EP3158311A1

EP3158311A1 - Einbettmedium für biologische proben und verfahren zum herstellen von eingebetteten biologischen proben sowie deren verwendung

Info

Publication number: EP3158311A1
Application number: EP15731036.8A
Authority: EP
Inventors: Mark KÜHNEL; Manuela Kellner; Danny Jonigk; Nicole Izykowski; Heiko Meyer; Raoul-Amadeus Lorbeer; Marko Heidrich
Original assignee: Medizinische Hochschule Hannover; LZH Laser Zentrum Hannover eV
Current assignee: LZH Laser Zentrum Hannover eV
Priority date: 2014-06-19
Filing date: 2015-06-19
Publication date: 2017-04-26
Also published as: WO2015193469A1; US20170212020A1; IL249598B; US10401266B2; IL249598A0; DE102014108642B3

Abstract

In einem ersten Aspekt richtet sich die Erfindung auf die Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung als Einbettmedium für biologische Proben. Diese UV-polymerisierbare Zusammensetzung ist eine mit einem Brechungsindex nach Polymerisation im Bereich von n = 1,45bis n = 1,6. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf ein Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben unter Verwendung dieser UV-polymerisierbaren Zusammensetzung sowie um diese eingebetteten biologischen Proben selbst. Diese biologischen Proben sind in verschiedensten Bereichen, unter anderem der Diagnostik, einsetzbar und eignen sich insbesondere auch zur RNA basierten Diagnostik.

Description

Einbettmedium für biologische Proben und Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben sowie deren Verwendung

In einem ersten Aspekt richtet sich die Erfindung auf die Verwendung einer UV- polymerisierbaren Zusammensetzung als Einbettmedium für biologische Proben. Diese UV-polymerisierbare Zusammensetzung ist eine mit einem Brechungsindex nach Polymerisation im Bereich von n = 1 ,45 bis n = 1 ,6. In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf ein Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben unter Verwendung dieser UV-polymerisierbaren Zusammensetzung sowie um diese eingebetteten biologischen Proben selbst. Diese biologischen Proben sind in verschiedensten Bereichen, unter anderem der Diagnostik, einsetzbar und eignen sich insbesondere auch zur RNA basierten Diagnostik. Daher richtet sich ein weiterer Aspekt auf ein Verfahren zur Untersuchung biologischer Proben umfassend ein bildgebendes Verfahren, ein his- tologisches Verfahren und gegebenenfalls ein molekularbiologisches Verfahren derselben Probe unter räumlicher Korrelation.

Stand der Technik Bei lichtmikroskopischen Bildgebungsverfahren wie OPT (Optical Projection To- mography), SLOT (Scanning Laser Optical Tomography), SPIM (Lichtscheiben- fluoreszenzmikroskopie) oder UM (Ultramikroskopie), bei dem die fixierte Probe

im Licht (üblicherweise Laserlicht) kontrolliert bewegt wird, kommt es häufig zu ungewünschten Bewegungen der Probe oder innerhalb der Probe, wodurch die Rekonstruktion der Datensätze erschwert wird. Es kommt zu Bewegungsartefakten und/oder die Zuordnung der einzelnen Bildebenen zueinander (z.B. bei SPIM) ist erschwert. Gerade bei biologischen Proben ist es weiterhin gewünscht, dass einerseits eine Untersuchung durch Bildgebungsmethoden, wie den oben genannten, erfolgt, und andererseits diagnostische Untersuchungen der Probe durchgeführt werden, z.B. histologische Untersuchungen oder Untersuchungen und Diagnostik an Proben-Schnitten einschließlich Untersuchungen auf Nuklein- säureebene. Bisher werden Proben zur histopathologischen Beurteilung eingebettet, geschnitten, histologisch gefärbt und anschließend beurteilt. Teilweise werden diese Schnitte zusätzlich mittels Lasermikrodissektion mit anschließender Isolierung von Bestandteilen, einschließlich RNA-Isolierung und RNA- Diagnostik, untersucht. Bei solchen Untersuchungen geht aber häufig die räum- liehe Korrelation verloren, da auf den Schnitten ausschließlich eine zweidimensionale Betrachtung erfolgen kann und zur dreidimensionalen Darstellung eine Vielzahl von konsekutiven Schnitten analysiert werden müssten. Benachbarte Ebenen bleiben bei einer solchen histopathologischen Beurteilung verborgen. Darüber hinaus ist die Beurteilung einer Probe anhand von Schnitten immer nur stichprobenartig möglich und beinhaltet das Risiko, möglicherweise wichtige Besonderheiten, z.B. eine beginnende Metastasierung, zu übersehen.

Solche Beeinträchtigungen können durch dreidimensionale Bildgebungsverfah- ren wie die oben genannten OPT, SLOT, SPIM, Ultramikroskopie (einschließlich Multiphotonenmikroskopie und scannende Konfokalmikroskopie) überwunden werden. Zu einer solchen Untersuchung mit den oben genannten Bildgebungs- verfahren ist es aber notwendig, dass die Probe in einer transparenten, d.h. durchsichtigen und die Bildgebungsmethode möglichst nicht beeinflussenden Art und Weise, eingebettet ist. Eine solche Anpassung bedeutet insbesondere, dass die Brechungsindizes der Probe und des Einbettmediums möglichst übereinstimmen, so dass eine möglichst geringe Streuung des Lichts während des Durchleuchtens auftritt. Es sind optimierte Einbettmedien bekannt, die eine optische Untersuchung mit dreidimensionalen Bildgebungsverfahren erlauben. Diese sind in ihrem Brechungsindex an die zu untersuchende Probe angepasst, um Brechungsartefakte aufheben, sodass elektromagnetische Wellen, wie Licht (sichtbares und nichtsichtbares Licht), möglichst unbeeinflusst durchgeführt werden können. Solche Einbettmedien werden auch als Aufklarungsmedien bezeichnet.

Nachteil dieser Aufklarungsmedien ist, dass sie ausschließlich im flüssigen Zu- stand vorliegen. Als Flüssigkeit mit aufklarender Wirkung, d.h. geeignet für dreidimensionale Bildgebungsmethoden, sind Stoffe wie MS/BB (Methylsalicylsäu- re/Benzylbenzoat), BABB (Benzylbenzoat/Benzylalkohol), Glycerin, Scale, und Xylol beschrieben. Diese flüssigen Aufklarungsmedien erlauben zwar die Anpassung des Brechungsindex dieser Medien an für das Licht notwendige Brechungsindices und erlauben eine optimierte Lichtausbeute bei entsprechenden Untersuchungen (d.h. eine„Aufklarung der Probe"), eine dauerhafte Immobilisierung der zu untersuchenden Probe, d.h. eine Dauerhaftigkeit und Färbbarkeit sowie Schneid- barkeit ist allerdings nicht gegeben. Dies hat zur Folge, dass lasertomographi- sche Ansätze, wie OPT und SLOT, mit Proben, die anschließend weiteren histo- pathologischen Untersuchungen unterworfen werden sollen, nur bedingt bis gar nicht durchgeführt werden können. Zu möglichen Einbettungsverfahren und Einbettungsmedien gibt es vor allem auf dem Gebiet der Histologie umfangreiche Untersuchungen. So werden unter anderem für die Histologie Kunstharze eingesetzt, die in Bezug auf Schneidbarkeit, Dauerhaftigkeit und Färbbarkeit optimiert sind, der Aspekt der Transparenz, also einer Unterdrückung von Licht-Streuung innerhalb der Probe wurde aber bisher vernachlässigt. Das heißt, die Anpassung des Einbettmediums an die Probe, um eine optische Aufklarung der Probe zu ermöglichen, wurde bisher nicht berücksichtigt. Die bisher überwiegend für die Histologie eingesetzten Einbettmedien mit entsprechenden Kohlenstoffen sind derart ausgewählt, dass sie für zweidimensionale Untersuchungen an Dünnschnitten geeignet sind, nicht aber für dreidimensionale Untersuchungen von Gewebeproben. Diese Kunstharze erlauben keine Bereitstellung von klaren, d.h. durchsichtigen Einbettmedien. D.h., die Medien sind zwar insoweit transparent, dass sie Durchlicht- oder Fluoreszenzmikroskopie erlauben, sie sind allerdings nicht darauf abgestimmt, eine Streuung des Lichts durch die Medien zu unterdrücken. Dieses ist aber gerade in den oben genannten dreidimensionalen Bildgebungsverfahren wichtig. Diese in der Histopathologie verwendeten Systeme beruhen üblicherweise auf chemisch gestarteten polymerisierten Kunststoffen. Es gibt hierzu verschiedene Kunststoffe üblicherweise auf Basis von Epoxiden, Acrylen oder Acrylaten bzw. Methacrylaten. Meist ist weiterhin eine thermische Polymerisierung des Mediums notwendig. Eine solche Polymerisierung über Wärmezufuhr ist aber für die zu untersuchende Struktur selbst schädlich. Insbesondere werden durch diese Wärmezufuhr empfindliche Moleküle, z.B. Nukleinsäuremoleküle, wie RNA- Moleküle, zerstört.

Ein wesentliches Problem ist weiterhin, dass die zur Polymerisation der Mono- mere notwendigen Starter vor dem Einbetten und Infundieren zu dem Medium hinzugegeben werden müssen und dass diese Starter dann bereits in einem gewissen Umfang die Polymerisation initiieren und somit das infundieren erschweren. Entsprechend kann die gewünschte Qualität des Einbettens ohne Luftblasen, Schlieren, etc. nicht erreicht werden.

Kellner M. et al ., J. Appl Physiol, 2012, 1 13, 975-983 beschreibt die Darstellung einer Mäuselunge mittels SLOT unter Verwendung von MS/BB. Für die anschließend erfolgte Histologie ist das Umbetten der Probe aus dem flüssigen MS/BB in ein Kunstharz, hier Technovit 8100, mit mehreren Substitutionsschrit- ten notwendig.

Zur Lösung des Problems der Einbettung einer biologischen Probe bei gleichzei- tiger Aufklarung wurde von Chung K. et al ., Nature, 201 3, 497, 332 ein als„Cla- rity" bezeichnetes Verfahren beschrieben. Dieses Verfahren basiert auf der Verwendung von Acrylamid und Bisacrylamid sowie Formaldehydkohlenstoffen, die erst infundiert und anschließend bei Wärme hybridisiert werden. Diesem schließt sich ein elektrophoretisches Verfahren an, um ein Aufklaren der immobilisierten Probe zu erreichen. Die so hergestellten Proben sind allerdings als Hydrogele tendenziell zu weich zur weiteren Verarbeitung, insbesondere einem Schneiden. Eine Langzeitlagerung bzw. ein Aufbereiten für eine anschließende Histologie ist zudem bei dieser Methodik ohne zusätzliche Arbeitsschritte nicht möglich.

Aus der DE 10 2012 210 185 ist ein UV-härtbares Einbettmedium für die Licht- und Fluoreszenzmikroskopie bekannt. UV-härtbare Medien haben den Vorteil, dass die Probe durch Einstrahlung von UV-Licht ausgehärtet wird, und somit ein Erwärmen und somit mögliches Zerstören von Molekülen in der Probe verhindert wird. Die dort beschriebene UV-polymerisierbare Zusammensetzung ist eine auf Basis einer polymerisierbaren organischen Verbindung und eines Alkoxysilans mit einer polymerisierbaren Gruppe. Dabei wird beschrieben, dass mit den genannten Werkstoffen die Einstellung des Brechungsindex im Hinblick auf den Anwendungszweck angepasst werden kann.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von neuen zum Infundieren von Proben geeigneten Einbettmedien, die eine Probenaufklarung für sowohl dreidimensionale Bildgebungsverfahren als auch für ein molekulares Profi- ling z.B. von entsprechend hergestellten histologischen Schnitten, an ein und derselben Probe erlaubt. Das heißt, die Erfindung richtet sich auf ein Einbettmedium, dass sowohl für die genannten Bildgebungsverfahren geeignet ist, als auch für histologische Untersuchungen an derselben Probe geeignet ist, einschließlich guter Schneidbarkeit und guter Lagerfähigkeit der Probe, sowie molekularbiologischen Untersuchungen hieran auch zu einem späteren Zeitpunkt.

Erfindungsgemäß wird diese Aufgabe durch Verwendung einer UV- polymerisierbaren Zusammensetzung als Einbettmedium für biologische Proben erreicht. Diese UV-polymerisierbaren Zusammensetzungen erlauben die Bereitstellung von eingebetteten biologischen Proben mit einem schneidbaren Kunststoff, der die Anfertigung von histologischen bis hin zu elektromikroskopischen Schnittpräparaten ermöglicht und gleichzeitig eine RNA-Extraktion aus den ein- gebetteten Proben erlaubt. Vorab können 3D-Bildgebungsverfahren, wie 3D- Tomographieuntersuchungen z.B. Lasertomographiemethoden zur Untersuchung der Probe eingesetzt werden, um 3D-Modelle der Probe zu erhalten.

Erfindungsgemäß ist es somit unter Verwendung der beschriebenen UV- polymerisierbaren Zusammensetzung möglich, sowohl 3D-Modelle der Probe zu erzeugen, als auch nachfolgend diagnostische Verfahren einschließlich Untersuchungen der RNA-Expression zu erlauben.

Die Proben zeigen dabei eine hervorragende Lagerbeständigkeit und Dauerhaf- tigkeit sowie gute Schneidbarkeit auf und zeichnen sich insbesondere durch solche Brechungsindices aus, die ein dreidimensionales Bildgebungsverfahren der Probe erlauben. Solche dreidimensionalen Bildgebungsverfahren sind insbesondere die genannten Tomographieverfahren einschließlich OPT, SLOT, SPIM und Ultramikroskopie. Die erfindungsgemäßen UV-polymerisierbaren Zusammenset- zungen führen zu Aufklarungsmedien, die ein Infundieren und anschließendes Einbetten der dreidimensionalen biologischen Proben erlauben.

Vorliegend wird unter dem Begriff„Einbettungsmedium" ein Medium verstanden, das die biologische Probe vollständig infundiert und in das die biologische Probe eingebettet wird, sodass diese biologische Probe vor äußeren Einwirkungen geschützt wird. Ein solches Einbettungsmedium wird vorliegend auch als„Aufkla- rungsmedium" bezeichnet. Dieses Aufklarungsmedium ist ein Medium, das mit der Probe zusammen klar, d.h. transparent, erscheint und somit dem Einbettmedium eine Durchstrahlung der Probe mit elektromagnetischer Strahlung, insbe- sondere sichtbarem und/oder nicht-sichtbarem Licht, erlaubt und dabei eine möglichst geringe Streuung des Lichtes verursacht. Erfindungsgemäß weist diese UV-polymerisierbare Zusammensetzung daher einen Brechungsindex auf, der mit dem Brechungsindex der Probe im Wesentlichen übereinstimmt.

Erfindungsgemäß ist daher der Brechungsindex der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung nach Polymerisation im Bereich von n = 1 ,45 bis n = 1 ,6. Be- vorzugt ist dieser Bereich in einem Bereich von n = 1 ,550 bis n = 1 ,565. In einer Ausführungsform ist der Brechungsindex dabei einer im Bereich von 1 ,552 bis 1 ,559.

Es zeigte sich, dass für eine Vielzahl von biologischen Proben ein solcher Bre- chungsindex geeignet ist, diese biologische Probe sowohl in bildgebenden dreidimensionalen Verfahren wie den genannten lichtmikroskopischen Bildgebungs- verfahren einzusetzen. Weiterhin erlaubt das erfindungsgemäße Medium eine gute Beständigkeit und Lagerfähigkeit, um zu einem späteren Zeitpunkt Schnitte und somit zweidimensionale Untersuchungen einschließlich diagnostischen Un- tersuchungen zu in der Probe vorliegenden Molekülen, wie Nukleinsäurefrag- menten einschließlich einer RNA-Extraktion. zu erlauben.

Die vorliegende Verwendung ermöglicht die korrelative Anwendung unterschiedlicher Analyseverfahren mit einer einzigen Probe durch Aufklarung der Probe im einen schneidbaren Kunststoff, der die Anfertigung von histologischen bis hin zu elektronenmikroskopischen Schnittpräparaten erlaubt und gleichzeitig RNA- Extraktion aus den eingebetteten Proben erlaubt. Somit können nacheinander durch Lasertomographie-Methoden Modelle der Proben erzeugt werden und anschließend histopathologische Untersuchungen einschließlich der Bestimmung der RNA-Expressionsmuster der Probe durchgeführt werden. Diese Untersuchungen können aufgrund der guten Lagerbeständigkeit der Probe zeitlich auseinander liegen.

„Korrelative Anwendung" oder „Korrelation", wie der Ausdruck hierin benutzt wird, bedeutet, dass die Daten aus dem dreidimensionalen bildgebenden Verfahren in Bezug gesetzt werden mit den Daten erhalten in den histologischen und gegebenenfalls molekularbiologischen Verfahren. Damit ist es möglich, die In- formationen aus dem histologischen und gegebenenfalls molekularbiologischen Verfahren in das dreidimensionale Bild zu projizieren.

In einer Ausführungsform umfasst die UV-polymerisierbare Zusammensetzung eine Mercaptoester-Verbindung. Mercaptoester umfassen die Gruppe

R1 -(C=O)-S-R2 und werden auch als Thioester oder Thiolester bezeichnet. Dabei sind die Reste R1 und R2 Organylgruppen z.B. Acrylgruppen oder Arylgrup- pen. Bei den Mercaptoestern kann es sich gegebenenfalls auch um Thionester handeln, d.h. Verbindungen mit der Gruppe R1 -(C=S-O)-R2. Dem Fachmann sind geeignete Mercaptoester-Verbindungen bekannt. In einer Ausführungsform liegt diese Mercaptoester-Verbindung oder Mischung verschiedener Mercaptoester-Verbindungen in der Zusammensetzung mit einem Anteil von mindestens 40 Gew.-% vor. Der Anteil der Mercaptoester-Verbindung kann dabei in einem Bereich von 40 bis 70 Gew.-%, wie 45 bis 65 Gew.-% liegen. In einer weiteren Aus- führungsform können die Mercaptoester-Anteile einer Mercaptoester-Verbindung oder einer Mischung von Mercaptoester-Verbindungen in einer Menge von 40 bis 85 Gew.-%, wie 50 bis 80 Gew.-% z.B. 55 bis 75 Gew.-% vorliegen. Dabei kann eine erste Mercaptoester-Verbindung mit einem Anteil von 40 bis 60 Gew.- % vorliegen, während die zweite Mercaptoester-Verbindung mit einem Anteil von 15 bis 35 Gew.-% vorliegt. Diese beiden Mercaptoester-Verbindungen werden dabei derart in ihren Anteilen zugegeben, dass der Gesamtanteil an Mercaptoester-Verbindungen im oben genannten Bereich liegt, z.B. im Bereich von 50 bis 80 Gew.-%, wie 55 bis 75 Gew.-%. In einer weiteren Ausführungsform umfasst die UV-polymerisierbare Verbindung weiterhin eine polymerisierbare Acrylat- und/oder Methacrylat-Verbindung. In dieser Verbindung kann der Anteil an der Mercaptoester-Verbindung in einem Bereich von z.B. 40 bis 70 Gew.-% liegen, während der Anteil der Acrylat- und/oder Methacrylat-Verbindungen im Bereich von 50 bis 25 Gew.-% liegt, der Gesamtanteil an Mercaptoester-Verbindungen und Acrylat- und/oder Methacrylat-Verbindungen liegt dabei im Bereich von 45 bis 80 Gew.-%, wie 50 bis 75 Gew.-% z.B. 60 bis 70 Gew.-%. Geeignete Mercaptoester-Verbindungen und geeignete Acrylat- und/oder Me- thacrylat-Verbindungen sind dem Fachmann bekannt. Geeignete Acrylat- und/oder Methacrylat-Verbindungen umfasst Tetrahydrofurfurylmethacrylat.

In einer Ausführungsform ist die UV-polymerisierbare Zusammensetzung dabei eine, die vor Polymerisation einen Brechungsindex im Bereich von n = 1 ,45 bis 1 ,6, wie n = 1 ,50 bis 1 ,55 aufweist. Soweit nicht anders ausgeführt umfasst der Ausdruck„umfassend" oder„beinhaltend" oder„enthaltend" Ausführungsformen von„bestehend aus".

Soweit nicht anders angegeben umfassen die unbestimmten Artikel„ein" und die bestimmten Artikel „der" sowohl einen als auch mehrere dieser bezeichneten Gegenstände.

Bei der biologischen Probe handelt es sich insbesondere um eine dreidimensionale biologische Probe, wobei die kleinste Kantenlänge dieser biologischen Probe mindestens 50 μιτι, wie mindestens 100 μιτι ist.

In einer Ausführungsform ist die biologische Probe eine aus einem Tier, insbesondere aus einem Menschen.

Es zeigte sich, dass unter der erfindungsgemäßen Verwendung der UV- polymerisierbaren Zusammensetzung die als Einbettmedium eingebetteten Proben nicht nur in dreidimensionalen Bildgebungsverfahren eingesetzt werden können, um die dreidimensionale Struktur der Probe darstellen zu können, sondern sie erlaubt auch eine dauerhafte Lagerung dieser Probe und eine spätere weitere Analyse hiervon einschließlich einer molekularbiologischen Analyse, wie einer Diagnostik z.B. auf Nukleinsäureebene, wie RNA-Ebene. Überraschenderweise zeigte sich, dass unter Verwendung der erfindungsgemäßen UV- polymerisierbaren Zusammensetzung in dieser so eingebetteten Probe auch nach einem längeren Lagern von einigen Monaten, z.B. von über sechs Monaten, molekularbiologische Untersuchungen einschließlich Isolierung und Bestimmung des Expressionsprofils von RNA. D.h., aus diesen erfindungsgemäß eingebetteten Proben war nach einem Zeitraum von über sechs Monaten die Herstellung von RNA-Profilen und Untersuchung von RNA-Expressionsmustern möglich.

Unter Verwendung des erfindungsgemäßen Verfahrens können somit von ein und derselben Probe sowohl dreidimensionale Modelle erstellt als auch daran anschließend zweidimensionale Analysen durchgeführt werden. Dadurch ist eine Korrelation der in den zweidimensionalen Schritten erhaltenen Ergebnisse mit dem vorher erstellten dreidimensionalen Modell möglich. Die entsprechenden histologischen und molekularbiologischen Untersuchungen am Schnitt sind im dreidimensionalen Raum darstellbar.

In einem weiteren Aspekt richtet sich die vorliegende Erfindung auf ein Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben einschließlich eingebetteten dreidimensionalen biologischen Proben, insbesondere solche, wo diese dreidimensionale Probe eine kleinste Kantenlänge von mindestens 50 μιτι, wie mindestens 100 μιτι aufweist. Hierzu umfasst das erfindungsgemäße Verfahren die Schritte des Entwässerns der biologischen Probe, des Infundierens einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung, insbesondere einer UV- polymerisierbaren Zusammensetzung wie vorliegend definiert, in die biologische Probe und ein Härten hiervon mit der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung infundierten biologischen Probe mit Licht mit einer Wellenlänge von <470 nm.

Dem Fachmann sind geeignete Verfahren zum Entwässern von biologischen Proben bekannt. Ein solches Entwässern kann z.B. mittels aufsteigender Alkoholreihe, wie einer aufsteigenden Ethanol-Reihe durchgeführt werden. Alternativ hierzu kann eine aufsteigende DMSO-Reihe erfolgen. Gegebenenfalls daran anschließend kann ein Entwässern mittels Xylol durchgeführt werden. Dem Entwässern der biologischen Probe voran kann der Schritt des Fixierens der biologischen Probe stehen. Ein solches Fixieren umfasst z.B. eines mit Aldehydgemischen oder Alkoholen. Dem Fachmann sind die geeigneten Fixierverfahren, wie sie für biologische Proben eingesetzt werden, bekannt. Es handelt sich hierbei um allgemeine Fixierverfahren wie sie in der Mikroskopie verwendet werden.

Das Infundieren der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung erfolgt in einer Ausführungsform im Unterdruck. Gegebenenfalls kann auch das Härten im Un- terdruck erfolgen. Das Infundieren der biologischen Probe mit der UV- polymerisierbaren Zusammensetzung erlaubt eine Verteilung dieser Zusammensetzung in der biologischen Probe, wobei möglichst wenige das Bildgebungsver- fahren beeinträchtigende Verunreinigungen vorliegen. Insbesondere erlaubt das Infundieren im Unterdruck die Bildung von Luftblasen oder Schlieren zu verhin- dem.

Das Härten der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung mit einer Strahlung mit einer Wellenlänge von < 470 nm kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Dem Fachmann sind die geeigneten Bedingungen bekannt bzw. er kann diese einfach bestimmen. Diese hängen insbesondere auch von der Stärke der Strahlungsquelle ab. Gegebenenfalls kann die biologische Probe während des Einstrahlens und Härtens oder/und bei diskontinuierlicher Bestrahlung während und/oder zwischen den Einstrahlungen gekühlt werden, um Schädigungen von Gewebe und Molekülen in der biologischen Probe zu verhindern.

In einem weiteren Aspekt richtet sich die Anmeldung auf eingebettete biologische Proben, insbesondere eingebettete dreidimensionale biologische Proben mit einer kleinsten Kantenlänge von mindestens 50 μιτι, wie mindestens 100 μιτι erhältlich unter Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung wie hierin beschrieben oder erhältlich gemäß einem erfindungsgemäßen Verfahren. Bei der eingebetteten biologischen Probe, insbesondere der eingebetteten dreidimensionalen biologischen Probe, handelt es sich in einem Aspekt um eine humane oder tierische Gewebeprobe. Es können aber auch pflanzliche oder my- kologische Proben etc. untersucht werden.

Die erfindungsgemäßen eingebetteten biologischen Proben sind vorteilhaft, da sie die Kombination einer dreidimensionalen Mikroskopie, z.B. einer Tomographie, wie SLOT, und ein nachfolgendes molekulares Profiling im Rahmen von histopathologischen Analysen erlauben.

Diese erfindungsgemäßen eingebetteten biologischen Proben sind dabei insbe- sondere zur Verwendung in der Diagnostik und hier in der molekularen Diagnostik geeignet. Eine vorteilhafte Ausführungsform umfasst dabei die Verwendung der eingebetteten biologischen Proben in der RNA basierten Diagnostik. Es zeigte sich überraschend, dass die eingebetteten biologischen Proben auch nach längerer Lagerung eine RNA-Extraktion und somit ein RNA-Profiling der Probe erlauben. Dadurch ist es möglich, nicht nur ein dreidimensionales Modell der biologischen Probe zu erstellen, sondern auch ein molekulares Profiling z.B. der RNA-Expression zu ermöglichen.

Aufgrund der transparenten Eigenschaften des Einbettmediums ist es weiterhin möglich, mit geeignetem Verfahren auch in der noch nicht geschnittenen dreidimensionalen Probe vorliegende Markermoleküle, z.B. Farbstoffe, Antikörper etc. nachzuweisen.

Die Verwendung solcher eingebetteten biologischen Proben ist vielfältig. Wie ausgeführt kann die mikroskopische Diagnostik um die dritte Dimension erweitert werden. Histopathologische Veränderungen können im räumlichen Kontext beurteilt werden. Weiterhin ist es möglich diese Proben aus der embryonalen Entwicklungsforschung im Bereich der Regenerationsmedizin und der Stammzellbiologie einzusetzen, aber auch in der Diagnostik von Tumorerkrankungen und möglicher Metastasierung von Geweben.

Erfindungsgemäß können somit unterschiedlichste Gewebetypen, wie Gehirn, Knochen und Knorpel z.B. Arthritismodelle, aber auch Lymphknoten bei Krebserkrankungen (z.B. zur Untersuchung von Metastasierung) aber auch Entzündungen und Fibrosen sowie Emphyseme untersucht werden. Die Erfindung stellt schließlich die Verwendung eines Kits oder eines Systems zum Einbetten von biologischen Proben umfassend die vorliegend beschriebene UV-polymerisierbare Zusammensetzung bereit, dieses Kit oder System umfasst dabei UV-polymerisierbare Zusammensetzungen als mehrkomponentige, getrennt vorliegende Zusammensetzung, wobei der gewünschte Brechungsindex durch geeignetes Mischen dieser beiden Komponenten eingestellt werden kann. Alternativ können Zusammensetzungen bereitgestellt werden, deren Brechungsindex aufgrund der definierten Anteile der Komponenten vorab auf einen Wert eingestellt ist.

Schließlich richtet sich die vorliegende Anmeldung auf ein Verfahren zur Untersuchung einer biologischen Probe, wobei diese Probe sowohl einem bildgebendem Verfahren und anschließend einem histologischen, und gegebenenfalls molekularbiologischen, Verfahren unterworfen wird, umfassend die Schritte:

a) Herstellen von eingebetteten biologischen Proben, mit einem erfindungsgemäßen Verfahren;

b) Durchführen eines dreidimensionalen Bildgebungsverfahrens;

c) Herstellung von gegebenenfalls konsekutiven histologischen Schnitten der in a) hergestellten und in b) einem dreidimensionalen Bildgebungsverfah- ren unterworfenen biologischen Probe;

d) histologische, und gegebenenfalls molekularbiologische, Untersuchung der in Schritt c) erhaltenen Schnitte.

Wie bereits oben ausgeführt kann aufgrund der 3D Daten eine entsprechende Auswahl der Schnittebene erfolgen, um dort vorliegende Objekte histologisch und gegebenenfalls molekularbiologisch zu untersuchen. Das heißt, einerseits kann auf Basis der 3D Daten eine Vorauswahl der Schnittebene erfolgen. Andererseits kann das Objekt in zufällig ausgewählten Schnitten untersucht und dann diese so erhaltenen Daten in das 3D Modell projiziert werden.

In einer Ausführungsform findet dabei weiterhin der Schritt der Korrelation der dreidimensionalen Bildgebung aus Schritt b) mit den histologischen und den ge- gebenenfalls molekularbiologischen Untersuchungen aus Schritt d) statt. Das heißt, die im Schritt b) erhaltenen Daten der dreidimensionalen Struktur der biologischen Probe können korreliert werden mit den zweidimensionalen histologisch bestimmten Daten derselben Probe. Diese histologischen Daten können dabei gegebenenfalls molekularbiologische Daten, einschließlich RNA-Profiling, enthalten.

Das bildgebende Verfahren kann dabei ein lichtmikroskopisches oder Tomographieverfahren sein, insbesondere OPT; SLOT; SPIM und Ultramikroskopie.

In einem Aspekt ist dabei das histologische Verfahren eines umfassend eine Mikrodissektion von einzelnen Bereichen, zum Beispiel einzelnen Zellen . Dieses kann insbesondere mithilfe einer Laser-Mikrodissektion erfolgen.

Das erfindungsgemäße Verfahren kann dabei ein molekularbiologisches Verfahren umfassen, insbesondere eine Diagnostik auf Nukleinsäureebene. Eine sol- che Diagnostik auf Nukleinsäureebene kann eine RNA basierte Diagnostik sein, zum Beispiel ein RNA-Profiling.

Die Erfindung wird unter Bezug auf die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne auf diese beschränkt zu sein.

Dabei werden in der Figur 1 schematisch die Bearbeitungsschritte dargestellt:

In einem ersten Schritt wird die Probe entnommen und gegebenenfalls fixiert. Die Probe wird anschließend entwässert. Daran anschließend erfolgt das Infun- dieren des erfindungsgemäßen Einbettmediums mit der erfindungsgemäßen Zusammensetzung nachdem diese entsprechend hergestellt wurde. Anschließend erfolgt die Polymerisation mittels UV-Einstrahlung zum Erhalt einer erfindungs- gemäß eingebetteten biologischen Probe.

In der Figur 3 sind schematisch die Bearbeitungsschritte des erfindungsgemäßen Verfahrens zur Untersuchung von biologischen Proben dargestellt. Dabei werden die in der Figur 1 dargestellten Bearbeitungsschritte durchgeführt. Hieran schließt sich die Durchführung des Bildgebungsverfahrens an, zum Beispiel mithilfe von Tomographieverfahren. Darauf folgt in einem weiteren Schritt die Herstellung von gegebenenfalls konsekutiven histologischen Schnitten mit geeigneten Vorrichtungen.

Daran anschließend werden die so erhaltenen Schnitte einer histologischen Untersuchung unterworfen. Diese histologischen Untersuchung kann eine molekularbiologische Untersuchung beinhalten . In einer Ausführungsform findet anschließend eine Korrelation der Daten der dreidimensionalen Bildgebung, das heißt des dreidimensionalen Modells, mit den histologischen und gegebenenfalls molekularbiologischen erhaltenen Daten statt. Beispiel 1

Die Probe wird entnommen und mit bekannten Mitteln, z.B. Natriumchloridlösung gewaschen und anschließend fixiert. Die Fixierung erfolgt mit bekannten Mitteln, z.B. mit Aldehydgemischen, wie 4% p-Formaledhyd oder 0,1 % Glutaraldehyd.

Die so fixierten Proben werden anschließend in einer aufsteigenden Alkoholreihe entwässert und anschließend in Xylol überführt. Die Schritte waren dabei wie folgt: 30% Ethanol in destilliertem Wasser, 2-4 Stunden,

50% Ethanol in destilliertem Wasser, 2-4 Stunden,

70% Ethanol in destilliertem Wasser, 2-4 Stunden, 90% Ethanol in destilliertem Wasser, über Nacht,

99,8% Ethanol, 4 Stunden,

100% Ethanol, 4 Stunden,

50% Ethanol/50% Xylol, über Nacht,

100% Xylol, 4 Stunden,

100% Xylol, 4 Stunden.

Anschließend wurde Xylol mit dem UV-polymerisierbaren Mittel in einem Anteil von 1 :1 vermischt und die Probe wurde über Nacht im Vakuumschrank bei < 100 mbar mit dieser 1 :1 Mischung inkubiert. Dann wurde die biologische Probe mit 100% UV-polymerisierbarer Zusammensetzung 6 Stunden im Vakuumschrank bei < 100 mbar behandelt.

Herstellung der UV-polymerisierbaren Probe:

Die UV-polymerisierbare Probe wurde aus einer Mischung von NOA (Norland Optical Adhesive 68, Norland Products Inc., Cranbury, USA und Norland Optical Adhesive 71 , Norland Products Inc., Cranbury, USA) hergestellt. Das Mischungsverhältnis dieser beiden Bestandteile wurde dabei so eingestellt, dass der Brechungsindex dieser UV-polymerisierbaren Zusammensetzung vor Polymerisation einen Wert von ca. 1 ,523 aufweist.

Ein bevorzugtes Mischungsverhältnis ist dabei eines von 1 :7 von NOA 68:NOA 71 .

Erfindungsgemäß erfolgt eine 24-stündige Polymerisation als Aushärtung dieses Kunststoffes, die zu einem Brechungsindex von ca. 1 ,556 führte. Zur Messung des Brechungsindex im Polymer werden parallel zu den Probeneinbettungen Kunststoffblöcke polymerisiert mit identischer Größe wie die Probeneinbettungen selbst. Diese Kunststoffblöcke werden dann zur Vorbereitung der Brechungsindexmessung am Refraktometer (Müller Abbe Refraktometer AR-4) plan geschliffen und schlussendlich mit einem Kontaktmedium mit höherem Brechungsindex auf das Messprisma gebracht.

Die Polymerisation kann kontinuierlich oder diskontinuierlich erfolgen. Diskontinuierliche Polymerisation:

Die Probe wurde für die Aushärtung in Spritzen (Füllmenge 3 bis 5 ml, je nach Probengröße) gefüllt mit der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung und einer zusätzlichen Probenhalterungsvorrichtung gehaltert. Hierzu wurde die Probe durch alternierende Phasen von je 1 Minute UV-Licht (Leica EM AFS2) und 1 Minute unter Kühlung bei 4°C anpolymerisiert. Nach 30 Minuten wurde die Spritze umgedreht und die zuvor angebrachte zusätzliche Probenhalterungsvorrichtung wurde entfernt, sodass die Probe in der Mitte der Spritze positioniert vorliegt. Anschließend wurde in alternierenden Schritten von UV und Kühlung die Polymerisierung fortgesetzt und schließlich durch Dauerbestrahlung mit UV bei Raumtemperatur beendet.

Die Figur 2 zeigt den Nachweis von RNA aus einer erfindungsgemäß eingebetteten humanen Lungenprobe. Nach der erfindungsgemäßen Einbettung der Probe wurde diese mittels SLOT (A) mikroskopiert und anschließend wurden 4μηη dicke Schnitte angefertigt und mit Hemalaun gefärbt (B). Areale von Interesse wurden mit einem Laser Mikrodissektionssystem ausgeschnitten (B Ausschnitt) und über Nacht in Proteinase K Puffer inkubiert. Es folgte eine Aufreinigung der im Überstand suspendierten RNA durch Phenol-Chloroform-Fällung, die Synthese von cDNA und eine Amplifikation mit geeigneten Primern erfolgten nach bekannten Verfahren. Dargestellt ist ein RNA-Expressionsprofil mit den folgenden Markern: Polyr2a (Polymerase 2alpha), BMP4 ( Bone morphogenic Protein 4), CD34, ACTA2 (alpha-2 Glattmuskulatur-Aktin), COL3A1 (Collagen 3A1 ), TIMP1 (Metallopeptidase Inhibitor 1 ), MMP2 (Matix Metalloprotease 2), CD14.

RNA Extraktion, Transkription und Amplification der cDNA erfolgte mit bekannten Verfahren.

Claims

Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben, umfassend die Schritte:

a) Entwässern der biologischen Probe,

b) Infundieren einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung, wobei diese UV-polymerisierbare Zusammensetzung einen Brechungsindex nach Polymerisation im Bereich von n = 1 ,45 bis n = 1 ,6, wie n = 1 ,550 bis n = 1 ,565 aufweist, in die biologische Probe,

c) Härten der mit der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung infundierten biologischen Probe mit Licht mit einer Wellenlänge von < 470 nm.

Verfahren zum Herstellen von eingebetteten biologischen Proben nach Anspruch 1 , wobei die Polymerisierung zu Beginn nicht kontinuierlich erfolgt und die biologische Probe gegebenenfalls zwischen den Einstrahlungen des Lichts mit einer Wellenlänge von < 470 nm einem Kühlen unterworfen wird.

Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei die biologische Probe vor dem Entwässern fixiert wurde, insbesondere mit Aldehydgemischen oder Alkoholen fixiert wurde.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei zumindest das Infundieren der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung unter Vakuum durchgeführt wird.

Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei das Entwässern der Probe mittels aufsteigender Alkoholreihe, insbesondere aufsteigender Ethanolreihe, oder mittels aufsteigender DMSO-Reihe erfolgt, und daran gegebenenfalls anschließend eine Entwässerung in Xylol.

6. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die UV- polymerisierbare Zusammensetzung eine Mercaptoester-Verbindung um- fasst.

7. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei diese Mercaptoester-Verbindung in der Zusammensetzung mit mindestens 40 Gew. -% vorliegt.

8. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei der Brechungsindex der UV-polymerisierbaren Zusammensetzung vor Polymerisation in einem Bereich von n = 1 ,4 bis 1 ,6, wie n = 1 ,50 bis 1 ,55 liegt.

9. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die UV- polymerisierbare Zusammensetzung weiterhin eine polymerisierbare Ac- rylat- und/oder Methacrylat-Verbindung aufweist.

10. Verfahren nach einem der vorherigen Ansprüche, wobei die biologische Probe eine dreidimensionale biologische Probe ist und wobei diese dreidimensionale Probe eine kleinste Kantenlänge von 50 μιτι, wie mindestens 100 μιτι aufweist.

1 1 . Verfahren zur Untersuchung von biologischen Proben, wobei diese Probe sowohl einem dreidimensionalen Bildgebungsverfahren und anschließend einem histologischen, und gegebenenfalls molekularbiologischen Verfahren unterworfen wird, umfassend die Schritte:

a) Herstellen von eingebetteten biologischen Proben, wie in einem der Ansprüche 1 bis 10 definiert;

b) Durchführung eines dreidimensionalen Bildgebungsverfahrens;

c) Herstellung von gegebenenfalls konsekutiven histologischen Schnitten der in a) hergestellten und in b) einem dreidimensionalen Bildgebungsverfahren unterworfenen biologischen Probe;

d) histologische und gegebenenfalls molekularbiologische Untersuchung der in Schritt c) erhaltenen Schnitte.

12. Verfahren nach Anspruch 1 1 , weiterhin umfassend den Schritt

e) Korrelation der dreidimensionalen Bildgebung aus Schritt b) mit den histologischen und gegebenenfalls molekularbiologischen Untersuchungen aus Schritt d).

13. Verfahren nach Anspruch 1 1 oder 12, wobei das bildgebende Verfahren ein lichtmikroskopisches oder Tomographieverfahren ist, insbesondere OPT; SLOT, SPIM und Ultramikroskopie.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 13, wobei das histologische Verfahren eine Mikrodissektion, insbesondere Laser-Mikrodissektion um- fasst.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 1 bis 14, wobei dieses ein molekularbiologisches Verfahren umfasst, insbesondere eine Diagnostik auf Nukleinsaureebene.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei die Diagnostik auf Nukleinsaureebene eine RNA basierte Diagnostik ist.

17. Verwendung einer UV-polymerisierbaren Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 und 6 bis 10 definiert, als Einbettmedium für biologische Proben.

18. Eingebettete biologische Probe erhältlich unter Verwendung einer UV- polymerisierbaren Zusammensetzung nach Anspruch 17 oder erhältlich gemäß einem Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10.

Eingebettete biologische Probe nach Anspruch 18, insbesondere eingebet tete tierische Gewebeprobe, wobei diese Probe eine dreidimensionale Pro be mit einer kleinsten Kantenlänge von mindestens 50 μιτι ist.

20. Verwendung eines Kits oder eines Systems zum Einbetten von biologischen Proben umfassend eine UV-polymerisierbare Zusammensetzung wie in einem der Ansprüche 1 oder 6 bis 10 definiert, insbesondere wobei die UV- polymerisierbare Zusammensetzung als mehrkomponentige, getrennt vorliegende Zusammensetzung vorliegt und wobei der gewünschte Brechungs- index durch geeignetes Mischen dieser beiden Komponenten eingestellt werden kann.

21 . Verwendung einer eingebetteten biologischen Probe nach Anspruch 18 o- der 19 in der Diagnostik.

22. Verwendung nach Anspruch 21 in der RNA basierten Diagnostik.