる。
（本発明の化合物を含む食用組成物）
本発明の化合物は、医薬品への利用以外に、食品への利用が可能である。例えば、飲食品へ添加・配合することにより抗癌効果、抗発癌効果、又は抗炎症効果をもった食用組成物（例えば、健康食品等）として利用することも可能である。
本発明の化合物は、医薬品への利用以外に、食品への利用が可能である。例えば、飲食品へ添加・配合することにより抗癌効果、抗発癌効果、又は抗炎症効果をもった食用組成物（例えば、健康食品等）として利用することも可能である。
（本発明の化合物の特性）
本発明者の一人は、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性、抗炎症活性及び抗発癌活性の間には互いに関連性が認められることを確認している。
したがって、本発明の化合物をリードとして、ＤＮＡポリメラーゼに対する阻害活性を調べることにより、抗癌剤又は抗炎症剤の候補化合物の効率的なスクリーニングができる。本発明は、このようなスクリーニング方法も含まれる。なお、本スクリーニング方法において、ＤＮＡポリメラーゼに対する阻害活性を調べる方法は自体公知の方法を採用することができる。
本発明者の一人は、ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性、抗炎症活性及び抗発癌活性の間には互いに関連性が認められることを確認している。
したがって、本発明の化合物をリードとして、ＤＮＡポリメラーゼに対する阻害活性を調べることにより、抗癌剤又は抗炎症剤の候補化合物の効率的なスクリーニングができる。本発明は、このようなスクリーニング方法も含まれる。なお、本スクリーニング方法において、ＤＮＡポリメラーゼに対する阻害活性を調べる方法は自体公知の方法を採用することができる。
以下、実施例を挙げて本発明を説明するが、本発明はこれら実施例により何ら限定されるものではない。
（SF226の単離、精製及び構造決定）
赤クラゲ（C. melanaster）に寄生するカビよりSF226を単離、精製した。そして、SF226の構造を決定した。詳細は、以下の通りである。
赤クラゲ（C. melanaster）に寄生するカビよりSF226を単離、精製した。そして、SF226の構造を決定した。詳細は、以下の通りである。
（１）菌株の単離
東京都葛西臨海公園にて採取した赤クラゲをPDA培地（ポテトデキストロース寒天培地）で培養し、菌株を単離した。
東京都葛西臨海公園にて採取した赤クラゲをPDA培地（ポテトデキストロース寒天培地）で培養し、菌株を単離した。
（２）SF226の精製
上記（１）で単離した菌株を1 L×4のPDB培地（ポテトデキストロース液体培地）を入れた4個の2 L三角フラスコで21日間、暗所で静置培養した。本菌株を培養した培養液はガーゼを用いて菌体を除去した。得られた濾液を塩化メチレン（CH2Cl2）で抽出し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗抽出物（384.4 mg）を得た。この粗抽出物はシリカゲルを担体とし、展開溶媒としてクロロホルム-メタノール（100: 0→0: 100）を用いたカラムクロマトグラフィーによって6つのフラクション（フラクション1〜6）に分画した。
さらに、6つのフラクションの内のフラクション 5を、シリカゲルを担体とし、展開溶媒としてトルエン-酢酸エチル（5: 1→0: 1）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、7つのフラクション（フラクション5-1〜フラクション5-7）に分画した。
最後に、フラクション5-3から茶色の粉末としてSF226を得た。
上記（１）で単離した菌株を1 L×4のPDB培地（ポテトデキストロース液体培地）を入れた4個の2 L三角フラスコで21日間、暗所で静置培養した。本菌株を培養した培養液はガーゼを用いて菌体を除去した。得られた濾液を塩化メチレン（CH2Cl2）で抽出し、ロータリーエバポレーターを用いて溶媒を留去し、粗抽出物（384.4 mg）を得た。この粗抽出物はシリカゲルを担体とし、展開溶媒としてクロロホルム-メタノール（100: 0→0: 100）を用いたカラムクロマトグラフィーによって6つのフラクション（フラクション1〜6）に分画した。
さらに、6つのフラクションの内のフラクション 5を、シリカゲルを担体とし、展開溶媒としてトルエン-酢酸エチル（5: 1→0: 1）を用いたカラムクロマトグラフィーによって、7つのフラクション（フラクション5-1〜フラクション5-7）に分画した。
最後に、フラクション5-3から茶色の粉末としてSF226を得た。
（３）SF226の構造決定
化合物SF226は、HR-ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、HMBC及びHMQCによって構造決定した。
図１には、SF226の構造並びに炭素番号を示す構造式を示した。
図２には、SF226のHMBC相関を示した。
図３には、MeODで測定したSF226の1H-NMR、13C-NMRデータを示した。
また、SF226の諸性質及びスペクトルデータ（NMRデータは除く）は次の通りである。
茶色固体状; HR ESIMS m/z 269.0425 [M+Na]+（calcdfor 269.0420）
SF226の構造決定の詳細の解析は、以下の通りである。
化合物SF226は、HR-ESIMS、1H-NMR、13C-NMR、HMBC及びHMQCによって構造決定した。
図１には、SF226の構造並びに炭素番号を示す構造式を示した。
図２には、SF226のHMBC相関を示した。
図３には、MeODで測定したSF226の1H-NMR、13C-NMRデータを示した。
また、SF226の諸性質及びスペクトルデータ（NMRデータは除く）は次の通りである。
茶色固体状; HR ESIMS m/z 269.0425 [M+Na]+（calcdfor 269.0420）
SF226の構造決定の詳細の解析は、以下の通りである。
SF226はHR-ESIMSから分子式C13H10O5を持つことが示された。C-1 （δ 172.4）の化学シフト値より、エステル基の存在が示唆された。H-5からC-1、C-3及びC-4へのHMBC相関より、メチレン基（C-5）はエステル基（C-1）と隣接し、ラクトン構造を形成していることが示唆された。H-7からC-2、C-6及びC-9へのHMBC相関、及びH-11からC-4、C-9、C-10及びC-12へのHMBC相関より、ナフタレンの部分構造を決定した。C-6 （δ 164.2）、C-10（δ 158.8）及びC-12（δ 154.3）の化学シフト値より、これらは水酸基と隣接することが示唆された。8-CH3からC-7、C-8及びC-9へのHMBC相関より、このメチル基はナフタレンの8位に結合していると決定した。
以上から、SF226を4,6,9-trihydroxy-7-methylbenzo[de]isochromen-1(3H)-one｛4,6,9-トリヒドロキシ-7-メチルベンゾ[de]イソクロメン-1(3H)-オン｝であると決定した。
以上から、SF226を4,6,9-trihydroxy-7-methylbenzo[de]isochromen-1(3H)-one｛4,6,9-トリヒドロキシ-7-メチルベンゾ[de]イソクロメン-1(3H)-オン｝であると決定した。
（ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性の確認）
上記実施例１で得られたSF226のＤＮＡポリメラーゼ群に対する阻害活性を以下の方法で測定した。なお、哺乳類のポリメラーゼ（ｐｏｌ）分子種は１５種類が存在しており、アミノ酸配列の相同性や機能の類似性からＡ−, Ｂ−, Ｘ−, Ｙ−の４つのファミリーに分類されている。各ポリメラーゼファミリーを代表してＤＮＡ複製型の子牛ｐｏｌα（Ｂ−ファミリーｐｏｌ）、ミトコンドリアＤＮＡ合成を担うヒトｐｏｌγ（Ａ−ファミリーｐｏｌ）、ＤＮＡ修復型のヒトｐｏｌκ（Ｙ−ファミリーｐｏｌ）、ＤＮＡ修復・組換え型のヒトｐｏｌλ（Ｘ−ファミリーｐｏｌ）を用いた。
上記実施例１で得られたSF226のＤＮＡポリメラーゼ群に対する阻害活性を以下の方法で測定した。なお、哺乳類のポリメラーゼ（ｐｏｌ）分子種は１５種類が存在しており、アミノ酸配列の相同性や機能の類似性からＡ−, Ｂ−, Ｘ−, Ｙ−の４つのファミリーに分類されている。各ポリメラーゼファミリーを代表してＤＮＡ複製型の子牛ｐｏｌα（Ｂ−ファミリーｐｏｌ）、ミトコンドリアＤＮＡ合成を担うヒトｐｏｌγ（Ａ−ファミリーｐｏｌ）、ＤＮＡ修復型のヒトｐｏｌκ（Ｙ−ファミリーｐｏｌ）、ＤＮＡ修復・組換え型のヒトｐｏｌλ（Ｘ−ファミリーｐｏｌ）を用いた。
（ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性の測定方法）
ＤＮＡポリメラーゼとして、哺乳類由来のＤＮＡポリメラーゼα、γ、κ、λについて試験を行った。ＤＮＡポリメラーゼαは、仔牛の胸腺から常法により抽出し、抗体カラムで精製した標品を使用した。ＤＮＡポリメラーゼγ、κ、λは、ヒト由来の該当遺伝子を、通常の遺伝子組み換え法により大腸菌に組み込み、生産させた標品を用いた。
ＤＮＡポリメラーゼとして、哺乳類由来のＤＮＡポリメラーゼα、γ、κ、λについて試験を行った。ＤＮＡポリメラーゼαは、仔牛の胸腺から常法により抽出し、抗体カラムで精製した標品を使用した。ＤＮＡポリメラーゼγ、κ、λは、ヒト由来の該当遺伝子を、通常の遺伝子組み換え法により大腸菌に組み込み、生産させた標品を用いた。
これらのＤＮＡポリメラーゼに対するSF226の阻害活性の測定には、一般的なＤＮＡポリメラーゼ反応系（日本生化学会編、新生化学実験講座２、核酸IV、東京化学同人、63〜66頁）を用いた。すなわち、放射性同位元素で標識した[3Ｈ]-ＴＴＰを含む系においてＤＮＡ合成反応を行い、鋳型ＤＮＡ [ｐｏｌｙ(ｄＡ)/ｏｌｉｇｏ(ｄＴ)18]へ重合された放射比活性を生成物（合成ＤＮＡ鎖）量の指標とするものである。
阻害率は、(a)コントロールでの合成ＤＮＡ量、(b) 被検物質存在下での合成ＤＮＡ量について、
(a -b) / a × 100 = 阻害率（％）
として評価した。なお、得られたデータは３回の測定値の平均値である。
(a -b) / a × 100 = 阻害率（％）
として評価した。なお、得られたデータは３回の測定値の平均値である。
（ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性の測定結果）
ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性の測定結果を図４に示す。図４の結果から明らかなように、１００μＭのSF226はＤＮＡポリメラーゼα、γ、κ、λのＤＮＡ合成活性を阻害した。
１００μＭで５０％以上の阻害活性を有する化合物はＤＮＡポリメラーゼ阻害剤として有効であるので、SF226はＤＮＡポリメラーゼ阻害活性があることを確認した。
以上により、本発明の化合物がＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を持つことを確認した。
ＤＮＡポリメラーゼ阻害活性の測定結果を図４に示す。図４の結果から明らかなように、１００μＭのSF226はＤＮＡポリメラーゼα、γ、κ、λのＤＮＡ合成活性を阻害した。
１００μＭで５０％以上の阻害活性を有する化合物はＤＮＡポリメラーゼ阻害剤として有効であるので、SF226はＤＮＡポリメラーゼ阻害活性があることを確認した。
以上により、本発明の化合物がＤＮＡポリメラーゼ阻害活性を持つことを確認した。
ＤＮＡポリメラーゼは、癌細胞のような細胞分裂が盛んな細胞や組織に対して酵素活性が高い。従って、SF226は抗癌剤として利用できる。
さらに、Ｙ−ファミリーのＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ修復を担っているため、癌組織に放射線や化学物質でＤＮＡに傷を生じさせながら、これらの化合物を投与することにより、癌細胞を死滅させることができる。すなわち、本発明の化合物による癌の放射線治療や化学療法への併用効果が期待できる。
さらに、Ｙ−ファミリーのＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡ修復を担っているため、癌組織に放射線や化学物質でＤＮＡに傷を生じさせながら、これらの化合物を投与することにより、癌細胞を死滅させることができる。すなわち、本発明の化合物による癌の放射線治療や化学療法への併用効果が期待できる。
（癌細胞増殖抑制活性の確認）
上記実施例１で得られたSF226の癌細胞増殖抑制活性を以下の方法で測定した。
上記実施例１で得られたSF226の癌細胞増殖抑制活性を以下の方法で測定した。
（癌細胞増殖抑制活性の測定）
本実施例に用いた細胞は、ヒト大腸癌由来ＨＣＴ１１６細胞である。培地としてはＲＰＭＩ１６４０培地｛日水製薬(株)製｝に、牛胎児血清１０％（ｖ/ｖ）を添加したものを用いた。培養は、５％ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で行った。
本実施例に用いた細胞は、ヒト大腸癌由来ＨＣＴ１１６細胞である。培地としてはＲＰＭＩ１６４０培地｛日水製薬(株)製｝に、牛胎児血清１０％（ｖ/ｖ）を添加したものを用いた。培養は、５％ＣＯ2インキュベーターにて３７℃で行った。
上記に示した培地に、１０μＭ 及び１００μＭのSF226を溶解した。ただし、SF226は水に難溶であるため、一度ＤＭＳＯ（ジメチルスルホキシド）に溶解し、そのものを上記の培地に溶かした。なお、培地中の培地内に存在するＤＭＳＯの終濃度は、すべての試験区で１％以下になっており、本実施例で用いたＨＣＴ１１６細胞の増殖の抑制にＤＭＳＯが関わる可能性は否定できる。培養は、９６穴マイクロプレートで行った。各ウェルに３．０×１０５個の細胞を植え込み、１つの試験濃度に対し５ウェルずつ与えた。またポジティブコントロールとして、培地に１％のＤＭＳＯを含むものを用いた。
SF226添加後は、５％ＣＯ2インキュベーター内、３７℃で２４時間培養し、各試験区の細胞生存率の判定を行った。生存率の判定は、文献［「RapidColorimetric Assay for Cellular Growth and Surviva1: Application toProliferation and Cytotoxicity Assays」、Tim Mosmann, J. Immunol. Methods、６５巻、５５頁（１９８３）］に記載されているＭＴＴアッセイ法を用いた。即ち、上記２４時間後テトラゾリウム塩ＭＴＴを添加し、更に４時間培養した。生細胞による還元を経て生産するホルマザン量を生細胞に比例するとみなし、５７０ｎｍの光学密度（Ｏ.Ｄ.）で定量した。
細胞生存率は次の式により算出した。
細胞生存率（％） = 試験区のＯ.Ｄ. ［５７０ ｎｍ］／ 対照区のＯ.Ｄ. ［５７０ ｎｍ］
得られた結果は５ウェルの平均である。
細胞生存率（％） = 試験区のＯ.Ｄ. ［５７０ ｎｍ］／ 対照区のＯ.Ｄ. ［５７０ ｎｍ］
得られた結果は５ウェルの平均である。
（癌細胞増殖抑制活性の測定結果）
癌細胞増殖抑制活性の測定結果を図５に示す。図５の結果から明らかなように、SF226はヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６ ｃｅｌｌｓ）の増殖を抑制した。
以上により、本発明の化合物が癌細胞増殖抑制活性を持つことを確認した。
癌細胞増殖抑制活性の測定結果を図５に示す。図５の結果から明らかなように、SF226はヒト大腸がん細胞（ＨＣＴ１１６ ｃｅｌｌｓ）の増殖を抑制した。
以上により、本発明の化合物が癌細胞増殖抑制活性を持つことを確認した。
新規なＤＮＡポリメラーゼ阻害剤及び抗癌剤を提供することができる。
Claims (6)
- 以下の一般式（Ｉ）で表される化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
- 前記化合物のR1、R2及びR3がHである請求項１に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩。
- 請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する医薬組成物。
- 請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有するＤＮＡポリメラーゼ阻害剤。
- 請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を有効成分として含有する抗癌剤。
- 請求項１又は２に記載の化合物又はその薬学的に許容し得る塩を食品に配合してなる食用組成物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2012066614A JP2013194044A (ja) | 2012-03-23 | 2012-03-23 | Ｄｎａポリメラーゼ阻害活性を有する新規化合物 |
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| JP2012066614A JP2013194044A (ja) | 2012-03-23 | 2012-03-23 | Ｄｎａポリメラーゼ阻害活性を有する新規化合物 |
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| JP2012066614A Pending JP2013194044A (ja) | 2012-03-23 | 2012-03-23 | Ｄｎａポリメラーゼ阻害活性を有する新規化合物 |
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|---|---|
| JP (1) | JP2013194044A (ja) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2018034987A1 (en) * | 2016-08-19 | 2018-02-22 | The Johns Hopkins University | Dna polymerase beta inhibitors |
-
2012
- 2012-03-23 JP JP2012066614A patent/JP2013194044A/ja active Pending
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
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| WO2018034987A1 (en) * | 2016-08-19 | 2018-02-22 | The Johns Hopkins University | Dna polymerase beta inhibitors |
| US10711027B2 (en) | 2016-08-19 | 2020-07-14 | The Johns Hopkins University | DNA polymerase beta inhibitors |
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