EP3180416A1 - Petrischale und verfahren zur mikrobiologischen untersuchung von flüssigkeiten mittels membranfiltration - Google Patents

Petrischale und verfahren zur mikrobiologischen untersuchung von flüssigkeiten mittels membranfiltration

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EP3180416A1
EP3180416A1 EP15741121.6A EP15741121A EP3180416A1 EP 3180416 A1 EP3180416 A1 EP 3180416A1 EP 15741121 A EP15741121 A EP 15741121A EP 3180416 A1 EP3180416 A1 EP 3180416A1
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EP
European Patent Office
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petri dish
shell
lid
filter
edge
Prior art date
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Pending
Application number
EP15741121.6A
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
Reiner HEDDERICH
Anne-Grit KLEES
Andreas Bubert
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Merck Patent GmbH
Original Assignee
Merck Patent GmbH
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Filing date
Publication date
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Publication of EP3180416A1 publication Critical patent/EP3180416A1/de
Pending legal-status Critical Current

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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/02—Form or structure of the vessel
    • C12M23/10—Petri dish
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
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    • C12M23/38—Caps; Covers; Plugs; Pouring means
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/46—Means for fastening
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12M—APPARATUS FOR ENZYMOLOGY OR MICROBIOLOGY; APPARATUS FOR CULTURING MICROORGANISMS FOR PRODUCING BIOMASS, FOR GROWING CELLS OR FOR OBTAINING FERMENTATION OR METABOLIC PRODUCTS, i.e. BIOREACTORS OR FERMENTERS
    • C12M23/00—Constructional details, e.g. recesses, hinges
    • C12M23/48—Holding appliances; Racks; Supports
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
    • C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor

Definitions

  • the invention relates to a Petri dish filled with medium, in which filters can be introduced in a particularly simple manner, and to a method for microbiological examination of, in particular, liquids by means of filtration and incubation of the filters in said Petri dishes.
  • Bacteria, molds and yeasts can increase the quality and shelf life of liquids such as e.g. Drinks, water or cosmetics, adversely affect. Such germs can be found in the raw materials, in the air or on surfaces during processing.
  • filters are typically used which differ from those to be investigated
  • Liquids are flowed through. After filtration, the filter is removed and placed, for example, in agar dishes on which the filter is stored in an incubator for several days at elevated temperature. Through the agar, the germs, which may have been filtered out of the liquid, receive nutrients that stimulate growth, so that the germs multiply and can be determined or counted.
  • a major difficulty of this known method is the handling of the usually extremely sensitive filters. Typically they will be with - 2 - tweezers and positioned on the medium of the Petri dish. The filter and the medium of the Petri dish may during the
  • Petri dish In general, Petri dishes are used, which have a much larger diameter than the filter to be examined. This is necessary because otherwise the filter can not be placed on the medium located far below the edge of the shell.
  • Petri dishes with a diameter of 60 mm and more are used.
  • the use of large Petri dishes means a larger one
  • Object of the present invention was therefore to simplify the handling of the filter in the task on the Petri dish and also to provide a space-saving shell as possible.
  • Diameter of the filter can be reduced. - 3 -
  • the present invention is therefore a Petri dish comprising a shell which is at least to 1 mm below the edge of the shell at most but filled to the edge of the shell with medium and a lid which closes the shell.
  • the shell is complete, i. to the edge, filled with medium.
  • the medium is an agar medium.
  • the shell and the lid are round.
  • the lid has an at least slightly larger inner diameter than the outer diameter of the shell, so that for closing the shell of the lid is slipped over the shell.
  • the lid bottom is not on the edge of the shell.
  • the lid bottom is preferably on the wall of the shell or on the lid one or more devices that cause the lid bottom does not rest directly on the edge of the shell.
  • the resting of the lid bottom is prevented by at least 3 elevations are applied to the edge of the shell, on which the lid rests.
  • brackets for example in the form of a bead or in the form of closure devices mounted on which the edge of the lid rests.
  • the subject of the present invention is also a method for
  • a liquid is filtered.
  • filter and petri dish are shaped round.
  • the inner diameter of the Petri dish is 2 to 10 mm larger than the diameter of the filter.
  • the filter has an exclusion limit between 0.2 and 0.45 ⁇ .
  • the filter preferably consists predominantly of cellulose acetate and / or cellulose nitrate.
  • Subject of the present invention is also the use of a Petri dish according to the invention for detecting germs on filters.
  • the filters are placed on the medium of the Petri dish, incubated and then evaluated the germs.
  • Figure 1 shows two possible embodiments of the shell of a Petri dish according to the invention. The lid is not shown. - 5 -
  • a petri dish is a container for holding nutrient media, including, for example, nutrient solutions or nutrient media, in particular for cultivating microorganisms, cell cultures, bacteria, etc.
  • the container comprises a shell and a lid closing the shell. At this point be on it
  • the lid can embrace the shell or engage in the shell. Consequently, the bowl and the lid are generally understood to mean parts that are more or less forming
  • the shell and the lid each comprise a preferably designed in the form of a circular surface bottom (tray bottom and lid bottom) and a projecting from the bottom, preferably annular wall
  • One of the walls, preferably the top wall, has an at least slightly larger inside diameter than the one
  • a Petri dish is typically a flat, round, mostly
  • Such a shell is commonly used in biology or chemistry. It is used for the cultivation of microorganisms, also called germs, and is used for the creation of cell cultures.
  • media are solid nutrient media or nutrient media on which nonspecifically different germs or specifically - 6 - certain germs can grow.
  • the basic composition of a medium usually consists of a major portion of water, a source of energy usable for the particular germ, for example organic compounds, and nutrients required by it (organic or inorganic carbon, nitrogen, sulfur and phosphate sources and other essential nutrients).
  • the nutrients are in the
  • Protein hydrolysates (peptones) and optionally fatty acids.
  • inorganic salts provide the germs vital ions, such as. As ammonium, potassium, sodium, phosphate, sulfate and trace elements. In addition, it can still contain:
  • Gelling agent such as agar or gelatin
  • Inhibitors for example antibiotics
  • selective agents to prevent the growth of undesirable microorganisms eg. antibiotics
  • agar-based media are preferred, i. they are media that contain agar.
  • Filters in the sense of the present invention are all filters which are used for
  • Collecting germs such as molds, yeasts or bacteria, are suitable. These may be paper filters or membrane filters e.g. be made of plastic. For example, filters made of PVDF are suitable.
  • filters based on cellulose mixed esters are filters containing at least cellulose acetate and / or cellulose nitrate.
  • the pore size of the filter depends on the size of the germs to be isolated. Typical exclusion variables are 0.2 to 0.45 pm. This means that the filters have pore sizes between 0.2 to 0.45 [im.
  • filters with diameters between 30 and 80 mm, preferably between 40 and 50 mm, are used.
  • An exemplary filter suitable for use in the process of the invention is EZ-PAK® membrane, available from Merck Millipore,
  • a Petri dish according to the invention which is filled with medium at least up to 1 mm below the edge of the shell but at most up to the edge of the shell, significantly simplifies the analysis of filters.
  • the diameter of the shell can be adapted to that of the filter.
  • the present invention now offers the possibility of using smaller Petri dishes in relation to the diameter of the filter, since placing the filter on a Petri dish filled to the edge is much simpler than placing the filter deep into the bowl.
  • the shell is filled to at least 1 mm below the edge of the shell but at the most to the edge of the shell with medium.
  • the shell is exactly to the edge, i. completely filled with medium.
  • the height of the media filling results from the wall height of the Petri dish.
  • Wall height means the wall height of the interior of the Petri dish. This deviates from the outer wall height of the shell by the thickness of the bottom of the Petri dish.
  • the inner wall height of the Petri dish should be at least 3 mm so that the height of the medium is at least 3 mm.
  • the height of the medium is between 3 and 7 mm.
  • the wall heights of 3 to 8 mm By choosing the wall height of
  • Petri dish can be influenced on the consumption of medium.
  • the medium is an agar medium. - 9 -
  • the shell and the lid are round and the lid has an at least slightly larger size
  • the tray and lid are preferably such that the lid bottom does not rest directly on the rim of the tray.
  • the edge of the shell may have at least 3 elevations on which the lid rests.
  • the lid is stable, but has the elevations a distance from the actual edge of the shell.
  • Embodiment is shown schematically in Figure 1A.
  • the illustration shows the round shell with four elevations at the top.
  • One of the four surveys is in the picture for the better
  • Have devices such as an inner or outer bead or one or more brackets on which rests the edge of the lid. If the height of the lid wall is now higher than the height of the wall of the bowl above the bead or holder, the bottom of the lid does not rest on the edge of the bowl.
  • the bead is formed as an outer circular groove into which the lid engages.
  • Figure 1 B The figure shows a section through the shell consisting of wall (2) and bottom (3). Outside the wall (2) is a bead (4), which is annular around the entire wall - 10 - runs. In the resulting recess or groove (5), the lid can engage. If the wall of the lid is now selected to be correspondingly high, the bottom of the lid does not rest on the edge of the dish.
  • outer brackets not only allow the distance between the lid bottom and shell edge but additionally cause a locking of the lid.
  • the brackets can, for example, as outwardly projecting locking lugs,
  • Such sealable Petri dishes are known, for example, from WO 2008/141597.
  • the subject of the present invention is also a method for
  • Cosmetics The most studied gas is air, e.g. in the pharmaceutical or drinks and / or food production.
  • the process is performed as follows.
  • filter and petri dish are shaped round.
  • the diameter in the interior of the Petri dish is 2 to 10 mm, preferably 1 to 8 mm larger than the diameter of the filter. In this way, a Petri dish with the smallest possible diameter can be used. For filters with a diameter of 47 mm, for example, petri dishes with a diameter of 55 mm are suitable.
  • the filter is placed in a funnel or other device for
  • the filter may be purged from the filtration device prior to removal to eliminate potential interfering effects of the original
  • the filter is typically placed on the medium of the opened Petri dish with sterile tweezers. Then the shell is closed with the lid. - 12 -
  • the Petri dish is typically placed in an incubator.
  • the incubation times are typically between 12 and 48 hours.
  • the temperatures are typically around 36 ° C.
  • the incubation times are preferably between 18 and 24
  • the plates After incubation, the plates can be removed from the incubator and evaluated. This can be done visually or with suitable equipment. Methods for the evaluation are known to the person skilled in the art.
  • Evaluation of the germ growth can be done by counting the germ colonies formed and / or by evaluating further features.
  • a count of the colonies formed on the agar For example, if 20 colonies are found on the agar, it is believed that 20 germs were filtered from the sample. Depending on the sample volume used, the number of bacteria can be determined from this
  • Calculate volume unit comprises the detection of a color change, for example due to a change in the pH or the metabolism of a chromogenic substrate.
  • the evaluation of further features can also be the isolation of one or more germs and their identification with further tests such. Mean PCR or antibody-based tests.
  • the present invention provides a substantial improvement in the determination of nuclei in liquids or gases by filtration.
  • Petri dishes the handling is significantly simplified.
  • the size of the Petri dishes can be reduced in relation to the filter.

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Abstract

Die Erfindung betrifft eine mit Medium gefüllte Petrischale, in die besonders einfach Filter eingebracht werden können sowie ein Verfahren zur mikrobiologischen Untersuchung von Flüssigkeiten oder Gasen mittels Filtration und Inkubation der Filter in besagten Petrischalen.

Description

Merck Patent Gesellschaft
mit beschränkter Haftung
64271 D a r m s t a d t
Petrischale und Verfahren zur
mikrobiologischen Untersuchung von Flüssigkeiten mittels Membranfiltration
- 1 -
Petrischale und Verfahren zur mikrobiologischen Untersuchung von Flüssigkeiten mittels Membranfiltration
Die Erfindung betrifft eine mit Medium gefüllte Petrischale, in die besonders einfach Filter eingebracht werden können sowie ein Verfahren zur mikrobiologischen Untersuchung von insbesondere Flüssigkeiten mittels Filtration und Inkubation der Filter in besagten Petrischalen.
Bakterien, Schimmel und Hefen können die Qualität und Haltbarkeit von Flüssigkeiten, wie z.B. Getränken, Wasser oder Kosmetika, negativ beeinträchtigen. Derartige Keime sind in den Rohmaterialien, in der Luft oder auch auf Oberflächen bei der Verarbeitung zu finden.
Daher wird typischerweise schon während der Produktion versucht, die Kontamination einerseits zu verhindern und andererseits mögliche
Kontaminationen durch regelmäßige Probenentnahme und Überprüfung an Schlüsselstellen aufzudecken. Ein systematisch ausgeführtes Programm von Probenentnahme und Analyse ermöglicht es dem Hersteller,
Kontaminationen an der Quelle zu entdecken und zu beheben, bevor sie sich zu einem größeren Problem entwickeln.
Zur mikrobiologischen Analyse von zu filtrierenden Flüssigkeiten werden typischerweise Filter eingesetzt, die von den zu untersuchenden
Flüssigkeiten durchströmt werden. Nach der Filtration wird der Filter entnommen und beispielsweise in Agarschalen eingelegt, auf denen der Filter in einem Brutschrank mehrere Tage bei erhöhter Temperatur lagert. Über den Agar erhalten die eventuell aus der Flüssigkeit gefilterten Keime Nährstoffe, die zum Wachstum anregen, so dass die Keime sich vermehren und bestimmt oder gezählt werden können.
Eine Hauptschwierigkeit dieses bekannten Verfahrens ist die Handhabung der zumeist extrem empfindlichen Filter. Typischerweise werden sie mit - 2 - einer Pinzette gegriffen und auf dem Medium der Petrischale positioniert. Dabei darf der Filter und das Medium der Petrischale während der
Handhabung nicht beschädigt oder deformiert werden. Ein weiteres Problem gerade für Labore, in denen eine Vielzahl von Proben parallel untersucht werden muss, ist der Platzbedarf der einzelnen
Petrischale. In der Regel werden Petrischalen verwendet, die einen wesentlich größeren Durchmesser aufweisen als der zu untersuchende Filter. Dies ist notwendig, da ansonsten der Filter nicht auf das weit unter dem Rand der Schale befindliche Medium platziert werden kann.
Beispielsweise werden für Filter mit einem Druchmesser von 47 mm
Petrischalen mit einem Durchmesser von 60 mm und mehr verwendet. Die Verwendung großer Petrischalen bedeutet einen größeren
Materialverbrauch für die Petrischale und das darin befindliche Medium und insbesondere einen größeren Platzbedarf in den Untersuchungslabors während der Inkubation der Schalen.
Aufgabe der vorliegenden Erfindung war es daher, die Handhabung der Filter bei der Aufgabe auf die Petrischale zu vereinfachen und zudem eine möglichst platzsparende Schale zur Verfügung zu stellen.
Es wurde gefunden, dass das seit Jahrzehnten bekannte und mit vielen teilweise komplizierten Vorichtungen durchgeführte Verfahren dadurch erheblich erleichtert werden kann, dass eine nahezu vollständig oder bevorzugt eine bis zum Rand mit Medium gefüllte Petrischale verwendet wird. Auf diese Weise kann der Filter ohne Behinderung durch den Rand der Petrischale auf das Medium aufgelegt und positioniert werden. Die Handhabung erfolgt schneller und mit weniger Beschädigungen des Filters oder des Mediums. Weiterhin kann dadurch Platz und Medium gespart werden, weil der Durchmesser der Petrischale bis fast auf den
Durchmesser des Filters reduziert werden kann. - 3 -
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist daher eine Petrischale umfassend eine Schale, die zumindest bis 1 mm unter den Rand der Schale höchstens aber bis zum Rand der Schale mit Medium gefüllt ist und einen Deckel, der die Schale schließt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Schale komplett, d.h. bis zum Rand, mit Medium gefüllt.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist das Medium ein Agar- Medium.
In einer anderen Ausführungsform sind die Schale und der Deckel rund.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat der Deckel einen zumindest geringfügig grösseren Innendurchmesser als der Aussendurchmesser der Schale, so dass zum Schliessen der Schale der Deckel über die Schale stülpbar ist.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform liegt der Deckelboden nicht auf dem Rand der Schale auf. Dazu befinden sich bevorzugt an der Wand der Schale oder am Deckel eine oder mehrere Vorrichtungen, die bewirken, dass der Deckelboden nicht direkt auf dem Rand der Schale aufliegt.
In einer Ausführungsform wird das Aufliegen des Deckelbodens verhindert, indem auf dem Rand der Schale mindestens 3 Erhebungen aufgebracht sind, auf denen der Deckel aufliegt.
In einer anderen Ausführungsform sind an der Wand der Schale (innen oder bevorzugt außen) Halterungen, beispielsweise in Form eines Wulstes oder in Form von Verschlußvorrichtungen angebracht, auf denen der Rand des Deckels aufliegt. - 4 -
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum
Nachweis von Keimen in Flüssigkeiten oder Gasen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte
a) Filtration der Flüssigkeit oder des Gases durch einen Filter
b) Applikation des Filters auf das Medium einer erfindungsgemäßen
Petrischale
c) Verschließen der Petrischale mit dem Deckel
d) Inkubation der Petrischale aus Schritt c)
e) Auswertung des Keim-Wachstums
In einer bevorzugten Ausführungsform wird eine Flüssigkeit filtriert.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Filter und Petrischale rund geformt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der innere Durchmesser der Petrischale 2 bis 10 mm größer als der Durchmesser des Filters.
Bevorzugt hat der Filter eine Ausschlußgrenze zwischen 0.2 und 0.45 μιη.
Bevorzugt besteht der Filter vorwiegend aus Zelluloseactetat und/oder Zellulosenitrat.
Gegenstand er vorliegenden Erfindung ist auch die Verwendung einer erfindungsgemäßen Petrischale zum Nachweis von Keimen auf Filtern.
Dazu werden die Filter auf das Medium der Petrischale aufgelegt, inkubiert und anschließend die Keime ausgewertet.
Abbildung 1 zeigt zwei mögliche Ausführungsformen der Schale einer erfindungsgemäßen Petrischale. Der Deckel ist jeweils nicht gezeigt. - 5 -
Eine Petrischale ist erfindungsgemäß ein Behältnis zur Aufnahme von Nährmedien, wobei darunter beispielsweise Nährlösungen oder Nährböden zu verstehen sind, insbesondere zur Kultivierung von Mikroorganismen, Zellkulturen, Bakterien, etc. Das Behältnis umfasst eine Schale und einen die Schale verschliessenden Deckel. An dieser Stelle sei darauf
hingewiesen, dass der Deckel die Schale umgreifen oder in die Schale eingreifen kann. Folglich sind die Schale und der Deckel ganz allgemein als Teile zu verstehen, die zur Bildung eines mehr oder weniger
abgeschlossenen Raumes ineinander greifen. Zur Vereinfachung wird fortlaufend von Schale und Deckel gesprochen.
Die Schale und der Deckel umfassen jeweils einen bevorzugt in Form einer Kreisfläche ausgebildeten Boden (Schalenboden und Deckelboden) und eine vom Boden abragende, bevorzugt kreisringförmige Wand
(Schalenwand und Deckelwand). Dabei wird die obere Kante der Wand als Rand bezeichnet. Eine der Wände, vorzugsweise die Deckelwand, hat einen zumindest geringfügig grösseren Innendurchmesser als der
Aussendurchmesser der anderen Wand, vorzugsweise der Schalenwand, so dass zum Schliessen der Schale die eine Wand über die andere (oder umgekehrt) stülpbar ist.
Eine Petrischale ist also typischerweise eine flache, runde, meist
durchsichtige Glas- oder Kunststoffschale mit bevorzugt übergreifendem Deckel. Eine solche Schale kommt üblicherweise in der Biologie oder Chemie zum Einsatz. Sie dient zur Kultivierung von Mikroorganismen, auch Keime genannt, und wird zum Anlegen von Zellkulturen genutzt.
in Bezug auf das gattungsbildende Behältnis sei lediglich beispielhaft auf die DE 44 06 725 A1 verwiesen, aus der ein Behältnis im Sinne einer Petrischale bekannt ist. Ein Deckel dient zum Verschluss des Behältnisses. Regelmässig wird der Deckel über die Schale bzw. über die Schalenwand gestülpt.
Medien im Sinne der vorliegenden Erfindung sind feste Nährmedien oder Nährböden, auf denen unspezifisch verschiedene Keime oder spezifisch - 6 - bestimmte Keime wachsen können. Die Grundzusammensetzung eines Mediums besteht meist aus einem Hauptanteil Wasser, einer für den jeweiligen Keim verwertbaren Energiequelle, beispielsweise organische Verbindungen , sowie von ihm benötigte Nährstoffe (organische oder anorganische Kohlenstoff-, Stickstoff-, Schwefel- und Phosphat-Quellen sowie andere essentielle Nährstoffe). Die Nährstoffe sind in den
Nährmedien für Heterotrophe meistens Kohlenhydrate („Zucker"),
Proteinhydrolysate (Peptone) und gegebenenfalls Fettsäuren. Zusätzlich liefern anorganische Salze den Keimen lebenswichtige Ionen, wie z. B. Ammonium, Kalium, Natrium, Phosphat, Sulfat sowie Spurenelemente. Daneben können noch enthalten sein:
- Farbstoffe bzw. deren Vorstufen (Mikroskopiefarbstoffe, chromogene Substrate)
- Geliermittel (Verfestigungsmittel), wie Agar oder Gelatine,
- Hemmstoffe (zum Beispiel Antibiotika) und selektive Agentien, um das Wachstum unerwünschter Mikroorganismen zu verhindern (z. B.
Chloramphenicol für Hefen/Schimmel-Nährböden)
- Indikatoren, um Änderungen anzuzeigen, wie z. B. beim pH-Wert, aber auch um gewisse Stoffwechselprodukte oder Stoffwechselaktivitäten anzuzeigen
- Puffersubstanzen, um den pH-Wert zu stabilisieren
- Wachstumsfaktoren, wie Hormone, Vitamine und dergleichen.
Bevorzugt sind erfindungsgemäß Medien auf Agar-Basis, d.h. es sind Medien, die Agar enthalten.
Medien für den Nachweis von Keimen sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für geeignete Medien finden sich beispielsweise in Microbiology Manual 2000, Merck KGaA, Deutschland.
Die folgende Tabelle nennt beispielhaft einige Medien und die mit ihnen nachzuweisenden Keime. - 7 -
Filter im Sinne der vorliegenden Erfindung sind alle Filter, die zum
Sammeln von Keimen, wie Schimmelpilzen, Hefen oder Bakterien, geeignet sind. Dies können Papierfilter oder Membranfilter z.B. aus Kunststoff sein. Geeignet sind beispielsweise Filter aus PVDF.
Besonders bevorzugt sind Filter auf Basis von Zellulose-Mischestern. Dies sind Filter, die zumindest Zelluloseacetat und/oder Zellulosenitrat enthalten. Die Porengröße der Filter richtet sich nach der Größe der zu isolierenden Keime. Typische Ausschlußgrößen sind 0.2 bis 0.45 pm. Das bedeutet, die Filter haben Porengrößen zwischen 0.2 bis 0.45 [im.
Typischerweise werden Filter mit Durchmessern zwischen 30 und 80 mm, bevorzugt zwischen 40 und 50 mm, verwendet.
Ein beispielhafter, für die Verwendung im erfindungsgemäßen Verfahren geeigneter Filter ist EZ-PAK ® Membrane, von Merck Millipore,
Deutschland. Dies ist ein Membran-Filter aus Basis von Zellulose-Estern mit einer Porengröße von 0.45 pm. - 8 -
Es wurde gefunden, dass eine erfindungsgemäße Petrischale, die zumindest bis 1 mm unter den Rand der Schale höchstens aber bis zum Rand der Schale mit Medium gefüllt ist, die Analyse von Filtern deutlich vereinfacht. Zum einen ist es wesentlich einfachen, die empfindlichen Filter auf das Medium der Schale zu positionieren. Zum anderen kann der Durchmesser der Schale an den des Filters angepasst werden. Gerade in Labors, in denen eine Vielzahl von Proben parallel untersucht werden muss, sollte der Platzverbrauch der einzelnen Petrischale möglichst klein sein. Die vorliegende Erfindung bietet nun die Möglichkeit, im Verhältnis zum Durchmesser des Filters kleinere Petrischalen einzusetzen, da das Auflegen des Filters auf eine bis zum Rand gefüllte Petrischale wesentlich einfacher ist als den Filter tief unten in die Schale hinein zu platzieren. Typischerweise ist die Schale bis mindestens 1 mm unter den Rand der Schale höchstens aber bis zum Rand der Schale mit Medium gefüllt.
Bevorzugt ist die Schale genau bis zum Rand, d.h. komplett mit Medium gefüllt. Die Höhe der Medienfüllung ergibt sich aus der Wandhöhe der Petrischale. Mit Wandhöhe ist dabei die Wandhöhe des Inneren der Petrischale gemeint. Diese weicht um die Dicke des Bodens der Petrischale von der äußeren Wandhöhe der Schale ab. Die innere Wandhöhe der Petrischale sollte mindestens 3 mm betragen, so dass sich eine Höhe des Mediums von mindestens 3 mm ergibt. Bevorzugt liegt die Höhe des Mediums zwischen 3 und 7 mm. Somit ergeben sich für die Petrischale bevorzugte Wandhöhen von 3 bis 8 mm. Durch die Wahl der Wandhöhe der
Petrischale kann Einfluß auf den Verbrauch an Medium genommen werden.
Bevorzugt ist das Medium ein Agar-Medium. - 9 -
In einer bevorzugten Ausführungsform sind die Schale und der Deckel rund und der Deckel hat einen zumindest geringfügig grösseren
Innendurchmesser als der Aussendurchmesser der Schale, so dass zum Schliessen der Schale der Deckel über die Schale stülpbar ist.
Um eine typischerweise gewünschte aerobe Inkubation zu ermöglichen sowie einen Kontakt zwischen Filter zund Deckel zu verhindern, sind Schale und Deckel bevorzugt so beschaffen, dass der Deckelboden nicht direkt auf dem Rand der Schale aufliegt. Dies kann auf verschiedene Weisen realisiert werden. Beispielsweise kann der Rand der Schale mindestens 3 Erhebungen aufweisen, auf denen der Deckel aufliegt.
Dadurch liegt der Deckel stabil auf, hat aber durch die Erhebungen einen Abstand zum eigentlichen Rand der Schale. Eine derartige
Ausführungsform ist in Abbildung 1A schematisch dargestellt. Die
Abbildung zeigt die runde Schale, auf deren Rand oben vier Erhebungen sind. Eine der vier Erhebungen ist in der Abbildung zum besseren
Verständnis mit der Zahl„1" markiert. Wird nun ein Deckel auf eine solche Schale aufgelegt, erzeugen die Erhebungen einen Abstand zwischen dem Deckelboden und dem Rand der Schale.
In einer weiteren Ausführungsform kann die Wand der Schale
Vorrichtungen wie einen inneren oder äußeren Wulst oder ein oder mehrere Halterungen aufweisen, auf denen der Rand des Deckels aufliegt. Ist die Höhe der Deckelwand nun höher als die Höhe der Wand der Schale über dem Wulst oder der Halterung, liegt der Boden des Deckels nicht auf dem Rand der Schale auf.
In einer Ausführungsform ist der Wulst als außenliegende kreisförmige Rille ausgebildet, in die der Deckel eingreift. Eine derartige Ausführungsform ist schematisch in Abbildung 1 B dargestellt. Die Abbildung zeigt einen Schnitt durch die Schale bestehend aus Wand (2) und Boden (3). Außen an der Wand (2) befindet sich ein Wulst (4), der ringförmig um die gesamte Wand - 10 - verläuft. In die dadurch entstehende Aussparung bzw. Rille (5) kann der Deckel eingreifen. Wird die Wand des Deckels nun entsprechend hoch gewählt, liegt der Deckelboden nicht auf dem Rand der Schale auf.
In einer anderen Ausführungsform ermöglichen außenliegende Halterungen nicht nur den Abstand zwischen Deckelboden und Schalenrand sondern bewirken zusätzlich noch eine Arretierung des Deckels. Dafür können die Halterungen beispielsweise als nach außen abragende Rastnasen,
Flansche, gewindeartige Teile, Kombinationen unterschiedlicher
Eingriffsmittel oder dergleichen ausgeführt sein. Derartige verschließbare Petrischalen sind beispielsweise bekannt aus WO 2008/141597.
Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist auch ein Verfahren zum
Nachweis von Keimen in Flüssigkeiten oder Gasen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte
a) Filtration der Flüssigkeit oder des Gases durch einen Filter b) Aufbringen des Filters auf das Medium einer
erfindungsgemäaßen Petrischale
c) Verschließen der Petrischale mit dem Deckel
d) Inkubation der verschlossenen Petrischale aus Schritt c) e) Auswertung des Keimwachstums
Das generalle Verfahren zur Untersuchung flüssiger oder gasförmiger Proben durch Filtration und anschließende Inkubation des Filters in einer Petrischale ist dem Fachmann bekannt. Flüssigkeiten sind dabei
insbesondere Wasser, Getränke, flüssige Lebensmittel oder flüssige
Kosmetikartikel. Das am meisten untersuchte Gas ist Luft, z.B. in der Pharma oder Getränke und/oder Lebensmittelproduktion.
Typischerweise wird das Verfahren wie folgt durchgeführt.
1. Bereitstellung von Filter und Petrischale - 11 -
Erfindungsgemäß wird dabei eine Pertischale bereitsgestellt, die
mindestens bis 1 mm unter den Rand, höchstens bis zum Rand mit
Medium gefüllt ist.
In einer bevorzugten Ausführungsform sind Filter und Petrischale rund geformt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Durchmesser im Inneren der Petrischale 2 bis 10 mm, bevorzugt 1 bis 8 mm größer als der Durchmesser des Filters. Auf diese Weise kann eine Petrischale mit möglichst kleinem Durchmesser verwendet werden. Für Filter mit einem Durchmesser von 47 mm sind so beispielsweise Petrischalen mit einem Durchmesser von 55 mm geeignet.
Weitere notwendige und bevorzugte Eigenschaften von Petrischale und Filter wurden bereits oben offenbart. 2. Der Filter wird in einen Trichter oder eine andere Vorrichtung zum
Filtrieren von Flüssigkeiten oder Gasen eingebracht.
Derartige Vorrichtungen sind dem Fachmann bekannt. Beispiele für
Vorrichtungen zum Filtrieren von Flüssigkeiten finden sich in
WO2008113443 und den dort zitierten Dokumenten.
Typischerweise werden zwischen 50 und 500 ml, bevorzugt zwischen 100 und 250 ml der Flüssigkeit durch den Filter gegeben. Dabei bleiben die
Keime auf dem Filter hängen.
3. Entfernen des Filters aus der Filtrationsvorrichtung.
Optional kann der Filter vor der Entnahme aus der Filtrationsvorrichtung gespült werden, um mögliche störende Einflüsse der ursprünglichen
Flüssigkeit bei dem folgenden Nachweis der Keime auszuschließen.
4. Einbringen des Filters in die Petrischale
Der Filter wird typischerweise mit einer sterilen Pinzette auf das Medium der geöffneten Petrischale gegeben. Dann wird die Schale mit dem Deckel verschlossen. - 12 -
5. Die verschlossene Petrischale wird inkubiert
Dazu wird die Petrischale typischerweise in einen Inkubator gestellt.
Inkubationszeit und Inkubationstemperatur sind für verschiedene
Keimsorten unterschiedlich. Die Inkubationszeiten betragen typischerweise zwischen 12 und 48 Stunden. Die Temperaturen liegen typischerweise um 36°C. Für E. coli/Coliforme auf einem chromogenen Coliformen Agar liegen die Inkubationszeiten beispielsweise bevorzugt zwischen 18 und 24
Stunden bei ca. 36°C. Der Fachmann ist in der Lage, die Temperatur und die Inkubationszeiten auf die jeweils nachzuweisenden Keime anzupassen.
6. Auswertung des Keimwachstums
Nach erfolgter Inkubation können die Platten aus dem Inkubator entfernt und ausgewertet werden. Dies kann visuell erfolgen oder mit geeigneten Geräten. Methoden zur Auswertung sind dem Fachmann bekannt. Die
Auswertung des Keimwachstums kann durch Zählen der gebildeten Keim- Kolonien erfolgen und/oder durch Auswertung weiterer Merkmale.
Typischerweise erfolgt eine Auszählung der gebildeten Kolonien auf dem Agar. Werden beispielsweise 20 Kolonien auf dem Agar gefunden, geht man davon aus, dass 20 Keime aus der Probe gefiltert wurden. Je nach eingesetztem Probenvolumen kann man daraus die Keimzahl pro
Volumeneinheit berechnen. Die Auswertung weiterer Merkmale umfasst die Detektion einer Farbänderung, beispielsweise aufgrund einer Änderung des pH-Wertes oder der Verstoffwechselung eines chromogenen Substrates. Die Auswertung weiterer Merkmale kann aber auch die Isolierung eines oder mehrerer Keime und deren Identifizierung mit weiteren Tests wie z.B. PCR oder Antikörper-basierten Tests bedeuten.
Somit stellt die vorliegende Erfindung eine wesentliche Verbesserung der Bestimmung von Keimen in Flüssigkeiten oder Gasen mittels Filtration zur Verfügung. Durch durch die einfache Erhöhung des Medienfüllstands der - 13 -
Petrischalen wird die Handhabung deutlich vereinfacht. Zudem kann die Größe der Petrischalen im Verhältnis zum Filter verringert werden.
Die voranstehend erörterten Ausführungsbeispiele nebst Abbildungen dienen lediglich der beispielhaften Erörterung der beanspruchten Lehre, schränkt diese jedoch nicht auf die Ausführungsbeispiele ein. Auch ohne weitere Ausführungen wird davon ausgegangen, dass ein Fachmann die obige Beschreibung im weitesten Umfang nutzen kann. Die vollständige Offenbarung aller vor- und nachstehend aufgeführten Anmeldungen, Patente und Veröffentlichungen, insbesondere der korrespondierenden Anmeldung EP 14002840.8, eingereicht am 14. August 2014, ist durch Bezugnahme in diese Anmeldung eingeführt.

Claims

- 14 - Ansprüche
1. Eine Petrischale umfassend eine Schale, die zumindest bis 1 mm unter den Rand der Schale höchstens aber bis zum Rand der Schale mit Medium gefüllt ist und einen Deckel.
2. Petrischale nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet, dass die Schale bis zum Rand mit Medium gefüllt ist.
3. Petrischale nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass das Medium Agar enthält.
4. Petrischale nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, dass die Schale und der Deckel rund sind.
5. Petrischale nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckel einen zumindest geringfügig grösseren Innendurchmesser als der Aussendurchmesser der Schale hat, so dass zum Schliessen der Schale der Deckel über die Schale stülpbar ist.
6. Petrischale nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, dass der Deckelboden nicht direkt auf dem Rand der Schale aufliegt.
7. Petrischale nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass auf dem Rand der Schale mindestens 3
Erhebungen aufgebracht sind, auf denen der Deckelboden aufliegt.
8. Petrischale nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, dass an der Wand der Schale außen mindestens eine Halterung für den Deckel angebracht ist. - 15 -
9. Ein Verfahren zum Nachweis von Keimen in Flüssigkeiten oder Gasen, gekennzeichnet durch folgende Verfahrensschritte
a) Filtration der Flüssigkeit oder des Gases durch einen Filter b) Aufbringen des Filters auf das Medium einer Petrischale nach einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8
c) Verschließen der Petrischale mit dem Deckel
d) Inkubation der Petrischale aus Schritt c)
e) Auswertung des Keim-Wachstums
10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass Filter und Petrischale rund geformt sind.
11. Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, dadurch gekennzeichnet, dass der innere Durchmesser der Petrischale 2 bis 10 mm größer ist als der
Durchmesser des Filters.
12. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 11 , dadurch gekennzeichnet, dass der Filter eine Ausschlußgrenze zwischen 0.2 und 0.45 pm hat.
13. Verfahren nach einem oder mehreren der Ansprüche 9 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass der Filter aus Zellulosemischestern besteht.
H.Verwendung einer Petrischale entsprechend einem oder mehreren der Ansprüche 1 bis 8 für den Nachweis von Keimen auf Filtern.
EP15741121.6A 2014-08-14 2015-07-17 Petrischale und verfahren zur mikrobiologischen untersuchung von flüssigkeiten mittels membranfiltration Pending EP3180416A1 (de)

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