EP3080144A1 - Stabilisation de la glutamate déshydrogénase en solution aqueuse - Google Patents

Stabilisation de la glutamate déshydrogénase en solution aqueuse

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EP3080144A1
EP3080144A1 EP14821808.4A EP14821808A EP3080144A1 EP 3080144 A1 EP3080144 A1 EP 3080144A1 EP 14821808 A EP14821808 A EP 14821808A EP 3080144 A1 EP3080144 A1 EP 3080144A1
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EP
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acid
bacterium
clostridium
stabilizing compound
gdh
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Jérôme MARTINEZ
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Biomerieux SA
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    • G01N2333/90616—Oxidoreductases (1.) acting on nitrogen containing compounds as donors (1.4, 1.5, 1.7) acting on the CH-NH2 group of donors (1.4) with NAD or NADP as acceptor (1.4.1) in general with a definite EC number (1.4.1.-)

Definitions

  • the present invention relates to the field of in vitro detection of bacterial proteins in biological samples that may contain these proteins.
  • the invention relates to the stabilization of the glutamate dehydrogenase of a bacterium of the genus Clostridium so that this protein retains its antigenic properties when in aqueous solution.
  • Clostridium bacteria are anaerobic, spore-forming, Gram-positive bacteria that are unable to reduce sulphates to sulphites. Some species are highly pathogenic, such as Clostridium difficile, Clostridium botulinum and Clostridium perfringens for the most well known.
  • Clostridium difficile is the main agent responsible for diarrhea following the administration of antibiotics. It is daunting because of its very high contagion potential. Although about 5% of the population are asymptomatic carriers of the bacterium, its pathological manifestations are closely related to a hospital stay. This bacterium grows in an intestinal flora weakened by antibiotic therapy and can secrete two toxins, A and B. Only strains producing toxins are pathogenic. Toxin A, an enterotoxin, causes the alteration of the permeability of the intestinal epithelium; toxin B, a cytotoxin, directly attacks epithelial cells. The combined effect of both toxins is decreased intestinal transit time and intestinal absorption, which results in diarrhea. More rarely, Clostridium difficile bacteria can cause severe inflammation of the colon (pseudomembranous colitis).
  • Clostridium botulinum is responsible for botulism. It produces spores that represent the form of resistance of the bacteria. These spores can withstand low heat treatments, such as pasteurization, which can cause food safety problems, and then give a metabolically active bacterial cell, able to multiply.
  • This bacterium secretes one of the most potent toxins in the living world, botulinum toxin. Active by ingestion, this toxin then diffuses in the body and acts by blocking the neuromuscular transmission: it inhibits the motor neurons of the muscular contraction. This Infection can lead to paralysis death of the respiratory muscles if no treatment is put in place.
  • Clostridium perfringens is a bacterium that develops in wounds, sometimes very deep. This bacterium will produce necrotoxins causing necrotizing enteritis.
  • the most common major toxin is alpha toxin, mainly produced by Clostridium perfringens type A. This toxin is implicated in many cases of gangrene in humans and animals. Alone or in combination with other toxins, it also causes sudden mortalities in pigs and ruminants.
  • the detection of the presence of bacteria in samples can be implemented by various techniques such as the use of culture media or the technique of immunoassays, which are widely known to those skilled in the art.
  • the technique of immunoassays is a technique consisting largely of detecting the presence of proteins using binding partners of these proteins.
  • one of the detectable proteins, representative of the presence of this bacterium is glutamate dehydrogenase (GDH).
  • GDH glutamate dehydrogenase
  • Other detectable proteins are toxins secreted when bacteria are toxigenic.
  • the detection or quantification by immunoassay of GDH is a technique which makes it possible to have a diagnostic sensitivity greater than the detection or quantification by immunoassay of the toxins.
  • the immunoassay technique also requires the use of reagents for calibration and / or test control.
  • reagents include GDH as such, which must retain its antigenic properties as long as necessary in view of the lifetime of the diagnostic kit in which it is contained.
  • the properties of a protein can be disturbed by any structural change, both from a chemical and a physical point of view.
  • the chemical modifications of a protein are based on changes in covalent bonds, eg due to oxidation, hydrolysis, etc., while physical changes, also called denaturation, cause disruption of the tertiary structure. or three-dimensional conformation of the protein, without breaking covalent bonds.
  • the denaturation of proteins can be induced by many factors, chemical or physical, such as, among others, temperature, pH change or a chemical agent. Such modifications result in a disruption of the proper activity of the protein.
  • an enzyme such as GDH, such modifications may alter its enzymatic activity, which the various authors have tried to overcome.
  • Ionizable groups include first groups that are positively charged when they are protonated and uncharged when they are deprotonated, and second groups that are uncharged when protonated and negatively charged when they are deprotonated, and
  • the H of the composition is maintained in a range of +/- 0.5 pH units to which the composition has its maximum stability with respect to pH.
  • GDH is usually preserved in freeze-dried form because it is known that it does not retain its antigenic properties when it is placed in aqueous solution.
  • the laboratory worker takes the freeze-dried GDH in an aqueous solvent, prepares aliquots and then must freeze at -20 ° C. .
  • the shelf life of the aqueous solution is then quite short, on average 2 months stored between 2 and 8 ° C.
  • the fact of resuming the GDH in an aqueous buffer has the drawbacks of not only entailing additional manipulations, but also additional risks of error recovery. Finally, it also requires the presence of a freezer.
  • the Applicant has unexpectedly found that it is possible to stabilize the GDH in aqueous solution so that its three-dimensional structure is preserved at least in part so that it retains its antigenic properties.
  • Such stabilization is carried out by adding, as a stabilizing compound, a carboxylic acid having a carbon chain of at least 3 carbon atoms and comprising at least 2 -COOH groups or a salt thereof.
  • a stabilizing compound a carboxylic acid having a carbon chain of at least 3 carbon atoms and comprising at least 2 -COOH groups or a salt thereof.
  • the An aqueous solution comprising GDH can be stored at 2-8 ° C for many months.
  • a first subject of the invention relates to a method for stabilizing the glutamate dehydrogenase of a bacterium of the genus Clostridium in order to maintain its antigenic activity, comprising the step of mixing, with said glutamate dehydrogenase in aqueous solution, a stabilizing compound which is a carboxylic acid having a carbon chain of at least 3 carbon atoms and at least 2 -COOH groups or a salt thereof.
  • Another subject of the invention concerns the stabilized aqueous compositions thus obtained, as well as the diagnostic kits comprising these compositions.
  • compositions for the establishment of standard ranges in the context of an immunoassay of GDH.
  • compositions as a calibrator and / or control in the context of an immunoassay of GDH.
  • a final subject of the invention relates to methods for detecting the presence of a bacterium of the genus Clostridium implementing a composition of the invention, the bacterium being optionally toxinogenic.
  • the Applicant has therefore unexpectedly shown that the use of particular compounds makes it possible to stabilize the GDH of bacteria of the genus Clostridium to maintain its antigenic properties when the GDH is in aqueous solution, especially in concentrations of the order of a few ng. / mL, for example from 0.75 to 10 ng / mL, from 2 to 10 ng / mL or from 3 to 6 ng / mL, which is particularly important in the context of tests for the detection of these bacteria by immunoassay .
  • GDH retains its binding property to the binding partners used in the context of the immunoassay because its structure is preserved, at least at the level of the antigenic determinant involved in the fixation. the link partner.
  • the prefix "immuno" in the term “immunoassay”, for example, is not to be considered in the present application as strictly indicating that the binding partner is necessarily a partner of immunological origin, such as an antibody or an antibody fragment.
  • this term is more widely used to designate tests and processes in which the binding partner is not a partner of origin / immunological nature but consists, by for example, an analyte receptor that one wishes to detect and / or quantify.
  • the condition being that the binding partner concerned is able to bind to the desired analyte, preferably in a specific manner.
  • ligand binding assay which could be translated into French by "dosage using ligand binding ", while the term” immuno "is included in the verbatim title corresponding to the acronym ELISA.
  • immuno is used in this application to refer to any biological assay using at least one binding partner adapted to bind to the analyte of interest and detect and / or quantify the latter. preferably, specifically, even when said binding partner is not of a strictly immunological nature or origin.
  • GDH binding partner any molecule capable of binding to GDH.
  • GDH binding partner mention may be made of antibodies, antibody fragments, nanofitins, GDH receptors, aptamers, DARPins or any other molecule which is known to interact with one another. with the GDH.
  • the binding partner antibodies are, for example, either polyclonal antibodies or monoclonal antibodies.
  • the polyclonal antibodies can be obtained by immunizing an animal with the targeted GDH as immunogen, followed by the recovery of the desired antibodies in purified form, by taking the serum of said animal, and separating said antibodies from the other constituents of the serum, by example by chromatography affinity on a column on which is fixed an antigen specifically recognized by the antibodies, in particular the immunogen, or with the aid of a protein A or G.
  • the monoclonal antibodies can be obtained by the hybridoma technique widely known to those skilled in the art.
  • the monoclonal antibodies can also be recombinant antibodies obtained by genetic engineering, by techniques well known to those skilled in the art.
  • antibody fragments By way of example of antibody fragments, mention may be made of the Fab, Fab ', F (ab') 2 fragments as well as the scFvs (single chain variable fragment) and dsFv (double-stranded variable fragment). These functional fragments can in particular be obtained by genetic engineering.
  • Nanofitins are small proteins that, like antibodies, are able to bind to a biological target that can detect, capture or simply target within an organism.
  • RNA or DNA oligonucleotides
  • SELEX Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment
  • Most aptamers are composed of RNA, because of the ability of RNA to adopt varied and complex structures, which allows to create on its surface cavities of various geometries, to fix various ligands.
  • biotechnological, diagnostic or therapeutic applications Their selectivity and ligand binding properties are comparable to that of antibodies.
  • DARPins for Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL and Plutckthun A, 2011) are another class of proteins that mimic antibodies and can bind with high affinity and selectivity to target proteins. They derive from the family of ankyrin proteins that are adapter proteins that make it possible to bind integral membrane proteins to the spectrin / actin network that constitutes the "spine" of the cellular plasma membrane. The structure of ankyrins is based on the repetition of a pattern of about 33 amino acids and so are the DARPins. Each pattern has a secondary structure of helix-turn-helix type. DARPins contain at least three, preferably four to five repeating units and are obtained by screening combinatorial libraries.
  • the liaison partners used may or may not be specific to the GDH. They are said to be specific when they are able to bind exclusively or almost exclusively to the GDH. They are said to be nonspecific when the GDH binding selectivity is lower and they are then able to bind to other ligands, such as other proteins or antibodies. According to a preferred embodiment, the specific binding partners are preferred.
  • the glutamate dehydrogenase that must be stabilized is any Clostridium glutamate dehydrogenase whose presence is to be detected, for example that of Clostridium difficile, Clostridium botulinum or Clostridium perfringens. It includes all possible variants. Such proteins are known and their sequences are described for example in the Uniprot database (www.uniprot.org).
  • Clostridium difficile GDH (accession No. Uniprot P27346) is a protein of 421 amino acids whose amino acid reference sequence is the
  • Clostridium perfringens GDH is a protein that does not yet have a reference sequence in the Uniprot base.
  • the first protein given in the Uniprot base (accession No. Uniprot Q8XK85) is the protein of strain 13 of type A,
  • Clostridium botulinum GDH is a protein that does not yet have a reference sequence in the Uniprot base.
  • the first protein given in the Uniprot base (accession No. Uniprot A5I2T3) is the protein of the Hall strain type A (ATCC 3502, NCTC 13319), of 421 amino acids, the amino acid sequence of which is SEQ ID NO. 3 next: 10 20 30 40 50 60
  • glutamate dehydrogenase is an enzyme of the bacterium Clostridium difficile.
  • the aqueous solution glutamate dehydrogenase is either of natural origin or of recombinant origin.
  • the natural glutamate dehydrogenase or called native can be obtained after cultivation of the bacterium Clostridium and purification of the protein from the bacterial lysate.
  • Recombinant glutamate dehydrogenase can be obtained by genetic engineering, by techniques well known to those skilled in the art. Such an assay is described, for example, by Anderson BM et al., 1993.
  • Recombinant glutamate dehydrogenase can be obtained from companies such as Holzel Diagnostika GmbH (Germany).
  • composition or aqueous solution is meant a liquid and clear solution obtained by completely dissolving one or more compounds and whose majority solvent is water, representing at least 50% by volume, generally at least 60%, 70% ), 80% o, 90% o, relative to the total volume of the solution.
  • the aqueous composition or solution is obtained by diluting the GDH in a solvent comprising predominantly water and a stabilizing compound as defined below.
  • the stabilizing compound to be added in the aqueous solution containing the GDH to be stabilized is a carboxylic acid having a carbon chain of at least 3 carbon atoms and comprising at least 2 -COOH groups, or a salt thereof.
  • carboxylic acid having a carbon chain of at least 3 carbon atoms and comprising at least 2 -COOH groups is meant a molecule consisting of:
  • a carbon chain linear or branched, contiguous (that is to say without interruption in the carbon chain) or interrupted by at least one other atom different from the carbon atom, for example a nitrogen atom or a 'oxygen,
  • CX at least one "CX" group, either at the end of the chain (it is then written -CX), or in the middle of the chain (it is then written -CX-), X being different from C.
  • the -CX groups are themselves independently selected from -CH 3 , -COOH (if there is more than 2 -COOH groups in the molecule) and -C (O) NH 2 .
  • the stabilizing compound may be succinic acid, of formula OH (O) C- (CH 2 ) 2 -C (O) OH, which is a molecule having a contiguous linear carbon chain of 4 carbon atoms. carbon, 2 -COOH groups at the end of the chain and 2 -CH 2 - groups.
  • N- (2-acetamido) iminodiacetic acid of formula H 2 NC (O) -CH 2 -N (CH 2 -COOH) 2 , which is a molecule having a branched carbon chain of 6 carbon atoms, interrupted by a nitrogen atom, consisting of 2 -COOH groups at the end of the chain, 3 -CH 2 - groups and 1 -C (O) NH 2 group .
  • the stabilizing compound is chosen from: fumaric acid, succinic acid, malic acid, glutaric acid, acid citric acid, tartaric acid, N- (2-acetamido) iminodiacetic acid, glutamic acid, adipic acid, aspartic acid, pimelic acid, malonic acid and their salts, the formulas are given in Figure 1.
  • carboxylic acid salt is meant a salt of a monovalent cation.
  • a monovalent cation mention may be made of ammonium (NH 4 + ), silver (Ag + ), diaminoargent (Ag (NH 3 ) 2 + ), cesium (Cs + ), copper (I) (Cu + ), mercury (Hg + ), methanium (CH 5 + ), methylium (CH 3 + ), nitrosium (N0 2 ) and alkali metal ions sodium (Na + ), potassium (K + ) and lithium (Li + ) .
  • the stabilizing compound is in the salt form, at least one H + proton of the -COOH groups is replaced by a monovalent cation described above.
  • the stabilizing compound is chosen from succinic acid, fumaric acid and their salts, in particular of alkali metals, as defined above.
  • it may comprise at least 3 carbon atoms at most 10 atoms, preferably at most 8, preferably at most 7, preferably at most 6 atoms,
  • the carboxylic acid may have one or more of the following characteristics:
  • a carbon chain of 4 carbon atoms having at least 2 -COOH groups and -CX- groups independently selected from CH-, -CH 2 - and -C (H) OH-, a carbon chain of 5 carbon atoms having at least 2 -COOH groups and -CX- groups selected from -CH 2 - and -C (H) NH 2 , a carbon chain of 6 carbon atoms having at least 2 groups - COOH and "-CX-" groups selected from -CH 2 -, -C (H) OH- (-CX-) and -C (O) NH 2 (-CX),
  • the amount of GDH present in the aqueous solution depends on the end use of the aqueous composition containing it.
  • GDH may be present in an amount of 0.75 to 10 ng / mL, or 2 to 10 ng / mL, preferably 3 to 6 ng / mL.
  • GDH will be present in a much lower quantity, for example less than 1 ⁇ g / ml, or even of the order of fg / ml.
  • the amount of stabilizing compound to be added in the aqueous solution containing GDH is in large excess relative to the amount of GDH. It depends on whether the stabilizing compound is used only as a stabilizing compound, another molecule then being added as a buffer, or if it is used both as a stabilizing compound and as a buffer. Thus, for example, when the stabilizing compound is used solely as a stabilizing compound, 20 to 100 molecules of stabilizing compound per GDH monomer, preferably 30 to 80 molecules of stabilizing compound per monomer of GDH, are added. GDH, more preferably from 40 to 60 GDH monomer stabilizing compound molecules.
  • the compound added as a buffer is any compound known to those skilled in the art having a pH of between 4.5 and 7, preferably between 5.5 and 6.5, a pH of 5.8 being preferred.
  • a compound added as a buffer mention may be made of phosphate and acetate.
  • 10 8 to 10 molecules of stabilizing compound per GDH monomer are added, preferably 1 ⁇ 10 9 to 5 ⁇ 10 9 monomer stabilizing compound of GDH, more preferably 1 ⁇ 10 9 to 2 ⁇ 10 9 molecules of monomer stabilizing compound of GDH.
  • Other compounds may also be added to the aqueous composition in the process of the invention.
  • a polyol may be added.
  • the addition of polyol makes it possible to promote the thermal stability of the proteins (resistance to thermal denaturation) and also to prevent aggregation.
  • the polyols have a co-solvent effect and contribute to maintaining the native conformation of the proteins in aqueous solution.
  • polyol there may be mentioned monosaccharide polyols such as triols, for example glycerol, tetraols, for example erythritol, pentols, for example xylitol, arabitol and ribitol, hexols. for example, sorbitol, dulcitol and mannitol, heptols, for example volemitol, as well as disaccharide polyols such as maltitol, isomaltitol and lactitol.
  • triols for example glycerol
  • tetraols for example erythritol
  • pentols for example xylitol
  • arabitol and ribitol arabitol and ribitol
  • hexols for example, sorbitol, dulcitol and mannitol, heptols, for example volemit
  • the polyol added to the aqueous composition of the process of the invention is sorbitol.
  • the polyol in the aqueous composition is added in an amount of at least 1%, preferably at least 5%, and more preferably at least 10%, with at most 50%.
  • the composition may also comprise another macromolecule, generically referred to as a "charge protein” even though macromolecules other than proteins are appropriate, which has nothing to do with GDH but is present in a large excess over GDH , further improving the stabilization of GDH.
  • This "charge protein” has a shielding effect in that it will partially undergo physico-chemical changes in the aqueous solution, thereby protecting the molecule of interest, here the GDH.
  • This added macromolecule may for example be a protein such as BSA (Bovine Serum Albumin), or else synthetic polymers such as dextran or polyethylene glycol. BSA, for example, is added at 50 g / L vs. 3 mg / L GDH.
  • the aqueous composition is buffered to have a pH of between 4.5 and 7, preferably between 5.5 and 6.5, a pH of 5.8 being preferred.
  • the stabilizing compound of the invention may also be used as a buffer, or another buffer compound may be added.
  • aqueous compositions comprising glutamate dehydrogenase of a bacterium of the genus Clostridium and a stabilizing compound which is a carboxylic acid having a carbon chain of at least 3 carbon atoms and having at least 2 -COOH groups or a salt thereof, it being understood that the stabilizing compound is neither glutamate nor alpha-ketoglutarate, a product of hydrolysis of glutamate by the enzyme GDH and coenzyme NAD +, nor citrate, nor succinate, nor glutarate, are new and constitute another subject of the invention .
  • the aqueous compositions of the invention also exclude glutamic acid, alpha-ketoglutaric acid, glutaric acid, succinic acid and / or citric acid.
  • Clostridium When the bacterium Clostridium is selected from the species of
  • compositions comprising glutamate dehydrogenase of one of these bacteria and a stabilizing compound which is a carboxylic acid having a carbon chain of at least 3 carbon atoms and having at least 2 -COOH groups or a salt thereof, it being understood that the stabilizing compound is neither glutamate, nor alpha-ketoglutarate, nor citrate, are new and constitute another subject of the invention.
  • the aqueous compositions of the invention also exclude glutamic acid, alpha-ketoglutaric acid and / or citric acid.
  • aqueous compositions of the invention are particularly useful for detecting the presence of a bacterium of the genus Clostridium in a biological sample that may contain such a bacterium.
  • the kits containing such compositions constitute another object of the invention.
  • the biological samples likely to contain a bacterium of the genus Clostridium can be samples coming from the clinical field or the field of the safety and even sterility control of industrial products.
  • the sample is an animal biological sample, preferably human, such as stool or derivatives, for example fecal protein extract, urine, blood or derivatives, for example serum or plasma, pus, etc.
  • the sample comes from a food or cosmetic product.
  • kits according to the invention may also contain the compounds necessary for carrying out a method for the detection, for example by immunoassay, of the presence of a bacterium of the genus Clostridium, and in particular Clostridium difficile.
  • the kits may contain one or more GDH binding partners as described above, and all the compounds necessary for the demonstration of the reaction between the binding partner (s) and the GDH.
  • the qualitative or quantitative immunoassay of GDH will preferably be a sandwich assay which is a widely known assay of the skilled person implementing two GDH binding partners.
  • One of the two partners may be coupled to a label to form a conjugate or a tracer.
  • the other link partner can be captured on a solid support. This is called capture partner for the latter and detection partner for the first.
  • the measured signal emitted by the conjugate is then proportional to the amount of GDH of the biological sample.
  • Marker means, in particular, any molecule containing a group reactive with a group of the binding partner, directly without chemical modification, or after chemical modification to include such a group, which molecule is capable of directly or indirectly generating a detectable signal.
  • a non-limiting list of these direct detection markers consists of:
  • Enzymes that produce a detectable signal for example by colorimetry, fluorescence, luminescence, such as horseradish peroxidase, alkaline phosphatase, ⁇ -galactosidase, glucose-6-phosphate dehydrogenase,
  • chromophores such as fluorescent compounds, luminescent compounds, dyes,
  • Radioactive molecules such as P, S or I, Fluorescent molecules such as Alexa or phycocyanins, and
  • Electrochemiluminescent salts such as organometallic derivatives based on acridinium or ruthenium.
  • Indirect detection systems can also be used, such as, for example, ligands capable of reacting with an anti-ligand.
  • the ligand then corresponds to the marker to form, with the binding partner, the conjugate.
  • ligand / anti-ligand pairs are well known to those skilled in the art, which is the case, for example, of the following pairs: biotin / streptavidin, hapten / antibody, antigen / antibody, peptide / antibody, sugar / lectin, polynucleotide / complementary polynucleotide.
  • the anti-ligand can then be detectable directly by the direct detection markers described above or be itself detectable by another ligand / anti-ligand pair, and so on.
  • reagents allowing the visualization of the marking or the emission of a detectable signal by any type of suitable measuring device, such as for example a spectrophotometer, a spectrofluorometer, a densitometer or a high definition camera.
  • the aqueous compositions of the invention are particularly useful for the establishment of a standard range, which constitutes another object of the invention. 'invention.
  • the establishment of the standard range, necessary step to perform a quantification of GDH is a step widely known to those skilled in the art.
  • a nutshell it consists in measuring the signal generated by increasing quantities and known concentrations of the GDH analyte, in plotting the curve giving the signal as a function of the quantity or the concentration and in finding a mathematical model which represents the most faithful way possible this relationship.
  • several aqueous compositions of the invention are used, each containing a different concentration of GDH.
  • the mathematical model will be used to extrapolate the unknown quantities or concentrations of GDH contained in the biological sample to be tested.
  • aqueous compositions of the invention where appropriate obtained according to the process of the invention, are also particularly useful as a calibrator, which constitutes another subject of the invention.
  • the GDH concentration of the composition is fixed and known.
  • the signal generated during the use of the immunoassay kit by the calibrator is also known.
  • the calibrator is used to verify that the measurement (signal) produced during the implementation of the immunoassay kit corresponds to the expected value. If this is not the case, the calibrator is used to measure the drift that may be corrected mathematically or by physical intervention on the measuring instrument (adjustment).
  • aqueous compositions of the invention where appropriate obtained according to the process of the invention, are also particularly useful as a control, which constitutes another subject of the invention. As such, they are used, for example, to verify that the immunoassay kit is functioning according to expectations (also called a control or positive control) and that the detection of GDH in the biological sample is not falsely negative in the measurement where the detection method worked well with the aqueous composition of the invention.
  • another subject of the invention relates to a method for detecting the presence of a bacterium of the genus Clostridium in a biological sample that may contain such a bacterium, characterized in that it comprises the steps of (i) putting a implementing a method for detecting the presence of a bacterium of the genus Clostridium by detection or quantification of glutamate dehydrogenase in said sample by using an aqueous composition of the invention, if appropriate as obtained according to the method of the invention, or a kit as defined above, and
  • step (ii) if the process of step (i) is positive, conclude that the bacterium is present. In other words, for step (ii) a positive result in step (i) makes it possible to conclude that the bacterium is present.
  • this bacterium does or does not produce at least one toxin, which is particularly important as a diagnostic aid when a patient presents with symptoms that may be caused by the presence of a toxigenic bacterium that expresses at least one toxin.
  • another subject of the invention relates to a method for detecting the presence of a toxinogenic bacterium of the Clostridium genus producing at least one toxin, in a biological sample that may contain such a bacterium and such at least one toxin, characterized in that it comprises the steps of:
  • step (ii ') if the process of step (i) is positive, implementing a method for detecting or quantifying at least one toxin capable of being released by said bacterium of the genus Clostridium, in the same biological sample, or in a new biological sample from the same individual, and conclude that the bacterium is toxigenic and produces said at least one toxin if said at least one toxin is present.
  • step (ii) a negative result in step (i) makes it possible to conclude that the bacterium is absent and a positive result in step (i) makes it possible to conclude that there is of the bacteria.
  • Step (i) above consisting in detecting the presence of a bacterium of the genus
  • Clostridium by detection or quantification of glutamate dehydrogenase in the biological sample has been previously described.
  • the aqueous composition of the invention where appropriate obtained by the process of the invention, can then be used for the establishment of the standard range and / or as a calibrator and / or as a positive control.
  • the step ( ⁇ ') above of detecting or quantifying at least one toxin capable of being released by said bacterium Clostridium genus is a step widely known to those skilled in the art. Such detection or quantification can be carried out for example by immunoassay using desired toxin binding partners.
  • the immunoassay of the toxins is implemented in a manner similar to the immunoassay for GDH as described above.
  • Toxin immunoassay kits of Clostridium bacteria are available on the market, such as the VIDAS® Clostridium difficile A & B kit which can detect Clostridium difficile toxins A and B.
  • Mass spectrometry may also be used to carry out the toxin detection / quantification step.
  • This technique is an analytical technique that allows the determination of the molar mass of the compounds analyzed, as well as the identification of their molecular structure, or even their quantification. Applied to a complex mixture such as a biological fluid or stool, it needs to be coupled with a separation technique that reduces the complexity. This is most often the case of gas chromatography (GC) or liquid chromatography (LC). Tandem mass spectrometry (MS / MS) combines 2 analyzers and can be used for detection / quantification purposes. The ionic compounds selected in the first analyzer and then fragmented are analyzed more finely in the second. This double analysis makes it possible to significantly increase the specificity of the method. For this technology, we can refer in particular to Van den Broek et al., 2013.
  • the detection and / or quantification of toxins can also be carried out by a stool immunotoxicity test (CTA) which makes it possible to demonstrate the biological effects of toxins in the stool (Eckert C. et al., 2011). .
  • CTA stool immunotoxicity test
  • the detection or quantification of the toxin is carried out in the same biological sample as that used for the detection or quantification of GDH, a part of which has been kept in this respect, or in a new biological sample coming from the same source, c that is, the individual from which the first tested biological sample is derived from the presence of GDH if the biological sample is a clinical specimen or from the same source if the biological sample is an industrial sample.
  • the second biological sample is either of the same nature or of a different nature, the first case being preferred.
  • the toxigenic bacterium whose presence is to be detected is Clostridium difficile and said at least one toxin comprises toxin A, toxin B or both.
  • FIG. 1 gives examples of stabilization compounds used in the aqueous compositions according to the invention, as well as their chemical formula, and
  • FIG. 2 is a graph showing the evolution of the fluorescent signal obtained during an immunoassay with the VIDAS® GDH kit (bioMérieux) emitted by aqueous compositions according to the invention or comparative compositions, as a function of time, when these compositions are maintained at 37 ° C.
  • the gluD gene encoding Clostridium difficile GDH (Genbank Accession No. M65250) supplemented with a sequence encoding an HIS tag is cloned into the pMR78 vector (bioMérieux, France).
  • the thus constructed expression plasmid is introduced into E. coli BL21 and derived bacteria (Stratagene, Agilent Technologies).
  • the cultures are carried out in 2x YT medium (Difco), in the presence of ampicillin, at 37 ° C. with stirring.
  • the induction of the expression of the protein is done by adding 1 mM IPTG (isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside).
  • IPTG isopropyl beta-D-1-thiogalactopyranoside
  • the bacterial pellets are taken up in 2 ⁇ PBS buffer (phosphate buffered saline) and lysed.
  • the lysates are centrifuged at 3000 g for 30 min at 4 ° C.
  • the supernatant contains the soluble proteins including the recombinant GDH to be purified. Purification of the protein is by one-step chelate metal affinity chromatography.
  • the supernatant obtained after centrifugation is loaded onto a NITTA-Agarose resin (Qiagen). After a wash cycle, the protein is eluted in the presence of an imidazole gradient.
  • the protein is dialyzed in 20 mM phosphate buffer.
  • the recombinant GDH, prepared in Example 1, is diluted to 3 ng / ml in the following formulations, according to the indications relating to the calibrator and control (SI / Cl) given in the VIDAS® GDH reagent leaflet (Ref 30125, bioMérieux, France) :
  • Comparative composition 100mM phosphate + 50g / L BSA, pH 5.8 (formulation of the Vidas® kit calibration solution, GDH in freeze-dried form, taken up in demineralized water),
  • composition according to the invention 1 N- (2-acetamido) iminodiacetic acid (ADA) 1 OOmM + B S A 5 Og / L pH 5.8 (ADA composition)
  • composition according to the invention 2 succinic acid lOOmM + BSA 50g / L pH 5.8 (succinate composition)
  • composition according to the invention 3 disodium fumarate 100mM + BSA 50g / L pH 5.8 (fumarate composition).
  • each composition was prepared beforehand as follows: each stabilization compound (1.18 g of succinic acid - Merck, 1.6 g of dibasic sodium fumarate - Sigma, 1.90 g ADA-Sigma or 0.78 g phosphate NaH 2 PO 4 .2H 2 O + 1.79 g Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O) was mixed with deionized water to obtain 50 mL. Then 10M N NaOH was added to adjust the pH to 5.8. Five grams of BSA (Millipore) were added. Finally, demineralized water was added to obtain a 100 mL solution.
  • each stabilization compound (1.18 g of succinic acid - Merck, 1.6 g of dibasic sodium fumarate - Sigma, 1.90 g ADA-Sigma or 0.78 g phosphate NaH 2 PO 4 .2H 2 O + 1.79 g Na 2 HPO 4 ⁇ 12H 2 O) was mixed with deionized water to obtain 50 mL. Then 10M
  • compositions containing the GDH are then aliquoted into 1 mL fractions and then stored at 37 +/- 1 ° C.
  • the impact of the formulation on the stability of the antigenic properties of the recombinant GDH protein is evaluated by performing several GDH assays over a period of 91 days with the VIDAS® GDH kit. (Ref 30125) and the VIDAS® instrument according to the manufacturer's instructions (bioMérieux, France).
  • VIDAS GDH test complies with the protocol of the kit marketed:
  • VIDAS instrument measures a fluorescence signal and the results are expressed in "relative fluorescence value" or RFV.
  • Example 2 The procedure of Example 2 was repeated, except that citric acid (100 mM) was used as the stabilizing compound and the aqueous solutions were stored for a longer period of time at 2- 8 ° C and 37 ° C.
  • Example 2 The procedure of Example 2 was repeated, except that 10% sorbitol was added in a succinate composition and the aqueous solutions were stored over a longer period of 2-8 °. C and 37 ° C.

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Abstract

La présente invention concerne un procédé de stabilisation de la glutamate déshydrogénase d'une bactérie du genre Clostridiumen solution aqueuse afin de maintenir ses propriétés antigéniques,comprenant l'étape de mélange de ladite glutamate déshydrogénase et d'un composé de stabilisation qui est un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements –COOH ou un de ses sels. Elle concerne également les compositions de GDH ainsi stabilisées, ainsi que leur utilisation pour la détection de la présence de bactéries du genre Clostridium.

Description

Stabilisation de la Glutamate Déshydrogénase en solution aqueuse
La présente invention concerne le domaine de la détection in vitro de protéines de bactéries dans des échantillons biologiques susceptibles de contenir ces protéines. En particulier, l'invention concerne la stabilisation de la glutamate déshydrogénase d'une bactérie du genre Clostridium afin que cette protéine conserve ses propriétés antigéniques lorsqu'elle est en solution aqueuse.
Les bactéries du genre Clostridium sont des bactéries anaérobies, sporulées, à Gram positif qui sont incapables de réduire les sulfates en sulfites. Certaines espèces sont très pathogènes, telles que Clostridium difficile, Clostridium botulinum et Clostridium perfringens pour les plus connues.
La bactérie Clostridium difficile est le principal agent responsable de la diarrhée suite à l'administration d'antibiotiques. Elle est redoutable en raison de son potentiel de contagion très élevé. Bien qu'environ 5 % de la population soient porteurs asymptomatiques de la bactérie, ses manifestations pathologiques sont étroitement reliées à un séjour à l'hôpital. Cette bactérie se développe dans une flore intestinale affaiblie par l'antibio thérapie et peut sécréter deux toxines, A et B. Seules les souches produisant des toxines sont pathogènes. La toxine A, une entéro toxine, provoque l'altération de la perméabilité de Pépithélium intestinal ; la toxine B, une cytotoxine, s'attaque directement aux cellules de Pépithélium. L'effet combiné des deux toxines est la diminution du temps de transit intestinal et de l'absorption intestinale, ce qui résulte en une diarrhée. Plus rarement, la bactérie Clostridium difficile peut provoquer une inflammation sévère du colon (colite pseudomembraneuse).
La bactérie Clostridium botulinum quant à elle est responsable du botulisme. Elle produit des spores qui représentent la forme de résistance de la bactérie. Ces spores peuvent résister à de faibles traitements thermiques, tels que la pasteurisation, ce qui peut poser des problèmes en sécurité alimentaire, puis donner une cellule bactérienne métaboliquement active, capable de se multiplier. Cette bactérie sécrète une des toxines les plus puissantes du monde vivant, la toxine botulique. Active par ingestion, cette toxine diffuse ensuite dans l'organisme et agit en bloquant la transmission neuromusculaire : elle inhibe les neurones moteurs de la contraction musculaire. Cette infection peut entraîner la mort par paralysie des muscles respiratoires si aucun traitement n'est mis en place.
La bactérie Clostridium perfringens est une bactérie qui se développe dans les plaies, parfois de façon très profonde. Cette bactérie va produire des nécrotoxines provoquant ainsi l'entérite nécrosante. La toxine majeure la plus fréquente est la toxine alpha, essentiellement produite par Clostridium perfringens type A. Cette toxine est impliquée dans de très nombreux cas de gangrène chez l'homme et les animaux. Seule ou en association avec d'autres toxines, elle cause également des mortalités brutales chez les porcs et les ruminants.
La détection de la présence de ces bactéries et de la sécrétion de leur toxine est donc un problème majeur de santé publique qui nécessite pour les laboratoires d'avoir des tests de détection fiables, tant au niveau de la sensibilité/spécificité, qu'au niveau de la reproductibilité des résultats obtenus avec ces tests. Pour ce faire, les laboratoires ont besoin notamment de tests incluant des réactifs qui ne se dégradent pas dans le temps et donc restent stables.
La détection de la présence de bactéries dans des échantillons peut être mise en œuvre par différentes techniques telles que l'utilisation de milieux de culture ou la technique des immunodosages, lesquels sont largement connues de l'homme du métier. La technique des immunodosages est une technique consistant dans les grandes lignes à détecter la présence de protéines en utilisant des partenaires de liaison de ces protéines. Dans le cadre de la détection des bactéries du genre Clostridium, l'une des protéines détectables, représentatives de la présence de cette bactérie, est la glutamate déshydrogénase (GDH). D'autres protéines détectables sont les toxines sécrétées lorsque les bactéries sont toxinogènes. La détection ou quantification par immunodosage de la GDH est une technique qui permet d'avoir une sensibilité diagnostique plus grande que la détection ou quantification par immunodosage des toxines. Elle est utilisée en tant que moyen de criblage sur les populations à risque. En cas de positivité, une recherche des toxines est alors recommandée car cette technique présente quant à elle une plus grande spécificité. Plusieurs sociétés de diagnostic proposent des trousses pour la détection de la GDH chez Clostridium difficile. On peut citer par exemple la trousse VIDAS® GDH de la Demanderesse.
Outre les partenaires de liaison, la technique d'immunodosage nécessite également l'utilisation de réactifs pour la calibration et/ou le contrôle du test. Ainsi, dans le cadre d'un immunodosage de la GDH, de tels réactifs comprennent la GDH en tant que telle, laquelle doit conserver ses propriétés antigéniques aussi longtemps que nécessaire au regard de la durée de vie de la trousse de diagnostic dans laquelle elle est contenue.
Les propriétés d'une protéine peuvent être perturbées par toute modification de structure, tant d'un point de vue chimique que physique. Les modifications chimiques d'une protéine sont basées sur des changements au niveau des liaisons covalentes, dus par exemple à des réactions d'oxydation, hydrolyse, etc., tandis que les modifications physiques, également appelées dénaturation, entraînent une désorganisation de la structure tertiaire ou conformation tridimensionnelle de la protéine, sans rupture des liaisons covalentes. La dénaturation des protéines peut être induite par de nombreux facteurs, chimiques ou physiques, tels que, entre autres, la température, la modification du pH ou un agent chimique. De telles modifications ont comme conséquence une perturbation de l'activité propre de la protéine. Ainsi, dans le cadre d'une enzyme comme la GDH, de telles modifications peuvent altérer son activité enzymatique, ce que les différents auteurs ont essayé de pallier.
Ainsi, par exemple, les auteurs de la demande de brevet WO2007/003936 ont décrit la stabilisation de l'activité enzymatique de différentes protéines en utilisant un ou plusieurs composés stabilisants ayant les caractéristiques suivantes :
Ils ont des groupes ionisables capables d'échange de protons avec la protéine à stabiliser et avec les produits ionisés de la solution aqueuse,
Les groupes ionisables incluent des premiers groupements qui sont chargés positivement lorsqu'ils sont protonés et non chargés quand ils sont déprotonés, et des seconds groupements qui sont non chargés lorsqu'ils sont protonés et négativement chargés quand ils sont déprotonés, et Le H de la composition est maintenue dans une gamme de +/- 0,5 unités pH du pH auquel la composition possède sa stabilité maximale par rapport au pH.
Ce document décrit que l'activité enzymatique de la GDH bovine est conservée par ajout de lysine comme composé stabilisant, alors que l'ajout de citrate ne permet pas à la GDH de conserver cette activité enzymatique.
Garcia-Galan C. et al., 2013, ont quant à eux décrit que la GDH de Escherichia coli pouvait être stabilisée pour qu'elle maintienne son activité enzymatique en revêtant la surface de la GDH par de la polyéthylèneimine en présence de Lithium+.
Toutefois, aucun auteur ne s'est intéressé à rechercher comment stabiliser la GDH pour qu'elle conserve ses propriétés antigéniques, alors que c'est un problème rencontré lorsque cette protéine est utilisée en solution aqueuse, notamment de façon très diluée, par exemple à une concentration de l'ordre de quelques ng/mL.
En effet, la GDH est habituellement conservée sous forme lyophilisée car il est connu qu'elle ne conserve pas ses propriétés antigéniques lorsqu'elle est mise en solution aqueuse. Aussi, lorsque la GDH doit être mise en solution aqueuse, par exemple dans le cadre d'un immunodosage de la GDH, le laborantin reprend la GDH lyophilisée dans un solvant aqueux, prépare des aliquotes qu'il doit ensuite congeler à -20°C. La durée de péremption de la solution aqueuse est alors assez courte, en moyenne de 2 mois conservée entre 2 et 8°C. De plus, le fait de reprendre la GDH dans un tampon aqueux a pour inconvénients d'entraîner non seulement des manipulations supplémentaires, mais également des risques supplémentaires d'erreur à la reprise. Enfin, cela nécessite également la présence d'un congélateur.
La Demanderesse a trouvé contre toute attente qu'il était possible de stabiliser la GDH en solution aqueuse afin que sa structure tridimensionnelle soit conservée au moins en partie de sorte qu'elle garde ses propriétés antigéniques. Une telle stabilisation est mise en œuvre par addition, en tant que composé de stabilisation, d'un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH ou d'un de ses sels. Grâce à l'ajout de ce composé, la solution aqueuse comprenant la GDH peut être conservée entre 2 et 8°C, et ce pendant de nombreux mois.
Ainsi, un premier objet de l'invention concerne un procédé de stabilisation de la glutamate déshydrogénase d'une bactérie du genre Clostridium afin de maintenir son activité antigénique, comprenant l'étape de mélange, à ladite glutamate déshydrogénase en solution aqueuse, d'un composé de stabilisation qui est un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et au moins 2 groupements -COOH ou un de ses sels.
Un autre objet de l'invention concerne les compositions aqueuses stabilisées ainsi obtenues, ainsi que les trousses de diagnostic comprenant ces compositions.
Encore un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des compositions pour l'établissement de gammes étalon dans le cadre d'un dosage immunologique de la GDH.
Encore un autre objet de l'invention concerne l'utilisation des compositions en tant que calibrateur et/ou contrôle dans le cadre d'un dosage immunologique de la GDH.
Enfin, un dernier objet de l'invention concerne les procédés de détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium mettant en œuvre une composition de l'invention, la bactérie étant le cas échéant toxinogène.
La Demanderesse a donc montré contre toute attente que l'utilisation de composés particuliers permettait de stabiliser la GDH des bactéries du genre Clostridium pour maintenir ses propriétés antigéniques lorsque la GDH se trouve en solution aqueuse, notamment dans des concentrations de l'ordre de quelques ng/mL, par exemple de 0,75 à 10 ng/mL, de 2 à 10 ng/mL ou encore de 3 à 6 ng/mL, ce qui est particulièrement important dans le cadre des tests pour la détection de ces bactéries par immunodosage.
Par maintien des propriétés antigéniques de la GDH, on entend que la GDH conserve sa propriété de liaison aux partenaires de liaison mis en œuvre dans le cadre de l'immunodosage car sa structure est conservée, au moins au niveau du déterminant antigénique impliqué dans la fixation du partenaire de liaison. Bien entendu, le préfixe « immuno » dans le terme « immunodosage », par exemple, n'est pas à considérer dans la présente demande comme indiquant strictement que le partenaire de liaison est nécessairement un partenaire d'origine immunologique, tel qu'un anticorps ou un fragment d'anticorps. En effet, comme cela est bien connu de l'homme du métier, ce terme est plus largement utilisé pour désigner des tests et procédés dans lesquels le partenaire de liaison n'est pas un partenaire d'origine/de nature immunologique mais consiste, par exemple, en un récepteur de l'analyte que l'on souhaite détecter et/ou quantifier. La condition étant que le partenaire de liaison concerné soit capable de se lier à l'analyte recherché, de préférence de manière spécifique. Ainsi, il est connu de parler du dosage ELIS A pour des dosages qui utilisent des partenaires de liaison non immuno logiques stricto sensu, appelés plus largement en anglais « ligand binding assay », que l'on pourrait traduire en langue française par « dosage utilisant la liaison à un ligand », alors que le terme « immuno » est inclus dans l'intitulé in extenso correspondant à l'acronyme ELISA. Dans un souci de clarté et d'uniformité, le terme « immuno » est employé dans la présente demande pour désigner toute analyse biologique utilisant au moins un partenaire de liaison adapté pour se lier à l'analyte recherché et détecter et/ou quantifier ce dernier, de préférence de manière spécifique, même quand ledit partenaire de liaison n'est pas de nature ou d'origine immunologique au sens strict.
Par partenaire de liaison à la GDH, on entend toute molécule capable de se lier à la GDH. A titre d'exemple de partenaire de liaison à la GDH, on peut citer les anticorps, les fragments d'anticorps, les nanofitines, les récepteurs à la GDH, les aptamères, les DARPins ou toute autre molécule qui est connue pour avoir une interaction avec la GDH.
Les anticorps partenaires de liaison sont par exemple soit des anticorps polyclonaux, soit des anticorps monoclonaux.
Les anticorps polyclonaux peuvent être obtenus par immunisation d'un animal avec, comme immunogène, la GDH cible, suivie de la récupération des anticorps recherchés sous forme purifiée, par prélèvement du sérum dudit animal, et séparation desdits anticorps des autres constituants du sérum, par exemple par chromatographie d'affinité sur une colonne sur laquelle est fixé un antigène spécifiquement reconnu par les anticorps, notamment l'immunogène, ou à l'aide de d'une protéine A ou G.
Les anticorps monoclonaux peuvent être obtenus par la technique des hybridomes largement connue de l'homme du métier. Les anticorps monoclonaux peuvent être également des anticorps recombinants obtenus par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier.
A titre d'exemple de fragments d'anticorps, on peut citer les fragments Fab, Fab', F(ab')2 ainsi que les scFv (Single chain variable fragment), dsFv (Double-stranded variable fragment). Ces fragments fonctionnels peuvent notamment être obtenus par génie génétique.
Les nanofitines (nom commercial) sont de petites protéines qui, comme les anticorps, sont capables de se lier à une cible biologique permettant ainsi de la détecter, de la capturer ou tout simplement de la cibler au sein d'un organisme.
Les aptamères sont des oligonucléotides, généralement ARN ou ADN, identifiés dans des banques contenant jusqu'à 1015 séquences différentes, par une méthode combinatoire de sélection in vitro appelée SELEX pour « Systematic Evolution of Ligands by Exponentiel Enrichment » (Ellington AD et Szostak JW., 1990). La plupart des aptamères sont composés d'ARN, en raison de la capacité de l'ARN à adopter des structures variées et complexes, ce qui permet de créer à sa surface des cavités de géométries variées, permettant de fixer des ligands divers. Il s'agit d'outils biochimiques d'intérêt qui peuvent être utilisés dans des applications biotechnologiques, diagnostiques ou thérapeutiques. Leur sélectivité et leurs propriétés de fixation de ligands sont comparables à celle des anticorps.
Les « DARPins » pour Designed Ankyrin Repeat ProteINS (Boersma YL et Plutckthun A, 2011) sont une autre classe de protéines permettant de mimer les anticorps et de pouvoir se fixer avec une affinité et une sélectivité élevées sur des protéines cibles. Ils dérivent de la famille des protéines ankyrines qui sont des protéines adaptatrices permettant de fixer les protéines de membrane intégrales au réseau spectrine/actine qui constitue « la colonne vertébrale » de la membrane plasmatique cellulaire. La structure des ankyrines est basée sur la répétition d'un motif d'environ 33 acides aminés et il en est de même des DARPins. Chaque motif a une structure secondaire de type hélice-coude-hélice (« helix-turn-helix »). Les DARPins contiennent au moins trois, de préférence quatre à cinq motifs répétés et sont obtenus par screening de banques combinatoires.
Les partenaires de liaison utilisés peuvent être spécifiques ou non de la GDH. Ils sont dits spécifiques quand ils sont capables de se lier de façon exclusive ou quasi exclusive à la GDH. Ils sont dits non spécifiques lorsque la sélectivité de liaison à la GDH est plus faible et qu'ils sont alors capables de se lier à d'autres ligands, tels que d'autres protéines ou anticorps. Selon un mode de réalisation préféré, on préfère les partenaires de liaison spécifiques.
La glutamate déshydrogénase qu'il convient de stabiliser est toute glutamate déshydrogénase de Clostridium dont on veut détecter la présence, par exemple celle de Clostridium difficile, de Clostridium botulinum ou de Clostridium perfringens. Elle inclut tous les variants possibles. De telles protéines sont connues et leurs séquences sont décrites par exemple dans la base de données Uniprot (www.uniprot.org).
Ainsi, la GDH de Clostridium difficile (N° accession Uniprot P27346) est une protéine de 421 acides aminés dont la séquence de référence en acides aminés est la
SEQ ID N°1 suivante :
10 20 30 40 50 60 MSGKDVNVFE MAQSQVKNAC DKLGMEPAVY ELLKEPMRVI EVSIPVKMDD GSIKTFKGFR
70 80 90 100 110 120
SQHNDAVGPT KGGIRFHQNV SRDEVKALSI WMTFKCSVTG IPYGGGKGGI IVDPSTLSQG 130 140 150 160 170 180
ELERLSRGYI DGIYKLIGEK VDVPAPDVNT NGQIMSWMVD EYNKLTGQSS IGVITGKPVE
190 200 210 220 230 240
FGGSLGRTAA TGFGVAVTAR EAAAKLGIDM KKAKIAVQGI GNVGSYTVLN CEKLGGTWA
250 260 270 280 290 300
MAEWCKSEGS YAIYNENGLD GQAMLDYMKE HGNLLNFPGA KRISLEEFWA SDVDIVIPAA
310 320 330 340 350 360 LENSITKEVA ESIKAKLVCE AANGPTTPEA DEVFAERGIV LTPDILTNAG GVTVSYFEWV
370 380 390 400 410 420
QNLYGYYWSE EEVEQKEEIA MVKAFESIWK IKEEYNVTMR EAAYMHSIKK VAEAMKLRGW
Y
Et dont les variants sont :
Tableau 1
La GDH de Clostridium perfringens est une protéine n'ayant pas encore de séquence de référence dans la base Uniprot. La première protéine donnée dans la base Uniprot (N° accession Uniprot Q8XK85) est la protéine de la souche 13 de type A, de
448 acides aminés, dont la séquence en acides aminés est la SEQ ID N°2 suivante :
10 20 30 40 50 60 MEVKKYVDNL MEDLKKNNPG ESEFLAAAEE VLYSLVPVLE KNPKYMEEGI LERIVEPERV
70 80 90 100 110 120
IMFRVPWVDD AGNVRVNRGY RVQFNSAIGP YKGGLRFHPS VNLSI IKFLG FEQIFKNSLT 130 140 150 160 170 180
TLPIGGGKGG SNFDPKGKSD REIMRFCQSF MSELYRHIGP NTDVPAGDIG VGGREIGYMF
190 200 210 220 230 240
GQYKKLKNSV DAGVLTGKGL TYGGSLARKE ATGYGLVYFV DEMLRDNGQT IEGKTWISG 250 260 270 280 290 300
SGNVAIYATE KVQELGGKW ALSDSSGYVY DENGIDLEW KEIKEVKRGR ISEYVNYVKT
310 320 330 340 350 360
AKFTEGFRGI WNVKCDIALP CATQNEIDKS SAKTLIDNGV IAVGEGANMP STLEAQKLFV
370 380 390 400 410 420
DNKILFAPAK AANAGGVATS ALEMSQNSLR MSWTFEEVDA KLKDIMKNIY YNSRNAASEY
430 440
GHDGNLIVGA NIAGFKKVAD AMLDHGI I
Et dont les variants sont :
Tableau 2
La GDH de Clostridium botulinum est une protéine n'ayant pas encore de séquence de référence dans la base Uniprot. La première protéine donnée dans la base Uniprot (N° accession Uniprot A5I2T3) est la protéine de la souche Hall de type A (ATCC 3502, NCTC 13319), de 421 acides aminés, dont la séquence en acides aminés est la SEQ ID N°3 suivante : 10 20 30 40 50 60
MAKENLNPFE NAQKQVKTAC DKLGMEPAVY ELLKEPQRVI EVSIPVKMDD GSVKVFKGYR
70 80 90 100 110 120 SQHNDAVGPT KGGVRFHPNV SLDEVKALSI WMTFKCSVTG IPYGGGKGGI IVDPKTLSKG
130 140 150 160 170 180
ELERLSRGYI DGIHKLIGEK VDVPAPDVNT NGQIMAWMVD EYNKLVGRSA IGVITGKPVE 190 200 210 220 230 240
FGGSLGRNAA TGFGVAVTAR EAAAKLGIDM KKAKLAIQGI GNVGSHTVLN CEKLGGTWA
250 260 270 280 290 300
LAEWCKEEGT YAIYNENGLD GKAMIEYVKE NGNLLGYPGA KKISLDEFWA LNVDILIPAA
310 320 330 340 350 360
LENAITHENA SSINAKLVCE AANGPITPDA DAILKEKGIT VTPDILTNAG GVTVSYFEWV
370 380 390 400 410 420 QNLYGYYWTE AEVEAKEEEA MVKAFESIWA IKEEYSVTMR EAAYMHSIKK VAGAMKLRGW
Et dont les variants, de 421, 447 ou 450 acides aminés selon les souches, sont : Tableau 3
Béluga'
Selon un mode de réalisation particulier, la glutamate déshydrogénase est une enzyme de la bactérie de l'espèce Clostridium difficile.
La glutamate déshydrogénase mise en solution aqueuse est soit d'origine naturelle, soit d'origine recombinante. La glutamate déshydrogénase naturelle ou encore appelée native peut être obtenue après culture de la bactérie Clostridium et purification de la protéine à partir du lysat bactérien. La glutamate déshydrogénase recombinante peut être obtenue par génie génétique, par des techniques bien connues de l'homme du métier. Une telle obtention est décrite par exemple par Anderson BM et al., 1993. La glutamate déshydrogénase recombinante peut être obtenue auprès de Sociétés telles que Holzel Diagnostika GmbH (Allemagne).
Par composition ou solution aqueuse, on entend une solution liquide et limpide obtenue par dissolution complète d'un ou plusieurs composés et dont le solvant majoritaire est l'eau, représentant au moins 50% en volume, en général au moins 60%, 70%), 80%o, 90%o, par rapport au volume total de la solution.
Dans le cadre de la présente invention, la composition ou solution aqueuse est obtenue en diluant la GDH dans un solvant comprenant majoritairement de l'eau et un composé de stabilisation tel que défini ci-après. Le composé de stabilisation à ajouter dans la solution aqueuse contenant la GDH à stabiliser est un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH, ou un de ses sels.
Par acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH, on entend une molécule constituée de :
- une chaîne carbonée, linéaire ou ramifiée, contigûe (c'est-à-dire sans interruption dans la chaîne carbonée) ou interrompue par au moins un autre atome différent de l'atome de carbone, par exemple un atome d'azote ou d'oxygène,
- au moins 2 groupements -COOH en bout de chaîne et
- au moins un groupement « CX », soit en bout de chaîne (il s'écrit alors -CX), soit en milieu de chaîne (il s'écrit alors -CX-), X étant différent de C.
Par exemple, les groupements -CX- sont choisis indépendamment parmi -CH2-, =CH-, -C(H)OH-, -C(H)NH2- et -C(O)-. Les groupements -CX sont quant à eux choisis indépendamment parmi -CH3, -COOH (s'il y a, dans la molécule, plus de 2 groupements -COOH) et -C(0)NH2.
Ainsi, par exemple, le composé de stabilisation peut être l'acide succinique, de formule OH(0)C-(CH2)2-C(0)OH, qui est une molécule ayant une chaîne carbonée linéaire contigûe de 4 atomes de carbone, 2 groupements -COOH en bout de chaîne et 2 groupements -CH2-.
Un autre exemple consiste en l'acide fumarique de formule OH(0)C-(CH=CH)- C(0)OH, qui est une molécule ayant une chaîne carbonée linéaire contigûe de 4 atomes de carbone, 2 groupements -COOH en bout de chaîne et 2 groupements -CH-.
Encore un autre exemple consiste en l'acide N-(2-acétamido)iminodiacétique, de formule H2NC(0)-CH2-N(CH2-COOH)2, qui est une molécule ayant une chaîne carbonée ramifiée de 6 atomes de carbone, interrompue par un atome d'azote, constituée de 2 groupements -COOH en bout de chaîne, de 3 groupements -CH2- et d' 1 groupement -C(0)NH2.
Selon un mode de réalisation particulier, le composé de stabilisation est choisi parmi : l'acide fumarique, l'acide succinique, l'acide malique, l'acide glutarique, l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide N-(2-acétamido)iminodiacétique, l'acide glutamique, l'acide adipique, l'acide aspartique, l'acide pimélique, l'acide malonique et leurs sels, dont les formules sont données sur la Figure 1.
Par sel d'acide carboxylique, on entend un sel d'un cation monovalent. A titre de cation monovalent, on peut citer les ions ammonium (NH4+), argent (Ag+), diaminoargent (Ag(NH3)2 +), césium (Cs+), cuivre(I) (Cu+), mercure (Hg+), le méthanium (CH5 +), le méthylium (CH3 +), le nitrosium (N02 ) et les ions des métaux alcalins sodium (Na+), potassium (K+) et lithium (Li+).
Lorsque le composé de stabilisation est sous forme de sel, au moins un proton H+ des groupements -COOH est remplacé par un cation monovalent décrit ci-dessus.
Selon un mode de réalisation préféré, le composé de stabilisation est choisi parmi l'acide succinique, l'acide fumarique et leurs sels, en particulier de métaux alcalins, tels que définis ci-dessus.
La chaîne carbonée peut comprendre une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :
elle peut comprendre au moins 3 atomes de carbone à au plus 10 atomes, de préférence au plus 8, de préférence au plus 7, de préférence au plus 6 atomes,
elle intercale un atome d'azote ou elle est contigue et n'est constituée que d'atomes de carbone,
les groupements « CX » sont choisis indépendamment parmi -CH2-, =CH-, -CH3, -COOH, -C(H)OH-, -C(0)NH2, -C(H)NH2-, -C(O) -, et elle peut comprendre ou non une ou plusieurs doubles liaisons et l'acide peut alors se trouver sous forme d'isomère E ou Z.
En particulier, l'acide carboxylique peut présenter une ou plusieurs des caractéristiques suivantes :
- une chaîne carbonée de 4, 5 ou 6 atomes de carbone,
une chaîne carbonée de 4 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements -CX- choisis indépendamment parmi =CH-, -CH2- et -C(H)OH-, une chaîne carbonée de 5 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements -CX- choisis parmi -CH2- et -C(H)NH2, une chaîne carbonée de 6 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements « -CX- » choisis parmi -CH2-, -C(H)OH- (-CX-) et -C(0)NH2 (-CX),
- une double liaison et est un isomère E,
2 groupements -COOH.
La quantité de GDH présente dans la solution aqueuse dépend de l'utilisation finale de la composition aqueuse qui la contient. Dans le cadre d'un immunodosage classique, la GDH peut être présente à raison de 0,75 à 10 ng/mL, ou de 2 à 10 ng/mL, de préférence de 3 à 6 ng/mL. Dans le cadre d'un immunodosage dit ultrasensible, la GDH sera présente en une quantité bien inférieure, par exemple inférieure au pg/mL, voire de l'ordre du fg/mL.
La quantité de composé de stabilisation à ajouter dans la solution aqueuse contenant la GDH est en large excès par rapport à la quantité de GDH. Elle dépend du fait que le composé de stabilisation est utilisé uniquement à titre de composé de stabilisation, une autre molécule étant alors ajoutée à titre de tampon, ou bien s'il est utilisé à la fois à titre de composé de stabilisation et de tampon. Ainsi, par exemple, lorsque le composé de stabilisation est uniquement utilisé à titre de composé de stabilisation, on ajoute de 20 à 100 molécules de composé de stabilisation par monomère de GDH, de préférence de 30 à 80 molécules de composé de stabilisation par monomère de GDH, de préférence encore de 40 à 60 molécules de composé de stabilisation par monomère de GDH. Dans ce cas, le composé ajouté à titre de tampon, est tout composé connu de l'homme du métier ayant un pH compris entre 4,5 et 7, de préférence entre 5,5 et 6,5, un pH de 5,8 étant préféré. A titre d'exemple de composé ajouté à titre de tampon, on peut citer le phosphate et l'acétate. Lorsque le composé de stabilisation est utilisé à la fois à titre de composé de stabilisation et de tampon, on ajoute de 108 à 1010 molécules de composé de stabilisation par monomère de GDH, de préférence de l x lO9 à 5x l09 molécules de composé de stabilisation par monomère de GDH, de préférence encore de 1 χ 109 à 2χ 109 molécules de composé de stabilisation par monomère de GDH. D'autres composés peuvent également être ajoutés à la composition aqueuse dans le procédé de l'invention. Ainsi, par exemple, un polyol peut être ajouté. L'ajout de polyol permet de favoriser la stabilité thermique des protéines (résistance à la dénaturation thermique) et aussi de prévenir l'agrégation. De manière générale les polyols ont un effet co-solvant et contribuent au maintien de la conformation native des protéines en solution aqueuse.
A titre d'exemples de polyol, on peut citer les polyols monosaccharidiques tels que les triols, par exemple le glycérol, les tétraols, par exemple l'érythritol, les pentols, par exemple le xylitol, l'arabitol et le ribitol, les hexols, par exemple le sorbitol, le dulcitol et le mannitol, les heptols, par exemple le volemitol, ainsi que les polyols disaccharidiques tels que le maltitol, l'isomaltitol et le lactitol.
Selon un mode de réalisation de l'invention, le polyol ajouté dans la composition aqueuse du procédé de l'invention est du sorbitol.
On ajoute le polyol dans la composition aqueuse à raison d'au moins 1%, de préférence d'au moins 5% et de préférence encore d'au moins 10%, avec au plus 50%.
La composition peut également comprendre une autre macromolécule, appelée de façon générique « protéine de charge » même si des macromolécules autres que des protéines sont appropriées, laquelle n'a rien à voir avec la GDH mais est présente en large excès par rapport à la GDH, améliorant encore la stabilisation de la GDH. Cette « protéine de charge » a un effet bouclier en ce sens qu'elle va en partie subir les modifications physico-chimiques dans la solution aqueuse, permettant ainsi de protéger la molécule d'intérêt, ici la GDH. Cette macromolécule ajoutée peut par exemple être une protéine comme la BSA (Bovine Sérum Albumine), ou encore des polymères synthétiques type dextran ou polyéthylène glycol. La BSA, par exemple, est ajoutée à raison de 50 g/L vs 3 mg/L de GDH.
La composition aqueuse est tamponnée pour avoir un pH compris entre 4,5 et 7, de préférence entre 5,5 et 6,5, un pH de 5,8 étant préféré. Comme indiqué précédemment, le composé de stabilisation de l'invention peut également être utilisé à titre de tampon, ou bien un autre composé tampon peut être ajouté.
Les compositions aqueuses comprenant la glutamate déshydrogénase d'une bactérie du genre Clostridium et un composé de stabilisation qui est un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH ou un de ses sels, étant entendu que le composé de stabilisation n'est ni le glutamate, ni l'alpha-cétoglutarate, produit d'hydrolyse du glutamate par l'enzyme GDH et la coenzyme NAD+, ni le citrate, ni le succinate, ni le glutarate, sont nouvelles et constituent un autre objet de l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, les compositions aqueuses de l'invention excluent aussi l'acide glutamique, l'acide alpha-cétoglutarique, l'acide glutarique, l'acide succinique et/ou l'acide citrique.
Lorsque la bactérie du genre Clostridium est choisie parmi les espèces de
Clostridium difficile, Clostridium botulinum et Clostridium perfringens, alors les compositions aqueuses comprenant la glutamate déshydrogénase d'une de ces bactéries et un composé de stabilisation qui est un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH ou un de ses sels, étant entendu que le composé de stabilisation n'est ni le glutamate, ni l'alpha-cétoglutarate, ni le citrate, sont nouvelles et constituent un autre objet de l'invention.
Selon un autre mode de réalisation, les compositions aqueuses de l'invention excluent aussi l'acide glutamique, l'acide alpha-cétoglutarique et/ou l'acide citrique.
Les mêmes caractéristiques et préférences décrites précédemment, notamment quant au choix de la GDH, du composé de stabilisation, des composés à ajouter et de leur quantité relative, données en relation avec le procédé, s'appliquent également aux compositions aqueuses selon l'invention.
Les compositions aqueuses de l'invention, notamment celles obtenues selon le procédé de l'invention sont particulièrement utiles pour la détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium dans un échantillon biologique susceptible de contenir une telle bactérie. Aussi, les trousses contenant de telles compositions constituent un autre objet de l'invention.
Les échantillons biologiques susceptibles de contenir une bactérie du genre Clostridium peuvent être des échantillons issus du domaine clinique ou du domaine du contrôle d'innocuité, voire de stérilité des produits industriels. Dans le domaine clinique, l'échantillon est un prélèvement biologique animal, de préférence humain, tel que les selles ou dérivés, par exemple extrait de protéines fécales, urine, sang ou dérivés, par exemple sérum ou plasma, pus, etc. Dans le domaine industriel, l'échantillon provient d'un produit alimentaire ou cosmétique.
Les trousses selon l'invention peuvent également contenir les composés nécessaires à la mise en œuvre d'un procédé pour la détection, par exemple par immunodosage, de la présence d'une bactérie du genre Clostridium, et en particulier Clostridium difficile. Ainsi, par exemple, les trousses peuvent contenir un ou des partenaires de liaison à la GDH tels que décrits précédemment, et tous les composés nécessaires pour la mise en évidence de la réaction entre le ou les partenaires de liaison et la GDH.
Le dosage immunologique qualitatif ou quantitatif de la GDH sera de préférence un dosage sandwich qui est un dosage largement connu de l'homme du métier mettant en œuvre deux partenaires de liaison à la GDH. L'un des deux partenaires peut être couplé à un marqueur pour former un conjugué ou un traceur. L'autre partenaire de liaison peut être capturé sur un support solide. On parle alors de partenaire de capture pour ce dernier et partenaire de détection pour le premier.
Le signal mesuré émis par le conjugué est alors proportionnel à la quantité de GDH de l'échantillon biologique.
Par marqueur, on entend, notamment, toute molécule contenant un groupement réactif avec un groupement du partenaire de liaison, directement sans modification chimique, ou après modification chimique pour inclure un tel groupement, laquelle molécule est capable de générer directement ou indirectement un signal détectable. Une liste non limitative de ces marqueurs de détection directe consiste en :
• les enzymes qui produisent un signal détectable par exemple par colorimétrie, fluorescence, luminescence, comme la peroxydase de raifort, la phosphatase alcaline, la β-galactosidase, la glucose-6-phosphate déshydrogénase,
• les chromophores comme les composés fluorescents, luminescents, colorants,
32 35 125
· les molécules radioactives comme le P, le S ou le I, • les molécules fluorescentes telles que les Alexa ou les phycocyanines, et
• les sels électrochimiluminescents tels que des dérivés organo -métalliques à base d'acridinium ou de ruthénium.
Des systèmes indirects de détection peuvent aussi être utilisés, comme par exemple des ligands capables de réagir avec un anti-ligand. Le ligand correspond alors au marqueur pour constituer, avec le partenaire de liaison, le conjugué.
Les couples ligand/anti- ligand sont bien connus de l'homme du métier, ce qui est le cas par exemple des couples suivants : biotine/streptavidine, haptène/anticorps, antigène/anticorps, peptide/anticorps, sucre/lectine, polynucléotide/complémentaire du polynucléotide.
L' anti-ligand peut alors être détectable directement par les marqueurs de détection directe décrits précédemment ou être lui-même détectable par un autre couple ligand/anti-ligand, et ainsi de suite.
Ces systèmes indirects de détection peuvent conduire, dans certaines conditions, à une amplification du signal. Cette technique d'amplification du signal est bien connue de l'homme du métier, et l'on pourra se reporter aux demandes de brevet antérieures FR 2781802 ou WO 95/08000 de la Demanderesse.
Selon le type de marquage utilisé, l'homme du métier ajoutera des réactifs permettant la visualisation du marquage ou l'émission d'un signal détectable par tout type d'appareil de mesure approprié, comme par exemple un spectrophotomètre, un spectrof uorimètre, un densitomètre ou encore une caméra haute définition.
Dans les procédés de dosage de la GDH, les compositions aqueuses de l'invention, le cas échéant obtenues selon le procédé de l'invention, sont particulièrement utiles pour l'établissement d'une gamme étalon, ce qui constitue un autre objet de l'invention. L'établissement de la gamme étalon, étape nécessaire pour pouvoir effectuer une quantification de la GDH, est une étape largement connue de l'homme du métier. En quelques mots, il consiste à mesurer le signal généré par des quantités ou concentrations croissantes et connues de l'analyte GDH, à tracer la courbe donnant le signal en fonction de la quantité ou de la concentration et à trouver un modèle mathématique qui représente de la manière la plus fidèle possible cette relation. Pour ce faire, plusieurs compositions aqueuses de l'invention sont utilisées, chacune contenant une concentration différente en GDH. Le modèle mathématique sera utilisé pour déterminer par extrapolation les quantités ou concentrations de GDH inconnues contenues dans l'échantillon biologique à tester.
Les compositions aqueuses de l'invention, le cas échéant obtenues selon le procédé de l'invention, sont également particulièrement utiles en tant que calibrateur, ce qui constitue un autre objet de l'invention. Dans ce cas, la concentration en GDH de la composition est fixe et connue. Le signal généré lors de l'utilisation de la trousse d'immunodosage par le calibrateur est également connu. Le calibrateur sert à vérifier que la mesure (signal) produite lors de la mise en œuvre de la trousse d'immunodosage correspond bien à la valeur attendue. Si ce n'est pas le cas, le calibrateur sert à mesurer la dérive qui pourra le cas échéant être corrigée mathématiquement ou par une intervention physique sur l'instrument de mesure (ajustement).
Les compositions aqueuses de l'invention, le cas échéant obtenues selon le procédé de l'invention, sont également particulièrement utiles en tant que contrôle, ce qui constitue un autre objet de l'invention. A ce titre, elles sont utilisées par exemple pour vérifier que la trousse d'immunodosage fonctionne selon les attentes (également appelé témoin ou contrôle positif) et que la détection de la GDH dans l'échantillon biologique n'est pas faussement négative dans la mesure où la méthode de détection a bien fonctionné avec la composition aqueuse de l'invention.
La détection de la GDH dans un échantillon biologique permet de conclure à la présence de la bactérie.
Aussi, un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium dans un échantillon biologique susceptible de contenir une telle bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de (i) mettre un œuvre un procédé de détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium par détection ou quantification de glutamate déshydrogénase dans ledit échantillon en utilisant une composition aqueuse de l'invention, le cas échéant telle qu'obtenue selon le procédé de l'invention, ou bien une trousse telle que définie précédemment, et
(ii) si le procédé de l'étape (i) est positif, conclure à la présence de la bactérie. En d'autres termes, pour l'étape (ii) un résultat positif à l'étape (i) permet de conclure à la présence de la bactérie.
En revanche, cela ne renseigne en rien sur le fait que cette bactérie produit ou non au moins une toxine, ce qui est particulièrement important en tant qu'aide au diagnostic lorsqu'un patient présente des symptômes qui pourraient être provoqués par la présence d'une bactérie toxinogène et exprimant au moins une toxine.
Aussi, un autre objet de l'invention concerne un procédé de détection de la présence d'une bactérie toxinogène du genre Clostridium produisant au moins une toxine, dans un échantillon biologique susceptible de contenir une telle bactérie et une telle au moins une toxine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de :
(i) mettre un œuvre un procédé de détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium par détection ou quantification de glutamate déshydrogénase dans ledit échantillon en utilisant une composition aqueuse de l'invention, le cas échéant telle qu'obtenue selon le procédé de l'invention, ou bien une trousse telle que définie précédemment, et
(ii) si le procédé de l'étape (i) est négatif, conclure à l'absence de la bactérie ou
(ii') si le procédé de l'étape (i) est positif, mettre en œuvre un procédé de détection ou quantification d'au moins une toxine susceptible d'être libérée par ladite bactérie du genre Clostridium, dans le même échantillon biologique, ou dans un nouvel échantillon biologique issu du même individu, et conclure au fait que la bactérie est toxinogène et produit ladite au moins une toxine si ladite au moins une toxine est présente.
En d'autres termes, pour l'étape (ii) un résultat négatif à l'étape (i) permet de conclure à l'absence de la bactérie et un résultat positif à l'étape (i) permet de conclure à la présence de la bactérie.
L'étape (i) ci-dessus consistant à détecter la présence d'une bactérie du genre
Clostridium par détection ou quantification de glutamate déshydrogénase dans l'échantillon biologique a été décrite précédemment. La composition aqueuse de l'invention, le cas échéant obtenue par le procédé de l'invention, peut alors être utilisée pour l'établissement de la gamme étalon et/ou à titre de calibrateur et/ou à titre de contrôle positif. L'étape (ϋ') ci-dessus consistant à détecter ou quantifier au moins une toxine susceptible d'être libérée par ladite bactérie du genre Clostridium est une étape largement connue de l'homme du métier. Une telle détection ou quantification peut être mise en œuvre par exemple par immunodosage en utilisant des partenaires de liaison aux toxines recherchées. L'immunodosage des toxines est mis en œuvre de façon similaire à l'immunodosage de la GDH tel que décrit précédemment. Des kits d'immunodosage de toxine de bactéries du genre Clostridium sont disponibles sur le marché, comme par exemple le kit VIDAS® Clostridium difficile A&B qui permet de détecter les toxines A et B de Clostridium difficile.
La spectrométrie de masse pourra également être utilisée pour réaliser l'étape de détection/quantification de la toxine. Cette technique est une technique d'analyse qui permet la détermination de la masse molaire des composés analysés, ainsi que l'identification de leur structure moléculaire, voire leur quantification. Appliquée à un mélange complexe comme un fluide biologique ou des selles, elle nécessite d'être couplée à une technique séparative qui permet d'en réduire la complexité. Il s'agit, le plus souvent, de la chromatographie en phase gazeuse (GC) ou de la chromatographie en phase liquide (LC). La spectrométrie de masse en tandem (MS/MS) combine 2 analyseurs et pourra être utilisée aux fins de détection/quantification. Les composés ioniques sélectionnés dans le premier analyseur puis fragmentés sont analysés de manière plus fine dans le second. Cette double analyse permet d'augmenter de manière significative la spécificité de la méthode. Pour cette technologie, on pourra notamment se référer à Van den Broek et al., 2013.
La détection et/ou quantification des toxines peut également être mise en œuvre par un test d'immunotoxicité dans les selles (CTA) qui permet de mettre en évidence les effets biologiques des toxines dans les selles (Eckert C. et al., 2011).
La détection ou quantification de la toxine est effectuée dans le même échantillon biologique que celui utilisé pour la détection ou quantification de la GDH, dont une partie a été gardée à cet égard, ou bien dans un nouvel échantillon biologique issu de la même provenance, c'est-à-dire de l'individu dont est issu le premier échantillon biologique testé par rapport à la présence de GDH si l'échantillon biologique est un échantillon clinique ou de la même source si l'échantillon biologique est un échantillon industriel. Le deuxième échantillon biologique est soit de même nature, ou de nature différente, le premier cas étant préféré.
Selon un mode de réalisation particulier, la bactérie toxinogène dont on veut détecter la présence est Clostridium difficile et ladite au moins une toxine comprend la toxine A, la toxine B ou les deux.
D'autres bactéries toxinogènes du genre Clostridium ont été décrites précédemment.
L'invention sera mieux comprise à l'aide des exemples suivants qui sont donnés à titre illustratif et non limitatif, ainsi qu'à l'aide des figures 1 et 2, dans lesquelles :
- la Figure 1 donne des exemples de composés de stabilisation mis en œuvre dans les compositions aqueuses selon l'invention, ainsi que leur formule chimique, et
- la Figure 2 est un graphe donnant l'évolution du signal fluorescent obtenu lors d'un immunodosage avec la trousse VIDAS® GDH (bioMérieux) émises par des compositions aqueuses selon l'invention ou des compositions comparatives, en fonction du temps, lorsque ces compositions sont maintenues à 37°C.
EXEMPLES
Exemple 1 : Préparation de GDH recombinante de Clostridium difficile
Le gène gluD codant pour la GDH de Clostridium difficile (N° accession Genbank M65250) complété d'une séquence codant un tag HIS est cloné dans le vecteur pMR78 (bioMérieux, France). Le plasmide d'expression ainsi construit est introduit dans des bactéries E. coli BL21 et dérivées (Stratagene, Agilent Technologies). Les cultures sont réalisées en milieu 2x YT (Difco), en présence d'ampicilline, à 37°C sous agitation. L'induction de l'expression de la protéine se fait par addition de 1 mM d'IPTG (isopropyl beta-D-l-thiogalactopyranoside). Les bactéries sont collectées par centrifugation en fin de culture.
Les culots bactériens sont repris en tampon PBS 2X (phosphate buffered saline) et lysés. Les lysats sont centrifugés à 3000 g pendant 30 min à 4°C. Le surnageant contient les protéines solubles dont la GDH recombinante à purifier. La purification de la protéine se fait par chromatographie d'affinité métal chélate en une étape. Le surnageant obtenu après centrifugation est chargé sur une résine Ni- NTA-Agarose (Qiagen). Après un cycle de lavage, la protéine est éluée en présence d'un gradient imidazole. La protéine est dialysée dans un tampon phosphate 20 mM.
Exemple 2 : Mise en évidence de la stabilisation des propriétés antigéniques de la GDH en utilisant des composés de stabilisation selon l'invention
La GDH recombinante, préparée dans l'exemple 1, est diluée à 3ng/mL dans les formulations suivantes, selon les indications relatives au calibrateur et contrôle (SI /Cl) données dans la notice du réactif VIDAS® GDH (Ref 30125, bioMérieux, France) :
Composition comparative : phosphate lOOmM + BSA 50g/L, pH 5,8 (formulation de la solution de calibration du kit Vidas®, GDH sous forme lyophilisée, reprise dans de l'eau déminéralisée),
Composition selon l'invention 1 : acide N-(2-acétamido)iminodiacétique (ADA) 1 OOmM + B S A 5 Og/L pH 5.8 (composition ADA)
Composition selon l'invention 2 : acide succinique lOOmM + BSA 50g/L pH 5.8 (composition succinate)
Composition selon l'invention 3 : fumarate disodique lOOmM + BSA 50g/L pH 5.8 (composition fumarate).
Chaque composition (comparative et ADA, succinate et fumarate) a été préparée au préalable comme suit : chaque composé de stabilisation (1,18 g d'acide succinique - Merck, 1,6 g de fumarate de sodium dibasique - Sigma, 1,90 g d'ADA - Sigma ou 0,78 g de phosphate NaH2P04.2H20 + 1,79 g de Na2HP04.12H20) a été mélangé à de l'eau déminéralisée pour obtenir 50 mL. Puis du NaOH 10M N a été ajouté pour ajuster le pH à 5,8. Cinq g de BSA (Millipore) ont été ajoutés. Enfin, de l'eau déminéralisée a été ajoutée pour obtenir une solution de 100 mL.
Les 4 compositions contenant la GDH sont ensuite aliquotées en fractions de 1 mL puis conservées à 37+/-l°C. L'impact de la formulation sur la stabilité des propriétés antigéniques de la protéine GDH recombinante est évaluée en réalisant plusieurs dosages de la GDH sur une période de 91 jours avec le kit VIDAS® GDH (Ref 30125) et l'instrument VIDAS® selon les instructions du fabricant (bioMérieux, France).
La mise en œuvre du test VIDAS GDH respecte le protocole du kit commercialisé :
introduction de 200μί d'échantillon + lmL du réactif de prétraitement RI homogénéisation par vortex
introduction de 300μί de cette dilution au 1/6 dans le puits échantillon de la cartouche du kit VIDAS® GDH
Chaque aliquot n'est utilisé que pour un seul temps de suivi, mais utilisé en duplicate systématiquement. L'instrument VIDAS mesure un signal de fluorescence et les résultats sont exprimés en « relative fluorescence value » ou RFV.
Les résultats de RFV obtenus pour les 2 mesures en duplicate (1 et 2) ainsi que le ratio J/JO (RFV au jour J sur RFV au jour 0) sont donnés dans le tableau 4 ci-dessous et sont également reproduits sur le graphe de la Figure 2.
Tableau 4
NA = non applicable
Les résultats mettent en évidence qu'à 37°C, l'utilisation de composés de stabilisation consistant en des acides carboxyliques ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH, permet d'améliorer très sensiblement la durée de conservation d'une solution aqueuse contenant de la GDH puisque, pour la composition comparative, il n'y a plus de signal à 28 jours, tandis que le rapport J/JO à cette date pour les compositions selon l'invention est au moins égal à 0,5.
EXEMPLE 3 : Suivi des propriétés antigéniques de la GDH en solution aqueuse en utilisant l'acide citrique comme composé de stabilisation
On a répété le mode opératoire de l'exemple 2, à ceci près qu'on a utilisé l'acide citrique (100 mM) comme composé de stabilisation et qu'on a conservé les solutions aqueuses sur une période plus longue, à 2-8°C et à 37°C.
Les résultats de RFV obtenus pour les 2 mesures en duplicate (1 et 2) ainsi que le ratio J/J0 sont donnés dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5
NA : non applicable
Les résultats ci-dessus mettent en évidence que l'ajout d'acide citrique permet une très bonne stabilité liée à la conservation des propriétés antigéniques de la GDH, avec une stabilisation quasi optimale, même au bout de 18 mois, lorsque la composition aqueuse est conservée entre 2-8°C. EXEMPLE 4 : Suivi des propriétés antigéniques de la GDH en solution aqueuse en utilisant de l'acide succinique et du sorbitol
On a répété le mode opératoire de l'exemple 2, à ceci près qu'on a ajouté en plus 10% de sorbitol dans une composition succinate et qu'on a conservé les solutions aqueuses sur une période plus longue, à 2-8°C et à 37°C.
Les résultats de RFV obtenus pour les 2 mesures en duplicate (1 et 2) ainsi que le ratio J/JO sont donnés dans le tableau 6 ci-dessous.
Tableau 6
NC : non calculé
Les résultats ci-dessus mettent en évidence que l'acide succinique permet également une stabilisation longue des propriétés antigéniques de la GDH en solution aqueuse, l'ajout de sorbitol n'altérant pas cette stabilisation, avec une stabilisation quasi optimale, même au bout d'environ 30 mois, lorsque la solution aqueuse est conservée entre 2-8°C. Références Bibliographiques
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- Van den Broek et al, 2013, J. Chromatogr. B, 929 : 161-179

Claims

REVENDICATIONS
1. Procédé de stabilisation de la glutamate déshydrogénase d'une bactérie du genre Clostridium en solution aqueuse afin de maintenir ses propriétés antigéniques, comprenant l'étape de mélange de ladite glutamate déshydrogénase et d'un composé de stabilisation qui est un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH ou un de ses sels.
2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que l'acide carboxylique contient une chaîne carbonée de 4, 5 ou 6 atomes de carbone.
3. Procédé selon l'une des revendications 1 ou 2, caractérisé en ce que le composé de stabilisation est choisi parmi les acides carboxyliques suivants et leurs sels :
(i) les acides carboxyliques contenant une chaîne carbonée de 4 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements -CX- choisis indépendamment parmi =CH-, -CH2- et -C(H)OH-, et
(ii) les acides carboxyliques contenant une chaîne carbonée de 5 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements -CX- choisis parmi -CH2- et -C(H)NH2, et
(iii) les acides carboxyliques contenant une chaîne carbonée de 6 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements « CX » choisis parmi -CH2- , -C(H)OH- et -C(0)NH2.
4. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acide carboxylique contient dans sa chaîne carbonée une double liaison et est un isomère E.
5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que l'acide carboxylique contient 2 groupements -COOH.
6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que le composé de stabilisation est choisi parmi l'acide fumarique, l'acide succinique, l'acide malique, l'acide glutarique, l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide N-(2- acétamido)iminodiacétique, l'acide glutamique, l'acide adipique, l'acide aspartique, l'acide pimélique et l'acide malonique et leurs sels.
7. Procédé selon la revendication 6, caractérisé en ce que le composé de stabilisation est choisi parmi l'acide succinique et l'acide fumarique et leurs sels, en particulier de métal alcalin.
8. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisée en ce que la glutamate déshydrogénase est une enzyme de la bactérie de l'espèce Clostridium difficile.
9. Composition aqueuse comprenant la glutamate déshydrogénase d'une bactérie du genre Clostridium et un composé de stabilisation qui est un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH ou un de ses sels, étant entendu que le composé de stabilisation n'est ni le glutamate, ni l'alpha-cétoglutarate, ni le citrate, ni le glutarate, ni le succinate.
10. Composition aqueuse comprenant la glutamate déshydrogénase d'une bactérie du genre Clostridium choisie parmi les espèces de Clostridium difficile, Clostridium botulinum et Clostridium perfringens, et un composé de stabilisation qui est un acide carboxylique ayant une chaîne carbonée d'au moins 3 atomes de carbone et comportant au moins 2 groupements -COOH ou un de ses sels, étant entendu que le composé de stabilisation n'est ni le glutamate, ni l'alpha-cétoglutarate, ni le citrate.
11. Composition selon la revendication 9 ou 10, caractérisée en ce que l'acide carboxylique contient une chaîne carbonée de 4, 5 ou 6 atomes de carbone.
12. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 11, caractérisée en ce que le composé de stabilisation est choisi parmi les acides carboxyliques suivants et leurs sels :
(i) les acides carboxyliques contenant une chaîne carbonée de 4 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements -CX- choisis indépendamment parmi =CH-, -CH2- et -C(H)OH-, et
(ii) les acides carboxyliques contenant une chaîne carbonée de 5 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements -CX- choisis parmi -CH2- et -C(H)NH2, et
(iii) les acides carboxyliques contenant une chaîne carbonée de 6 atomes de carbone ayant au moins 2 groupements -COOH et des groupements « CX » choisis parmi -CH2- , -C(H)OH- et -C(0)NH2.
13. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 12, caractérisée en ce que l'acide carboxylique contient dans sa chaîne carbonée une double liaison et est un isomère E.
14. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 13, caractérisée en ce que l'acide carboxylique contient 2 groupements -COOH.
15. Composition selon la revendication 9, caractérisée en ce que le composé de stabilisation est choisi parmi l'acide fumarique, l'acide succinique, l'acide malique, l'acide glutarique, l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide N-(2- acétamido)iminodiacétique, l'acide glutamique, l'acide adipique, l'acide aspartique, l'acide pimélique et l'acide malonique et leurs sels, à l'exception du citrate, du glutamate, du succinate et du glutarate.
16. Composition selon la revendication 10, caractérisée en ce que le composé de stabilisation est choisi parmi l'acide fumarique, l'acide succinique, l'acide malique, l'acide glutarique, l'acide citrique, l'acide tartrique, l'acide N-(2- acétamido)iminodiacétique, l'acide glutamique, l'acide adipique, l'acide aspartique, l'acide pimélique et l'acide malonique et leurs sels, à l'exception du citrate et du glutamate.
17. Composition selon la revendication 16, caractérisée en ce que le composé de stabilisation est choisi parmi l'acide succinique, l'acide fumarique et leurs sels, en particulier de métaux alcalins.
18. Composition selon l'une quelconque des revendications 9 à 17, caractérisée en ce que la glutamate déshydrogénase est une enzyme de la bactérie de l'espèce Clostridium difficile.
19. Trousse pour la détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium dans un échantillon biologique susceptible de contenir une telle bactérie, comprenant une composition aqueuse telle que stabilisée selon le procédé de stabilisation défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou telle que définie dans l'une quelconque des revendications 9 à 18, ainsi que les composés nécessaires à la mise en œuvre d'un procédé pour la détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium, en particulier Clostridium difficile.
20. Utilisation d'une composition aqueuse telle que stabilisée selon le procédé de stabilisation défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou telle que définie dans l'une quelconque des revendications 9 à 18 pour l'établissement d'une gamme étalon.
21. Utilisation d'une composition aqueuse telle que stabilisée selon le procédé de stabilisation défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou telle que définie dans l'une quelconque des revendications 9 à 18 en tant que calibrateur.
22. Utilisation d'une composition aqueuse telle que stabilisée selon le procédé stabilisation défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou telle que définie dans l'une quelconque des revendications 9 à 18 en tant que contrôle.
23. Procédé de détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium dans un échantillon biologique susceptible de contenir une telle bactérie, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de :
(i) mettre un œuvre un procédé de détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium par détection ou quantification de la présence de glutamate déshydrogénase dans ledit échantillon en utilisant une composition aqueuse telle que stabilisée selon le procédé de stabilisation défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou telle que définie dans l'une quelconque des revendications 9 à 18, ou bien une trousse telle que définie dans la revendication 19, et
(ii) un résultat positif à l'étape (i) permet de conclure à la présence de la bactérie.
24. Procédé de détection de la présence d'une bactérie toxinogène du genre Clostridium produisant au moins une toxine, dans un échantillon biologique susceptible de contenir une telle bactérie et une telle au moins une toxine, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes de :
(i) mettre un œuvre un procédé de détection de la présence d'une bactérie du genre Clostridium par détection ou quantification de la présence de glutamate déshydrogénase dans ledit échantillon en utilisant une composition aqueuse telle que stabilisée selon le procédé de stabilisation défini dans l'une quelconque des revendications 1 à 8 ou telle que définie dans l'une quelconque des revendications 9 à 18, ou bien une trousse telle que définie dans la revendication 19, et
(ii) un résultat négatif à l'étape (i) permet de conclure à l'absence de la bactérie ou
(ii') si le procédé de l'étape (i) est positif, mettre en œuvre un procédé de détection ou quantification d'au moins une toxine susceptible d'être libérée par ladite bactérie du genre Clostridium, dans le même échantillon biologique, ou dans un nouvel échantillon biologique issu du même individu, et conclure au fait que la bactérie est toxinogène et produit ladite au moins une toxine si ladite au moins une toxine est présente.
25. Procédé selon la revendication 24, caractérisé en ce que la bactérie est Clostridium difficile et ladite au moins une toxine comprend la toxine A, la toxine B ou les deux.
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